CN101974554A - 一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及其应用，本发明方法是利用PCR定点突变技术将商业化载体pEGFP-N1进行改造得到一种突变型载体pEGFP-N1m。比较分析实验结果表明，利用本发明中构建的突变型载体pEGFP-N1m对分子量接近于或小于EGFP的蛋白多肽进行亚细胞定位分析时，可以消除额外的EGFP蛋白表达对定位实验结果的干扰，明显地提高亚细胞定位实验结果的准确性和可信度，同时还可以提高融合蛋白的表达效率。

Description

一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种商业化质粒pEGFP-N1被改造为一种突变型载体pEGFP-N1m的方法及其应用。

背景技术

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是学名为Aequorea victoria的水母体内产生的一种能够发出绿色荧光的蛋白质。GFP是一种由238个氨基酸(分子量约27KDa)组成的发光蛋白质——aequorin，在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色荧光；GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠和α螺旋，将荧光基团包含在其中，严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱导Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成(详见参考文献：Zimmer M.Chem.Soc.Rev.，2009，38，2823-32)。由于GFP与其他蛋白形成的融合蛋白几乎不会影响其原本的蛋白活性或流动性，也几乎不会产生细胞毒性，故在细胞生物学与分子生物学研究中，GFP作为一种重要的报告基因(reporter gene)被广泛应用。在应用上，能够使GFP与目的基因发生基因重组，波长约490nm的紫外线激发下，用显微镜观察绿色荧光的分布，因而可用于标记活体生物样品。

尽管野生型GFP能够发出绚丽的荧光，但它还是有不少缺点，比如有两个激发峰、光稳定性不好、在37℃时不能正确地折叠等等。1996年Remington小组最先在Science杂志上发表了GFP的S65T突变体晶体结构后，人们更好地了解到GFP发光基团的组成以及与周围残基的相互作用等。研究人员通过定点或随机突变，不断地改造这些残基，得到了我们今天使用的GFP衍生物。华裔科学家钱永健(Roger Y Tsien)于1994年开始改造GFP，并在1995年完成了GFP单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，且荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发波长转移至488nm，而发射峰仍保持在509nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，这样产生了增强型GFP(Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP)，也就是现在科研上所常用的EGFP。EGFP是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型的强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度，同时具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，更适用于细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记。因此，EGFP在研究中常作为一种重要的报告基因被应用【详见参考文献：1)Zimmer M.Chem.Soc.Rev.，2009，38，2823-32；2)Phillips GJ.FEMS Microbiol Lett，2001，204，9-18】。

pEGFP-N1载体(质粒图谱见图1)是一种商业化的真核细胞表达载体，携带有EGFP蛋白的表达基因，可融合于目的蛋白的N端，稳定、高效地在多种异源生物中表达且无细胞毒性，在生物医学研究中常作为一种重要的研究工具被使用。在实际应用中，通常将pEGFP-N1载体与目的基因进行重组连接，构建重组表达质粒、转染细胞、表达融合蛋白，然后观察细胞是否表达绿色荧光蛋白、以及确定该融合蛋白的亚细胞定位。

然而，在实际应用过程中，由于融合蛋白表达序列中的第二个翻译起始位点ATG在EGFP表达序列上的存在，有可能会在融合蛋白得到表达的同时，会另外表达出一个单独的EGFP蛋白，这种情况在文献报道中已经屡见不鲜(详见参考文献：Jackson RJ，et al.NAT REV MOL CELL BIO.，2010，11，113-27)。例如，FGF-2基因能够表达出一种分子量大小约为18kDa的、特异性地定位于细胞核仁中的纤维原细胞生长因子；当FGF-2基因的开放阅读框(open read frame，ORF)被重组克隆到pEGFP-N1载体上之后，研究其亚细胞的定位情况时，除了如预期的在细胞核中表达融合蛋白外，还可以在细胞质中观察到额外表达较弱的绿色荧光蛋白GFP；这些结果通过蛋白表达检测和共聚焦显微镜观察均可以得到证实，这明显地影响了目的蛋白亚细胞定位实验结果的准确性(详见参考文献：Sheng J，et al.J.Biol.Chem.，2004，279，40153-60)。又如，SARS-CoV3a蛋白是存在于SARS病毒内的一种独特蛋白，其大小为28kDa，主要定位于细胞质的高尔基体；当CoV3a蛋白的ORF被重组克隆到pEGFP-N1载体之后，同样在细胞中其他部位也表达了额外的绿色荧光蛋白GFP，这些都影响了实验结果的准确性(详见参考文献：Yuan X，et al.Virus Res.，2005，109，191-202)。此外，本室于2007年发表的相关研究结果表明：对于一种成熟肽只有23aa的钾通道蝎毒素Bmkk2而言，当其表达序列被克隆到pEGFP-N1载体之后，很难得到融合蛋白；而将EGFP蛋白的翻译起始位点ATG突变后，则能够明显地提高融合蛋白的表达量(详见参考文献：Dai C，et al.CELL.MOL.BIOL.LETT.，2007，12，362-9)。这些实验证据充分说明，当我们将能够表达分子量接近或小于EGFP蛋白的ORF克隆进入pEGFP-N1质粒后，由于“渗漏扫描”和“翻译重起始”现象的存在【详细的分子机制参见文献：1)Poyry，TA，et al.Genes Dev.，2004，18，62-75；2)Jackson RJ，et al.NAT REV MOL CELL BIO.，2010，11，113-27；3)Kozak M.Gene，2002，299，1-34】，当第二个翻译起始位点ATG与前一个翻译起始位点的距离越为接近，就越容易使得核糖体从第二个ATG开始翻译；而当上游开放阅读框较长或是上游开放阅读框含有稳定的RNA二级结构时，重扫描和翻译重起始发生的可能性会明显地减少。

因此，为了改善pEGFP-N1质粒在被克隆进入较短的ORF后可能表达额外的EGFP蛋白而影响融合蛋白的亚细胞定位结果或影响融合蛋白的表达量这一缺陷，本发明通过定点突变研究手段，将pEGFP-N1质粒上EGFP蛋白表达序列的Kozak序列进行了突变(采用定点突变方式，将pEGFP-N1质粒中EGFP翻译起始位点的Kozak序列CCACCATGG突变为CCtCCcTGt)，得到了一种突变型载体pEGFP-N1m。将该突变型载体与现有的商业化载体pEGFP-N1结合使用，可以明显改善pEGFP-N1载体在使用过程中的上述缺陷，提高了分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽在亚细胞定位实验结果的准确性，以及提高融合蛋白的表达效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法及其应用。本发明中所涉及的突变型载体pEGFP-N1m，结合pEGFP-N1一起应用，能够显著提高分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽在亚细胞定位实验结果的准确性，以及提高融合蛋白的表达效率。

本发明所提供的突变型载体pEGFP-N1m的构建方法，包括如下步骤：

1)引物设计：采用的上游引物序列为：5’

-GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGG GCGAGG-3’，下游引物序列为：5’

-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3’；

2)PCR定点突变：以pEGFP-N1质粒为模板，进行PCR反应；

3)回收PCR反应产物，常规方法进行酶切、连接和转化；

4)阳性克隆筛选以及测序鉴定，完成突变型载体pEGFP-N1m的构建。

本发明选取分子量大于、等于或小于EGFP的、亚细胞定位已知的蛋白多肽的表达序列，分别将这些表达序列克隆进入pEGFP-N1和pEGFP-N1m，构建相应的表达载体；通过Western blot分析和共聚焦显微镜观察方法，证实突变型载体pEGFP-N1m可以显著提高分子量约等于或小于EGFP的蛋白多肽的亚细胞定位结果的准确性以及提高融合蛋白的表达效率。

本发明中所得到的突变型载体pEGFP-N1m，具有明显改善分子量约等于或小于EGFP蛋白的多肽分子在亚细胞定位结果的准确性，为该商业质粒的进一步开发应用提供了重要的实验数据。

附图说明

图1 pEGFP-N1载体的模式图(引自Clontech公司技术手册)。

图2本发明中pEGFP-N1载体上EGFP蛋白表达序列中Kozak序列的突变策略，即将原Kozak序列CCACCATGG(图1中的674-682位核苷酸序列)突变为CCtCCcTGt。

图3利用pEGFP-N1和pEGFP-N1m构建的多种表达质粒的酶切鉴定图谱。泳道1和5：DNA marker；泳道2：KRAB-EGFP-N1；泳道3和4：KRAB-EGFP-N1m；泳道6：Tat-EGFP-N1；泳道7：Tat-EGFP-N1m。

图4 PK-EGFP融合蛋白的Western blot检测图谱。

图5 PK-EGFP融合蛋白的共聚焦显微镜观测。

图6融合蛋白KRAB-EGFP的Western blot检测图谱。

图7融合蛋白KRAB-EGFP的共聚焦显微镜观察。

图8融合蛋白EGFP-Tat的共聚焦显微镜观察。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明具体应用方法。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，按照常规实验条件，如Sambrook等编，《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1：突变型载体pEGFP-N1m的构建

将pEGFP-N1载体中EGFP核苷酸表达序列的翻译起始位点ATG及其附近的Kozak序列采用PCR定点突变技术进行突变(如图2)，使其不能得到表达；只有当插入带有翻译起始位点ATG及Kozak序列的外源基因片段之后才会高效地表达出“靶基因-EGFP融合蛋白”。

一、构建突变型载体pEGFP-N1m的引物设计与合成

采用引物设计软件Primer Premier 5.0进行突变引物设计，上游引物序列为：5’-GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGGGCGAGG-3’，下游引物序列为：5’-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3’(下划线所标注的序列即为定点突变的序列)。

本发明中所用到的引物核苷酸序列均由深圳华大基因公司合成。

二、PCR定点突变

以本室保存的pEGFP-N1质粒(由本室购自Clontech公司)为模板，采用PCR定点突变方法(采用上述引物)进行突变。构建如下PCR反应体系：

pEGFP-N1质粒(0.2μg/μl)：1μl；MgSO₄(25mmol/L)：1μl；dNTP(dGTP、dATP、dTTP、dCTP各5mmol/L)：1μl；国产KOD+DNA聚合酶：  0.5μl；10X KOD+DNA聚合酶缓冲液：2.5μl；上游引物(10μmol/L)：0.25μl；下游引物(10μmol/L)：0.25μl；无菌双蒸水：18.5μl，反应体积为25μl。

PCR反应循环为：95℃10min；(95℃ 30s，58℃ 30s，68℃ 30s；35 cycles)；68℃ 5min；16℃ 24h。

用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收PCR产物，详细的操作方法参照试剂盒说明。

三、PCR产物和pEGFP-N1质粒酶切、片段连接和转化

按照常规分子克隆的方法，利用相应的限制性内切酶对于上述PCR产物和pEGFP-N1质粒进行酶切、产物回收和连接反应，转化感受态大肠杆菌。

四、阳性克隆筛选及测序验证

挑取阳性克隆，进行后续的质粒提取、酶切反应和PCR反应鉴定，最后送交测序公司进行测序验证。将已鉴定好的质粒送交华大基因生物公司测序，经过序列比对，证明突变位点的质粒是正确的，即突变型载体pEGFP-N1m构建成功。

实施例2：不同分子量大小的融合蛋白表达载体的构建

为了比较分析pEGFP-N1和pEGFP-N1m载体克隆进入不同大小的蛋白多肽表达序列后，对于融合蛋白的表达效率和定位结果的影响，首先根据文献报道，挑选不同大小的、且其亚细胞定位已知的多肽表达核苷酸序列，分别克隆连接到质粒pEGFP-N1和pEGFP-N1m的EGFP表达序列的上游，构建成不同的表达质粒。

由于实验需要，需选取大小不同的蛋白，同时需要这些蛋白符合亚细胞结构定位已知，且定位精确，能满足处于且仅处于细胞核内、细胞质内、特定细胞器内或细胞内生物膜上的条件。在NCBI蛋白数据库中，注解部分有包括蛋白亚细胞结构定位及蛋白已知功能在内的信息。运用生物信息学的方法，在Linux系统下用Perl高级程序语言可以编写相应的搜索程序，实现全面、有效且快速蛋白数据库搜索，发现符合特定条件的基因。

一、丙酮酸激酶基因

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)，其生物化学缩写式为三磷酸腺苷：丙酮酸-2-O-磷酸转移酶，其基因长度为12142bp，能够编码包含574aa(分子量约62KDa，其大于约26KDa的EGFP的分子量)长度的蛋白。在无氧条件下，葡萄糖进行分解，形成2分子丙酮酸并提供能量，这一过程称为糖酵解作用；在此过程中，PK是催化形成第二个ATP反应的酶(Liapounova，N.A.et al.，Eukaryot Cell，2006，5，2138-46)。

利用常规的分子生物学方法，将PK蛋白的表达序列分别克隆进入pEGFP-N1和pEGFP-N1m的EGFP表达序列的上游，然后转染HeLa细胞，检测其表达情况。

二、ZNF268锌指蛋白的KRAB结构功能域

KRAB/C2H2型锌指蛋白均含有一个保守的KRAB功能结构域。ZNF268是一种典型的KRAB/C2H2型锌指蛋白，含有一个74aa的KRAB结构域(参见文献：Gou，D.M.，et al.Biochimica et Biophysica Acta.2001，1518，306-10)。我们的前期实验结果表明：单独表达的ZNF268锌指蛋白的KRAB结构域是定位于细胞核中的。

为了比较分析pEGFP-N1和pEGFP-N1m载体对于融合蛋白的表达量和亚细胞定位结果准确性的影响，我们将KRAB多肽的表达序列分别克隆进入pEGFP-N1和pEGFP-N1m的EGFP表达序列的上游，然后转染HeLa细胞，检测其表达情况。

利用常规的分子生物学方法，将KRAB多肽的表达序列分别克隆进入pEGFP-N1和pEGFP-N1m的EGFP表达序列的上游，然后转染HeLa细胞，检测其表达情况。

构建成功的表达质粒载体如图3所示。经测序验证，表达序列正确无误，可以用于下游实验。

三、反式激活转录子基因

反式激活转录子基因来自于I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)，其含义为反式激活转录子(Trans-Activator of Transcription，Tat)。人工培养的感染细胞能够释放Tat蛋白，而HIV-1感染的患者血液中也有发现。由于不同亚种之间的区别，TAT蛋白的大小介于86-101aa之间。在本实验中所用的为分子量大小14KDa(其小于约26KDa的EGFP的分子量)的蛋白。在人类免疫缺陷病毒中，Tat蛋白能够大幅度增加HIV的单链RNA的转录。同时，Tat能够直接参与到HIV的致病过程之中发挥作用(Ammosova，T.，et al.J Biol Chem，2005，280，36364-71)。

将Tat蛋白的表达序列分别克隆进入pEGFP-N1和pEGFP-N1m的EGFP表达序列的上游，然后转染HeLa细胞，检测其表达情况。

利用常规的分子生物学方法，将Tat蛋白的表达序列分别克隆进入pEGFP-N1和pEGFP-N1m的EGFP表达序列的上游，然后转染HeLa细胞，检测其表达情况。

构建成功的表达质粒载体如图3所示。经测序验证，表达序列正确无误，可以用于下游细胞转染实验分析。

实施例3：比较分析pEGFP-N1和pEGFP-N1m载体

以下细胞转染实验均在HeLa细胞中进行。HeLa细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，由本室按照常规操作方法进行保存。

一、二者均可用于分子量大于EGFP的多肽的亚细胞定位

丙酮酸激酶蛋白(PK)基因能够编码一种分子量约62KDa的蛋白多肽，其分子量远远大于EGFP，定位于细胞质中。当我们利用pEGFP-N1和pEGFP-N1m载体对PK-EGFP融合蛋白在HeLa细胞中进行亚细胞定位实验验证时，将PK-EGFP-N1(unmatation)和PK-EGFP-N1(matation)质粒转染HeLa细胞，通过Western blot分析，由图4可见，pEGFP-N1质粒在HeLa细胞中正常定位表达于细胞质中；此外，由于PK蛋白本身的分子量很大，因此与EGFP形成融合蛋白后，无论是采用pEGFP-N1载体还是pEGFP-N1m载体，均不会在细胞的其它部位表达额外的EGFP蛋白。通过共聚焦分析，由图5可见，PK蛋白的表达序列无论是与pEGFP-N1还是pEGFP-N1m载体融合，由于PK分子量很大，均不会表达额外的EGFP蛋白。EGFP：表示对于绿色荧光蛋白EGFP的表达定位；DAPI染核实验显示了细胞核所在的位置；Merge：二者的重叠图谱，显示PK蛋白完全定位在细胞质中。

说明对于分子量较大的蛋白多肽进行定位实验分析时，pEGFP-N1载体是一种非常好的蛋白多肽亚细胞定位分析的实验工具。

二、pEGFP-N1m载体比pEGFP-N1更适合于分子量小于EGFP的蛋白多肽的亚细胞定位分析

文献报道及本室研究结果表明，当利用pEGFP-N1载体对于分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽进行亚细胞定位分析时，除了在应有的亚细胞结构中表达出绿色荧光蛋白外，在其他的地方也有一些模糊的荧光，这影响了定位实验结果的准确性，这些结果可以用Western blot得到验证。因此，我们认为，除了表达目的蛋白-EGFP融合蛋白外，应该还表达了额外的EGFP蛋白，影响了亚细胞定位结果的准确性。因此改善pEGFP-N1载体势在必行。

利用锌指蛋白ZNF268的KRAB结构域和HIV病毒蛋白Tat作为研究例子，我们比较分析了pEGFP-N1和pEGFP-N1m载体用于目的蛋白的分子量小于EGFP的蛋白多肽的亚细胞定位分析。

图6为融合蛋白KRAB-EGFP分别在载体pEGFP-N1和pEGFP-N1m中的表达情况检测。A图中泳道1：EGFP表达对照；泳道2：KRAB-EGFP在载体pEGFP-N1m中的表达情况，由于EGFP蛋白表达序列中的Kozak序列发生了突变，因此不会表达额外的EGFP蛋白。B图中泳道3：EGFP对照；泳道4：KRAB-EGFP在载体pEGFP-N1中的表达情况，由于EGFP蛋白表达序列中的Kozak序列未发生突变，因此该表达质粒除了表达KRAB-EGFP融合蛋白外，还额外表达了大量的EGFP蛋白，影响了融合蛋白的表达量及其亚细胞定位结果的准确性。

图7利用共聚焦显微镜观察方法，验证了图6的结论。上半部分图显示分子量小于EGFP的、且特异定位于细胞核中的多肽序列KRAB的表达序列克隆进入载体pEGFP-N1后，除了表达了大部分融合蛋白外，在细胞质中也表达了许多EGFP蛋白，影响了该蛋白的亚细胞定位结果的准确性；下图表示KRAB表达序列克隆进入载体pEGFP-N1m后，只在细胞核中表达了大量的融合蛋白，亚细胞定位结果非常好，且融合蛋白的表达效率明显提高。EGFP：表示绿色荧光蛋白EGFP表达检测；DAPI：显示细胞核所在的位置；merge：表示前面二者的重叠图谱。

图8利用共聚焦显微镜观察方法，显示分子量小于EGFP的、且特异定位于细胞核中的Tat蛋白与之融合表达时的情况。上图表示EGFP-Tat融合表达蛋白的序列克隆进入pEGFP-N1载体时的表达情况；下图显示EGFP-Tat融合表达蛋白的序列克隆进入pEGFP-N1m载体时的表达情况。结果表明在突变型载体pEGFP-N1m中，细胞质中额外的EGFP的相对量大为减少，可以显著提高融合蛋白的亚细胞定位结果的准确性以及融合蛋白的表达效率。EGFP：表示绿色荧光蛋白EGFP表达检测；DAPI：显示细胞核所在的位置；merge：表示前面二者的重叠图谱。

总之，未突变的载体pEGFP-N1用于KRAB和Tat的定位分析时，除了在细胞核表达了融合蛋白外(图7、8)，在其他的部位也表达了额外的EGFP蛋白(图6、7、8)；而当利用突变型载体pEGFP-N1m进行对比实验时，我们发现额外表达的EGFP蛋白大大减少(图6)，在融合蛋白不应该表达的细胞结构中也未发现绿色荧光蛋白(图7、8)，且融合蛋白的表达效率也得到较大的提高(图7、8)。上述结果显示，当我们利用pEGFP-N1载体对Tat和锌指蛋白ZNF268的KRAB结构域进行亚细胞定位分析时，由于它们的分子量小于EGFP，可能由于“重扫描”和“翻译重起始”现象的存在，明显地在细胞中额外表达了EGFP蛋白，这严重地影响了亚细胞定位结果的准确性；当改用本发明中构建的突变型载体pEGFP-N1m进行平行实验时，可以看到，不仅可以消除额外的EGFP蛋白的表达，而且融合蛋白的表达效率也得到了极大地提高，这将极大地提高亚细胞定位实验结果的准确性和可信度。因此，本发明中的突变型载体pEGFP-N1m将可以作为商业化载体系统pEGFP的重要补充，在用于分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽的亚细胞定位分析中，可以极大地提高实验结果的准确性和可信度。

Claims (4)

1.一种突变型载体pEGFP-N1m的构建方法 ，其特征在于：将pEGFP-N1载体中EGFP核苷酸表达序列的翻译起始位点ATG及其附近的Kozak序列采用PCR定点突变技术进行突变，使其不能得到表达。

2.如权利要求1所述的突变型载体pEGFP-N1m的构建方法 ，其特征在于包括如下步骤：

1）引物设计：采用的上游引物序列为：5’-GGATCCACCGGTCGCCTC CCTGTTGAGCAAGG GCGAGG-3’，下游引物序列为：5’-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3’；

2）PCR定点突变：以pEGFP-N1质粒为模板，进行PCR反应；

3）回收PCR反应产物，常规方法进行酶切、连接和转化；

4）阳性克隆筛选以及测序鉴定，完成突变型载体pEGFP-N1m的构建。

3.如权利要求2所述的突变型载体pEGFP-N1m的构建方法 ，其特征在于步骤2中 PCR 反应循环为：95℃    10min；（95℃ 30s，58℃ 30s，68℃ 30s；35 cycles）；68℃ 5min；16℃ 24h。

4.突变型载体pEGFP-N1m用于分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽的亚细胞定位分析。

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