CN109844109A - TATκ-CDKL5融合蛋白、其组合物、配制品以及用途 - Google Patents

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Abstract

在此披露了含有TATκ‑CDKL5融合蛋白的组合物和配制品。还披露了由含有TATκ‑CDKL5 cDNA的载体产生TATκ‑CDKL5融合蛋白的方法以及使用含有TATκ‑CDKL5 cDNA的这些载体和该TATκ‑CDKL5融合蛋白转导细胞的方法。还披露了TATκ‑CDKL5融合蛋白用于治疗CDKL5缺陷的用途，该用途通过全身给予或静脉内给予该融合蛋白来实现。

Description

TATκ-CDKL5融合蛋白、其组合物、配制品以及用途
发明背景
细胞周期蛋白依赖激酶样5(CDKL5)突变/缺陷(也被称为非典型Rett综合征)是一种衰竭性出生后神经障碍，该神经障碍在世界范围内每出生17,000至38,000名女性出现1例。男性同样受其影响，而发病率较低。此障碍不限于人种或种族起源。CDKL5突变/缺陷的症状在从轻微到严重的范围内，并且以早期癫痫发作、认知失能、张力减退以及自调、睡眠和胃肠紊乱存在。疾病的症状由功能性CDKL5蛋白的缺陷引起。
个体中伴X染色体的CDKL5基因中的突变或CDKL5蛋白中的缺陷与非典型或先天性Rett综合征的发展有关联。参见，Bertani等人，J.biol.Chem.[生物化学杂志]，2006，281:32048-32056；Scala等人，J.Med.Gen.[医学基因学杂志]，2005，42:103-107；以及Kalscheuer等人，Am.J.Hum.Genet.[美国人类遗传学杂志]2003，72:1401-1411。CDKL5基因位于X染色体上并且编码为正常的脑发育和功能所必需的蛋白质。CDKL5蛋白是在神经元细胞中具有多效性的多功能蛋白质。例如，CDKL5可以充当激酶并且使MeCP2磷酸化。MeCP2是非典型性Rett综合征的靶标。受CDKL5突变或缺陷影响的女生典型地具有以下特征：正常的出生前史；在围产期易激惹和困倦；早发癫痫，其在5月龄之前发病；Rett样特征，包括头生长减速、刻板症、较差至丧失的自主手使用、和睡眠紊乱，及伴有眼神交流差的严重性精神发育迟缓，以及语言几乎丧失。参见Bahi-Buisson和Bienvenu，2012，Mol.Syndromol.[分子合成学]2:137-152。
对于CDKL5突变/缺陷的当前治疗主要集中于处理症状上。然而，目前不存在改善具有CDKL5突变或缺陷的受试者的神经结果的治疗。因此，存在开发用于治疗CDKL5突变和缺陷的疗法的需要。
概述
在此描述了具有CDKL5多肽序列和TATκ多肽序列的融合蛋白，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至100％的序列一致性，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有至少98％、至少99％或至少99.5％的序列一致性。在一些方面中，该融合蛋白可以含有Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在另外的方面中，该融合蛋白可以含有报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在其他方面中，该融合蛋白可以含有蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，与对照相比，这些融合蛋白可以增加受试者脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。在其他方面中，与对照相比，这些融合蛋白可以减少受试者脑中的神经元细胞凋亡。在一些方面中，该融合蛋白可以具有根据SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
在此还提供了含有治疗有效量的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物配制品，该融合蛋白具有CDKL5多肽序列和TATκ多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至100％的序列一致性，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有至少98％、至少99％或至少99.5％的序列一致性。在一些方面中，包含在这些药物配制品中的该融合蛋白可以含有Igκ-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，包含在这些药物配制品中的该融合蛋白可以含有报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在另外的方面中，包含在这些药物配制品中的该融合蛋白可以具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以治疗受试者的CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体中的一种或多种症状。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以增加受试者脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。在其他方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以减少受试者脑中的神经元细胞凋亡。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以改善受试者的运动功能。在一些方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以改善受试者的认知功能。在另外的方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以增加受试者的视觉皮层中的神经活动。
在此提供了向对其有需要的受试者给予治疗有效量的药物配制品的方法，该药物配制品含有一定量的融合蛋白和药学上可接受的载体，其中该融合蛋白含有CDKL5多肽序列和TATκ多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约50％至100％的序列一致性，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。在一些方面中，对其有需要的受试者患有或疑似患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体。在一些方面中，该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有至少98％、至少99％或至少99.5％的序列一致性。在给予治疗有效量的药物配制品的该方法的其他方面中，与对照相比，该治疗有效量的该融合蛋白可以治疗受试者的CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体中的一种或多种症状。
本文还提供了融合蛋白用于治疗CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体的用途，该用途通过全身给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品来实现。在一些方面中，静脉内给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品。
本文还提供了融合蛋白用于增加在患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体的患者的视觉皮层中的神经活动的用途，该用途通过全身给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品来实现。在一些方面中，静脉内给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品。
本文还提供了融合蛋白用于增加在患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体的患者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度的用途，该用途通过全身给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品来实现。在一些方面中，静脉内给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品。
本文还提供了融合蛋白用于减少在患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体的患者的脑中的神经元细胞凋亡的用途，该用途通过全身给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品来实现。在一些方面中，静脉内给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品。
本文还提供了融合蛋白用于改善在患有CDKL5缺陷、Rett综合征或Rett综合征变体的患者的运动功能的用途，该用途通过全身给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品来实现。在一些方面中，静脉内给予融合蛋白或包含融合蛋白的药物配制品。
附图简要说明
图1示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中该CDKL5融合蛋白由培养的细胞产生并且被分泌到周围培养基中。
图2示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中该CDKL5融合蛋白未被分泌到周围的细胞培养基中。
图3示出了经由转导或转染(未具体示出)自体细胞向受试者递送CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例。
图4A和图4B展示了来自转染的HEK 293T细胞中的TATκ-CDKL5115蛋白表达的蛋白质印迹分析结果。用eGFP蛋白标记TATκ-CDKL5115融合蛋白以允许使用抗-GFP抗体进行蛋白质印迹分析。图4A展示了来自转染的HEK 293T细胞的细胞提取物中的TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白表达。图4B展示了从20X浓缩细胞培养基对来自TATκ-eGFP-CDKL5115转染的HEK293T细胞的TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行的纯化。
图5A和图5B展示了来自激酶活性测定的结果(图5A)，证明了TAT-eGFP-CDKL5115融合蛋白保留了CDKL5自身磷酸化活性。在Ni-NTA树脂上从培养基中纯化TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白。
图6示出了孵育时间对HEK 293T细胞中的TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白的一个实施例的转导效率的影响。
图7A和图7B示出了TATκ-eGFP-CDKL5115处理的HEK 293T细胞中的CDKL5的定位(图7B)。图7A和图7B展示了与对照(图7A)(左图)相比用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行HEK293T细胞转导的效率。使用抗-GFP抗体进行免疫检测并且用DAPI复染细胞。白色箭头指示转导的HEK 293T细胞。
图8是展示了来自共聚焦显微镜的一系列12张图像(1-12)的图像，这12张图像展示出用纯化的TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白处理30分钟进入SH-SY5Y细胞中的TATκ-eGFP-CDKL5115转导。Z堆栈大小是0.4μm。图8展示了用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行SH-SY5Y细胞转导的效率。
图9A和图9B展示了神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中转导的CDKL5对细胞增殖的影响。与TATκ-eGFP(对照)处理的细胞(图9A)相比，观察到TATκ-eGFP-CDKL5115处理的细胞(图9B)具有减少的增殖。白色箭头指示有丝分裂的细胞核。
图10示出了展示用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白处理的SH-SY5Y细胞的有丝分裂指数的图。y-轴示出了有丝分裂细胞/总细胞，表达为％TATκ-eGFP。数据示出为平均值±S.E.。***P<0.001(t检验)。
图11A-11B是展示了TATκ-eGFP处理的(对照)SH-SY5Y细胞(图11A)和TATκ-eGFP-CDKL5115处理的SH-SY5Y细胞(图11B)的代表性相衬图像的图像。与对照细胞相比，观察到TATκ-eGFP-CDKL5115处理的SH-SY5Y细胞中的神经突生长更大。
图12示出了展示出用TATκ-eGFP融合蛋白(对照)或TATκ-eGFP-CDKL5115处理的SH-SY5Y细胞的神经突增生的定量的图。数据示出为平均值±S.E。*P<0.05(t检验)。y-轴以微米示出了神经突(neuritic)长度/细胞。
图13A-13B示出了展示出如通过在45日龄的雄性CDKL5野生型(+/Y)(图13A)和CDKL5敲除(KO)雄性小鼠(-/Y)(图13B)(它们为半合子型)中的双皮质素(DCX)的免疫组织化学所示的新生海马颗粒细胞的树突形态和数目的图像。比例尺＝50μm。缩写：GR，颗粒层；H，门。
图14A-14B示出了分化的神经元前体细胞(NPC)的双荧光图像，展示出与雌性野生型(+/+)(图14A)神经元培养物相比，来源于2日龄的纯合子的雌性CDKL5敲除小鼠(-/-)(图14B)的神经元培养物中的新神经元(红色细胞)的产生和成熟减少。具有神经元表型的细胞对β-微管蛋白III(红色)具有免疫阳性，并且具有星形细胞表型的细胞对GFAP(绿色)具有免疫阳性。使用Hoechst染料(蓝色)对细胞核进行染色。比例尺＝25μm。
图15A-15C示出了从来源于用TATκ-eGFP(图15B)或TATκ-eGFP-CDKL5115(图15C)转导的2日龄的纯合子的CDKL5敲除小鼠(-/-)的细胞产生的神经元前体培养物(图15B和15C)，以及来自野生型小鼠(+/+)的神经元前体培养物(图15A)的代表性图像。比例尺＝20μm。
图16示出了展示出在来源于新生的(2日龄)野生型雌性(+/+)和纯合子的CDKL5KO(-/-)小鼠的神经元前体培养物中如通过分化的神经元(对β-微管蛋白III呈阳性的神经元)的总神经突长度所测量的对神经成熟的定量的图。用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5115处理培养和分化的细胞。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，**p<0.01；与未处理的KO样品相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图17A-17F示出了展示出用浓缩培养基(媒介物)(图17A和图17D)、TATκ-eGFP(图17B和图17E)以及TATκ-eGFP-CDKL5115(图17C和图17F)全身性处理(单一皮下注射)的小鼠(出生后第7天)脑中的CDKL5的免疫检测的图像。注射后4小时收集样品。图17D-17F分别示出了图17A-17C中的虚线框的放大图。通过使用抗-eGFP抗体(红色)的免疫组织化学来评价脑中的TATκ-eGFP-CDKL5115和TATκ-GFP的定位。图像在感觉运动皮层的水平处获取。比例尺＝60μm(较低放大倍数)和20μm(较高放大倍数)。
图18A-18D示出了展示出如图17A-17F那样用培养基(媒介物)(图18A和图18B)和TATκ-eGFP-CDKL5115(图18C和图18D)全身性处理的小鼠(出生后第7天)脑中的TATκ-eGFP-CDKL5115的免疫检测的小脑切片的图像。注射后4小时收集样品。通过使用抗-GFP抗体的免疫组织化学来评价脑中的TATκ-eGFP-CDKL5115的定位(图18A-18B)。用DAPI固定载玻片以染色细胞核(图18B-18C)。缩写：EGL，外颗粒层；IGL，内颗粒层；ML，分子层；PL，浦肯野(Purkinje)层。比例尺＝60μm。
图19展示了对于TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白向小鼠的脑室内给予的插管的放置。
图20示出了描绘出用于图21-34中说明的研究的植入物和融合蛋白注射时间表的草图。小鼠在植入时为4-6月龄。
图21A-21C示出了DCX免疫染色的海马齿状回切片的图像，证明了与雄性野生型小鼠(+/Y)(分别为图21B和图21A)相比，CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)中新生颗粒细胞的神经突长度和数目减少。观察到连续五天脑室内给予TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白将雄性CDKL5敲除小鼠(图21C)中的新生颗粒细胞的神经突长度和数目增加到类似于野生型(图21A)的水平。比例尺＝70μm。
图22A-22C示出了图21中的齿状回的颗粒层的水平下的图像的放大图。比例尺＝25μm。
图23A-23C示出了以下各项的新生颗粒细胞的重构树突树的实例：CDKL5野生型(WT)雄性小鼠(在本文中也称为CDKL5+/Y或+/Y)(图23A)、CDKL5敲除(KO)雄性小鼠(在本文中也称为CDKL5-/Y或-/Y)(图23B)、和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5115)(图23C)。
图24A-24B示出了展示出以下各项的齿状回新生颗粒细胞(DCX阳性细胞)的平均总树突长度(图24A)和树突段的平均数目(图24B)的定量的图：CDKL5WT雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。值表示平均值±SE。与+/Y相比，**p<0.01；***p<0.001；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图25A-25B示出了展示出以下各项的齿状回新生颗粒细胞的不同级的分支的平均长度(图25A)和平均数量(图25B)的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。值表示平均值±SE。与+/Y相比，*p<0.05；**p<0.01；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图26示出了展示出以下各项中的凋亡细胞(半胱天冬酶-3阳性细胞)的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。值表示平均值±SE。与+/Y相比，*P<0.05；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图27示出了展示出以下各项的DG中的DCX阳性细胞的数目的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。数据表示为细胞数目/mm2。与+/Y相比，*p<0.05；与-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图28A-28C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层的、处理用于突触泡蛋白(SYN)免疫荧光的脑切片的代表性图像：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)(图28A)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)(图28B)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)(图28C)。比例尺＝80μm。缩写：GR，颗粒层；Mol，分子层。
图29A-29C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层的、处理用于磷酸-AKT(P-AKT)免疫荧光的脑切片的代表性图像：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)(图29A)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)(图29B)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)(图29C)。比例尺＝80μm。缩写：GR，颗粒层；Mol，分子层。
图30A-30B示出了展示出以下各项中的海马体的分子层(图30A)和皮层的III层(图30B)中的突触泡蛋白(SYN)光密度的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TAT-eGFP-CDKL5)。数据给出为相对于野生型小鼠的分子层或皮层的相应区的倍数差异。值表示平均值±SD。与+/Y相比，**p<0.01；***p<0.001；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图31A-31B示出了展示出以下各项中的海马体的分子层(图31A)和皮层的V层(图31B)中的Ser437磷酸化-AKT(PAKT)光密度的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。数据给出为相对于野生型小鼠的分子层或皮层的相应区的倍数差异。值表示平均值±SD。与+/Y相比，**p<0.01；与-/Y样品相比，#p<0.01(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图32示出了展示出以下各项中的高尔基体染色的颗粒细胞树突平均总树突长度的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)和用媒介物或TATκ-eGFP-CDKL5115经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)。在海马切片的右侧方案示出了不同的层和CA1锥体细胞和颗粒细胞的位置。齿状回(DG)的分子层(Mol)含有颗粒细胞树突。值表示平均值±SE。与+/Y相比，**p<0.01；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图33示出了以下各项的颗粒细胞的高尔基体染色的树突状分支的图像：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)和用媒介物或TATκ-eGFP-CDKL5115经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)。
图34示出了展示了以下各项的颗粒细胞的树突棘数目的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)和用媒介物或TATκ-eGFP-CDKL5115经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)。值表示平均值±SE。与+/Y相比，**p<0.01；与-/Y样品相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图35示出了描绘出用于图36-38中说明的行为研究的植入物和融合蛋白注射时间表的草图。小鼠在植入时为4-6月龄。
图36示出了展示出以下各项中的如经由莫里斯水迷宫测试(Morris Water Mazetest)确定的学习期的定量的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y；n＝8)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y；n＝8)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5；n＝6)。值表示平均值±SE。与未处理的野生型情况相比，*P<0.05，**P<0.01，并且与未处理的CDKL5敲除情况相比#P<0.01，如在ANOVA之后用Fisher LSD检验的。
图37A-37B示出了展示出以下各项中如通过被动回避测试确定的记忆能力的图：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y；n＝8)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y；n＝8)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5；n＝6)。图示出了在行为程序的第一天(图37A)时和第二天(图37B)时进入黑暗隔区的潜伏时间。值表示平均值±SE。与未处理的野生型情况相比***P<0.001，并且与未处理的CDKL5敲除小鼠相比#P<0.01，如在ANOVA之后用Fisher LSD检验的。
图38A-38B示出了展示出如通过抱拢测试确定的运动能力的定量的图，其中测量了在2分钟间隔期间中以下各项的肢抱拢所用的时间总量：CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y；n＝8)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y；n＝8)和根据图35中的注射时间表用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-CDKL5；n＝8)。值表示平均值±SD。与+/Y相比，***p<0.001；与-/Y样品相比，#p<0.001(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图39展示了根据图20(+/Y；n＝8)或图35(-/Y；n＝6)的治疗时间表用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白进行处理的CDKL5野生型雄性(+/Y)和CDKL5敲除雄性(-/Y)小鼠的体重(以克计)。在插管植入之后，使小鼠恢复7天。
图40A-40F展示了在未经处理的动物和用TATκ-eGFP-CDKL5115通过脑室内注射处理5天或10天的动物中同种异体移植炎症因子1(AIF-1)染色的比较。接受注射的小鼠为4-6月龄。
图41示出了展示在DMEM中培养的HEK 293T细胞中分泌(泳道1-4)和表达(泳道5-8)TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白的蛋白质印迹以及比较TATκ-eGFP-CDKL5115和TATκ-eGFP-CDKL5107的表达和分泌模式的图像。从HEK 293T细胞或来自瞬时转染的培养的HEK 293T细胞的培养基产生提取物。将约15μg的HEK 293T细胞的总蛋白质提取物加载到凝胶上，加载20μL的40x浓缩的DMEM培养基以显示蛋白质分泌。箭头表示相应的CDKL5融合蛋白。
图42A-42B示出了展示了CDKL5融合蛋白在HEK 293T(图42A)和神经母细胞瘤细胞(图42B)中的稳定性的图。用含有编码TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107的多核苷酸的质粒转染HEK 293T或神经母细胞瘤细胞。24小时后，将细胞与环己酰亚胺(Chx；50μg/ml)一起孵育持续指定的时间(3小时、6小时或8小时)。通过CDKL5免疫印迹来检测异位表达的CDKL5。
图43示出了在HEK 293T细胞中展示TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107的蛋白质稳定性的蛋白质印迹的图像。用TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107转染HEK293T细胞。24小时后，将细胞与环己酰亚胺(Chx；50μg/ml)一起孵育持续指定的时间(3小时和6小时)。
图44示出了比较TATκ-eGFP-CDKL5115、TATκ-CDKL5115和TATκ-eGFP-CDKL5107对神经母细胞瘤细胞增殖的影响的图。用TATκ-eGFP、TATκ-eGFP-CDKL5115、TATκ-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107处理SH-SY5Y细胞。转染24小时后，将有丝分裂指数评估为有丝分裂细胞数目比总细胞数目，表达为％TATκ-eGFP。注意，与TATκ-eGFP处理的对照细胞相比，两种CDKL5同种型显示对SH-SY5Y有丝分裂相似的抑制活性。值表示平均值±SEM。与TATκ-eGFP处理的细胞相比，***p<0.001(t检验)。
图45A-45D示出了CDKL5在TATκ-eGFP-CDKL5107处理的海马神经元培养物中的定位。图45A和45C展示了TATκ-eGFP对照蛋白的转导效率和亚细胞定位。图45B和45D展示了TATκ-eGFP-CDKL5107蛋白的转导效率和亚细胞定位。使用抗-GFP抗体进行免疫检测并且用DAPI复染细胞。较高的放大倍数显示树突段的放大。
图46A-46C示出了用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的海马神经元的树突段的通过激光共聚焦显微镜的图像。图像示出了TATκ-eGFP-CDKL5107蛋白与突触后蛋白质(PSD-95)的共定位。使用抗-GFP抗体进行eGFP-CDKL5免疫检测(图45A)。
图47示出了展示用TATκ-eGFP、TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白处理后CDKL5KO(-/Y)海马神经元的树突长度的图。值表示平均值±SEM。与CDKL5野生型(+/Y)神经元相比，***p<0.001；与-/Y神经元相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图48示出了展示了用TATκ-eGFP、TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白处理后CDKL5KO(-/Y)海马神经元的海马神经元突触泡蛋白斑点的数目的图。值表示平均值±SEM。与CDKL5野生型(+/Y)神经元相比，***p<0.001；与-/Y神经元相比，#p<0.05(ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图49A-49B示出了描绘CDKL5融合蛋白的治疗时间表和给予途径的草图。如上所述，雄性CDKL5野生型(CDKL5+/Y；+/Y)小鼠接受了用TATκ-eGFP(n＝6)进行的处理，而用TATκ-eGFP(n＝6)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝6)处理了KO(CDKL5-/Y；-/Y)小鼠。治疗期由以下各项组成：连续5天的单次每日注射(10μl注射，约50ng/注射)、随后是两天休息期、然后是单次注射另外的5天。在12天的时间内进行了总共10次注射。小鼠在植入时为4-6月龄。在图49A-49B中使用的治疗时间表、给予途径和小鼠的年龄适用于图51-59。
图50示出了展示在如图49A-49B中所述接受TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白之后来自莫里斯水迷宫测试的结果的图。值表示平均值±SE。与用TATκ-eGFP处理的CDKL5野生型小鼠(+/Y)(+/Y+TATκ-eGFP)相比，*p<0.05，**p<0.01；与用TATκ-eGFP处理的CDKL5KO小鼠(-/Y)(-/Y+TATκ-eGFP)相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图51A-51C示出了展示来自测量(图51A)进入前一个平台象限的潜伏期、(图51B)进入前一个平台象限的频率、(图51C)在前一个平台象限中花费的时间百分比的空间记忆的图。在TATκ-eGFP处理的CDKL5KO小鼠(-/Y+TATκ-eGFP)中，所有参数的性能严重受损。TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)显示出所有参数的统计学显著的改善，图51A、51B和51C。值表示平均值±SE。与CDKL5野生型小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO小鼠相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图52A-52B示出了使用被动回避(PA)测试展示处理对学习和记忆的影响的图。在处理期和两天的休息期后，小鼠接受了被动回避(PA)测试。该实验利用了具有两个腔室(光明和黑暗)的测试笼子。在第一天，动物被置于光明腔室中并且本能地移动到黑暗腔室中，在该黑暗腔室中，它们遭受单一的不良事件(足部电击)。图52A表明对于所有组，进入黑暗腔室的潜伏时间是类似的。在第二天(测试期)，将动物再次置于光明腔室。通过进入黑暗腔室的潜伏时间来测定对不良事件的记忆，并将其呈现在图52B中。TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP)在此任务中严重受损，如通过与使用TATκ-eGFP处理的CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y+TATκ-eGFP)相比进入黑暗区室的潜伏期减少所证明的。与野生型雄性小鼠相比，TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)显示相似的潜伏时间(图52B)。与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP)相比，这些差异是统计学显著的。与CDKL5野生型雄性情况相比，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性情况相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图53A-53B示出了(图53A)用于评估处理对学习和记忆的影响的Y迷宫的草图和(图53B)展示来自Y迷宫测试的结果的图。用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)显示出与用TATκ-eGFP处理的CDKL5野生型小鼠(+/Y+TATκ-eGFP)相似的性能。与野生型情况相比，*p<0.05，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO情况(-/Y+TATκ-eGFP)相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图54A-54B示出了展示在用于评价处理对运动功能的影响的后肢抱拢测试中抱拢(右小鼠)与不抱拢(左小鼠)的图(图54A)和图像(图54B)。与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO(-/Y+TATκ-eGFP)相比，用TATκ-eGFP-CDKL5107处理CDKL5KO小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)导致抱拢时间统计学显著降低。值表示平均值±SE。与野生型情况(+/Y+TATκ-eGFP)相比，***p<0.001；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO相比，##p<0.001(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图55A和55B示出了展示在处理的(TATκ-eGFP-CDKL5107)和未处理的(+TATκ-eGFP)CDKL5野生型(+/Y)或CDKL5KO(-/Y)小鼠中呼吸紊乱的图，如通过非快速眼动(NREM)(图55A)和快速眼动(REM)(图55B)睡眠期间呼吸暂停的次数进行测量的。使用全身体积描记法来测量呼吸暂停。与野生型情况相比，*p<0.01；**p<0.01；与CDKL5KO-/Y情况相比，#p<0.01(t检验)。
图56A-56D示出了新生颗粒细胞的图(图56A)和重构树突树(图56B-56D)，展示了用TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白(+TATκ-eGFP-CDKL5107)或TATκ-eGFP(+TATκ-eGFP)处理对CDKL5野生型(+/Y)或CDKL5KO(-/Y)小鼠的影响。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO情况相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图57展示了在用TATκ-eGFP处理的CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)(+/Y+TATκ-eGFP)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)(-/Y+TATκ-eGFP)、和用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)的海马体(齿状回)中DCX阳性细胞数目的定量。治疗期由以下各项组成：每日一次脑室内注射持续5天、随后是两天休息期、然后是另外的5次注射。在最后一次注射后10天将动物处死。数据表示为细胞数目/mm。与+/Y相比，**p<0.01；与CDKL5KO样品相比，##p<0.001(在ANOVA后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。数据表明，用TATκ-eGFP-CDKL5处理对DCX阳性细胞的数目的积极影响在处理完成后10天仍保留。
图58展示了在用TATκ-eGFP处理的CDKL5野生型雄性小鼠(+/Y)(+/Y+TATκ-eGFP)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)(-/Y+TATκ-eGFP)、和用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)的海马体(齿状回)中裂解半胱天冬酶3阳性细胞的总数目的定量。治疗方案是每日一次脑室内注射给予5天，随后是两天休息期，然后是另外的5次注射。在最后一次注射后10天将动物处死。
图59示出了展示经由每日一次脑室内注射用TATκ-eGFP(+TATκ-eGFP)处理的CDKL5KO(-/Y)和CDKL5野生型(+/Y)小鼠或用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO(-/Y)小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5107)的体重的图。在插管植入后7天允许小鼠恢复，并在最后一次注射后10天将小鼠处死。
图60A-60C示出了用TATκ-eGFP-CDKL5107转导的海马神经元的树突段的通过激光共聚焦显微镜的图像。图像示出了TATκ-eGFP-CDKL5107蛋白与突触前蛋白质(突触泡蛋白；SYN)的共定位。使用抗-GFP抗体进行eGFP-CDKL5免疫检测(图64A)。图60A-60C使用如关于图45所述的方案产生。
图61示出了展示用TATκ-eGFP(+TATκ-eGFP)、TATκ-eGFP-CDKL5115(+TATκ-eGFP-CDKL5115)或TATκ-eGFP-CDKL5107(+TATκ-eGFP-CDKL5107)融合蛋白处理后，在高尔基体染色切片中CDKL5野生型(+/Y)或CDKL5KO(-/Y)海马神经元的树突棘数目的图。值表示平均值±SEM。与野生型(+/Y)神经元相比，**p<0.01；与CDKL5(-/Y)神经元相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图62示出了CDKL5融合蛋白的全身给予的治疗时间表。为了模拟每日人类剂量给予，我们使用了如下输注方法，该方法基于用可重新填装的容器在皮肤下植入的可编程泵。用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理CDKL5-/Y小鼠。通过插管将蛋白质直接注射到颈内动脉。该系统允许我们每天应用两次输注方案(早上和晚上；20μl注射，约50ng/注射)，持续10天的时间。小鼠在植入时为4-6月龄。关于图62描述的治疗时间表和小鼠年龄适用于图63A-72。
图63A-63B示出了对DCX免疫染色的海马齿状回片段的图像。连续10天向4-6月龄的小鼠全身给予TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白，观察到CDKL5KO雄性小鼠的神经突长度增加和新生颗粒细胞数目增加(图63B)。
图64示出了展示如通过在NREM睡眠期间呼吸暂停的次数测量的，用TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白对4-6月龄的小鼠进行全身处理对呼吸紊乱的影响的图。
图65是显示未处理的CDKL5+/Y和CDKL5-/Y小鼠以及用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5-/Y小鼠的新生(双皮质素-阳性)颗粒细胞的平均总树突长度的图。值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，**p<0.01；***p<0.001；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图66是显示未处理的CDKL5+/Y和CDKL5-/Y小鼠以及用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5-/Y小鼠的高尔基体染色的颗粒细胞的平均总树突长度的图。值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，**p<0.01；***p<0.001；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图67是显示未处理的CDKL5+/Y和CDKL5-/Y小鼠以及用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5-/Y小鼠的挖掘发作次数的图。值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，**p<0.01；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图68是显示未处理的CDKL5+/Y和CDKL5-/Y小鼠以及用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5-/Y小鼠的窝质量的图。值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，**p<0.01；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图69是在用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的一只CDKL5-/Y小鼠中在不同时间点收集的视觉皮层中的神经活动的一系列代表性图像。
图70是显示用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5-/Y小鼠中处理之前和处理6天和10天之后测量的视觉上诱发的反应的平均幅度的图。在处理停止(清除)后6-10天，用另外的测量评估作用的持续性。作为参考，在图案化区域中显示未处理的野生型反应幅度随时间的95％置信区间。误差条表示平均值的标准误差。双因子ANOVA(对因子时间的重复测量)揭示了时间X处理相互作用(p<0.05)；事后Holm-Sidak的多重比较测试：*p<0.05，**p<0.01。
图71是显示来自以下各项的初级视觉皮层(V1)锥体神经元(第2/3层)的树突棘密度的图：未处理的CDKL5+/Y和CDKL5-/Y小鼠，以及用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝5)处理且在处理结束时(短期)处死或用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理且在处理停止后10天(长期)处死的CDKL5-/Y小鼠。值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图72是显示在以下各项的初级视觉皮层(V1)中展现PSD-95免疫反应性的的荧光斑点数目/μm2的图：未处理的CDKL5+/Y(n＝3)和CDKL5-/Y(n＝3)小鼠，以及用TATκ-eGFP(n＝4)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝6)处理且在处理结束时(短期)处死或用TATκ-eGFP(n＝4)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝4)处理且在处理停止后10天(长期)处死的CDKL5-/Y小鼠。值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，**p<0.01；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
详细说明
在此提供了TATκ-CDKL5融合蛋白组合物和配制品以及它们用于治疗CDKL5介导的疾病和障碍，尤其是由于CDKL5突变和/或缺陷所导致的障碍和疾病的方法。在此还提供了用于产生TATκ-CDKL5融合蛋白组合物和配制品的方法。这些方法为CDKL5介导的神经障碍的研究提供了改进的实验工具以及为罹患与CDKL5功能异常相关的障碍的患者提供改进的治疗选择。在此还提供了使用这样的TATκ-CDKL5融合蛋白组合物和配制品用于治疗CDKL5介导的疾病和障碍的方法。在此还提供了在患有CDKL5介导的疾病或障碍的患者中增加视觉皮层的神经活动的方法。在此还提供了在患有CDKL5介导的疾病或障碍的患者的脑中增加神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度的方法。在此还提供了减少患有CDKL5介导的疾病或障碍的患者的脑中的神经元细胞凋亡的方法。在此还提供了改善患有CDKL5介导的疾病或障碍的患者的运动功能的方法。
定义
如在此所用，当与数值变量结合使用时，“约”、“大约”等通常是指该变量的值并且是指该变量的在实验误差之内(例如在平均值的95％置信区间之内)或在指示值的+/-10％之内的所有值(无论哪个更大)。
如在此所用，“活性剂”或“活性成分”是指一种物质、化合物或分子，其具有生物活性或以其他方式对其所给予至的受试者诱导生物学或生理学效应。换句话说，“活性剂”或“活性成分”是指组合物中的一种或多种组分，该组合物的全部或部分作用归因于该一种或多种组分。
如在此所用，“累加效应”是指在两种或更多种分子、化合物、物质、因素或组合物之间出现的与它们的单独效应的总和相等或相同的效应。
如在此所用，术语“两亲性的”是指将亲水特性和亲脂(疏水)特性相结合的分子。
如在此所用，“抗体”是指包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白、或其抗原结合部分。每条重链由一个重链可变区(在此缩写为VH)和一个重链恒定区构成。每条轻链由一个轻链可变区和一个轻链恒定区构成。VH区和VL区保留了对抗原的结合特异性并且可以进一步细分为超变区，命名为互补决定区(CDR)。CDR散布有更保守的区，命名为框架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端排到羧基末端的三个CDR和四个框架区组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
如在此所用，“抗感染药”是指可以杀伤传染剂或抑制其传播的化合物或分子。抗感染药包括但不限于抗生素、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药和抗原生动物药。
如在此所用，“适配子”是指可以结合至具有高亲和力和特异性的预选择的靶标(包括蛋白质)上的单链DNA或RNA分子。其特异性和特征不能通过其一级序列直接确定，而是通过其三级结构来确定。
如在此所用，术语“生物相容的”是指通常对受者是无毒性的并且对受者不产生任何明显的不良作用的材料以及其任何代谢物或降解产物。一般而言，生物相容材料是当给予至患者时不引发明显的炎性应答或免疫应答的材料。
如在此所用的“生物可降解的”通常是指将在生理条件下降解或腐蚀为能够被受试者代谢、消除或排泄出的较小单元或化学物质的材料。降解时间是组成和形态的函数。降解时间可以是从数小时至数周。
如在此所用，术语“亲水性的”是指具有易于与水相互作用的强极性基团的物质。
如在此所用，“cDNA”是指与细胞中的RNA转录物互补的DNA序列。cDNA是人造的分子。典型地，cDNA使用RNA转录物为模板通过所谓的逆转录酶的酶在体外形成。
如在此所用，“CDKL5缺陷”是指蛋白质的生物学功能的任何缺陷。该缺陷可以产生自编码蛋白质的DNA或DNA相关调节区中的任何DNA突变，或由于表观遗传DNA修饰的任何变化导致的蛋白质功能的任何变化，包括但不限于DNA甲基化或组蛋白修饰、CDKL5蛋白的二级、三级或四级结构的任何变化，或CDKL5蛋白相比于野生型或正常受试者执行其生物学功能的能力的任何变化。
如在此所用，“CDKL5突变”是指CDKL5蛋白质的编码区的核苷酸序列中的任何变化。
如在此所用，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括子代。还应当理解的是所有的子代的DNA含量可能不是精确相同的，这归因于故意的或非故意的突变。包括了具有相同功能或生物学特性的变体子代，如在原始转化细胞中所筛选的。
如在此所用，“组合物”是指活性剂与至少一种其他化合物或分子，惰性(例如可检测试剂或标记)或活性的，诸如佐剂的组合。
如在此所用，“浓缩的”是指一种分子，包括但不限于多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，该分子可与其天然存在的对应物的区别在于分子的浓度或数目/体积大于其天然存在的对应物的分子的浓度或数目/体积。
如在此所用，“对照”是在实验中用于比较目的并且被包含以最小化或辨别出除独立变量之外的变量的影响的替代性受试者或样品。
如在此所用，“化学治疗剂(chemotherapeutic agent)”或“化学治疗剂(chemotherapeutic)”是指用于预防或治疗癌症的治疗剂。
如在此所用，“培养”是指在其中细胞可以繁殖并且避免衰老成一群细胞的条件下维持细胞。“培养”还可以包括其中细胞还或可替代地分化的条件。
如在此所用，“脱氧核糖核酸(DNA)”和“核糖核酸(RNA)”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。RNA可以是呈以下形式：tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、RNAi(RNA干扰构建体)、siRNA(短干扰RNA)或核酶。
如在此所用，“DNA分子”包括由DNA组成的核酸/多核苷酸。
如在此所用，“衍生物”是指与化合物具有相同或类似的核心结构但具有至少一种结构差异的任何化合物，该至少一种结构差异包括取代、缺失和/或添加一个或多个原子或官能团。术语“衍生物”不意指衍生物由母体化合物作为起始物料或中间体合成，但是可以是这样的情形。术语“衍生物”可以包括前药、或母体化合物的代谢物。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的游离氨基基团已被衍生化以形成盐酸胺盐、对甲苯磺酰胺、苯酰氧基羧酰胺(benzoxycarboamides)、叔丁氧羧酰胺(t-butyloxycarboamides)、硫代氨基甲酸酯型衍生物、三氟乙酰胺(trifluoroacetylamides)、氯乙酰胺或甲酰胺。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的羧基基团已被衍生化以形成甲基酯和乙基酯，或其他类型的酯或酰肼。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的羟基基团已被衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。衍生物包括这样的化合物，其中母体化合物中的供氢键基团被替换为另一种供氢键基因诸如OH、NH或SH。衍生物包括将母体化合物中的氢键受体基团替换为另一种氢键受体基团诸如酯、醚、酮、碳酸盐、叔胺、亚胺、硫酮、砜、叔酰胺以及硫化物。“衍生物”还包括用饱和的或不饱和的环己烷或其他更复杂的例如含氮的环以及具有不同侧基团的这些环的延伸物替换环戊烷环的延伸物。
如在此所用，“分化(differentiate)”或“分化(differentiation)”是指前体细胞或祖细胞(例如神经元祖细胞)分化为特定的细胞类型(例如神经元)所通过的过程。
如在此所用，“差异性表达”是指与由正常或对照细胞中的相同基因或调节区产生的RNA水平相比，差异性产生RNA，包括但不限于由基因组的基因或调节区转录的mRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snRNA以及piRNA，或由基因编码的蛋白质产物。在另一背景下，“差异性表达”还是指与正常或对照细胞相比，细胞或组织中的具有不同的时间和/或空间表达谱的核苷酸序列或蛋白质。
如在此所用，“稀释的”是指一种分子，包括但不限于多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，该分子可与其天然存在的对应物的区别在于分子的浓度或数目/体积小于其天然存在的对应物的分子的浓度或数目/体积。
如在此所用，“剂量(dose)”、“单位剂量”或“剂量(dosage)”是指适合用于受试者的物理离散单位，各单位含有预定量的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和/或其药物配制品，该预定量经计算以产生所希望的应答或与其给予相关联的应答。
如在此所用，“有效量”是足以使细胞、组织、系统、动物或人类产生有益的或所希望的生物学、情绪、医学或临床应答的量。有效量可以一次或多次给予、施用或剂量来给予。该术语在其范围之内还包括有效增强正常生理功能的量。
如在此所用，在细胞背景下的“扩增(expansion)”或“扩增的”是指由原始细胞群体增加特征性的一种或多种细胞类型的数目，这些原始细胞群体可以是或可以不是相同的。用于扩增的原始细胞不一定与由扩增产生的细胞相同。例如，扩增的细胞可以通过原始细胞群体的离体或体外生长和分化产生。
如在此所用，“表达”是指多核苷酸被转录为RNA转录物所通过的过程。在mRNA和其他翻译的RNA种类的背景下，“表达”还是指转录的RNA随后被翻译为肽、多肽或蛋白质所通过的一种或多种过程。
如在此所用，“融合蛋白”是指由至少两种不同的蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质。融合蛋白是由重组DNA分子编码的。因此，“CDKL5融合蛋白”是指具有可操作地连接至其他多肽序列上的人类CDKL5多肽或其变体的重组蛋白。
如在此所用，“基因”是指对应于DNA序列的遗传单位，该遗传单位占据染色体上的特定位置并且含有生物体中的一个或多个特征或一个或多个性状的遗传指令。
如在此所用，“绿色荧光蛋白”、“黄色荧光蛋白”、“红色荧光蛋白”等及其缩写包括但不限于此类蛋白质的所有形式，因为它们经常被修饰、被衍生并且通常是本领域普通技术人员所已知的。例如，“绿色荧光蛋白”包括但不限于增强的绿色荧光蛋白(eGFP)、氧化还原敏感性GFP(roGFP)和所有颜色突变体。
如在此所用，“HEK 293T”是本领域的术语并且是指表达大T抗原的人胚胎肾(HEK)293细胞，并且是本领域中通常已知的且通过供应商(例如美国组织典型培养物保藏中心(American Tissue Type Culture Collection))可商购获得。
如在此所用，术语“疏水性的”是指缺乏对水的亲和力；倾向于排斥而不吸收水以及不溶解于水中或不与水混合的物质。
如在此所用，“一致性”是两种或更多种多肽序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“一致性”还是指多肽之间的序列相关性程度，如通过此类序列串之间的匹配所确定的。“一致性”可以容易地通过已知方法计算，这些已知方法包括但不限于以下各项中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学]，Lesk,A.M.编著，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组计划]，Smith,D.W.编著，学术出版社(Academic Press)，纽约，1993；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析]，第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著，新泽西州胡马纳出版社(Humana Press，New Jersey)，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析]，von Heinje,G.，学术出版社(Academic Press)，1987；以及SequenceAnalysis Primer[序列分析初级读本]，Gribskov,M.和Devereux,J.编著，纽约州米斯托克顿出版社(M Stockton Press，New York)，1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.，SIAMJ.Applied Math.[工业与应用数学学会应用数学杂志]1988，48:1073。设计了用于确定一致性的优选方法，以得出测试序列之间的最大匹配。确定一致性的方法编纂在公众可获得的计算机程序中。可以通过使用结合Needelman和Wunsch(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，1970，48:443-453)算法(例如，NBLAST和XBLAST)的分析软件(例如，遗传计算组的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊(Madison Wis.))来确定在两个序列之间的百分比一致性。使用缺省参数来确定本披露的多肽的一致性。
如在此所用，“免疫调节剂”是指一种试剂，诸如治疗剂，其能够调控或调节一种或多种免疫功能或应答。
如在此所用，“诱导(induces)”、“诱导(inducing)”或“诱导的(induced)”是指激活或刺激细胞内的过程或途径，诸如胞吞作用、分泌和胞吐作用。
如在此所用，“分离的”意指与组分、细胞和其他物质分开的，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段正常是天然结合在一起的。非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来使其与其天然存在的对应物相区分。
如在此所用，术语“亲脂性的”是指对脂质具有亲和力的化合物。
如在此所用，用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养动物和农场动物、非人类灵长类动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，诸如但不限于狗、马、猫和牛。
如在此所用，“基质”是指一种材料，其中嵌入了一种或多种专门结构、分子或组合物。
如在此所用，术语“分子量”通常是指材料的质量或平均质量。在聚合物或低聚物的情况下，分子量可以是指本体聚合物的相对平均链长或相对链质量。在实践中，聚合物和低聚物的分子量可以不同方式来估计或表征，包括凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管测粘法。GPC分子量是作为重均分子量(Mw)报告的，该重均分子量是与数均分子量(Mn)相对的。毛细管测粘法将分子量的估计值提供为使用一组特定的浓度、温度和溶剂条件由稀释的聚合物溶液确定的特性黏度。
如在此所用，“阴性对照”是指被设计成不产生影响或结果的“对照”，前提条件是所有的试剂功能正常并且实验是正确进行的。与“阴性对照”可互换的其他术语包括“假处理(sham)”、“安慰剂(placebo)”和“模拟物(mock)”。
如在此所用，“核酸”和“多核苷酸”通常是指一条至少两个碱基-糖-磷酸盐的组合串并且除此之外是指单链和双链的DNA、是单链区与双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA、以及是单链区与双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或单链区与双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。而且，在此所用的多核苷酸是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。在此类区中的链可以来自相同的分子或不同的分子。这些区可以包含一个或多个分子中的全部，但是更典型地仅包含一些分子的区。三螺旋区的分子中的一种常常是寡核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还涵盖多核苷酸的此类化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(除了别的之外包括简单细胞和复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。例如，术语多核苷酸包括如以上所述的含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，仅举两个实例，包含稀有碱基(诸如肌苷)或修饰碱基(诸如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是如该术语在此所用的多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸以及天然核酸的磷酸主链的其他变体。天然核酸具有磷酸主链，人工核酸可以含有其他类型主链，但是含有相同的碱基。因此，出于稳定性或其他原因而对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在此所意指的“核酸”或“多核苷酸”。
如在此所用，“核酸序列”和“寡核苷酸”还涵盖如以上所定义的核酸和多核苷酸。如在此所用，“生物体”、“宿主”和“受试者”是指由至少一个细胞构成的任何活的实体。活的生物体可以简单至例如单个分离的真核细胞或培养细胞或细胞系，或者复杂至哺乳动物，包括人类和动物(例如，脊椎动物、两栖动物、鱼、哺乳动物，例如猫、狗、马、猪、牛、绵羊、啮齿动物、兔、松鼠、熊、灵长类动物(例如，黑猩猩、大猩猩和人类))。“受试者”还可以是细胞、细胞群体、组织、器官或生物体，优选人类及其组分。如在此所用，“过表达的”或“过表达”是指与正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达水平相比，由基因编码的RNA或蛋白质产物的表达水平增加。
如在此所用，“可操作地连接”可以指明可用于表达核酸的编码序列的调节序列以相对于编码序列的适当位置位于核酸分子中以便实现编码序列的表达。此相同定义有时适用于表达载体中的编码序列和/或转录控制元件(例如，启动子、增强子和终止元件)和/或选择性标记的安排。
如在此所用，“患者”是指需要治疗的生物体、宿主或受试者。
如在此所用，“肽”是指相对于蛋白质或多肽是短的至少2个氨基酸的链。
如在此所用，“药物配制品”是指活性剂、化合物或成分与药学上可接受的载体或赋形剂的组合，从而使该组合物适合于体外、体内或离体的诊断性、治疗性或预防性用途。
如在此所用，“药学上可接受的载体或赋形剂”是指可用于制备药物配制品的载体或赋形剂，该载体或赋形剂通常是安全、无毒性的并且既不是生物学上也不是其他不合需要的，并且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的载体或赋形剂。如说明书和权利要求书中所用的“药学上可接受的载体或赋形剂”包括一种和多于一种的此载体或赋形剂两者。
如在此所用，“药学上可接受的盐”是指任何酸或碱加成盐，其反离子对它们以盐的药物剂量所给予至的受试者没有毒性。
如在此所用，如在此所用的“质粒”是指包含完整“复制子”的非染色体的双链DNA序列，由此使得该质粒在宿主细胞中被复制。
如在此所用，“阳性对照”是指被设计成产生所希望的结果的“对照”，前提条件是所有的试剂功能正常并且实验是正确进行的。
如在此所用，“预防性(preventative)”和“预防(prevent)”是指在疾病或病状发生之前阻止或终止该疾病或病状，即使未诊断出，或者在该疾病或病状仍处于亚临床阶段时。
如在此所用，如在此所用的“蛋白质”是指由一条或多条氨基酸链以特定顺序组成的大分子。术语蛋白质与“多肽”可互换地使用。该顺序是通过编码该蛋白质的基因中的核苷酸的碱基序列确定的。蛋白质是为身体的细胞、组织和器官的结构、功能和调节所需要的。每种蛋白质具有独特的功能。
如在此所用，“纯化的”或“纯化”用于指相对于自然环境具有增加的纯度的核酸序列、肽或多肽。
如在此所用，术语“重组体”通常是指非天然存在的核酸、核酸构建体或多肽。此类非天然存在的核酸可以包括已经被修饰(例如具有缺失、取代、翻转、插入等)的天然核酸，和/或使用分子生物技术所接合的不同来源的核酸序列的组合(例如，编码融合蛋白(例如，由两种不同的蛋白质或蛋白质片段的组合形成的蛋白质或多肽)的核酸序列，编码多肽的核酸与启动子序列的组合，其中编码序列和启动子序列来自不同的来源或以其他方式典型地非天然地一起出现(例如核酸和组成型启动子)等)。重组体还是指由重组核酸编码的多肽。非天然存在的核酸或多肽包括通过人而经修饰的核酸和多肽。
如在此所用，“Rett综合征变体”、“Rett综合征的变体”等是指Rett综合征的非典型形式，其与Rett综合征具有类似的临床征象但病因学未知。
如在此所用，“分开的”是指与原始来源或群体在物理上分割开的状态，使得分开的化合物、试剂、粒子或分子可以不再被认为是原始来源或群体的一部分。
如在此所用，“特异性地结合”或“特异性结合”是指此类成对物种诸如酶/底物、受体/激动剂或拮抗剂、抗体/抗原、凝集素/碳水化物、寡DNA引物/DNA、酶或蛋白质/DNA，和/或RNA分子与其他核酸(DNA或RNA)或氨基酸之间存在的结合，该结合可以是由共价相互作用或非共价相互作用或共价相互作用和非共价相互作用的组合介导的。当两种物种的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合典型地是静电的、氢键的或亲脂性相互作用的结果。因此，“特异性结合”发生在成对物种之间，其中两者之间存在产生具有以下的特征的结合复合物的相互作用：抗体/抗原、酶/底物、DNA/DNA、DNA/RNA、DNA/蛋白质、RNA/蛋白质、RNA/氨基酸、受体/底物相互作用。具体地，特异性结合的特征在于对中的一个成员与结合成员的相应成员所属于的化合物家族内的特定物种结合并且不与其他物种结合。因此，例如，抗体优选结合蛋白质家族内的单一表位并且不结合其他表位。
如在此所用，“特异性结合配偶体”或“结合配偶体”是相比于所有其他分子或化合物，与第二化合物或分子的结合的亲和力更高的化合物或分子。
如在此可互换所用，“受试者”、“个体”或“患者”是指脊椎动物生物体。
如在此所用，“基本上纯的”意指目标物种是存在的占优势物种(即，在摩尔基础上它比该组合物中的任何其他单独物种更丰富)，并且优选地基本上纯化的级分是其中目标物种占存在的所有物种的约50％的组合物。一般地说，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的所有物种的大于约80％，更优选大于约85％、90％、95％和99％。更优选地，目标物种被纯化至必要的均质性(通过常规的检测方法不能在该组合物中检测到污染物物种)，其中该组合物主要由单一物种组成。
如在此所用，“基本上纯的细胞群体”是指具有指定的细胞标记特征和分化潜能的细胞群体，该细胞群体是组成总细胞群体的细胞的约50％、优选约75％-80％、更优选约85％-90％，并且最优选约95％。因此，“基本上纯的细胞群体”是指这样的细胞群体：在所指定的测定条件下，该细胞群体含有少于约50％、优选少于约20％-25％、更优选少于约10％-15％，并且最优选少于约5％的不展示出指定的标记特征和分化潜能的细胞。
如在此可交换使用的术语“足够的”和“有效的”是指实现一种或多种希望的结果所需要的量(例如，质量、体积、剂量、浓度和/或时间周期)。例如，治疗有效量是指实现一种或多种治疗性效果所需要的量。
如在此所用，“协同效应”、“协同作用”或“协同性”是指在两种或更多种分子、化合物、物质、因素或组合物之间出现的大于或不同于它们的单独效应的总和的效应。
如在此所用，“治疗性的”是指治疗、治愈和/或改善疾病、障碍、病状或副作用，或者是指降低疾病、障碍、病状或副作用的发展速率。该术语在其范围之内还包括增强正常的生理功能、姑息治疗以及疾病、障碍、病状、副作用或其症状的部分补救。该疾病或障碍可以是CDKL5缺陷和/或Rett综合征。
如在此所用，“治疗有效量”是指在此所述的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品、助剂或第二试剂将引发组织、系统、动物或人类的生物或医学应答的量，该量是由研究者、兽医、医师或其他临床医师所寻求的。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以防止CDKL5缺陷和/或Rett综合征的一种或多种症状的发展、将该一种或多种症状减少或减轻至一定程度的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以增加受试者的脑的区中的神经元存活率、神经元数目、神经突生长、延长、树突棘数目、和/或分支密度的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以增加受试者的学习能力的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以增加受试者的记忆能力的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，与对照相比，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以改善受试者的运动功能的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以将学习能力、记忆能力和/或运动功能恢复至基本上类似于野生型或正常水平的水平的量。“治疗有效量”包括当单独给予或与第二试剂共同给予时，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的足以将脑的区中的神经元数目、神经元存活率、神经突生长、神经突延长、树突棘数目、神经突分支数目和/或神经突分支密度恢复至基本上类似于野生型或正常水平的水平的量。该治疗有效量将根据以下各项变化：CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、其药物配制品的确切化学结构、被治疗的CDKL5缺陷、Rett综合征或其症状、给予路径、给予时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断、剂型以及有待治疗的受试者的年龄、重量、一般健康状况、性别和/或饮食。
如在此所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”通常是指获得所希望的药理学和/或生理学效应。在预防或部分预防疾病、其症状或病状，诸如由CDKL5突变和/或缺陷、Rett综合征的CDKL5变体产生的疾病或障碍，或其他CDKL5介导的神经障碍方面，该效果可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病状、症状或归因于该疾病、障碍或病状的不良作用方面，该效果可以是预防性的。如在此所用，术语“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类的CDKL5介导的神经障碍的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病在可能易受疾病但是还未被诊断为罹患疾病的受试者身上发生；(b)抑制疾病，即，遏制它发展；或(c)减轻疾病，即，缓和或改善疾病和/或其症状或病状。如在此所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些包括已经患有障碍的那些以及其中有待预防障碍的那些。
如在此所用，“有形的表达介质”是指物理上有形的介质并且不仅仅是抽象思维或无记录的口头语言。有形的表达介质包括但不限于纤维素或塑料材料上的字或适合的设备诸如快闪存储器或CD-ROM上存储的数据。
如在此所用，“转导的”是指将蛋白质直接引入到细胞中。
如在此所用，术语“转染”是指将外源性和/或重组核酸序列引入到活细胞的细胞膜封闭空间的内部中，包括将核酸序列引入到细胞的胞液以及线粒体、细胞核或叶绿体的内部空间中。核酸可以呈裸DNA或RNA的形式，其可以与不同蛋白质或调节元件(例如，启动子和/或信号元件)缔合，或者核酸可以掺入到载体或染色体中。可以将核酸掺入病毒颗粒中。
如在此所用，“转化”或“转化的”是指将核酸(例如，DNA或RNA)引入细胞中，以此方式使得允许引入的核酸的编码部分表达。
如在此所用，“低表达的”或“低表达”是指与正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达水平相比，由基因编码的RNA或蛋白质产物的表达水平降低。
如在此所用，“变体”是指不同于参考多肽但是保留了必要的特性的多肽。多肽的典型变体与另一个参考多肽在氨基酸序列上不同。一般来讲，差异是受限的，使得参考多肽和变体的序列总体上是紧密类似的并且在许多区中是相同的。变体和参考多肽可以通过一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)而在氨基酸序列上不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是被遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的诸如等位基因变体，或者可以是未知是天然存在的变体。“变体”包括功能和结构的变体。
如在此所用，术语“载体”用于指用于将外源性核酸序列引入到细胞中的媒介物。载体可以包括线性或环状的DNA分子(例如质粒)，该DNA分子包含编码感兴趣的多肽的区段，该区段被可操作地连接至在引入到宿主细胞或宿主细胞细胞器中后提供其转录和翻译的另外区段上。此类另外的区段可以包括启动子序列和终止子序列，并且还可以包括一个或多个复制起点、一种或多种选择性标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于酵母或细菌基因组或质粒DNA、或病毒DNA，或可以含有两者的元件。
如在此所用，“野生型”是在自然界中出现的典型形式的生物体、变种、菌株、基因、蛋白质或特征，与可能产生自选择育种或使用转基因的转化的变体形式相区分。
除非在此另外定义，否则在此使用的所有技术性和科学性的术语具有与本领域技术人员所普遍理解的相同含义。
讨论
TATκ-CDKL5融合基因和蛋白质
在人类CDKL5中，前两个报道的剪接变体在5'UTR方面不同，并产生相同的115kDa蛋白质。这些剪接变体被称为同种型I(含有在广泛组织中转录的外显子1)，以及仅限于睾丸和胎儿脑中的同种型II(包括外显子1a和1b)(Kalscher等人，2003，Am J Hum Genet[美国人类遗传学杂志]，72:1401-11和Williamson等人，2012，Hum Genet[人类遗传学]，131:187-200)。所得到的CDKL5转录物产生分子量为115kDa、具有1030个氨基酸的蛋白质(CDKL5115)，并且主要在睾丸中表达。最近，已经鉴定出可变剪接事件，导致至少三种不同的人类蛋白质同种型。这些同种型之一的特征在于改变的C-末端区域并且被称为CDKL5107(Fichou等人，2011，J.Hum Genet[人类遗传学杂志]，56:52-57，Williamson等人，2012，Hector等人，2016，PLoS One[公共科学图书馆杂志]，11(6):e0157758)。CDKL5107是人和小鼠脑中主要的同种型。在所有人类组织中，CDKL5107是最丰富的转录物，其中组织表达CDKL5107比CDKL5115多10倍至100倍或更多。具体地，在整个脑中存在CDKL5107比CDKL5115多37倍。睾丸是例外，CDKL5107仅比CDKL5115多2.5倍，这反映出了在该组织中CDKL5115相对丰富。CDKL5的C末端(在两种同种型中是不同的)在调节其亚细胞定位和细胞核中截短的蛋白质的积累中是重要的。(Bertani等人，2006，J Biol Chem[生物化学杂志]，281:32048-56和Rusconi等人，2008，J Biol Chem[生物化学杂志]，283:30101-11)。
已经检查了CDKL5107同种型的细胞分布，这揭示了与先前研究过的人类CDKL5115蛋白质大部分重叠而不完全重叠的亚细胞定位和催化活性。体外数据表明CDKL5115同种型的蛋白酶体降解由仅在该同种型中存在的在氨基酸904和1030之间的信号介导，而CDKL5107更稳定，并且更不易于通过蛋白酶体途径降解。
融合基因和蛋白质
在此披露了重组cDNA序列，其编码不同的含有修饰TAT(TATκ)序列的CDKL5融合蛋白。包含在融合蛋白中的CDKL5可以是CDKL5115同种型。包含在融合蛋白中的CDKL5可以是CDKL5107同种型。SEQ ID NO:2对应于CDKL5115同种型多肽，并且SEQ ID NO:16对应于CDKL5107同种型多肽。在一个实施例中，该融合蛋白含有可操作地连接至TATκ多肽上的人类CDKL5多肽。编码CDKL5融合蛋白的cDNA序列可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:1、7、9、11、13，或其变体中的任一个的序列。CDKL5融合蛋白可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:8、10、12、14，或其变体中的任一个的多肽序列。
在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以根据SEQ ID NO:1或15。在另外的实施例中，人类CDKL5cDNA可以与SEQ ID NO:1或15具有约90％至约100％、80％至约90％、或约50％至约80％一致。在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以编码根据SEQ ID NO:2或16的氨基酸序列。在另外的实施例中，人类CDKL5 cDNA序列可以编码与SEQ ID NO:2或16具有约90％至约100％、80％至约90％、或约50％至约80％一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以是与SEQ ID NO:1中的12个连续核苷酸具有约90％至100％一致的至少12个连续核苷酸的片段。在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以是与SEQ ID NO:1中的12个连续核苷酸具有约80％至90％一致的至少12个连续核苷酸的片段。在一些实施例中，cDNA序列可以是与SEQ ID NO:1中的12个连续核苷酸具有约50％至80％一致的至少12个连续核苷酸的片段。
在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以是与SEQ ID NO:15中的12个连续核苷酸具有约90％至100％一致的至少12个连续核苷酸的片段。在一些实施例中，人类CDKL5cDNA序列可以是与SEQ ID NO:15中的12个连续核苷酸具有约80％至90％一致的至少12个连续核苷酸的片段。在一些实施例中，cDNA序列可以是与SEQ ID NO:15中的12个连续核苷酸具有约50％至80％一致的至少12个连续核苷酸的片段。
CDKL5融合蛋白含有可操作地连接至人类CDKL5多肽上的修饰的反式作用激活的转录(TAT)蛋白质转导结构域(PTD)(TATκ)。TATκ可以具有根据SEQ ID NO:3的cDNA序列和根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列。TATκ是修饰的TAT-PTD。未修饰的TAT-PTD介导肽和蛋白质到细胞中的转导。然而，未修饰的TAT-PTD不允许TAT-PTD融合蛋白被细胞分泌。未修饰的TAT-PTD通过弗林内切蛋白酶在位于未修饰TAT-PTD之内的弗林蛋白酶识别序列处从融合蛋白裂解出来。相反，TATκ被修饰使得其不含有弗林蛋白酶识别序列。因此，在此所述的含有TATκ的CDKL5融合蛋白可以其全长形式被真核细胞分泌。
在一些实施例中，TATκcDNA序列可以与SEQ ID NO:3具有约90％至100％或约80％至约90％一致。在一些实施例中，TATκcDNA可以编码与SEQ ID NO:4具有约90％至100％或约80％至约90％一致的多肽序列。TATκcDNA能够可操作地连接至编码CDKL5融合蛋白的cDNA。
CDKL5融合蛋白可以任选地含有Igκ-链前导序列以在由细胞产生过程中将多肽引向分泌途径。在一些实施例中，该Igκ-链前导序列可以被可操作地连接在人类CDKL5多肽的N-末端处。该Igκ-链前导序列可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:5或其变体的cDNA序列并且可以具有根据在此所述的SEQ ID NO:6或其变体的氨基酸序列。Igκ链前导序列cDNA能够可操作地连接至编码CDKL5融合蛋白的cDNA。
在其他实施例中，该Igκ-链前导序列cDNA可以与SEQ ID NO:5具有约90％至100％、约80％至约90％、或约80％至90％一致。在一些实施例中，该Igκ-链前导序列可以具有与SEQ ID NO:6具有约90％至约100％、约80％至约90％、或约50％至约80％一致的氨基酸序列。
CDKL5融合蛋白可以任选地含有可操作地连接至CDKL5融合蛋白上的一个或多个蛋白标签。这些标签类型是允许融合蛋白的亲和纯化、溶解、色谱分离和/或免疫检测的氨基酸序列。适合的蛋白标签包括但不限于几丁质结合蛋白质(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、FLAG标签(包括任何FLAG标签变体，例如3x FLAG)、V5标签、Myc标签、HA标签、S标签、SBP标签、Sf标签1、Sof标签3、Tc标签、Xpress标签、Strep标签、Isopep标签、Spy标签、Ty标签、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及Nus标签。根据SEQ ID NO:7、9或11、分别具有根据SEQ ID NO:8、10或12的氨基酸序列的CDKL5融合蛋白cDNA展示了含有TATκ和Myc标签和聚(HIS)标签的CDKL5融合蛋白的非限制性实施例。根据SEQ ID NO:13、具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDKL5融合蛋白cDNA展示了具有FLAG标签的CDKL5融合蛋白的非限制性实施例。
CDKL5融合蛋白可以任选地含有可操作地连接至CDKL5多肽上的一种或多种报告蛋白。适合的报告基因包括但不限于荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)以及青色荧光蛋白(CFP))、β-半乳糖苷酶、荧光素酶(细菌、萤火虫和海肾荧光素酶)、抗生素耐性基因(例如氯霉素乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶和NPT-II)、β-葡萄糖醛酸酶(p-glucuronidase)以及碱性磷酸酶。报告蛋白的包含(除了别的之外)允许融合蛋白和融合蛋白功能的直接和/或间接表征，以及该蛋白质的亲和纯化。该报告蛋白可以被可操作地连接至人类CDKL5多肽的N-末端和/或C-末端上。在其他实施例中，该报告蛋白可以被可操作地连接至CDKL5融合蛋白的N-末端和/或C-末端上。根据SEQ ID NO:9或11并且分别具有根据SEQ ID NO:10或12的氨基酸序列的CDKL5融合蛋白cDNA展示了含有荧光报告蛋白的CDKL5融合蛋白的非限制性实施例。重组载体
CDKL5融合cDNA序列可以被掺入到适合的表达载体中。该表达载体可以含有用于促进CDKL5融合cDNA的表达的一种或多种调节序列或一种或多种其他序列。该表达载体可以含有用于促进CDKL5融合表达载体的复制的一种或多种调节序列或一种或多种其他序列。该表达载体可以适用于在细菌细胞中表达CDKL5融合蛋白。在其他实施例中，该表达载体可以适用于在酵母细胞中表达CDKL5融合蛋白。在另外实施例中，该表达载体可以适用于在植物细胞中表达CDKL5融合蛋白。在其他实施例中，该表达载体可以适用于在哺乳动物细胞中表达CDKL5融合蛋白。在另一个实施例中，该载体可以适用于在真菌细胞中表达CDKL5融合蛋白。在另外的实施例，该载体可以适用于在昆虫细胞中表达CDKL5融合蛋白。合适的表达载体对于本领域的技术人员而言通常是已知的。
TATκ-CDKL5蛋白质产生
在一些实施例中，CDKL5融合蛋白在细胞培养体系中体外产生。该细胞培养体系可以含有一种或多种细菌、酵母、昆虫、真菌、植物或哺乳动物细胞。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白被一种或多种培养细胞分泌到细胞培养基中。在其他实施例中，CDKL5融合蛋白被包含在一种或多种培养细胞的细胞质或细胞膜之内。
由此，转向图1，其示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中CDKL5融合蛋白由培养的细胞产生并且被分泌到周围培养基中。该方法开始于使含有CDKL5融合蛋白cDNA序列的适合载体转染或以其他方式递送至培养物中的一种或多种细胞(6000)。然后使用通常已知的方法培养细胞(6010)以使得转染的细胞由载体产生CDKL5融合蛋白并且将CDKL5融合蛋白分泌到周围细胞培养基中。在其他实施例中，可以使用本领域普通技术人员通常已知的技术产生稳定转染的细胞系，该细胞系表达一种或多种载体，该载体含有CDKL5融合蛋白cDNA。可以使用通常已知的方法来培养这些细胞(6010)，以允许细胞产生CDKL5融合蛋白。
在适量时间之后，收集含有分泌的CDKL5融合蛋白的培养基(6020)。在一些实施例中，将细胞培养从约12小时至约96小时。这时候，确定是否需要进一步从培养基中纯化CDKL5融合蛋白(6030)。在一些实施例中，含有CDKL5融合蛋白的培养基不进一步进行纯化并且直接用于转导一种或多种细胞(6050)。在其他实施例中，进一步从培养基中纯化CDKL5融合蛋白和/或将CDKL5融合蛋白浓缩在培养基中。在一些实施例中，使用适合的方法纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白。合适的方法包括但不限于溶剂分配盐溶或盐析、基于亲和力的方法以及色谱分离方法例如疏水相互作用、离子交换、混合模式、染料结合和尺寸排阻，如在以下文献中所例证的：Kameshita等人(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications[生物化学和生物物理学研究通讯]377，1162-1167(2008))，Sekiguchi等人(Archives of Biochemistry and Biophysics[生物化学和生物物理学集刊]535，257-267(2013))和Katayama等人(Biochemistry[生物化学]，54，2975-2987(2015))，其通过引用并入本文。
考虑到分泌性产生方法的理解，转向图2，其示出了产生CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例，其中CDKL5融合蛋白未被分泌到周围的细胞培养基中。该方法开始于使含有CDKL5融合蛋白cDNA序列的适合载体转染或以其他方式递送至培养物中的一种或多种细胞(6000)。然后使用通常已知的方法培养细胞(6010)以使得转染的细胞由载体产生CDKL5融合蛋白。在适量时间之后，使用标准方法裂解细胞(7000)。在一些实施例中，在进行裂解之前，将细胞培养从12小时至96小时。
接着，确定CDKL5融合蛋白是否被整合在细胞膜或细胞质之内(7010)。如果CDKL5融合蛋白在细胞膜级分中，那么收集细胞膜级分(7020)。在收集细胞膜级分之后(7020)，使用适合的方法将CDKL5融合蛋白与膜级分分开(6040)以用于纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白。
在其中CDKL5融合蛋白存在于细胞质中的实施例中，收集含有CDKL5融合蛋白的上清液(7030)。在收集上清液之后(7030)，确定是否应当进一步纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白。如果确定应当进一步纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白，那么使用适合的方法纯化和/或浓缩CDKL5融合蛋白(6040)。适合的方法包括但不限于亲和纯化、大小排阻分离以及色谱分离方法。在其中确定不应当进一步从上清液中纯化和/或浓缩CDKL5的其他实施例中，含有CDKL5融合蛋白的上清液直接用于转导细胞(6050)。
含有TATκ-CDKL5融合蛋白的组合物和配制品
含有如在此所述的CDKL5融合蛋白的组合物和配制品也在本披露的范围之内。该组合物可以是含有可以根据在此所述的方法产生的CDKL5融合蛋白的培养基或上清液。
在此所述的CDKL5融合蛋白可以单独地或作为诸如药物配制品中的活性成分被提供给对其有需要的受试者。因此，还在此描述了含有一定量的CDKL5融合蛋白的药物配制品。在一些实施例中，这些药物配制品含有治疗有效量的CDKL5融合蛋白。在此所述的这些药物配制品可以被给予至对其有需要的受试者。对其有需要的受试者可以患有CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状。在其他实施例中，该CDKL5融合蛋白可以被使用在用于治疗或预防CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状的药剂的制造中。
药学上可接受的载体和辅助成分以及试剂
含有治疗有效量的在此所述的CDKL5融合蛋白的药物配制品可以进一步包含药学上可接受的载体。适合的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、以及聚乙烯吡咯烷酮，它们不与活性组合物发生有害反应。
可以对这些药物配制品进行灭菌并且必要时与助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与活性组合物发生有害反应。
除治疗有效量的在此所述的CDKL5融合蛋白之外，该药物配制品还可以包含有效量的辅助活性剂，包括但不限于抑制必要的肿瘤蛋白质和基因的翻译或转录的DNA、RNA、氨基酸、肽、多肽、抗体、适配子、核糖核酸酶、核糖核酸酶的指导序列、激素、免疫调节剂、解热药、抗焦虑剂、抗精神病药、镇痛药、镇痉药、抗炎药、抗组胺药、抗感染药、以及化疗药物。
适合的激素包括但不限于氨基酸衍生的激素(例如，褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白质激素(例如促甲状腺激素释放激素、抗利尿激素、类胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素以及促甲状腺激素)、类花生酸类(例如花生油酸、脂氧素和前列腺素)以及类固醇激素(例如雌二醇、睾酮、四氢睾酮皮质醇)。
适合的免疫调节剂包括但不限于泼尼松、硫唑嘌呤、6-MP、环孢霉素、他克莫司、甲氨蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子以及咪喹莫特)、趋化因子(例如CCL3、CCL26和CXCL7)、胞嘧啶磷酸盐-鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体以及适配子)。
适合的解热药包括但不限于非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、阿司匹林和相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、对乙酰氨基酚/醋氨酚、美他米佐、萘丁美酮、安替比林以及奎宁。
适合的抗焦虑剂包括但不限于苯并二氮卓(例如阿普唑仑、溴西潘、利眠宁、氯硝西泮、氯氮卓、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮、三唑仑和托非索泮)、5-羟色胺能抗抑郁药(例如选择性5-羟色胺再吸收抑制剂、三环抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)、梅比卡、afobazole、selank、布罗曼坦、3-羟基-6-甲基-2-乙基盐酸吡啶、阿扎哌隆、巴比妥酸盐、羟嗪、普瑞巴林、伐力多以及β阻断剂。
适合的抗精神病药包括但不限于苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齐特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪、dizyrazine、氟奋乃静、左美丙嗪、甲砜哒嗪、培拉嗪、哌氰嗪、奋乃静、哌泊噻嗪、丙氯拉嗪、普马嗪、异丙嗪、丙硫喷地、硫丙拉嗪、甲硫达嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨、替沃噻吨、珠氯噻醇、氯噻平、克塞平、丙硫喷地、卡匹帕明、氯卡帕明、吗啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、维拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、鲁拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奥氮平、帕潘立酮、哌罗匹隆、奎硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、曲米帕明、齐拉西酮、佐替平、alstonie、百分普那、比托派汀、依匹唑派、大麻二酚、卡利拉嗪、匹莫范色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、呫诺美林以及奇洛那平。
适合的镇痛药包括但不限于对乙酰氨基酚/醋氨酚、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)、阿片样物质(例如吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、双氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡)、曲马朵、去甲肾上腺素、flupiretine、奈福泮、奥芬那君、普瑞巴林、加巴喷丁、环苯扎林、东莨菪碱、美沙酮、凯托米酮、哌腈米特和阿司匹林以及相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)。
适合的镇痉药包括但不限于美贝维林、罂粟碱、环苯扎林、卡立普多、奥芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定以及丹曲林。
适合的抗炎药包括但不限于泼尼松、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)以及免疫选择性抗炎衍生物(例如下颌下腺肽-T及其衍生物)。
适合的抗组胺药包括但不限于H1-受体拮抗剂(例如阿伐斯汀、氮卓斯汀、比拉斯汀、溴苯那敏、布克力嗪、溴苯醇胺、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪、氯苯那敏、克立马丁、赛庚啶、地洛他定、右溴苯那敏(dexbromapheniramine)、右氯苯那敏、茶苯海明、二甲茚定、苯海拉明、抗敏安(doxylamine)、依巴斯汀(ebasine)、恩布拉敏(embramine)、非索非那定、羟嗪、左旋西替利嗪(levocetirzine)、氯雷他定(loratadine)、美克洛嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、吡拉明(pyrilamine)、喹硫平、卢帕他定、曲吡那敏(tripelennamine)和曲普利啶(triprolidine))；H2-受体拮抗剂(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁(rafitidine)和罗沙替丁(roxatidine))；曲托喹啉；儿茶素；色甘酸盐；奈多罗米以及β2-肾上腺素能激动剂。
适合的抗感染药包括但不限于抗阿米巴药(例如硝唑尼特、巴龙霉素、甲硝唑、替硝唑、氯喹、米替福新、两性霉素b和双碘喹啉)；氨基糖苷类(例如巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素和新霉素)；驱肠虫剂(例如噻嘧啶、甲苯哒唑、伊佛霉素、吡喹酮、阿苯哒唑、噻苯哒唑、奥沙尼喹)；抗真菌药(例如唑类抗真菌药(例如依曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克霉唑、咪康唑和伏立康唑)、棘白菌素类(例如卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净)、灰黄霉素、特比萘芬、氟胞嘧啶、以及多烯类(例如制真菌素和两性霉素b))；抗疟药(例如乙胺嘧啶/磺胺多辛、蒿甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍、奎宁、羟氯喹、甲氟喹、氯喹、多西环素、乙胺嘧啶和卤泛曲林)；抗痨剂(例如氨基水杨酸盐(例如氨基水杨酸)、异烟肼/利福平、异烟肼/吡嗪酰胺/利福平、贝达喹啉、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素和环丝氨酸)；抗病毒药(例如金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿巴卡韦/拉米夫定、恩曲他滨/替诺福韦、考比泰特/埃替格韦/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/罗匹那韦/利托那韦/替诺福韦、干扰素α2v/利巴韦林、聚乙二醇干扰素α-2b、马拉韦罗、雷特格韦、德罗格韦、恩夫韦地、膦甲酸、福米韦生、奥司他韦、扎那米韦、奈韦拉平、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、地拉韦啶、奈韦拉平、恩替卡韦、拉米夫定、阿德福韦、索非布韦、地达诺新、替诺福韦、avacivr、齐多夫定、司他夫定、恩曲他滨、扎西他滨、替比夫定、西米普韦、波西普韦、特拉匹韦、洛匹那韦/利托那韦、弗沙那韦、瑞纳韦、利托那韦、替拉那韦、阿扎那韦、奈非那韦、安瑞那韦、茚地那韦、沙喹那韦、利巴韦林、伐昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦和缬更昔洛韦)；碳青霉烯类(例如多利培南、美罗培南、厄他培南和西司他丁/亚胺培南)；头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢拉啶、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢西丁、头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢唑肟和头孢他啶)；糖肽抗生素(例如万古霉素、达巴万星、奥利万星和替拉万星)；甘氨环素类(例如替加环素)；抗麻风药(例如氯法齐明和萨力多胺)；洁霉素及其衍生物(例如克林霉素和洁霉素)；大环内酯类及其衍生物(例如泰利霉素、非达霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和醋竹桃霉素)；利奈唑胺；磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶；利福昔明；氯霉素；磷霉素；甲硝唑；氨曲南；杆菌肽；青霉素类(阿莫西林、氨比西林、巴氨西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林/克拉维酸、氨比西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、克拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素、苯唑西林、双氯西林和萘夫西林)；喹诺酮类(例如洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西诺沙星、萘啶酸、依诺沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星和司帕沙星)；磺酰胺类(例如磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶、柳氮磺胺吡啶和磺胺异噁唑)；四环素类(例如多西环素、地美环素、米诺环素、多西环素/水杨酸、多西环素/ω-3多不饱和脂肪酸和四环素)以及尿道抗感染药(例如呋喃咀啶、乌洛托品、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶和亚甲基蓝)。
适合的化学药物包括但不限于紫杉醇、贝伦妥单抗维多汀、多柔比星、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司、培美曲塞、美法仑、帕米膦酸钠、阿那曲唑、依西美坦、奈拉滨、奥法木单抗、贝伐单抗、贝林司他、托西莫单抗、卡莫司汀、博来霉素、博舒替尼、白消安、阿仑单抗、伊立替康、凡德他尼、比卡鲁胺、洛莫司汀、柔红霉素、氯法拉滨、卡博替尼、更生霉素、雷莫芦单抗、阿糖孢苷、癌得星、环磷酰胺、地西他滨、地塞米松、多西他赛、羟基脲、氨烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奥沙利铂、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔单抗、维莫德吉、天冬酰胺酶菊欧氏杆菌、氨磷汀、依托泊苷、氟他胺、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、甲氨蝶呤、氟尿苷、奥比妥珠单抗、吉西他滨、阿法替尼、伊马替尼甲磺酸、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠单抗、六甲蜜胺、拓扑替康、帕纳替尼、伊达比星、异环磷酰胺、依鲁替尼、阿西替尼、干扰素α-2a、吉非替尼、罗米地辛、伊沙匹隆、鲁索利替尼、卡巴他塞、阿多-曲妥珠单抗恩他新、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、米托坦、长春新碱、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司钠、锶-89氯化物、氮芥、丝裂霉素、白消安、吉妥珠单抗奥佐米星、长春瑞滨、非格司亭、乙二醇化非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素-毒素连接物、阿利维A酸、卡铂、帕妥珠单抗、顺铂、泊马度胺、强的松、阿地白介素、巯嘌呤、唑来磷酸、来那度胺、利妥昔单抗、奥曲肽、达沙替尼、瑞格非尼、组氨瑞林、舒尼替尼、司妥昔单抗、奥马他辛、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤)、达拉菲尼、埃罗替尼、蓓萨罗丁、替莫唑胺、噻替派、萨力多胺、BCG、西罗莫司、盐酸苯达莫司汀、曲普瑞林、三氧化二砷、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼单抗、长春花碱、硼替佐米、维A酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亚叶酸、克里唑蒂尼、卡培他滨、恩杂鲁胺、伊匹单抗、戈舍瑞林、伏立诺他、艾代拉利司、色瑞替尼、阿比特龙、埃博霉素、他氟泊苷、硫唑嘌呤、去氧氟尿苷、长春地辛以及全反式维甲酸。
CDKL5融合蛋白和助剂的有效量
药物配制品可以含有治疗有效量的CDKL5融合蛋白，和任选地治疗有效量的助剂。精确的剂量将依据受试者的年龄、体型、性别和病症，待治疗的障碍的性质和严重程度等而变化；因此，精确的有效量不能提前指定并且将由护理人员确定。然而，CDKL5融合蛋白的治疗有效量通常可以在从约1μg/kg至约10mg/kg的范围内。在另外的实施例中，CDKL5融合蛋白的治疗有效量可以在从约1ng/g体重至约0.1mg/g体重的范围内。CDKL5融合蛋白的治疗有效量可以在从约1pg至约10g的范围内。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白或含有此CDKL5融合蛋白的药物组合物的治疗有效量可以在约10nL至约10mL的范围内。在其他实施例中，CDKL5融合蛋白或药物组合物的治疗有效量为从约10nL至约1μL。
在一些实施例中，治疗有效量的范围也可以在从约20至约50ng/注射，例如针对脑室内注射而言。在其他实施例中，治疗有效量可以是约10微升/注射，诸如针对脑室内注射而言。在另外的实施例中，治疗有效量可以是约5ng/μL，诸如针对脑室内注射而言。在又一另外的实施例中，针对脑室内注射而言，治疗有效量可以是约1.9μg/kg体重。在其他实施例中，对于脑室内注射，治疗有效量可以为从约1至3μg/kg体重。
在其他实施例中，治疗有效量可以是从约1至约2微克/注射，诸如针对全身性给予的注射而言。在一些实施例中，治疗有效量可以是约5ng/μL，诸如针对全身性注射而言。对于一些实施例，治疗有效量可以是从约1至约1.5μg/5g体重。
在一个或多个实施例中，全身给予是静脉内给予。静脉内配制品可以通过直接静脉内注射(静脉内推注)给予，或者可以通过添加到适当的输注溶液(例如0.9％氯化钠注射液或其他相容的输注溶液)中输注来给予。最常使用的IV输注系统由填充有IV液体的袋子、滴注器、用于控制流量的辊夹(可变阻力控制器)和与IV导管连接的管组成。该系统中升高的IV袋充当压力源，辊夹充当用户控制的阻力器，并且IV导管充当固定的阻力器。
最常见的是，IV流体流动的速率由观察到液体通过滴注器滴落的速率来确定。肠胃外溶液的重力输注通过如下方式来实现：将溶液容器悬挂在患者上方几英尺，并且经由包括滴注器和柔性输送管的一次性静脉内给药装置将溶液容器连接到穿刺部位。
在其中除CDKL5融合蛋白之外药物配制品中还含有辅助活性剂的实施例中，辅助活性剂的治疗有效量将根据辅助活性剂而变化。在一些实施例中，辅助活性剂的有效量在从0.001微克至约1毫克的范围内。在其他实施例中，辅助活性剂的有效量在从约0.01IU至约10000IU的范围内。在另外的实施例中，辅助活性剂的有效量在从0.001mL至约1mL的范围内。在又其他实施例中，辅助活性剂的有效量在总药物配制品的从约1％w/w至约50％w/w的范围内。在另外的实施例中，辅助活性剂的有效量在总药物配制品的从约1％v/v至约50％v/v的范围内。在再其他实施例中，辅助活性剂的有效量在总药物配制品的从约1％w/v至约50％w/v的范围内。
剂型
在一些实施例中，在此所述的药物配制品可以呈剂型形式。剂型可以适于通过任何适当路径的给予。适当路径包括但不限于口服(包括颊内和舌下)、直肠、硬膜外、颅内、眼内、吸入、鼻内、局部(包括颊内、舌下或经皮)、阴道、尿道内、肠胃外、颅内、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、骨内、心内、关节内、海绵窦内(intracavernous)、鞘内、玻璃体内(intravireal)、脑内和脑室内以及皮内。此类配制品可以通过本领域已知的任何方法来制备。
适于口服给予的剂型可以是离散的剂量单位诸如胶囊、药丸或片剂、粉剂或颗粒、呈水性或非水性液体的溶液或悬浮液；可食的泡沫剂或气泡体(whips)，或呈水包油液体乳液或油包水液体乳液形式。在一些实施例中，适于口服给予的药物配制品还包含调味、防腐、着色或有助于分散药物配制品的一种或多种试剂。被制备用于口服给予的剂型还可以呈可以作为泡沫、喷雾或液体溶液来递送的液体溶液形式。在一些实施例中，口服剂型可以含有约1ng至1000g的药物配制品，该药物配制品含有治疗有效量或其适当部分的CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物。可以向对其有需要的受试者给予口服剂型。
在适当的情况下，在此所述的剂型可以进行微胶囊化。还可以制备剂型来延长或持续任何成分的释放。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白是释放得以延缓的成分。在其他实施例中，任选包含的辅助成分的释放被延缓。用于延缓成分的释放的适合方法包括但不限于用聚合物、蜡、凝胶等将成分包衣或包埋在材料中。缓释剂量配制品可以如标准参考文献诸如以下各项中所述来制备：“Pharmaceutical dosage form tablets[药物剂型片剂]”，Liberman等人(纽约，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)，1989)；“Remington-Thescience and practice of pharmacy[雷明顿-药物科学与实践]”，第20版，马里兰州巴尔的摩市利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins)，2000；以及“Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems[药物剂型和药物递送系统]”，第6版，Ansel等人(宾夕法尼亚州米提亚(Media,PA)：威廉姆斯和威尔金斯出版社(Williams and Wilkins)，1995)。这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂和药丸、胶囊和颗粒的缓释剂型的赋形剂、材料、设备和方法的信息。缓释可以是在从约一小时至约3小时或更长的任一时候。
适合的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素以及乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名(罗姆药厂(Rohm Pharma)，魏特尔斯塔特(Westerstadt)，德国)商购获得的甲基丙酸烯树脂、玉米素、紫胶以及多糖类。
在存在或不存在水不溶性/水溶性非聚合物赋形剂的情况下，可以用不同比率的水溶性聚合物、水不溶性聚合物和/或pH依赖性聚合物形成包衣以产生所希望的释放曲线。包衣在剂型(基质或简单的)上进行，该剂型包括但不限于片剂(用或不用包衣珠压缩)、胶囊(具有或不具有包衣珠)、珠剂、粒子组合物，被配制为但不限于悬浮液形式或配制为喷撒剂型的“原样成分”。
适于局部给予的剂型可以配制为软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂。在一些实施例中，对于眼睛或其他外部组织，例如口或皮肤的治疗，药物配制品作为局部软膏或乳膏来施用。当配制在软膏中时，CDKL5融合蛋白、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐可以与石蜡或水可混溶性软膏基质一起配制。在其他实施例中，活性成分可以与水包油乳膏基质或油包水基质一起配制在乳膏中。适于口中的局部给予的剂型包括锭剂、软锭剂以及漱口剂。
适于鼻给予或吸入给予的剂型包括气雾剂、溶液、混悬滴剂、凝胶或干燥粉末。在一些实施例中，适于吸入的剂型中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐呈减小了粒径的形式，该形式是通过微粉化获得或可获得的。在一些实施例中，大小减小(例如微粉化)的化合物或其盐或溶剂化物的粒径是由如通过本领域已知的适当方法所测量的约0.5至约10微米的D50值限定的。适于吸入给予的剂型还包括细粒粉尘或薄雾。其中载体或赋形剂是用于作为鼻喷雾剂或滴剂给予的液体的适合剂型包括活性成分的水性或油性溶液/悬浮液，其可以通过不同类型的计量加压喷雾器、雾化器或吹入器产生。
在一些实施例中，剂型是适于吸入给予的气雾剂配制品。在这些实施例中的一些中，气雾剂配制品含有CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和/或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的水性或非水性溶剂的溶液或细悬浮液。气雾剂配制品可以灭菌形式的单剂量或多剂量提供于密封容器中。对于这些实施例中的一些，密封容器是单剂量或多剂量的鼻或配备有计量阀门(例如计量吸入器)的气雾剂分配器，一旦容器中的内容物被耗尽即可将它丢弃。
在气雾剂剂型包含在气雾剂分配器中的情况下，分配器含有处于压力下的适合推进剂，诸如压缩空气、二氧化碳或有机推进剂(包括但不限于氢氟烃)。其他实施例中的气雾剂配制品剂型包含在泵雾化器中。加压的气雾剂配制品也可以含有CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物或其药物配制品的溶液或悬浮液。在另外的实施例中，气雾剂配制品还含有被掺入以改善配制品的例如稳定性和/或味觉和/或微粒子质量特征(量和/或分布图)的共溶剂和/或改性剂。气雾剂配制品的给予可以是每日一次或每日数次，例如每日2次、3次、4次或8次，其中每次递送1个、2个或3个剂量。
对于适合和/或适于吸入给予的一些剂型，药物配制品是可吸入的干燥粉末配制品。除CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐之外，此类剂型可以含有粉末基质诸如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和/或淀粉。在这些实施例的一些中，CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐是呈减小了粒径的形式。在另外的实施例中，性能改性剂是诸如L-亮氨酸或另一种氨基酸、八醋酸纤维二糖酯和/或硬脂酸的金属盐诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙。
在一些实施例中，气雾剂配制品被安排使得每次计量的气雾剂剂量含有预定量的活性成分，诸如在此所述的CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物中的一种或多种。
适于阴道给予的剂型可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾配制品提供。适于直肠给予的剂型包括栓剂或灌肠剂。
适于肠胃外给予和/或适于任何注射类型(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、皮内、骨内、硬膜外、心内、关节内、海绵窦内、鞘内、玻璃体内、脑内和脑室内)的剂型可以包括水性和/或非水性无菌注射溶液，这些溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使该组合物与受试者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，这些悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。适于肠胃外给予的剂型可以提供于单一单位剂量或多单位剂量容器中，包括但不限于密封的安瓿或小瓶。可以将这些剂量冻干并且重悬于无菌载体中以在给予之前重构剂量。在一些实施例中，可以由无菌粉剂、颗粒和片剂制备临时的注射溶液和悬浮液。
适于眼部给予的剂型可以包括水性和/或非水性无菌溶液，这些溶液可以任选地适于注射，并且这些溶液可以任选地含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使该组合物与受试者的眼部或眼部中含有的或眼部周围的流体等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，这些悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。
对于一些实施例，剂型含有预定量的CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物/单位剂量。在一个实施例中，CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物的预定量是CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物的用于治疗或预防CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状的治疗有效量。在其它实施例中，CDKL5融合蛋白或含有CDKL5融合蛋白的组合物的预定量可以是活性成分的治疗有效量的适当部分。因此，此类单位剂量可以每日给予一次或多于一次。此类药物配制品可以通过本领域熟知的任何方法来制备。
使用TATκ-CDKL5组合物和配制品来治疗神经障碍
在此所述的CDKL5融合蛋白和其药物配制品可以用于治疗和/或预防受试者的疾病、障碍、综合征或其症状。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白和其药物配制品可以用于治疗和/或预防CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状。在一些实施例中，受试者患有CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白及其药物配制品可以用于增加患有CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状的患者中视觉皮层的神经活动。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白及其药物配制品可以用于增加患有CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状的患者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白及其药物配制品可以用于减少患有CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状的患者的脑中神经元细胞凋亡。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白及其药物配制品可以用于改善患有CDKL5缺陷、Rett综合征、Rett综合征的变体和/或其症状的患者的运动功能。
一定量的在此所述的CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以每天、每周、每月或每年向对其有需要的受试者给予一次或多次。在一些实施例中，给予的量可以是CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品的治疗有效量。例如，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以日剂量来给予。此量可以单剂量/天给出。在其他实施例中，日剂量可以是经多剂量/天来给予，其中各剂量含有待给予的总日剂量的一部分(亚剂量)。在一些实施例中，每天递送的剂量的量是2个、3个、4个、5个或6个。在另外的实施例中，化合物、配制品或其盐每周给予一次或多次，诸如每周1次、2次、3次、4次、5次或6次。在其他实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以每月给予一次或多次，诸如每月1次至5次。在再另外的实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以每年给予一次或多次，诸如每年1次至11次。
CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以通过任何方便的路径与第二试剂共同给予。第二试剂是单独于CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品的化合物和/或配制品。第二试剂可以与CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品同时给予。第二试剂可以与CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品依序给予。第二试剂可以与CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品具有累加或协同效应。适合的第二试剂包括但不限于抑制必要的肿瘤蛋白质和基因的翻译和转录的DNA、RNA、氨基酸、肽、多肽、抗体、适配子、核糖核酸酶、核糖核酸酶的指导序列、激素、免疫调节剂、解热药、抗焦虑剂、抗精神病药、镇痛药、镇痉药、抗炎药、抗组胺药、抗感染药、以及化疗药物。在一些实施例中，第二试剂是DCA。
适合的激素包括但不限于氨基酸衍生的激素(例如，褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白质激素(例如促甲状腺激素释放激素、抗利尿激素、类胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素以及促甲状腺激素)、类花生酸类(例如花生油酸、脂氧素和前列腺素)以及类固醇激素(例如雌二醇、睾酮、四氢睾酮皮质醇)。
适合的免疫调节剂包括但不限于泼尼松、硫唑嘌呤、6-MP、环孢霉素、他克莫司、甲氨蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子以及咪喹莫特)、趋化因子(例如CCL3、CCL26和CXCL7)、胞嘧啶磷酸盐-鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体以及适配子)。
适合的解热药包括但不限于非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、阿司匹林和相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、对乙酰氨基酚/醋氨酚、美他米佐、萘丁美酮、安替比林以及奎宁。
适合的抗焦虑剂包括但不限于苯并二氮卓(例如阿普唑仑、溴西潘、利眠宁、氯硝西泮、氯氮卓、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮、三唑仑和托非索泮)、5-羟色胺能抗抑郁药(例如选择性5-羟色胺再吸收抑制剂、三环抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)、梅比卡、afobazole、selank、布罗曼坦、3-羟基-6-甲基-2-乙基盐酸吡啶、阿扎哌隆、巴比妥酸盐、羟嗪、普瑞巴林、伐力多以及β阻断剂。
适合的抗精神病药包括但不限于苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齐特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪、dizyrazine、氟奋乃静、左美丙嗪、甲砜哒嗪、培拉嗪、哌氰嗪、奋乃静、哌泊噻嗪、丙氯拉嗪、普马嗪、异丙嗪、丙硫喷地、硫丙拉嗪、甲硫达嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨、替沃噻吨、珠氯噻醇、氯噻平、克塞平、丙硫喷地、卡匹帕明、氯卡帕明、吗啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、维拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、鲁拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奥氮平、帕潘立酮、哌罗匹隆、奎硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、曲米帕明、齐拉西酮、佐替平、alstonie、百分普那、比托派汀、依匹唑派、大麻二酚、卡利拉嗪、匹莫范色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、呫诺美林以及奇洛那平。
适合的镇痛药包括但不限于对乙酰氨基酚/醋氨酚、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)、阿片样物质(例如吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、双氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡)、曲马朵、去甲肾上腺素、flupiretine、奈福泮、奥芬那君、普瑞巴林、加巴喷丁、环苯扎林、东莨菪碱、美沙酮、凯托米酮、哌腈米特和阿司匹林以及相关的水杨酸盐(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)。
适合的镇痉药包括但不限于美贝维林、罂粟碱、环苯扎林、卡立普多、奥芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定以及丹曲林。
适合的抗炎药包括但不限于泼尼松、非甾体类抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬以及尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来考昔和艾托考昔)以及免疫选择性抗炎衍生物(例如下颌下腺肽-T及其衍生物)。
适合的抗组胺药包括但不限于H1-受体拮抗剂(例如阿伐斯汀、氮卓斯汀、比拉斯汀、溴苯那敏、布克力嗪、溴苯醇胺、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、赛克利嗪、氯苯那敏、克立马丁、赛庚啶、地洛他定、右溴苯那敏(dexbromapheniramine)、右氯苯那敏、茶苯海明、二甲茚定、苯海拉明、抗敏安(doxylamine)、依巴斯汀(ebasine)、恩布拉敏(embramine)、非索非那定、羟嗪、左旋西替利嗪(levocetirzine)、氯雷他定(loratadine)、美克洛嗪、米氮平、奥洛他定、奥芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、异丙嗪、吡拉明(pyrilamine)、喹硫平、卢帕他定、曲吡那敏(tripelennamine)和曲普利啶(triprolidine))；H2-受体拮抗剂(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁(rafitidine)和罗沙替丁(roxatidine))；曲托喹啉；儿茶素；色甘酸盐；奈多罗米以及β2-肾上腺素能激动剂。
适合的抗感染药包括但不限于抗阿米巴药(例如硝唑尼特、巴龙霉素、甲硝唑、替硝唑、氯喹、米替福新、两性霉素b和双碘喹啉)；氨基糖苷类(例如巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素和新霉素)；驱肠虫剂(例如噻嘧啶、甲苯哒唑、伊佛霉素、吡喹酮、阿苯哒唑、噻苯哒唑、奥沙尼喹)；抗真菌药(例如唑类抗真菌药(例如依曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克霉唑、咪康唑和伏立康唑)、棘白菌素类(例如卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净)、灰黄霉素、特比萘芬、氟胞嘧啶、以及多烯类(例如制真菌素和两性霉素b))；抗疟药(例如乙胺嘧啶/磺胺多辛、蒿甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍、奎宁、羟氯喹、甲氟喹、氯喹、多西环素、乙胺嘧啶和卤泛曲林)；抗痨剂(例如氨基水杨酸盐(例如氨基水杨酸)、异烟肼/利福平、异烟肼/吡嗪酰胺/利福平、贝达喹啉、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素和环丝氨酸)；抗病毒药(例如金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿巴卡韦/拉米夫定、恩曲他滨/替诺福韦、考比泰特/埃替格韦/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/罗匹那韦/利托那韦/替诺福韦、干扰素α2v/利巴韦林、聚乙二醇干扰素α-2b、马拉韦罗、雷特格韦、德罗格韦、恩夫韦地、膦甲酸、福米韦生、奥司他韦、扎那米韦、奈韦拉平、依法韦仑、依曲韦林、利匹韦林、地拉韦啶、奈韦拉平、恩替卡韦、拉米夫定、阿德福韦、索非布韦、地达诺新、替诺福韦、avacivr、齐多夫定、司他夫定、恩曲他滨、扎西他滨、替比夫定、西米普韦、波西普韦、特拉匹韦、洛匹那韦/利托那韦、弗沙那韦、瑞纳韦、利托那韦、替拉那韦、阿扎那韦、奈非那韦、安瑞那韦、茚地那韦、沙喹那韦、利巴韦林、伐昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、更昔洛韦和缬更昔洛韦)；碳青霉烯类(例如多利培南、美罗培南、厄他培南和西司他丁/亚胺培南)；头孢菌素类(例如头孢羟氨苄、头孢拉啶、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢吡肟、头孢洛林、氯碳头孢、头孢替坦、头孢呋辛、头孢罗齐、氯碳头孢、头孢西丁、头孢克洛、头孢布烯、头孢曲松、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢地尼、头孢克肟、头孢托仑、头孢唑肟和头孢他啶)；糖肽抗生素(例如万古霉素、达巴万星、奥利万星和替拉万星)；甘氨环素类(例如替加环素)；抗麻风药(例如氯法齐明和萨力多胺)；洁霉素及其衍生物(例如克林霉素和洁霉素)；大环内酯类及其衍生物(例如泰利霉素、非达霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和醋竹桃霉素)；利奈唑胺；磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶；利福昔明；氯霉素；磷霉素；甲硝唑；氨曲南；杆菌肽；青霉素类(阿莫西林、氨比西林、巴氨西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林、阿莫西林/克拉维酸、氨比西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、克拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素、苯唑西林、双氯西林和萘夫西林)；喹诺酮类(例如洛美沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西诺沙星、萘啶酸、依诺沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星和司帕沙星)；磺酰胺类(例如磺胺甲噁唑/甲氧苄氨嘧啶、柳氮磺胺吡啶和磺胺异噁唑)；四环素类(例如多西环素、地美环素、米诺环素、多西环素/水杨酸、多西环素/ω-3多不饱和脂肪酸和四环素)以及尿道抗感染药(例如呋喃咀啶、乌洛托品、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶和亚甲基蓝)。
适合的化学药物包括但不限于紫杉醇、贝伦妥单抗维多汀、多柔比星、5-FU(氟尿嘧啶)、依维莫司、培美曲塞、美法仑、帕米膦酸钠、阿那曲唑、依西美坦、奈拉滨、奥法木单抗、贝伐单抗、贝林司他、托西莫单抗、卡莫司汀、博来霉素、博舒替尼、白消安、阿仑单抗、伊立替康、凡德他尼、比卡鲁胺、洛莫司汀、柔红霉素、氯法拉滨、卡博替尼、更生霉素、雷莫芦单抗、阿糖孢苷、癌得星、环磷酰胺、地西他滨、地塞米松、多西他赛、羟基脲、氨烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奥沙利铂、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔单抗、维莫德吉、天冬酰胺酶菊欧氏杆菌、氨磷汀、依托泊苷、氟他胺、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、甲氨蝶呤、氟尿苷、奥比妥珠单抗、吉西他滨、阿法替尼、伊马替尼甲磺酸、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠单抗、六甲蜜胺、拓扑替康、帕纳替尼、伊达比星、异环磷酰胺、依鲁替尼、阿西替尼、干扰素α-2a、吉非替尼、罗米地辛、伊沙匹隆、鲁索利替尼、卡巴他塞、阿多-曲妥珠单抗恩他新、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、米托坦、长春新碱、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司钠、锶-89氯化物、氮芥、丝裂霉素、白消安、吉妥珠单抗奥佐米星、长春瑞滨、非格司亭、乙二醇化非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培门冬酶、地尼白介素-毒素连接物、阿利维A酸、卡铂、帕妥珠单抗、顺铂、泊马度胺、强的松、阿地白介素、巯嘌呤、唑来磷酸、来那度胺、利妥昔单抗、奥曲肽、达沙替尼、瑞格非尼、组氨瑞林、舒尼替尼、司妥昔单抗、奥马他辛、硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤)、达拉菲尼、埃罗替尼、蓓萨罗丁、替莫唑胺、噻替派、萨力多胺、BCG、西罗莫司、盐酸苯达莫司汀、曲普瑞林、三氧化二砷、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼单抗、长春花碱、硼替佐米、维A酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亚叶酸、克里唑蒂尼、卡培他滨、恩杂鲁胺、伊匹单抗、戈舍瑞林、伏立诺他、艾代拉利司、色瑞替尼、阿比特龙、埃博霉素、他氟泊苷、硫唑嘌呤、去氧氟尿苷、长春地辛以及全反式维甲酸。
在其中CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品与第二试剂同时地共同给予的实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品可以在与第二试剂基本上相同的时间下向受试者给予。如在此背景下所用，“基本上相同的时间”是指CDKL5融合蛋白、组合物及其药物配制品与第二试剂的给予，其中CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂的给予之间的时间段处于0与10分钟之间。
在其中CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂依序地共同给予的实施例中，可以首先给予CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品，并且然后在一段时间之后给予第二试剂。在其中CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂依序地共同给予的其他实施例中，可以首先给予第二试剂，并且然后在一段时间之后给予CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品。在任何实施例中，CDKL5融合蛋白、组合物或其药物配制品与第二试剂的给予之间的时间段可以在从10分钟至约96小时之间。在一些实施例中，时间段可以是约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时或约12小时。可以根据需要在治疗周期过程内重复依序给予。
可被给予的CDKL5融合蛋白、组合物、其药物配制品的量在此其他地方进行描述。第二试剂的量将根据第二试剂变化。第二试剂的量可以是治疗有效量。在一些实施例中，第二试剂的有效量在从0.001微克至约1毫克的范围内。在其他实施例中，第二试剂的量在从约0.01IU至约10000IU的范围内。在另外的实施例中，第二试剂的量在从0.001mL至约1mL的范围内。在又其他实施例中，第二试剂的量在总药物配制品的从约1％w/w至约50％w/w的范围内。在另外的实施例中，第二试剂的量在总药物配制品的从约1％v/v至约50％v/v的范围内。在再其他实施例中，第二试剂的量在总的第二试剂组合物或药物配制品的从约1％w/v至约50％w/v的范围内。
在一些实施例中，含有CDKL5融合蛋白的组合物或配制品经由注射给予至患者。适合的注射方法包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、皮内、骨内、硬膜外、心内、关节内、海绵窦内、鞘内、玻璃体内、脑内和脑室内注射。含有CDKL5融合蛋白的组合物或配制品的其他适合的给予方法包括但不限于局部、经皮、经鼻或经口递送。在一些实施例中，CDKL5融合蛋白的剂量在从约0.01μg/g体重至约10mg/g体重的范围内。
在其他实施例中，CDKL5融合蛋白可以经由细胞疗法递送至需要治疗的患者。出于这种考虑，将注意力转向图3，该图3示出了经由自体细胞递送CDKL5融合蛋白的方法的一个实施例。该方法通过体外培养细胞(8000)开始。优选地，细胞是自体细胞。在一个实施例中，自体细胞是神经元或神经元前体细胞，诸如神经干细胞。在一些实施例中，自体细胞是来源于诱导性多能干细胞的神经元。在其他实施例中，自体细胞是来源于脐带血干细胞的神经元。
接着，用纯化的CDKL5融合蛋白转导培养细胞(8010)。在其他实施例中，通过将培养细胞暴露于如先前所述的含有CDKL5融合蛋白的培养基来转导培养细胞。在另外的实施例中，用含有CDKL5融合蛋白cDNA的适合载体转染培养细胞。然后将细胞培养适量时间以使得CDKL5融合蛋白表达(8020)。在一些实施例中，将细胞培养约6小时至约96小时。细胞培养之后，将一种或多种转导细胞给予至患者。
在一个实施例中，使用外科技术将转导的自体神经元递送至脑。在一些实施例中，经由注射将一种或多种转导细胞给予至患者。在一些实施例中，配制品中包含一种或多种转导细胞。在一个实施例中，含有一种或多种转导细胞的配制品还包含药学上可接受的载体和/或活性剂。在一些实施例中，经由注射或使用外科技术将含有一种或多种转导细胞的配制品给予至患者。
含有CDKL5融合蛋白和其配制品的试剂盒
在此所述的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品可以作为组合试剂盒提供。如在此所用，术语“组合试剂盒”或“成套试剂盒”是指在此所述的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品以及用于包装、出售、市售、递送和/或给予包含于其中的元件组合或单一元件诸如活性成分的另外组件。此类另外的组件包括但不限于包装、注射器、泡包装、瓶子等。当同时给予包含在试剂盒中的一种或多种组分(例如活性剂)时，组合试剂盒可以含有在单一药物配制品(例如，片剂)中或在分开的药物配制品中的活性剂。
组合试剂盒可以含有在分开组合物或药物配制品中的各试剂、组合物、药物配制品或其组分。分开的组合物或药物配制品可以包含在试剂盒内的单一包装中或分开的包装中。在一些实施例中还提供了缓冲剂、稀释剂、增溶试剂、细胞培养基以及其他试剂。这些另外的组分可以包含在试剂盒内的单一包装中或分开的包装中。
在一些实施例中，组合试剂盒还包括印刷在有形表达介质上或以其他方式包含在该有形表达介质中的说明书。说明书可以提供关于包含于其中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的含量的信息、关于包含于其中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的含量的安全信息、关于包含于其中的CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的剂量、使用适应症和/或一个或多个推荐的治疗方案的信息。在一些实施例中，说明书可以提供用于向患有CDKL5缺陷、Rett综合征和/或其症状的受试者给予CDKL5融合蛋白、含有CDKL5融合蛋白的组合物和其药物配制品，和/或其他助剂和/或第二试剂的说明。
无需进一步解释，据信本领域中技术人员可以基于在此的说明最大程度地利用本披露。强调的是，本披露的实施例，尤其是任何“优选”实施例仅仅是实施的可能性实例，仅仅是为了清楚地理解本披露的原理而阐述的。在实质上不背离本披露的精神和原理的情况下可以对本披露的一个或多个所披露实施例进行许多变化和修改。所有此类修改和变化都在本披露的范围之内。
在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合在此，就好像每个单独的公开物或专利被确切地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不应理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独地确认。
如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，在此描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
除非另外指明，否则本披露的实施例将采用分子生物学、微生物学、纳米技术学、有机化学、生物化学、植物学等的技术，这些技术是在本领域的技术之内。此类技术在文献中得到充分解释。
实例
提出以下实例来为本领域的普通技术人员提供如何执行方法和使用在此披露且要求保护的组合物和化合物的完整的披露内容和说明。以下实例仅被视为说明性的而不以任何方式来限定本披露的其余部分。已经做出努力来确保关于数字(例如量、温度等)的精确性，但一些误差和偏差也应当考虑。除非另外指明，否则份数是重量份，温度是以℃计并且压力是在大气压下或接近大气压。标准温度和压力被定义为20℃和1个大气压。
实例1：TATκ-CDKL5115和TATκ-CDKL5107融合蛋白的生产和纯化。
为了产生可递送的TAT-CDKL5融合蛋白，使用了合成的TATκ-PTD，其中TAT结构域中的弗林蛋白酶识别序列的突变实现了重组蛋白的分泌。观察到分泌的蛋白成功被靶细胞摄取。将含有人类CDKL5115或CDKL5107的TATκ-CDKL5115或TATκ-CDKL5107融合基因克隆到表达质粒pSecTag2(生命技术公司(Life Technologies))中。此质粒被设计成能够实现基因在哺乳动物宿主中的表达和靶蛋白的高表达水平。将表达自pSecTag2的蛋白质在N-末端处融合至鼠类Igκ链前导序列上，以用于培养基中的蛋白质分泌。用eGFP蛋白标记TATκ-CDKL5融合蛋白以允许使用抗-GFP抗体进行蛋白质印迹分析。为了促进蛋白质纯化，将TATκ-CDKL5融合蛋白配置为在TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107基因的C-末端区域包括myc-标签、6xHis标签和/或FLAG标签。使用标准质粒递送方法，用TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107表达质粒转染HEK 293T细胞。在转染之后，使细胞在无血清培养基(高葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))中生长。48小时之后，收集培养基，使用Amicon超离心过滤器(50kDa截留)对该培养基进行渗滤和浓缩。此方法允许缓冲液交换和分泌蛋白的富集。
图4A和图4B展示了来自转染的HEK 293T细胞中的TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白表达的蛋白质印迹分析结果。图4A展示了来自转染的HEK 293T细胞的细胞匀浆中的TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白表达。图4B展示了来自转染的HEK 293T细胞的浓缩的(20X)细胞培养基中的TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白累积。尽管在图4A-4B中未示出，用TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白获得了相似的结果。
实例2：TATκ-CDKL5115激酶活性的验证。
为了纯化TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白，在TATκ-eGFP-CDKL5115基因的C-末端区域添加了myc-标签和6xHis标签。在Ni-NTA树脂上从培养基中纯化TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白。已显示，CDKL5激酶具有高的自身磷酸化活性。如图5A和图5B(其示出了来自体外激酶活性测定的结果)中所示，纯化的TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白保留了其自身磷酸化活性。这证明了纯化的融合蛋白保留了其激酶活性。
实例3：HEK 293T细胞对TATκ-CDKL5115的内化。
为了评价TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白的转导效率，将HEK 293T细胞与纯化/浓缩的融合蛋白一起孵育。简言之，如实例1中所述来产生并纯化TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白。将HEK 293T细胞在含有融合蛋白的浓缩培养基中孵育。在不同的孵育时间之后，将细胞裂解并且将总的蛋白质提取物通过SDS-PAGE分离并转移至硝化纤维膜以用于免疫印迹，从而对TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白进行定量。如图6中所示，在仅孵育约30分钟之后，TATκ-eGFP-CDKL5115被细胞内化。平行处理了其他培养物并且进行固定、用抗-GFP特异性抗体进行免疫染色以可视化转导的TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白。如图7A-7B中所展示的，TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白被有效地易位到细胞中。靶细胞中的内化通过共聚焦显微镜(图8)来证实。将SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞在含有融合蛋白的浓缩培养基中孵育30分钟。图8示出了TATκ-eGFP-CDKL5115转导的SH-SY5Y细胞的一系列共聚焦图像(1-12)的图像，从而证明了TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白被靶细胞内化并且位于SH-SY5Y细胞的细胞核和细胞质两者中(图8)。
实例4：TATκ-CDKL5115诱导分化并且抑制SHSY5Y神经母细胞瘤细胞系的增殖
尽管CDKL5对于中枢神经系统具有明显的重要性，但是此激酶的生物学功能大部分仍是未知的。CDKL5蛋白质影响了神经细胞的增殖和分化两者(参见例如Valli等人，2012，Biochim Biophys Acta.[生物化学与生物物理学学报]，1819:1173-1185，以及Rizzi等人，2011，Brain Res.[脑研究]，1415:23-33)。神经母细胞瘤细胞与正常神经元享有若干个特征，并且因此被认为是用于研究神经元细胞的生物化学特性和功能特性的良好体外模型，特别是当它们在用试剂诸如视黄酸(RA)处理后而被诱导分化时(参见例如，Singh，2007，Brain Res.[脑研究]，1154，第8-21页；Melino，1997，J.Neurooncol.[神经肿瘤杂志]，31，第65-83页)。出于这些原因，采用神经母细胞瘤细胞来体外研究CDKL5功能。
与实例3中所述的处理类似，用纯化的TATκ-eGFP-CDKL5处理SH-SY5Y细胞。在此，将SH-SY5Y细胞与含有纯化的TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白的浓缩培养基一起孵育约24小时。使用Hoecsht核染色将细胞增殖评价为有丝分裂指数(细胞中发生有丝分裂的群体的数目与细胞的总数目之间的比率)。通过检查神经突生长(其是神经元分化的标志)来评价分化。对于神经突生长的分析，在存在或不存在促分化剂RA的情况下使细胞另外生长1-2天。使用图像分析系统测量神经突增生。
与对照相比，CDKL5表达的诱导(通过TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白)对细胞增殖产生强的抑制(例如图9A-9B和图10)，同时不增加凋亡性细胞死亡(数据未示出)。此外，如图11A-11B和图12中所示，TATκ-eGFP-CDKL5115促进了神经母细胞瘤细胞分化，如通过SH-SY5Y细胞的神经突增生所指明的。这些结果证明TATκ-eGFP-CDKL5115在体外神经元模型中是具有功能性的。
实例5：CDKL5-KO小鼠模型的表征
最近在意大利蒙特罗顿多(Monterotondo，Italy)由Cornelius Gross博士领导的组通过EMBL创建了CDKL5敲除小鼠模型(Amendola，2014，PLoS One[公共科学图书馆杂志]，9(5):e91613)。为了建立CDKL5-缺失功能对新生神经元的树突发育的影响，检查了来源于CDKL5KO小鼠的新生海马颗粒细胞的树突形态。用双皮层蛋白(DCX)的免疫组织化学分析新生神经元的树突形态，利用了在神经突延长阶段过程中此蛋白质在成熟神经元的细胞质中的表达。如图13A-13B中所示，与CDKL5野生型(+/Y)对应物(图13A)相比，CDKL5KO小鼠(-/Y)的DCX阳性细胞表现出具有高度不成熟型式的树突树(图13B)。高度不成熟型式可以由很少的分支和延长表明。CDKL5的不存在使得DCX阳性细胞数目减少(图13B)，这是由于凋亡性细胞死亡增加(数据未示出)，观察到该增加影响了有丝分裂期后的不成熟的颗粒神经元(DCX阳性细胞)(Fuchs，2014，Neurobiol Dis.[疾病神经生物学]，70，第53-68页)。这些数据表明CDKL5通过影响神经前体存活和新生神经元的成熟而对出生后神经发生具有基础性作用。观察到来自CDKL5敲除小鼠的室下区(subventricolar zone，SVZ)的神经元前体细胞(NPC)的培养物表现出体内观察到的小脑颗粒细胞前体中的相同缺陷。换句话说，在来源于雌性野生型小鼠(+/+)的神经元前体细胞的培养物中，存在比来源于纯合子的CDKL5KO雌性小鼠(-/-)的神经元前体细胞的培养物中更多的神经元(β-微管蛋白III阳性细胞，红色细胞)(图14A和图14B)。这表明CDKL5的缺失降低了有丝分裂期后的神经元的存活率。对β-微管蛋白III阳性细胞中神经突增生的评估证明与雌性野生型(+/+)神经元相比，由Cdkl5敲除NPC产生的神经元分化较少(图14A和图14B)。这些结果表明来自CDKL5敲除小鼠的有丝分裂期后的NPC不仅在细胞存活方面而且在神经元成熟方面都具有本征缺陷。
实例6：TATκ-CDKL5115蛋白恢复来源于CDKL5KO小鼠的神经元细胞前体的神经突发育。
用TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP处理来自雌性纯合子的CDKL5KO(-/-)小鼠和野生型(+/+)小鼠的神经元前体细胞培养物。通过测量分化的神经元(对β-微管蛋白III呈阳性)的总神经突长度来评价。通过使用图像分析系统Image Pro Plus(媒体控制公司(Media Cybernetics)，银泉(Silver Spring)，马里兰州20910，美国)进行了神经突长度的评价。通过用总神经突长度除以区中所计数的细胞数目来计算平均神经突长度/细胞。如图15A-15C和图16中所示，CDKL5的不存在使得新神经元的成熟减少并且用TATκ-eGFP-CDKL5115的处理恢复了神经突发育。对于图15A-16，从新生(2日龄)小鼠的室下区(SVZ)分离细胞。对于分化分析，将体外三次传代后获得的神经球解离，并以20,000个细胞/孔的密度将其涂板在涂有15μg/ml聚-1-鸟氨酸(西格玛公司(Sigma))的盖波片上。使细胞生长2天，然后从第3天转移到分化培养基(无EGF和FGF，加1％胎牛血清)上持续7天。在缓冲液与DMEM-F12交换后，每天以最终10x浓度给予TATκ-CDKL5115融合蛋白，避免培养基完全变化。每3天，将一半的培养基用新鲜的分化培养基补充。
实例7：TATκ-CDKL5115向小鼠脑中的递送。
用单剂量的使用TATκ-eGFP-CDKL5115、TATκ-eGFP转染的HEK 293T细胞的培养基或来自未转染的细胞(媒介物)的培养基皮下注射七日龄小鼠幼崽(单剂量对应于约200μl的200x浓缩培养基；其含有约1μg-1.5μg的融合蛋白)。在48小时之后收集来自转染的培养基并且用Amicon超离心过滤器(50kDa截留)对该培养基进行渗滤和浓缩。给予处理后4小时，将小鼠处死。将脑储存在固定剂中24小时，沿着中线切割并且在于磷酸盐缓冲液中的20％的蔗糖中再保存24小时。将半球冷冻并且储存在-80℃下。用冷冻切片机将右半球切割为30μm厚的冠状切片。在自由漂浮的切片上进行免疫组织化学。通过使用抗-GFP抗体和TSA扩增试剂盒的免疫组织化学来评价脑中的TATκ-eGFP-CDKL5115和TATκ-eGFP的定位。图像在感觉运动皮层和小脑的水平处获取。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染细胞。展示出TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白在小鼠的感觉运动皮层和小脑中的存在的代表性图像分别显示在图17A-17F和图18A-18D中。考虑到TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白是皮下给予的，这些数据证明TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白有效地转运跨过血脑屏障并且进入脑细胞中。
实例8：在体内TATκ-CDKL5115融合蛋白对神经元成熟、存活和连通性的影响
使用TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP，将成年小鼠(4-6月龄)脑室内注射(图19)连续5天(参见例如图20的实验计划表)。简言之，用氯胺酮(100mg/kg-125mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg-12.5mg/kg)麻醉小鼠。将插管(0.31mm直径，脑灌注试剂盒III；Alzet，库栢蒂诺(Cupertino)，加利福尼亚州(CA))立体定位地植入到侧脑室中(A/P-0.4mm尾部，M/L1.0mm，D/V-2.0mm；图19)。植入后七天，通过使用连接至机动化的纳米注射器(以0.5μl/min的速率)的汉密尔顿氏注射器用10μl(约50ng)的于PBS中的TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP对小鼠连续5天进行灌注。最后注射后四小时，将动物处死，并且使用DCX的免疫组织化学分析新生海马颗粒细胞的树突形态。图21A-21C和图22A-22C证明与野生型对应物的DCX阳性神经元相比，雄性CDKL5KO小鼠的DCX阳性神经元具有更短的突起(process)(图21A-21B和图22A-22B)。观察到连续五天脑室内给予TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白将CDKL5敲除雄性小鼠(图22C)中的神经突长度和分支数目增加到类似于野生型(图22A)的水平。图23A-23B示出了以下各项的新生颗粒细胞的重构树突树的实例：野生型(+/Y)(图23A)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图23B)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白处理的CDKL5敲除雄性小鼠。
DCX阳性细胞的树突大小的定量证明与野生型雄性小鼠(图24A和图24B)相比，CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)具有更短的树突长度(图24A)和减少的区段数目(图24B)。在TATκ-eGFP-CDKL5115处理的CDKL5敲除雄性小鼠中，两个参数都存在增加，与野生型雄性小鼠相比甚至变得更大(图24A-24B)。通过分别评价每个树突级来检查TATκ-eGFP-CDKL5115处理对树突构造的细节的影响。CDKL5KO小鼠的显著特征是不存在更高级的分支(图25A-25B；红色箭头)。虽然野生型雄性小鼠具有高达10级的分支，但是CDKL5敲除雄性小鼠缺乏8-10级的分支(图25A，箭头)。此外，CDKL5敲除雄性小鼠显示出减小的5-8级的分支长度(图25A)和减小的6-8级的分支数目(图25B)。一起考虑，这些数据表明在CDKL5KO雄性小鼠中，新生颗粒细胞的树突树具有发育障碍并且此缺陷是归因于中级分支数目和长度的减小以及更高级分支的缺乏。观察到所有这些缺陷被TATκ-eGFP-CDKL5115处理完全挽救(图25A至25B)。
为了评价TATκ-eGFP-CDKL5115处理对凋亡性细胞死亡的影响，我们计数了海马齿状回中的表达裂解的半胱天冬酶-3的凋亡细胞的数目(图26)。裂解的半胱天冬酶-3细胞的定量显示TATκ-eGFP-CDKL5115处理完全使CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)中的凋亡性细胞死亡正常化(图26)。观察到CDKL5敲除雄性小鼠在海马齿状回中具有比野生型雄性小鼠更少的有丝分裂期后的神经元(DCX阳性细胞)(图27)。TATκ-eGFP-CDKL5115处理的CDKL5敲除小鼠经历有丝分裂期后的神经元数目的增加，从而变得类似于野生型雄性小鼠的有丝分裂期后的神经元数目(图27)。这表明特征化CDKL5敲除小鼠的有丝分裂期后的不成熟颗粒细胞的死亡增加被TATκ-eGFP-CDKL5115处理挽救。一起考虑，这些数据证明CDKL5敲除小鼠中的用TATκ-eGFP-CDKL5115进行的处理增加了海马体中新生细胞的神经突长度和存活率，这表明注射的TATκ-CDKL5从侧脑室扩散到海马体并且恢复了有丝分裂期后的颗粒细胞的成熟和存活。
不受任何一个理论束缚，连通性的降低可能是与特征化CDKL5KO小鼠的新生颗粒细胞的树突发育障碍相对应的。突触泡蛋白(SYN；也称为p38)是为突触前末梢的特异性标记的突触泡糖蛋白。在此，在CDKL5敲除雄性小鼠中观察到海马体分子层中的SYN的光密度比野生型雄性小鼠中的明显更低(图28和图30A)，这表明CDKL5KO雄性小鼠的齿状回中具有较少的突触连接。图28A-28C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层的、处理用于突触泡蛋白(SYN)免疫荧光的脑切片的代表性图像：野生型雄性小鼠(+/Y)(图28A)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图28B)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)(图28C)。将来自动物的DG的30-μm厚的冠状切片的六分之一进行处理以用于免疫组织化学。在冷冻脑的自由漂浮切片上进行免疫组织化学。对于突触泡蛋白免疫组织化学，在4℃下将切片与小鼠单克隆抗-SYN(SY38)抗体(1:1000，MAB 5258，密理博生物科学(Millipore Bioscience)研究试剂)一起孵育48小时并且与Cy3轭合的抗-小鼠IgG第二抗体(1:200；杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)一起孵育2小时。通过免疫组织化学染色的切片的光密度测定法来确定免疫反应性(IR)的强度。使用配备有尼康(Nikon)数码照相机DXM1200(ATI系统公司(ATI system))的尼康Eclipse E600显微镜捕获荧光图像。使用Nis-元素软件3.21.03(尼康)进行分子层和皮层的光密度分析。对于每个图像，通过分析图像区域中不含有IR的像素强度的分布来估计强度阈值。然后减去此值以计算每个取样区域的IR。此值以对照CDKL5野生型雄性小鼠的光密度的百分比给出(平均值+标准误差)。
与野生型对应物相比，CDKL5KO小鼠的皮层锥形神经元的树突分枝明显减少(Amendola，2014，PLoS One[公共科学图书馆杂志]，9(5):e91613)。在新皮层的III层中观察到类似较低的SYN免疫反应性水平(图30B)。在用TATκ-eGFP-CDKL5115处理的CDKL5KO雄性小鼠中，这些缺陷被完全挽救(图28和图30A和图30B)，这表明使用TATκ-eGFP-CDKL5115的处理对树突结构的正面影响与对神经元的输入的恢复是并行发生的。
实例9：在体内TATκ-CDKL5115融合蛋白对P-AKT的影响
AKT是与多个细胞途径相关联的中枢信号传导激酶。磷酸化AKT(P-AKT)在CDKL5敲除动物、CDKL5缺陷和Rett综合征中明显减少。图29A-29C示出了展示出来自以下各项的齿状回(DG)分子层的、处理用于P-AKT免疫荧光的脑切片的代表性图像：野生型雄性小鼠(+/Y)(图29A)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)(图29B)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白经由每天一次、连续5天给予的脑室内注射处理的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)(图29C)。对于磷酸-AKT免疫组织化学，在4℃下将切片与小鼠单克隆抗-磷酸-AKT-Ser473抗体(1:1000，细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))一起孵育24小时并且与Cy3轭合的抗-小鼠IgG第二抗体(1:200；杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)一起孵育2小时。通过免疫组织化学染色的切片的光密度测定法来确定免疫反应性(IR)的强度。使用配备有尼康(Nikon)数码照相机DXM1200(ATI系统公司(ATI system))的尼康Eclipse E600显微镜捕获荧光图像。
观察到，在CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)中DG分子层中(图31A)和皮层的V层(图31B)中的P-AKT的光密度比+/Y小鼠中的明显更低。在用TATκ-eGFP-CDKL5115连续五天脑室内注射的CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)中，这些缺陷被完全挽救(图31A和图31B)，证明CDKL5敲除小鼠中用TATκ-eGFP-CDKL5115处理恢复了AKT活性。
实例10：在体内TATκ-CDKL5115融合蛋白对成熟神经元的树突构造的影响
分析了处理对成熟神经元树突构造的影响。为此，检查位于颗粒细胞层的中间部分的高尔基体染色的颗粒神经元。虽然与野生型雄性小鼠相比，CDKL5KO雄性小鼠显示出较短的树突分支长度，但是通过用TATκ-eGFP-CDKL5115处理完全挽救了这些缺陷(图32)。在处理的(-/Y)和(+/Y)小鼠两者中，与未处理的(+/Y)小鼠相比，总树突长度变得更大。这些结果表明，通过用TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白处理，恢复了在CDKL5KO雄性小鼠中观察到的成熟颗粒神经元的受损树突构造。
在高尔基体染色的切片中，对颗粒细胞的棘进行计数，并在分子层的内部一半和外部一半的树突段上测量棘密度。未处理的CDKL5 KO成年雄性小鼠与野生型小鼠相比显示出较低的棘密度，而用TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白处理完全恢复密度，消除了在敲除与野生型情况之间的差异。代表性图像显示在图33中，并且可以在图34右边的直方图中观察到相对量化。
一起考虑，这些数据表明，使用TATκ-eGFP-CDKL5115处理通过恢复突触泡蛋白表达和通过校正树突棘数目和成熟来完全恢复CDKL5KO雄性小鼠中的连通性。
实例11：TATκ-CDKL5115融合蛋白对学习能力和记忆能力的影响
与野生型小鼠相比，雄性CDKL5敲除小鼠表现出学习缺失和记忆缺失(参见例如图36和图37A-37B)。
为了检查记忆能力和学习能力，将CDKL5敲除雄性小鼠每日给予脑室内注射TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白，持续10天(参见例如图35的实验计划表)。在10天注射完结的两天休息期之后，所有组中的小鼠接受莫里斯水迷宫(MWM)测试(图36)。MWM测定发现和回忆浸入水中隐藏平台的位置的能力。在MWM任务中，训练小鼠寻找圆形水池中的隐藏逃跑平台。该装置由具有透明圆形逃跑平台(10cm2)的大型圆形水箱(1.00m直径，50cm高度)组成。将水池基本上分为四个均等象限，将这些象限鉴别为东北、西北、东南和西南。用22℃温度下的自来水填充水箱直至高于平台顶部0.5cm，并且使用乳使水变得不透明。将平台以固定位置(在西北象限的中间)置于水箱中。将水池置于大房间中，该房间具有许多内部的(四方形、三角形、圆形和星形)和外部的迷宫视觉提示。训练之后，对每个小鼠测试两个阶段，每个阶段每天4次，连续进行5天，其中阶段间的间隔为40分钟(采集阶段)。将录像照相机置于水池中央上方并且连接至视频跟踪系统(Ethovision 3.1；诺达思信息技术公司(NoldusInformation Technology B.V.)，瓦赫宁恩(Wageningen)，荷兰)。从以下出发点开始、面向水池壁释放小鼠：北、东、南或西并且允许小鼠寻找平台高达60秒。如果小鼠找不到平台，则将它渐渐地引导至平台并且使它在那儿逗留15秒。将查找隐藏平台的潜伏时间作为学习的量度。所有实验阶段在上午9:00与下午3:00之间进行。
这个测试的结果展示在图36中。图36示出了展示出以下各项中的如经由莫里斯水迷宫测试(Morris Water Maze test)确定的学习期的定量的图：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)和用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。野生型小鼠到第二天学会了查找平台，但是在CDKL5KO小鼠中没有检测出明显的学习。用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白处理的CDKL5KO雄性小鼠在第四天开始恢复学习能力，并且在第5天连续改善。
使用被动回避测试进一步检查响应于TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白处理的记忆能力和学习能力。在连续10天的治疗和两天的休息时间之后，不同组的小鼠接受了被动回避测试(图37)。该实验利用了具有两个腔室(光明和黑暗)的测试笼子。在第一天(条件作用期)，动物被置于光明腔室中并且本能地移动到黑暗腔室中，在该黑暗腔室中，它们遭受单一的不良事件(足部电击)。对于被动回避测试，我们使用了被滑动门分成两个区室的倾斜底板箱(47×18×26cm)和结合减震器(乌戈巴斯勒公司(Ugo Basile)，意大利(Italy))的控制单元。用于巴甫洛夫条件作用的此经典仪器利用了小鼠从照明区域逃跑到黑暗区域的倾向(避暗实验方法)。在第一天，将小鼠分别放置到照明区室中。在60秒适应期之后，打开腔室之间的连接门。一般来说，小鼠快速地步过门并且进入黑暗区室，因为小鼠更喜欢在黑暗中。在进入黑暗区室之后，小鼠接受短暂的足部电击(0.7mA，持续3秒)并且在15秒的潜伏时间之后将其从腔室中移出。如果小鼠在光明区室中逗留试验的持续时间(358s)，则关闭门并且将小鼠从光明区室中移出。在各个小鼠的测试之间，用70％乙醇清洁腔室。在24小时的保留期之后，将小鼠放回到光明区室中并且所测得的它们重新进入黑暗区室所花费的时间(潜伏时间)高达358秒。
图37A-37B展示了来自被动回避测试的结果。图37A表明对于所有组，进入黑暗腔室的潜伏时间是类似的。在第二天(测试期)(图37B)，将动物再次置于光明腔室。通过进入黑暗腔室的潜伏时间来测定对不良事件的记忆。CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)在完成此任务方面严重受损，如通过与GDKL5雄性野生型小鼠(+/Y)相比进入黑暗区室的潜伏期减少所证明的。与野生型小鼠相比，TATκ-eGFP-CDKL5115处理的CDKL5敲除雄性小鼠表现出类似的潜伏时间。
总之，数据证明TATκ-eGFP-CDKL5115可以使CDKL5敲除雄性小鼠的学习能力和记忆能力增加且恢复至与它们相对应的未处理的野生型小鼠中观察的类似水平。实例12：TATκ-CDKL5115融合蛋白对运动功能的影响
CDKL5敲除雄性小鼠在被悬挂时表现出延长的肢抱拢(参见例如图38A-38B)。
为了检查TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白对运动功能的影响，向小鼠每日给予TATκ-eGFP-CDKL5115的脑室内注射，连续进行10天(图38)。完成给药方案后10天，抓住尾巴，将动物悬挂在空中(图38A和图38B)。将所有小鼠悬挂约2分钟并且测量肢抱拢的总时间。将来自此实验的结果展示在图38A-38B中。
图38A-38B示出了展示出如通过抱拢测试确定的运动能力的定量的图，其中测量了在2分钟间隔期间中以下各项的肢抱拢所用的时间总量：野生型雄性小鼠(+/Y)、CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)和根据图35中的注射时间表用TATκ-eGFP-CDKL5115融合蛋白处理的CDKL5KO雄性小鼠(-/Y+TATκ-eGFP-CDKL5)。总之，数据证明用TATκ-eGFP-CDKL5115的处理改善了CDKL5KO雄性小鼠的运动功能。
测量了野生型(+/Y)雄性小鼠和用TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白注射5(+/Y)或10(-/Y)天的CDKL5KO(-/Y)雄性小鼠的体重并且将结果展示在图39中。在注射期过程中没有观察到体重的明显变化，这表明不存在由TATκ-eGFP-CDKL5115蛋白给予导致的任何副作用。
图40A-40F中显示了在未经处理的动物和用TATκ-eGFP-CDKL5115通过脑室内注射处理5天或10天的动物中同种异体移植炎症因子1(AIF-1)染色的比较。数据显示，处理不会引起小胶质细胞的激活，这表明对延长的TATκ-eGFP-CDKL5115处理没有炎症性反应。
实例13：TATκ-CDKL5同种型的表达与活性比较。
已经描述了CDKL5基因的可变剪接同种型(Kilstrup-Nielsen，2012)。原始CDKL5转录物产生1030个氨基酸的蛋白质(CDKL5115；115kDa)。虽然CDKL5115是第一个表征的CDKL5同种型，但是最近鉴定的107kDa同种型已被证明含有改变的C-末端区域，并被认为与脑功能有关(CDKL5107)(Williamson等人，2012)。如上所述，可以使用任何合适的同种型(例如本文别处所述的变体)形成CDKL5融合蛋白。对于本实例，使用本文别处描述的类似方法，通过将CDKL5115同种型(SEQ ID NO:2)或CDKL5107同种型(SEQ ID NO:16)可操作地连接到TATκ来形成CDKL5融合蛋白。
为了比较两种CDKL5同种型(115和107)的产生和活性水平，在HEK 293T细胞中瞬时表达或稳定表达TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107。观察到从培养基中TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白的回收率高于TATκ-eGFP-CDKL5115的回收率(图41)。
观察到两种CDKL5同种型具有类似的细胞内稳定性。图42A-42B示出了展示了在HEK 293T细胞(图42A)和SKNBE细胞(图42B)中表达的TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白的细胞内稳定性的图。用TATκ-eGFP-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5107转染HEK 293T和SKNBE细胞。24小时后，将细胞与环己酰亚胺(Chx；50μg/ml)一起孵育指定的时间(3小时、6小时或8小时)。通过CDKL5免疫印迹检测异位表达的CDKL5。
重要的是，在功能水平上，我们发现两种同种型具有可比的生理学活性。与TATκ-CDKL5115和TATκ-eGFP-CDKL5115平行测试TATκ-eGFP-CDKL5115的体外活性。在接种后那天，用纯化的TATκ-CDKL5115或TATκ-eGFP-CDKL5115和TATκ-eGFP(作为对照)处理SH-SY5Y细胞。具体地，将细胞与含有浓缩的/纯化的蛋白质的浓缩培养基一起孵育约24小时。使用Hoechst核染色，将细胞增殖评估为有丝分裂指数(使用有丝分裂的群体中的细胞数与总细胞数之间的比率)。如图52所示，我们证明了两种CDKL5同种型在抑制增殖方面对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞具有相同的作用。我们测试了与没有eGFP的TATκ-CDKL5115蛋白平行的TATκ-eGFP-CDKL5115的体外活性。如图52所示，我们证明了两种蛋白质在抑制增殖方面对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞具有相同的作用，这表明eGFP标签不改变CDKL5活性。
实例14：TATκ-CDKL5蛋白具有与天然CDKL5相同的亚细胞定位，并恢复来源于CDKL5KO小鼠的海马神经元的神经突发育。
已经显示在海马神经元中，CDKL5主要具有在突触后区室富集的细胞质定位。我们发现在这些神经元中，内化的TATκ-eGFP-CDKL5107主要位于细胞质中，并且特别是在树突水平上，它特异性地定位于树突棘(图45A-45D)。共聚焦图像显示TATk-eGFP-CDKL5与突触前(突触泡蛋白；SYN，图60A-60C)和突触后(PSD-95；图46A-46D)共定位。这表明外源蛋白位于天然CDKL5的相同亚细胞位点。
为了确定TATκ-eGFP-CDKL5107是否保留了CDKL5的生理学活性，使来自CDKL5敲除雄性小鼠(-/Y)的海马神经元培养物在TATκ-eGFP-CDKL5107(添加到培养基中)存在下生长8日。在这些神经元中，CDKL5的缺失导致神经元成熟的降低，如通过树突长度减小(图47)、突触连接的数目(图48)和棘密度(图61)所示。用TATκ-eGFP-CDKL5处理恢复神经突发育(图47-48和61)，表明融合蛋白保留了CDKL5的生理学活性。
实例15：TATκ-CDKL5107融合蛋白对行为的影响。
图49A-49B示出了描绘用于行为测试的CDKL5融合蛋白的治疗时间表和给予途径的草图。如上所述，雄性CDKL5野生型小鼠(+/Y)接受了用TATκ-eGFP(n＝6)进行的处理，而用TATκ-eGFP(n＝6)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝6)处理了CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)。治疗期由以下各项组成：连续5天的单次每日注射(10μl注射，约50ng/注射)、随后是两天休息期、然后是单次注射另外的5天。在12天的时间内进行了总共10次注射。
图50示出了展示在如图49A-49B中所述接受TATκ-eGFP-CDKL5107融合蛋白之后来自莫里斯水迷宫测试的结果的图。在处理期和两天休息期之后，小鼠接受了莫里斯水迷宫测试(MWM)测试。该测定发现和回忆浸入水中隐藏平台的位置的能力。测试小鼠学习5天(学习期)的能力，并在第6天进行探针测试(第4页)。TATκ-eGFP处理的野生型(+/Y)雄性小鼠在第三天习得找到平台，但在用TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性小鼠中没有检测到显著的学习，表明学习能力缺失。TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠在第3天开始恢复学习能力，并在第4天和第5天达到与WT类似的表现。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，*p<0.05，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO(-/Y)情况相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图51A-51C示出了展示来自测量(图51A)进入前一个平台象限的潜伏期、(图51B)进入前一个平台象限的频率、(图51C)在前一个平台象限中花费的时间百分比的空间记忆的图。在TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性小鼠中，所有参数的性能严重受损。TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠显示出所有参数的统计学显著的改善，图A、B和C。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与TATκ-eGFP处理的Cdkl5KO-/Y情况相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图52A-52B示出了使用被动回避(PA)测试展示处理对学习和记忆的影响的图。在处理期和两天的休息期后，小鼠接受了被动回避(PA)测试。该实验利用了具有两个腔室(光明和黑暗)的测试笼子。在第一天，动物被置于光明腔室中并且本能地移动到黑暗腔室中，在该黑暗腔室中，它们遭受单一的不良事件(足部电击)。图52A表明对于所有组，进入黑暗腔室的潜伏时间是类似的。在第二天(测试期)，将动物再次置于光明腔室。通过进入黑暗腔室的潜伏时间来测定对不良事件的记忆，并将其呈现在图52B中。TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性(-/Y)小鼠在此任务中严重受损，如通过与野生型雄性(+/Y)小鼠相比进入黑暗区室的潜伏期减少所证明的。与野生型小鼠相比，TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠表现出类似的潜伏时间(图52B)。与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性小鼠相比，这些差异是统计学显著的。与野生型雄性情况相比，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO-/Y情况相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图53A-53B示出了(图53A)用于评估处理对学习和记忆的影响的Y迷宫的草图和(图53B)展示来自Y迷宫测试的结果的图。在处理期和两天休息期之后，小鼠接受了Y迷宫测试。Y迷宫自发交替用于测量小鼠探索新环境的意愿，并且表示海马体依赖性空间参考记忆。将每只小鼠放置在面向迷宫中心的一个臂部的远端部分。三个臂部中的每一个都是34cm x 5cm x 10cm的高度，臂部之间互成120°角，并且由灰色不透明的塑料制成。在引入迷宫后，允许动物自由探索三个臂部8分钟。在多次臂部进入的过程中，受试者应当显示进入最近访问的臂部的倾向。臂部进入被定义为全部四只爪子存在于一个臂部中。将自发交替的百分比定义为：(总交替/总臂部进入-2)x 100。一个交替被定义为三个不同臂部的连续进入。与TATκ-eGFP处理的野生型雄性(+/Y)小鼠相比，TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性(-/Y)小鼠在这项任务中受损，如通过自发交替百分比的降低所证明的。用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠显示出与用TATκ-eGFP处理的WT相似的性能。与野生型雄性情况相比，*p<0.05，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性情况相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
图54A-54B示出了展示在用于评价处理对运动功能的影响的后肢抱拢测试中抱拢(右小鼠)与不抱拢(左小鼠)的图(图54A)和图像(图54B)。在治疗期后，抓住尾巴，将动物悬挂在空中。将所有小鼠悬挂2分钟并且测量后肢抱拢的总时间。上图报告了后肢抱拢的时间占总悬挂时间的百分比。与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性(-/Y)小鼠相比，用TATκ-eGFP-CDKL5107处理导致抱拢时间的统计学显著降低。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，***p<0.001；与TATκ-eGFP处理的CDKL5KO雄性情况相比，##p<0.001(在ANOVA之后进行FisherLSD检验)。
图55A和55B显示了展示在非REM(NREM)(图55A)和REM(图55B)睡眠期间通过呼吸暂停的次数测量的CDKL5KO(-/Y)雄性小鼠的呼吸紊乱的图。用TATκ-eGFP-CDKL5107处理导致在CDKL5KO雄性小鼠中非REM(NREM)(图55A)和REM(图55B)睡眠期间呼吸暂停的次数急剧减少。
测量了雄性野生型(+/Y)小鼠和用TATκ-eGFP-CDKL5107蛋白注射10(-/Y)天的CDKL5KO(-/Y)小鼠的体重并且将结果展示在图59中。在注射期期间中没有观察到体重的显著变化，这表明不存在由TATκ-eGFP-CDKL5蛋白给予导致的任何副作用。
实例16：TATκ-CDKL5107体内处理对神经元成熟和存活的长效应。
需要在患者的整个寿命期间继续进行蛋白质替代疗法。鉴于人类未来治疗方案可能降低注射频率的想法，我们评估了治疗停止后存留的积极作用。
图56A-56D示出了新生颗粒细胞的图(图56A)和重构树突树(图56B-56D)，展示了用TATκ-eGFP-CDK5107融合蛋白处理的作用。在治疗期完成后12天，用免疫组织化学方法对DCX分析颗粒细胞树突形态，该DCX是神经突延伸期期间(神经元出生后1至4周)存在于细胞质中的蛋白质。图A表示用TATκ-eGFP处理的雄性野生型(+/Y)(WT)和雄性CDKL5KO(-/Y)小鼠以及用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的雄性CDKL5KO(-/Y)小鼠的平均总树突长度。图56B、56C和56D分别示出了以下各项的新生颗粒细胞的重构树突树的实例：用TATκ-eGFP处理的雄性野生型(+/Y)小鼠、用TATκ-eGFP处理的雄性CDKL5KO(-/Y)小鼠以及用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO(-/Y)小鼠。数据表明用TATκ-eGFP-CDKL5107处理导致形态学变化，其从给药停止的时间持续至少12天。值表示平均值±SE。与野生型情况相比，**p<0.01；与TATκ-eGFP处理的(-/Y)情况相比，#p<0.01(在ANOVA之后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。
图57展示了在野生型(WT)雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)、和用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠的海马体(齿状回)中DCX阳性细胞数目的定量。治疗期由以下各项组成：每日一次脑室内注射5天、随后是两天休息期、然后是另外的持续5天的每日一次注射。在最后一次注射后10天将动物处死。数据表示为细胞数目/μm，与+/Y+TATκ-eGFP样品中的细胞数目/μm相比，**p<0.01；与-/Y+TATκ-eGFP样品中的细胞数目/μm相比，##p<0.001(在ANOVA后进行邦弗朗尼(Bonferroni)检验)。数据表明，用TATκ-eGFP-CDKL5处理对DCX阳性细胞的数目的积极影响在处理完成后10天仍保留。
图58展示了在野生型(WT)雄性小鼠(+/Y)、CDKL5KO雄性小鼠(-/Y)、和用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5KO雄性小鼠的海马体(齿状回)中裂解的半胱天冬酶-3阳性细胞的总数目的定量。治疗期由以下各项组成：每日一次脑室内注射5天、随后是两天休息期、然后是另外的持续5天的每日一次注射。在最后一次注射后10天将动物处死。
实例17：全身给予TATκ-CDKL5107蛋白对神经元发育和行为的影响。
图62示出了CDKL5融合蛋白的全身给予的治疗时间表。为了模拟每日人类剂量给予，我们使用了一种创新的输注方法，该方法基于用可重新填装的容器在皮肤下植入的可编程泵。将泵连接到植入颈动脉的插管上。该系统允许我们每天应用两次输注方案(早上和晚上)，持续10天的时间。使用TATκ-eGFP(20μl+20μl)或TATκ-eGFP-CDKL5107(20μl+20μl)，每天两次输注雄性CDKL5KO(-/Y)小鼠，持续10天。两次输注的时间为上午9-10点和晚上9-10点。该处理时间表用于生成图63A-72所示的数据。在图65-68和70-72中，值表示为平均值±SE。与未处理的CDKL5+/Y情况相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；与未处理的CDKL5-/Y样品相比，#p<0.05(在ANOVA之后进行Fisher LSD检验)。
如图17A-17F所示，CDKL5融合蛋白115同种型在全身给予时可以穿过血脑屏障。图63A-63B展示了用TATκ-eGFP-CDKL5107全身性处理对新生颗粒细胞成熟的影响。最后注射后一小时，将动物处死，并且使用DCX的免疫组织化学分析新生海马颗粒细胞的树突形态。图63A-63B展示了处理的雄性CDKL5敲除小鼠的DCX阳性神经元具有比未处理的雄性CDKL5KO小鼠更长的过程。图64显示在用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的小鼠中，睡眠期间的呼吸暂停显著降低，表明处理的积极效果。
图65示出了未处理的CDKL5+/Y(n＝5)和CDKL5-/Y(n＝5)小鼠以及用TATκ-eGFP(n＝6)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝6)处理的CDKL5-/Y小鼠的新生(双皮质素-阳性)颗粒细胞的总树突长度。图66示出了未处理的CDKL5+/Y(n＝5)和CDKL5-/Y(n＝5)小鼠以及用TATκ-eGFP(n＝4)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝5)处理的CDKL5-/Y小鼠的高尔基体染色的颗粒细胞的总树突长度。从图65和图66中可以看出，与未处理的CDKL5+/Y小鼠相比，全身给予CDKL5融合蛋白显著增加了树突长度。
图67示出了未处理的CDKL5+/Y(n＝24)和CDKL5-/Y(n＝11)小鼠以及用TATκ-eGFP(n＝6)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝5)处理的CDKL5-/Y小鼠的挖掘发作次数。从图67中可以看出，与未处理的CDKL5+/Y小鼠相比，全身给予CDKL5融合蛋白显著增加了挖掘发作次数。
图68示出了未处理的CDKL5+/Y(n＝6)和CDKL5-/Y(n＝20)小鼠以及用TATκ-eGFP(n＝6)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝5)处理的CDKL5-/Y小鼠的窝质量。从图68中可以看出，与未处理的CDKL5+/Y小鼠相比，全身给予CDKL5融合蛋白显著增加了窝质量。
图69示出了在用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的一只CDKL5-/Y小鼠中在不同时间点收集的视觉皮层中的神经活动的代表性图像。在图69中，较暗的图像显示更高水平的神经活动，较亮的图像显示较低水平的神经活动。从图69中可以看出，用TATκ-eGFP处理的小鼠在视觉皮层中具有非常少的神经活动，然而用TATκ-eGFP-CDKL5107处理的小鼠在整个10天的处理期间恢复了视觉活动，并且在清除期间保留了视觉活动。
图70示出了用TATκ-eGFP或TATκ-eGFP-CDKL5107处理的CDKL5-/Y小鼠中处理之前和处理6天和10天之后测量的视觉上诱发的反应的平均幅度。在处理停止(清除)后6-10天，用另外的测量评估作用的持续性。作为参考，在图案化区域中显示未处理的野生型反应幅度随时间的95％置信区间。误差条表示平均值的标准误差。双因子ANOVA(对因子时间的重复测量)揭示了时间X处理相互作用(p<0.05)；事后Holm-Sidak的多重比较测试：*p<0.05，**p<0.01。从图70中可以看出，与用TATκ-eGFP处理的CDKL5+/Y小鼠相比，全身给予CDKL5融合蛋白6天和10天显著降低视觉上诱发的反应的平均幅度。这种趋势甚至在处理停止后继续。
图71示出了来自以下各项的初级视觉皮层(V1)锥体神经元(第2/3层)的树突棘密度：未处理的CDKL5+/Y(n＝5)和CDKL5-/Y(n＝5)小鼠，以及用TATκ-eGFP(n＝4)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝5)处理且在处理结束时(短期)处死或用TATκ-eGFP(n＝3)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝3)处理且在处理停止后10天(长期)处死的CDKL5-/Y小鼠。从图71中可以看出，与未处理的CDKL5+/Y小鼠相比，全身给予CDKL5融合蛋白显著增加了树突棘密度。这种趋势甚至在处理停止后继续。
图72示出了在以下各项的初级视觉皮层(V1)中展现PSD-95免疫反应性的的荧光斑点数目/μm2：未处理的CDKL5+/Y(n＝3)和CDKL5-/Y(n＝3)小鼠，以及用TATκ-eGFP(n＝4)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝6)处理且在处理结束时(短期)处死或用TATκ-eGFP(n＝4)或TATκ-eGFP-CDKL5107(n＝4)处理且在处理停止后10天(长期)处死的CDKL5-/Y小鼠。从图72中可以看出，与未处理的CDKL5+/Y小鼠相比，全身给予CDKL5融合蛋白显著增加PSD-95荧光斑点数目/μm2。这种趋势甚至在处理停止后继续。
这些数据支持全身(例如，静脉内)给予CDKL5融合蛋白用于治疗CDKL5缺陷、增加树突长度、增加视觉皮质中的神经活动、以及改善行为。
序列表
SEQ ID NO:1CDKL5 115同种型cDNA(缺乏起始子甲硫氨酸的ATG起始密码子)aagattcctaacattggtaatgtgatgaataaatttgagatccttggggttgtaggtgaaggagcctatggagttgtacttaaatgcagacacaaggaaacacatgaaattgtggcgatcaagaaattcaaggacagtgaagaaaatgaagaagtcaaagaaacgactttacgagagcttaaaatgcttcggactctcaagcaggaaaacattgtggagttgaaggaagcatttcgtcggaggggaaagttgtacttggtgtttgagtatgttgaaaaaaatatgctcgaattgctggaagaaatgccaaatggagttccacctgagaaagtaaaaagctacatctatcagctaatcaaggctattcactggtgccataagaatgatattgtccatcgagatataaaaccagaaaatctcttaatcagccacaatgatgtcctaaaactgtgtgactttggttttgctcgtaatctgtcagaaggcaataatgctaattacacagagtacgttgccaccagatggtatcggtccccagaactcttacttggcgctccctatggaaagtccgtggacatgtggtcggtgggctgtattcttggggagcttagcgatggacagcctttatttcctggagaaagtgaaattgaccaactttttactattcagaaggtgctaggaccacttccatctgagcagatgaagcttttctacagtaatcctcgcttccatgggctccggtttccagctgttaaccatcctcagtccttggaaagaagataccttggaattttgaatagtgttctacttgacctaatgaagaatttactgaagttggacccagctgacagatacttgacagaacagtgtttgaatcaccctacatttcaaacccagagacttctggatcgttctccttcaaggtcagcaaaaagaaaaccttaccatgtggaaagcagcacattgtctaatagaaaccaagccggcaaaagtactgctttgcagtctcaccacagatctaacagcaaggacatccagaacctgagtgtaggcctgccccgggctgacgaaggtctccctgccaatgaaagcttcctaaatggaaaccttgctggagctagtcttagtccactgcacaccaaaacctaccaagcaagcagccagcctgggtctaccagcaaagatctcaccaacaacaacataccacaccttcttagcccaaaagaagccaagtcaaaaacagagtttgattttaatattgacccaaagccttcagaaggcccagggacaaagtacctcaagtcaaacagcagatctcagcagaaccgccactcattcatggaaagctctcaaagcaaagctgggacactgcagcccaatgaaaagcagagtcggcatagctatattgacacaattccccagtcctctaggagtccctcctacaggaccaaggccaaaagccatggggcactgagtgactccaagtctgtgagcaacctttctgaagccagggcccaaattgcggagcccagtaccagtaggtacttcccatctagctgcttagacttgaattctcccaccagcccaacccccaccagacacagtgacacgagaactttgctcagcccttctggaagaaataaccgaaatgagggaacgctggactcacgtcgaaccacaaccagacattctaagacgatggaggaattgaagctgccggagcacatggacagtagccattcccattcactgtctgcacctcacgaatctttttcttatggactgggctacaccagccccttttcttcccagcaacgtcctcataggcattctatgtatgtgacccgtgacaaagtgagagccaagggcttggatggaagcttgagcatagggcaagggatggcagctagagccaacagcctgcaactcttgtcaccccagcctggagaacagctccctccagagatgactgtggcaagatcttcggtcaaagagacctccagagaaggcacctcttccttccatacacgccagaagtctgagggtggagtgtatcatgacccacactctgatgatggcacagcccccaaagaaaatagacacctatacaatgatcctgtgccaaggagagttggtagcttttacagagtgccatctccacgtccagacaattctttccatgaaaataatgtgtcaactagagtttcttctctaccatcagagagcagttctggaaccaaccactcaaaaagacaaccagcattcgatccatggaaaagtcctgaaaatattagtcattcagagcaactcaaggaaaaagagaagcaaggatttttcaggtcaatgaaaaagaaaaagaagaaatctcaaacagtacccaattccgacagccctgatcttctgacgttgcagaaatccattcattctgctagcactccaagcagcagaccaaaggagtggcgccccgagaagatctcagatctgcagacccaaagccagccattaaaatcactgcgcaagttgttacatctctcttcggcctcaaatcacccggcttcctcagatccccgcttccagcccttaacagctcaacaaaccaaaaattccttctcagaaattcggattcaccccctgagccaggcctctggcgggagcagcaacatccggcaggaacccgcaccgaagggcaggccagccctccagctgccagacggtggatgtgatggcagaagacagagacaccattctggaccccaagatagacgcttcatgttaaggacgacagaacaacaaggagaatacttctgctgtggtgacccaaagaagcctcacactccgtgcgtcccaaaccgagcccttcatcgtccaatctccagtcctgctccctatccagtactccaggtccgaggcacttccatgtgcccgacactccaggtccgaggcactgatgctttcagctgcccaacccagcaatccgggttctctttcttcgtgagacacgttatgagggaagccctgattcacagggcccaggtaaaccaagctgcgctcctgacataccatgagaatgcggcactgacgggcaag
SEQ ID NO:2CDKL5同种型115多肽(缺乏起始子甲硫氨酸)
KIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTLRELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPDGGCDGRRQRHHSGPQDRRFMLRTTEQQGEYFCCGDPKKPHTPCVPNRALHRPISSPAPYPVLQVRGTSMCPTLQVRGTDAFSCPTQQSGFSFFVRHVMREALIHRAQVNQAALLTYHENAALTGK
SEQ ID NO:3TATκ多核苷酸序列
tacgccagaaaggccgccaggcaggccagggca
SEQ ID NO:4TATκ多肽序列
YARKAARQARA
SEQ ID NO:5Igκ-链前导多核苷酸序列
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt
SEQ ID NO:6Igκ链前导多肽
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID NO:7CDKL5 115同种型融合蛋白(Igκ-TATκ-CDKL5(115)-MYC-HIS)多核苷酸
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccaggcgcgcgcgccgtacgaagcttgcggcctacgccagaaaggccgccaggcaggccagggcaccggtgaagattcctaacattggtaatgtgatgaataaatttgagatccttggggttgtaggtgaaggagcctatggagttgtacttaaatgcagacacaaggaaacacatgaaattgtggcgatcaagaaattcaaggacagtgaagaaaatgaagaagtcaaagaaacgactttacgagagcttaaaatgcttcggactctcaagcaggaaaacattgtggagttgaaggaagcatttcgtcggaggggaaagttgtacttggtgtttgagtatgttgaaaaaaatatgctcgaattgctggaagaaatgccaaatggagttccacctgagaaagtaaaaagctacatctatcagctaatcaaggctattcactggtgccataagaatgatattgtccatcgagatataaaaccagaaaatctcttaatcagccacaatgatgtcctaaaactgtgtgactttggttttgctcgtaatctgtcagaaggcaataatgctaattacacagagtacgttgccaccagatggtatcggtccccagaactcttacttggcgctccctatggaaagtccgtggacatgtggtcggtgggctgtattcttggggagcttagcgatggacagcctttatttcctggagaaagtgaaattgaccaactttttactattcagaaggtgctaggaccacttccatctgagcagatgaagcttttctacagtaatcctcgcttccatgggctccggtttccagctgttaaccatcctcagtccttggaaagaagataccttggaattttgaatagtgttctacttgacctaatgaagaatttactgaagttggacccagctgacagatacttgacagaacagtgtttgaatcaccctacatttcaaacccagagacttctggatcgttctccttcaaggtcagcaaaaagaaaaccttaccatgtggaaagcagcacattgtctaatagaaaccaagccggcaaaagtactgctttgcagtctcaccacagatctaacagcaaggacatccagaacctgagtgtaggcctgccccgggctgacgaaggtctccctgccaatgaaagcttcctaaatggaaaccttgctggagctagtcttagtccactgcacaccaaaacctaccaagcaagcagccagcctgggtctaccagcaaagatctcaccaacaacaacataccacaccttcttagcccaaaagaagccaagtcaaaaacagagtttgattttaatattgacccaaagccttcagaaggcccagggacaaagtacctcaagtcaaacagcagatctcagcagaaccgccactcattcatggaaagctctcaaagcaaagctgggacactgcagcccaatgaaaagcagagtcggcatagctatattgacacaattccccagtcctctaggagtccctcctacaggaccaaggccaaaagccatggggcactgagtgactccaagtctgtgagcaacctttctgaagccagggcccaaattgcggagcccagtaccagtaggtacttcccatctagctgcttagacttgaattctcccaccagcccaacccccaccagacacagtgacacgagaactttgctcagcccttctggaagaaataaccgaaatgagggaacgctggactcacgtcgaaccacaaccagacattctaagacgatggaggaattgaagctgccggagcacatggacagtagccattcccattcactgtctgcacctcacgaatctttttcttatggactgggctacaccagccccttttcttcccagcaacgtcctcataggcattctatgtatgtgacccgtgacaaagtgagagccaagggcttggatggaagcttgagcatagggcaagggatggcagctagagccaacagcctgcaactcttgtcaccccagcctggagaacagctccctccagagatgactgtggcaagatcttcggtcaaagagacctccagagaaggcacctcttccttccatacacgccagaagtctgagggtggagtgtatcatgacccacactctgatgatggcacagcccccaaagaaaatagacacctatacaatgatcctgtgccaaggagagttggtagcttttacagagtgccatctccacgtccagacaattctttccatgaaaataatgtgtcaactagagtttcttctctaccatcagagagcagttctggaaccaaccactcaaaaagacaaccagcattcgatccatggaaaagtcctgaaaatattagtcattcagagcaactcaaggaaaaagagaagcaaggatttttcaggtcaatgaaaaagaaaaagaagaaatctcaaacagtacccaattccgacagccctgatcttctgacgttgcagaaatccattcattctgctagcactccaagcagcagaccaaaggagtggcgccccgagaagatctcagatctgcagacccaaagccagccattaaaatcactgcgcaagttgttacatctctcttcggcctcaaatcacccggcttcctcagatccccgcttccagcccttaacagctcaacaaaccaaaaattccttctcagaaattcggattcaccccctgagccaggcctctggcgggagcagcaacatccggcaggaacccgcaccgaagggcaggccagccctccagctgccagacggtggatgtgatggcagaagacagagacaccattctggaccccaagatagacgcttcatgttaaggacgacagaacaacaaggagaatacttctgctgtggtgacccaaagaagcctcacactccgtgcgtcccaaaccgagcccttcatcgtccaatctccagtcctgctccctatccagtactccaggtccgaggcacttccatgtgcccgacactccaggtccgaggcactgatgctttcagctgcccaacccagcaatccgggttctctttcttcgtgagacacgttatgagggaagccctgattcacagggcccaggtaaaccaagctgcgctcctgacataccatgagaatgcggcactgacgggcaagtccgctcgaggagggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattga
SEQ ID NO:8CDKL5 115同种型融合蛋白(Igκ-TATκ-CDKL5(115)-MYC-HIS)多肽METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLAAYARKAARQARAPVKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTLRELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPDGGCDGRRQRHHSGPQDRRFMLRTTEQQGEYFCCGDPKKPHTPCVPNRALHRPISSPAPYPVLQVRGTSMCPTLQVRGTDAFSCPTQQSGFSFFVRHVMREALIHRAQVNQAALLTYHENAALTGKSARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
SEQ ID NO:9CDKL5 115同种型融合蛋白(Igk-TATκ-eGFP-CDKL5(115)-MYC-HIS)多核苷酸。下划线表示起始子甲硫氨酸的密码子。
gctagccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccaggcgcgcgcgccgtacgaagcttgcggcctacgccagaaaggccgccaggcaggccagggcaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcgagcgaagattcctaacattggtaatgtgatgaataaatttgagatccttggggttgtaggtgaaggagcctatggagttgtacttaaatgcagacacaaggaaacacatgaaattgtggcgatcaagaaattcaaggacagtgaagaaaatgaagaagtcaaagaaacgactttacgagagcttaaaatgcttcggactctcaagcaggaaaacattgtggagttgaaggaagcatttcgtcggaggggaaagttgtacttggtgtttgagtatgttgaaaaaaatatgctcgaattgctggaagaaatgccaaatggagttccacctgagaaagtaaaaagctacatctatcagctaatcaaggctattcactggtgccataagaatgatattgtccatcgagatataaaaccagaaaatctcttaatcagccacaatgatgtcctaaaactgtgtgactttggttttgctcgtaatctgtcagaaggcaataatgctaattacacagagtacgttgccaccagatggtatcggtccccagaactcttacttggcgctccctatggaaagtccgtggacatgtggtcggtgggctgtattcttggggagcttagcgatggacagcctttatttcctggagaaagtgaaattgaccaactttttactattcagaaggtgctaggaccacttccatctgagcagatgaagcttttctacagtaatcctcgcttccatgggctccggtttccagctgttaaccatcctcagtccttggaaagaagataccttggaattttgaatagtgttctacttgacctaatgaagaatttactgaagttggacccagctgacagatacttgacagaacagtgtttgaatcaccctacatttcaaacccagagacttctggatcgttctccttcaaggtcagcaaaaagaaaaccttaccatgtggaaagcagcacattgtctaatagaaaccaagccggcaaaagtactgctttgcagtctcaccacagatctaacagcaaggacatccagaacctgagtgtaggcctgccccgggctgacgaaggtctccctgccaatgaaagcttcctaaatggaaaccttgctggagctagtcttagtccactgcacaccaaaacctaccaagcaagcagccagcctgggtctaccagcaaagatctcaccaacaacaacataccacaccttcttagcccaaaagaagccaagtcaaaaacagagtttgattttaatattgacccaaagccttcagaaggcccagggacaaagtacctcaagtcaaacagcagatctcagcagaaccgccactcattcatggaaagctctcaaagcaaagctgggacactgcagcccaatgaaaagcagagtcggcatagctatattgacacaattccccagtcctctaggagtccctcctacaggaccaaggccaaaagccatggggcactgagtgactccaagtctgtgagcaacctttctgaagccagggcccaaattgcggagcccagtaccagtaggtacttcccatctagctgcttagacttgaattctcccaccagcccaacccccaccagacacagtgacacgagaactttgctcagcccttctggaagaaataaccgaaatgagggaacgctggactcacgtcgaaccacaaccagacattctaagacgatggaggaattgaagctgccggagcacatggacagtagccattcccattcactgtctgcacctcacgaatctttttcttatggactgggctacaccagccccttttcttcccagcaacgtcctcataggcattctatgtatgtgacccgtgacaaagtgagagccaagggcttggatggaagcttgagcatagggcaagggatggcagctagagccaacagcctgcaactcttgtcaccccagcctggagaacagctccctccagagatgactgtggcaagatcttcggtcaaagagacctccagagaaggcacctcttccttccatacacgccagaagtctgagggtggagtgtatcatgacccacactctgatgatggcacagcccccaaagaaaatagacacctatacaatgatcctgtgccaaggagagttggtagcttttacagagtgccatctccacgtccagacaattctttccatgaaaataatgtgtcaactagagtttcttctctaccatcagagagcagttctggaaccaaccactcaaaaagacaaccagcattcgatccatggaaaagtcctgaaaatattagtcattcagagcaactcaaggaaaaagagaagcaaggatttttcaggtcaatgaaaaagaaaaagaagaaatctcaaacagtacccaattccgacagccctgatcttctgacgttgcagaaatccattcattctgctagcactccaagcagcagaccaaaggagtggcgccccgagaagatctcagatctgcagacccaaagccagccattaaaatcactgcgcaagttgttacatctctcttcggcctcaaatcacccggcttcctcagatccccgcttccagcccttaacagctcaacaaaccaaaaattccttctcagaaattcggattcaccccctgagccaggcctctggcgggagcagcaacatccggcaggaacccgcaccgaagggcaggccagccctccagctgccagacggtggatgtgatggcagaagacagagacaccattctggaccccaagatagacgcttcatgttaaggacgacagaacaacaaggagaatacttctgctgtggtgacccaaagaagcctcacactccgtgcgtcccaaaccgagcccttcatcgtccaatctccagtcctgctccctatccagtactccaggtccgaggcacttccatgtgcccgacactccaggtccgaggcactgatgctttcagctgcccaacccagcaatccgggttctctttcttcgtgagacacgttatgagggaagccctgattcacagggcccaggtaaaccaagctgcgctcctgacataccatgagaatgcggcactgacgggcaagtccgctcgaggagggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattga
SEQ ID NO:10CDKL5 115同种型融合蛋白(Igκ-TATκ-eGFP-CDKL5(115)-MYC-HIS)多肽。从SEQ ID NO:9的核苷酸11(起始子甲硫氨酸)翻译。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLAAYARKAARQARAPVATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSGLRSRAKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTLRELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPDGGCDGRRQRHHSGPQDRRFMLRTTEQQGEYFCCGDPKKPHTPCVPNRALHRPISSPAPYPVLQVRGTSMCPTLQVRGTDAFSCPTQQSGFSFFVRHVMREALIHRAQVNQAALLTYHENAALTGKSARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
SEQ ID NO:11CDKL5 107同种型融合蛋白(Igκ-TATκ-eGFP-CDKL5(107)-MYC-HIS)多核苷酸
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccaggcgcgcgcgccgtacgaagcttgcggcctacgccagaaaggccgccaggcaggccagggcaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcgagcgaagattcctaacattggtaatgtgatgaataaatttgagatccttggggttgtaggtgaaggagcctatggagttgtacttaaatgcagacacaaggaaacacatgaaattgtggcgatcaagaaattcaaggacagtgaagaaaatgaagaagtcaaagaaacgactttacgagagcttaaaatgcttcggactctcaagcaggaaaacattgtggagttgaaggaagcatttcgtcggaggggaaagttgtacttggtgtttgagtatgttgaaaaaaatatgctcgaattgctggaagaaatgccaaatggagttccacctgagaaagtaaaaagctacatctatcagctaatcaaggctattcactggtgccataagaatgatattgtccatcgagatataaaaccagaaaatctcttaatcagccacaatgatgtcctaaaactgtgtgactttggttttgctcgtaatctgtcagaaggcaataatgctaattacacagagtacgttgccaccagatggtatcggtccccagaactcttacttggcgctccctatggaaagtccgtggacatgtggtcggtgggctgtattcttggggagcttagcgatggacagcctttatttcctggagaaagtgaaattgaccaactttttactattcagaaggtgctaggaccacttccatctgagcagatgaagcttttctacagtaatcctcgcttccatgggctccggtttccagctgttaaccatcctcagtccttggaaagaagataccttggaattttgaatagtgttctacttgacctaatgaagaatttactgaagttggacccagctgacagatacttgacagaacagtgtttgaatcaccctacatttcaaacccagagacttctggatcgttctccttcaaggtcagcaaaaagaaaaccttaccatgtggaaagcagcacattgtctaatagaaaccaagccggcaaaagtactgctttgcagtctcaccacagatctaacagcaaggacatccagaacctgagtgtaggcctgccccgggctgacgaaggtctccctgccaatgaaagcttcctaaatggaaaccttgctggagctagtcttagtccactgcacaccaaaacctaccaagcaagcagccagcctgggtctaccagcaaagatctcaccaacaacaacataccacaccttcttagcccaaaagaagccaagtcaaaaacagagtttgattttaatattgacccaaagccttcagaaggcccagggacaaagtacctcaagtcaaacagcagatctcagcagaaccgccactcattcatggaaagctctcaaagcaaagctgggacactgcagcccaatgaaaagcagagtcggcatagctatattgacacaattccccagtcctctaggagtccctcctacaggaccaaggccaaaagccatggggcactgagtgactccaagtctgtgagcaacctttctgaagccagggcccaaattgcggagcccagtaccagtaggtacttcccatctagctgcttagacttgaattctcccaccagcccaacccccaccagacacagtgacacgagaactttgctcagcccttctggaagaaataaccgaaatgagggaacgctggactcacgtcgaaccacaaccagacattctaagacgatggaggaattgaagctgccggagcacatggacagtagccattcccattcactgtctgcacctcacgaatctttttcttatggactgggctacaccagccccttttcttcccagcaacgtcctcataggcattctatgtatgtgacccgtgacaaagtgagagccaagggcttggatggaagcttgagcatagggcaagggatggcagctagagccaacagcctgcaactcttgtcaccccagcctggagaacagctccctccagagatgactgtggcaagatcttcggtcaaagagacctccagagaaggcacctcttccttccatacacgccagaagtctgagggtggagtgtatcatgacccacactctgatgatggcacagcccccaaagaaaatagacacctatacaatgatcctgtgccaaggagagttggtagcttttacagagtgccatctccacgtccagacaattctttccatgaaaataatgtgtcaactagagtttcttctctaccatcagagagcagttctggaaccaaccactcaaaaagacaaccagcattcgatccatggaaaagtcctgaaaatattagtcattcagagcaactcaaggaaaaagagaagcaaggatttttcaggtcaatgaaaaagaaaaagaagaaatctcaaacagtacccaattccgacagccctgatcttctgacgttgcagaaatccattcattctgctagcactccaagcagcagaccaaaggagtggcgccccgagaagatctcagatctgcagacccaaagccagccattaaaatcactgcgcaagttgttacatctctcttcggcctcaaatcacccggcttcctcagatccccgcttccagcccttaacagctcaacaaaccaaaaattccttctcagaaattcggattcaccccctgagccaggcctctggcgggagcagcaacatccggcaggaacccgcaccgaagggcaggccagccctccagctgccaggtcagatggatcctggttggcatgtgtcctctgtgaccaggagtgccacagagggcccttcctactctgaacagctgggtgccaaaagtgggccaaatgggcacccctataacagaacaaatcgctcacgaatgccaaatctgaatgatttaaaagagacagccttgtccgctcgaggagggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattga
SEQ ID NO:12CDKL5 107同种型融合蛋白(Igκ-TATκ-eGFP-CDKL5(107)-MYC-HIS)多肽
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLAAYARKAARQARAPVATMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSGLRSRAKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTLRELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETALSARGGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
SEQ ID NO:13CDKL5 107同种型融合蛋白(Igk-TATκ-CDKL5(107)-3XFLAG)多核苷酸。下划线表示起始子甲硫氨酸的密码子。
gctagccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccaggcgcgcgcgccgtacgaagcttgcggcctacgccagaaaggccgccaggcaggccagggcaccggtgaagattcctaacattggtaatgtgatgaataaatttgagatccttggggttgtaggtgaaggagcctatggagttgtacttaaatgcagacacaaggaaacacatgaaattgtggcgatcaagaaattcaaggacagtgaagaaaatgaagaagtcaaagaaacgactttacgagagcttaaaatgcttcggactctcaagcaggaaaacattgtggagttgaaggaagcatttcgtcggaggggaaagttgtacttggtgtttgagtatgttgaaaaaaatatgctcgaattgctggaagaaatgccaaatggagttccacctgagaaagtaaaaagctacatctatcagctaatcaaggctattcactggtgccataagaatgatattgtccatcgagatataaaaccagaaaatctcttaatcagccacaatgatgtcctaaaactgtgtgactttggttttgctcgtaatctgtcagaaggcaataatgctaattacacagagtacgttgccaccagatggtatcggtccccagaactcttacttggcgctccctatggaaagtccgtggacatgtggtcggtgggctgtattcttggggagcttagcgatggacagcctttatttcctggagaaagtgaaattgaccaactttttactattcagaaggtgctaggaccacttccatctgagcagatgaagcttttctacagtaatcctcgcttccatgggctccggtttccagctgttaaccatcctcagtccttggaaagaagataccttggaattttgaatagtgttctacttgacctaatgaagaatttactgaagttggacccagctgacagatacttgacagaacagtgtttgaatcaccctacatttcaaacccagagacttctggatcgttctccttcaaggtcagcaaaaagaaaaccttaccatgtggaaagcagcacattgtctaatagaaaccaagccggcaaaagtactgctttgcagtctcaccacagatctaacagcaaggacatccagaacctgagtgtaggcctgccccgggctgacgaaggtctccctgccaatgaaagcttcctaaatggaaaccttgctggagctagtcttagtccactgcacaccaaaacctaccaagcaagcagccagcctgggtctaccagcaaagatctcaccaacaacaacataccacaccttcttagcccaaaagaagccaagtcaaaaacagagtttgattttaatattgacccaaagccttcagaaggcccagggacaaagtacctcaagtcaaacagcagatctcagcagaaccgccactcattcatggaaagctctcaaagcaaagctgggacactgcagcccaatgaaaagcagagtcggcatagctatattgacacaattccccagtcctctaggagtccctcctacaggaccaaggccaaaagccatggggcactgagtgactccaagtctgtgagcaacctttctgaagccagggcccaaattgcggagcccagtaccagtaggtacttcccatctagctgcttagacttgaattctcccaccagcccaacccccaccagacacagtgacacgagaactttgctcagcccttctggaagaaataaccgaaatgagggaacgctggactcacgtcgaaccacaaccagacattctaagacgatggaggaattgaagctgccggagcacatggacagtagccattcccattcactgtctgcacctcacgaatctttttcttatggactgggctacaccagccccttttcttcccagcaacgtcctcataggcattctatgtatgtgacccgtgacaaagtgagagccaagggcttggatggaagcttgagcatagggcaagggatggcagctagagccaacagcctgcaactcttgtcaccccagcctggagaacagctccctccagagatgactgtggcaagatcttcggtcaaagagacctccagagaaggcacctcttccttccatacacgccagaagtctgagggtggagtgtatcatgacccacactctgatgatggcacagcccccaaagaaaatagacacctatacaatgatcctgtgccaaggagagttggtagcttttacagagtgccatctccacgtccagacaattctttccatgaaaataatgtgtcaactagagtttcttctctaccatcagagagcagttctggaaccaaccactcaaaaagacaaccagcattcgatccatggaaaagtcctgaaaatattagtcattcagagcaactcaaggaaaaagagaagcaaggatttttcaggtcaatgaaaaagaaaaagaagaaatctcaaacagtacccaattccgacagccctgatcttctgacgttgcagaaatccattcattctgctagcactccaagcagcagaccaaaggagtggcgccccgagaagatctcagatctgcagacccaaagccagccattaaaatcactgcgcaagttgttacatctctcttcggcctcaaatcacccggcttcctcagatccccgcttccagcccttaacagctcaacaaaccaaaaattccttctcagaaattcggattcaccccctgagccaggcctctggcgggagcagcaacatccggcaggaacccgcaccgaagggcaggccagccctccagctgccaggtcagatggatcctggttggcatgtgtcctctgtgaccaggagtgccacagagggcccttcctactctgaacagctgggtgccaaaagtgggccaaatgggcacccctataacagaacaaatcgctcacgaatgccaaatctgaatgatttaaaagagacagccttgtctagaggatcccgggctgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaagtag
SEQ ID NO:14CDKL5 107同种型融合蛋白(Igκ-TATκ-CDKL5(107)-3XFLAG)多核苷酸
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLAAYARKAARQARAPVKIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTLRELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETALSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
SEQ ID NO:15CDKL5 107同种型多核苷酸。序列缺乏起始子甲硫氨酸的密码子。aagattcctaacattggtaatgtgatgaataaatttgagatccttggggttgtaggtgaaggagcctatggagttgtacttaaatgcagacacaaggaaacacatgaaattgtggcgatcaagaaattcaaggacagtgaagaaaatgaagaagtcaaagaaacgactttacgagagcttaaaatgcttcggactctcaagcaggaaaacattgtggagttgaaggaagcatttcgtcggaggggaaagttgtacttggtgtttgagtatgttgaaaaaaatatgctcgaattgctggaagaaatgccaaatggagttccacctgagaaagtaaaaagctacatctatcagctaatcaaggctattcactggtgccataagaatgatattgtccatcgagatataaaaccagaaaatctcttaatcagccacaatgatgtcctaaaactgtgtgactttggttttgctcgtaatctgtcagaaggcaataatgctaattacacagagtacgttgccaccagatggtatcggtccccagaactcttacttggcgctccctatggaaagtccgtggacatgtggtcggtgggctgtattcttggggagcttagcgatggacagcctttatttcctggagaaagtgaaattgaccaactttttactattcagaaggtgctaggaccacttccatctgagcagatgaagcttttctacagtaatcctcgcttccatgggctccggtttccagctgttaaccatcctcagtccttggaaagaagataccttggaattttgaatagtgttctacttgacctaatgaagaatttactgaagttggacccagctgacagatacttgacagaacagtgtttgaatcaccctacatttcaaacccagagacttctggatcgttctccttcaaggtcagcaaaaagaaaaccttaccatgtggaaagcagcacattgtctaatagaaaccaagccggcaaaagtactgctttgcagtctcaccacagatctaacagcaaggacatccagaacctgagtgtaggcctgccccgggctgacgaaggtctccctgccaatgaaagcttcctaaatggaaaccttgctggagctagtcttagtccactgcacaccaaaacctaccaagcaagcagccagcctgggtctaccagcaaagatctcaccaacaacaacataccacaccttcttagcccaaaagaagccaagtcaaaaacagagtttgattttaatattgacccaaagccttcagaaggcccagggacaaagtacctcaagtcaaacagcagatctcagcagaaccgccactcattcatggaaagctctcaaagcaaagctgggacactgcagcccaatgaaaagcagagtcggcatagctatattgacacaattccccagtcctctaggagtccctcctacaggaccaaggccaaaagccatggggcactgagtgactccaagtctgtgagcaacctttctgaagccagggcccaaattgcggagcccagtaccagtaggtacttcccatctagctgcttagacttgaattctcccaccagcccaacccccaccagacacagtgacacgagaactttgctcagcccttctggaagaaataaccgaaatgagggaacgctggactcacgtcgaaccacaaccagacattctaagacgatggaggaattgaagctgccggagcacatggacagtagccattcccattcactgtctgcacctcacgaatctttttcttatggactgggctacaccagccccttttcttcccagcaacgtcctcataggcattctatgtatgtgacccgtgacaaagtgagagccaagggcttggatggaagcttgagcatagggcaagggatggcagctagagccaacagcctgcaactcttgtcaccccagcctggagaacagctccctccagagatgactgtggcaagatcttcggtcaaagagacctccagagaaggcacctcttccttccatacacgccagaagtctgagggtggagtgtatcatgacccacactctgatgatggcacagcccccaaagaaaatagacacctatacaatgatcctgtgccaaggagagttggtagcttttacagagtgccatctccacgtccagacaattctttccatgaaaataatgtgtcaactagagtttcttctctaccatcagagagcagttctggaaccaaccactcaaaaagacaaccagcattcgatccatggaaaagtcctgaaaatattagtcattcagagcaactcaaggaaaaagagaagcaaggatttttcaggtcaatgaaaaagaaaaagaagaaatctcaaacagtacccaattccgacagccctgatcttctgacgttgcagaaatccattcattctgctagcactccaagcagcagaccaaaggagtggcgccccgagaagatctcagatctgcagacccaaagccagccattaaaatcactgcgcaagttgttacatctctcttcggcctcaaatcacccggcttcctcagatccccgcttccagcccttaacagctcaacaaaccaaaaattccttctcagaaattcggattcaccccctgagccaggcctctggcgggagcagcaacatccggcaggaacccgcaccgaagggcaggccagccctccagctgccaggtcagatggatcctggttggcatgtgtcctctgtgaccaggagtgccacagagggcccttcctactctgaacagctgggtgccaaaagtgggccaaatgggcacccctataacagaacaaatcgctcacgaatgccaaatctgaatgatttaaaagagacagccttg
SEQ ID NO:16CDKL5 107同种型多肽。序列缺乏起始子甲硫氨酸。
KIPNIGNVMNKFEILGVVGEGAYGVVLKCRHKETHEIVAIKKFKDSEENEEVKETTLRELKMLRTLKQENIVELKEAFRRRGKLYLVFEYVEKNMLELLEEMPNGVPPEKVKSYIYQLIKAIHWCHKNDIVHRDIKPENLLISHNDVLKLCDFGFARNLSEGNNANYTEYVATRWYRSPELLLGAPYGKSVDMWSVGCILGELSDGQPLFPGESEIDQLFTIQKVLGPLPSEQMKLFYSNPRFHGLRFPAVNHPQSLERRYLGILNSVLLDLMKNLLKLDPADRYLTEQCLNHPTFQTQRLLDRSPSRSAKRKPYHVESSTLSNRNQAGKSTALQSHHRSNSKDIQNLSVGLPRADEGLPANESFLNGNLAGASLSPLHTKTYQASSQPGSTSKDLTNNNIPHLLSPKEAKSKTEFDFNIDPKPSEGPGTKYLKSNSRSQQNRHSFMESSQSKAGTLQPNEKQSRHSYIDTIPQSSRSPSYRTKAKSHGALSDSKSVSNLSEARAQIAEPSTSRYFPSSCLDLNSPTSPTPTRHSDTRTLLSPSGRNNRNEGTLDSRRTTTRHSKTMEELKLPEHMDSSHSHSLSAPHESFSYGLGYTSPFSSQQRPHRHSMYVTRDKVRAKGLDGSLSIGQGMAARANSLQLLSPQPGEQLPPEMTVARSSVKETSREGTSSFHTRQKSEGGVYHDPHSDDGTAPKENRHLYNDPVPRRVGSFYRVPSPRPDNSFHENNVSTRVSSLPSESSSGTNHSKRQPAFDPWKSPENISHSEQLKEKEKQGFFRSMKKKKKKSQTVPNSDSPDLLTLQKSIHSASTPSSRPKEWRPEKISDLQTQSQPLKSLRKLLHLSSASNHPASSDPRFQPLTAQQTKNSFSEIRIHPLSQASGGSSNIRQEPAPKGRPALQLPGQMDPGWHVSSVTRSATEGPSYSEQLGAKSGPNGHPYNRTNRSRMPNLNDLKETAL
序列表
<110> 万校之母-博洛尼亚大学（ALMA MATER STUDIORUM-UNIVERSITA DI BOLOGNA）
Ciani, Elisabetta
Laccone, Franco
阿米库斯治疗学公司(AMICUS THERAPEUTICS, INC.)
<120> TATκ-CDKL5融合蛋白、其组合物、配制品
以及用途
<130> ACS0052-00WO
<150> US 62/355,579
<151> 2016-06-28
<150> US 62/381,886
<151> 2016-08-31
<160> 16
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3087
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 115同种型cDNA
<400> 1
aagattccta acattggtaa tgtgatgaat aaatttgaga tccttggggt tgtaggtgaa 60
ggagcctatg gagttgtact taaatgcaga cacaaggaaa cacatgaaat tgtggcgatc 120
aagaaattca aggacagtga agaaaatgaa gaagtcaaag aaacgacttt acgagagctt 180
aaaatgcttc ggactctcaa gcaggaaaac attgtggagt tgaaggaagc atttcgtcgg 240
aggggaaagt tgtacttggt gtttgagtat gttgaaaaaa atatgctcga attgctggaa 300
gaaatgccaa atggagttcc acctgagaaa gtaaaaagct acatctatca gctaatcaag 360
gctattcact ggtgccataa gaatgatatt gtccatcgag atataaaacc agaaaatctc 420
ttaatcagcc acaatgatgt cctaaaactg tgtgactttg gttttgctcg taatctgtca 480
gaaggcaata atgctaatta cacagagtac gttgccacca gatggtatcg gtccccagaa 540
ctcttacttg gcgctcccta tggaaagtcc gtggacatgt ggtcggtggg ctgtattctt 600
ggggagctta gcgatggaca gcctttattt cctggagaaa gtgaaattga ccaacttttt 660
actattcaga aggtgctagg accacttcca tctgagcaga tgaagctttt ctacagtaat 720
cctcgcttcc atgggctccg gtttccagct gttaaccatc ctcagtcctt ggaaagaaga 780
taccttggaa ttttgaatag tgttctactt gacctaatga agaatttact gaagttggac 840
ccagctgaca gatacttgac agaacagtgt ttgaatcacc ctacatttca aacccagaga 900
cttctggatc gttctccttc aaggtcagca aaaagaaaac cttaccatgt ggaaagcagc 960
acattgtcta atagaaacca agccggcaaa agtactgctt tgcagtctca ccacagatct 1020
aacagcaagg acatccagaa cctgagtgta ggcctgcccc gggctgacga aggtctccct 1080
gccaatgaaa gcttcctaaa tggaaacctt gctggagcta gtcttagtcc actgcacacc 1140
aaaacctacc aagcaagcag ccagcctggg tctaccagca aagatctcac caacaacaac 1200
ataccacacc ttcttagccc aaaagaagcc aagtcaaaaa cagagtttga ttttaatatt 1260
gacccaaagc cttcagaagg cccagggaca aagtacctca agtcaaacag cagatctcag 1320
cagaaccgcc actcattcat ggaaagctct caaagcaaag ctgggacact gcagcccaat 1380
gaaaagcaga gtcggcatag ctatattgac acaattcccc agtcctctag gagtccctcc 1440
tacaggacca aggccaaaag ccatggggca ctgagtgact ccaagtctgt gagcaacctt 1500
tctgaagcca gggcccaaat tgcggagccc agtaccagta ggtacttccc atctagctgc 1560
ttagacttga attctcccac cagcccaacc cccaccagac acagtgacac gagaactttg 1620
ctcagccctt ctggaagaaa taaccgaaat gagggaacgc tggactcacg tcgaaccaca 1680
accagacatt ctaagacgat ggaggaattg aagctgccgg agcacatgga cagtagccat 1740
tcccattcac tgtctgcacc tcacgaatct ttttcttatg gactgggcta caccagcccc 1800
ttttcttccc agcaacgtcc tcataggcat tctatgtatg tgacccgtga caaagtgaga 1860
gccaagggct tggatggaag cttgagcata gggcaaggga tggcagctag agccaacagc 1920
ctgcaactct tgtcacccca gcctggagaa cagctccctc cagagatgac tgtggcaaga 1980
tcttcggtca aagagacctc cagagaaggc acctcttcct tccatacacg ccagaagtct 2040
gagggtggag tgtatcatga cccacactct gatgatggca cagcccccaa agaaaataga 2100
cacctataca atgatcctgt gccaaggaga gttggtagct tttacagagt gccatctcca 2160
cgtccagaca attctttcca tgaaaataat gtgtcaacta gagtttcttc tctaccatca 2220
gagagcagtt ctggaaccaa ccactcaaaa agacaaccag cattcgatcc atggaaaagt 2280
cctgaaaata ttagtcattc agagcaactc aaggaaaaag agaagcaagg atttttcagg 2340
tcaatgaaaa agaaaaagaa gaaatctcaa acagtaccca attccgacag ccctgatctt 2400
ctgacgttgc agaaatccat tcattctgct agcactccaa gcagcagacc aaaggagtgg 2460
cgccccgaga agatctcaga tctgcagacc caaagccagc cattaaaatc actgcgcaag 2520
ttgttacatc tctcttcggc ctcaaatcac ccggcttcct cagatccccg cttccagccc 2580
ttaacagctc aacaaaccaa aaattccttc tcagaaattc ggattcaccc cctgagccag 2640
gcctctggcg ggagcagcaa catccggcag gaacccgcac cgaagggcag gccagccctc 2700
cagctgccag acggtggatg tgatggcaga agacagagac accattctgg accccaagat 2760
agacgcttca tgttaaggac gacagaacaa caaggagaat acttctgctg tggtgaccca 2820
aagaagcctc acactccgtg cgtcccaaac cgagcccttc atcgtccaat ctccagtcct 2880
gctccctatc cagtactcca ggtccgaggc acttccatgt gcccgacact ccaggtccga 2940
ggcactgatg ctttcagctg cccaacccag caatccgggt tctctttctt cgtgagacac 3000
gttatgaggg aagccctgat tcacagggcc caggtaaacc aagctgcgct cctgacatac 3060
catgagaatg cggcactgac gggcaag 3087
<210> 2
<211> 1029
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5同种型115多肽
<400> 2
Lys Ile Pro Asn Ile Gly Asn Val Met Asn Lys Phe Glu Ile Leu Gly
1 5 10 15
Val Val Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu Lys Cys Arg His Lys
20 25 30
Glu Thr His Glu Ile Val Ala Ile Lys Lys Phe Lys Asp Ser Glu Glu
35 40 45
Asn Glu Glu Val Lys Glu Thr Thr Leu Arg Glu Leu Lys Met Leu Arg
50 55 60
Thr Leu Lys Gln Glu Asn Ile Val Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Val Glu Lys Asn Met Leu
85 90 95
Glu Leu Leu Glu Glu Met Pro Asn Gly Val Pro Pro Glu Lys Val Lys
100 105 110
Ser Tyr Ile Tyr Gln Leu Ile Lys Ala Ile His Trp Cys His Lys Asn
115 120 125
Asp Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Ser His
130 135 140
Asn Asp Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Phe Ala Arg Asn Leu Ser
145 150 155 160
Glu Gly Asn Asn Ala Asn Tyr Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr
165 170 175
Arg Ser Pro Glu Leu Leu Leu Gly Ala Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp
180 185 190
Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Leu Ser Asp Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ile Asp Gln Leu Phe Thr Ile Gln Lys
210 215 220
Val Leu Gly Pro Leu Pro Ser Glu Gln Met Lys Leu Phe Tyr Ser Asn
225 230 235 240
Pro Arg Phe His Gly Leu Arg Phe Pro Ala Val Asn His Pro Gln Ser
245 250 255
Leu Glu Arg Arg Tyr Leu Gly Ile Leu Asn Ser Val Leu Leu Asp Leu
260 265 270
Met Lys Asn Leu Leu Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Glu
275 280 285
Gln Cys Leu Asn His Pro Thr Phe Gln Thr Gln Arg Leu Leu Asp Arg
290 295 300
Ser Pro Ser Arg Ser Ala Lys Arg Lys Pro Tyr His Val Glu Ser Ser
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Arg Asn Gln Ala Gly Lys Ser Thr Ala Leu Gln Ser
325 330 335
His His Arg Ser Asn Ser Lys Asp Ile Gln Asn Leu Ser Val Gly Leu
340 345 350
Pro Arg Ala Asp Glu Gly Leu Pro Ala Asn Glu Ser Phe Leu Asn Gly
355 360 365
Asn Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ser Pro Leu His Thr Lys Thr Tyr Gln
370 375 380
Ala Ser Ser Gln Pro Gly Ser Thr Ser Lys Asp Leu Thr Asn Asn Asn
385 390 395 400
Ile Pro His Leu Leu Ser Pro Lys Glu Ala Lys Ser Lys Thr Glu Phe
405 410 415
Asp Phe Asn Ile Asp Pro Lys Pro Ser Glu Gly Pro Gly Thr Lys Tyr
420 425 430
Leu Lys Ser Asn Ser Arg Ser Gln Gln Asn Arg His Ser Phe Met Glu
435 440 445
Ser Ser Gln Ser Lys Ala Gly Thr Leu Gln Pro Asn Glu Lys Gln Ser
450 455 460
Arg His Ser Tyr Ile Asp Thr Ile Pro Gln Ser Ser Arg Ser Pro Ser
465 470 475 480
Tyr Arg Thr Lys Ala Lys Ser His Gly Ala Leu Ser Asp Ser Lys Ser
485 490 495
Val Ser Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ala Gln Ile Ala Glu Pro Ser Thr
500 505 510
Ser Arg Tyr Phe Pro Ser Ser Cys Leu Asp Leu Asn Ser Pro Thr Ser
515 520 525
Pro Thr Pro Thr Arg His Ser Asp Thr Arg Thr Leu Leu Ser Pro Ser
530 535 540
Gly Arg Asn Asn Arg Asn Glu Gly Thr Leu Asp Ser Arg Arg Thr Thr
545 550 555 560
Thr Arg His Ser Lys Thr Met Glu Glu Leu Lys Leu Pro Glu His Met
565 570 575
Asp Ser Ser His Ser His Ser Leu Ser Ala Pro His Glu Ser Phe Ser
580 585 590
Tyr Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Pro Phe Ser Ser Gln Gln Arg Pro His
595 600 605
Arg His Ser Met Tyr Val Thr Arg Asp Lys Val Arg Ala Lys Gly Leu
610 615 620
Asp Gly Ser Leu Ser Ile Gly Gln Gly Met Ala Ala Arg Ala Asn Ser
625 630 635 640
Leu Gln Leu Leu Ser Pro Gln Pro Gly Glu Gln Leu Pro Pro Glu Met
645 650 655
Thr Val Ala Arg Ser Ser Val Lys Glu Thr Ser Arg Glu Gly Thr Ser
660 665 670
Ser Phe His Thr Arg Gln Lys Ser Glu Gly Gly Val Tyr His Asp Pro
675 680 685
His Ser Asp Asp Gly Thr Ala Pro Lys Glu Asn Arg His Leu Tyr Asn
690 695 700
Asp Pro Val Pro Arg Arg Val Gly Ser Phe Tyr Arg Val Pro Ser Pro
705 710 715 720
Arg Pro Asp Asn Ser Phe His Glu Asn Asn Val Ser Thr Arg Val Ser
725 730 735
Ser Leu Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gly Thr Asn His Ser Lys Arg Gln
740 745 750
Pro Ala Phe Asp Pro Trp Lys Ser Pro Glu Asn Ile Ser His Ser Glu
755 760 765
Gln Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Gly Phe Phe Arg Ser Met Lys Lys
770 775 780
Lys Lys Lys Lys Ser Gln Thr Val Pro Asn Ser Asp Ser Pro Asp Leu
785 790 795 800
Leu Thr Leu Gln Lys Ser Ile His Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser Arg
805 810 815
Pro Lys Glu Trp Arg Pro Glu Lys Ile Ser Asp Leu Gln Thr Gln Ser
820 825 830
Gln Pro Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu His Leu Ser Ser Ala Ser
835 840 845
Asn His Pro Ala Ser Ser Asp Pro Arg Phe Gln Pro Leu Thr Ala Gln
850 855 860
Gln Thr Lys Asn Ser Phe Ser Glu Ile Arg Ile His Pro Leu Ser Gln
865 870 875 880
Ala Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Arg Gln Glu Pro Ala Pro Lys Gly
885 890 895
Arg Pro Ala Leu Gln Leu Pro Asp Gly Gly Cys Asp Gly Arg Arg Gln
900 905 910
Arg His His Ser Gly Pro Gln Asp Arg Arg Phe Met Leu Arg Thr Thr
915 920 925
Glu Gln Gln Gly Glu Tyr Phe Cys Cys Gly Asp Pro Lys Lys Pro His
930 935 940
Thr Pro Cys Val Pro Asn Arg Ala Leu His Arg Pro Ile Ser Ser Pro
945 950 955 960
Ala Pro Tyr Pro Val Leu Gln Val Arg Gly Thr Ser Met Cys Pro Thr
965 970 975
Leu Gln Val Arg Gly Thr Asp Ala Phe Ser Cys Pro Thr Gln Gln Ser
980 985 990
Gly Phe Ser Phe Phe Val Arg His Val Met Arg Glu Ala Leu Ile His
995 1000 1005
Arg Ala Gln Val Asn Gln Ala Ala Leu Leu Thr Tyr His Glu Asn
1010 1015 1020
Ala Ala Leu Thr Gly Lys
1025
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TATk多核苷酸
<400> 3
tacgccagaa aggccgccag gcaggccagg gca 33
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TATk多肽
<400> 4
Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Igk-链前导多核苷酸
<400> 5
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Igk-链前导多肽
<400> 6
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 7
<211> 3318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 115同种型融合蛋白多核苷酸
<400> 7
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttgcggccta cgccagaaag 120
gccgccaggc aggccagggc accggtgaag attcctaaca ttggtaatgt gatgaataaa 180
tttgagatcc ttggggttgt aggtgaagga gcctatggag ttgtacttaa atgcagacac 240
aaggaaacac atgaaattgt ggcgatcaag aaattcaagg acagtgaaga aaatgaagaa 300
gtcaaagaaa cgactttacg agagcttaaa atgcttcgga ctctcaagca ggaaaacatt 360
gtggagttga aggaagcatt tcgtcggagg ggaaagttgt acttggtgtt tgagtatgtt 420
gaaaaaaata tgctcgaatt gctggaagaa atgccaaatg gagttccacc tgagaaagta 480
aaaagctaca tctatcagct aatcaaggct attcactggt gccataagaa tgatattgtc 540
catcgagata taaaaccaga aaatctctta atcagccaca atgatgtcct aaaactgtgt 600
gactttggtt ttgctcgtaa tctgtcagaa ggcaataatg ctaattacac agagtacgtt 660
gccaccagat ggtatcggtc cccagaactc ttacttggcg ctccctatgg aaagtccgtg 720
gacatgtggt cggtgggctg tattcttggg gagcttagcg atggacagcc tttatttcct 780
ggagaaagtg aaattgacca actttttact attcagaagg tgctaggacc acttccatct 840
gagcagatga agcttttcta cagtaatcct cgcttccatg ggctccggtt tccagctgtt 900
aaccatcctc agtccttgga aagaagatac cttggaattt tgaatagtgt tctacttgac 960
ctaatgaaga atttactgaa gttggaccca gctgacagat acttgacaga acagtgtttg 1020
aatcacccta catttcaaac ccagagactt ctggatcgtt ctccttcaag gtcagcaaaa 1080
agaaaacctt accatgtgga aagcagcaca ttgtctaata gaaaccaagc cggcaaaagt 1140
actgctttgc agtctcacca cagatctaac agcaaggaca tccagaacct gagtgtaggc 1200
ctgccccggg ctgacgaagg tctccctgcc aatgaaagct tcctaaatgg aaaccttgct 1260
ggagctagtc ttagtccact gcacaccaaa acctaccaag caagcagcca gcctgggtct 1320
accagcaaag atctcaccaa caacaacata ccacaccttc ttagcccaaa agaagccaag 1380
tcaaaaacag agtttgattt taatattgac ccaaagcctt cagaaggccc agggacaaag 1440
tacctcaagt caaacagcag atctcagcag aaccgccact cattcatgga aagctctcaa 1500
agcaaagctg ggacactgca gcccaatgaa aagcagagtc ggcatagcta tattgacaca 1560
attccccagt cctctaggag tccctcctac aggaccaagg ccaaaagcca tggggcactg 1620
agtgactcca agtctgtgag caacctttct gaagccaggg cccaaattgc ggagcccagt 1680
accagtaggt acttcccatc tagctgctta gacttgaatt ctcccaccag cccaaccccc 1740
accagacaca gtgacacgag aactttgctc agcccttctg gaagaaataa ccgaaatgag 1800
ggaacgctgg actcacgtcg aaccacaacc agacattcta agacgatgga ggaattgaag 1860
ctgccggagc acatggacag tagccattcc cattcactgt ctgcacctca cgaatctttt 1920
tcttatggac tgggctacac cagccccttt tcttcccagc aacgtcctca taggcattct 1980
atgtatgtga cccgtgacaa agtgagagcc aagggcttgg atggaagctt gagcataggg 2040
caagggatgg cagctagagc caacagcctg caactcttgt caccccagcc tggagaacag 2100
ctccctccag agatgactgt ggcaagatct tcggtcaaag agacctccag agaaggcacc 2160
tcttccttcc atacacgcca gaagtctgag ggtggagtgt atcatgaccc acactctgat 2220
gatggcacag cccccaaaga aaatagacac ctatacaatg atcctgtgcc aaggagagtt 2280
ggtagctttt acagagtgcc atctccacgt ccagacaatt ctttccatga aaataatgtg 2340
tcaactagag tttcttctct accatcagag agcagttctg gaaccaacca ctcaaaaaga 2400
caaccagcat tcgatccatg gaaaagtcct gaaaatatta gtcattcaga gcaactcaag 2460
gaaaaagaga agcaaggatt tttcaggtca atgaaaaaga aaaagaagaa atctcaaaca 2520
gtacccaatt ccgacagccc tgatcttctg acgttgcaga aatccattca ttctgctagc 2580
actccaagca gcagaccaaa ggagtggcgc cccgagaaga tctcagatct gcagacccaa 2640
agccagccat taaaatcact gcgcaagttg ttacatctct cttcggcctc aaatcacccg 2700
gcttcctcag atccccgctt ccagccctta acagctcaac aaaccaaaaa ttccttctca 2760
gaaattcgga ttcaccccct gagccaggcc tctggcggga gcagcaacat ccggcaggaa 2820
cccgcaccga agggcaggcc agccctccag ctgccagacg gtggatgtga tggcagaaga 2880
cagagacacc attctggacc ccaagataga cgcttcatgt taaggacgac agaacaacaa 2940
ggagaatact tctgctgtgg tgacccaaag aagcctcaca ctccgtgcgt cccaaaccga 3000
gcccttcatc gtccaatctc cagtcctgct ccctatccag tactccaggt ccgaggcact 3060
tccatgtgcc cgacactcca ggtccgaggc actgatgctt tcagctgccc aacccagcaa 3120
tccgggttct ctttcttcgt gagacacgtt atgagggaag ccctgattca cagggcccag 3180
gtaaaccaag ctgcgctcct gacataccat gagaatgcgg cactgacggg caagtccgct 3240
cgaggagggc ccgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc cgtcgaccat 3300
catcatcatc atcattga 3318
<210> 8
<211> 1105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 115同种型融合蛋白多肽
<400> 8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr
20 25 30
Lys Leu Ala Ala Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Pro
35 40 45
Val Lys Ile Pro Asn Ile Gly Asn Val Met Asn Lys Phe Glu Ile Leu
50 55 60
Gly Val Val Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu Lys Cys Arg His
65 70 75 80
Lys Glu Thr His Glu Ile Val Ala Ile Lys Lys Phe Lys Asp Ser Glu
85 90 95
Glu Asn Glu Glu Val Lys Glu Thr Thr Leu Arg Glu Leu Lys Met Leu
100 105 110
Arg Thr Leu Lys Gln Glu Asn Ile Val Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg
115 120 125
Arg Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Val Glu Lys Asn Met
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Glu Glu Met Pro Asn Gly Val Pro Pro Glu Lys Val
145 150 155 160
Lys Ser Tyr Ile Tyr Gln Leu Ile Lys Ala Ile His Trp Cys His Lys
165 170 175
Asn Asp Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Ser
180 185 190
His Asn Asp Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Phe Ala Arg Asn Leu
195 200 205
Ser Glu Gly Asn Asn Ala Asn Tyr Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp
210 215 220
Tyr Arg Ser Pro Glu Leu Leu Leu Gly Ala Pro Tyr Gly Lys Ser Val
225 230 235 240
Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Leu Ser Asp Gly Gln
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ser Leu Glu Arg Arg Tyr Leu Gly Ile Leu Asn Ser Val Leu Leu Asp
305 310 315 320
Leu Met Lys Asn Leu Leu Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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465 470 475 480
Tyr Leu Lys Ser Asn Ser Arg Ser Gln Gln Asn Arg His Ser Phe Met
485 490 495
Glu Ser Ser Gln Ser Lys Ala Gly Thr Leu Gln Pro Asn Glu Lys Gln
500 505 510
Ser Arg His Ser Tyr Ile Asp Thr Ile Pro Gln Ser Ser Arg Ser Pro
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565 570 575
Ser Pro Thr Pro Thr Arg His Ser Asp Thr Arg Thr Leu Leu Ser Pro
580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
His Arg His Ser Met Tyr Val Thr Arg Asp Lys Val Arg Ala Lys Gly
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Leu Asp Gly Ser Leu Ser Ile Gly Gln Gly Met Ala Ala Arg Ala Asn
675 680 685
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Met Thr Val Ala Arg Ser Ser Val Lys Glu Thr Ser Arg Glu Gly Thr
705 710 715 720
Ser Ser Phe His Thr Arg Gln Lys Ser Glu Gly Gly Val Tyr His Asp
725 730 735
Pro His Ser Asp Asp Gly Thr Ala Pro Lys Glu Asn Arg His Leu Tyr
740 745 750
Asn Asp Pro Val Pro Arg Arg Val Gly Ser Phe Tyr Arg Val Pro Ser
755 760 765
Pro Arg Pro Asp Asn Ser Phe His Glu Asn Asn Val Ser Thr Arg Val
770 775 780
Ser Ser Leu Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gly Thr Asn His Ser Lys Arg
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820 825 830
Lys Lys Lys Lys Lys Ser Gln Thr Val Pro Asn Ser Asp Ser Pro Asp
835 840 845
Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Ile His Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser
850 855 860
Arg Pro Lys Glu Trp Arg Pro Glu Lys Ile Ser Asp Leu Gln Thr Gln
865 870 875 880
Ser Gln Pro Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu His Leu Ser Ser Ala
885 890 895
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900 905 910
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Gln Arg His His Ser Gly Pro Gln Asp Arg Arg Phe Met Leu Arg Thr
965 970 975
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980 985 990
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Pro Ala Pro Tyr Pro Val Leu Gln Val Arg Gly Thr Ser Met Cys
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Pro Thr Leu Gln Val Arg Gly Thr Asp Ala Phe Ser Cys Pro Thr
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1055 1060 1065
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1085 1090 1095
Asp His His His His His His
1100 1105
<210> 9
<211> 4072
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 115同种型融合蛋白多核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (11)..(13)
<223> 甲硫氨酸起始密码子
<400> 9
gctagccacc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg 60
ttccactggt gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttgcggccta 120
cgccagaaag gccgccaggc aggccagggc accggtcgcc accatggtga gcaagggcga 180
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 240
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 300
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 360
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 420
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 480
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 540
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 600
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 660
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 720
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 780
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 840
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tccggactca gatctcgagc 900
gaagattcct aacattggta atgtgatgaa taaatttgag atccttgggg ttgtaggtga 960
aggagcctat ggagttgtac ttaaatgcag acacaaggaa acacatgaaa ttgtggcgat 1020
caagaaattc aaggacagtg aagaaaatga agaagtcaaa gaaacgactt tacgagagct 1080
taaaatgctt cggactctca agcaggaaaa cattgtggag ttgaaggaag catttcgtcg 1140
gaggggaaag ttgtacttgg tgtttgagta tgttgaaaaa aatatgctcg aattgctgga 1200
agaaatgcca aatggagttc cacctgagaa agtaaaaagc tacatctatc agctaatcaa 1260
ggctattcac tggtgccata agaatgatat tgtccatcga gatataaaac cagaaaatct 1320
cttaatcagc cacaatgatg tcctaaaact gtgtgacttt ggttttgctc gtaatctgtc 1380
agaaggcaat aatgctaatt acacagagta cgttgccacc agatggtatc ggtccccaga 1440
actcttactt ggcgctccct atggaaagtc cgtggacatg tggtcggtgg gctgtattct 1500
tggggagctt agcgatggac agcctttatt tcctggagaa agtgaaattg accaactttt 1560
tactattcag aaggtgctag gaccacttcc atctgagcag atgaagcttt tctacagtaa 1620
tcctcgcttc catgggctcc ggtttccagc tgttaaccat cctcagtcct tggaaagaag 1680
ataccttgga attttgaata gtgttctact tgacctaatg aagaatttac tgaagttgga 1740
cccagctgac agatacttga cagaacagtg tttgaatcac cctacatttc aaacccagag 1800
acttctggat cgttctcctt caaggtcagc aaaaagaaaa ccttaccatg tggaaagcag 1860
cacattgtct aatagaaacc aagccggcaa aagtactgct ttgcagtctc accacagatc 1920
taacagcaag gacatccaga acctgagtgt aggcctgccc cgggctgacg aaggtctccc 1980
tgccaatgaa agcttcctaa atggaaacct tgctggagct agtcttagtc cactgcacac 2040
caaaacctac caagcaagca gccagcctgg gtctaccagc aaagatctca ccaacaacaa 2100
cataccacac cttcttagcc caaaagaagc caagtcaaaa acagagtttg attttaatat 2160
tgacccaaag ccttcagaag gcccagggac aaagtacctc aagtcaaaca gcagatctca 2220
gcagaaccgc cactcattca tggaaagctc tcaaagcaaa gctgggacac tgcagcccaa 2280
tgaaaagcag agtcggcata gctatattga cacaattccc cagtcctcta ggagtccctc 2340
ctacaggacc aaggccaaaa gccatggggc actgagtgac tccaagtctg tgagcaacct 2400
ttctgaagcc agggcccaaa ttgcggagcc cagtaccagt aggtacttcc catctagctg 2460
cttagacttg aattctccca ccagcccaac ccccaccaga cacagtgaca cgagaacttt 2520
gctcagccct tctggaagaa ataaccgaaa tgagggaacg ctggactcac gtcgaaccac 2580
aaccagacat tctaagacga tggaggaatt gaagctgccg gagcacatgg acagtagcca 2640
ttcccattca ctgtctgcac ctcacgaatc tttttcttat ggactgggct acaccagccc 2700
cttttcttcc cagcaacgtc ctcataggca ttctatgtat gtgacccgtg acaaagtgag 2760
agccaagggc ttggatggaa gcttgagcat agggcaaggg atggcagcta gagccaacag 2820
cctgcaactc ttgtcacccc agcctggaga acagctccct ccagagatga ctgtggcaag 2880
atcttcggtc aaagagacct ccagagaagg cacctcttcc ttccatacac gccagaagtc 2940
tgagggtgga gtgtatcatg acccacactc tgatgatggc acagccccca aagaaaatag 3000
acacctatac aatgatcctg tgccaaggag agttggtagc ttttacagag tgccatctcc 3060
acgtccagac aattctttcc atgaaaataa tgtgtcaact agagtttctt ctctaccatc 3120
agagagcagt tctggaacca accactcaaa aagacaacca gcattcgatc catggaaaag 3180
tcctgaaaat attagtcatt cagagcaact caaggaaaaa gagaagcaag gatttttcag 3240
gtcaatgaaa aagaaaaaga agaaatctca aacagtaccc aattccgaca gccctgatct 3300
tctgacgttg cagaaatcca ttcattctgc tagcactcca agcagcagac caaaggagtg 3360
gcgccccgag aagatctcag atctgcagac ccaaagccag ccattaaaat cactgcgcaa 3420
gttgttacat ctctcttcgg cctcaaatca cccggcttcc tcagatcccc gcttccagcc 3480
cttaacagct caacaaacca aaaattcctt ctcagaaatt cggattcacc ccctgagcca 3540
ggcctctggc gggagcagca acatccggca ggaacccgca ccgaagggca ggccagccct 3600
ccagctgcca gacggtggat gtgatggcag aagacagaga caccattctg gaccccaaga 3660
tagacgcttc atgttaagga cgacagaaca acaaggagaa tacttctgct gtggtgaccc 3720
aaagaagcct cacactccgt gcgtcccaaa ccgagccctt catcgtccaa tctccagtcc 3780
tgctccctat ccagtactcc aggtccgagg cacttccatg tgcccgacac tccaggtccg 3840
aggcactgat gctttcagct gcccaaccca gcaatccggg ttctctttct tcgtgagaca 3900
cgttatgagg gaagccctga ttcacagggc ccaggtaaac caagctgcgc tcctgacata 3960
ccatgagaat gcggcactga cgggcaagtc cgctcgagga gggcccgaac aaaaactcat 4020
ctcagaagag gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat catcatcatt ga 4072
<210> 10
<211> 1353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 115同种型融合蛋白多肽
<400> 10
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr
20 25 30
Lys Leu Ala Ala Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Pro
35 40 45
Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val
50 55 60
Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser
65 70 75 80
Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu
85 90 95
Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu
100 105 110
Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp
115 120 125
His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr
130 135 140
Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu
165 170 175
Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys
180 185 190
Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys
195 200 205
Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu
210 215 220
Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile
225 230 235 240
Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln
245 250 255
Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu
260 265 270
Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu
275 280 285
Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala Lys Ile Pro Asn Ile Gly Asn
290 295 300
Val Met Asn Lys Phe Glu Ile Leu Gly Val Val Gly Glu Gly Ala Tyr
305 310 315 320
Gly Val Val Leu Lys Cys Arg His Lys Glu Thr His Glu Ile Val Ala
325 330 335
Ile Lys Lys Phe Lys Asp Ser Glu Glu Asn Glu Glu Val Lys Glu Thr
340 345 350
Thr Leu Arg Glu Leu Lys Met Leu Arg Thr Leu Lys Gln Glu Asn Ile
355 360 365
Val Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Arg Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Val
370 375 380
Phe Glu Tyr Val Glu Lys Asn Met Leu Glu Leu Leu Glu Glu Met Pro
385 390 395 400
Asn Gly Val Pro Pro Glu Lys Val Lys Ser Tyr Ile Tyr Gln Leu Ile
405 410 415
Lys Ala Ile His Trp Cys His Lys Asn Asp Ile Val His Arg Asp Ile
420 425 430
Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Ser His Asn Asp Val Leu Lys Leu Cys
435 440 445
Asp Phe Gly Phe Ala Arg Asn Leu Ser Glu Gly Asn Asn Ala Asn Tyr
450 455 460
Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ser Pro Glu Leu Leu Leu
465 470 475 480
Gly Ala Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile
485 490 495
Leu Gly Glu Leu Ser Asp Gly Gln Pro Leu Phe Pro Gly Glu Ser Glu
500 505 510
Ile Asp Gln Leu Phe Thr Ile Gln Lys Val Leu Gly Pro Leu Pro Ser
515 520 525
Glu Gln Met Lys Leu Phe Tyr Ser Asn Pro Arg Phe His Gly Leu Arg
530 535 540
Phe Pro Ala Val Asn His Pro Gln Ser Leu Glu Arg Arg Tyr Leu Gly
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Val Leu Leu Asp Leu Met Lys Asn Leu Leu Lys Leu
565 570 575
Asp Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Glu Gln Cys Leu Asn His Pro Thr
580 585 590
Phe Gln Thr Gln Arg Leu Leu Asp Arg Ser Pro Ser Arg Ser Ala Lys
595 600 605
Arg Lys Pro Tyr His Val Glu Ser Ser Thr Leu Ser Asn Arg Asn Gln
610 615 620
Ala Gly Lys Ser Thr Ala Leu Gln Ser His His Arg Ser Asn Ser Lys
625 630 635 640
Asp Ile Gln Asn Leu Ser Val Gly Leu Pro Arg Ala Asp Glu Gly Leu
645 650 655
Pro Ala Asn Glu Ser Phe Leu Asn Gly Asn Leu Ala Gly Ala Ser Leu
660 665 670
Ser Pro Leu His Thr Lys Thr Tyr Gln Ala Ser Ser Gln Pro Gly Ser
675 680 685
Thr Ser Lys Asp Leu Thr Asn Asn Asn Ile Pro His Leu Leu Ser Pro
690 695 700
Lys Glu Ala Lys Ser Lys Thr Glu Phe Asp Phe Asn Ile Asp Pro Lys
705 710 715 720
Pro Ser Glu Gly Pro Gly Thr Lys Tyr Leu Lys Ser Asn Ser Arg Ser
725 730 735
Gln Gln Asn Arg His Ser Phe Met Glu Ser Ser Gln Ser Lys Ala Gly
740 745 750
Thr Leu Gln Pro Asn Glu Lys Gln Ser Arg His Ser Tyr Ile Asp Thr
755 760 765
Ile Pro Gln Ser Ser Arg Ser Pro Ser Tyr Arg Thr Lys Ala Lys Ser
770 775 780
His Gly Ala Leu Ser Asp Ser Lys Ser Val Ser Asn Leu Ser Glu Ala
785 790 795 800
Arg Ala Gln Ile Ala Glu Pro Ser Thr Ser Arg Tyr Phe Pro Ser Ser
805 810 815
Cys Leu Asp Leu Asn Ser Pro Thr Ser Pro Thr Pro Thr Arg His Ser
820 825 830
Asp Thr Arg Thr Leu Leu Ser Pro Ser Gly Arg Asn Asn Arg Asn Glu
835 840 845
Gly Thr Leu Asp Ser Arg Arg Thr Thr Thr Arg His Ser Lys Thr Met
850 855 860
Glu Glu Leu Lys Leu Pro Glu His Met Asp Ser Ser His Ser His Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ala Pro His Glu Ser Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Tyr Thr Ser
885 890 895
Pro Phe Ser Ser Gln Gln Arg Pro His Arg His Ser Met Tyr Val Thr
900 905 910
Arg Asp Lys Val Arg Ala Lys Gly Leu Asp Gly Ser Leu Ser Ile Gly
915 920 925
Gln Gly Met Ala Ala Arg Ala Asn Ser Leu Gln Leu Leu Ser Pro Gln
930 935 940
Pro Gly Glu Gln Leu Pro Pro Glu Met Thr Val Ala Arg Ser Ser Val
945 950 955 960
Lys Glu Thr Ser Arg Glu Gly Thr Ser Ser Phe His Thr Arg Gln Lys
965 970 975
Ser Glu Gly Gly Val Tyr His Asp Pro His Ser Asp Asp Gly Thr Ala
980 985 990
Pro Lys Glu Asn Arg His Leu Tyr Asn Asp Pro Val Pro Arg Arg Val
995 1000 1005
Gly Ser Phe Tyr Arg Val Pro Ser Pro Arg Pro Asp Asn Ser Phe
1010 1015 1020
His Glu Asn Asn Val Ser Thr Arg Val Ser Ser Leu Pro Ser Glu
1025 1030 1035
Ser Ser Ser Gly Thr Asn His Ser Lys Arg Gln Pro Ala Phe Asp
1040 1045 1050
Pro Trp Lys Ser Pro Glu Asn Ile Ser His Ser Glu Gln Leu Lys
1055 1060 1065
Glu Lys Glu Lys Gln Gly Phe Phe Arg Ser Met Lys Lys Lys Lys
1070 1075 1080
Lys Lys Ser Gln Thr Val Pro Asn Ser Asp Ser Pro Asp Leu Leu
1085 1090 1095
Thr Leu Gln Lys Ser Ile His Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser Arg
1100 1105 1110
Pro Lys Glu Trp Arg Pro Glu Lys Ile Ser Asp Leu Gln Thr Gln
1115 1120 1125
Ser Gln Pro Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu His Leu Ser Ser
1130 1135 1140
Ala Ser Asn His Pro Ala Ser Ser Asp Pro Arg Phe Gln Pro Leu
1145 1150 1155
Thr Ala Gln Gln Thr Lys Asn Ser Phe Ser Glu Ile Arg Ile His
1160 1165 1170
Pro Leu Ser Gln Ala Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Arg Gln Glu
1175 1180 1185
Pro Ala Pro Lys Gly Arg Pro Ala Leu Gln Leu Pro Asp Gly Gly
1190 1195 1200
Cys Asp Gly Arg Arg Gln Arg His His Ser Gly Pro Gln Asp Arg
1205 1210 1215
Arg Phe Met Leu Arg Thr Thr Glu Gln Gln Gly Glu Tyr Phe Cys
1220 1225 1230
Cys Gly Asp Pro Lys Lys Pro His Thr Pro Cys Val Pro Asn Arg
1235 1240 1245
Ala Leu His Arg Pro Ile Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Pro Val Leu
1250 1255 1260
Gln Val Arg Gly Thr Ser Met Cys Pro Thr Leu Gln Val Arg Gly
1265 1270 1275
Thr Asp Ala Phe Ser Cys Pro Thr Gln Gln Ser Gly Phe Ser Phe
1280 1285 1290
Phe Val Arg His Val Met Arg Glu Ala Leu Ile His Arg Ala Gln
1295 1300 1305
Val Asn Gln Ala Ala Leu Leu Thr Tyr His Glu Asn Ala Ala Leu
1310 1315 1320
Thr Gly Lys Ser Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1325 1330 1335
Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
1340 1345 1350
<210> 11
<211> 3852
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 107同种型融合蛋白多核苷酸
<400> 11
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttgcggccta cgccagaaag 120
gccgccaggc aggccagggc accggtcgcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc 180
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 240
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 300
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 360
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 420
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 480
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 540
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 600
aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 660
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 720
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 780
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 840
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tccggactca gatctcgagc gaagattcct 900
aacattggta atgtgatgaa taaatttgag atccttgggg ttgtaggtga aggagcctat 960
ggagttgtac ttaaatgcag acacaaggaa acacatgaaa ttgtggcgat caagaaattc 1020
aaggacagtg aagaaaatga agaagtcaaa gaaacgactt tacgagagct taaaatgctt 1080
cggactctca agcaggaaaa cattgtggag ttgaaggaag catttcgtcg gaggggaaag 1140
ttgtacttgg tgtttgagta tgttgaaaaa aatatgctcg aattgctgga agaaatgcca 1200
aatggagttc cacctgagaa agtaaaaagc tacatctatc agctaatcaa ggctattcac 1260
tggtgccata agaatgatat tgtccatcga gatataaaac cagaaaatct cttaatcagc 1320
cacaatgatg tcctaaaact gtgtgacttt ggttttgctc gtaatctgtc agaaggcaat 1380
aatgctaatt acacagagta cgttgccacc agatggtatc ggtccccaga actcttactt 1440
ggcgctccct atggaaagtc cgtggacatg tggtcggtgg gctgtattct tggggagctt 1500
agcgatggac agcctttatt tcctggagaa agtgaaattg accaactttt tactattcag 1560
aaggtgctag gaccacttcc atctgagcag atgaagcttt tctacagtaa tcctcgcttc 1620
catgggctcc ggtttccagc tgttaaccat cctcagtcct tggaaagaag ataccttgga 1680
attttgaata gtgttctact tgacctaatg aagaatttac tgaagttgga cccagctgac 1740
agatacttga cagaacagtg tttgaatcac cctacatttc aaacccagag acttctggat 1800
cgttctcctt caaggtcagc aaaaagaaaa ccttaccatg tggaaagcag cacattgtct 1860
aatagaaacc aagccggcaa aagtactgct ttgcagtctc accacagatc taacagcaag 1920
gacatccaga acctgagtgt aggcctgccc cgggctgacg aaggtctccc tgccaatgaa 1980
agcttcctaa atggaaacct tgctggagct agtcttagtc cactgcacac caaaacctac 2040
caagcaagca gccagcctgg gtctaccagc aaagatctca ccaacaacaa cataccacac 2100
cttcttagcc caaaagaagc caagtcaaaa acagagtttg attttaatat tgacccaaag 2160
ccttcagaag gcccagggac aaagtacctc aagtcaaaca gcagatctca gcagaaccgc 2220
cactcattca tggaaagctc tcaaagcaaa gctgggacac tgcagcccaa tgaaaagcag 2280
agtcggcata gctatattga cacaattccc cagtcctcta ggagtccctc ctacaggacc 2340
aaggccaaaa gccatggggc actgagtgac tccaagtctg tgagcaacct ttctgaagcc 2400
agggcccaaa ttgcggagcc cagtaccagt aggtacttcc catctagctg cttagacttg 2460
aattctccca ccagcccaac ccccaccaga cacagtgaca cgagaacttt gctcagccct 2520
tctggaagaa ataaccgaaa tgagggaacg ctggactcac gtcgaaccac aaccagacat 2580
tctaagacga tggaggaatt gaagctgccg gagcacatgg acagtagcca ttcccattca 2640
ctgtctgcac ctcacgaatc tttttcttat ggactgggct acaccagccc cttttcttcc 2700
cagcaacgtc ctcataggca ttctatgtat gtgacccgtg acaaagtgag agccaagggc 2760
ttggatggaa gcttgagcat agggcaaggg atggcagcta gagccaacag cctgcaactc 2820
ttgtcacccc agcctggaga acagctccct ccagagatga ctgtggcaag atcttcggtc 2880
aaagagacct ccagagaagg cacctcttcc ttccatacac gccagaagtc tgagggtgga 2940
gtgtatcatg acccacactc tgatgatggc acagccccca aagaaaatag acacctatac 3000
aatgatcctg tgccaaggag agttggtagc ttttacagag tgccatctcc acgtccagac 3060
aattctttcc atgaaaataa tgtgtcaact agagtttctt ctctaccatc agagagcagt 3120
tctggaacca accactcaaa aagacaacca gcattcgatc catggaaaag tcctgaaaat 3180
attagtcatt cagagcaact caaggaaaaa gagaagcaag gatttttcag gtcaatgaaa 3240
aagaaaaaga agaaatctca aacagtaccc aattccgaca gccctgatct tctgacgttg 3300
cagaaatcca ttcattctgc tagcactcca agcagcagac caaaggagtg gcgccccgag 3360
aagatctcag atctgcagac ccaaagccag ccattaaaat cactgcgcaa gttgttacat 3420
ctctcttcgg cctcaaatca cccggcttcc tcagatcccc gcttccagcc cttaacagct 3480
caacaaacca aaaattcctt ctcagaaatt cggattcacc ccctgagcca ggcctctggc 3540
gggagcagca acatccggca ggaacccgca ccgaagggca ggccagccct ccagctgcca 3600
ggtcagatgg atcctggttg gcatgtgtcc tctgtgacca ggagtgccac agagggccct 3660
tcctactctg aacagctggg tgccaaaagt gggccaaatg ggcaccccta taacagaaca 3720
aatcgctcac gaatgccaaa tctgaatgat ttaaaagaga cagccttgtc cgctcgagga 3780
gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat 3840
catcatcatt ga 3852
<210> 12
<211> 1283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 107同种型融合蛋白多肽
<400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr
20 25 30
Lys Leu Ala Ala Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Pro
35 40 45
Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val
50 55 60
Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser
65 70 75 80
Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu
85 90 95
Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu
100 105 110
Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp
115 120 125
His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr
130 135 140
Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu
165 170 175
Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys
180 185 190
Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys
195 200 205
Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu
210 215 220
Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile
225 230 235 240
Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln
245 250 255
Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu
260 265 270
Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu
275 280 285
Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala Lys Ile Pro Asn Ile Gly Asn
290 295 300
Val Met Asn Lys Phe Glu Ile Leu Gly Val Val Gly Glu Gly Ala Tyr
305 310 315 320
Gly Val Val Leu Lys Cys Arg His Lys Glu Thr His Glu Ile Val Ala
325 330 335
Ile Lys Lys Phe Lys Asp Ser Glu Glu Asn Glu Glu Val Lys Glu Thr
340 345 350
Thr Leu Arg Glu Leu Lys Met Leu Arg Thr Leu Lys Gln Glu Asn Ile
355 360 365
Val Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Arg Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Val
370 375 380
Phe Glu Tyr Val Glu Lys Asn Met Leu Glu Leu Leu Glu Glu Met Pro
385 390 395 400
Asn Gly Val Pro Pro Glu Lys Val Lys Ser Tyr Ile Tyr Gln Leu Ile
405 410 415
Lys Ala Ile His Trp Cys His Lys Asn Asp Ile Val His Arg Asp Ile
420 425 430
Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Ser His Asn Asp Val Leu Lys Leu Cys
435 440 445
Asp Phe Gly Phe Ala Arg Asn Leu Ser Glu Gly Asn Asn Ala Asn Tyr
450 455 460
Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ser Pro Glu Leu Leu Leu
465 470 475 480
Gly Ala Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile
485 490 495
Leu Gly Glu Leu Ser Asp Gly Gln Pro Leu Phe Pro Gly Glu Ser Glu
500 505 510
Ile Asp Gln Leu Phe Thr Ile Gln Lys Val Leu Gly Pro Leu Pro Ser
515 520 525
Glu Gln Met Lys Leu Phe Tyr Ser Asn Pro Arg Phe His Gly Leu Arg
530 535 540
Phe Pro Ala Val Asn His Pro Gln Ser Leu Glu Arg Arg Tyr Leu Gly
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Val Leu Leu Asp Leu Met Lys Asn Leu Leu Lys Leu
565 570 575
Asp Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Glu Gln Cys Leu Asn His Pro Thr
580 585 590
Phe Gln Thr Gln Arg Leu Leu Asp Arg Ser Pro Ser Arg Ser Ala Lys
595 600 605
Arg Lys Pro Tyr His Val Glu Ser Ser Thr Leu Ser Asn Arg Asn Gln
610 615 620
Ala Gly Lys Ser Thr Ala Leu Gln Ser His His Arg Ser Asn Ser Lys
625 630 635 640
Asp Ile Gln Asn Leu Ser Val Gly Leu Pro Arg Ala Asp Glu Gly Leu
645 650 655
Pro Ala Asn Glu Ser Phe Leu Asn Gly Asn Leu Ala Gly Ala Ser Leu
660 665 670
Ser Pro Leu His Thr Lys Thr Tyr Gln Ala Ser Ser Gln Pro Gly Ser
675 680 685
Thr Ser Lys Asp Leu Thr Asn Asn Asn Ile Pro His Leu Leu Ser Pro
690 695 700
Lys Glu Ala Lys Ser Lys Thr Glu Phe Asp Phe Asn Ile Asp Pro Lys
705 710 715 720
Pro Ser Glu Gly Pro Gly Thr Lys Tyr Leu Lys Ser Asn Ser Arg Ser
725 730 735
Gln Gln Asn Arg His Ser Phe Met Glu Ser Ser Gln Ser Lys Ala Gly
740 745 750
Thr Leu Gln Pro Asn Glu Lys Gln Ser Arg His Ser Tyr Ile Asp Thr
755 760 765
Ile Pro Gln Ser Ser Arg Ser Pro Ser Tyr Arg Thr Lys Ala Lys Ser
770 775 780
His Gly Ala Leu Ser Asp Ser Lys Ser Val Ser Asn Leu Ser Glu Ala
785 790 795 800
Arg Ala Gln Ile Ala Glu Pro Ser Thr Ser Arg Tyr Phe Pro Ser Ser
805 810 815
Cys Leu Asp Leu Asn Ser Pro Thr Ser Pro Thr Pro Thr Arg His Ser
820 825 830
Asp Thr Arg Thr Leu Leu Ser Pro Ser Gly Arg Asn Asn Arg Asn Glu
835 840 845
Gly Thr Leu Asp Ser Arg Arg Thr Thr Thr Arg His Ser Lys Thr Met
850 855 860
Glu Glu Leu Lys Leu Pro Glu His Met Asp Ser Ser His Ser His Ser
865 870 875 880
Leu Ser Ala Pro His Glu Ser Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Tyr Thr Ser
885 890 895
Pro Phe Ser Ser Gln Gln Arg Pro His Arg His Ser Met Tyr Val Thr
900 905 910
Arg Asp Lys Val Arg Ala Lys Gly Leu Asp Gly Ser Leu Ser Ile Gly
915 920 925
Gln Gly Met Ala Ala Arg Ala Asn Ser Leu Gln Leu Leu Ser Pro Gln
930 935 940
Pro Gly Glu Gln Leu Pro Pro Glu Met Thr Val Ala Arg Ser Ser Val
945 950 955 960
Lys Glu Thr Ser Arg Glu Gly Thr Ser Ser Phe His Thr Arg Gln Lys
965 970 975
Ser Glu Gly Gly Val Tyr His Asp Pro His Ser Asp Asp Gly Thr Ala
980 985 990
Pro Lys Glu Asn Arg His Leu Tyr Asn Asp Pro Val Pro Arg Arg Val
995 1000 1005
Gly Ser Phe Tyr Arg Val Pro Ser Pro Arg Pro Asp Asn Ser Phe
1010 1015 1020
His Glu Asn Asn Val Ser Thr Arg Val Ser Ser Leu Pro Ser Glu
1025 1030 1035
Ser Ser Ser Gly Thr Asn His Ser Lys Arg Gln Pro Ala Phe Asp
1040 1045 1050
Pro Trp Lys Ser Pro Glu Asn Ile Ser His Ser Glu Gln Leu Lys
1055 1060 1065
Glu Lys Glu Lys Gln Gly Phe Phe Arg Ser Met Lys Lys Lys Lys
1070 1075 1080
Lys Lys Ser Gln Thr Val Pro Asn Ser Asp Ser Pro Asp Leu Leu
1085 1090 1095
Thr Leu Gln Lys Ser Ile His Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser Arg
1100 1105 1110
Pro Lys Glu Trp Arg Pro Glu Lys Ile Ser Asp Leu Gln Thr Gln
1115 1120 1125
Ser Gln Pro Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu His Leu Ser Ser
1130 1135 1140
Ala Ser Asn His Pro Ala Ser Ser Asp Pro Arg Phe Gln Pro Leu
1145 1150 1155
Thr Ala Gln Gln Thr Lys Asn Ser Phe Ser Glu Ile Arg Ile His
1160 1165 1170
Pro Leu Ser Gln Ala Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Arg Gln Glu
1175 1180 1185
Pro Ala Pro Lys Gly Arg Pro Ala Leu Gln Leu Pro Gly Gln Met
1190 1195 1200
Asp Pro Gly Trp His Val Ser Ser Val Thr Arg Ser Ala Thr Glu
1205 1210 1215
Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Gln Leu Gly Ala Lys Ser Gly Pro Asn
1220 1225 1230
Gly His Pro Tyr Asn Arg Thr Asn Arg Ser Arg Met Pro Asn Leu
1235 1240 1245
Asn Asp Leu Lys Glu Thr Ala Leu Ser Ala Arg Gly Gly Pro Glu
1250 1255 1260
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His
1265 1270 1275
His His His His His
1280
<210> 13
<211> 3121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 107同种型融合蛋白多核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (11)..(13)
<223> 甲硫氨酸起始密码子
<400> 13
gctagccacc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg 60
ttccactggt gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttgcggccta 120
cgccagaaag gccgccaggc aggccagggc accggtgaag attcctaaca ttggtaatgt 180
gatgaataaa tttgagatcc ttggggttgt aggtgaagga gcctatggag ttgtacttaa 240
atgcagacac aaggaaacac atgaaattgt ggcgatcaag aaattcaagg acagtgaaga 300
aaatgaagaa gtcaaagaaa cgactttacg agagcttaaa atgcttcgga ctctcaagca 360
ggaaaacatt gtggagttga aggaagcatt tcgtcggagg ggaaagttgt acttggtgtt 420
tgagtatgtt gaaaaaaata tgctcgaatt gctggaagaa atgccaaatg gagttccacc 480
tgagaaagta aaaagctaca tctatcagct aatcaaggct attcactggt gccataagaa 540
tgatattgtc catcgagata taaaaccaga aaatctctta atcagccaca atgatgtcct 600
aaaactgtgt gactttggtt ttgctcgtaa tctgtcagaa ggcaataatg ctaattacac 660
agagtacgtt gccaccagat ggtatcggtc cccagaactc ttacttggcg ctccctatgg 720
aaagtccgtg gacatgtggt cggtgggctg tattcttggg gagcttagcg atggacagcc 780
tttatttcct ggagaaagtg aaattgacca actttttact attcagaagg tgctaggacc 840
acttccatct gagcagatga agcttttcta cagtaatcct cgcttccatg ggctccggtt 900
tccagctgtt aaccatcctc agtccttgga aagaagatac cttggaattt tgaatagtgt 960
tctacttgac ctaatgaaga atttactgaa gttggaccca gctgacagat acttgacaga 1020
acagtgtttg aatcacccta catttcaaac ccagagactt ctggatcgtt ctccttcaag 1080
gtcagcaaaa agaaaacctt accatgtgga aagcagcaca ttgtctaata gaaaccaagc 1140
cggcaaaagt actgctttgc agtctcacca cagatctaac agcaaggaca tccagaacct 1200
gagtgtaggc ctgccccggg ctgacgaagg tctccctgcc aatgaaagct tcctaaatgg 1260
aaaccttgct ggagctagtc ttagtccact gcacaccaaa acctaccaag caagcagcca 1320
gcctgggtct accagcaaag atctcaccaa caacaacata ccacaccttc ttagcccaaa 1380
agaagccaag tcaaaaacag agtttgattt taatattgac ccaaagcctt cagaaggccc 1440
agggacaaag tacctcaagt caaacagcag atctcagcag aaccgccact cattcatgga 1500
aagctctcaa agcaaagctg ggacactgca gcccaatgaa aagcagagtc ggcatagcta 1560
tattgacaca attccccagt cctctaggag tccctcctac aggaccaagg ccaaaagcca 1620
tggggcactg agtgactcca agtctgtgag caacctttct gaagccaggg cccaaattgc 1680
ggagcccagt accagtaggt acttcccatc tagctgctta gacttgaatt ctcccaccag 1740
cccaaccccc accagacaca gtgacacgag aactttgctc agcccttctg gaagaaataa 1800
ccgaaatgag ggaacgctgg actcacgtcg aaccacaacc agacattcta agacgatgga 1860
ggaattgaag ctgccggagc acatggacag tagccattcc cattcactgt ctgcacctca 1920
cgaatctttt tcttatggac tgggctacac cagccccttt tcttcccagc aacgtcctca 1980
taggcattct atgtatgtga cccgtgacaa agtgagagcc aagggcttgg atggaagctt 2040
gagcataggg caagggatgg cagctagagc caacagcctg caactcttgt caccccagcc 2100
tggagaacag ctccctccag agatgactgt ggcaagatct tcggtcaaag agacctccag 2160
agaaggcacc tcttccttcc atacacgcca gaagtctgag ggtggagtgt atcatgaccc 2220
acactctgat gatggcacag cccccaaaga aaatagacac ctatacaatg atcctgtgcc 2280
aaggagagtt ggtagctttt acagagtgcc atctccacgt ccagacaatt ctttccatga 2340
aaataatgtg tcaactagag tttcttctct accatcagag agcagttctg gaaccaacca 2400
ctcaaaaaga caaccagcat tcgatccatg gaaaagtcct gaaaatatta gtcattcaga 2460
gcaactcaag gaaaaagaga agcaaggatt tttcaggtca atgaaaaaga aaaagaagaa 2520
atctcaaaca gtacccaatt ccgacagccc tgatcttctg acgttgcaga aatccattca 2580
ttctgctagc actccaagca gcagaccaaa ggagtggcgc cccgagaaga tctcagatct 2640
gcagacccaa agccagccat taaaatcact gcgcaagttg ttacatctct cttcggcctc 2700
aaatcacccg gcttcctcag atccccgctt ccagccctta acagctcaac aaaccaaaaa 2760
ttccttctca gaaattcgga ttcaccccct gagccaggcc tctggcggga gcagcaacat 2820
ccggcaggaa cccgcaccga agggcaggcc agccctccag ctgccaggtc agatggatcc 2880
tggttggcat gtgtcctctg tgaccaggag tgccacagag ggcccttcct actctgaaca 2940
gctgggtgcc aaaagtgggc caaatgggca cccctataac agaacaaatc gctcacgaat 3000
gccaaatctg aatgatttaa aagagacagc cttgtctaga ggatcccggg ctgactacaa 3060
agaccatgac ggtgattata aagatcatga catcgactac aaggatgacg atgacaagta 3120
g 3121
<210> 14
<211> 1036
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 107同种型融合蛋白多肽
<400> 14
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr
20 25 30
Lys Leu Ala Ala Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Pro
35 40 45
Val Lys Ile Pro Asn Ile Gly Asn Val Met Asn Lys Phe Glu Ile Leu
50 55 60
Gly Val Val Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu Lys Cys Arg His
65 70 75 80
Lys Glu Thr His Glu Ile Val Ala Ile Lys Lys Phe Lys Asp Ser Glu
85 90 95
Glu Asn Glu Glu Val Lys Glu Thr Thr Leu Arg Glu Leu Lys Met Leu
100 105 110
Arg Thr Leu Lys Gln Glu Asn Ile Val Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg
115 120 125
Arg Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Val Glu Lys Asn Met
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Glu Glu Met Pro Asn Gly Val Pro Pro Glu Lys Val
145 150 155 160
Lys Ser Tyr Ile Tyr Gln Leu Ile Lys Ala Ile His Trp Cys His Lys
165 170 175
Asn Asp Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Ser
180 185 190
His Asn Asp Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Phe Ala Arg Asn Leu
195 200 205
Ser Glu Gly Asn Asn Ala Asn Tyr Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp
210 215 220
Tyr Arg Ser Pro Glu Leu Leu Leu Gly Ala Pro Tyr Gly Lys Ser Val
225 230 235 240
Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Leu Ser Asp Gly Gln
245 250 255
Pro Leu Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ile Asp Gln Leu Phe Thr Ile Gln
260 265 270
Lys Val Leu Gly Pro Leu Pro Ser Glu Gln Met Lys Leu Phe Tyr Ser
275 280 285
Asn Pro Arg Phe His Gly Leu Arg Phe Pro Ala Val Asn His Pro Gln
290 295 300
Ser Leu Glu Arg Arg Tyr Leu Gly Ile Leu Asn Ser Val Leu Leu Asp
305 310 315 320
Leu Met Lys Asn Leu Leu Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Thr
325 330 335
Glu Gln Cys Leu Asn His Pro Thr Phe Gln Thr Gln Arg Leu Leu Asp
340 345 350
Arg Ser Pro Ser Arg Ser Ala Lys Arg Lys Pro Tyr His Val Glu Ser
355 360 365
Ser Thr Leu Ser Asn Arg Asn Gln Ala Gly Lys Ser Thr Ala Leu Gln
370 375 380
Ser His His Arg Ser Asn Ser Lys Asp Ile Gln Asn Leu Ser Val Gly
385 390 395 400
Leu Pro Arg Ala Asp Glu Gly Leu Pro Ala Asn Glu Ser Phe Leu Asn
405 410 415
Gly Asn Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ser Pro Leu His Thr Lys Thr Tyr
420 425 430
Gln Ala Ser Ser Gln Pro Gly Ser Thr Ser Lys Asp Leu Thr Asn Asn
435 440 445
Asn Ile Pro His Leu Leu Ser Pro Lys Glu Ala Lys Ser Lys Thr Glu
450 455 460
Phe Asp Phe Asn Ile Asp Pro Lys Pro Ser Glu Gly Pro Gly Thr Lys
465 470 475 480
Tyr Leu Lys Ser Asn Ser Arg Ser Gln Gln Asn Arg His Ser Phe Met
485 490 495
Glu Ser Ser Gln Ser Lys Ala Gly Thr Leu Gln Pro Asn Glu Lys Gln
500 505 510
Ser Arg His Ser Tyr Ile Asp Thr Ile Pro Gln Ser Ser Arg Ser Pro
515 520 525
Ser Tyr Arg Thr Lys Ala Lys Ser His Gly Ala Leu Ser Asp Ser Lys
530 535 540
Ser Val Ser Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ala Gln Ile Ala Glu Pro Ser
545 550 555 560
Thr Ser Arg Tyr Phe Pro Ser Ser Cys Leu Asp Leu Asn Ser Pro Thr
565 570 575
Ser Pro Thr Pro Thr Arg His Ser Asp Thr Arg Thr Leu Leu Ser Pro
580 585 590
Ser Gly Arg Asn Asn Arg Asn Glu Gly Thr Leu Asp Ser Arg Arg Thr
595 600 605
Thr Thr Arg His Ser Lys Thr Met Glu Glu Leu Lys Leu Pro Glu His
610 615 620
Met Asp Ser Ser His Ser His Ser Leu Ser Ala Pro His Glu Ser Phe
625 630 635 640
Ser Tyr Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Pro Phe Ser Ser Gln Gln Arg Pro
645 650 655
His Arg His Ser Met Tyr Val Thr Arg Asp Lys Val Arg Ala Lys Gly
660 665 670
Leu Asp Gly Ser Leu Ser Ile Gly Gln Gly Met Ala Ala Arg Ala Asn
675 680 685
Ser Leu Gln Leu Leu Ser Pro Gln Pro Gly Glu Gln Leu Pro Pro Glu
690 695 700
Met Thr Val Ala Arg Ser Ser Val Lys Glu Thr Ser Arg Glu Gly Thr
705 710 715 720
Ser Ser Phe His Thr Arg Gln Lys Ser Glu Gly Gly Val Tyr His Asp
725 730 735
Pro His Ser Asp Asp Gly Thr Ala Pro Lys Glu Asn Arg His Leu Tyr
740 745 750
Asn Asp Pro Val Pro Arg Arg Val Gly Ser Phe Tyr Arg Val Pro Ser
755 760 765
Pro Arg Pro Asp Asn Ser Phe His Glu Asn Asn Val Ser Thr Arg Val
770 775 780
Ser Ser Leu Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gly Thr Asn His Ser Lys Arg
785 790 795 800
Gln Pro Ala Phe Asp Pro Trp Lys Ser Pro Glu Asn Ile Ser His Ser
805 810 815
Glu Gln Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Gly Phe Phe Arg Ser Met Lys
820 825 830
Lys Lys Lys Lys Lys Ser Gln Thr Val Pro Asn Ser Asp Ser Pro Asp
835 840 845
Leu Leu Thr Leu Gln Lys Ser Ile His Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser
850 855 860
Arg Pro Lys Glu Trp Arg Pro Glu Lys Ile Ser Asp Leu Gln Thr Gln
865 870 875 880
Ser Gln Pro Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu His Leu Ser Ser Ala
885 890 895
Ser Asn His Pro Ala Ser Ser Asp Pro Arg Phe Gln Pro Leu Thr Ala
900 905 910
Gln Gln Thr Lys Asn Ser Phe Ser Glu Ile Arg Ile His Pro Leu Ser
915 920 925
Gln Ala Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Arg Gln Glu Pro Ala Pro Lys
930 935 940
Gly Arg Pro Ala Leu Gln Leu Pro Gly Gln Met Asp Pro Gly Trp His
945 950 955 960
Val Ser Ser Val Thr Arg Ser Ala Thr Glu Gly Pro Ser Tyr Ser Glu
965 970 975
Gln Leu Gly Ala Lys Ser Gly Pro Asn Gly His Pro Tyr Asn Arg Thr
980 985 990
Asn Arg Ser Arg Met Pro Asn Leu Asn Asp Leu Lys Glu Thr Ala Leu
995 1000 1005
Ser Arg Gly Ser Arg Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr
1010 1015 1020
Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1025 1030 1035
<210> 15
<211> 2877
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 107同种型多核苷酸
<400> 15
aagattccta acattggtaa tgtgatgaat aaatttgaga tccttggggt tgtaggtgaa 60
ggagcctatg gagttgtact taaatgcaga cacaaggaaa cacatgaaat tgtggcgatc 120
aagaaattca aggacagtga agaaaatgaa gaagtcaaag aaacgacttt acgagagctt 180
aaaatgcttc ggactctcaa gcaggaaaac attgtggagt tgaaggaagc atttcgtcgg 240
aggggaaagt tgtacttggt gtttgagtat gttgaaaaaa atatgctcga attgctggaa 300
gaaatgccaa atggagttcc acctgagaaa gtaaaaagct acatctatca gctaatcaag 360
gctattcact ggtgccataa gaatgatatt gtccatcgag atataaaacc agaaaatctc 420
ttaatcagcc acaatgatgt cctaaaactg tgtgactttg gttttgctcg taatctgtca 480
gaaggcaata atgctaatta cacagagtac gttgccacca gatggtatcg gtccccagaa 540
ctcttacttg gcgctcccta tggaaagtcc gtggacatgt ggtcggtggg ctgtattctt 600
ggggagctta gcgatggaca gcctttattt cctggagaaa gtgaaattga ccaacttttt 660
actattcaga aggtgctagg accacttcca tctgagcaga tgaagctttt ctacagtaat 720
cctcgcttcc atgggctccg gtttccagct gttaaccatc ctcagtcctt ggaaagaaga 780
taccttggaa ttttgaatag tgttctactt gacctaatga agaatttact gaagttggac 840
ccagctgaca gatacttgac agaacagtgt ttgaatcacc ctacatttca aacccagaga 900
cttctggatc gttctccttc aaggtcagca aaaagaaaac cttaccatgt ggaaagcagc 960
acattgtcta atagaaacca agccggcaaa agtactgctt tgcagtctca ccacagatct 1020
aacagcaagg acatccagaa cctgagtgta ggcctgcccc gggctgacga aggtctccct 1080
gccaatgaaa gcttcctaaa tggaaacctt gctggagcta gtcttagtcc actgcacacc 1140
aaaacctacc aagcaagcag ccagcctggg tctaccagca aagatctcac caacaacaac 1200
ataccacacc ttcttagccc aaaagaagcc aagtcaaaaa cagagtttga ttttaatatt 1260
gacccaaagc cttcagaagg cccagggaca aagtacctca agtcaaacag cagatctcag 1320
cagaaccgcc actcattcat ggaaagctct caaagcaaag ctgggacact gcagcccaat 1380
gaaaagcaga gtcggcatag ctatattgac acaattcccc agtcctctag gagtccctcc 1440
tacaggacca aggccaaaag ccatggggca ctgagtgact ccaagtctgt gagcaacctt 1500
tctgaagcca gggcccaaat tgcggagccc agtaccagta ggtacttccc atctagctgc 1560
ttagacttga attctcccac cagcccaacc cccaccagac acagtgacac gagaactttg 1620
ctcagccctt ctggaagaaa taaccgaaat gagggaacgc tggactcacg tcgaaccaca 1680
accagacatt ctaagacgat ggaggaattg aagctgccgg agcacatgga cagtagccat 1740
tcccattcac tgtctgcacc tcacgaatct ttttcttatg gactgggcta caccagcccc 1800
ttttcttccc agcaacgtcc tcataggcat tctatgtatg tgacccgtga caaagtgaga 1860
gccaagggct tggatggaag cttgagcata gggcaaggga tggcagctag agccaacagc 1920
ctgcaactct tgtcacccca gcctggagaa cagctccctc cagagatgac tgtggcaaga 1980
tcttcggtca aagagacctc cagagaaggc acctcttcct tccatacacg ccagaagtct 2040
gagggtggag tgtatcatga cccacactct gatgatggca cagcccccaa agaaaataga 2100
cacctataca atgatcctgt gccaaggaga gttggtagct tttacagagt gccatctcca 2160
cgtccagaca attctttcca tgaaaataat gtgtcaacta gagtttcttc tctaccatca 2220
gagagcagtt ctggaaccaa ccactcaaaa agacaaccag cattcgatcc atggaaaagt 2280
cctgaaaata ttagtcattc agagcaactc aaggaaaaag agaagcaagg atttttcagg 2340
tcaatgaaaa agaaaaagaa gaaatctcaa acagtaccca attccgacag ccctgatctt 2400
ctgacgttgc agaaatccat tcattctgct agcactccaa gcagcagacc aaaggagtgg 2460
cgccccgaga agatctcaga tctgcagacc caaagccagc cattaaaatc actgcgcaag 2520
ttgttacatc tctcttcggc ctcaaatcac ccggcttcct cagatccccg cttccagccc 2580
ttaacagctc aacaaaccaa aaattccttc tcagaaattc ggattcaccc cctgagccag 2640
gcctctggcg ggagcagcaa catccggcag gaacccgcac cgaagggcag gccagccctc 2700
cagctgccag gtcagatgga tcctggttgg catgtgtcct ctgtgaccag gagtgccaca 2760
gagggccctt cctactctga acagctgggt gccaaaagtg ggccaaatgg gcacccctat 2820
aacagaacaa atcgctcacg aatgccaaat ctgaatgatt taaaagagac agccttg 2877
<210> 16
<211> 959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDKL5 107同种型多肽
<400> 16
Lys Ile Pro Asn Ile Gly Asn Val Met Asn Lys Phe Glu Ile Leu Gly
1 5 10 15
Val Val Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu Lys Cys Arg His Lys
20 25 30
Glu Thr His Glu Ile Val Ala Ile Lys Lys Phe Lys Asp Ser Glu Glu
35 40 45
Asn Glu Glu Val Lys Glu Thr Thr Leu Arg Glu Leu Lys Met Leu Arg
50 55 60
Thr Leu Lys Gln Glu Asn Ile Val Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Val Glu Lys Asn Met Leu
85 90 95
Glu Leu Leu Glu Glu Met Pro Asn Gly Val Pro Pro Glu Lys Val Lys
100 105 110
Ser Tyr Ile Tyr Gln Leu Ile Lys Ala Ile His Trp Cys His Lys Asn
115 120 125
Asp Ile Val His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile Ser His
130 135 140
Asn Asp Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Phe Ala Arg Asn Leu Ser
145 150 155 160
Glu Gly Asn Asn Ala Asn Tyr Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr
165 170 175
Arg Ser Pro Glu Leu Leu Leu Gly Ala Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp
180 185 190
Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Gly Glu Leu Ser Asp Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ile Asp Gln Leu Phe Thr Ile Gln Lys
210 215 220
Val Leu Gly Pro Leu Pro Ser Glu Gln Met Lys Leu Phe Tyr Ser Asn
225 230 235 240
Pro Arg Phe His Gly Leu Arg Phe Pro Ala Val Asn His Pro Gln Ser
245 250 255
Leu Glu Arg Arg Tyr Leu Gly Ile Leu Asn Ser Val Leu Leu Asp Leu
260 265 270
Met Lys Asn Leu Leu Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Glu
275 280 285
Gln Cys Leu Asn His Pro Thr Phe Gln Thr Gln Arg Leu Leu Asp Arg
290 295 300
Ser Pro Ser Arg Ser Ala Lys Arg Lys Pro Tyr His Val Glu Ser Ser
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Arg Asn Gln Ala Gly Lys Ser Thr Ala Leu Gln Ser
325 330 335
His His Arg Ser Asn Ser Lys Asp Ile Gln Asn Leu Ser Val Gly Leu
340 345 350
Pro Arg Ala Asp Glu Gly Leu Pro Ala Asn Glu Ser Phe Leu Asn Gly
355 360 365
Asn Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ser Pro Leu His Thr Lys Thr Tyr Gln
370 375 380
Ala Ser Ser Gln Pro Gly Ser Thr Ser Lys Asp Leu Thr Asn Asn Asn
385 390 395 400
Ile Pro His Leu Leu Ser Pro Lys Glu Ala Lys Ser Lys Thr Glu Phe
405 410 415
Asp Phe Asn Ile Asp Pro Lys Pro Ser Glu Gly Pro Gly Thr Lys Tyr
420 425 430
Leu Lys Ser Asn Ser Arg Ser Gln Gln Asn Arg His Ser Phe Met Glu
435 440 445
Ser Ser Gln Ser Lys Ala Gly Thr Leu Gln Pro Asn Glu Lys Gln Ser
450 455 460
Arg His Ser Tyr Ile Asp Thr Ile Pro Gln Ser Ser Arg Ser Pro Ser
465 470 475 480
Tyr Arg Thr Lys Ala Lys Ser His Gly Ala Leu Ser Asp Ser Lys Ser
485 490 495
Val Ser Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ala Gln Ile Ala Glu Pro Ser Thr
500 505 510
Ser Arg Tyr Phe Pro Ser Ser Cys Leu Asp Leu Asn Ser Pro Thr Ser
515 520 525
Pro Thr Pro Thr Arg His Ser Asp Thr Arg Thr Leu Leu Ser Pro Ser
530 535 540
Gly Arg Asn Asn Arg Asn Glu Gly Thr Leu Asp Ser Arg Arg Thr Thr
545 550 555 560
Thr Arg His Ser Lys Thr Met Glu Glu Leu Lys Leu Pro Glu His Met
565 570 575
Asp Ser Ser His Ser His Ser Leu Ser Ala Pro His Glu Ser Phe Ser
580 585 590
Tyr Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Pro Phe Ser Ser Gln Gln Arg Pro His
595 600 605
Arg His Ser Met Tyr Val Thr Arg Asp Lys Val Arg Ala Lys Gly Leu
610 615 620
Asp Gly Ser Leu Ser Ile Gly Gln Gly Met Ala Ala Arg Ala Asn Ser
625 630 635 640
Leu Gln Leu Leu Ser Pro Gln Pro Gly Glu Gln Leu Pro Pro Glu Met
645 650 655
Thr Val Ala Arg Ser Ser Val Lys Glu Thr Ser Arg Glu Gly Thr Ser
660 665 670
Ser Phe His Thr Arg Gln Lys Ser Glu Gly Gly Val Tyr His Asp Pro
675 680 685
His Ser Asp Asp Gly Thr Ala Pro Lys Glu Asn Arg His Leu Tyr Asn
690 695 700
Asp Pro Val Pro Arg Arg Val Gly Ser Phe Tyr Arg Val Pro Ser Pro
705 710 715 720
Arg Pro Asp Asn Ser Phe His Glu Asn Asn Val Ser Thr Arg Val Ser
725 730 735
Ser Leu Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gly Thr Asn His Ser Lys Arg Gln
740 745 750
Pro Ala Phe Asp Pro Trp Lys Ser Pro Glu Asn Ile Ser His Ser Glu
755 760 765
Gln Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Gly Phe Phe Arg Ser Met Lys Lys
770 775 780
Lys Lys Lys Lys Ser Gln Thr Val Pro Asn Ser Asp Ser Pro Asp Leu
785 790 795 800
Leu Thr Leu Gln Lys Ser Ile His Ser Ala Ser Thr Pro Ser Ser Arg
805 810 815
Pro Lys Glu Trp Arg Pro Glu Lys Ile Ser Asp Leu Gln Thr Gln Ser
820 825 830
Gln Pro Leu Lys Ser Leu Arg Lys Leu Leu His Leu Ser Ser Ala Ser
835 840 845
Asn His Pro Ala Ser Ser Asp Pro Arg Phe Gln Pro Leu Thr Ala Gln
850 855 860
Gln Thr Lys Asn Ser Phe Ser Glu Ile Arg Ile His Pro Leu Ser Gln
865 870 875 880
Ala Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Arg Gln Glu Pro Ala Pro Lys Gly
885 890 895
Arg Pro Ala Leu Gln Leu Pro Gly Gln Met Asp Pro Gly Trp His Val
900 905 910
Ser Ser Val Thr Arg Ser Ala Thr Glu Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Gln
915 920 925
Leu Gly Ala Lys Ser Gly Pro Asn Gly His Pro Tyr Asn Arg Thr Asn
930 935 940
Arg Ser Arg Met Pro Asn Leu Asn Asp Leu Lys Glu Thr Ala Leu
945 950 955

Claims (56)

1.一种用于在治疗CDKL5缺陷或Rett综合征变体中使用的融合蛋白，其中该融合蛋白是全身给予的并且该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
2.根据权利要求1所述使用的融合蛋白，进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
3.根据权利要求1或2所述使用的融合蛋白，进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
4.根据权利要求1-3中任一项所述使用的融合蛋白，进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
5.根据权利要求1-4中任一项所述使用的融合蛋白，其中该融合蛋白具有根据SEQIDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述使用的融合蛋白，其中与对照相比，该融合蛋白增加受试者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。
7.根据权利要求1-6中任一项所述使用的融合蛋白，其中与对照相比，该融合蛋白减少受试者的脑中的神经元细胞凋亡。
8.根据权利要求1-7中任一项所述使用的融合蛋白，其中该融合蛋白经静脉内给予。
9.一种用于在治疗CDKL5缺陷或Rett综合征变体中使用的药物配制品，其中该药物配制品包含药学上可接受的载体和有效量的根据权利要求1-8中任一项所述使用的融合蛋白。
10.一种用于在增加患有CDKL5缺陷的患者的视觉皮层中的神经活动中使用的融合蛋白，其中该融合蛋白是全身给予的并且该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
11.根据权利要求10所述使用的融合蛋白，进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
12.根据权利要求10或11所述使用的融合蛋白，进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
13.根据权利要求10-12中任一项所述使用的融合蛋白，进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
14.根据权利要求10-13中任一项所述使用的融合蛋白，其中该融合蛋白具有根据SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
15.根据权利要求10-14中任一项所述使用的融合蛋白，其中与对照相比，该融合蛋白增加受试者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。
16.根据权利要求10-15中任一项所述使用的融合蛋白，其中与对照相比，该融合蛋白减少受试者的脑中的神经元细胞凋亡。
17.根据权利要求10-16中任一项所述使用的融合蛋白，其中该融合蛋白经静脉内给予。
18.一种用于在增加患有CDKL5缺陷或Rett综合征变体的患者的视觉皮层中的神经活动中使用的药物配制品，其中该药物配制品包含药学上可接受的载体和有效量的根据权利要求10-17中任一项所述使用的融合蛋白。
19.一种治疗CDKL5缺陷或Rett综合征变体的方法，该方法包括向对其有需要的患者全身给予一种融合蛋白，该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
20.根据权利要求19所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中与对照相比，全身给予该融合蛋白增加受试者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中与对照相比，全身给予该融合蛋白减少受试者的脑中的神经元细胞凋亡。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中该融合蛋白经静脉内给予。
27.一种增加患有CDKL5缺陷或Rett综合征变体的患者的视觉皮层中的神经活动的方法，该方法包括向对其有需要的患者全身给予一种融合蛋白，该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中与对照相比，全身给予该融合蛋白增加受试者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度。
33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法，其中与对照相比，全身给予该融合蛋白减少受试者的脑中的神经元细胞凋亡。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中该融合蛋白经静脉内给予。
35.一种增加患有CDKL5缺陷或Rett综合征变体的患者的脑中的神经突生长、延长、树突棘数目、分支数目或分支密度的方法，该方法包括向对其有需要的患者全身给予一种融合蛋白，该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
36.根据权利要求35所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中该融合蛋白经静脉内给予。
41.一种降低患有CDKL5缺陷或Rett综合征变体的患者的脑中的神经元细胞凋亡的方法，该方法包括向对其有需要的患者全身给予一种融合蛋白，该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
42.根据权利要求41所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中该融合蛋白经静脉内给予。
47.一种改善患有CDKL5缺陷或Rett综合征变体的患者的运动功能的方法，该方法包括向对其有需要的患者全身给予一种融合蛋白，该融合蛋白包含：
CDKL5多肽序列，其中该CDKL5多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:16具有约98％至100％的序列一致性；以及
TATκ多肽序列，其中该TATκ多肽序列与SEQ ID NO:4具有约90％至约100％的序列一致性，其中该TATκ多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
48.根据权利要求47所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含Igk-链前导序列多肽，其中该Igk-链前导序列被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含报告蛋白多肽，其中该报告蛋白多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中该融合蛋白进一步包含蛋白标签多肽，其中该蛋白标签多肽被可操作地连接至该CDKL5多肽上。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法，其中该融合蛋白具有根据SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的多肽序列。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中该融合蛋白经静脉内给予。
53.一种如在此实质上描述的多核苷酸。
54.一种如在此实质上描述的多肽。
55.一种如在此实质上描述的载体。
56.一种如在此实质上描述的药物配制品。
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