KR20230092999A - 감마 하위단위 예방 전이를 표적화하는 미토콘드리아 atp 억제제 - Google Patents

감마 하위단위 예방 전이를 표적화하는 미토콘드리아 atp 억제제 Download PDF

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마이클 피. 리산티
페데리카 소트지아
마르코 피오릴로
유시 캉가스메트사
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루넬라 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

미토콘드리아 ATP-합성효소에 의한 높은 ATP 생성은 특히 종양 진행을 예방하기 위한 항암 요법의 새로운 치료 표적이다. 미토콘드리아 ATP 합성효소(ATP5F1C)의 감마 하위단위를 특징으로 하는 전이에 대한 미토콘드리아 관련 유전자 시그니처가 기재되어 있다. ATP5F1C 발현의 녹다운은 ATP 생성, 3D 고정 독립적 성장 및 세포 이동을 상당히 감소시킨다. 베다퀼린, 또는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체의 투여는 시험관 내에서 ATP5F1C 발현을 하향조절하고 생체 내에서 자발적인 전이를 예방한다. 미토콘드리아 ATP5F1C는 전이성 질환 진행을 예방하기 위한 미래의 약물 개발을 위한 유망한 새로운 바이오마커 및 분자 표적이다.

Description

감마 하위단위 예방 전이를 표적화하는 미토콘드리아 ATP 억제제
관련 출원
본 출원은 2020년 10월 22일에 출원된, 미국 가특허 출원 63/104,160의 이익을 주장하며 그 전문은 참조로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 암 줄기 세포(CSC)의 전이 가능성을 예방하거나 감소시키기 위해 미토콘드리아 ATP를 억제하는 것에 관한 것이다.
연구자들은 새로운 항암 치료법을 개발하기 위해 노력해 왔다. 기존의 암 치료법(예로, 방사선 조사, 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제, 및 5-플루오로우라실과 같은 항대사물질)은 세포 성장 및 DNA 복제와 관련된 세포 메커니즘을 방해함으로써 빠르게 성장하는 암 세포를 선택적으로 감지하고 근절하려는 시도를 해왔다. 다른 암 치료법은 빠르게 성장하는 암 세포(예로, 단일클론 항체)의 돌연변이 종양 항원에 선택적으로 결합하는 면역 치료법을 사용해왔다. 불행하게도, 종양은 종종 이러한 치료법 후에 동일하거나 상이한 부위(들)에서 다시 나타나고, 이것은 모든 암세포가 근절되지 않았음을 나타낸다. 재발은 불충분한 화학요법 투여량 및/또는 치료법에 내성이 있는 암 클론의 출현으로 인한 것일 수 있다. 따라서, 새로운 암 치료 전략이 필요하다.
돌연변이 분석의 발전으로 인해 암 발생 중에 발생하는 유전적 돌연변이에 대한 심도 있는 연구가 가능해졌다. 게놈 환경에 대한 지식이 있음에도 불구하고, 현대 종양학은 암 하위유형 전반에 걸쳐 주요 구동 돌연변이를 식별하는 데 어려움을 겪었다. 가혹한 현실은 각 환자의 종양이 독특하고, 단일 종양이 여러 개의 다양한 클론 세포를 함유할 수 있다는 것이다. 그렇다면, 필요한 것은 서로 다른 암 유형 간의 공통점을 강조하는 새로운 접근법이다. 종양 세포와 정상 세포 사이의 대사적 차이를 표적화하는 것은 새로운 암 치료 전략으로서 가능성을 가지고 있다. 인간 유방암 샘플의 전사 프로파일링 데이터를 분석한 결과 미토콘드리아 생물발생 및/또는 미토콘드리아 번역과 연관된 95개 이상의 증가된 mRNA 전사가 밝혀졌다. Sotgia et al., Cell Cycle, 11(23):4390-4401 (2012). 또한, 95개의 상향조절된 mRNA 중 35개 이상이 미토콘드리아 리보솜 단백질(MRP)을 암호화한다. 인간 유방암 줄기 세포의 단백질체 분석은 여러 미토리보솜 단백질뿐만 아니라 미토콘드리아 생물 발생과 연관된 다른 단백질의 상당한 과발현을 밝혀냈다. Lamb et al., Oncotarget, 5(22):11029-11037 (2014).
미토콘드리아는 세포의 요구사항을 충족시키고 세포 미세환경에 적응하기 위해 관형 네트워크 또는 파편화된 과립을 형성하기 위해 지속적으로 분할, 신장되고 서로 연결되어 있는 매우 역동적인 소기관이다. 미토콘드리아 융합 및 분열의 균형은 미토콘드리아의 형태, 풍부함, 기능 및 공간적 분포를 결정하므로, 아데노신 트리포스페이트(ATP) 생성, 미토파지, 아폽토시스, 및 칼슘 항상성과 같은 과다한 미토콘드리아 의존적 필수 생물학적 과정에 영향을 미친다. 차례로, 미토콘드리아 동역학은 미토콘드리아 대사, 호흡 및 산화 스트레스에 의해 조절될 수 있다.
ATP는 원핵 박테리아 및 진핵 효모와 같은 미생물을 포함하는 모든 살아있는 세포 및 조직의 보편적인 생물에너지 "통화"이다. 진핵생물에서, 미토콘드리아 소기관은 세포의 "발전소" 역할을 한다. 미토콘드리아는 TCA 회로 및 산화적 인산화(OXPHOS)를 통해 막대한 양의 ATP를 생성하는 반면, 해당과정은 소량의 ATP에 기여한다. 반대로, 미토콘드리아 기능장애는 ATP 고갈을 유도하여, 미토콘드리아 구동 아폽토시스(프로그래밍된 세포 사멸) 및/또는 괴사를 초래한다. 따라서, 본 발명자들은 ATP 고갈 요법이 심지어 "가장 적합한" 암 세포를 표적화하여 근절하기 위한 실행가능한 전략이 될 수 있음을 제안하였다.
MCF7 유방암 세포에서, 미토콘드리아 구동 OXPHOS는 ATP 생성의 80-90%에 기여하는 반면, 해당작용은 정상산소 상태에서 나머지 10-20%만 기여한다. 따라서, 정상 세포와 마찬가지로, 암 세포는 미토콘드리아 ATP 생성에 크게 의존한다. 그러나, 암 세포의 ATP 수준이 전이성 확산의 두 가지 특징인 3D 고정 독립적 성장 및 세포 이동을 겪는 데 기여하는지 여부는 여전히 크게 알려져 있지 않다.
본 발명의 목적은 항암 요법, 특히 종양 진행을 예방하기 위한 새로운 치료 표적을 확인하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 특히 종양 재발 및/또는 전이의 가능성을 예방 및/또는 감소시키기 위한, 항암 활성을 갖는 화합물을 확인하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 치료 표적에 관한 동반 진단을 제공하는 것이다.
전술한 배경을 고려하여, CSC를 근절하기 위해 사용될 수 있는 치료제를 설명하는 것이 본 발명의 목적이다. 추가로 본 발명의 목적은 약학 조성물과 같은 조성물, 및 암을 치료하고 예방하는 방법을 기술하는 것이다.
베다퀼린(일명 서튜러)은 약물 내성 결핵 치료에 임상적으로 사용되는 FDA 승인 항생제이다. 원래, 베다퀼린은 마이코박테리아 ATP-합성효소에만 영향을 미치는 것으로 여겨졌지만, 본 발명자들의 연구에 따르면 베다퀼린은 또한 효모와 인간 미토콘드리아 ATP-합성효소를 강력하게 억제하는 것으로 나타났다. 고해상도 크라이오-EM 연구에 따르면 베다퀼린이 미토콘드리아 ATP 합성효소의 회전축을 형성하는 감마 하위단위(ATP5F1C)에 직접 결합하는 것으로 나타났고, 이것은 토크 전달에 결정적으로 관여하여 궁극적으로 ATP 합성에 필요한 기계적 화학적 에너지를 제공한다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, ATP5F1C에 대한 베다퀼린의 결합은 살아있는 세포에서 ATP5F1C의 분해를 초래한다. 베다퀼린은 미토콘드리아 ATP 고갈과 함께, 시간 및 농도 의존적 방식으로 ATP5F1C 단백질 발현의 하향조절을 유도한다. 또한, 베다퀼린 처리에 의해 유도된 ATP 고갈은 비발암성 인간 세포(MCF10A) 또는 닭 배아에서 유의미한 독성 없이, 생체 내 자발적 전이를 효과적으로 차단한다.
본 접근법 하에서, 미토콘드리아 ATP-합성효소(ATP5F1C)의 감마-하위단위는 종양 재발 및/또는 전이를 포함한 공격적인 암 세포 거동을 완화시키기 위한 새로운 치료 표적으로서 확인된다.
본 명세서에는 암 세포에서 ATP 고갈을 유도하기 위한 FDA 승인 약물인 베다퀼린(Bedaquiline)으로도 알려진 (1R,2S)-1-(6-브로모-2-메톡시퀴놀린-3-일)-4-(디메틸아미노)-2-나프탈렌-1-일-1-페닐부탄-2-올, 및 그 유사체의 용도가 기재되어 있다. 실험실 실험에서, 베다퀼린은 MDA-MB-231 유방암 세포에서 ATP 고갈을 효과적으로 유도했다. 예를 들어, 베다퀼린을 이용한 8일 간의 치료는 종양 성장에 영향을 미치지 않으면서, 이종이식 모델에서 생체 내 자발적 전이의 발병을 예방하기에 충분했다. 베다퀼린 및 이의 특정 유사체는 미토콘드리아 ATP 합성효소의 감마 하위단위인 ATP5F1C를 특이적으로 표적으로 한다. 이 표적은 기능적 바이오마커이자 전이 예방을 위한 치료 표적인 ATP5F1C와 일치한다.
또한 본 명세서에는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체가 기재되어 있다. 이러한 화합물은 CSC에서 ATP 고갈을 유도하고 종양 재발 및/또는 전이의 가능성을 효과적으로 예방 및/또는 감소시킨다. 베다퀼린 유도체는 베다퀼린보다 더 강력하고, CSC에 대해 선택적이고, 정상적이고 건강한 세포에 독성이 없다.
본 접근법은 종양 재발 및/또는 전이를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수도 있다. 특히 수술 후 종양이 재발하거나 전이되기 때문에 항암 치료는 종종 실패한다. CSC 미토콘드리아 활성은 적어도 부분적으로 이러한 치료 실패 원인에 대해 책임이 있는 것으로 이해된다. 본 접근법의 구현예는 종양 재발 및/또는 전이로 인한 치료 실패 가능성을 예방 또는 감소시키기 위해, 종래의 암 치료법이 실패한 상황에서, 및/또는 항암 치료와 함께 또는 그 전에 사용될 수 있다.
본 접근법의 일부 구현예는 대상체에서 종양 재발 및 전이 중 적어도 하나를 치료 또는 예방하기 위한 방법의 형태를 취할 수 있다. 상기 방법은 약학적 유효량의 베다퀼린 또는 지방산을 갖는 베다퀼린 유도체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 다양한 베다퀼린 유도체가 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 베다퀼린 유도체는 하기 일반식을 갖는다:
Figure pct00001
, 여기서 n은 3 내지 18의 정수이다.
일부 구현예에서, 베다퀼린 유도체는 하기 일반식을 갖는다:
Figure pct00002
, 여기서 R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C1-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고; n은 1 내지 18의 정수이고; m은 1 내지 12의 정수이고; A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화된다.
일부 구현예에서, 베다퀼린 유도체는 하기 일반식을 갖는다:
Figure pct00003
, 여기서 R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고; n은 1 내지 18의 정수이고; m은 1 내지 12의 정수이고; A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화되고; B는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화된다.
일부 구현예에서, 본 접근법은 환자에서 종양 전이 및 종양 재발의 가능성을 예방 및/또는 감소시키기 위한 방법의 형태를 취할 수 있다. 환자로부터 암의 생물학적 샘플을 수득할 수 있다. ABCA2, ATP5F1C, COX20, NDUFA2 및 UQCRB로 이루어진 ATP 관련 전이 유전자 시그니처의 생물학적 샘플 내 바이오마커 수준을 결정하고, 역치 수준과 비교할 수 있다. 결정된 수준이 역치 수준을 초과하는 경우, 베다퀼린 또는 지방산을 갖는 베다퀼린 유도체를 함유하는 조성물의 약학적 유효량이 투여될 수 있다.
도 1a는 ATP-관련 유전자(OXPHOS 및 ATP-관련 수송체)의 전사 프로필을 비교하는 히트맵(HeatMap)을 예시한다. 도 1b 및 1c는 각각 GSE2034 및 GSE59000 GEO 데이터세트에 대한 화산 플롯을 보여준다. 도 1d는 2개의 GEO 데이터세트의 교차점을 보여주는 벤 다이어그램이다. 도 1e는 ATP5F1C와 상관관계가 있는 유전자의 표이다.
도 2a-2c는 각각 ER(+) 무재발 생존("RFS"), ER(+) 원격 무전이 생존("DMFS"), 및 ER(+) LN-음성, 타목시펜 처리된 RFS에 대한 KM 플롯이다.
도 3은 MCF7 및 T47D 데이터 세트에서 단백질의 벤 다이어그램을 나타내고, 각 데이터 세트에서 상향조절된 ATP-관련 단백질의 표를 포함한다.
도 4는 Tet-On 시스템에서 ATP5F1C를 표적화하는 shRNA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입된 MDA-MB-231 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 5a-5d는 ATP 생성, 세포 이동, 및 3D 고정 독립적 성장에 대한 ATP5F1C 녹다운 결과를 보여준다.
도 6은 시간 경과에 따라 다양한 농도의 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 2D 세포 단층의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 7은 대조군 및 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 세포 사이의 바이오트래커 ATP-레드(신호 평균)의 배수 변화를 비교한 것이다.
도 8a 및 8b는 각각 시간 경과에 따른 10μM 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 및 MCF10A 세포의 단층 성장을 보여준다.
도 9a는 상이한 농도의 베다퀼린(0.1, 1.0, 및 10μM)에 대한 맘모스피어 형성 분석 결과를 보여준다. 도 9b는 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 세포의 세포 주기의 각 단계에서 세포의 백분율을 보여준다. 도 9c 및 9d는 각각 대조군 및 베다퀼린으로 처리된 세포에 대한 대표적인 FACS 추적을 보여준다. 도 9e는 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 세포의 대표적인 이동 이미지를 나타내고, 도 9f는 대조군 대비 이동을 나타낸다.
도 10a-10c는 각각 48, 72 및 120 시간 후 베다퀼린(1 및 10μM) 또는 비히클 단독으로 처리된 MDA-MB-231 세포에 대한 세포 주기 개체군을 보여준다. 도 10d-10f는 살아있는 세포/죽은 세포 분석 결과를 보여준다. MDA-MB-231 세포를 베다퀼린(1 및 10μM) 또는 비히클 단독으로 48, 72 및 120 시간 동안 처리한 후, FACS로 생/사 분석을 수행하였다. 도 10g는 처리 120시간 후, MDA-MB에서 PARP 및 p21 단백질 발현에 대한 베다퀼린(0, 0.1, 1 및 10μM) 효과의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다.
도 11a는 CAM 분석에 대한 시각표를 예시한다. 도 11b는 CAM 분석에서 각 처리에 대해 생존한 알의 수를 나타내고, 도 11c는 동일한 데이터를 생존율로 나타낸다. 도 11d는 각각의 처리 후 평균 종양 중량을 나타내고, 도 11e는 대조군과 비교하여 각각의 처리에 대한 상대 전이량을 나타낸다.
다음의 설명은 본 접근법의 실시를 가능하게 하기에 충분히 상세하게 본 접근법의 구현예를 예시한다. 본 접근법은 이러한 특정 구현예를 참조하여 설명되지만, 본 접근법은 다른 형태로 구현될 수 있으며, 이 설명은 본 명세서에 제시된 특정 구현예로 첨부된 임의의 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 이들 구현예는 본 발명을 더욱 충실하고 완전하게 하며, 본 기술분야의 숙련자에게 본 접근법의 범위를 완전하게 전달하기 위해 제공되는 것이다.
이 설명은 본 기술분야의 숙련자가 이해해야 하는 다양한 용어를 사용한다. 의심을 피하기 위해 다음과 같이 설명을 기재한다.
용어 "암"은 전형적으로 제어되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭한다. 이 정의는 양성 및 악성 암을 포함한다. 암의 예는 암 유형, 림프종, 모세포종(수모세포종 및 망막모세포종을 포함함), 육종(지방육종 및 윤활막 육종을 포함함), 신경내분비 종양(카르시노이드 종양, 가스트린 생성 종양 및 섬세포 암종을 비제한적으로 포함함), 육종, 슈반세포종(청신경집종을 포함함), 수질 암종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프구 종양을 포함한다. 암의 구체적인 예는 방광암, 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 및 폐의 편평상피암을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포 암종, 위장암 또는 위암을 포함하는 위의 암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암(전이성 유방암을 포함함), 결장암, 직장암, 결장 직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액 선암종, 신장암(신장암) 또는 신장암(신장의 암), 전립선암, 생식기암, 갑상선암, 간암, 항문암, 음경암, 고환암, 식도암, 담관 종양, 및 두경부암 및 다발성 골수종을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, "종양"이라는 용어는 전암성 및 암성 세포 및 조직을 포함하는, 악성이든 양성이든, 종양 세포의 성장 및 증식을 지칭한다.
용어 "전이"는 암이 원발 부위에서 신체의 다른 부분으로 확산되는 것을 지칭한다. 암세포는 원발성 종양에서 빠져나와, 림프관 및 혈관에 침투하고, 혈류를 순환하며, 신체 다른 곳의 정상 조직에 있는 원격 병변에서 성장하거나 "전이"할 수 있다. 전이는 국소적이거나 원격일 수 있다. 전이는 종양 세포가 원발성 종양에서 빠져나와, 혈류를 통해 이동하고, 원격 부위에서 중단되는 것을 필요로 하는 순차적인 과정이다. 이 새로운 부위에서, 세포는 혈액 공급을 확립하고 성장하여 생명을 위협하는 덩어리를 형성할 수 있다. 종양 세포 내의 자극 및 억제 둘 다인 분자 경로는 모두 이러한 거동을 제어하며, 원격 위치에서의 종양 세포 및 숙주 세포 사이의 상호작용도 중요하다.
용어 "치료하다", "치료된", "치료하는" 및 "치료"는 치료되는 상태, 장애 또는 질병, 특히 암과 연관되거나 이에 의해 야기되는 적어도 하나의 증상의 감소 또는 완화를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료는 본 발명의 화합물에 의해 치료되는 암과 관련되거나 암에 의해 유발되는 적어도 하나의 증상을 감소 및/또는 완화시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 숙주에서 특정 암의 전이 또는 재발에 관여할 가능성이 있는 CSC와 같은 세포 카테고리의 사멸을 유발하는 것을 포함하고, 암 세포가 추가로 증식하는 것을 예방 및/또는 예를 들어 이러한 세포에서 에너지 생성 메커니즘을 박탈하여 CSC 기능을 억제함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 치료는 암의 하나 또는 여러 증상의 감소, 또는 암의 완전한 근절일 수 있다. 또 다른 예로서, 본 접근법은 암에서 미토콘드리아 대사를 억제하고, 암에서 CSC를 근절하고(예로, 증식 속도보다 높은 속도로 사멸), 암에서 TIC를 근절하고, 암에서 순환 종양 세포를 근절하고, 암의 증식을 억제하고, CSC를 표적화 및 억제하고, TIC를 표적화 및 억제하고, 순환 종양 세포를 표적화 및 억제하고, 전이의 가능성을 예방 또는 감소시키고, 재발을 방지하고, 암을 화학요법제에 민감하게 만들고, 암을 방사선요법에 민감하게 만들고, 암을 광선요법에 민감하게 만들기 위해 사용될 수 있다.
종양 재발 및/또는 전이의 맥락에서, 용어 "예방하다" 및 "가능성을 감소시키다"는, 대상체에서, 재발 또는 전이에 관련될 가능성이 있는 CSC, TIC, 및 순환 종양 세포의 존재를 대조군(즉, 종양 재발 및/또는 전이의 가능성을 예방하거나 감소시키기 위한 치료를 하지 않음)과 비교해 종양 재발 및/또는 원발 부위로부터의 전이가 발생할 것 같지 않은 수준으로 감소시키는 것을 지칭한다. 실제로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 재발 및/또는 전이의 가능성을 예방 및/또는 감소시키기 위한 치료는 CSC, TIC를 표적화 및 억제하거나 근절하고, 순환 종양 세포를 억제한다.
용어 "암 줄기 세포" 및 "CSC"는 동물 숙주에 이식되었을 때 자가 재생, 분화, 및 발암성 능력을 갖는 종양 내의 암 세포의 하위개체군을 지칭한다. "벌크" 암 세포와 비교하여, CSC는 증가된 미토콘드리아 질량, 강화된 미토콘드리아 생물발생, 및 미토콘드리아 단백질 번역의 더 높은 활성화를 갖는다. 본 명세서에서 사용될 때, "순환 종양 세포"는 원발성 종양으로부터 맥관구조 또는 림프관으로 흘러들어와 혈액 순환에서 신체 주위로 운반되는 암 세포이다. 셀서치 순환 종양 세포 시험은 순환 종양 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "약학적 유효량"이라는 구절은 단백질 키나아제 활성의 조절, 조정, 또는 억제, 예를 들어 단백질 키나아제 활성의 억제, 또는 암의 치료와 같은, 치료 결과를 달성하기 위해, 숙주, 또는 숙주의 세포, 조직, 또는 기관에 투여하는 데 필요한 양을 나타낸다. 본 기술분야의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 본 기술분야에 잘 알려져 있고 이용가능한 방법을 이용하여 주어진 대상체에게 필요한 약학 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 약학 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 용량을 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "활성 화합물"이라는 구절은 본 명세서에 기재된 베다퀼린 또는 베다퀼린 유도체 화합물을 지칭하고, 이것은 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 동위원소 유사체를 포함할 수 있다. 활성 화합물(들)은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 바와 같이 임의의 적합한 접근법을 통해 대상체에게 투여될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 활성 화합물의 양 및 그의 투여 시기는 치료되는 개별 대상체(예로, 기타 요인들 중에서도 나이 및 체질량), 투여 방식, 특정 활성 화합물(들)의 약동학적 특성, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 대상체 간 가변성으로 인해, 본 명세서에 기재된 임의의 투여량은 초기 가이드라인으로 의도되며, 의사는 대상체에게 적절하다고 생각하는 치료를 달성하기 위해 화합물의 투여량을 적정할 수 있다. 원하는 치료 정도를 고려할 때, 의사는 대상체의 연령 및 체중, 기존 질병의 존재 여부, 및 기타 질병의 존재 여부와 같은 다양한 요인의 균형을 맞출 수 있다. 제약 제형물은 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이, 경구, 정맥내, 또는 분무 투여를 비제한적으로 포함하는 임의의 원하는 투여 경로를 위해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "약학적으로 허용가능한 담체"라는 구절은 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제형물의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 락토오스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당: (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로오스, 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 말트; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 인산염 완충 용액; 및 (21) 제약 제형물에 사용되는 기타 무독성 호환성 물질.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "유도체"는 참조 화학 모이어티로부터 유도되거나 합성된 화학 모이어티이다. 예를 들어, 본 접근법에 따른 화합물은 베다퀼린 유도체로서 지칭될 수 있고, 6-브로모 위치 또는 디메틸아미노에 접합된 지방산 모이어티를 갖는다.
본 명세서에 사용될 때, "지방산" 모이어티는 포화되거나 불포화된 지방족 사슬을 갖는 카르복실산이다. 지방산의 예는 단쇄 지방산(즉, 화학 구조에 5개 이하의 탄소 원자를 가짐), 중쇄 지방산(화학 구조에 6-12개의 탄소 원자를 가짐), 및 기타 장쇄 지방산(즉, 화학 구조에 13-21개의 탄소 원자를 가짐)을 포함한다. 포화 지방산의 예는 라우르산(CH3(CH2)10COOH), 팔미트산(CH3(CH2)14COOH), 스테아르산(CH3(CH2)16COOH), 및 미리스트산(CH3(CH2)12COOH)을 포함한다. 올레산(CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH)은 자연적으로 발생하는 불포화 지방산의 예이다. 본 접근법의 화합물은 선형 포화 지방산, 바람직하게는 3 내지 20개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 7 내지 19개의 탄소 원자, 더욱 더 바람직하게는 총 12 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 선형 포화 지방산과 접합된 베다퀼린을 포함함을 이해해야 한다. 예시적 구현예에서, 선형 포화 지방산은 14개의 탄소 원자를 갖는 미리스트산이다.
베다퀼린 및 지방산 모이어티를 갖는 특정 베다퀼린 유도체는 종양 재발 및/또는 전이를 치료 및/또는 예방하기 위해 CSC를 선택적으로 근절하는 데 사용될 수 있다. 베다퀼린은 활동성 결핵, 특히 다제 내성 결핵을 치료하기 위해 현재 사용되고 있고 FDA 승인을 받은 약물이다. 기계적으로, 베다퀼린은 마이코박테리아의 ATP 합성효소를 위한 양성자 펌프를 차단한다. 세포 에너지 생산은 ATP 생성에 의존하고, ATP 생성 손실은 마이코박테리아의 성장의 억제를 초래한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 시험관 내 실험은 베다퀼린이 또한 악성 포유동물 세포의 미토콘드리아 ATP 합성효소를 표적화하고 종양 재발율 및 전이율을 감소시킴을 보여준다. 본 접근법 하에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학적 유효량의 베다퀼린, 또는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체는 종양 재발 및/또는 전이를 치료 및/또는 예방하기 위해 암을 가진 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 성인 인간 대상체를 치료하기 위한 일부 구현예에서, 400㎎의 베다퀼린은 정제 형태로 1 내지 2주 동안 매일 투여될 수 있고, 이어서 600㎎의 베다퀼린은 역시 정제 형태로 또 다른 1 내지 2주 동안 주당 3회 투여될 수 있다. 이 실증 용량은 현재 성인의 다제 내성 결핵 치료에 사용된다. 본 접근법 하에서 종양 재발 및/또는 전이를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 베다퀼린의 약학적 유효량은 본 기술분야에 공지된 바와 같이 대상체(예로, 연령, 체중, 건강 상태 등)에 따라 달라질 수 있다. 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체를 포함하는 본 접근법의 구현예에서, 본 접근법 하에서 종양 재발 및/또는 전이를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 약학적 유효량은 베다퀼린의 약학적 유효량보다 낮을 것이다. 약학적 유효량의 결정은 본 발명을 검토한 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 치료 주기는 결핵 치료를 위한 치료 주기와 동일하거나 유사할 수 있거나, 특정 구현예, 사용되는 베다퀼린 유도체, 및 본 기술분야에 공지된 다른 요인에 따라 상이할 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명자들은 먼저 암세포에서 ATP 합성의 역할을 탐구하고, 그 다음 암세포에서 ATP 생성 억제의 영향을 분석함으로써 본 접근법을 개발하였다. ATP 억제를 위한 표적 유전자를 확인한 후, 본 발명자들은 맘모스피어 형성 분석 및 병아리 융모요막("CAM") 분석과 같은 다양한 분석을 이용하여 ATP 억제 활성에 대해 다양한 화합물을 평가하였다. 다음 단락에서는 ATP 합성의 역할에 대한 생물정보학적 분석을 설명한다. 이 논의는 암 전이에서 미토콘드리아 ATP 합성효소의 감마 하위단위인 ATP5F1C의 중요성을 다룬다. ATP5F1C 유전자는 미토콘드리아 ATP 합성효소의 하위단위를 암호화한다. 미토콘드리아 ATP 합성효소는 산화적 인산화 동안 내막을 가로지르는 양성자의 전기화학적 구배를 이용하여 ATP 합성을 촉매한다. 미토콘드리아 ATP 합성효소의 촉매 부분은 5개의 상이한 하위단위(알파, 베타, 감마, 델타, 및 엡실론)로 구성된다. 이 유전자는 촉매 코어의 감마 하위단위를 암호화한다.
본 발명자들은 생물정보학 접근법을 이용하여, 미토콘드리아 ATP 합성이 3D 고정 독립적 성장 및 전이의 주요 결정인자임을 결정하였다. 첫 번째 단계로, GEO 전사 프로파일링 데이터세트를 분석하여 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주인 MDA-MB-231 세포의 2D 성장, 3D 성장, 및 생체 내 종양 성장을 비교하였다. 히트맵을 생성하였고, 이는 2D 부착 성장 모두에 비해 3D 성장 조건(고정 독립적 및 생체 내 종양) 둘 다에서 ATP 관련 유전자가 전사적으로 상향조절되었음을 강조한다.
도 1a는 이전에 NCBI 데이터베이스에 기탁된 GSE36953 GEO 데이터세트를 이용하여 ATP 관련 유전자(OXPHOS 및 ATP 관련 수송체)의 전사 프로필을 비교하는 히트맵을 나타낸다. 히트맵은 일반적으로 분자 생물학에서 DNA 마이크로어레이에서 수득된 여러 비교가능한 샘플(예로, 상이한 상태의 세포, 상이한 환자로부터의 샘플)에 걸쳐 많은 유전자의 발현 수준을 나타내는 데 사용된다. 히트맵은 일반적으로 색상으로 표시되며, 녹색 음영은 음의 로그 배수 변화("FC") 값을 나타내고, 붉은색 음영은 양의 로그 FC 값을 나타낸다. 음영이 밝을수록 로그 FC는 크다. PCT 규칙 11.13으로 인해 도 1a는 흑백으로 표시된다. 도 1a의 컬러 버전은 2D 세포에 대해 첫 번째 열에 주로 녹색을 나타내고, 3D 및 이종이식 세포에 대해 두 번째 및 세 번째 열에 붉은색을 점유한다. 도 1a에서 더 밝은 음영은 log FC의 더 높은 절대값을 나타내고, 첫 번째 열의 2D 세포는 음의 log FC를 나타냈음에 유의한다. 총 RNA는 2D 부착 성장, 3D 고정 독립 성장 및 생체 내 종양 성장의 세 가지 상이한 성장 조건 하에서 TNBC 세포주인 MDA-MB-231 세포로부터 준비되었다. 아피매트릭스(Affymetrix) 인간 게놈 U133 Plus 2.0 어레이를 이용하여 분석을 수행하였다. 히트맵은 퀴아젠 오믹소프트 스위트 소프트웨어로 생성하였다. -4<Log FC>+4 히트맵 축척 막대가 표시된다. ATP 관련 유전자는 2D 부착 성장 모두에 비해 3D 성장 조건(고정 독립적 및 생체 내 종양) 둘 다에서 전사적으로 상향조절되었음에 유의한다.
ATP 관련 유전자(OXPHOS 및 ATP 관련 수송체)의 전사 발현은 인간 유방암 전이와 관련된 2개의 별개의 GEO 데이터세트에서 조사되었고, 전이의 바이오마커로서 작용하는 ATP 관련 유전자를 드러냈다. 도 1b 및 1c는 각각 GSE2034 및 GSE59000 GEO 데이터세트에 대한 화산 플롯을 나타낸다. 이러한 유형의 플롯은 일반적으로 위에서 설명한 히트맵과 유사하게 색상으로 나타낸다. 흑백에서 0의 왼쪽 음영은 녹색(음의 상관관계를 나타냄)을 나타내고 0의 오른쪽 음영은 붉은색(양의 상관관계를 나타냄)을 나타낸다. GSE2034는 유방암 전이와 유방암 전이 없음을 비교한다. GSE59000은 유방암 전이를 유방암 원발성 종양과 비교한다. 이러한 화산 플롯은 온코랜드 전이성 암(퀴아젠 오믹소프트 스위트)에 있는 주석을 검사하고 수정되지 않은 p-값 컷오프 <0.05로 주석이 달린 유전자에 대해 독창성 경로 분석 소프트웨어(IPA; 퀴아젠)를 이용하여 기능적 "핵심 분석"을 수행하여 생성되었다. GEO 데이터세트 둘 다에서 ATP 관련 유전자(OXPHOS 및 ATP 관련 수송체)의 전사 프로필이 증가했으며 전이와 구체적으로 연관되어 있음에 유의한다.
도 1d는 2개의 GEO 데이터세트의 교차점을 보여주는 벤 다이어그램으로, ABCA2, ATP5F1C, COX20, NDUFA2 및 UQCRB로 구성된 5개 구성원 ATP-관련 전이 유전자 시그니처가 도출된다. 도 1e는 ATP5F1C와 상관관계가 있는 유전자의 표이다. 그 중에서 특히, ATP5F1C(ATP5C1이라고도 함)는 미토콘드리아 ATP 합성효소, 복합체 V의 가용성 F1 촉매적 코어의 감마 하위단위를 암호화한다.
진정한 유방암 전이성 병변에서, ATP5F1C 전사 발현은 i) 5개의 전이성 마커 유전자(EPCAM, MKI67, RRP1B, VCAM1, CXCR4), ii) 4개의 세포 주기 조절 유전자(CDK1, CDK2, CDK4, CDK6) 및 iii) 11개의 암 줄기 세포(CSC) 마커 유전자(CDH1, ALDH2, ALDH1BA1, ALDH9A1, SOX2, VIM, CDH2, ALDH7A1, ALDH1B1, CD44, ALDH3B2, 통계적 유의성의 순위로 나열됨)의 동시 발현과 양의 상관관계가 있다. 하기 표 1-12는 ATP5F1C와 상관관계가 있는 다양한 유전자 군에 대한 발현 데이터를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, ATP5F1C 전사 발현은 또한 미토콘드리아 복합체 I-V, mt-DNA 암호화된 전사체 및 5개-구성원 전이 유전자 시그니처의 3개의 다른 구성원, 즉 UQCRB, COX20 및 NDUFA2의 동시 발현과 양의 상관관계가 있다.
Figure pct00004
표 1. ATP5F1C와 상관관계가 있는 복합체 I 유전자 전사체
Figure pct00005
표 2. ATP5F1C와 상관관계가 있는 복합체 II 유전자 전사체
Figure pct00006
표 3. ATP5F1C와 상관관계가 있는 복합체 III 유전자 전사체
Figure pct00007
표 4. ATP5F1C와 상관관계가 있는 복합체 IV 유전자 전사체
Figure pct00008
표 5. ATP5F1C와 상관관계가 있는 복합체 5 유전자 전사체
Figure pct00009
표 6. ATP5F1C와 상관관계가 있는 모든 ATP 유전자 전사체
Figure pct00010
표 7. ATP5F1C와 상관관계가 있는 mt-DNA 유전자 전사체
Figure pct00011
표 8. ATP5F1C와 상관관계가 있는 ABC 유전자 전사체
Figure pct00012
표 9. ATP5F1C와 상관관계가 있는 유방암 줄기 세포 마커 유전자 전사체
Figure pct00013
표 10. ATP5F1C와 상관관계가 있는 전이성 마커 유전자 전사체
Figure pct00014
표 11. ATP5F1C와 상관관계가 있는 세포 주기 유전자 전사체
유사하게, 이 전이 유전자 시그니처의 2개 구성원, 즉 ATP5F1C 및 UQCRB의 발현은 인간 골격근 조직에서 최대 산소 섭취량(VO2max) 및 높은 백분율의 1형 섬유(미토콘드리아 풍부)와 기능적으로 상관관계가 있다. 골격근에서 ATP5F1C의 발현도 운동 훈련 후에 상당히 증가하며, 환자의 근육 체력이 증가했음을 반영한다. 반대로, ATP5F1C 수준은 고령에서 감소했으며 조로증 환자에서 감소했다. 이러한 결과는 높은 ATP5F1C 발현은 세포 수준에서의 증가된 미토콘드리아 ATP 생성의 바이오마커임을 매우 암시한다.
카플란 마이어(K-M) 분석을 이용하여, ATP5F1C는 원격 전이 및 종양 재발에 대한 예후 바이오마커로 결정되었으며, 특히 진단 시 림프절 음성이고 타목시펜으로 치료받은 ER(+) 환자에서 그러하다(HR(RFS)=2.77; P=3.4E-06; N=471). 도 2a-2c는 각각 ER(+) 무재발 생존("RFS"), ER(+) 원격 무전이 생존("DMFS"), 및 ER(+) LN-음성, 타목시펜 처리된 RFS에 대한 KM 플롯이다. 위험 비율("HR")을 도면에 나타낸다. ATP5F1C에 대한 K-M 분석을 수행하기 위해 개방형 온라인 생존 분석 도구를 이용하여 유방암 환자의 공개적으로 이용가능한 마이크로어레이 데이터를 조사했다. 이 접근법은 종양 재발의 마커로서 ATP5F1C의 직접적인 인 실리코 검증을 허용하였다.
또한, 본 발명자들은 기존 GEO 데이터세트를 이용하여, ATP 관련 유전자 및 OXPHOS 유전자는 환자의 유방암 순환 종양 세포(CTC)의 전사 바이오마커임을 결정하였다. GSE55470으로부터의 ATP-ABC 및 OXPHOS 유전자의 히트맵을 이용하여 CTC의 높은 ATP 함량은 전혈에서 CTC를 식별 및 추적하는 바이오마커로 유용할 수 있으며, 이로써 잠재적으로 암 진단을 개선하고 전이성 확산을 방지할 수 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 또한 2개의 별개의 ER(+) 유방암 세포주, 즉 MCF7 및 T47D에서 2D-단층을 3D-맘모스피어와 비교하여 기존의 단백질체 프로파일링 데이터를 재조사하였다. 전반적으로, 두 세포주에 있는 1,519개의 공통 단백질 중에서 21개의 ATP 관련 단백질은 3D 맘모스피어의 두 데이터세트 모두에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 도 3은 두 데이터세트에서 단백질의 벤 다이어그램을 보여주고, 각 데이터세트에서 상향조절된 ATP 관련 단백질의 표를 포함한다. 이 21개의 ATP 관련 단백질 중에서, ATP5F1B, ATP5F1C, ATP5IF1, ATP5MG, ATP5PB, ATP5PD 및 ATP5PO를 포함하여 미토콘드리아 ATP 합성효소의 7개 하위단위가 검출되었다. 도 3은 2D-부착 및 3D-고정 독립적 성장 조건 하에서 먼저 비교된 2개의 ER(+) 유방암 세포주(MCF7 및 T47D)의 단백질체 프로필을 비교한 벤 다이어그램이다. 공통적으로 공유된 ATP 관련 유전자 산물(OXPHOS 및 ATP 관련 수송체)이 벤 다이어그램 아래에 열거되어 있다. 1519개의 공통 단백질 중에서, 21개의 ATP 관련 단백질은 두 데이터세트 모두에서 상향조절된 것으로 밝혀졌다. 단백질체 데이터세트는 독창성 경로 분석 소프트웨어(IPA; 퀴아젠)를 이용하여 기능적 "핵심 분석"을 수행하여 조사하였다.
종합하면, 생물정보학적 분석은 증가된 미토콘드리아 ATP 합성이 3D 고정 독립적 성장 및 전이의 주요 동인이 될 수 있음을 확인시켜준다. 이 확인과 일치하게, 본 발명자들은 ATP5F1C 단백질 발현의 shRNA-표적 녹다운이 ATP 생성, 세포 이동 및 3D 고정 독립적 성장을 억제한다는 것을 결정하였다.
본 발명자들은 암 전이의 임상적 바이오마커로서 ATP5F1C를 확인하였다. 잠재적인 치료 표적으로서의 기능적 관련성을 추가로 검증하기 위해, shRNA 접근법을 이용하여 단일 렌티바이러스 벡터로 조작된 Tet-On 시스템을 사용함으로써 유도가능한 방식으로 ATP5F1C 발현을 하향조절하였다. 도 4는 Tet-On 시스템에서 ATP5F1C를 표적화하는 shRNA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 안정적으로 형질도입된 MDA-MB-231 세포의 웨스턴 블롯 분석이다. 세 가지 상이한 shRNA 구조물(a, b, 및 c)을 시험하였다. MDA-MB-231 세포도 동시에 shRNA-제어 벡터로 형질도입되었다. 독시사이클린(10μM)으로 처리하여 48시간 동안 shRNA를 유도한 후, 웨스턴 블롯 분석으로 ATP5F1C의 수준을 평가하였다. +DOX에 대한 결과 주위에 밝은 회색 상자로 표시한 바와 같이, shRNA 구조물 c만이 ATP5F1C 발현 수준의 유도 하향조절을 나타냈음에 유의한다. 그 결과, shRNA 대조군과 비교한 추가 실험에는 구조물 c로 형질도입된 세포만을 사용하였다.
도 4는, 이 접근법을 이용하여, 낮은 수준의 독시사이클린을 사용한 유도 방식으로 ATP5F1C 발현이 성공적으로 하향조절됨을 보여준다. 중요한 것은 ATP5F1C 발현을 제거하기 위해 이 유전적 접근법을 이용함으로써, ATP5F1C의 손실이 i) ATP 생성, ii) 세포 이동 및 iii) 3D 고정 독립적 성장을 표현형적으로 억제하기에 충분한 것으로 나타났다.
도 5a 내지 5d는 ATP 생성, 세포 이동, 및 3D 고정 독립적 성장에 대한 ATP5F1C 녹다운 결과를 보여준다. 먼저, 도 5a는 대조군과 ATP5F1C 녹다운 사이의 바이오트래커 ATP-레드(신호 평균)의 배수 변화를 비교한다. ATP5F1C의 유도된 하향조절은 shRNA 대조군에 비해 ATP 수준을 ~45%까지 감소시킨다. 짝이 없는 t-검정, **p < 0.005. 도 5b는 대조군과 ATP5F1C 녹다운 둘 다에 대해 16시간 후 세포 이동의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 5c는 대조군의 백분율로 데이터를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, ATP5F1C의 유도된 하향조절은 shRNA 대조군에 비해 ~65%까지 세포 이동을 차단한다. MDA-MB-231 세포를 독시사이클린(10μM)의 존재 하에 32시간 동안 배양하고 독시사이클린의 존재 하에 16시간 동안 트랜스웰로 옮겼다. 짝이 없는 t-검정, **p < 0.005. 도 5d는 맘모스피어 형성 분석 결과를 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, ATP5F1C의 녹다운은 3D 고정 독립적 성장을 억제한다. ATP5F1C의 유도된 하향조절은 shRNA 대조군에 비해 ~50%까지 3D 맘모스피어 형성을 차단한다. 짝이 없는 t-검정, ***p < 0.0005.
데이터는 ATP5F1C가 종양 재발 및 전이를 치료하기 위한 적합한 표적임을 입증한다. 본 발명자들은 베다퀼린 또는 베다퀼린의 특정 접합체로 ATP5F1C를 표적화하는 것이 ATP 생성, 세포 이동, 3D 고정 독립적 성장, 및 생체 내 전이를 예방한다는 것을 결정하였다. 베다퀼린(하기 구조 [1])은 다제 내성 결핵(TB) 치료를 위해 예약된 FDA 승인된 항생제이다. 이것은 2009년 3월 3일에 발행된 미국 특허 7,498,343 및 2013년 10월 1일에 발행된 미국 특허 8,546,428에 추가로 기술되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 참조로서 포함된다. 화학적으로, 베다퀼린은 마이코-박테리아 ATP-합성효소를 기계적으로 억제한다. 그러나, 본 명세서에 기재된 연구는 베다퀼린이 또한 인간 미토콘드리아 ATP-합성효소에 특이적으로 결합하여 그의 활성을 강력하게 억제한다는 점을 강조한다. 초구조적으로, 상세한 크라이오-EM 연구는 베다퀼린의 결합 부위가 C-고리(ATP5G1/2/3)와의 직접 접촉을 포함하고 있음을 보여주었으며, C-고리는 미토콘드리아 ATP-합성효소의 감마 하위단위, 즉 ATP5F1C와 밀접하게 접촉하고 있다.
Figure pct00015
ATP5F1C에 대한 베다퀼린의 인 시츄(in situ) 결합은 단백질의 분해를 유도한다. 도 6은 4개 시점(인큐베이션의 24, 48, 72 및 120시간)에서 베다퀼린(0, 0.1, 1 및 10μM에서)으로 처리된 MDA-MB-231 2D 세포 단층의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. ATP5F1C 단백질 발현 수준은 비히클 단독(DMSO) 대조군에 비해 지속적인 방식으로 감소되었으며 특히 10μM 베다퀼린에서 감소됨에 유의한다. 결과는 ATP5F1C의 발현이 베다퀼린 처리에 대한 반응으로 하향조절되었음을 보여준다. 효과는 시간 및 농도 의존적이다.
또한, 베다퀼린 처리에 의해 유도된 ATP5F1C 발현의 손실은 최대 75%까지 미토콘드리아 ATP 고갈을 초래했다. 도 7은 대조군 및 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 세포 사이의 바이오트래커 ATP-레드(신호 평균)의 배수 변화를 비교한다. 알 수 있는 바와 같이, 베다퀼린은 미토콘드리아 ATP 생성을 감소시킨다. 미토콘드리아 ATP 수준을 구체적으로 검출하기 위해, 바이오트래커 ATP-레드 1을 이용하여 평가했을 때, 베다퀼린은 MDA-MB-231 세포에서, 10μM 농도에서, 시간 의존적 방식으로 미토콘드리아 ATP 생성을 유의하게 억제했음에 유의한다. 75%의 최대 억제는 120시간 처리에서 관찰되었다. 도 7의 데이터는 이원분산분석, 시닥(Sidak)의 다중 비교 검정을 기반으로 한다; *p < 0.05, ** p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.0001이다.
베다퀼린에 의해 유도된 ATP 고갈은 또한 2D 단층에서 MDA-MB-231 세포의 성장을 억제했지만, 비발암성 인간 유방 상피 세포주인 MCF10A 세포의 성장에는 영향을 미치지 않았다. 도 8a 및 8b는 각각 10μM 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 및 MCF10A 세포의 시간 경과에 따른 단층 성장을 보여준다. 베다퀼린은 10μM의 농도에서, MDA-MB-231 세포의 2D 성장을 시간 의존적 방식으로 효과적으로 억제한다. 정상적인 대조군 인간 유방 상피 세포주로 여겨지는 MCF10A에서는 효과가 관찰되지 않았다. 짝이 없는 t-검정 *p < 0.05, ** p < 0.005. 이것은 베다퀼린을 이용한 처리가 발암성 세포에 대해 선택적임을 보여준다.
또한, 베다퀼린에 의해 유도된 ATP-고갈은 또한 MDA-MB-231 세포가 3D 고정 독립적 성장 및 세포 이동을 겪는 것을 억제하였다; 유사하게, 베다퀼린 처리는 아마도 S-기 수준에서 작용하여 세포 주기 진행을 차단함으로써 세포 사멸을 유도하기에 충분했다. 도 9a는 상이한 농도의 베다퀼린(0.1, 1.0, 및 10μM)에 대한 맘모스피어 형성 분석 결과를 보여준다. 3D 맘모스피어 형성의 억제는 농도 의존적 방식이며, 베다퀼린은 10μM 농도에서 ~65%까지 MDA-MB-231 세포 내 3D 맘모스피어 형성을 효과적으로 차단한다. 일원분산분석, 던넷의 다중 비교 검정, ** p < 0.005, *** p < 0.0005.
베다퀼린을 통한 ATP 고갈은 또한 DNA 합성을 억제하고 세포 사멸을 유도한다. 도 9b는 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 세포의 세포 주기 각 단계에서의 세포 백분율을 보여준다. 120시간 처리 후, S-기에서 MDA-MB-231 세포는 2배 감소하고 동시에 하위 G0-G1 개체군은 2배 증가한다. 이원분산분석, 시닥의 다중 비교 검정, ns=유의하지 않음, ***p < 0.0005. 도 9c 및 9d는 각각 대조군 및 베다퀼린으로 처리된 세포에 대한 대표적인 FACS 추적을 보여준다.
베다퀼린을 이용한 처리는 세포 이동도 억제한다. 도 9e는 베다퀼린으로 처리된 MDA-MB-231 세포의 대표적인 이동 이미지를 나타내고, 도 9f는 대조군 대비 이동을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 베다퀼린은 MDA-MB-231 세포 이동을 ~50%까지 차단한다. MDA-MB-231 세포를 베다퀼린(10μM)의 존재 하에 32시간 동안 배양하고, 베다퀼린(10μM)의 존재 하에 16시간 동안 트랜스웰로 옮겼다. 짝이 없는 t-검정, **p < 0.005.
추가 세포 주기 분석은 MDA-MB-231 세포의 베다퀼린 처리가 용량 및 시간 의존적 방식으로 구체적으로 S-기 세포 개체군을 감소시키고 세포 사멸을 증가시킴을 보여준다. 도 10a-10c는 각각 48, 72 및 120시간 후, 베다퀼린(1 및 10μM) 또는 비히클 단독으로 처리된 MDA-MB-231 세포에 대한 세포 주기 개체군을 보여준다. 세포 주기 분석은 FACS를 이용하여 수행하였다. 48시간에 효과는 감지되지 않았다. 그러나, 72시간 및 120시간에서 S-기 개체군의 감소 및 하위 G0-G1 개체군의 동시 증가를 도 10b 및 10c에서 볼 수 있다. 이원분산분석, 시닥의 다중 비교 검정, ns=유의하지 않음, *p< 0.01, **p< 0.001, ***p < 0.0005.
도 10d-10f는 살아있는 세포/죽은 세포 분석 결과를 보여준다. MDA-MB-231 세포를 베다퀼린(1 및 10μM) 또는 비히클 단독으로 48, 72 및 120시간 동안 처리한 후 FACS로 생/사 분석을 수행하였다. 48시간에 효과는 감지되지 않았다. 그러나, 72시간 및 120시간(도 10e 및 10f)에서 살아있는 세포 개체군의 감소 및 죽은 세포 개체군의 증가를 볼 수 있다. 그러나, 아폽토시스 세포 개체군(초기 또는 후기)의 증가는 관찰되지 않았으며, 이는 세포 사멸이 괴사로 인한 것임을 암시한다. 이원분산분석, 시닥의 다중 비교 검정, ns=유의하지 않음, *p<0.01, **p<0.001, ***p< 0.0005.
도 10g는 처리 120시간 후, MDA-MB에서 PARP 및 p21 단백질 발현에 대한 베다퀼린(0, 0.1, 1 및 10μM)의 효과의 웨스턴 블롯 분석에 대한 결과를 보여준다. PARP 및 p21은 농도 의존적 방식으로 감소했음에 유의한다. 베타-액틴은 균등 로딩을 위한 대조군으로 사용되었다.
다음으로, 생체 내 활성을 시험하기 위해, MDA-MB-231 세포와 함께 잘 확립된 CAM 분석을 이용하여 종양 성장, 자발적 전이 및 배아 독성에 대해 영향을 미치는 베다퀼린 효과를 측정하였다. 도 11a는 CAM 분석에 대한 시각표를 예시한다. 1×106 MDA-MB-231 세포의 접종물을 각각의 알의 CAM에 첨가(E9일)한 후 알을 무작위로 군 분류하였다. E10일에 종양을 검출할 수 있었고 이후 비히클 단독(PBS 중 1% DMSO) 또는 베다퀼린으로 8일 동안 매일 처리하였다. 약물 투여 8일 후, E18일에, 모든 종양을 칭량하고, 전이성 세포의 수를 평가하기 위해 하부 CAM을 수집하고, 인간 Alu 서열에 대한 특이적 프라이머를 이용해 qPCR로 분석하였다. 각각의 약물 투여 전에, 살아있는 닭 배아와 죽은 닭 배아의 수를 점수화하여 처리 관용성을 평가하였다.
도 11b는 각 처리에 대해 생존한 알의 수를 나타내고, 도 11c는 동일한 데이터를 생존율로 나타낸다. 데이터는 베다퀼린 처리가 생체 내에서 시험된 모든 농도에서 병아리 배아에 대해 독성이 없었음을 보여준다. 도 11d는 각각의 처리 후 평균 종양 중량을 보여준다. 베다퀼린은 종양 성장에 통계적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 그러나, 현저한 차이로, 베다퀼린은 용량 의존적으로 120μM 처리에서 최대 84%까지 자발적 전이를 억제했다. 도 11e는 대조군과 비교하여 각각의 처리에 대한 상대 전이량을 나타낸다. 결과는 베다퀼린을 이용한 미토콘드리아 ATP-합성효소의 약리학적 표적화가 ATP 고갈을 유도함으로써 독성을 유발하지 않으면서 종양 세포 전이를 선택적으로 예방할 수 있음을 보여준다.
베다퀼린은 염 형태(예로, 베다퀼린 푸마레이트) 및 유리 염기 형태로 이용가능함을 이해해야 한다. CSC에서 미토콘드리아 ATP 고갈 유도와 관련하여 후자가 전자보다 더 효과적일 수 있다. 상대적 유효성 및 최소 억제 농도에 대한 추가 평가가 진행 중이다.
상기 논의된 데이터는 비접합 베다퀼린 화합물에 관한 것이다. 베다퀼린은 지방산과 접합되어 미토콘드리아 섭취를 증가시키고, 그 결과 화합물의 억제 강도를 증가시킬 수 있음을 이해해야 한다. 지방산 모이어티는 치료제가 미토콘드리아 막에 보다 효과적으로 침투하여 세포 미토콘드리아에 축적되도록 한다. 또한, CSC의 대사 증가로 인해 베다퀼린-지방산 접합체는 정상적이고 건강한 세포보다 CSC에 대해 선호도를 나타낸다. 초기 평가는 본 명세서에 기재된 베다퀼린 유도체의 유효성이 비접합 베다퀼린 화합물과 비교할 때 10% 내지 10배 또는 그 이상 개선되었음을 나타낸다. 예를 들어, 아래에 설명된 구조 [3B], [4B], 및 [5]를 갖는 베다퀼린 유도체의 초기 평가는 이러한 베다퀼린 유도체가 ATP 고갈, 맘모스피어 형성 억제, 및 자발적 전이 억제와 관련하여 비접합 베다퀼린보다 적어도 2배 내지 5배 더 강력함을 나타낸다.
일부 구현예에서, 지방산 모이어티는 디메틸 아미노기에서 아미드 결합을 통해 접합될 수 있다. 아래의 일반 구조 [2A]는 이 위치에서 지방산 모이어티가 있는 베다퀼린을 예시하며, 여기서 n은 1 내지 18의 정수이다.
Figure pct00016
바람직한 구현예에서, n은 3 내지 16, 더욱 바람직하게는 5 내지 14, 더욱 더 바람직하게는 12 내지 14일 수 있다. 하기 나타낸 구조 [2B]는 바람직한 구현예를 예시하며, 여기서 n은 12이므로, 베다퀼린과 접합된 미리스트산 모이어티가 생성된다.
Figure pct00017
일부 구현예에서, 지방산 모이어티는 할로겐의 제거를 통해 카르복실 결합을 통해 접합될 수 있다. 하기에 나타낸 일반 구조 [3A]는 이 위치에서 지방산 모이어티가 있는 베다퀼린을 예시하고, 여기서:
R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C1-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클일 수 있고;
n은 1 내지 18, 바람직하게는 5 내지 16, 더 바람직하게는 12 내지 14의 정수이고;
m은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 4의 정수이고; 및
A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S일 수 있으며, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화된다.
Figure pct00018
하기에 나타낸 구조 [3B]는 바람직한 구현예를 예시하고, 여기서 R은 메틸이고, n은 12이고, m은 4이고, A는 O이므로, 베다퀼린과 접합된 미리스트산 모이어티를 생성하며, 본 명세서에서 지방산 모이어티가 있는 베다퀼린 유도체로도 지칭된다.
Figure pct00019
일부 구현예에서, 지방산 모이어티는 할로겐의 제거를 통해 카르복실 결합을 통해 접합될 수 있고, 지방족 꼬리 앞에 추가적인 B 종을 포함할 수 있다. 하기에 나타낸 일반 구조 [4A]는 이 위치에서 지방산 모이어티가 있고 지방족 꼬리에 추가적인 종 B를 갖는 베다퀼린 유도체를 예시한다. 구조 [4A]에서,
R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클일 수 있고;
n은 1 내지 18, 바람직하게는 5 내지 16, 더 바람직하게는 12 내지 14의 정수이고;
m은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 4의 정수이고;
A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S일 수 있으며, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화되고; 및
B는 부재하거나 C, O, N, 또는 S일 수 있으며, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화된다.
Figure pct00020
하기 나타낸 구조 [4B]는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체의 또 다른 바람직한 구체예를 예시한다. 이 구현예에서, R은 메틸이고, n은 12이고, b는 4이고, A는 O이고, B는 부재하여, 베다퀼린과 접합된 미리스트산 모이어티를 생성한다. 구조 [4B]는 ATP 억제, 3D 맘모스피어 형성 억제, 및 전이의 상대적 양의 감소(즉, CAM 분석을 통해)와 같은 특성에서 비접합 베다퀼린에 비해 적어도 2-5배의 상당한 개선을 나타낸다.
Figure pct00021
본 명세서에 기재된 접합된 화합물들은 본 기술분야에 공지된 통상적인 합성 기술을 이용하여 베다퀼린으로부터 합성될 수 있음을 이해해야 한다. 베다퀼린으로 시작하는 실증적 합성 스킴이 아래에 제시되어 있다.
Figure pct00022
상기 예시적인 합성 스킴은 구조 [5]를 생성하고, 여기서 R은 메틸이고, B는 부재하고, n은 7이고, m은 4이다. 구조 [5]의 화합물의 초기 평가는 이 베다퀼린 유도체가 비접합 베다퀼린보다 ATP 고갈, 맘모스피어 형성 억제, 및 자발적 전이 억제에서 적어도 5배 더 강력함을 나타낸다. 최종 반응에서 지방산 모이어티는 생성된 베다퀼린 유도체의 알킬 사슬 길이를 결정한다는 것을 이해해야 한다. 이 접근법에 사용될 수 있는 다른 ATP 합성효소 억제제는 레스베라트롤, 트랜스-레스베라트롤, 퀘르세틴, 피세아타놀, Bz 423 (7-클로로-1,3-디히드로-5-(4-히드록시페닐)-1-메틸-3-(2-나프탈레닐메틸)-2H-1,4-벤조디아제핀-2-온으로도 알려짐), 및 지복신(Gboxin) (2-에틸-1-메틸-3-[2-[[(1R,2S,5R)-5-메틸-2-(1-메틸에틸)사이클로헥실]옥시]-2-옥소에틸]-1H-벤즈이미다졸륨으로도 알려진 산화적 인산화 억제제)를 포함한다.
본 명세서에 개시된 데이터는 주로 유방암 세포주에 기초한 것이지만, 본 접근법의 화합물은 다른 유형의 암에 대해 효능을 갖는다. 이전 연구에서, 본 발명자들은 미토콘드리아 생물발생 억제제가 여러 종양 유형으로부터의 광범위한 세포주에서 종양-구체 형성을 성공적으로 억제하였음을 입증하였다. 하기 표 12에는 미토콘드리아 생물발생 억제제에 민감한 것으로 나타난 암 세포주가 나열되어 있다. 이것은 다양한 암 유형이 종양 재발 및 전이를 포함한 성장을 위해 ATP에 크게 의존함을 보여준다. 따라서 이러한 암 유형에서 CSC의 ATP 생성을 억제하면 맘모스피어 형성을 억제하고, 그 결과 종양 재발 및/또는 전이의 가능성을 예방 및/또는 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, 이러한 결과가 주어졌으므로, 본 접근법은 수많은 암 유형에 대해 효과적이다.
Figure pct00023
표 12. 미토콘드리아 생물발생 억제는 다양한 암 유형에 대해 효과적이다.
다음 단락은 본 명세서에 기재된 데이터를 생성하는 데 사용된 물질 및 분석법을 설명한다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 명세서에 기재된 바와 동일한 분석을 수행하고, 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물의 물리적, 화학적, 및 약학적 특성을 평가하기 위해 본 기술분야에 일반적으로 공지된 다른 분석을 활용할 수 있음을 이해해야 한다.
생물정보학적 분석: 2D-단층 및 3D-맘모스피어를 비교하는 편향되지 않은 무표지 단백질 유전 연구는 MCF7 및 T47D 유방암 세포주를 이용하여 수행하였다. 본 접근법을 벗어나지 않으면서 다른 세포주를 이용할 수 있음을 이해해야 한다. NCBI 데이터베이스에 보관되고 3D 성장, 전이 및 순환 종양 세포(CTC)와 관련하여 공개적으로 이용가능한 다양한 GEO 데이터세트(GSE36953; GSE2034; GSE59000; GSE55470)를 사용하여 정보학적 분석을 수행하였다. 이러한 GEO 데이터세트에서 유전자 발현 프로파일링 데이터를 추출하였다. 히트맵은 퀴아젠 오믹소프트 스위트 소프트웨어로 생성하였다. 화산 플롯은 온코랜드 전이성 암(퀴아젠 오믹소프트 스위트)에 있는 주석을 조사하여 생성하였다. 또한, 주석이 달린 유전자에 대해 독창성 경로 분석 소프트웨어(IPA; 퀴아젠)를 이용하여 기능적 "핵심 분석"을 수행하였다. cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)을 이용하여 The Metastatic Breast Cancer Project Provisional(2020)에서 유전자 동시 발현 프로필을 추출하였다; mRNA 발현 프로파일링(RNA Seq V2 RSEM)은 146명의 환자로부터 얻은 전이성 유방암 샘플의 RNA 시퀀싱을 통해 수행하였다.
카플란 마이어(K-M) 분석을 ATP5F1C에 대해 수행하였다. 개방형 온라인 생존 분석 도구를 이용하여 최대 3,951명의 유방암 환자로부터 공개적으로 이용가능한 마이크로어레이 데이터를 조사했다. 이를 위해, ER(+) 환자의 데이터를 분석하였다. 편향된 배열 데이터는 분석에서 제외하였다. 이를 통해 유의미한 예후 마커인 ATP5F1C(ATP5C1로도 알려짐)를 확인할 수 있었다. 최적의 자동 선택 컷오프에서 위험 비율을 계산하고, 로그 순위 시험을 이용하여 p값을 계산하고 R에 플롯팅하였다. K-M 곡선은 일변량 분석: https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast을 이용하여, K-M 플로터(고해상도 TIFF 파일)를 이용하여 온라인으로 생성하였다. 이 접근법은 종양 재발(RFS, 무재발 생존) 및 원격 전이(DMFS, 원격 무전이 생존)의 마커로서 ATP5F1C의 인 실리코 검증을 직접 수행할 수 있게 했다. 이러한 모든 분석에는 최신 2020 버전의 데이터베이스가 활용되었다.
시약 및 모델 세포주: 본 접근법을 벗어나지 않으면서 다른 세포주를 사용할 수 있음이 명백해야 한다. 바이오트래커 ATP-레드 1(#SCT045)은 머크 밀리포아 사(Merck-Millipore, Inc.)에서 상업적으로 구입하였다. 삼중 음성 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231은 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC)에서 구입했다. 비발암성 인간 유방 상피 세포주인 MCF10A 세포도 ATCC에서 구입했다. MDA-MB-231 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS, 시그마 알드리치), 2mM 글루타맥스(깁코, 라이프 테크놀로지스, 월섬, MA, USA), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(깁코, 라이프 테크놀로지스)이 보충된 DMEM(고 포도당)에서 배양하였다. MCF10A 세포주는 0.4% 소 뇌하수체 추출물(BPE), 0.1% 인슐린, 0.1% hEGF, 0.1% 히드로코르티손, 0.1% GA-1000, 및 100 ng/㎖의 콜레라 독소가 보충된 유방 상피 세포 성장 배지(MEGM; 론자, 바젤, 스위스)에서 유지하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO2, 가습 분위기에서 배양하였다.
바이오트래커 ATP-레드 1을 이용한 ATP 분석: 다양한 처리 후 바이오트래커 ATP-레드 1로 세포를 염색하였다. 인큐베이션 30분 후, 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 수집하고 40㎛ 세포 여과기를 이용해 단일 세포 현탁액으로 분리했다. Attune NxT 유세포 분석기를 이용하여 세포를 분석하였다. 신호의 평균(570nm에서)을 비교하였다.
3D 고정 독립적 성장 분석: 이 분석은 맘모스피어 형성 분석이라고도 지칭한다. 효소적, 및 수동적 분해(25g 바늘)를 이용하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 이후, (2-히드록시에틸메타크릴레이트)(폴리-HEMA, 시그마 알드리치 사)로 미리 코팅된 배양 접시에서, 비부착성 조건 하에서 맘모스피어 배지(DMEM-F12 + 1X B-27 부가 보충물 + 20 ng/㎖ EGF + 펜/스트렙)에("맘모스피어 플레이트"라고 함) 세포를 500 세포/㎠의 밀도로 도말하였다. 세포를 5일 동안 성장시키고 37℃의 가습 인큐베이터에서 유지시켰다. 배양 5일 후, 접안렌즈("계수선")를 이용하여 >50㎛의 3D-맘모스피어를 계수하고, 구체를 형성하는 도말된 세포의 백분율을 계산하였고 백분율 맘모스피어 형성이라고 지칭하며, 1로 정규화하였다(1 = 100% MFE). 3D 맘모스피어 형성 효율(MFE)은 세포의 ATP-낮음 및 ATP-높음 하위-개체군 모두에서 분석하였다. 모든 3D 맘모스피어 실험은 최소 3회 독립적으로 3중으로 수행하였다.
shRNA 렌티바이러스 형질도입: 렌티바이러스 플라스미드, 패키징 세포 및 시약은 진코포에이아(Genecopoeia)에서 구입하였다. 분주 후 48시간 후, 293Ta 패키징 세포를 유도성 U6 프로모터, CMV 프로모터-TetR-SV40 프로모터-eGFP-IRES-퓨로마이신과 함께, 렌티바이러스 psi-LVRInU6TGP 벡터에, 인간 ATP5F1C에 대한 모든 3개의 변이체에 대한 3개 구축물의 shRNA 클론 세트를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 스크램블된 대조군 psi-LVRInU6TGP 벡터(sh-대조군)를 동시에 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 렌티바이러스 함유 배양 배지를 0.45㎛ 필터에 통과시키고 5 ㎍/㎖ 폴리브렌의 존재 하에 표적 세포(MDA-MB-231)에 첨가하였다. 1.5 ㎍/㎖의 퓨로마이신 농도로, 감염된 세포를 선택하였다.
웨스턴 블롯팅: 완충액 10㎖ 당 완전한 TM 억제제 믹스(로쉐 어플라이드 사이언스, 인디애나폴리스) 1정 및 PhosSTOP™ 포스페이트 억제제 1정을 함유하는 RIPA 완충액(시그마 알드리치 사)에서 세포를 용해시키고 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 겔을 트랜스-플롯 터보 트랜스퍼 시스템(바이오-라드 사)을 이용하여 0.2㎛ 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 트리스-완충 식염수, 0.1% 트윈 20(시그마 알드리치 사) 및 5% 소 혈청 알부민(BSA; 시그마 알드리치 사)(TBST)에 희석된 각각의 1차 항체와 함께 인큐베이션하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 블롯을 세척하고 적절한 2차 항체와 함께 인큐베이션하고 G-Box(신진 사)를 사용하여 슈퍼 시그널 웨스트 피코 화학발광 기질(써모 싸이언티픽 사)을 이용하여 검출하였다. 웨스턴 블롯 분석에 사용된 항체 및 희석액은 다음과 같다: 마우스 항-ATP5F1C 1:500, 마우스 항-β-액틴 1:10,000, 토끼 항-PARP 1:1,000, 토끼 항-p21 1:1,000. 생성된 면역 블롯 이미지는 제네시스 소프트웨어(신진 사)를 이용하여 획득하였다.
FACS에 의한 세포 주기 분석: 세포 주기 분석은 Attune NxT 유세포 분석기를 이용한 FACS 분석에 의해, ATP-높음 및 ATP-낮음 세포 하위-개체군에 대해 수행하였다. 간단히 말해서, 트립신 처리 후, 재현탁된 세포를 제조업체의 권장사항(머크 밀리포어 사)에 따라 요오드화 프로피디움과 함께 인큐베이션하였다. 조건 당 최소 25,000개의 사건을 분석하였다. 관문 세포를 세포 주기 단계로 분류하였다.
세포 이동 분석: 간략하게, 0.1% BSA를 함유하는 무혈청 DMEM 0.5㎖ 중의 3.5×104개 세포를 8-㎛ 공극, 코팅되지 않은 막 변형 보이든 챔버(트랜스웰)의 웰에 넣었다. 하부 챔버는 화학 유인물질로서 작용하도록 DMEM에 10% 태아 소 혈청을 포함하였다. 세포를 37℃에서 인큐베이션하고 16시간의 과정 동안 이동하도록 하였다. 면봉으로 문질러 막의 상부 표면에서 비침습성 세포를 제거하였다. 챔버를 100% 메탄올에 희석한 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 30-60분 동안 염색하고, 물로 헹구고 명시야 현미경으로 검사하였다. 침입 및 이동에 대한 값은 막(20× 대물렌즈) 당 5개의 필드를 계수하여 수득했고 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
종양 성장, 전이 및 배아 독성 분석: 이종이식 분석은 INOVOTION(Societe: 811310127)(라 트롱쉐 - 프랑스)에 의해 수행되었다. 수정된 백색 레그혼종 알을 37.5℃, 상대 습도 50%에서 9일 동안 인큐베이션하였다. 그 때(E9), 달걀껍질을 통해 작은 구멍을 뚫어 융모요막(CAM)을 기낭으로 떨어뜨리고, CAM 위의 달걀껍질에 1㎠의 창을 절단했다. MDA-MB-231 종양 세포주는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. E9일에, 세포를 트립신으로 분리하고, 완전 배지로 세척하고 이식 배지에 현탁시켰다. 1×106 MDA-MB-231 세포의 접종물을 각각의 알(E9)의 CAM에 첨가한 후 알을 무작위로 군 분류하였다. E10일에, 종양을 검출할 수 있었고, 이후 8일 동안 비히클 단독(PBS 중 1% DMSO) 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 3가지 상이한 투여량의 베다퀼린 또는 베다퀼린 접합체로 매일 처리하였다. 18일(E18)에, 각각의 알에서 CAM의 상부를 제거하고, PBS로 세척한 후 파라포름알데히드로 직접 옮기고(48시간 동안 고정) 칭량하였다. 종양 성장 분석을 위해, 군 당 최소 14개(N ≥ 14)의 종양 샘플을 수집하고 분석했다. E18일에, 하부 CAM의 1㎠ 부분을 수집하여 군 당 최소 7개(N ≥ 7)의 샘플에서 전이성 세포의 수를 평가하였다. CAM(상업용 키트)에서 게놈 DNA를 추출하고 인간 Alu 서열에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 qPCR로 분석했다. 각 샘플에 대한 Cq 계산, 평균 Cq 및 각 군에 대한 상대적인 전이 양은 바이오-라드® CFX 마에스트로 소프트웨어에서 직접 관리한다. 모든 데이터에 대해 사후 검정을 이용한 일원분산분석을 수행하였다. 각 투여 전에, 살아있는 배아와 죽은 배아의 수를 점수화하여 처리 관용성을 평가하였다.
통계 분석: 모든 분석은 그래프패드 프리즘 6으로 수행하였다. 데이터는 평균 ± SD(또는 표시된 경우 ± SEM)로 표시하였다. 모든 실험은 시험된 각 실험 조건에 대해 >3의 기술 복제본을 이용하여 독립적으로 최소 3회 수행하였다(예로, 대표 데이터가 표시된 경우와 같이 달리 명시되지 않는 한). 통계적으로 유의미한 차이는 스튜던트 t 검정 또는 분산 분석(ANOVA) 검정을 이용하여 결정하였다. 여러 군 간의 비교를 위해 일원분산분석을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다. p < 0.05는 유의미한 것으로 간주되었다.
본 접근법의 일부 구현예는 전이의 가능성을 예방 및/또는 감소시키기 위한 조성물과 같은 약학 조성물의 형태를 취할 수 있음을 이해해야 한다. 본 접근법의 약학 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 내에 활성 화합물로서 베다퀼린 또는 지방산을 갖는 베다퀼린 유도체(이의 염 포함함)를 포함할 수 있다. 용액이 필요한 경우, 물은 수용성 화합물 또는 염에 대한 선택적 담체가 될 수 있다. 수용해도와 관련하여, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이들의 혼합물과 같은 유기 비히클이 적합할 수 있다. 추가로, 본 접근법을 벗어나지 않으면서 수용해도를 증가시키는 방법이 사용될 수 있다. 후자의 경우, 유기 비히클은 상당한 양의 물을 함유할 수 있다. 이후, 두 경우 모두 용액은 예를 들어 0.22-마이크론 필터를 통한 여과에 의해, 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 적절한 방식으로 멸균될 수 있다. 멸균 후 용액은 발열원 제거된 유리 바이알과 같은 적절한 용기에 분배될 수 있다. 분배는 선택적으로 무균 방법으로 수행된다. 이후 멸균된 마개를 바이알에 놓고, 원하는 경우, 바이알 내용물을 동결건조할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 접근법은 특정 투여 형태에 제한되지 않는 것으로 의도된다.
활성 화합물 이외에, 본 접근법의 약학 제형물은 본 기술분야에 공지된 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 산(예로, 염산), 및 염기 또는 완충액(예로, 나트륨 아세테이트, 나트륨 보레이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 글루코네이트, 나트륨 락테이트, 및 나트륨 포스페이트)과 같은 pH 조절제를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 메틸파라벤, 프로필파라벤, 및 벤질 알코올과 같은 항미생물 보존제를 포함할 수 있다. 항미생물 보존제는 제형물이 다회용으로 설계된 바이알에 배치될 때 종종 포함된다. 본 명세서에 기재된 약학 제형물은 본 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 동결건조될 수 있다.
활성 화합물의 경구 투여를 포함하는 구현예에서, 약학 조성물은 캡슐, 정제, 알약, 분말, 용액, 현탁액 등의 형태를 취할 수 있다. 나트륨 시트레이트, 칼슘 카보네이트 및 칼슘 포스페이트와 같은 다양한 부형제를 함유하는 정제는 전분(예로, 감자 또는 타피오카 전분) 및 특정 복합 실리케이트과 같은 다양한 붕해제와 함께, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 결합제와 함께 사용될 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 탈크와 같은 윤활제가 타정 목적으로 포함될 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물이 연질 및 경질 충진 젤라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수 있다. 이와 관련된 물질에는 락토오스 또는 유당, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜도 포함된다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여에 필요한 경우, 현재 개시된 주제의 화합물은 다양한 감미제, 향미제, 착색제, 유화제 및/또는 현탁제, 및 희석제 예컨대 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이들의 다양한 유사 조합과 조합될 수 있다.
본 명세서에 제공된 추가적인 구현예는 본 명세서에 개시된 활성 화합물의 리포좀 제형물을 포함한다. 리포좀 현탁액을 형성하는 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 화합물이 수용성 염인 경우, 종래의 리포좀 기술을 이용하여, 지질 소포에 이것을 혼입할 수 있다. 그러한 예에서, 활성 화합물의 수용해도로 인해, 활성 화합물은 리포좀의 친수성 중심 또는 코어 내에 실질적으로 동반될 수 있다. 사용된 지질층은 임의의 통상적인 조성물일 수 있고 콜레스테롤을 함유하거나 콜레스테롤을 함유하지 않을 수 있다. 관심 있는 활성 화합물이 수불용성인 경우, 다시 종래의 리포좀 형성 기술을 사용하면, 염은 리포좀의 구조를 형성하는 소수성 지질 이중층 내에 실질적으로 동반될 수 있다. 두 경우 모두, 표준 초음파처리 및 균질화 기술을 사용하여, 생성되는 리포좀의 크기를 줄일 수 있다. 본 명세서에 개시된 활성 화합물을 포함하는 리포좀 제형물은 동결건조되어서, 리포좀 현탁액을 재생하기 위한 물과 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 이용해 재구성될 수 있는 동결건조물을 생성할 수 있다.
약학 조성물과 관련하여, 본 명세서에 기재된 활성 화합물(예로, 베다퀼린 또는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체)의 약학적 유효량은 보건 의료인에 의해 결정될 것이며, 환자의 상태, 크기 및 나이, 및 전달 경로에 따라 달라질 것이다. 하나의 비제한적 구현예에서, 약 0.1 내지 약 200 ㎎/㎏의 투여량은 치료 효능을 가지며, 여기서 중량비는 대상체의 중량에 대한, 염이 사용되는 경우를 포함한, 활성 화합물의 중량이다. 일부 구현예에서, 투여량은 최대로 약 1 및 5, 10, 20, 30, 또는 40μM 사이의 활성 화합물의 혈청 농도를 제공하는 데 필요한 활성 화합물의 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 10, 일부 구현예에서 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏의 투여량이 경구 투여에 사용될 수 있다. 전형적으로, 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏의 투여량이 근육내 주사에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 정맥 내 또는 경구 투여용 화합물의 투여량은 약 1 μmol/㎏ 내지 약 50 μmol/㎏, 또는, 선택적으로, 약 22 μmol/㎏ 내지 약 33 μmol/㎏일 수 있다. 경구 투여 형태는 예를 들어 정제 또는 다른 고체 투여 형태 당 5㎎ 내지, 50, 100, 200, 또는 500㎎을 포함하는 임의의 적절한 양의 활성 화합물을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 유리 염기 또는 염으로서 활성 화합물을 사용할 수 있다. 일반적인 염은 모노하이드레이트 및 하이클레이트를 포함하고, 후자는 용해도를 개선하는 데 유용할 수 있다. 실증적 약학 조성물이 제공되며, 이것은 단지 비제한적인 예를 의미한다. 캡슐 형태에서, 조성물은 50㎎ 또는 100㎎의 활성 화합물을 베이스로서 포함할 수 있다. 다른 성분은 젤라틴, 마그네슘 스테아레이트, 셸락 유약, 나트륨 라우릴 설페이트, 전분, 퀴놀린 옐로우(E104), 에리트로신(E127), 패턴트 블루 V(E131), 이산화티타늄(E171), 흑색 산화철(E172), 및 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 지연 방출 정제 형태는 60㎎ 또는 120㎎의 활성 화합물, 및 각각 3.6㎎ 또는 7.2㎎의 나트륨, 및 락토오스 모노하이드레이트; 미정질 셀룰로오스; 나트륨 라우릴 설페이트; 염화나트륨; 탈크; 무수 락토오스; 옥수수 전분; 크로스포비돈; 마그네슘 스테아레이트; 및 셀룰로오스 폴리머 코팅;을 포함하는 불활성 성분을 포함할 수 있다. 본 접근법을 벗어나지 않으면서 다른 약학 조성물이 사용될 수 있음을 이해해야 하며, 임의의 특정 제형물로 제한하려는 의도는 아니다.
일부 구현예에서, 활성 화합물은 푸마레이트 염과 같은 염으로서 존재할 수 있다. 활성 화합물의 푸마레이트 염은 물에 불용성이다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 정제 형태일 수 있고, 활성 화합물은 콜로이드성 이산화규소, 크로스포비돈, 하이프로멜로스 2910, 폴리소르베이트 20, 규화 미정질 셀룰로오스, 및 나트륨 스테아릴 푸마레이트와 같은 불활성 성분과 함께 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 정제의 형태일 수 있고, 활성 화합물은 콜로이드성 이산화규소, 옥수수 전분, 크로스카르멜로스 나트륨, 하이프로멜로스 219, 락토오스 모노하이드레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미정질 셀룰로오스, 및 폴리소르베이트 20과 같은 불활성 성분과 함께 존재할 수 있다. 정확한 제형물은 특정 구현예에 의존하고, 통상의 지식을 가진 자는 본 기술분야에 공지되고 이용가능한 제형물 방법을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 접근법은 약학적 유효량의 하나 이상의 약학 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 본 접근법은 전이를 유발할 가능성이 있는 CSC 개체군을 근절함으로써, 원래의 CSC 개체군으로부터의 전이 및 재발 가능성을 예방하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 접근법은 종양 재발, 전이의 가능성을 예방 및/또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특히 수술 후 종양이 재발하거나 전이되기 때문에 항암 치료는 종종 실패한다. CSC 미토콘드리아 활성은, 적어도 부분적으로, 이러한 치료 실패 원인에 대해 책임이 있다. 본 접근법의 구현예는 종래의 암 치료법이 실패한 상황에서, 및/또는 종양 재발 및/또는 전이로 인한 실패 가능성을 예방 또는 감소시키기 위해 항암 치료법과 함께 사용될 수 있다. 활성 화합물로서 본 명세서에 기재된 베다퀼린 또는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체를 함유하는 약학 조성물의 약학적 유효량이 환자에게 투여될 수 있다. 환자는 암에 걸렸거나, 암에 걸릴 위험이 있거나, 또는 종양 재발 및/또는 전이의 위험이 있을 수 있다.
그 전문이 참조로서 포함되고, 출원인의 동시 계류 중인 2018년 6월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/686,881, 및 2018년 9월 14일에 출원된 62/731,561에 기재된 바와 같이, e-CSC는 증식과 관련된 CSC 표현형을 나타낸다. 벌크 암 세포 및 CSC에 더하여, 본 발명자들이 e-CSC로 지칭하는 과증식성 세포 하위-개체군을 표적화하기 위해 본 접근법이 사용될 수 있음을 이해해야 하며, e-CSC는 줄기 마커(ALDH 활성 및 맘모스피어 형성 활성)의 점진적인 증가, 고도로 증가된 미토콘드리아 질량, 및 증가된 해당작용 및 미토콘드리아 활성을 나타낸다.
전술한 바에 비추어 볼 때, 본 접근법은 구현예에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 접근법의 구현예는 조성물, 특히 약학 조성물의 형태를 취할 수 있다. 치료 화합물은 활성 성분일 수 있으며, 약학적 유효량으로 존재할 수 있다.
본 접근법의 구현예는 또한 종양 재발 및 전이 중 적어도 하나의 가능성을 예방 또는 감소시키는 방법의 형태를 취할 수 있다. 일부 구현예에서, 그의 활성 화합물로서 베다퀼린을 갖는 조성물의 유효량이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그의 활성 화합물로서, 본 명세서에 기재된 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체를 갖는 조성물의 유효량이 투여될 수 있다.
본 접근법의 일부 구현예는 본 명세서에 기재된 ATP-관련 유전자 시그니처를 이용한 동반 진단의 형태를 취할 수 있다. 유전자 시그니처는 전술한 바와 같이 베다퀼린 또는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체를 사용한 ATP 억제 치료법으로부터 이익을 얻을 수 있는 암 환자를 식별하기 위한 동반 진단으로서 사용될 수 있다. 일단 확인되면, 후보자는 활성 화합물로서 베다퀼린 또는 지방산 모이어티를 갖는 베다퀼린 유도체를 포함하는 조성물의 약학적 유효량을 수용할 수 있다.
암의 생물학적 상피 샘플이 수득될 수 있고, 생물학적 샘플의 선택된 유전자 시그니처에서 각 바이오마커의 수준은 본 기술분야에 공지되고 이용가능한 바이오마커 발현을 측정하는 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 결정된 수준은 시그니처 내의 각 바이오마커에 대한 역치 수준과 비교되고, 유전자 시그니처에서 결정된 바이오마커의 수준이 역치 수준을 초과하는 경우 약학적 유효량의 ATP 억제제가 투여된다. 바람직하게는, 유전자 시그니처에서 모든 바이오마커에 대해 결정된 수준이 바이오마커에 대한 역치 수준을 초과하는 경우 ATP 억제제가 투여된다. 각각의 바이오마커에 대한 역치 수준은 동일한 대상체의 비암성 상피 샘플을 이용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "한", "하나" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명은 다음의 상세한 설명을 고려하여 명백해지는 바와 같이, 수많은 대안, 수정, 및 등가물을 포함한다.
본 발명의 다양한 요소를 설명하기 위해 "제1", "제2", "제3", "a)", "b)" 및 "c)" 등의 용어가 사용될 수 있지만 청구범위는 이러한 용어에 의해 제한되어서는 안 됨을 이해할 것이다. 이러한 용어는 본 발명의 한 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용된다. 따라서, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 한, 이하에서 논의되는 제1 요소는 구성요소 측면으로 명명될 수 있고, 유사하게 제3 요소로 명명될 수 있다. 따라서, "제1", "제2", "제3", "a)", "b)", 및 "c)" 등의 용어는 관련 요소에 순서 또는 다른 계층을 반드시 전달하려는 것이 아니라 식별 목적으로만 사용된다. 작업(또는 단계)의 순서는 청구범위에 제시된 순서로 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, (기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서) 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 맥락에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 본 명세서에서 명시적으로 정의되지 않는 한 이상화되거나 과도한 공식적 의미로 해석되어서는 안 됨을 또한 이해할 것이다. 본 명세서에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로서 포함된다. 용어 상충이 있는 경우, 본 명세서가 우선한다.
또한, 본 명세서에서 사용될 때, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안("또는")으로 해석될 때의 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
"치료 주기"라는 구절은 정기적으로 또는 사전 정의된 기준으로 반복되는 투여 일정과 같은 치료 과정을 지칭한다. 치료 주기는 수일 간의 치료 후 수일 간의 휴식을 포함할 수 있다. 예를 들어, 4주 치료 주기에 걸쳐서, 제제를 2주 동안 매일 투여한 후 2주 동안 치료하지 않을 수 있다. 치료 주기는 개체에서 원하는 반응을 이끌어 내기 위해, 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중뿐만 아니라 특정 제제(들) 및/또는 방법론과 같은 여러가지 요인에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 구체적으로 의도한다. 나아가, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 명세서에서 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함한다고 기술하는 경우, A, B 또는 C 중 임의의 것, 또는 이들의 조합이 생략되고 부인될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
본 명세서에서 사용될 때, 전환구 "필수적으로 구성된"(및 문법적 변형)은 인용된 물질 또는 단계 및 청구된 본 발명의 "기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 사용될 때 "필수적으로 구성된"이라는 용어는 "포함하는"과 동등한 것으로 해석되어서는 안 된다.
예를 들어, 양 또는 농도 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 특정 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 또는 심지어 ±0.1%의 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 측정가능한 값에 대해 본 명세서에서 제공되는 범위는 임의의 다른 범위 및/또는 그 안의 개별 값을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예를 설명하였지만, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명은 이하 청구되는 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 명백한 변형이 가능하기 때문에 상기 설명에 제시된 특정 세부사항에 의해 제한되지 않음을 이해해야 한다.

Claims (15)

  1. 대상체에서 종양 재발 및 전이 중 적어도 하나를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은:
    베다퀼린 및 지방산을 갖는 베다퀼린 유도체로부터 선택되는 활성 화합물의 약학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성 화합물은
    Figure pct00024
    이고, 여기서 n은 3 내지 18의 정수인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    n은 12인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성 화합물은
    Figure pct00025
    이고, 여기서 R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C1-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n은 1 내지 18의 정수이고;
    m은 1 내지 12의 정수이고; 및
    A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화되는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    R은 메틸이고, n은 12이고, m은 4이고, A는 O인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성 화합물은
    Figure pct00026
    이고, 여기서 R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n은 1 내지 18의 정수이고;
    m은 1 내지 12의 정수이고;
    A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 총족시키기 위해 필요에 따라 양성자화되고; 및
    B는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화되는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    R은 메틸이고, n은 12이고, m은 4이고, A는 O이고, B는 부재하는 것인 방법.
  8. 하기 구조의 화합물:
    Figure pct00027
    , 여기서 n은 3 내지 18의 정수이다.
  9. 청구항 8에 있어서,
    n이 12인 화합물.
  10. 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00028
    , 여기서 R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C1-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n은 1 내지 18의 정수이고;
    m은 1 내지 12의 정수이고; 및
    A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화된다.
  11. 청구항 10에 있어서,
    R은 메틸이고, n은 12이고, m은 4이고, A는 O인 화합물.
  12. 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00029
    , 여기서 R은 H, 치환 또는 비치환 C1-C6 직쇄 알킬, 치환 또는 비치환 C3-C6 분지형 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n은 1 내지 18의 정수이고;
    m은 1 내지 12의 정수이고;
    A는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화되고; 및
    B는 부재하거나 C, O, N, 또는 S로부터 선택되고, 원자가를 충족시키기 위해 필요에 따라 양성자화된다.
  13. 청구항 12에 있어서,
    R은 메틸이고, n은 12이고, m은 4이고, A는 O이고, B는 부재하는 것인 화합물.
  14. 환자에서 종양 전이 및 종양 재발의 가능성을 예방 및/또는 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    환자로부터 암의 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    ABCA2, ATP5F1C, COX20, NDUFA2 및 UQCRB로 이루어진 ATP 관련 전이 유전자 시그니처의 생물학적 샘플에서 바이오마커 수준을 결정하거나, 또는 결정한 단계;
    결정된 수준을 바이오마커에 대한 역치 수준과 비교하는 단계; 및
    결정된 수준이 역치 수준을 초과하는 경우 베다퀼린 및 지방산을 갖는 베다퀼린 유도체로부터 선택되는 활성 화합물을 함유하는 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계;를 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 활성 화합물은 청구항 8 내지 청구항 13 중 어느 한 항의 화합물인 방법.
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