PT2154971E - Combinação farmacêutica sinérgica para o tratamento de cancro - Google Patents

Description

ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Combinação farmacêutica sinérgica para o tratamento de cancro"

Campo da Invenção: A presente invenção refere-se a uma nova combinação farmacêutica para o tratamento de cancro em que a referida combinação exibe um efeito sinérgico. A combinação farmacêutica compreende um agente antineoplásico citotóxico seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e pelo menos um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) seleccionado entre os compostos de fórmula I (como aqui descrito) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção refere-se também a um método para o tratamento de cancro, método esse que compreende a administração a um paciente, necessitado desse tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida combinação.

Anterioridade da Invenção: 0 cancro é um termo geral utilizado para descrever doenças em que células anormais de dividem sem controlo. As células cancerosas podem invadir tecidos vizinhos e podem espalhar-se através da corrente sanguínea e do sistema linfático para outras partes do corpo. Existem diferentes tipos de cancros tais como cancro da bexiga, cancro da mama, cancro do cólon, cancro rectal, cancro da cabeça e pescoço, cancro do endométrio, cancro do rim (de células renais), leucemia, cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro pancreático, cancro da próstata, cancro da tiróide, cancro da pele, linfoma não hodgkiniano e melanoma. Presentemente existem mais tratamentos disponíveis para o cancro do que sempre existiram, incluindo quimioterapia, radiação, cirurgia, terapia hormonal, imunoterapia e terapia génica. A quimioterapia é o tratamento utilizado por rotina contra muitos tipos de cancro. Os agentes quimioterapêuticos mais amplamente utilizados (os agentes antineoplásicos) incluem paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, 2 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ etoposido, carboplatina, cisplatina, topotecano e gencitabina. Estes e outros agentes antineoplásicos semelhantes têm sido utilizados com sucesso para o tratamento de diferentes cancros. Contudo, em devido tempo, verificou-se gue alguns pacientes de cancro desenvolvem resistência a monoterapias gue envolvem a utilização destes agentes antineoplásicos padrão. A tolerância ou a resistência a um fármaco representam o principal impedimento ao sucesso de um tratamento. Esta resistência é freguentemente considerada como intrínseca (i.e. presente no início do tratamento) ou adguirida (i.e. ocorre durante o decorrer da guimioterapia). Um estudo envolvendo a exposição de células de cancro do pulmão de células não pequenas humano (NC1-H460) a concentrações gradualmente crescentes de doxorrubicina relatou o surgimento de uma nova linha celular (NCI-H460/R) que era resistente a doxorrubicina (96,2 vezes) e cruzadamente resistente a etoposido, paclitaxel, vimblastina e epirrubicina (J. Chemother., 2006 Feb; 18(1) 66-73). Noutro estudo que descreve a prevalência de resistência a quimioterapia in vitro em culturas tumorais de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), foi relatada resistência extrema a fármacos ou resistência intermédia a fármacos para vários agentes antineoplásicos incluindo cisplatina, doxorrubicina, etoposido, gencitabina, navelbina, paclitaxel, taxotere e topotecano (Ann. Thorac. Surg. 2006 Feb; 81 (2) :440-6; discussão 446-7). A gencitabina foi considerada o fármaco mais clinicamente activo para o tratamento de cancro pancreático, contudo, não conseguiu melhorar significativamente a condição de pacientes de cancro pancreático devido à pré-existência ou aquisição de quimiorresistência ao fármaco da maioria das células tumorais (Oncogene 2003 May 22; 22(21): 3243-51). Outro problema observado ou prevalecente no tratamento do cancro é a grave toxicidade associada à maioria dos agentes antineoplásicos. A incidência de graves efeitos secundários tais como toxicidade cardíaca no caso de fármacos como a doxorrubicina, foi relatada em J Egypt Natl Canc Inst 2005 Dec_17 (4)_291-300. Apesar da incidência de resistência e grave toxicidade associadas aos agentes antineoplásicos convencionais e.g. gencitabina, paclitaxel, estes agentes continuarão a ser importantes no tratamento do cancro porque têm a capacidade de reduzir a massa tumoral. De modo a melhorar a taxa de resposta e prevenir a toxicidade associada aos agentes antineoplásicos 3 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ convencionais, estão a ser avaliadas novas abordagens terapêuticas. Uma destas abordagens é dirigida a um protocolo que envolve a combinação de diferentes agentes anticancerosos possuindo diferentes mecanismos biológicos (Jekunen et al., Br. J. Câncer, 69, 299-306 (1994); Yeh et al., Life Sciences, 54, 431-35 (1994)). Um protocolo de quimioterapia de combinação óptimo pode resultar numa eficácia terapêutica aumentada, na diminuição da toxicidade para o hospedeiro e numa resistência a fármacos minima ou retardada. Quando se combinam fármacos com diferentes toxicidades, cada fármaco pode ser utilizado na sua dose óptima, ajudando a minimizar efeitos secundários intoleráveis, como relatado para a combinação de capecitabina e docetaxel em Oncology (Williston Park). 2002 Oct; 16:17-22. Verificou-se que alguns dos agentes antineoplásicos são sinergicamente eficazes quando utilizados em combinação com outros agentes anticancerosos relativamente a quando são utilizados como monoterapia. Por exemplo, a ciclofosfamida e o 5-fluorouracilo actuam sinergicamente em células de adenocarcinoma ovariano de células claras como relatado em Câncer Lett. 2001 Jan 10; 162(1):39-48. A quimioterapia de combinação pode também ser vantajosamente utilizada para o tratamento de cancros em estádios avançados que são dificeis de tratar com monoterapia, radiação ou tratamento cirúrgico, por exemplo, uma combinação de paclitaxel e gencitabina foi relatada para o tratamento de cancro do pulmão de células não pequenas metastático (Câncer, 2006 Sep 1; 107 (5) :1050-4) .

Recentemente, foi tentada a combinação de um ou mais agentes antineoplásicos padrão tais como paclitaxel, cisplatina, etc. com um agente anticanceroso molecularmente direccionado para o tratamento de cancro, para melhorar as taxas de resposta aos fármacos e para abordar a resistência aos agentes antineoplásicos. Os agentes molecularmente direccionados e.g. mesilato de imatinib, flavopiridol, etc. modulam proteínas, tais como quinases, cujas actividades estão mais especificamente associadas com células cancerosas. Investigações ao longo de um período de tempo longo provaram que os membros da família das quinases dependentes de ciclina (CDK) desempenham papéis-chave em vários processos celulares. Conhecem-se até agora 11 membros da família das CDK. Entre eles, sabe-se que as CDK1, 2, 3, 4 e 6 desempenham importantes 4 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ papéis no ciclo celular (Cyclins and cyclin-dependent kinases: theme and variations. Adv Câncer Res. 1995;66:181-212). As CDK são activadas pela formação de complexos não covalentes com ciclinas tais como as ciclinas do tipo A, B, C, D (Dl, D2 e D3) e E. Cada isozima desta família é responsável por aspectos particulares (sinalização celular, transcrição, etc.) do ciclo celular, e algumas das isozimas CDK são especificas para determinados tipos de tecidos. A expressão aberrante e a sobre-expressão destas quinases estão evidenciadas em muitas condições de doença. Foram desenvolvidos e relatados na literatura vários compostos possuindo propriedades inibitórias de CDK potencialmente úteis. 0 flavopiridol é o primeiro inibidor potente de quinases dependentes de ciclina (CDK) a atingir os ensaios clínicos. Verificou-se que o flavopiridol potência sinergicamente a resposta citotóxica dos agentes antineoplásicos convencionais numa variedade de linhas celulares de cancro. Por exemplo, foi relatado o tratamento sequencial de cancro do cólon HCT116 com docetaxel, flavopiridol e 5-fluorouracilo em Acta Pharmacol Sin. 2006 Oct; 27(10):1375-81. Igualmente, o tratamento combinado com docetaxel e flavopiridol foi relatado para células de cancro do pulmão em Radiother Oncol. 2004 May; 71(2) :213-21 e para o tratamento de cancro gástrico em Mol Câncer Ther. 2003 Jun;2(6) :549-55.

Embora as combinações de agentes anticancerosos se tenham provado um avanço significativo nos protocolos de tratamento do cancro, existem ainda várias necessidades por atender e existe espaço para melhoramentos de medicações para o tratamento de cancros, que são difíceis de tratar, ou que apresentaram resistência ao tratamento com os agentes antineoplásicos convencionais em monoterapia. Mais particularmente, o desenvolvimento de novas abordagens de combinação para a entrega de agentes anticancerosos conhecidos possuindo diferentes mecanismos de acção representaria um importante avanço na especialidade. Embora o protocolo que envolve a combinação de agentes anticancerosos possuindo diferentes mecanismos de acção possa funcionar no caso de algumas combinações, pode não funcionar da mesma maneira para outra combinação de agentes anticancerosos e essa combinação pode não resultar sempre numa combinação com efeitos terapêuticos vantajosos. Contudo, os presentes inventores 5 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ verificaram surpreendentemente que uma nova combinação farmacêutica de agentes anticancerosos conhecidos compreendendo um inibidor de quinase dependente de ciclina seleccionado entre compostos representados pela fórmula I (como aqui descrito) e um agente antineoplásico citotóxico padrão para o tratamento de diferentes cancros proporciona uma inesperadamente maior eficácia do que quando os agentes anticancerosos são utilizados isoladamente.

Sumário da Invenção:

Num primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma combinação farmacêutica compreendendo um agente antineoplásico citotóxico seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) seleccionado entre os compostos de fórmula I (como aqui descrito) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis. A combinação exibe efeito sinérgico no tratamento de cancros.

Num segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma combinação farmacêutica compreendendo um agente antineoplásico citotóxico seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) seleccionado entre os compostos de fórmula I (como aqui descrito) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis, para administração simultânea ou sequencial para o tratamento de cancro.

Num terceiro aspecto, a presente invenção refere-se à combinação farmacêutica do primeiro ou do segundo aspectos para utilização no tratamento de cancro e para utilização na indução de apoptose celular.

Num quarto aspecto, a presente invenção refere-se à combinação de um agente antineoplásico citotóxico seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) seleccionado entre os compostos de fórmula I (como aqui descrito) ou um seu 6 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis, para utilização no tratamento de cancro.

Num quinto aspecto, a presente invenção refere-se à utilização da combinação do primeiro ou do segundo aspectos para a preparação de um medicamento para tratamento de cancro.

Outros aspectos e âmbito adicional de aplicabilidade da presente invenção serão evidentes da descrição detalhada que se segue.

Breve descrição dos esquemas: A Figura 1 ilustra que a combinação de doxorrubicina e do composto A no tratamento de células H-460 de pulmão de células não pequenas in vitro exibe sinergia. Os gráficos A, B, C e D representam a distribuição no ciclo celular de diferentes grupos de tratamento, nomeadamente, de controlo (durante 96 horas), 200 nM de doxorrubicina sozinha (durante 24 horas), 800 nM do composto A sozinho (durante 72 horas) e da combinação compreendendo a administração de 200 nM de doxorrubicina (durante 24 horas) seguida de 800 nM de composto A (72 horas) respectivamente. A Figura 2 ilustra que a combinação de doxorrubicina e do composto A no tratamento de células H-460 de pulmão de células não pequenas in vitro exibe sinergia. Os gráficos A, B, C e D representam a distribuição no ciclo celular de diferentes grupos de tratamento, nomeadamente, do controlo (durante 120 horas), 100 nM de doxorrubicina sozinha (durante 24 horas), 1200 nM do composto A sozinho (durante 96 horas) e da combinação compreendendo a administração de 100 nM de doxorrubicina (24 horas) seguida de 1200 nM de composto A (96 horas) respectivamente. A Figura 3 demonstra que a utilização da combinação de gencitabina e do composto A no tratamento de células pancreáticas (Panc-1) in vitro resultou em actividade sinérgica. Os gráficos A, B, C, D e E mostram a distribuição no ciclo celular de diferentes grupos de tratamento, nomeadamente, do controlo (durante 24 horas), do controlo (durante 96 horas), 70 nM de gencitabina sozinha (durante 7 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ 24 horas), 300 ηΜ do composto A sozinho (durante 72 horas) e da combinação compreendendo a administração de 70 nM de gencitabina (24 horas) seguida de 300 nM do composto A (72 horas) respectivamente. A Figura 4 demonstra a detecção de uma apoptose precoce na combinação sinérgica de doxorrubicina seguida por composto A ao fim de 120 horas de tratamento utilizando coloração com Anexina V. Os gráficos A, B, C e D mostram a distribuição de células em quatro quadrantes em diferentes grupos de tratamento, nomeadamente, do controlo (durante 120 horas), 1200 nM do composto A sozinho (durante 96 horas), 100 nM de doxorrubicina sozinha (durante 24 horas) e da combinação compreendendo a administração de 100 nM de doxorrubicina (24 horas) seguida de 1200 nM de composto A (96 horas) respectivamente A Figura 5 ilustra que a combinação de doxorrubicina e do composto A no tratamento de células H-460 de pulmão de células não pequenas in vitro exibe sinergia quando testada num ensaio Clonogénico. A Figura 6 mostra a análise Western blot de várias proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular e na apoptose. A Figura 7a ilustra a eficácia in vivo da combinação de doxorrubicina (2 mg/kg) e composto A (20 mg/kg) num modelo de xenoenxerto de H-460 de células de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460). A Figura 7b ilustra a eficácia in vivo da combinação de doxorrubicina (2 mg/kg) e composto A (35 mg/kg) no modelo de xenoenxerto de H-460.

As Figuras 8a & 8b mostram o peso tumoral médio no final do tratamento e EP (barras) de 8 tumores de ratinhos individuais em cada grupo no final do estudo. A percentagem de inibição do crescimento (IC) no final do tratamento está representada para o grupo respectivo no topo de cada barra. Utilizou-se o teste t emparelhado para avaliar a significância estatística da diferença entre diferentes grupos 8 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ de tratamento. Considerou-se estar presente uma diferença estatisticamente significativa com P< 0,05. A Figura 9 mostra o Western blotting utilizando anticorpo para COX-2.

Descrição detalhada da invenção:

Verificou-se agora que a combinação da presente invenção, que compreende um agente antineoplásico citotóxico convencional seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um inibidor de CDK seleccionado entre os compostos de fórmula I (como aqui descrito) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis; exibe efeito sinérgico quando utilizada no tratamento de cancro, particularmente de tumores sólidos. O inibidor de CDK utilizado na combinação farmacêutica da presente invenção é seleccionado entre os compostos de fórmula I como aqui descrito adiante. Os inibidores de CDK representados pela fórmula I que se segue estão divulgados no pedido PCT de patente com n.° de publicação W02004004632. Os compostos de fórmula I são inibidores de CDK promissores, que podem inibir a proliferação de muitas células de cancro. Os compostos de fórmula I como utilizados na presente invenção são eficazes contra várias malignidades sólidas e hematológicas. Os inventores da presente invenção observaram que a combinação dos inibidores de CDK de fórmula I com um agente antineoplásico citotóxico convencional seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina, resultou num aumento da apoptose, ou morte celular programada.

Os inibidores de CDK utilizados na presente invenção são seleccionados entre os compostos representados pela fórmula I que se segue, 9 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ ΟΗ Ο

em que Ar é um grupo fenilo, que não está substituído ou está substituído com 1, 2 ou 3 substituintes idênticos ou diferentes seleccionados entre: halogéneo tal como cloro, bromo, fluoro ou iodo, nitro, ciano, alquilo-Ci-C4, trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi-Ci-C4, carboxi, alcoxicarbonilo-Ci-C4, CONH2 e NR1R2; em que Ri e R2 são, cada um independentemente, seleccionados entre hidrogénio ou alquilo-Ci-C4. 0 fabrico dos compostos de fórmula I, que podem estar na forma de sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis, e o fabrico da composição farmacêutica oral e/ou parentérica contendo os compostos acima estão divulgados no pedido PCT de patente com n.° de publicação W02004004632. Esta patente, que é aqui incorporada por referência, divulga que os inibidores de CDK representados pela fórmula I exibem significativa eficácia anticancerosa.

Como aqui indicado acima os inibidores de CDK de fórmula I podem ser utilizados na forma dos seus sais ou solvatos. Os sais preferidos dos compostos de fórmula I incluem o sal cloridrato, o sal do ácido metanossulfónico e o sal do ácido trifluoroacético.

Os peritos na especialidade notarão que os compostos de fórmula I contêm pelo menos dois centros quirais. Os compostos de fórmula I existem assim na forma de dois isómeros ópticos diferentes (i.e. enantiómeros ( + ) ou (-)) . Todos estes enantiómeros e suas misturas incluindo misturas racémicas estão incluídos no âmbito da invenção. Os enantiómeros do composto de fórmula I podem ser obtidos por métodos divulgados em W02004/004632 e WO2007/148158, pedidos de patente que são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Os enantiómeros do composto de fórmula I podem também ser obtidos 10 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ por métodos bem conhecidos na especialidade, tais como HPLC quiral e resolução enzimática. Alternativamente, os enantiómeros dos compostos de fórmula (I) podem ser sintetizados utilizando materiais de partida opticamente activos. Assim, a definição do inibidor de CDK de fórmula I é inclusiva de todos os estereoisómeros possíveis e suas misturas. A definição da fórmula I inclui as formas racémicas e os isómeros ópticos isolados possuindo a actividade especificada. 0(s) agente (s) citotóxico (s) antineoplásico (s) convencional (ais) utilizado (s) na combinação farmacêutica da presente invenção pode(m) ser seleccionado(s) do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina, gencitabina e agentes citotóxicos antineoplásicos análogos que exibam actividade anticancerosa através de mecanismos de acção similares. O paclitaxel é um produto diterpeno natural isolado do teixo do pacífico Taxus brevifolia (Rowinsky et ai., J. Natl. Câncer Inst., 82, 1247-1259 (1990)). O isolamento do paclitaxel e a sua estrutura estão divulgados em J. Am. Chem. Soc. 93, 2325 (1971). É um agente antimicrotúbulos que promove a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabiliza os microtúbulos prevenindo a despolimerização. O paclitaxel foi aprovado para uso clínico no tratamento de cancro ovariano (Merkman et ai.; Yale Journal Of Biology and Medicine, 64:583, 1991) e para o tratamento de cancro da mama (Holmes et ai.; J. Nat. Câncer Inst., 83; 1797, 1991), contudo, é também útil no tratamento de outros cancros. Por exemplo, foi considerado como potencial candidato para o tratamento de cancro da cabeça e pescoço (Forastire et ai., Sem. Oncol., 20: 56, 1990) e cancro do pulmão (M. Ghaemmaghami et ai.; Chest; 113; 86-91 (1998)). O paclitaxel está divulgado na Pat. U.S. 5, 670,537 que é aqui incorporada por referência pelos seus ensinamentos na utilização ou administração de paclitaxel no tratamento de cancros susceptíveis. O paclitaxel está comercialmente disponível na forma de uma solução injectável, Taxol®. A utilização de paclitaxel em monoterapia é geralmente acompanhada de efeitos secundários indesejáveis, incluindo reacções de hipersensibilidade, hipotensão, 11 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ bradicardia, hipertensão, náuseas e vómitos, e reacções no local da injecção. 0 docetaxel pertence à família do taxano e é um derivado semi-sintético do paclitaxel. 0 docetaxel está indicado principalmente para o cancro da mama e o cancro do pulmão de células não pequenas. É também útil no tratamento de outros cancros. Este composto está divulgado em U.S. 4,814,470, que é aqui incorporada por referência pelos seus ensinamentos sobre a síntese e utilização de docetaxel para o tratamento de cancros susceptíveis. O tri-hidrato de docetaxel está comercialmente disponível na forma de solução injectável, Taxotere®. Todos os tratamentos baseados em derivados taxóides, incluindo o docetaxel, podem apresentar toxicidades sérias e problemáticas, tais como mielossupressão, neutropenia, hipersensibilidade, neuropatia periférica e retenção de fluidos, entre outros (Fumoleau et al., Buli. Câncer, (82)8: 629-636 (1995)). A doxorrubicina é o nome genérico para a Adriamycin® e está comercialmente disponível numa forma injectável. A doxorrubicina foi isolada pela primeira vez a partir do caldo de fermentação de Sreptomyces peucetius var caesius (Pat. U.S. 3,590,028). Este agente antineoplásico citotóxico liga-se a ácidos nucleicos, presumivelmente por intercalação específica do núcleo planar de antraciclina na hélice dupla de ADN, resultando uma replicação celular anormal. A doxorrubicina é utilizada no tratamento de cancros da mama, da bexiga, do fígado, do pulmão, da próstata, do estômago e da tiróide; sarcomas do osso e tecidos moles; linfomas e leucemias; e tumores da infância. A utilização de doxorrubicina é geralmente acompanhada por vários efeitos secundários incluindo mielossupressão, náuseas e vómitos, efeitos mucocutâneos e cardíacos. A gencitabina é o nome genérico atribuído a 2'-desoxi-2', 2'-difluorocitidina. Está comercialmente disponível na forma do sal monocloridrato, e na forma do isómero β. A gencitabina está divulgada nas Pat. U.S. 4,808,614 e 5,464,826, que são aqui incorporadas por referência pelos seus ensinamentos sobre como sintetizar e utilizar gencitabina para o tratamento de cancros susceptíveis. A formulação comercial 12 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ de cloridrato de gencitabina como único agente está indicada como tratamento de primeira linha para pacientes com adenocarcinoma localmente avançado ou metastático do pâncreas ou carcinoma de células pulmonares (NSCLC), e é vulgarmente utilizada em pacientes previamente tratados com 5-fluorouracilo.

Os termos genéricos aqui utilizados, acima e adiante, têm preferivelmente, dentro do contexto da presente divulgação, os seguintes significados, a menos que indicado em contrário:

As formas singulares "a", "o", "uma" e "um" incluem as referências no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. A expressão "um agente antineoplásico" é sinónimo de "um agente quimioterapêutico" ou "um agente anticanceroso" e refere-se a um agente terapêutico, que actua por inibição ou prevenção do crescimento de neoplasmas. A expressão "um agente antineoplásico" ou "um agente anticanceroso" em geral refere-se a compostos que impedem as células cancerosas de se multiplicar (i.e. agentes anti-proliferativos). Em geral, o(s) agente(s) antineoplásico(s) cai(em) em duas classes, citotóxicos anti-proliferativos e citostáticos anti-proliferativos. Os agentes citotóxicos impedem as células cancerosas de se multiplicarem: (1) interferindo na capacidade das células replicarem o ADN e (2) induzindo morte celular e/ou apoptose nas células cancerosas. Os agentes eitostásticos anti-proliferativos actuam por via da modulação, interferindo em, ou inibindo os processos de transdução de sinal celulares que regulam a proliferação celular. Na presente invenção os agentes antineoplásicos compreendidos na combinação farmacêutica da presente invenção são os agentes citotóxicos e portanto são referidos como agentes citotóxicos antineoplásicos.

Como aqui se utiliza, o termo "sinérgico" significa que o efeito conseguido com os métodos e combinações da presente invenção são superiores à soma dos efeitos que resultam da utilização do(s) agente(s) citotóxico(s) antineoplásico(s) ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e do inibidor de CDK de fórmula I ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente 13 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ aceitáveis, separadamente. Vantajosamente, esta sinergia proporciona maior eficácia com as mesmas doses, e/ou previne ou atrasa a construção de resistência a múltiplos fármacos.

Como aqui se utiliza, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de agente quimioterapêutico, que proporciona a máxima apoptose de células proliferativas com a minima toxicidade para células não proliferativas. 0 termo "apoptose" refere-se a um tipo de morte celular em que uma série de passos moleculares numa célula conduz à sua morte. Esta é a maneira normal do corpo se livrar de células desnecessárias ou anormais. 0 processo de apoptose pode estar bloqueado em células cancerosas. Também é denominada morte celular programada. (Dicionário de termos ligados ao cancro. National Câncer Institute)

Como aqui se utiliza, a expressão "aumentar a apoptose" é definida como um aumento na taxa de morte celular programada, i.e. mais células são induzidas para o processo de morte em comparação com a exposição (contacto) quer com o agente antineoplásico citotóxico sozinho quer com o inibidor de CDK sozinho. 0 termo "indivíduo" como aqui se utiliza, refere-se a um animal, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano, que foi objecto de tratamento, observação ou experiência.

Numa concretização, a presente invenção refere-se a uma nova combinação farmacêutica para o tratamento de cancro em que a referida combinação compreende um agente antineoplásico citotóxico seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina ou gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e pelo menos um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) seleccionado entre os compostos de fórmula I (como aqui descrito) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis.

Numa concretização, a combinação farmacêutica compreendendo o inibidor de CDK de fórmula I e o agente 14 ΕΡ 2 154 971/PT antineoplásico citotóxico como aqui descrito, não está exclusivamente limitada às combinações que são obtidas por associação física dos referidos ingredientes, mas também abrange as que permitem uma administração separada, que pode ser simultânea, sequencial ou espaçada ao longo de um período de tempo de modo a obter a máxima eficácia da combinação. Assim, a combinação farmacêutica pode ser administrada simultaneamente ou espaçada ao longo de um período de tempo para um tratamento eficaz do cancro.

Para os fins da presente invenção, o inibidor de CDK seleccionado entre os compostos de fórmula I pode ser administrado, por exemplo, antes de, depois de, ou simultaneamente com o agente antineoplásico citotóxico. Numa concretização preferida da presente invenção, o agente antineoplásico citotóxico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, é administrado antes da administração do inibidor de CDK de fórmula I ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis, na gama de dosagem descrita adiante. Contudo, o método e a sequência de administração óptimos do inibidor de CDK e do agente antineoplásico citotóxico em determinadas condições podem ser adequadamente seleccionados pelos peritos na especialidade seguindo técnicas de rotina e a informação contida no presente fascículo.

Numa concretização, os constituintes compreendidos na combinação podem ter que ser administrados por diferentes vias devido às suas diferentes características físicas e químicas. Por exemplo, os inibidores de CDK de fórmula I podem ser administrados por via oral ou parentérica para gerar e manter os seus bons níveis sanguíneos, enquanto o(s) agente(s) citotóxico(s) antineoplásico (s) podem ser administrados parentericamente, por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular.

Para uso oral, os inibidores de CDK de fórmula I podem ser administrados, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas, pós, grânulos dispersáveis, ou hóstias, ou na forma de soluções ou suspensões aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, os transportadores que são vulgarmente utilizados incluem lactose, amido de milho, carbonato de magnésio, talco, e açúcar, e são vulgarmente adicionados agentes lubrificantes 15 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ tais como estearato de magnésio. Para administração oral na forma de cápsulas, os transportadores úteis incluem lactose, amido de milho, carbonato de magnésio, talco e açúcar.

Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutâneo e intravenoso, são usualmente empregues soluções estéreis do ingrediente activo (o((s) agente(s) citotóxico(s) antineoplásico(s) ou o inibidor de CDK), e o pH das soluções deverá ser adequadamente ajustado e tamponado. É aqui também divulgado um método para o tratamento de cancro, método este que compreende a administração a um indivíduo necessitado desse tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida combinação. Desse modo, no método, o cancro é tratado num indivíduo por administração ao indivíduo de uma quantidade terapêutica de um agente antineoplásico citotóxico eficaz para tratar o cancro, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de CDK seleccionado entre os compostos de fórmula I ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis, em que resulta um efeito sinérgico.

Como aqui indicado antes, os ingredientes activos contidos na composição farmacêutica podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente.

Assim, o método de tratamento de cancro pode compreender a administração ao indivíduo necessitado desse tratamento de uma quantidade terapêutica do agente antineoplásico citotóxico simultaneamente com uma quantidade terapêutica do inibidor de CDK representado pelos compostos de fórmula I. 0 método de tratamento de cancro pode envolver a administração sequencial de uma quantidade terapêutica do agente antineoplásico citotóxico e uma quantidade terapêutica do inibidor de CDK representado pelos compostos de fórmula I, a um indivíduo necessitado desse tratamento. 0 método de tratamento de cancro pode envolver a administração a um indivíduo necessitado desse tratamento de uma quantidade terapêutica do agente antineoplásico citotóxico 16 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ antes da administração do inibidor de CDK representado pelos compostos de fórmula I. A combinação farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada no tratamento de cancro seleccionado entre o grupo compreendendo cancro da mama, cancro do pulmão (incluindo cancro do pulmão de células pequenas e de células não pequenas e adenocarcinoma pulmonar), cancro ovariano, cancro pancreático (incluindo carcinoma pancreático exócrino), cancro gástrico, cancro colorrectal e carcinoma hepatocelular.

Numa concretização preferida, a combinação farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada no tratamento de cancro seleccionado entre cancro do pulmão de células não pequenas e cancro pancreático. A dosagem efectiva dos ingredientes activos contidos na combinação pode ser variada dependendo dos requisitos do paciente e da gravidade da condição a tratar. A determinação da dosagem correcta para uma situação particular faz parte dos conhecimentos do perito na especialidade. Geralmente, o tratamento é iniciado com doses menores, que são inferiores à dose óptima do composto. Posteriormente, a dose de cada ingrediente é aumentada em quantidades pequenas até ser atingido o efeito óptimo sob as circunstâncias. Contudo, a quantidade de cada ingrediente na combinação farmacêutica será tipicamente inferior a uma quantidade que produziria um efeito terapêutico se administrada sozinha. Por conveniência, a dose total diária pode ser dividida e administrada em porções durante o dia se necessário. Numa concretização preferida, o agente antineoplásico citotóxico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e o inibidor de CDK representado pelos compostos de fórmula I ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis são administrados sequencialmente em formas injectáveis, de modo que o agente antineoplásico citotóxico é administrado numa dose sinergicamente eficaz variando de 10 mg a 1400 mg, preferivelmente variando de 15 mg a 1000 mg e o inibidor de CDK é administrado numa dose sinergicamente eficaz variando de 5 mg a 750 mg, preferivelmente variando de 10 mg a 300 mg. 17 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Numa concretização preferida da invenção, quando o agente antineoplásico citotóxico é paclitaxel, é administrado numa dose sinergicamente eficaz variando de 30 mg a 300 mg.

Em ainda outra concretização preferida da invenção, quando o agente antineoplásico citotóxico é docetaxel, é administrado numa dose sinergicamente eficaz variando de 20 mg a 175 mg.

Ainda numa outra concretização preferida da invenção, quando o agente antineoplásico citotóxico é doxorrubicina, é administrado numa dose sinergicamente eficaz variando de 17,5 mg a 75 mg.

Em ainda outra concretização preferida da invenção, quando o agente antineoplásico citotóxico é gencitabina, é administrado numa dose sinergicamente eficaz variando de 70 mg a 1200 mg.

As combinações proporcionadas pela presente invenção foram avaliadas em certos sistemas de ensaio, e em vários esquemas de administração diferentes in vitro. Os detalhes experimentais são conforme aqui proporcionado adiante. Os dados aqui apresentados indicam claramente que o agente antineoplásico citotóxico quando combinado com um inibidor de CDK de fórmula I exibe efeito sinérgico. É claramente indicado que os agentes anticancerosos quando utilizados em combinação no tratamento de cancro aumentam a apoptose ou a citotoxicidade em células proliferativas relativamente a quando as células são tratadas com apenas o inibidor de CDK de fórmula I sozinho ou o agente antineoplásico citotóxico sozinho. Por exemplo, pode observar-se claramente dos dados proporcionados nas tabelas 2-4 que o inibidor de CDK, um composto de fórmula I representativo designado aqui por composto A, aumentou sinergicamente a citotoxicidade da doxorrubicina numa análise in vitro contra células de carcinoma do pulmão de células não pequenas H-460. O composto representativo, o composto A utilizado nos ensaios farmacológicos, refere-se a cloridrato de ( + ) - trans-2-(2-clorofenil)-5,7-di-hidroxi-8-(2-hidroximetil-l-metilpirrolidin-3-il)cromen-4-ona e foi um dos compostos 18 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ divulgados no pedido PCT de patente com n.° de publicação W02004004632, aqui incorporado por referência.

Os inventores também estabeleceram modelos de xenoenxerto para estender observações in vitro a um sistema in vivo. Os inventores testaram a combinação da presente invenção quanto à sua eficácia in vivo utilizando modelos de xenoenxerto de pulmão, de células não pequenas, de ratinhos SCID {"Severely Combined Immune-Deficiency" - imunodeficiência grave combinada) machos. Foi observado que o inibidor de CDK aumentou sinergicamente a eficácia de doxorrubicina quando administrado em combinação sequencial com doxorrubicina. É evidente da representação gráfica nas Figuras 7a e 7b que a combinação farmacêutica da presente invenção exibiu actividade terapeuticamente sinérgica em modelos de xenoenxerto de pulmão, de células não pequenas, de ratinhos SCID.

Num estudo in vitro em paralelo conduzido pelos presentes inventores envolvendo a utilização de uma combinação compreendendo um agente antineoplásico citotóxico convencional, doxorrubicina, e outro inibidor de CDK conhecido, Flavopiridol, no tratamento de linhas celulares H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano, verificou-se que a combinação de doxorrubicina e flavopiridol independentemente da sequência de administração resultou num efeito aditivo e não foi exibida sinergia (Tabela 16 - A, B, C) . Os detalhes deste estudo estão aqui demonstrados adiante. Assim, não se pode prever com certeza que uma combinação de agentes anticancerosos possuindo diferentes mecanismos de acção possa sempre resultar em efeitos terapêuticos vantajosos. Contudo, os inventores demonstraram claramente a eficácia sinérgica da nova combinação farmacêutica da presente invenção. 0 efeito sinérgico da combinação da presente invenção compreendendo um agente antineoplásico citotóxico e um inibidor de CDK é agora explicado com mais detalhes com referência a suas concretizações preferidas. Deve notar-se que estas são proporcionadas apenas como exemplos e não se destinam a limitar a invenção. 19 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Ensaios Farmacológicos:

Ensaio de citotoxicidade in vitro: 0 ensaio de citotoxicidade utilizado foi o ensaio do MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, sal interno). As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço em 180 yL de meio de cultura numa placa de 96 poços e foram incubadas durante a noite para permitir que as células aderissem. Várias concentrações dos fármacos contidos na combinação foram adicionadas aos poços e incubados durante um periodo de tempo apropriado numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37°C no caso de exposição a um único fármaco. Aquando do tratamento com dois fármacos o agente antineoplásico citotóxico convencional (paclitaxel, docetaxel e doxorrubicina) foi administrado durante 3 horas ou 24 horas seguindo-se a remoção do meio e a lavagem das células uma vez com o meio. Após lavagem das células, adicionaram-se duas concentrações diferentes de composto A aos poços e incubaram-se as placas durante 48, 72 ou 96 horas numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37°C. Trataram-se poços de controlo com um veiculo. No final do periodo de incubação, removeu-se o meio dos poços e adicionaram-se a cada poço 20 yL de MTS (2 mg/mL em solução salina de tampão de fosfato, pH 6-6,5 e esterilizada por filtração) e 1 yL de metossulfato de fenazina (PMS, 3 mM em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,3 e esterilizada por filtração) e ajustou-se o volume total a 200 yL com meio completo. Incubou-se a placa durante 2-4 horas numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37°C. Leu-se a placa a 490 nm num espectrofotómetro (SpectraMax, Molecular Devices); calcularam-se a percentagem de citotoxicidade e a IC50 utilizando o software para SpectraMax, SoftMax.

Exemplo 1:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de doxorrubicina e composto A em que a doxorrubicina e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que a doxorrubicina foi administrada antes do composto A. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com a doxorrubicina ou o composto A sozinhos. O 20 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ tratamento com doxorrubicina foi efectuado durante as primeiras 24 horas seguindo-se meio completo durante 72 horas enquanto no caso do composto A, as primeiras 24 horas foram em meio completo seguido do composto A durante as 72 horas seguintes. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 100 nM e 200 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 800 nM (concentração IC30 após 48 horas de tratamento). No estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 200 nM ou 100 nM de doxorrubicina durante as primeiras 24 horas seguindo-se 800 nM do composto A durante 72 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 96 horas, processaram-se as placas para ensaio de viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 1 que se segue.

Tabela 1

Tratamento com Fármaco Concentração de Doxorrubicina (nM) Concentração de inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Doxorrubicina 200 0 19 100 0 16 inibidor de CDK (composto A) 0 800 17 Doxorrubicina (24 horas) seguida pelo inibidor de CDK (composto A) (72 horas) 200 800 53 100 800 46

Exemplo 2:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de doxorrubicina e composto A em que a doxorrubicina e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que a doxorrubicina foi administrada antes do composto A. Neste exemplo o composto A foi utilizado numa concentração de 1200 nM. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com a doxorrubicina ou o 21 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ composto A sozinhos. 0 tratamento com doxorrubicina foi efectuado durante as primeiras 24 horas seguindo-se meio completo durante 72 horas enquanto no caso do composto A as primeiras 24 horas foram em meio completo seguido do composto A durante as 72 horas seguintes. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 200 nM e 100 nM, enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 1200 nM (concentração IC5o após 48 horas de tratamento). No estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 100 nM ou 200 nM de doxorrubicina durante 24 horas seguindo-se 1200 nM do composto A durante 72 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 96 horas, processaram-se as placas para ensaio de viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 2 seguinte.

Tabela 2

Tratamento com fármaco Concentração de Doxorrubicina (nM) Concentração de inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Doxorrubicina 200 0 19 100 0 16 inibidor de CDK (composto A) 0 1200 36 Doxorrubicina (24 horas) seguida por inibidor de CDK (composto A) (72 horas) 200 1200 70 100 1200 67

Exemplo 3:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de doxorrubicina e composto A em que a doxorrubicina e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que a doxorrubicina foi administrada antes do composto A. Neste exemplo o composto A foi utilizado numa concentração de 1200 nM e o periodo de tempo foi de 96 horas. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células 22 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho í.e. com a doxorrubicina ou o composto A sozinhos. 0 tratamento com doxorrubicina foi efectuado durante as primeiras 24 horas seguindo-se meio completo durante 96 horas enquanto no caso do composto A, as primeiras 24 horas foram em meio completo seguido pelo composto A durante as 96 horas seguintes. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 100 nM e 200 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 1200 nM (concentração IC5o após 48 horas de tratamento) . No estudo de combinação, as células foram primeiro tratadas com 100 nM ou 200 nM de doxorrubicina durante 24 horas seguida de 1200 nM do composto A durante 96 horas. Após conclusão do tratamento com fármacos i.e. ao fim de 120 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 3 seguinte.

Tabela 3

Tratamento com fármaco Concentração de Doxorrubicina (nM) Concentração de inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Doxorrubicina 200 0 17 100 0 8 inibidor de CDK (composto A) 0 1200 32 Doxorrubicina (24 horas) seguida de inibidor de CDK (composto A) (96 horas) 200 1200 73 100 1200 69

Exemplo 4:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de doxorrubicina e composto A administrados simultaneamente durante 120 horas. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada 23 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ um dos fármacos sozinho i.e. com a doxorrubicina ou o composto A sozinhos durante 120 horas cada um. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 30 nM e 100 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 800 nM e 1200 nM (concentração ~IC3o e ~ICso após 48 horas de tratamento). Neste estudo da combinação, adicionaram-se 30 nM ou 100 nM de doxorrubicina e 1200 nM ou 800 nM de composto A, respectivamente, conjuntamente durante 120 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 120 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 4 seguinte.

Tabela 4

Tratamento com fármaco Concentração de Doxorrubicina (nM) Concentração de inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Doxorrubicina 100 0 19 30 0 3 inibidor de CDK (composto A) 0 1200 44 0 800 24 Doxorrubicina e inibidor de CDK (composto A) em conjunto durante 120 horas 100 800 61 30 1200 60

Exemplo 5:

Este exemplo mostra que não há efeito sinérgico quando o composto A foi administrado antes do agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com a doxorrubicina ou o composto A sozinho. O tratamento com composto A foi efectuado durante as primeiras 96 horas seguindo-se meio completo durante 24 horas enquanto no caso da 24 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ doxorrubicina, as primeiras 96 horas foram em meio completo seguido de doxorrubicina durante 24 horas. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 30 nM, 70 nM, 100 nM e 200 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 800 nM e 1200 nM (concentração ~IC3o e -ICso após 48 horas de tratamento). Neste estudo da combinação, adicionaram-se 1200 nM ou 800 nM de composto A durante as primeiras 96 horas seguindo-se 30 nM, 70 nM, 100 nM ou 200 nM de doxorrubicina durante 24 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 120 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. A Tabela 6 indica que a percentagem de citotoxicidade nesta combinação é inferior à citotoxicidade do composto A quando administrado sozinho. Portanto o efeito desta sequência é antagonista, pois a doxorrubicina não potência o efeito do primeiro fármaco, que é o composto A neste caso. Os resultados estão apresentados na Tabela 5 seguinte.

Tabela 5

Concentração de doxorrubicina (nM) Concentração de inibidor de CDK(composto A) (nM) % de Citotoxicidade [inibidor de CDK, composto A (96 horas) seguido de Doxorrubicina (24 horas)] 200 1200 46 800 16 100 1200 45, 6 800 15 70 1200 42,3 800 14 30 1200 41 800 17,5 0 1200 52 0 800 19

Os Exemplos 1-4 exibem claramente que o inibidor de CDK potência sinergicamente o efeito da doxorrubicina quando o inibidor de CDK é administrado após, ou simultaneamente com, o fármaco citotóxico. O Exemplo 5 também mostra a importância do tratamento sequencial. Verifica-se que o tratamento com 25 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ doxorrubicina seguido pelo inibidor de CDK é sinérgico enquanto a sequência inversa não é eficaz.

Exemplo 6:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de docetaxel e do composto A em que o docetaxel e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que o docetaxel foi administrado antes do composto A. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 3000 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com o docetaxel ou o composto A sozinhos. O tratamento com docetaxel foi efectuado durante as primeiras 3 horas seguindo-se meio completo durante 45 horas enquanto no caso do tratamento com composto A, as primeiras 3 horas foram em meio completo seguido pelo composto A durante as 45 horas seguintes. As concentrações de docetaxel utilizadas foram 0,1 nM e 3 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 700 nM (concentração ~IC3o após 48 horas de tratamento). Neste estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 0,1 nM ou 3 nM de docetaxel durante 3 horas seguindo-se 700 nM do composto A durante 45 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 48 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 6 seguinte.

Tabela 6

Tratamento com fármaco Concentração de Docetaxel (nM) Concentração de inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Docetaxel 3 0 2 0,1 0 0 inibidor de CDK (composto A) 0 700 13 Docetaxel (3 horas) seguido pelo inibidor de CDK (composto A) (45 horas) 3 700 33 0,1 700 30 26 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Exemplo 7:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de docetaxel e do composto A em que o docetaxel e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que o docetaxel foi administrado antes do composto A. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 3000 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com o docetaxel ou o composto A sozinhos. O tratamento com docetaxel foi efectuado durante as primeiras 3 horas seguindo-se meio completo durante 45 horas enquanto no caso do tratamento com composto A, as primeiras 3 horas foram em meio completo seguido pelo composto A durante as 45 horas seguintes. As concentrações de docetaxel utilizadas foram 0,1 nM e 3 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 1000 nM (concentração -ICso após 48 horas de tratamento). No estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 0,1 nM ou 3 nM de docetaxel durante 3 horas seguindo-se 1000 nM do composto A durante 45 horas. As placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 7 seguinte.

Tabela 7

Tratamento com fármaco Concentração de Docetaxel (nM) Concentração de inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Docetaxel 3 0 2 0,1 0 0 inibidor de CDK (composto A) 0 1000 35 Docetaxel (3 horas) seguido de inibidor de CDK (composto A) (45 horas) 3 1000 53 0,1 1000 52 27 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Exemplo 8:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de paclitaxel e do composto A em que o paclitaxel e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que o paclitaxel foi administrado antes do composto A. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com o paclitaxel ou o composto A sozinhos. O tratamento com paclitaxel foi efectuado durante as primeiras 3 horas seguindo-se meio completo durante 45 horas enquanto no caso do tratamento com composto A, as primeiras 3 horas foram em meio completo seguido pelo composto A durante as 45 horas seguintes. A concentração de paclitaxel utilizada foi 10 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 700 nM (concentração ~IC3o após 48 horas de tratamento) . No estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 10 nM de paclitaxel durante 3 horas seguindo-se 700 nM do composto A durante 45 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 48 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 8 seguinte.

Tabela 8

Tratamento com fármaco Concentração de Paclitaxel (nM) Concentração do inibidor de CDK (Composto A) (nM) % de Citotoxicidade Paclitaxel 10 0 10 inibidor de CDK (composto A) 0 700 21 Paclitaxel (3 horas) seguido de inibidor de CDK (composto A) (45 horas) 10 700 41 28 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Exemplo 9:

Este exemplo exibe o efeito sinérgico da combinação de gencitabina e do composto A em que a gencitabina e o composto A foram administrados sequencialmente de tal modo que a gencitabina foi administrada antes do composto A. As células da linha celular pancreática humana (Panc-1) foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho í.e. com a gencitabina ou o composto A sozinhos. O tratamento com gencitabina foi efectuado durante as primeiras 24 horas seguindo-se meio completo durante 72 horas. Enquanto no caso do tratamento com composto A, as primeiras 24 horas foram em meio completo seguido pelo composto A durante as 72 horas seguintes. A gencitabina foi utilizada numa concentração de 70 nM enquanto o composto A foi utilizado numa concentração de 300 nM (concentração ~IC3o após 48 horas de tratamento) . No estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 70 nM de gencitabina durante 24 horas seguindo-se 300 nM do composto A durante 72 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 96 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 9 seguinte.

Tabela 9

Tratamento com fármaco Concentração de gencitabina (nM) Concentração do inibidor de CDK (composto A) (nM) % de Citotoxicidade Gencitabina 200 0 78 100 0 38 70 0 18 30 0 2 inibidor de CDK (composto A) 0 300 34 Gencitabina (24 horas) seguido pelo inibidor de CDK (composto A) (72 horas) 200 300 97 100 300 82 70 300 74 30 300 53 29 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Análise da distribuição no ciclo celular e citometria de fluxo: 0 carcinoma de pulmão de células não pequenas humano H-460 foi semeado em balões de cultura de tecidos de 25 mm3. Após 24 horas, trataram-se as células com o composto A sozinho durante 72 horas ou 96 horas e o agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina, sozinho durante 24 horas. Para os estudos da combinação, as células foram tratadas primeiro com o agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina, durante 24 horas, seguido pelo composto A durante 72 horas ou 96 horas após remoção do agente antineoplásico citotóxico e lavagem das células duas vezes com PBS. As células de controlo foram deixadas sem tratamento durante 96 horas ou 120 horas. Tanto as células destacadas como as aderentes foram colhidas em diferentes pontos de tempo. Lavaram-se as células duas vezes com aproximadamente 5 mL de PBS com centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos. Ressuspenderam-se as células em 500 pL de PBS e fixaram-se em 500 pL de etanol a 70% gelado. Incubaram-se as células fixadas à temperatura ambiente durante 30 minutos e centrifugadas a 1000 rpm durante 10 minutos. À pelete de células adicionou-se 1 mL de etanol a 70% refrigerado e depois manteve-se a pelete de células no frigorifico até posterior análise. Lavaram-se as células duas vezes com PBS para remover o fixador e ressuspenderam-se em 250 pL de PBS. Adicionaram-se 50 pL de iodeto de propídio (4 mg/mL em PBS) e 12,5 pL de ARNase A (lmg/mL). Após incubação a 37°C durante 30 minutos, analisaram-se as células utilizando citometria de fluxo.

Utilizou-se um citómetro de fluxo Becton Dickinson FACS Calibur de acordo com as recomendações do fabricante. Utilizou-se o laser de iões de árgon regulado para 488 nm como fonte de excitação. As células com teor de ADN entre 2n e 4n foram designadas como estando nas fases Gi, S e G2/M do ciclo celular, como definido pelo nivel de fluorescência de vermelho. As células que exibiam menos de 2n de teor de ADN foram designadas como células sub-Gi. O número de células em cada compartimento do ciclo celular foi expresso como percentagem do número total de células presentes. 30 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Exemplo 10:

Este exemplo dá a distribuição no ciclo celular para os vários tratamentos como mostrado na figura 1. Semearam-se cerca de 1-2 x 106 células num balão de cultura de tecidos para os grupos de tratamento. O protocolo de ensaio foi como mencionado acima em "análise da distribuição no ciclo celular e citometria de fluxo". O ciclo celular foi dividido em quatro partes, que estão representadas na figura 1 como Ml, M2, M3 e M4. Ml corresponde à fase Gl, M2 à fase S, M3 á fase G2-M e M4 à fase sub-Gl, que representa as células que estão a sofrer apoptose. O controlo de 96 horas onde não houve tratamento com fármaco mostrou uma apoptose desprezável de apenas 2%, enquanto o grupo de tratamento com cada fármaco sozinho mostrou apenas 10% de apoptose tanto para o composto A como para a doxorrubicina sozinhos. A combinação de ambos os fármacos mostrou uma apoptose aumentada de 34%.

Exemplo 11:

Este exemplo dá a distribuição no ciclo celular para os vários grupos de tratamento como mostrado na figura 2.

Semearam-se cerca de 1-2 x 106 células num balão de cultura de tecidos para os grupos de tratamento. O protocolo de ensaio foi o mencionado acima em "análise da distribuição no ciclo celular e citometria de fluxo". O ciclo celular foi dividido em quatro partes, que estão representadas na figura por Ml, M2, M3 e M4. Ml corresponde à fase Gl, M2 à fase S, M3 à fase G2-M e M4 à fase sub-Gl, que representa as células que estão a sofrer apoptose. O controlo de 120 horas onde não houve tratamento com fármaco mostrou uma apoptose desprezável de apenas 8%, enquanto o grupo de tratamento com cada um dos fármacos sozinhos mostrou 32% e 3% de apoptose para o

composto A e para a doxorrubicina, respectivamente. A combinação de ambos os fármacos mostrou uma apoptose aumentada de 65%.

Exemplo 12:

Este exemplo dá a distribuição no ciclo celular para os vários grupos de tratamento como mostrado na figura 3.

Semearam-se cerca de 1-2 x 106 células pancreáticas (Panc-1) num balão de cultura de tecidos para os grupos de tratamento. O protocolo de ensaio foi o mencionado acima em "análise da 31 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ distribuição no ciclo celular e citometria de fluxo". 0 ciclo celular foi dividido em quatro partes, que estão representadas na figura por Ml, M2, M3 e M4. Ml corresponde à fase Gl, M2 à fase S, M3 à fase G2-M e M4 à fase sub-Gl, que representa as células que estão a sofrer apoptose. 0 controlo de 96 horas onde não houve tratamento com fármaco mostrou uma apoptose desprezável de apenas 2,1%, enquanto o grupo de tratamento com cada um dos fármacos sozinhos mostrou 4,3% e 1,7% de apoptose para o composto A e para a gencitabina, respectivamente. A combinação de ambos os fármacos mostrou uma apoptose aumentada de 25,4%.

Exemplo 13:

Coloração com Anexina V-FITC (para a detecção de apoptose precoce) A Anexina V-FITC é uma sonda sensivel para a identificação de células apoptóticas. Durante a apoptose precoce a fosfotidilserina (PS) dos fosfolipidos da membrana é translocada da folha interior para a exterior da membrana plasmática, desse modo expondo a PS ao ambiente celular externo. A anexina V é uma proteína de ligação a fosfolipidos de cálcio de 35-36 kDa que possui uma elevada afinidade para com a PS e se liga às células com PS exposta. 0 iodeto de propídio (PI) é um corante polar que entra nas células através de membranas permeáveis e portanto é utilizado em conjunto com FITC para a detecção de apoptose tardia.

Semeou-se o carcinoma do pulmão de células não pequenas humano H-4 60 em balões de cultura de tecidos de 25 mm3. Após 24 horas, trataram-se as células com 1200 nM do composto A ou 100 nM de doxorrubicina sozinhos durante 96 horas e 24 horas, respectivamente. Para os estudos da combinação trataram-se as células primeiro com 100 nM do agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina, durante 24 horas seguindo-se 1200 nM do composto A durante 96 horas após remoção do agente antineoplásico citotóxico (doxorrubicina) e lavagem das células uma vez com meio. As células de controlo foram deixadas sem tratamento durante 120 horas. Colheram-se os meios contendo células flutuantes e reuniram-se com as células aderentes após colheita com tripsina em diferentes pontos de tempo. Lavaram-se as células duas vezes com PBS frio com 32 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos. Ressuspendeu-se a pelete de células em tampão de ligação IX (HEPES 10 mm, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) a uma concentração de 1 x 106 células/mL. Coraram-se 100 μΐ da solução (1 x 105 células) com Anexina V-FITC e Iodeto de propidio. Incubaram-se as células durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro e analisou-se a amostra por citometria de fluxo.

Utilizou-se um citómetro de fluxo Becton Dickinson FACS Calibur para estes estudos de acordo com as recomendações do fabricante. Utilizou-se o laser de iões de árgon regulado para 488 nm como fonte de excitação. A Figura 4 mostra a distribuição de células em quatro quadrantes. O quadrante 1 situado no canto inferior esquerdo (IE) mostra células, que são negativas para FITC e PI, o que indica que as células são saudáveis. O quadrante II situado no canto inferior direito (ID) corresponde a células, que são positivas apenas para PI, o que indica que estas células estão completamente apoptóticas. O quadrante III no canto superior direito (SD) corresponde a células que são positivas tanto para anexina como para PI, o que indica que estas células estão a entrar em apoptose tardia, vindas da apoptose precoce. O quadrante IV no canto superior esquerdo (SE) mostra células que são apenas positivas para a anexina, o que indica que estas células estão em apoptose precoce.

Se as células mesmo após a terminação da exposição ao composto continuam a seguir para apoptose, irão corar positivamente com anexina. As células, uma vez em apoptose precoce, estão comprometidas na morte celular programada e num ponto sem retorno. Os resultados são como indicado na Tabela 10. Verificou-se que a maior percentagem de células na combinação está em apoptose precoce ou precoce para tardia, em comparação com cada fármaco sozinho. 33 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Tabela 10

Tratamento com fármaco Células vivas (%) (células saudáveis) +vas para Anexina (%) (células em apoptose precoce) +vas para Anexina e PI (%) (células em apoptose precoce para tardia) +vas para PI (%) (células mortas) Controlo 90,5 3 4 2,3 Doxorrubicina (100 nM) 60 30,4 8, 6 1 inibidor de CDK (composto A) (1200 nM) 53 38,5 8,2 0, 3 Doxorrubicina seguida de inibidor de CDK (composto A) 14,1 58,2 27, 3 1

Exemplo 14:

Ensaio clonogénico:

Semearam-se células de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460) a uma densidade de 750-1000 células por placa graduada de cultura de tecidos de 35 mm. Incubou-se durante a noite a 37°C para as células se ligarem à placa. Trataram-se as células com o agente antineoplásico citotóxico durante 24 horas seguindo-se lavagem das células e adição de meio fresco contendo o composto A durante 96 horas. No final do tratamento substituiu-se novamente o meio por meio fresco completo contendo FCS a 10% e incubou-se durante 7-14 dias para a formação de colónias. Quando surgiram colónias visiveis na placa, removeu-se o meio e fixaram-se as colónias com mistura Metanol : Ácido acético na razão de 2:1 durante 5 minutos. Lavaram-se as placas com água e repetiu-se o procedimento de fixação. Secaram-se as placas e coraram-se as colónias com corante violeta de cristal a 0,1% durante 3-5 minutos. Enxaguaram-se as placas cuidadosamente com água, secaram-se e contaram-se as colónias no Geldoc.

Trataram-se as células com 1200 nM de composto A ou 100 nM de doxorrubicina sozinhos durante 96 horas e 24 horas, respectivamente, ou com combinação de 100 nM de doxorrubicina seguida de 1200 nM de composto A durante 96 horas. A Figura 5 indica um efeito sinérgico da combinação pois apenas uma 34 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ colónia foi observada na combinação em comparação com o controlo ou com cada um dos fármacos sozinhos.

Experiências de recuperação após tratamento 0 protocolo do ensaio para o tratamento de células com composto A e doxorrubicina sozinhos ou em combinação foi o descrito na análise da distribuição no ciclo celular. Após o tratamento com fármacos, deixaram-se as células recuperar em meio fresco completo contendo FCS a 10%. Analisaram-se as células em recuperação por FACS nos pontos de tempo de 0, 6, 18, 24 e 48 horas para o tratamento com cada fármaco sozinho e com a combinação. Nos exemplos que se seguem, a recuperação das células é representada pela percentagem de células que sofrem apoptose.

Exemplo 15:

Trataram-se as células apenas com o agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina, durante 24 horas, seguindo-se a remoção do meio e a substituição por meio fresco completo. A análise FACS foi realizada como descrito no método especificado para determinar a percentagem de células que sofrem apoptose durante o periodo de recuperação após o final do tratamento com fármaco. Determinou-se a apoptose a 0, 6, 18, 24 e 48 horas durante o periodo de recuperação. Ao fim de 24 horas de tratamento com fármaco a percentagem de apoptose era de 3%, que durante o periodo de recuperação não aumenta significativamente, o que indica que as células ultimamente recuperam do tratamento com o fármaco. Os resultados estão indicados na Tabela 11.

Tabela 11

Recuperação de células a 0, 6, 18, 24 e 48 horas após tratamento com apenas o agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina, durante 24 horas. Tratamento com fármaco (Doxorrubicina 100 nM durante 24 horas) % de Apoptose 0 horas de recuperação 3 6 horas de recuperação 5 18 horas de recuperação 4 24 horas de recuperação 5 48 horas de recuperação 4 35 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Exemplo 16: 0 ensaio foi realizado como descrito no protocolo. Trataram-se as células apenas com o composto A durante 96 horas seguindo-se a remoção do meio e substituição por meio fresco completo. A análise FACS foi realizada como descrito no método dado para determinar a percentagem de células que sofrem apoptose durante o periodo de recuperação após o final do tratamento com fármaco. Determinou-se a apoptose a 0, 6, 18, 24 e 48 horas durante o periodo de recuperação. Ao fim de 96 horas do tratamento com fármaco a percentagem de apoptose era de 32%, que durante o periodo de recuperação diminuiu de 24% para 19% ao fim de 48 horas de recuperação, o que indica que as células estão a recuperar gradualmente com o aumento do periodo de recuperação. Os resultados estão indicados na Tabela 12.

Tabela 12

Recuperação de células a 0, 6, 18, 24 e 48 horas após tratamento com apenas composto A durante 96 horas Tratamento com fármaco (Composto A 1200 nM durante 96 horas) % de Apoptose 0 horas de recuperação 32 6 horas de recuperação 24 18 horas de recuperação 23 24 horas de recuperação 21 48 horas de recuperação 19

Exemplo 17: O ensaio foi realizado como descrito no protocolo. Trataram-se as células com doxorrubicina durante 24 horas seguida de composto A durante 96 horas, seguindo-se a remoção do meio e substituição por meio fresco completo. A análise FACS foi realizada como descrito no método dado para determinar a percentagem de células que sofrem apoptose durante o periodo de recuperação após o final do tratamento com fármacos. Determinou-se a apoptose a 0, 6, 18, 24 e 48 horas durante o periodo de recuperação. No fim do tratamento com fármacos a percentagem de apoptose era de 55%. 36 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Durante ο período de recuperação, um adicional de 32% entram em apoptose ao fim de 6 horas, que aumenta, para 57% ao fim de 48 horas de recuperação, indicando que as células não recuperam mas, pelo contrário, continuam a sofrer apoptose durante o período de recuperação. Os resultados estão indicados na Tabela 13.

Tabela 13

Recuperação de células a 0, 6, 18, 24 e 48 horas após tratamento com doxorrubicina durante 24 horas seguida de composto A durante 96 horas. Tratamento com fármacos (Doxorrubicina 100 nM durante 24 horas seguida de Composto A 1200 nM durante 96 horas) % de Apoptose 0 horas de recuperação 55 6 horas de recuperação 32 18 horas de recuperação 34 24 horas de recuperação 49 48 horas de recuperação 57

Exemplo 18:

Análise Western blot: Células de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460) foram deixadas sem tratamento í.e. células de controlo, ou foram tratadas com 100 nM de doxorrubicina sozinha durante 24 horas ou com 1200 nM do composto A sozinho durante 96 horas. No tratamento com a combinação, as células foram primeiro tratadas com 100 nM de doxorrubicina durante 24 horas seguida de 1200 nM do composto A durante 96 horas. No final do período de tratamento lisaram-se as células e estimou-se o teor de proteína do lisado utilizando o reagente Bradford. Carregaram-se 40 pg de proteína em SDS-PAGE e transferiram-se para membrana PVDF. Sondaram-se as membranas com anticorpos para p53, Bax, Bcl-2, ciclina Dl, Cdkl e actina. Os anticorpos primários foram detectados com anticorpo secundário com peroxidase de rábano e submetidos a reagentes de quimioluminescência de pico west. 37 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ A Figura 6 mostra a análise Western blot das várias proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular e na apoptose. Carregou-se uma quantidade igual de proteína nas quatro pistas. As diferentes amostras carregadas nos poços estão descritas na legenda da figura. Os resultados indicam que a proteína anti-apoptótica Bcl-2 foi significativamente infra-regulada no tratamento de combinação comparativamente com cada fármaco sozinho, que foi quase equivalente ao controlo. Isto correlaciona-se com a apoptose aumentada observada no tratamento de combinação na análise FACS. A proteína pró-apoptótica Bax está ligeiramente supra-regulada em relação ao controlo em todas as amostras de tratamento. A proteína supressora tumoral p53 foi significativamente supra-regulada no tratamento de combinação comparativamente com o controlo mas não tanto nos outros dois grupos de tratamento. A Cdkl-Bl é um iniciador da mitose. A desregulação desta enzima conduz a tumorigénese. Portanto, a inibição de Cdkl irá inibir a sua actividade e portanto a iniciação de mitose e a proliferação celular. A figura indica que a doxorrubicina induz significativamente níveis de Cdkl enquanto a adição de composto A reduz a Cdkl para níveis desprezáveis, desse modo impedindo que as células sofram mitose. 0 composto A sozinho apresentou níveis iguais ao controlo. Os níveis de ciclina Dl não apresentam alteração significativa nos vários grupos de tratamento. No tratamento de combinação os níveis foram equivalentes ao controlo enquanto com composto A e com doxorrubicina sozinhos observou-se uma ligeira redução dos níveis.

Exemplo 19:

Este exemplo exibe o teste à eficácia in vivo da combinação de doxorrubicina e do inibidor de CDK, o composto A, num modelo de xenoenxerto do pulmão de células não pequenas (H-460).

Utilizou-se neste estudo uma linha celular de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460) obtida da American Type Culture Collection (ATCC) , EUA. A doxorrubicina e o composto A para administração i.p. foram preparados por dissolução dos compostos em solução salina. 38 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Utilizou-se um grupo de 36 ratinhos SCID (do inglês Severely Combined Immune-Deficiency - imunodeficiência grave combinada) machos pesando ~20g, de 6-8 semanas de idade.

Cresceram-se as células de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460) em meio RPMI 1640 contendo soro fetal de vitelo a 10% numa incubadora com 5% de CCq a 37°C. Sedimentaram-se as células numa pelete por centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos. Ressuspenderam-se as células em solução salina para obter uma contagem de 25 X 106 células por mL. Injectaram-se 0,2 mL desta suspensão celular por via subcutânea (s.c.) em ratinhos SCID. Observaram-se os ratinhos em dias alternados quanto a massa tumoral palpável. Quando o tamanho do tumor atingiu uma dimensão de 5-7 mm de diâmetro, distribuíram-se aleatoriamente os animais pelos respectivos grupos de tratamento conforme indicado na Tabela 14 que se segue. A doxorrubicina foi administrada uma vez por semana enquanto o composto A foi administrado uma vez por dia durante 5 dias como indicado na Tabela 15. A primeira dose de doxorrubicina foi seguida pelo composto A após um intervalo de 6 h, seguindo-se o composto A todos os dias ao longo de um período de cinco dias, o que constituiu um ciclo. Após um intervalo de dois dias começaria o ciclo seguinte. O tratamento consistiu num total de 2 ciclos. Registou-se o peso corporal diariamente. Registaram-se a dimensão do tumor e outros sinais de toxicidade em dias alternados. Não se observaram perda de peso ou sinais de morbidade significativos. O peso do tumor (mg) foi estimado de acordo com a fórmula de um elipsóide prolato: {Comprimento (mm) x [Largura (mm)2] x 0,5} assumindo uma densidade relativa de um e π como três. O crescimento do tumor em animais tratados com o composto foi calculado como T/C (Tratado/Controlo) x 100% e a Percentagem de Inibição de Crescimento (IC%) foi [100 — T/C%] . Os resultados estão apresentados graficamente nas figuras 7a, 7b, 8 e 9. 39 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Tabela 14

Grupos de Tratamento Grupos Tratamento com fármaco Dose Via N.° de tratamentos n= I Controlo (Não tratado) i.p. 8 II Doxorrubicina 2 mg/kg i.p. Uma vez por semana (2 w) 8 III Composto A 20 mg/kg i.p. Cinco dias por semana (2 w) 8 IV Composto A 35 mg/kg i.p. Cinco dias por semana (2 w) 8 V Doxo> Composto A 2 mg/kg >20 mg/kg i.p. Cinco dias por semana (2 w) 8 VI Doxo> Composto A 2 mg/kg >35 mg/kg i.p. Cinco dias por semana (2 w) 8 Doxo - doxorrubicina, w - semana, i.p. Interperitonealmente ">" indica que a doxorrubicina é administrada antes do composto A.

Tabela 15

Ciclo de Dosagem (Um ciclo) Grupos Descrição S T Q Q s Grupo I Não tratado s s s s s Grupo II Doxorrubicina 2 mg/kg D - - - - Grupo III Composto A 20 mg/kg P P P P P Grupo IV Composto A 35 mg/kg P P P P P Grupo V D>P: 2 mg/kg > 20 mg/kg D/P P P P P Grupo VI D>P: 2 mg/kg > 35 mg/kg D/P P P P P S - Solução salina, P - Composto A, D - Doxorrubicina S, T, Q, Q e S: Dias da semana (Segunda-feira, Terça- feira, Quarta-feira, Quinta-feira e Sexta-feira) ">" indica que a doxorrubicina é administrada antes do composto A. 40 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ

Exemplo 20:

Análise Western blot utilizando anticorpo para COX-2 A Figura 9 indica a análise Western blot utilizando anticorpo para COX-2. As diferentes amostras carregadas nos poços estão descritas na legenda da figura. Os resultados indicam que: O controlo apresentou niveis basais de COX-2, que são baixos. 0 composto A sozinho também apresentou níveis baixos de COX-2. A doxorrubicina induziu fortemente COX-2 que é responsável pela via de sinalização de NFkB da quimiorresistência. A adição de composto A após a doxorrubicina infra-regulou significativamente a COX-2.

Portanto, a inibição mediada por NFkB de COX-2 pelo composto A pode estar envolvida na supressão do crescimento tumoral e a doxorrubicina induziu quimiorresistência em xenoenxerto de tumor de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460).

Exemplo 21:

Estudos da combinação de Doxorrubicina e Flavopiridol na linha celular de carcinoma do pulmão de células não pequenas humano (H-460)

Este exemplo mostra que não existe efeito sinérgico quando flavopiridol foi administrado após (Tabela 16A), antes (Tabela 16B) ou simultaneamente (Tabela 16C) com o agente antineoplásico citotóxico, doxorrubicina. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. Conforme na

Tabela 16A, as células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com doxorrubicina ou flavopiridol sozinhos. O tratamento com doxorrubicina foi efectuado durante as primeiras 24 horas seguindo-se meio completo durante 96 horas enquanto no caso do flavopiridol, as primeiras 24 horas foram em meio completo seguido de flavopiridol durante as 96 horas seguintes. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 30 nM, 70 nM, 100 nM e 200 nM enquanto o flavopiridol foi utilizado numa concentração de 41 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ 200 ηΜ e 350 ηΜ (concentrações IC3o e IC5o respectivamente após 48 horas de tratamento) . No estudo da combinação, as células foram primeiro tratadas com 30 nM, 70 nM, 100 nM e 200 nM de doxorrubicina durante as primeiras 24 horas seguindo-se 200 nM e 350 nM de flavopiridol durante 96 horas. Após conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 120 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 16A.

Conforme na Tabela 16B, as células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com doxorrubicina ou flavopiridol sozinhos. O tratamento com flavopiridol foi efectuado durante as primeiras 96 horas seguindo-se meio completo durante 24 horas enquanto no caso da doxorrubicina, as primeiras 96 horas foram em meio completo seguido de doxorrubicina durante 24 horas. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 30 nM, 70 nM, 100 nM e 200 nM enquanto o flavopiridol foi utilizado numa concentração de 200 nM e 350 nM (concentração ~IC3o e -ICso após 48 horas de tratamento). Neste estudo da combinação, adicionaram-se 200 nM ou 350 nM de flavopiridol durante as primeiras 96 horas seguindo-se 30 nM, 70 nM, 100 nM ou 200 nM de doxorrubicina durante 24 horas. Após a conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 120 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 16B. A Tabela 16C não exibe efeito sinérgico da combinação de doxorrubicina e flavopiridol administrados simultaneamente durante 120 horas. As células H-460 de carcinoma de pulmão de células não pequenas humano foram semeadas a uma densidade de 1500 células/poço. As células foram primeiro tratadas com cada um dos fármacos sozinho i.e. com doxorrubicina ou flavopiridol sozinhos durante 120 horas cada um. As concentrações de doxorrubicina utilizadas foram 30 nM, 70 nM, 100 nM e 200 nM enquanto o flavopiridol foi utilizado numa concentração de 200 nM e 350 nM (concentração ~IC3o e ~ICso após 48 horas de tratamento). Neste estudo da combinação, adicionaram-se 30 nM, 70 nM, 100 nM ou 200 nM de doxorrubicina e 200 nM ou 350 nM de 42

ΕΡ 2 154 971/PT flavopiridol, respectivamente, conjuntamente durante 120 horas. Após a conclusão do tratamento com os fármacos i.e. ao fim de 120 horas, as placas foram processadas para ensaio da viabilidade com MTS e calculou-se a percentagem de citotoxicidade em comparação com o controlo. Os resultados estão apresentados na Tabela 16C seguinte.

Tabela 16

Estudos da combinação de doxorrubicina e flavopiridol na linha celular H-460 A) Doxorrubicina seguida de inibidor de CDK, flavopiridol

Doxo (24h) > FP (200 nM) (96h) Cone. de Doxo % de Citotoxi cidade 200 nM Doxo 48 Doxo>FP 65 100 nM Doxo 16 Doxo>FP 38 7 0 nM Doxo 14 Doxo>FP 35 30 nM Doxo 0 Doxo>FP 16 FP 2 00 nM 17

Doxo (24h) > FP (350 nM) (96h) Cone. de Doxo % de Citotoxi cidade 200 nM Doxo 48 Doxo>FP 75 100 nM Doxo 9 Doxo>FP 66 7 0 nM Doxo 12 Doxo>FP 71 30 nM Doxo 0 Doxo>FP 56 FP 350 nM 57 B) Flavopiridol seguido de doxorrubicina FP (96h) (200 nM] > Doxo (24h) Cone. de Doxo % de Citotoxi cidade 20 0 nM FP>Doxo 26 10 0 nM FP>Doxo 26 70 nM FP>Doxo 26 30 nM FP>Doxo 24 FP 2 00 nM 29 FP (96h) (200 nM) > Doxo (24h) Cone. de Doxo % de Citotoxi cidade 2 00 nM FP>Doxo 80 100 nM FP>Doxo 75 7 0 nM FP>Doxo 79 30 nM FP>Doxo 77 FP 350 nM 73 ">" indica que um fármaco é administrado antes do outro. 43 ΕΡ 2 154 971/ΡΤ C) Flavopiridol e doxorrubicina administrados simultaneamente

Doxo + FP (200 nM) (120h) Cone. de Doxo % de Citotoxi- cidade 200 nM Doxo 48 Doxo+FP 68 10 0 nM Doxo 24 Doxo+FP 62 7 0 nM Doxo 28 Doxo+FP 65 30 nM Doxo 2 Doxo+FP 35 FP 2 00 nM 39

Doxo + FP (200 nM) (12Oh) Cone. de Doxo % de Citotoxi- cidade 200 nM Doxo 48 Doxo+FP 88 100 nM Doxo 24 Doxo+FP 85 7 0 nM Doxo 28 Doxo+FP 87 30 nM Doxo 2 Doxo+FP 80 FP 350 nM 81

Doxo = Doxorrubicina, FP = Flavopiridol "+" indica que os fármacos são administrados simultaneamente.

Lisboa, 2012-03-26

Claims (12)

1. ΕΡ 2 154 971/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Combinação farmacêutica para utilização no tratamento de um cancro; a referida combinação compreendendo um agente antineoplásico citotóxico seleccionado do grupo que consiste em paclitaxel, docetaxel, doxorrubicina e gencitabina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um inibidor de CDK ou um seu enantiómero ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis, em que o referido inibidor de CDK é representado pela seguinte fórmula I; OH O

   Fórmula I em que Ar é fenilo, que não está substituído ou está substituído com 1, 2 ou 3 substituintes idênticos ou diferentes seleccionados entre: halogéneo seleccionado entre cloro, bromo, flúor ou iodo, nitro, ciano, alquilo-Ci-C4, trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi-Ci-C4, carboxi, alcoxicarbonilo-Ci-C4, CONH2 e NRiR2; em que Ri e R2 são seleccionados entre hidrogénio ou alquilo-Ci-C4; em que a utilização da referida combinação para o tratamento de cancro compreende a administração do referido agente antineoplásico citotóxico antes do referido inibidor de CDK.
2. 2. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de CDK é um composto de fórmula I em que o grupo fenilo está substituído com 1, 2 ou 3 substituintes idênticos ou diferentes seleccionados entre: halogéneo seleccionado entre cloro, bromo, flúor ou iodo, alquilo-Ci-C4 ou trifluorometilo.
3. 3. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, em que o inibidor de CDK é um composto de fórmula I em que o grupo fenilo está substituído com 1, 2 ou 3 halogéneos seleccionados entre cloro, bromo, flúor ou iodo. ΕΡ 2 154 971/ΡΤ 2/2
4. 4. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que o inibidor de CDK é um composto de fórmula I em que o grupo fenilo está substituido com cloro.
5. 5. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, em que o inibidor de CDK é um composto de fórmula I em que o grupo fenilo está substituido com 1, 2 ou 3 grupos trifluorometilo.
6. 6. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de CDK representado pelo composto de fórmula I é (+)-trans-2-(2-Clorofenil)-5,7-di-hidroxi-8-(2-hidroximetil-l-metilpirrolidin-3-il)cromen-4-ona ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente antineoplásico citotóxico é paclitaxel.
8. 8. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente antineoplásico citotóxico é docetaxel.
9. 9. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente antineoplásico citotóxico é doxorrubicina.
10. 10. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente antineoplásico citotóxico é gencitabina.
11. 11. Combinação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 anteriores; em que o cancro é seleccionado do grupo que consiste em cancro da mama, cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro ovariano, cancro pancreático, cancro gástrico, cancro colorrectal e carcinoma hepatocelular.
12. 12. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que o cancro é cancro do pulmão de células não pequenas ou cancro pancreático. Lisboa, 2012-03-26