TWI449525B - 治療癌症之相乘醫藥組合 - Google Patents

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Description

治療癌症之相乘醫藥組合 【發明領域】
本發明係關於治療癌症的一種新穎醫藥組合，其中該組合顯現相乘效果。該醫藥組合物包含一種由太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)或吉西他濱(gemcitabine)或是其醫藥可接受鹽類所組成族群選出的細胞毒性抗腫瘤劑及至少一種由分子式I化合物(如此處所敘述)或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的細胞週期依賴激酶(CDK)抑制劑。本發明亦關於一種癌症治療方法，此方法包含投藥醫療有效量的該組合物至需要此種治療的病人。
【發明背景】
癌症為一種用於敘述不正常細胞無控制地分裂的疾病之統稱，癌症細胞會侵入鄰近組織及可經由血液及淋巴系統分散至身體其他部分。存在不同形式的癌症例如膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌症、子宮內膜癌、腎(腎細胞)癌、白血病、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、攝護腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、非何杰金氏淋巴瘤及黑色素瘤，與以前相較，現今已有許多治療可提供用於癌症，其包含化療、輻射、手術、荷爾蒙療法、免疫療法及基因療法，化療為對付許多形式的癌症之日常使用治療，最常使用的化療劑(抗腫瘤劑)包含太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、滅必治、佳鉑帝、順鉑、拓撲替康及吉西他濱，這些及其他類似抗腫瘤劑已成功用於不同癌症的治 療。然而，在適當的時候，已發現一些癌症病人會發展對使用此種標準抗腫瘤劑的單一藥物治療的抗性。對藥物的耐受或抗性表示對成功治療的一種主要阻礙，此種抗性常考慮為本質的(亦即在治療開始時即存在)或是獲得的(亦即在化療過程期間發生)。涉及人類非小細胞肺癌細胞(NCI－H460)暴露於逐漸增加濃度的阿霉素之研究報告為抗阿霉素(96.2倍)的及與滅必治、太平洋紫杉醇、長春花鹼及表阿黴素為交互抗的(化療期刊,2006 Feb；18(1)66－73)新細胞系(NCI－H460/R)的出現。在敘述非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤培養中活體外化療阻抗的普遍性之另一研究，已報告對數種包含順鉑、抗阿霉素、滅必治、吉西他濱、諾維本、太平洋紫杉醇、剋癌易及拓撲替康的抗腫瘤劑的泛耐藥性或介導耐藥性(Ann.Thorac.Surg.2006 Feb；81(2)：440－6；討論446－7)。吉西他濱係考慮為胰臟癌治療的最臨床活性藥物，然而其無法顯著改善胰臟癌病人的情況因為大部分腫瘤細胞對藥物的先前存在或獲得的化療耐藥性(Oncogene 2003 May 22；22(21)：3243－51)。於癌症治療所發現或普遍存在的另一個問題為伴隨大部分抗腫瘤劑的嚴重毒性，在類似阿霉素的藥物之情況嚴重副作用例如心臟毒性的發生已於J Egypt Natl Canc Inst.2005 Dec_17(4)_291~300報告。儘管伴隨習知抗腫瘤劑例如吉西他濱、太平洋紫杉醇的抗藥性及嚴重毒性的發生，這些試劑在癌症治療持續為重要的因為它們具減少腫瘤質體的能力，為改善回應速率及防止伴隨習知抗腫瘤劑的毒性，新的治療方法被評估，一個此 種方法係關於涉及合併具不同生物機構的不同抗癌劑的原創步驟流程(Jekunen等,Br.J.Cancer,69,299－306(1994)；葉等，生命科學,54,431－35(1994))。一種最適組合化療流程會產生增加的醫療效用、減少的宿主毒性、及最少或延遲抗藥性。當具不同毒性的藥物合併時，每一種藥物可以其最適劑量使用，幫助最小化不可耐受副作用，如在Oncology(Williston Park).2002 Oct；16：17－22對截瘤達及多西紫杉醇的組合所報告。已發現與當用做單一藥物治療比較，當與其他抗癌劑合併使用時一些抗腫瘤劑為加乘有效的，例如，環磷醯胺及5－氟嘧啶二酮於卵巢透明细胞癌细胞相乘地作用如在Cancer Lett.2001 Jan 10；162(1)：39－48所報告。組合化療亦可有利地用於治療晚期癌症，此種晚期癌症不易使用單一藥物治療、輻射或外科手術治療，例如，已報告太平洋紫杉醇及吉西他濱之組合可用於轉移性非小細胞肺癌之治療(癌症,2006 Sep 1；107(5)：1050－4)。
最近，具癌症治療的分子標的抗癌劑的一或更多標準抗腫瘤劑例如太平洋紫杉醇、順鉑等的組合已被試驗以改善藥物回應速率及以強調對抗腫瘤劑的抗藥性。分子標的劑例如甲磺酸伊馬替尼、夫拉平度等調節蛋白質例如激酶其活性係更特定地伴隨癌症細胞，於長時間的研究已證實細胞週期依賴激酶(CDK)族的成員在各種細胞方法扮演關鍵角色，CDK族中的11個成員為目前已知，其中，已知CDK1、2、3、4、及6在細胞循環扮演重要角色(細胞週期素及細胞週期依賴激酶：主題及變化。Adv Cancer Res.1995； 66：181－212)。CDKs係由與細胞週期素例如A－、B－、C－、D－(D1、D2、及D3)、及E－型式細胞週期素形成非共價複合物而活化，此族的每一個異構酶係負責細胞週期的特定方面(細胞之訊號傳遞、轉錄，等)，及一些CDK異構酶係特定於某些種類的組織，這些激酶的異常表現及過度表現發現於許多疾病情況。已發展具潛在有用的CDK抑制性質的數種化合物及報告於文獻，夫拉平度為細胞週期依賴激酶(CDKs)達到臨床治療的第一有效抑制劑，已發現夫拉平度可相乘地加強習知抗腫瘤劑於各種癌症細胞系的細胞毒性反應，例如，使用多西紫杉醇、夫拉平度及5－氟尿嘧啶所進行的HCT116結腸癌之後續治療已在Acta Pharmacol Sin.2006 Oct；27(10)：1375－81報告，同樣地，肺癌細胞的合併多西紫杉醇與夫拉平度治療已於Radiother Oncol.2004 May；71(2)：213－21報告及於胃癌的治療已於Mol Cancer Ther.2003 Jun；2(6)：549－55報告。
雖然抗癌劑的合併已證實在癌症治療流程具顯著進展，仍有癌症治療醫藥的一些未滿足的需求及改良空間，這些癌症為困難治療的，或是對使用習知抗腫瘤劑做為單一藥物治療的療法具抗藥性。更特定言之，發展新穎組合方法以傳送具不同作用機構的已知抗癌劑在該技藝中代表重要進展，雖然涉及具不同作用機構的抗癌劑組合之流程在一些組合可有效作用，其他抗癌劑組合未必能以相同方式有效作用及此種組合未必總是能產生具有利醫療效用的組合，然而，本發明者已令人驚訝地發現包含由分子式I(如 此處所敘述)所表示的化合物所選出的細胞週期依賴激酶抑制劑的已知抗癌劑與治療不同癌症的標準細胞毒性的抗腫瘤劑之新穎醫藥組合產生較單獨使用抗癌劑時為預期外的更大效用。
【發明摘要】
在一方面，本發明係關於一種新穎醫藥組合，其包含一種由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或吉西他濱或是其醫藥可接受鹽類所選出的細胞毒性抗腫瘤劑；及由分子式I化合物(如此處所敘述)或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的細胞週期依賴激酶(CDK)抑制劑，其中該組合在癌症治療顯現相乘作用。
在另一方面，本發明係關於一種醫藥組合，其包含一種由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或吉西他濱或是其醫藥可接受鹽類所選出的細胞毒性抗腫瘤劑；及由分子式I化合物(如此處所敘述)或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的細胞週期依賴激酶(CDK)抑制劑，以用於癌症治療的同時或循序投藥。
在進一步方面，本發明係關於一種使用該新穎醫藥組合治療癌症及誘發細胞凋亡。
在另一進一步方面，本發明係關於一種癌症治療方法，此方法包含將醫療有效量的由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或吉西他濱或是其醫藥可接受鹽類所選出的細胞毒性抗腫瘤劑；與醫療有效量的由分子式I化合物(如此處所敘述)或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的細胞 週期依賴激酶(CDK)抑制劑一起投藥至需要此種治療的病人。
在另一進一步方面，本發明係關於使用該新穎醫藥組合以製備用於治療癌症的醫藥。
本發明的其他方面及進一步可應用範圍可由下文詳細敘述變為明顯。
【本發明詳細敘述】
現在發現本發明新穎組合，其包含一種由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或吉西他濱或是其醫藥可接受鹽類所選出的習知細胞毒性抗腫瘤劑及由分子式I化合物(如此處所敘述)或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的CDK抑制劑；當用於癌症，特別是固體腫瘤治療時顯現相乘作用。
用於本發明醫藥組合的CDK抑制劑係由下文所敘述分子式I化合物所選出，由下文分子式I所表示的CDK抑制劑係揭示於PCT專利公開案第WO2004004632號。分子式I化合物為有希望的CDK抑制劑，其可抑制許多癌症細胞的增生。用於本發明的分子式I化合物對抗各種固體及血液性惡性腫瘤為有效的，本發明發明者觀察到合併分子式I的CDK抑制劑與由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或吉西他濱所選出的習知細胞毒性抗腫瘤劑產生凋亡，或是計畫性細胞死亡的增加。
用於本發明的CDK抑制劑係由下列分子式I所表示的化合物選出，
其中Ar係為苯基，其為未經取代的或是由1、2、或3個相同或不同取代基所取代，取代基可選自：鹵素例如氯、溴、氟或碘、硝基、氰基、C1 －C4 －烷基、三氟甲基、羥基、C1 －C4 －烷氧基、羧基、C1 －C4 －烷氧羰基、CONH2 、及NR1 R2 ； 其中R1 及R2 每一個係獨立地選自氫或C1 －C4 －烷基。
分子式I化合物，其可為醫藥可接受鹽類或溶合物的形式，之製造，及包含上述化合物的口服及/或非腸道醫藥組合物的製造係揭示於PCT專利公開案第WO2004004632號。此專利，其係併入此處做為參考，揭示由分子式I所表示的CDK抑制劑顯現顯著抗癌效用。
如上文所指出分子式I的CDK抑制劑可以它們的鹽類或溶合物的形式使用，分子式I化合物的較佳鹽類係包含鹽酸鹽、甲磺酸鹽及三氟醋酸鹽。
由熟知該技藝者所了解分子式I化合物包含至少兩種對掌中心，分子式I化合物於是以兩種不同光學異構物(亦即(＋)或(－)對映異構物)的形式存在。所有此種對映異構物及其包含消旋混合物的混合物係包含於本發明範圍內，分子式I化合物的對映異構物可由揭示於PCT專利公開案第WO2004004632號的方法得到及申請者的申請中國際專利 申請案第PCT/IB2006/052294號，這些專利申請案係以其全文併入本文做為參考。分子式I化合物的對映異構物亦可由在該技藝中所熟知方法得到，例如對掌HPLC及酶法拆分，或者是，分子式(I)化合物的對映異構物可由使用光學活性起始物質合成，於是，分子式I的CDK抑制劑之定義包含所有可能的立體異構物及其混合物。分子式I定義包含具經訂定活性的消旋型式及經分離光學異構物。
用於本發明新穎醫藥組合物的習知細胞毒性抗腫瘤劑可由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、吉西他濱及類似物細胞毒性抗腫瘤劑(其經由類似作用機構顯現抗癌活性)所組成族群選出。
太平洋紫杉醇為一種自太平洋紫杉短葉紅豆杉分離的天然二萜產物(Rowinsky等，J.Natl.Cancer Inst.,82,1247－1259(1990))。太平洋紫杉醇的分離及其結構係揭示於美國化學協會期刊93,2325(1971)，其為一種促進自微管蛋白二聚體的微管組裝及藉由防止解聚合作用而穩定化微管的有絲分裂微小管抑制劑。太平洋紫杉醇已於卵巢癌的治療(Merkman等；Yale Journal Of Biology and Medicine,64：583,1991)及於乳癌的治療(Holmes等；J.Nat.Cancer Inst.,83；1797,1991)之臨床使用證實，然而，其亦有用於治療其他癌症例如，其已被考慮為頭頸部癌症(Forastire等，Sem.Oncol.,20：56,1990)及肺癌(M.Ghaemmaghami等；Chest；113；86－91(1998))治療的有效藥物。太平洋紫杉醇係揭示於美國專利第5,670,537號，其係併入本文做為在使用或投藥 太平洋紫杉醇於可疑癌症的治療之參考，太平洋紫杉醇係商業提供為可注射溶液，Taxol。使用太平洋紫杉醇做為單一藥物治療一般係伴隨著不欲的副作用，其包含過敏反應、低血壓、心律遲緩、高血壓、噁心及嘔吐、及注射局部反應。
多西紫杉醇屬於紫杉類族及為太平洋紫杉醇的半合成衍生物，多西紫杉醇主要用做乳癌及非小細胞肺癌的治療，其亦有用於治療其他癌症。此化合物係揭示於美國專利第4,814,470號，其係併入本文做為在合成及使用多西紫杉醇於可疑癌症的治療之參考，三水多烯紫杉醇係商業提供為可注射溶液，Taxotere。基於紫杉烷衍生物，包含多西紫杉醇，的所有治療會顯示嚴重及麻煩的毒性，尤其是例如骨髓抑制、粒細胞減少症、超敏、周圍神經病、及體液滯留(Fumoleau等，Bull.Cancer,(82)8：629－636(1995))。
阿霉素為阿黴素的學名及係以可注射型式商業提供，阿霉素係先自波賽鏈黴菌表灰變種的發酵液分離出(美國專利第3,590,028號)。此細胞毒性抗腫瘤藥物連結至核酸，大抵藉由平面蒽環類細胞核與DNA雙螺旋的特定插層，而產生不正常的細胞複製。阿霉素係用於乳癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、攝護腺癌、胃癌及甲狀腺；骨及軟組織肉瘤；淋巴肉瘤及白血球過多症；及兒童腫瘤的治療。阿霉素的使用一般係伴隨著數種副作用，包含骨髓抑制、噁心及嘔吐、皮膚粘膜、及心臟作用。
吉西他濱為指定為2’－脫氧－2’,2’－雙氟胞苷的學名，其 係商業提供為單鹽酸鹽、及為β－異構物。吉西他濱係揭示於美國專利第4,808,614及5,464,826號，其係併入本文做為在如何合成及使用吉西他濱於治療可疑癌症之參考，吉西他濱鹽酸做為單一試劑的商業配方係為具局部晚期或轉移性胰臟或肺癌(NSCLC)的病人之第一線治療，及係常用於先前以5－氟尿嘧啶治療的病人。
除非另外說明，此處及後文所使用一般名稱較佳為在本揭示內文內具下列意義： 單數形式”一種”、”一”、及”該”包含複數個參考物件，除非文中清楚表示。
名稱”一種抗腫瘤藥物”係與”一種化療劑”或是”一種抗癌劑”有相同意義及係表示治療劑，其係由抑制或防止腫瘤生長而作用。名稱”一種抗腫瘤藥物”或”一種抗癌劑”一般係表示防止癌細胞倍增的化合物(亦即抗增生劑)。一般，抗腫瘤藥物分為兩類，抗增生細胞毒性及抗增生細胞穩定，細胞毒性劑藉由：(1)干擾細胞複製DNA的能力及(2)誘發癌細胞中細胞死亡及/或凋亡而防止癌細胞倍增。抗增生細胞穩定劑係經由調節、干擾或抑制調節細胞增生的細胞信號轉導的方法而作用。在本發明包含於本發明醫藥組合的抗腫瘤藥物為細胞毒性劑及於是係稱為細胞毒性抗腫瘤藥物。
如此處所使用，名稱”相乘”表示使用本發明方法及組合所達到的效果大於分別使用細胞毒性抗腫瘤藥物或是其醫藥可接受鹽類，及分子式I的CDK抑制劑或其醫藥可接 受鹽類或溶劑化物所得到效果的總和。有利的是，此種協同作用於相同劑量提供更大效用，及/或防止或延遲多重藥物抗藥性的累積。
如此處所使用名稱”醫療有效量”係表示一種化療劑的量，其以對非增生細胞的最小毒性提供增生細胞的最大凋亡。
名稱”凋亡”係表示一種形式的細胞死亡，其中細胞中一系列分子步驟導致其死亡，其為免除不需要或是不正常細胞的身體正常途徑，此凋亡方法可在癌症細胞中受阻，亦稱為程序性細胞死亡。(癌症名稱字典，國家癌症機構)。
當用於此處時名稱”增加凋亡”係定義為在程序性細胞死亡速率的增加，亦即更多細胞誘發為死亡方法當與暴露於(接觸)單獨細胞毒性抗腫瘤藥物或是單獨CDK抑制劑相較。
當用於此處時名稱”個體”，係表示一種動物，較佳為哺乳動物，最佳為人類，其已為治療、觀察或實驗的目標。
在一個具體實施例，本發明係關於一種治療癌症的新穎醫藥組合，其中該組合物包含一種由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或吉西他濱或是其醫藥可接受鹽類所組成族群選出的細胞毒性抗腫瘤劑及至少一種由分子式I化合物(如此處所敘述)或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的細胞週期依賴激酶(CDK)抑制劑。
在一個具體實施例，包含如此處所敘述的分子式I的CDK抑制劑及細胞毒性抗腫瘤藥物的醫藥組合物，並非獨 獨限於由該成分的物理締合所得到的這些組合，而是亦包含允許個別投藥的這些組合，個別投藥可為同時的、循序的或是間隔一段時間以得到組合的最大效用。於是，該醫藥組合物可同時或是間隔一段時間投藥以得到有效癌症治療。
為本發明目的，由分子式I化合物所選出的CDK抑制劑可在，例如，細胞毒性抗腫瘤藥物之前、之後或是與之同時投藥。在本發明較佳具體實施例，該細胞毒性抗腫瘤藥物或是其醫藥可接受鹽類，係在分子式I的CDK抑制劑或是其醫藥可接受鹽類或溶合物投藥之前以下文所敘述劑量範圍投藥。然而，在已知條件下CDK抑制劑及細胞毒性抗腫瘤藥物的投藥之最適方法及順序可由熟知該技藝者藉由本專利說明書所包含的下列常用技術及資訊適當地選擇。
在一個具體實施例，包含於該組合物的成分因為其不同的物理及化學性質必需由各種路徑投藥。例如，分子式I的CDK抑制劑可口服或是非腸道地投藥以產生及維持其良好血液含量，且細胞毒性抗腫瘤藥物可藉由靜脈注射、皮下或是肌肉內途徑非腸道地投藥。
為口服目的，分子式I的CDK抑制劑可例如以錠劑或膠囊、粉末、可分散粉粒、或是扁囊劑的形式、或是以水性溶液或懸浮液投藥。在口服用定劑的情況，較常使用的載液包含乳糖、玉米澱粉、碳酸鎂、滑石及糖，及常加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。為以膠囊形式口服投藥，有用載液 包含乳糖、玉米澱粉、碳酸鎂、滑石、及糖。
為肌肉內、腹膜內、皮下及靜脈注射使用，總是使用活性成分(細胞毒性抗腫瘤藥物或CDK抑制劑)的無菌溶液，及溶液pH應適當調整及緩衝。
在另一個具體實施例，本發明係關於一種癌症治療方法，此方法包含將醫療有效量的該組合物投藥至需要此種治療的病人。於是，在本發明方法，癌症係藉由投藥有效於治療癌症的醫療量的細胞毒性抗腫瘤藥物，與醫療有效量的自分子式I化合物或是其醫藥可接受鹽類或溶合物所選出的CDK抑制劑之組合至該個體而於個體治療，其中相乘效果產生。
如此處所指出，包含於該醫藥組合物的活性成分可同時或循序投藥。
於是，根據本發明，該癌症治療方法係包含將醫療量的細胞毒性抗腫瘤藥物同時與醫療量的由分子式I化合物所表示的CDK抑制劑投藥至需要此種治療的病人。
在一個具體實施例，該癌症治療方法係包含循序投藥醫療量的細胞毒性抗腫瘤藥物及醫療量的由分子式I化合物所表示的CDK抑制劑至需要此種治療的病人。
在另一個具體實施例，該癌症治療方法係包含在投藥由分子式I化合物所表示的CDK抑制劑之前投藥醫療量的細胞毒性抗腫瘤藥物至需要此種治療的病人。
本發明方法及醫藥組合可用於由包含乳癌、肺癌(包含小及非小細胞肺癌及肺細胞腺癌)、卵巢癌、胰臟癌(包含胰 腺癌)、胃癌、大腸癌及肝癌所組成族群選出的癌症之治療。
在較佳具體實施例，本發明醫藥組合物可用於自非小細胞肺癌及胰臟癌所選出的癌症之治療。
包含於該組合物的活性成分之實際劑量可依據病人的要求及要治療情況的嚴重性而變化，特定情況的適當劑量之決定係在該技藝知識內，一般，治療係使用較小劑量開始，此較小劑量係小於該化合物的最適劑量，之後，每一個成分的劑量係以少量增加直到達到環境下得最適效果，然而，醫藥組合物中每一個成分的量典型上小於若單獨投藥時會產生醫療效果的量。方便起見，若希望時總每日劑量可於白天期間分配及分次投藥。在較佳具體實施例中，該細胞毒性抗腫瘤藥物或其醫藥可接受鹽類，及由分子式I化合物所表示的CDK抑制劑或是其醫藥可接受鹽類或溶合物係以可注射型是循序投藥，使得細胞毒性抗腫瘤藥物係以範圍自10毫克至1400毫克，較佳為範圍自15毫克至1000毫克的相乘有效劑量投藥且CDK抑制劑係以範圍自5毫克至750毫克，較佳為範圍自10毫克至300毫克的相乘有效劑量投藥。
在本發明一個較佳具體實施例，當細胞毒性抗腫瘤藥物係為太平洋紫杉醇，其係以範圍自30毫克至300毫克的相乘有效劑量投藥。
在本發明另一較佳具體實施例，當細胞毒性抗腫瘤藥物係為多西紫杉醇，其係以範圍自20毫克至175毫克的相乘有效劑量投藥。
在本發明另一較佳具體實施例，當細胞毒性抗腫瘤藥物係為阿霉素，其係以範圍自17.5毫克至75毫克的相乘有效劑量投藥。
在本發明另一較佳具體實施例，當細胞毒性抗腫瘤藥物係為吉西他濱，其係以範圍自70毫克至1200毫克的相乘有效劑量投藥。
由本發明所提供的組合已在某些研究系統，及在許多不同投藥計畫活體外評估，實驗細節係如下文所提供，此處所呈現數據清楚顯示當與分子式I的CDK抑制劑組合時細胞毒性抗腫瘤藥物顯現相乘效果。結果清楚地顯示與當細胞以單獨使用分子式I的CDK抑制劑或是單獨細胞毒性抗腫瘤藥物治療時相較，當以組合用於癌症治療時抗癌劑增加增生細胞中的凋亡或細胞毒性，例如，由表2－4所提供數據可清楚地觀察到CDK抑制劑，分子式I的代表性化合物此處命名為化合物A，在對非小細胞肺癌H－460細胞的活體外分析中相乘地增加阿霉素的細胞毒性。
代表性化合物，用於藥理分析的化合物A係表示(＋)－反式－2－(2－氯－苯基)－5,7－二羥基－8－(2－羥甲基－1－甲基－吡咯烷－3－基)－苯並吡喃－4－酮鹽酸及係為揭示於公開PCT專利申請案WO2004004632的化合物中的一個，其係併入此處做為參考。
本發明者亦建立異種移植模型以延伸活體外觀察至活體內系統，本發明者使用SCID(重度合併性免疫缺陷)雄性老鼠的非小細胞肺部異種移植模型測試本發明組合的活體 內效用，觀察到當與阿霉素以循序組合方式投藥時CDK抑制劑相乘地增強阿霉素的效用，其可由在第7a及7b圖的圖式表示明顯可見本發明醫藥組合物於SCID老鼠的非小細胞肺部異種移植模型顯現醫療相乘活性。
在由本發明者所進行的平行活體外研究涉及使用包含習知細胞毒性抗腫瘤藥物、阿霉素及另一種已知CDK抑制劑，夫拉平度的組合於人類非小細胞肺癌H－460細胞系的治療，發現與投藥順序無關阿霉素與夫拉平度的組合產生累加效應及未顯現相乘性(表16－A、B、C)，此研究的細節係說明於下文，於是，無法無疑問地預期具不同作用機構的抗癌劑之組合總是可產生有利醫療效果。然而，本發明者已清楚證實本發明新穎醫藥組合的相乘效用。
包含細胞毒性抗腫瘤藥物及CDK抑制劑的本發明組合之相乘效果現在參考其較佳具體實施例更詳細解釋。要注意這些具體實施例係僅提供做為實例及不在用於限制本發明。
藥理分析：
活體外細胞毒性分析：
所使用細胞毒性分析為MTS(3－(4,5－二甲基噻唑－2－基)－5－(3－羧甲氧基苯基)－2－(4－磺基苯)－2H－四唑，惰性鹽類)研究。人類非小細胞肺癌H－460細胞係於96－孔培養板以1500細胞/孔的密度於180微升培養介質播種及培養過夜以允許細胞黏附。在單一藥物暴露情況包含於組合物的各種藥物濃度係加至孔中及於加濕5%CO2 培養箱於37℃培養 一段適當時間。當使用兩種藥物治療時投藥習知細胞毒性抗腫瘤藥物(太平洋紫杉醇、多西紫杉醇及阿霉素)3小時或24小時接著移出介質及使用介質洗細胞一次，在洗細胞之後，將兩種不同濃度的化合物A加至孔中及將培養板於加濕5%CO2 培養箱於37℃培養48、72或96小時。控制孔係使用載劑處哩，在培養期間結束時，自孔移出介質及將20微升的MTS(2毫克/毫升於磷酸鹽緩衝溶液，pH 6－6.5及經過濾器殺菌)及1微升的吩嗪硫酸甲脂(PMS，3毫莫耳濃度於磷酸鹽緩衝溶液，pH 7.3及經過濾器殺菌)加至每一個孔及使用完全培養基將總體積調整至200毫升，將培養板於加濕5%CO2 培養箱於37℃培養2－4小時。培養板於分光光度計(SpectraMax，分子裝置)在490奈莫耳濃度讀取；百分率細胞毒性及IC50係使用SoftMax，SpectraMax的軟體計算得到。
實例1：
此實例顯示阿霉素及化合物A的組合之相乘效果，其中阿霉素及化合物A係依序投藥使得阿霉素在化合物A之前投藥。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一，亦即單獨使用阿霉素或化合物A處理，阿霉素處理係對前24小時接著為完全培養基72小時，然而在化合物A的情況下前24小時係於完全培養基接著為化合物A72小時。所使用阿霉素的濃度為100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度然而化合物A係以800奈莫耳濃度(在48小時處理之後的IC30 濃度)的濃度使用。 在組合研究，細胞先使用200奈莫耳濃度或100奈莫耳濃度阿霉素處理前24小時接著為800奈莫耳濃度化合物A72小時，在藥物處理完成後亦即在96小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表1。
實例2：
此實例顯示阿霉素及化合物A的組合之相乘效果，其中阿霉素及化合物A係依序投藥使得阿霉素在化合物A之前投藥。在此實例化合物A係以1200奈莫耳濃度的濃度使用。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一，亦即單獨使用阿霉素或化合物A處理，阿霉素處理係對前24小時接著為完全培養基72小時，然而在化合物A的情況下前24小時係於完全培養基接著為化合物A72小時。所使用阿霉素的濃度為200奈莫耳濃度及100奈莫耳濃度，然而化合物A係以1200奈 莫耳濃度(在48小時處理之後的IC50 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用100奈莫耳濃度或200奈莫耳濃度阿霉素處理24小時接著為1200奈莫耳濃度化合物A72小時，在藥物處理完成後亦即在96小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表2。
實例3：
此實例顯示阿霉素及化合物A的組合之相乘效果，其中阿霉素及化合物A係依序投藥使得阿霉素在化合物A之前投藥。在此實例化合物A係以1200奈莫耳濃度的濃度使用及服藥時間為96小時。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或化合物A，阿霉素處理係對前24小時接著為完全培養基96小時，然而在化合物A的情況下，前24小時係於完全培養基接著為化合物A96小時。所使用 阿霉素的濃度為100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度，然而化合物A係以1200奈莫耳濃度(在48小時處理之後的IC50 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用100奈莫耳濃度或200奈莫耳濃度阿霉素處理24小時接著為1200奈莫耳濃度化合物A96小時，在藥物處理完成後亦即在120小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表3。
實例4：
此實例顯示阿霉素及化合物A同時投藥120小時的組合之相乘效果，人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一治療，亦即單獨使用阿霉素或化合物A，每一個為處理120小時。所使用阿霉素的濃度為30奈莫耳濃度及100奈莫耳濃度，然而化合物A係以800奈莫耳濃度及1200奈莫耳濃度(在48小時治療之後的~IC30 及~IC50 濃度)的濃度使用。在此組合研 究，分別為30奈莫耳濃度或100奈莫耳濃度阿霉素及1200奈莫耳濃度或800奈莫耳濃度化合物A一起加入120小時，在藥物治療完成後亦即在120小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表4。
實例5：
此實例顯示當化合物A在細胞毒性抗腫瘤藥物，阿霉素，之前投藥時沒有任何相乘效果，人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或化合物A，化合物A處理係對前96小時接著為完全培養基24小時，然而在阿霉素的情況下，前96小時係於完全培養基接著為阿霉素24小時。所使用阿霉素的濃度為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度，然而化合物A係以800奈莫耳濃度及1200奈莫耳濃度(在48小時處理之後的~IC30 及~IC50 濃度)的濃度使用。在組合研究，先加入1200 奈莫耳濃度或800奈莫耳濃度的化合物A96小時接著為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度或200奈莫耳濃度的阿霉素24小時，在藥物處理完成後亦即在120小時結束時，將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。表6顯示在此組合中百分率細胞毒性較化合物A的細胞毒性為小當單獨投藥化合物A時。所以此順序效應為拮抗的，因為阿霉素不會使第一種藥物，在此情況第一種藥物為化合物A，的效果為可能。結果示於下表5。
實例1－4清楚地顯示當CDK抑制劑在細胞毒性劑之後投藥或與之同時投藥時CDK抑制劑相乘地使阿霉素的效果為可能。實例5亦顯示循序治療的重要性。發現使用阿霉素接著為CDK抑制劑的治療係為相乘的然而相反順序則不為有效的。
實例6：
此實例顯示阿霉素及化合物A的組合之相乘效果，其中阿霉素及化合物A係依序投藥使得阿霉素在化合物A之前投藥。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以3000細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或化合物A，阿霉素處理係對前3小時接著為完全培養基45小時，然而在化合物A處理的情況下，前3小時係於完全培養基接著為化合物A進行下一個45小時。所使用阿霉素的濃度為0.1奈莫耳濃度及3奈莫耳濃度，然而化合物A係以700奈莫耳濃度(在48小時處理之後的~IC30 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用0.1奈莫耳濃度及3奈莫耳濃度阿霉素處理3小時接著為700奈莫耳濃度化合物A 45小時，在藥物處理完成後亦即在48小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表6。
實例7：
此實例顯示阿霉素及化合物A的組合之相乘效果，其中阿霉素及化合物A係依序投藥使得阿霉素在化合物A之前投藥。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以3000細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或化合物A，阿霉素處理係對前3小時接著為完全培養基45小時，然而在化合物A處理的情況下，前3小時係於完全培養基接著為化合物A進行下一個45小時。所使用阿霉素的濃度為0.1奈莫耳濃度及3奈莫耳濃度，然而化合物A係以1000奈莫耳濃度(在48小時處理之後的~IC50 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用0.1奈莫耳濃度或3奈莫耳濃度阿霉素處理3小時接著為1000奈莫耳濃度化合物A 45小時，將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表7。
實例8：
此實例顯示太平洋紫杉醇及化合物A的組合之相乘效果，其中太平洋紫杉醇及化合物A係依序投藥使得太平洋紫杉醇在化合物A之前投藥。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用太平洋紫杉醇或化合物A，太平洋紫杉醇處理係對前3小時接著為完全培養基45小時，然而在化合物A處理的情況下，前3小時係於完全培養基接著為化合物A進行下一個45小時。所使用太平洋紫杉醇的濃度為10奈莫耳濃度然而化合物A係以700奈莫耳濃度(在48小時處理之後的~IC30 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用10奈莫耳濃度的太平洋紫杉醇處理3小時接著為700奈莫耳濃度的化合物A 45小時，在藥物處理完成後亦即在48小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表8。
實例9：
此實例顯示吉西他濱及化合物A的組合之相乘效果，其中吉西他濱及化合物A係依序投藥使得吉西他濱在化合物A之前投藥。自人類胰臟(Panc－1)細胞系的細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用吉西他濱或化合物A，吉西他濱處理係對前24小時接著為完全培養基72小時，然而在化合物A處理的情況下，前24小時係於完全培養基接著為化合物A進行下一個72小時。吉西他濱係於70奈莫耳濃度的濃度使用然而化合物A係以300奈莫耳濃度(在48小時處理之後的~IC30 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用70奈莫耳濃度的吉西他濱處理24小時接著為300奈莫耳濃度的化合物A 72小時，在藥物處理完成後亦即在96小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於下表9。
細胞週期分布及流式細胞技術的分析
人類非小細胞肺癌H－460係播種於25毫米3 細胞培養瓶，24小時後，單獨使用化合物A處理細胞72小時或96小時及單獨使用細胞毒性抗腫瘤劑，阿霉素處理24小時。對組合研究，細胞先使用細胞毒性抗腫瘤劑，阿霉素處理24小時接著在移除細胞毒性抗腫瘤劑之後使用化合物A處理72小時或96小時及以PBS洗細胞兩次，控制組細胞保持未處理96小時或120小時。脫離及黏著細胞係皆在不同時間點得到，使用約5毫升PBS洗細胞兩次並在1000轉每分鐘離心10分鐘，將細胞再次懸浮於500微升PBS及固定於500微升冰冷70%乙醇。經固定細胞於室溫培養30分鐘，在1000轉每分鐘旋轉10分鐘。將1毫升冷凍70%乙醇加至細胞粒及將該細胞粒放於冷凍庫直到進一步分析。使用PBS洗細胞兩次以移除固定劑及再次懸浮於250微升PBS，於此加入50微升碘化丙啶(4毫克/毫升於PBS)及加入12.5微升Rnase A(1毫克/毫升)，於37℃培養30分鐘之後，使用流式細胞技術分析細胞。
BeCton Dickinson FACS Calibur流式細胞儀係根據廠商建議使用，設定於488奈米的氬離子雷射係用做激發來源，具DNA含量在2n及4n之間的細胞係命名為細胞週期的G1 、S及G2 /M階段，如由紅色螢光位準所定義，顯現少於2n DNA含量的細胞係指定為次－G1 細胞，在每一個細胞週期的細胞數目係以所存在總細胞數目的百分率表示。
實例10：
此實例給予各種治療的細胞週期分布，如在第1圖所示。約1－2 x 106 細胞係播種於細胞培養瓶做為治療組。研究流程係如上文”細胞週期分布及流式細胞技術的分析”所提及。細胞週期分為四部份，在第1圖係表示為M1、M2、M3及M4，M1係對應於G1階段，M2係對應於S階段，M3係對應於G2－M階段及M4係對應於次G1階段，此階段表示細胞進行凋亡。沒有任何藥物治療的96小時控制組顯示僅2%的可忽略凋亡，然而使用僅一種藥物的治療組顯示對單獨化合物A及阿霉素的治療皆為僅10%的凋亡，兩種藥物的組合顯示34%的增加凋亡。
實例11：
此實例給予各種治療組的細胞週期分布，如在第2圖所示。約1－2 x 106 細胞係播種於細胞培養瓶做為治療組。 研究流程係如上文”細胞週期分布及流式細胞技術的分析”所提及。細胞週期分為四部份，其在該圖係表示為M1、M2、M3及M4，M1係對應於G1階段，M2係對應於S階段，M3係對應於G2－M階段及M4係對應於次G1階段，此階段表示細胞進行凋亡。沒有任何藥物治療的120小時控制組顯示僅8%的可忽略凋亡，然而使用僅一種藥物的治療組顯示對單獨化合物A及阿霉素的治療分別為32%及3%的凋亡，兩種藥物的組合顯示65%的增加凋亡。
實例12：
此實例給予各種治療組的細胞週期分布，如在第3圖所示。約1－2 x 106 的胰臟細胞(Panc－1)係播種於細胞培養瓶 做為治療組。研究流程係如上文”細胞週期分布及流式細胞技術的分析”所提及。細胞週期分為四部份，其在該圖係表示為M1、M2、M3及M4，M1係對應於G1階段，M2係對應於S階段，M3係對應於G2－M階段及M4係對應於次G1階段，此階段表示細胞進行凋亡。沒有任何藥物治療的96小時控制組顯示僅2.1%的可忽略凋亡，然而使用僅一種藥物的治療組顯示對單獨化合物A及吉西他濱的治療分別為4.3%及1.7%的凋亡，兩種藥物的組合顯示25.4%的增加凋亡。
實例13：
Annexin V－FITC染色(早期凋亡的偵測)
Annexin V－FITC為一種辨識凋亡細胞的敏感探針，在早期凋亡期間薄膜磷脂絲氨酸磷脂(PS)係由血漿薄膜的內部改變位置至外部小葉，於是暴露PS於外部細胞環境。鈣依賴性磷脂結合蛋白V(Annexin V)為一種35－36 kDa磷脂鈣結合蛋白，其具對PS的高親和力及使用暴露的PS連結至細胞。碘化丙啶(PI)係為一種極性染料，其經由滲透薄膜進入細胞及於是與FITC一同使用已偵測晚期凋亡。
人類非小細胞肺癌H－460係播種於25毫米3 細胞培養瓶，24小時後，細胞係單獨以1200奈莫耳濃度的化合物A或是100奈莫耳濃度的阿霉素分別治療96小時及24小時。對組合研究，細胞先使用100奈莫耳濃度的細胞毒性抗腫瘤，阿霉素，治療24小時，在移除細胞毒性抗腫瘤(阿霉素)及使用介質洗細胞一次之後接著為1200奈莫耳濃度化合物 A 96小時。控制組細胞保留未經處理120小時。在於不同時間點使用胰蛋白酶收穫之後收集包含游離細胞的介質及使用貼附性細胞，使用冷PBS洗細胞兩次及於1000轉每分鐘離心10分鐘，將細胞粒以1 x 106 細胞/毫升的濃度再次懸浮於1x結合緩衝液(10毫米HEPES pH 7.4，140毫莫耳濃度NaCl，2.5毫莫耳濃度CaCl2 )。100微升該溶液(1 x 105 細胞)係使用Annexin V－FITC及碘化丙啶染色，細胞係於室溫於黑暗處培養15分鐘及將樣品以流式細胞技術分析。
BeCton Dickinson FACS Calibur流式細胞儀係根據廠商建議用於這些研究，設定於488奈米的氬離子雷射係用做激發來源。第4圖以四個象限顯示細胞分佈，位於左下角側(LL)的象限1顯示細胞，其為FITC及PI負的(此顯示細胞為健康的)。位於右下角側(LR)的象限II顯示細胞，其為僅PI為正的(此顯示這些細胞為完全凋亡的)。在右上角(UR)的象限III顯示annexin及PI皆為正的細胞(此顯示這些細胞由早期凋亡進入晚期凋亡)。在左上角(UL)的象限IV顯示僅annexin為正的細胞(此顯示這些細胞係在早期凋亡)。若甚至在化合物暴露結束後細胞仍持續進入凋亡，它們會對annexin為染色陽性，該細胞一旦在早期凋亡會付諸於程序性細胞死亡及在一種不會回復的位置。結果係示於表10，發現在組合中的最高細胞百分率為在早期或早期至晚期凋亡與單獨一種藥物相較。
實例14：
同本繁殖分析：
人類非小細胞肺癌細胞(H－460)係以750－1000細胞每35毫米細胞等級培養盤的密度播種，於37℃培養過夜以使細胞附著於培養盤，細胞先使用細胞毒性抗腫瘤劑治療24小時接著為洗細胞及加入包含化合物A的新鮮介質96小時。在治療結束後介質再次以包含10% FCS的新鮮完全介質置換及培養7－14天以進行集落形成，一旦肉眼可見集落出現於培養盤，移除介質及使用比值為2：1的甲醇：醋酸混合物固定集落5分鐘。以水洗培養盤及重複固著步驟，乾燥培養盤及使用0.1%結晶紫染色集落3－5分鐘，使用水小心地輕洗培養盤、乾燥及於Geldoc上計算集落。
單獨使用1200奈莫耳濃度的化合物A或100奈莫耳濃 度的阿霉素分別處理細胞96小時及24小時或是以100奈莫耳濃度的阿霉素接著為1200奈莫耳濃度的化合物A的組合處理細胞96小時。第5圖顯示組合的相乘效果因為與控制組或是單獨藥物的其中一個相較在組合僅見到一個集落。
治療後恢復實驗
單獨使用化合物A或阿霉素或是以組合處理細胞的分析流程與在細胞週期分布的分析中所敘述的相同。在藥物處理之後，將細胞於包含10% FCS的新鮮完全介質中恢復，對單獨藥物及組合處理由FACS於0、6、18、24及48小時的時間點分析在恢復的細胞。在下列實例中，細胞的恢復係由進行凋亡的細胞百分率表示。
實例15：
細胞係僅使用細胞毒性抗腫瘤劑，阿霉素處理24小時接著為移除介質及使用新鮮完全介質置換。在藥物處理結束之後於恢復期間以在特定於決定進行凋亡的細胞百分率之方法中所敘述的進行FACS分析。在恢復期間凋亡係於0、6、18、24及48小時決定。在藥物治療24小時結束時凋亡百分率為3%，在恢復期間此值未顯著增加表示細胞最終自藥物處理恢復。結果係如表11所示。
實例16：
該研究係如在流程中所敘述執行，細胞係僅使用化合物A處理96小時接著為移除介質及使用新鮮完全介質置換。在藥物處理結束之後於恢復期間以決定進行凋亡的細胞百分率之方法中所敘述的進行FACS分析。在恢復期間凋亡係於0、6、18、24及48小時決定。在藥物治療96小時結束時凋亡百分率為32%，在恢復48小時結束時於恢復期間此值自24%減少至19%，表示細胞隨恢復時間增加而逐漸恢復。結果係如表12所示。
實例17：
該研究係如在流程中所敘述執行，細胞係使用阿霉素處理24小時接著為使用化合物A處理96小時接著移除介質及使用新鮮完全介質置換。在藥物處理結束之後於恢復期間以決定進行凋亡的細胞百分率之方法中所敘述的進行FACS分析。在恢復期間凋亡係於0、6、18、24及48小時決定。在藥物治療結束時凋亡百分率為55%，在恢復期間於6小時結束時額外32%進入凋亡，在48小時恢復結束時此增加至57%，表示在恢復期間細胞不會恢復而是持續進行凋亡。結果係如表13所示。
實例18：
西方轉漬法分析
人類非小細胞肺癌(H－460)細胞係為未經治療的亦即控制細胞或是單獨以100奈莫耳濃度阿霉素治療24小時或單獨使用1200奈莫耳濃度化合物A治療96小時。在組合治 療，細胞先以100奈莫耳濃度阿霉素治療24小時接著以1200奈莫耳濃度化合物A治療96小時。在治療期間結束時溶解細胞及使用Bradford試劑估計溶解產物的蛋白含量。將40微克蛋白質負載於SDS－PAGE及轉移於PVDF薄膜，薄膜以p53、Bax、Bcl－2、細胞週期素D1 、Cdk1及肌動蛋白抗體研究，初級抗體係使用山葵過氧化酶二級抗體偵測及進行west pico化學發光試劑。
第6圖顯示涉及細胞週期調節及凋亡的各種蛋白質之西方轉漬法分析，將相等量的蛋白質放置於四個泳道，放置於孔中的不同樣品係敘述於圖示說明。結果顯示抗凋亡蛋白質Bcl－2在組合治療顯著向下調節當與單獨一種藥物相較時(其幾乎相當於控制組)，此與FACS分析中在組合治療所見到的增加凋亡相關聯。在所有治療樣品中前凋亡蛋白質Bax係相關於控制組些微向上調節。與控制組相較在組合治療腫瘤抑制劑蛋白質p53顯著向上調節，但是在其他兩個治療組並未如此顯著向上調節。Cdk1－B1為一種有絲分裂的起始劑，此酵素的去調節造成腫瘤發生。所以抑制Cdk1會抑制其活性及因而有絲分裂的起始及細胞增生。該圖顯示阿霉素顯著誘發Cdk1含量然而化合物A的添加降低Cdk1至可忽略的含量於是防止細胞進行有絲分裂，單單化合物A顯示含量等於控制組，細胞週期素D1 含量在各種治療組並未顯示顯著變化，在組合治療含量相當於控制組但在單獨化合物A及阿霉素可見含量的些微減少。
實例19：
此實例顯示非小細胞肺(H－460)異種移植模型中阿霉素及CDK抑制劑，化合物A的組合物中活體內效用測試。
由American Type Culture Collection(ATCC),USA所得到的人類非小細胞肺癌(H－460)細胞系係用於此研究，用於腹膜投藥的阿霉素及化合物A係由溶解化合物於生理食鹽水而製備。
使用一組6－8週大重量~20公克的36隻重度合併性免疫缺陷SCID雄性老鼠。
人類非小細胞肺癌(H－460)細胞係於包含10%胎牛血清的RPMI 1640介質於5%CO2 培養箱在37℃生長。細胞係由在1000轉每分鐘離心10分鐘而製粒，將細胞再次懸浮於生理食鹽水以得到25 x 106細胞每毫升的計數，0.2毫升的此細胞懸浮液係由皮下(s.c.)路徑注射於SCID老鼠。每兩天觀察老鼠的可觸摸腫瘤質體，一旦腫瘤質體大小達到5－7毫米直徑的尺寸，將動物隨機排列為個別治療組如在下表14所示。每週投藥阿霉素一次然而每天投藥化合物A一次投藥5天如在表15所示，第一劑阿霉素之後6小時間隔接著為化合物A，接著為每天投藥化合物A進行5天，此構成一個循環。在兩天間隔之後下一個循環開始，治療包含總共兩個循環，每天記錄體重，每兩天記錄腫瘤尺寸及其他毒性徵兆，未觀察到任何顯著重量減少或是病態徵兆，腫瘤重量(毫克)係根據扁長橢面的公式：{長度(毫米)x[寬度(毫米)2 ]x 0.5}估計假設比重為一及π為三，在經化合物 治療的動物之腫瘤生長係計算為T/C(經治療/控制)x 100%及生長抑制百分率(GI%)為[100－T/C%]。結果圖示地表示於第7a、7b、8及9圖。
S－生理食鹽水，p－化合物A，D－阿霉素M、T、W、T及F：週的天(星期一、星期二、星期三、星期四及星期五)“>”表示阿霉素係在化合物A之前投藥。
實例20：
使用COX－2抗體的西方轉漬法分析
第9圖顯示使用COX－2抗體的西方轉漬法分析，放置於孔中的不同樣品係敘述於圖示說明。結果顯示：控制組顯示COX－2的基礎水平，其為低的。
單獨化合物A亦顯示低含量的COX－2。
阿霉素強烈誘發COX－2，其係負責經由NF發信號投途徑的化療耐藥性。
在阿霉素之後添加化合物A顯著向下調節COX－2。
所以，人類非小細胞肺癌(H－460)腫瘤異種移植中藉由化合物A的COX－2之NF媒介抑制會涉及抑制腫瘤生長及阿霉素誘發的化療耐藥性。
實例21：
人類非小細胞肺癌細胞系(H－460)中阿霉素及夫拉平度的組合研究
此實例顯示當夫拉平度在細胞毒性抗腫瘤藥物，阿霉素之後(表16A)、之前(表16B)或是伴隨(表16C)投藥時都不會有相乘效果。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，根據表16A細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或夫拉平度，阿霉素處理係對前 24小時接著為完全培養基96小時，然而在夫拉平度的情況下，前24小時係於完全培養基接著為夫拉平度96小時。所使用阿霉素的濃度為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度，然而夫拉平度係以200奈莫耳濃度及350奈莫耳濃度(分別在48小時治療之後的IC30 及IC50 濃度)的濃度使用。在組合研究，細胞先使用30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度的阿霉素處理24小時接著為200奈莫耳濃度及350奈莫耳濃度的夫拉平度96小時，在藥物處理完成後亦即在120小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於表16A。
根據表16B細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或夫拉平度，夫拉平度治療係對前96小時接著為完全培養基24小時，然而在阿霉素的情況下，前96小時係於完全培養基接著為阿霉素24小時。所使用阿霉素的濃度為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度，然而夫拉平度係以200奈莫耳濃度及350奈莫耳濃度(在48小時治療之後的~IC30 及~IC50 濃度)的濃度使用。在組合研究，於前96小時先加入200奈莫耳濃度或350奈莫耳濃度的夫拉平度接著為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度或200奈莫耳濃度的阿霉素治療24小時，在藥物處理完成後亦即在120小時結束時，將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於表16B。
表16C顯示阿霉素及夫拉平度的組合同時投藥120小時沒有任何相乘效果。人類非小細胞肺癌H－460細胞係以1500細胞/孔的密度播種，細胞先單獨以藥物之一處理，亦即單獨使用阿霉素或夫拉平度每一個處理120小時。所使用阿霉素的濃度為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度及200奈莫耳濃度，然而夫拉平度係以200奈莫耳濃度及350奈莫耳濃度(48小時治療之後的~IC30 及~IC50 濃度)的濃度使用。在此組合研究，分別為30奈莫耳濃度、70奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度或200奈莫耳濃度的阿霉素及200奈莫耳濃度或350奈莫耳濃度的夫拉平度加在一起120小時，在藥物處理完成後亦即在120小時結束時將培養板進行MTS活力分析及與控制組相較計算百分率細胞毒性。結果示於表16C。
Doxo‧‧‧阿霉素
Annexin‧‧‧鈣依賴性磷脂結合蛋白
第1圖 說明阿霉素及化合物A的組合於H－460非小細胞肺細胞之活體外治療顯現相乘。圖A、B、C及D表示不同治療族群的細胞循環分佈，這些族群分別稱之為控制(於96小時)、單獨200奈莫耳濃度的阿霉素(於24小時)、單獨800奈莫耳濃度的化合物A(於72小時)及包含投藥200奈莫耳濃度阿霉素(於24小時)接著800奈莫耳濃度化合物A(於72小時)之組合。
第2圖 說明阿霉素及化合物A的組合於H－460非小細胞肺細胞之活體外治療顯現相乘。圖A、B、C及D表示不同治療族群的細胞循環分佈，這些族群分別稱之為控制(於120小時)、單獨100奈莫耳濃度的阿霉素(於24小時)、單獨1200奈莫耳濃度的化合物A(於96小時)及包含投藥100奈莫耳濃度阿霉素(於24小時)接著1200奈莫耳濃度化合物A(於96小時)之組合。
第3圖 證實吉西他濱及化合物A的組合於胰臟(Panc－1)細胞之活體外治療產生相乘活性。圖A、B、C、D及E表示不同治療族群的細胞循環分佈，這些族群分別稱之為控制(於24小時)、控制(於96小時)、單獨70奈莫耳濃度的吉西他濱(於24小時)、單獨300奈莫耳濃度的化合物A(於72小時)及包含投藥70奈莫耳濃度吉西他濱(於24小時)接著300奈莫耳濃度化合物A(於72小時)之組合。
第4圖 證實在使用Annexin V染色治療120小時結束時阿霉素接著化合物A的相乘組合中早期凋亡之偵測。圖A、 B、C及D顯示不同治療族群的四個象限之細胞分佈，這些族群分別稱之為控制(於120小時)、單獨1200奈莫耳濃度的化合物A(於96小時)、單獨100奈莫耳濃度的阿霉素(於24小時)及包含投藥100奈莫耳濃度阿霉素(於24小時)接著1200奈莫耳濃度化合物A(於96小時)之組合。
第5圖 說明當於同本繁殖實驗測試時阿霉素及化合物A的組合於H－460非小細胞肺細胞之活體外治療顯現相乘性。
第6圖 顯示涉及細胞循環調節及凋亡的各種蛋白質的西方轉漬分析。
第7a圖 說明H－460異種移植模型中自人類非小細胞肺癌(H－460)細胞的阿霉素(2 mpk)及化合物A(20 mpk)組合活體內效用。
第7b圖 說明H－460異種移植模型中阿霉素(2 mpk)及化合物A(35 mpk)組合活體內效用。
第8a & 8b圖 顯示在治療結束時平均腫瘤重量及在研究結束時在每一組自個別老鼠的8個腫瘤的SE(條狀)，在治療結束時百分率生長抑制(GI)係於每一個條狀頂部對個別組表示。使用成對t測試以評估在不同治療組之間差異的統計顯著性，統計顯著差異在P<0.05係考慮為存在。
第9圖 表示使用COX－2抗體的西方轉漬。
Doxo‧‧‧阿霉素

Claims (11)

  1. 一種醫藥組合，其包含一種由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、及吉西他濱所組成族群選出的細胞毒性抗腫瘤劑；及一種CDK抑制劑或是其對映異構物或是醫藥可接受鹽類，其中該CDK抑制劑係由下列分子式I所表示； 其中Ar係為苯基，其為未經取代的或是由1或2個相同或不同取代基所取代，取代基係選自氯及三氟甲基；該醫藥組合係用於由乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰臟癌、胃癌、大腸癌及肝癌所組成族群選出的癌症之治療，其中該細胞毒性抗腫瘤劑以及該CDK抑制劑係同時或依序投藥。
  2. 如申請專利範圍第3項的醫藥組合，其中該CDK抑制劑係為一種分子式I的化合物其中該苯基係由氯所取代。
  3. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中由分子式I化合物所表示的該CDK抑制劑係為(+)-反式-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯並吡喃-4-酮或其醫藥可接受鹽類。
  4. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中該細胞毒性抗腫瘤劑係為太平洋紫杉醇。
  5. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中該細胞毒性抗腫瘤劑係為多西紫杉醇。
  6. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中該細胞毒性抗腫瘤劑係為阿霉素。
  7. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中該細胞毒性抗腫瘤劑係為吉西他濱。
  8. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中該癌症係為非小細胞肺癌或胰臟癌。
  9. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中一醫療有效量的細胞毒性抗腫瘤劑及一醫療有效量的CDK抑制劑係同時投藥，該細胞毒性抗腫瘤劑由太平洋紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、及吉西他濱所組成族群選出，該CDK抑制劑由分子式I化合物或是其對映異構物或是醫藥可接受鹽類所代表。
  10. 如申請專利範圍第1項的醫藥組合，其中一醫療有效量的的細胞毒性抗腫瘤劑及一醫療有效量的CDK抑制劑係依序投藥，該細胞毒性抗腫瘤劑由太平洋紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、及吉西他濱所組成族群選出，該CDK抑制劑由分子式I化合物或是其對映異構物或是醫藥可接受鹽類所代表。
  11. 一種申請專利範圍第10項的醫藥組合，其中該醫療有效量的由太平洋紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、及吉西他 濱所組成族群選出的細胞毒性抗腫瘤劑係在醫療有效量的由分子式I化合物或是其對映異構物或是醫藥可接受鹽類所代表的CDK抑制劑之前投藥。
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