CN101050468A

CN101050468A - G－eGFP蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101050468A
Application number: CN 200610155306
Authority: CN
Inventors: 张传溪; 杨章女; 孙建新
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2026-12-19
Also published as: CN100489101C

Abstract

本发明公开了一种G－eGFP融合蛋白及其制法和用途，G－eGFP融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。G－eGFP融合蛋白是Protein G与eGFP蛋白的融合，表达的产物经过纯化后立即可用，不存在偶联的效率等问题。因而在蛋白的亚细胞高效定位中有很好的应用前景。另外，G－eGFP融合蛋白在各种通过抗体检测的生物化学和分子生物学方面如蛋白印迹杂交、流式细胞仪检测等方面也有广阔的应用前景。

Description

G-eGFP蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是一种新的绿色荧光蛋白和细菌细胞壁蛋白G的融合表达的蛋白(G-eGFP)，以及制备方法和应用。

背景技术

目前细胞内蛋白定位及基因表达的检测方法大多需要有底物或辅助因子，包括利用编码半乳糖苷酶、萤火虫荧光酶、细菌荧光酶的融合基因进行检测，但这些方法在活组织的应用十分有限。目前用于抗体标记的荧光素主要是异硫氰酸荧光素FITC或罗达明RB200。但这两种荧光素都必须与相应的二抗进行偶联之后才能应用于蛋白的亚细胞定位中，偶联步骤复杂，其效率关系到最终的结果，同时，化学荧光素也存在一定的低毒性和不稳定性。而eGFP蛋白对细胞生长却无毒，且不需要任何底物或辅助因子来发光。

维多利亚水母的绿色荧光蛋白(GFP)是一个含有238个氨基酸残基，预测分子量为26，888D的蛋白(Prasher D C，Eckenrode VK，Ward WW，Prendergast FG，Cormier MJ.1992.Primary structure of the Aequorea victoriagreen-fluorescent protein.Gene.111(2)：229-33.)。因为GFP在各种环境中稳定，而且具有光激发的性质(March et al.，2003.Biotechnological applicationsofgreen fluorencent protein.Appl Microbiol Biotechnol，62：303-315)，因而在各种生物系统中被广泛应用。同时，具有不同光谱的GFP突变体以及GFP相关的蛋白已经得到发展，其中增强型(enhanced)GFP突变体(eGFP)的荧光比野生型GFP强35倍。应用共聚焦显微镜或更便利的荧光显微镜来检测GFP与目标蛋白或功能域的融合蛋白是十分方便的。

蛋白G是一个能结合免疫球蛋白(IgG)的细菌细胞壁蛋白，从链球菌中分离得到。是检测IgG的有力试剂，包括人、牛、兔、羊、鼠的IgG(Akerstrom B，Bbodin T，Reis K and Bjorck L.1985.Protein G：A powerful toolfor binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies.TheJournal of immunology135(4)：2589-92)。

发明内容

本发明提供了一种G-eGFP融合蛋白及其制备方法和在结合抗体和亚细胞定位的应用。

一种G-eGFP融合蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，该蛋白是蛋白G与eGFP的融合蛋白。

所述的G-eGFP融合蛋白，其编码的蛋白质具有序列表中SEQ IDNO.2所述的氨基酸序列。

一种具有所述的G-eGFP融合蛋白的活性多肽。该活性多肽的制备方法，包括：

(a)将编码的具有G-eGFP融合蛋白的多肽的核苷酸序列，即蛋白G的核苷酸序列与eGFP核苷酸序列，可操作地连于表达调控序列，形成G-eGFP融合蛋白的表达载体；

(b)将步骤(a)的表达载体转入宿主细胞，形成G-eGFP融合蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达G-eGFP融合蛋白的条件下，培养步骤(b)的重组细胞；

(d)分离出具有G-eGFP融合蛋白活性的多肽。

所述的适合表达G-eGFP融合蛋白的条件为25-37℃下培养至生长对数期OD600＝0.3-0.7，加入IPTG至终浓度为0.1-1mM，在26-37℃，180-240rpm/min的转速下培养8-18h。

本发明还提供了一种分离的具有活性的G-eGFP融合蛋白的最终表达产物；它包括：具有蛋白G的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，以及eGFP的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。

本发明还提供了一种载体，它含有所述G-eGFP融合蛋白的核苷酸序列；

本发明还提供了一种含有所述G-eGFP融合蛋白的核苷酸序列载体转化的宿主细胞。

本发明还提供了一种所述的G-eGFP融合蛋白在亚细胞定位中的应用。

本发明利用蛋白G能结合抗体(免疫球蛋白)和eGFP能激发强绿色荧光的特性得到了G-eGFP融合蛋白的活性多肽，该多肽可以应用于生物化学免疫定位、亚细胞定位、抗体纯化。

本发明得到的融合蛋白为蛋白G与eGFP的融合产物，在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”是指，该DNA片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA片段或蛋白产物已经于天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“G-eGFP融合蛋白或(多肽)编码序列”是指编码具有G-eGFP融合蛋白的多肽的核苷酸序列。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳的至少50％，更佳的至少80％，最佳的至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“G-eGFP融合蛋白”是指具有有蛋白G的核苷酸序列与eGFP核苷酸序列的多肽。该术语还包括具有G-eGFP融合蛋白相同功能的序列的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括G-eGFP融合蛋白的片段和衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、重复序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度下能与G-eGFP融合蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白，以及利用抗G-eGFP融合蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

发明还提供了G-eGFP融合蛋白或多肽的类似物，这些类似物与G-eGFP融合蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工种或进一步加工步骤种进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括G-eGFP融合蛋白多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内G-eGFP融合蛋白的表达。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞。昆虫细胞和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞。COS细胞等。

Protein G与eGFP蛋白融合表达的产物经过纯化后立即可用，不存在偶联的效率等问题。因而在蛋白的亚细胞高效定位中有很好的应用前景。另外，Protein G与eGFP融合蛋白在各种通过抗体检测的生物化学和分子生物学方面如蛋白印迹杂交、流式细胞仪检测等方面也有广阔的应用前景。

附图说明

图1 G-eGFP融合基因的核苷酸序列和氨基酸序列。方框表示插入的酶切位点，下划线表示Protein G氨基酸序列，灰色表示eGFP氨基酸序列。

图2 G-eGFP fusion protein融合蛋白的SDS-PAGE分析。泳道1：BL21；泳道2：BL21 with pET21b；泳道3：表达G-eGFP在细胞总蛋白；泳道4：不可溶的蛋白部分；泳道5：可溶性蛋白部分。泳道6：纯化的后的G-eGFP蛋白；泳道7：蛋白标准分子量。

图3 亚细胞定位检测的实例图片。通过共聚焦激光扫描，利用G-eGFP蛋白检测棉铃虫核型多角体病毒感染棉铃虫细胞后Ha orf29基因和Ha orf3基因在细胞中表达的情况。A)Ha orf29荧光观察的情况。B)Haorf29白光观察的情况。C)Ha orf33荧光观察的情况。D)Ha orf33白光观察的情况。

具体实施方式

G-eGFP基因序列的合成

根据链球菌(Streptococcus sp.GX7805)蛋白G中结合抗体区氨基酸序列(数据来源：GenBank Y00428)，优化设计了密码子，由上海生工生物工程有限公司提供所设计的核苷酸序列(见附图1G-eGFP融合基因的核苷酸序列和氨基酸序列。方框表示插入的酶切位点，下划线表示ProteinG氨基酸序列，灰色表示eGFP氨基酸序列。)与链球菌Streptococcus蛋白G编码核苷酸序列和氨基酸序列85％相同，15％不同，两端设BamHI和HindIII酶切位点；设计的序列合成合成后克隆到pMD18-T载体中。eGFP基因编码区从pEGFP-N1中通过PCR扩增获得(张传溪、孙建新、施惠娟、陈哲宇、吴祥甫“EGFP基因在粉纹夜蛾细胞中的高效表达”《动物学研究》，1999 20(6)：468-470)，两端分别加有HindIII和XhoI酶切位点。(见附图1G-eGFP融合基因的核苷酸序列和氨基酸序列。方框表示插入的酶切位点，下划线表示Protein G氨基酸序列，灰色表示eGFP氨基酸序列。)

G-eGFP基因序列载体的构建

将合成的蛋白G基因编码片段用BamHI和HindIII切下，pET-21b质粒载体相应位点中，再将中eGFP基因编码区用HindIII和XhoI切下，也插入pET-21b质粒载体相应位点中。最后蛋白G核苷酸序列和EGFP的核苷酸序列通过HindIII酶切位点连接在一起，形成G-EGFP融合蛋白基因，经序列测定验证无误。pET-21b质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)，一个细菌复制起点(Ori)，一个IPTG可调控启动子/操纵子，一个核糖体结合位点，以及限制性内切酶克隆位点，并在表达产物后端连接上可用于表达蛋白纯化的His-Tag。将构建好的含目的基因的质粒转化商品名为TG1的E.coli菌株，37℃培养过夜后，用碱裂解法提取质粒。用BamHI和XhoI双酶切消化质粒1.5h，在浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳上鉴定插入片段的大小。

G-eGFP蛋白的表达

将鉴定好的质粒转化商品名为BL21的E.coli菌株，BL21含有多拷贝的重组质粒，其表达lac I阻遏物并携带氨苄抗性(Ampr)，在含Ampr的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，BamHI和XhoI双酶切后琼脂糖电泳鉴定插入了正确大小的片段。挑取正确的克隆后接种至5ml含Ampr的LB中在37℃下培养至生长对数期(OD600＝0.5)，加入IPTG()至终浓度为0.33Mm，接着在28℃，180rpm/min的转速下培养12h。以4000rpm/min的转速离心菌液，弃去上清，用PBS重悬浮沉淀(140mM NaCl，2.7Mm KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)，用超声波破碎细胞。接着，在悬浮液中加入SDS-PAGE上样缓冲液，并煮沸5min。在含8％聚丙烯酰胺的SDS-PAGE胶上分析样品。

G-eGFP蛋白的纯化

用Ni NTA商品树脂柱纯化G-eGFP蛋白。收集菌液，用超声裂解法破碎细胞，以1×Ni NTA Bind Buffer(300mM NaCl，50mM磷酸钠缓冲液，10mM咪唑，pH8.0)为平衡液以及结合液，蛋白液用经预平衡的NiNTA商品树脂柱过柱，再用20ml 1×Ni NTA Wash Buffer(300mM NaCl，50mM磷酸钠缓冲液，20mM咪唑，pH8.0)洗去杂蛋白，然后用含250mM咪唑的1×Ni-NTA Elute Buffer进行洗脱。最后用ddH2O对蛋白进行透析并冻干保存。除非特别指明，纯化的所有步骤都在4℃进行。

G-eGFP蛋白的抗体结合实验

G-eGFP蛋白偶联到激活的CNBr Sepharose 4 Fast Flow(根据美国Amersham公司的操作手册进行，方法如下：取少量激活的CNBr 4，溶于1mM HCl中，室温静置30分钟，使其充分膨胀。用15倍体积的1mM HCl平衡之后，按1∶2(蛋白体积∶柱床体积)的体积在4℃进行吸附过夜。以至少5倍柱床体积的coupling buffer(0.1M NaHCO₃，PH8.3，含0.5M NaCl)洗去多余的配体。用blocking buffer(0.1M Tris-HCl)在4℃封闭2h。接着，以0.1M acetate buffer(含0.5M NaCl，PH3-4)和0.1M Tris-HCl(含0.5M NaCl，PH8-9)轮流洗三次，存于20％乙醇中。

兔多抗融解在RIPA buffer(50mM Tris-HCl，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF，1mg/ml抑肽酶，1mg/ml亮氨酸，1mg/ml抑肽素，1mM Na₃VO₄，1mM NaF)中，并与偶联Sepharose的G-eGFP蛋白在4℃结合。然后，用RIPA buffer洗sepharose柱床，除去未结合的IgG。用PBS重悬浮柱床，加入上样缓冲液后，煮沸进行SDS-PAGE分析其结合抗体的能力。

G-eGFP蛋白在亚细胞定位中的应用

G-eGFP蛋白同时可以用于通过共聚焦激光扫描在活细胞中进行蛋白定位。在此紧举一例在病毒学研究中的应用。单层细胞在合适的培养皿中培养后感染病毒，48小时后用1×PBS洗三次，然后用1×PBS配制的4％多聚甲醛固定。用渗透液处理细胞。固定好的细胞在分别依次与目标蛋白的多克隆抗体和G-eGFP蛋白反应后，用共聚焦激光扫描检测目标蛋白的亚细胞定位。同时，由于G-eGFP蛋白能结合抗体和发绿色荧光特性及良好的稳定性，在各种通过抗体检测的研究和临床医学方面如蛋白印迹杂交、流式细胞仪检测等方面也有广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>G-eGFP蛋白及其制备方法与应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>951

<212>DNA

<213>G-eGFP蛋白

<220>

<221>Protein G核苷酸序列

<222>(7)...(222)

<220>

<221>eGFP核苷酸序列

<222>(229)...(945)

<400>1

ggatccatga cttacaaact gatcctgaac ggtaaaaccc tgaaaggcga aaccactact 60

gaagcagtag acgcggctac ggcagaaaaa gttttcaaac agtacgctaa cgacaacggt 120

gttgatggtg aatggaccta tgatgatgcg accaagacct tcaccgtaac cgaattcaaa 180

ccagaagtga tcgatgcgtc tgaactgacc ccggccgtga ccaagcttat ggtgagcaag 240

ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 300

ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 360

ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 420

ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 480

ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 540

ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 600

gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 660

aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 720

aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 780

cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 840

cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 900

gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagctcga g 951

<210>2

<211>317

<212>PRT

<213>G-eGFP蛋白

<220>

<221>Protein G氨基酸序列

<222>(3)...(74)

<220>

<221>eGFP氨基酸序列

<222>(77)...(315)

<400>2

Gly Ser Met Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe

20 25 30

Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp

35 40 45

Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Phe Lys Pro Glu Val Ile

50 55 60

Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Lys Leu Met Val Ser Lys

65 70 75 80

Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp

85 90 95

Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly

100 105 110

Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly

115 120 125

Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly

130 135 140

Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe

145 150 155 160

Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe

165 170 175

Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu

180 185 190

Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys

195 200 205

Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser

210 215 220

His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val

225 230 235 240

Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val His Tyr Leu

245 250 255

Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His

260 265 270

Met Val Leu Leu Glu Phe Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr

275 280 285

Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn Val Thr Ala Ala

290 295 300

Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu

305 310 315

Claims

1、一种G-eGFP融合蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2、一种G-eGFP融合蛋白，其编码的蛋白质具有序列表中SEQ IDNO.2所述的氨基酸序列。

3、一种具有权利要求1所述的G-eGFP融合蛋白的活性多肽。

4、如权利要求3所述的活性多肽的制备方法，包括：

(d)分离出具有G-eGFP融合蛋白活性的多肽。

5、如权利要求4所述的活性多肽的制备方法，其特征在于：所述的适合表达G-eGFP融合蛋白的条件为25-37℃下培养至生长对数期OD600＝0.3-0.7，加入IPTG至终浓度为0.1-1mM，在26-37℃，180-240rpm/min的转速下培养8-18h。

6、一种含权利要求1所述的G-eGFP融合蛋白核苷酸序列的重组载体。

7、一种含权利要求6所述重组载体的宿主细胞。

8、如权利要求1所述的G-eGFP融合蛋白在亚细胞定位中的应用。