CN110283244A - 用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白片段，编码所述蛋白片段的核酸序列如SEQ ID No:56所示，或SEQ ID No:57所示，或SEQ ID No:58所示。还公开了一种用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统，包括三分sfGFP系统中的GFP10，还包括由SEQ ID No:58所示核酸序列编码的蛋白，或者还包括由SEQ ID No:56和57所示核酸序列编码的蛋白。还公开了含有前述核酸序列的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。还公开了前述蛋白片段在检测蛋白质之间是否相互作用中的应用；或上述核酸序列在检测蛋白质之间是否相互作用中的应用。改进型分段sfGFP系统的荧光信号得到显著的提高。

Description

用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统。
背景技术
探测活细胞中蛋白质分子间的相互作用(protein-protein interactions，PPIs)，对于揭示这些分子在生理或病理过程中的作用非常重要。为了检测蛋白质的相互作用，研究者们发明了各种方法，包括亲和层析、免疫共沉淀、各种双杂交系统、亲和杂交、噬菌体展示、荧光共振能量转移(FRET)、表面等离子共振(SPR)、双分子荧光互补(BiFC)、生物发光共振能量传递(BRET)、分裂荧光素酶互补分析(SLCA)等等(Eric M.et al,Microbiological Reviews.1995；Micheal C.et al,Drug Discovery Today.2016等)。这些方法各有特点，适用于不同的应用场景。
在这些方法中，双分子荧光互补(BiFC)在某些方面具有特别的优势。BiFC的主要原理，是将荧光蛋白分子分成两个单独不能发荧光的部分，分别将其与目标蛋白融合，当两个目标蛋白因为相互作用互相靠近时，前述两个荧光分子片段也因为物理距离靠近，而重新互补，形成具有活性的荧光蛋白从而可以被检测到。因此，这种由于互补而产生的荧光信号及其强弱，可以用来指示两目标蛋白是否发生了相互作用及其作用强弱。由于双分子荧光互补，可以通过荧光显微镜直接观察，因此具有直观的特点，在生物医学的基础和应用研究中都有广泛用途。
双分子荧光互补技术的建立，要基于荧光蛋白。在这些荧光蛋白中，一种较为常用的是绿色荧光蛋白的突变体，即超折叠绿色荧光蛋白(super fold GFP,sfGFP)，其结构的稳定性高。2005年，waldo实验室首次将sfGFP结构中第1-10个β折叠(简称为GFP 1-10)与第11个β折叠(简称为GFP 11)分开，这两个片段各自单独不能发荧光，当GFP 1-10与含有GFP11片段的蛋白混合后，GFP 1-10可以主动结合到GFP 11上(表示GFP 1-10和GFP 11具有较高亲和力)，从而恢复荧光活性(Nature biotechnology,2005)。这个系统虽然可以用于检测带有GFP 11标签的蛋白分子，但是不能用做双分子荧光互补来探测别的蛋白的相互作用，因为GFP 1-10和GFP 11之间本来就有相互作用。2013年，waldo实验室在上述基础上，进一步将sfGFP的第10个β折叠单独分离出来，发明了一种三分段sfGFP系统，该系统包括GFP1-9,GFP 10和GFP 11三个部分。由于GFP 10和GFP 11之间亲和力低，因此该系统可以用于检测蛋白相互作用(Scientific report,2013)。其基本原理如图1所示，将GFP 10和GFP 11分别与目标蛋白A和B融合，然后将这两个融合蛋白于GFP 1-9共表达，由于另一段GFP 1-9和GFP11之间有亲和力，当GFP 10和GFP 11通过目标蛋白的相互作用靠近，GFP 1-9也因为与GFP 11之间的亲和力被招募到附近，继而这三段重新汇集，恢复荧光活性。这个三分段sfGFP系统可以用于蛋白相互作用检测，除了直观的优点以外，GFP 10和GFP 11都是短肽，因此对融合蛋白结构的影响可能较小，另外，由于被分成了三部分，其荧光背景进一步降低，有助于提高检测的信噪比。
三分sfGFP系统发明后，得到一些应用，比较典型的例子如，Faten等利用该技术构建了一种药物筛选模型，来筛选GTPase酶的活性调节剂(J Cell Sci,2017)。Gregory等利用该技术研究酵母中蛋白的相互作用(MBoC,2016)。我们前期也利用该技术来研究乙肝病毒核心蛋白间的相互作用，但是，在研究过程中，我们发现该系统的信号强度弱，在普通荧光显微镜下难以分辨。前述Faten等的研究中也遇到了同样的问题，即荧光信号低，他们后来在系统中加入一种抗GFP的nanobody，使荧光强度有所改善。我们后来也采用了这种抗GFP的nanobody，但效果仍不理想，信号虽稍有增加，但背景也有所增加。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统。
本发明实现其目的的技术方案为：
一种蛋白片段，编码所述蛋白片段的核酸序列如SEQ ID No:56所示，或SEQ IDNo:57所示，或SEQ ID No:58所示。
一种用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统，包括三分sfGFP系统中的GFP10，还包括由SEQ ID No:58所示核酸序列编码的蛋白，或者还包括由SEQ ID No:56和SEQ ID No:57所示核酸序列编码的蛋白。
含有上述核酸序列的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
上述蛋白片段在检测蛋白质之间是否相互作用中的应用；或上述核酸序列在检测蛋白质之间是否相互作用中的应用。
本发明的有益效果是：高亲和分子对N11S+C10改进型及GFP1-9-11改进型分段sfGFP系统的荧光信号相对于原来的三分sfGFP系统，得到了显著的提高，而且没有明显可见的背景荧光，可用于蛋白相互作用检测、药物筛选等诸多方面。在平均荧光强度方面，N11S与C10亲和蛋白的融合使系统的S/N从99％提高到237％，GFP1-9和G11融合在一起使系统的S/N提高到185％。
附图说明
图1为三分段sfGFP检测蛋白相互作用的原理示意图。
图2为改进三分段sfGFP信号强度的策略原理图。
图3为实施例二的实验设计原理图，其中，A为在GFP1-9和GFP11上分别融合一对高亲和力分子，B为将GFP1-9和GFP11直接融合起来，C为将具有高亲和力的分子对分别融合到GFP1-9和GFP11上。
图4为RAP介导的FKBP12和FRB的三元复合物的相互作用，其中，A为质粒结构示意图，B为改进的三分段sfGFP系统的荧光信号，C为荧光细胞数量方面的信噪比，D为平均荧光强度。
图5为利用改进型三分段sfGFP系统表征HBc单体的相互作用，其中，A为质粒结构示意图，B为改进的三分段sfGFP系统的荧光信号，C为荧光细胞数量方面的信噪比，D为平均荧光强度。
具体实施方式
为了解决背景技术中所述的三分sfGFP系统信号弱的问题，我们提出了一种新思路。这种思路基于以下分析：(1)三分sfGFP的荧光信号，来源于GFP 1-9,GFP 10,GFP 11三者的聚集；(2)这三者的聚集效率取决于三者之间的相互作用强度或亲和力；(3)这三者当中，GFP 10和GFP 11之间的亲和力由与其融合的目标蛋白决定，无法改变；(4)因此，要提高三者的聚集效率，只能通过增加GFP 1-9与GFP 11和GFP 10二者之一之间的亲和力(不能同时增加这两种亲和力)。(5)我们推测GFP 1-9与GFP 11之间原本存在相当的亲和力，而与GFP 10之间的亲和力较弱(事实证明亦如此)。因此，我们最终的方案，是进一步提高GFP 1-9与GFP 11之间的亲和力。
我们设计了两种可能实现上述思路的实验策略，如图2所示。第一，通过突变GFP11，找到一种与GFP 1-9亲和力得到提高的突变体，从而增加三部分的结合效率；第二，通过在GFP 1-9和GFP 11上分别融合一对高亲和力分子，从而提高二者的亲和力，进而增加系统的信号强度。我们通过实验研究表明，第一种策略未能显著提高三分段sfGFP的信号强度，而通过特定的高亲和分子对，则能显著提高了三分段sfGFP系统的信号强度。本发明因此提供了一种改进的分段sfGFP系统，可用于蛋白相互作用检测，药物筛选等诸多方面。
本申请所用试剂材料来源：
2×PrimeSTAR HS Mix：Takara公司，日本
胶回收试剂盒，基因组DNA提取试剂盒：QIAGEN公司，德国
大肠杆菌JM109、Promega公司，美国
BsmB I、Tango buffer、DTT：Thermo scientific公司，美国
Rapamycin:MCE公司，美国
ATP、T7ligase、T4连接酶buffer、T4多核苷酸激酶：New England Biolabs公司，美国HEK293细胞：美国模式菌种收集中心
本发明实施例中所用扩增引物序列如下表1所示：
表1.本发明实施例中所用引物序列
实施例一、通过突变GFP 11筛选与GFP 1-9亲和力得到提高的GFP 11突变体
本实施例的实验方案，是对GFP 11的不同位置氨基酸进行饱和突变，筛选能增强三分段sfGFP信号强度的GFP 11突变体。我们首先基于乙肝病毒核心蛋白HBc(两个HBc单体能相互结合)，构建了三分段sfGFP检测系统。
1.利用三分段sfGFP表征HBc单体的相互作用
利用HBc为模型，测试Waldo研究组提出的三分sfGFP系统。本测试需要构建3种质粒，分别为表达GFP 1-9的质粒(PCH-GFP 1-9)，表达GFP 10-HBc融合蛋白的质粒(pGFP10-HBc)，以及表达GFP11-HBc融合蛋白的质粒(pGFP11-HBc)。以下为具体构建过程：
1.1质粒PCH-GFP 1-9的构建
基因sfGFP 1-9(序列参见Cabantous等，A New Protein-Protein InteractionSensor Based on Tripartite Split-GFP Association.Scientific report,2013)由成都擎科生物技术有限公司合成并克隆到载体pUC57上(即带有GFP 1-9的质粒)。首先，用引物F GFP 1-9+R GFP 1-9扩增该基因。
PCR反应体系为：带有GFP 1-9的质粒10ng，引物F GFP 1-9(10μM)及R GFP 1-9(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag1。
以质粒RlucN-HBC(与中国专利申请CN 201610564291.6中的质粒RlucN-HBC相同)为模板，用引物FSV40GG2+R Bsmb1vect扩增载体。PCR反应体系为：质粒RlucN-HBC 10ng，引物F SV40GG2(10μM)及R Bsmb1 vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃1min，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag2。
将以上得到的两个片段frag1、frag2做Golden gate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag11μl(50ng)、frag22μl(100ng)、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒PCH-GFP 1-9。
1.2质粒pGFP10-HBc的构建
以质粒RlucN-HBC为模板，用引物F G4SGG7+R vect GFP 10扩增。PCR反应体系为：质粒RlucN-HBC 10ng，引物F G4SGG7(10μM)及R vect GFP 10(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃1min30s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag3。
将寡核苷酸F GFP 10和R GFP 10退火并做5’磷酸化，反应体系如下：F GFP 10 1μl(100μM)、R GFP 10 1μl(100μM)、10X T4连接酶buffer 1μl、T4多核苷酸激酶0.5μl、ddH2O6.5μl，总体积10μl。
将反应管在PCR仪上反应，条件为37℃30min，95℃5min,然后进入降温循环，每循环降低1℃，循环时间为15s，通过70个循环降低至25℃，结束反应。取反应产物1μl，用ddH2O199μl稀释，然后取稀释后的产物(命名为frag4)与frag3做Golden gate反应，反应体系如下：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag3 1μl(80ng)、frag4 1μl、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pGFP10-HBc。
1.3质粒pGFP11-HBc的构建
以质粒RlucN-HBC为模板，用引物F G4SGG7+R vect G11扩增。PCR反应体系为：质粒RlucN-HBC 10ng，引物F G4SGG7(10μM)及R vect G11(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃1min 30s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag5。
将寡核苷酸F G11和R G11退火并做5’磷酸化，反应体系如下：F G11 1μl(100μM)、R G11 1μl(100μM)、10X T4连接酶buffer 1μl、T4多核苷酸激酶0.5μl、ddH2O 6.5μl，总体积10μl。将反应管在PCR仪上进行反应，条件为37℃30min，95℃5min,然后进入降温循环，每循环降低1℃，循环时间为15s，通过70个循环降低至25℃，结束反应。取反应产物1μl，用ddH2O 199μl稀释，然后取稀释后的产物(命名为frag6)与frag5做Golden gate反应，反应体系如下：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag5 1μl(80ng)、frag6 1μl、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pGFP11-HBc。
1.4 PCH-RFP质粒构建
用引物F RFP和引物R RFP扩增质粒RFP-47G4S-HBc(即为中国专利ZL201510075723.2中的质粒RFP-47G4S-HBc)，PCR反应体系为：质粒RFP-47G4S-HBc 10ng，引物F RFP(10μM)及R RFP(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag7。将frag7与前述frag2做Golden gate，反应体系如下：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag2 1μl(50ng)、frag7 1μl(20ng)，ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒PCH-RFP。
1.5三分段sfGFP表征HBc相互作用的细胞转染实验
将HEK293细胞接种到放置了玻片的24孔板中，第二天共转染质粒PCH-RFP(2ng)+PCH-GFP 1-9(300ng)+pGFP10-HBc(100ng)+pGFP11-HBc(100ng)，阴性对照组为PCH-RFP(2ng)+PCH-GFP 1-9(300ng)+空载体(100ng)+pGFP11-HBc(100ng)和PCH-RFP(2ng)+PCH-GFP 1-9(300ng)+pGFP10-HBc(100ng)+空载体(100ng)，转染操作步骤按lipofectamin3000说明书进行。转染后48小时，取出玻片并固定封片，然后用激光共聚焦显微镜(Leica,德国)观察。结果实验组可见绿色荧光和红色荧光，而对照组只可见红色荧光，提示三分段sfGFP可以反映HBc的相互作用。然而，尽管PCH-RFP的转染量相当少(仅2ng)，在相同激发激光强度下，红色荧光仍然显著强于绿色荧光，而在普通荧光显微镜下(Leica,德国)，绿色荧光非常稀少，而且仅隐约可见。
2.GFP11突变体的筛选
前述结果表明，三分段sfGFP虽然可以表征HBc的相互作用，但其荧光信号很弱，不利于检测，为此我们将以上述体系为基础，筛选能增强三分段sfGFP荧光信号的GFP11突变体。筛选策略是，首先选定GFP11第4、5、6、8、11、14位氨基酸，做饱和突变，筛选能增强其信号的突变体，若能筛选到信号增强的突变体，则以该突变体为基础，进一步对GFP11第7、9、10、12、13、15、16、17位氨基酸做饱和突变，筛选能进一步增强荧光信号的突变体。若第一轮筛选未能筛选到信号增强的突变体，则继续对剩余位点进行单点饱和突变。
2.1第一轮突变体筛选
为了构建饱和突变体，我们针对不同位点，设计了不同的突变引物组合。下面以第5位氨基酸的突变为例，说明不同位点饱和突变体的构建过程。
用引物R G11M5+F amp扩增pGFP11-HBc，PCR反应体系为：pGFP11-HBc质粒10ng，引物F amp(10μM)及R G11M5(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag8。
分别用引物组合F G11M5-1+R amp，F G11M5-2+R amp，F G11M5-3+R amp，FG11M5-4+R amp，F G11M5-5+R amp，F G11M5-6+R amp，F G11M5-7+R amp，F G11M5-8+R amp扩增GFP11-HBc，各PCR反应体系为：pGFP11-HBc质粒10ng，引物R amp(10μM)及F G11M5系列引物(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃45s，35个循环。将得到的8个PCR反应产物分别胶回收，回收产物分别取100ng混合，所得混合物命名为frag9。将frag9与frag8做Golden gate，反应体系如下：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag8 1μl(50ng)、frag9 2μl(100ng)、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，挑取60个克隆，测序鉴定，根据测序结果确定突变体的突变性质。
将各种突变体GFP11M5-HBc(20ng)分别与质粒PCH-GFP 1-9(60ng)和pGFP10-HBc(20ng)共转染接种于96孔板中的HEK293细胞，48h后通过荧光显微镜观测荧光，与野生型转染组pGFP11-HBc(20ng)+PCH-GFP 1-9(60ng)+pGFP10-HBc(20ng)比较荧光强度。其它位点的饱和突变体制备方法与GFP11M5-HBc的制备方法类似，仅PCR扩增时所用的引物序列根据突变位点的不同而不同。
第一轮筛选中，我们共获得了92种突变体，转染实验显示，这些突变体中大部分都未能检测到荧光，仅有6种突变体可在普通荧光显微镜下观测到荧光，但这些突变体的荧光强度均没有显著高于原来的三分sfGFP系统。
2.2第二轮突变体筛选
由于第一轮突变体筛选未能得到符合要求的突变体，我们继续对GFP11的其他位点进行饱和突变。第二轮突变位点包括第7、9、10、12、13、15、16、17位氨基酸。下面以第7位氨基酸的饱和突变体制备为例，说明制备过程。
用引物R G11M7+F amp扩增pGFP11-HBc，PCR反应体系为：pGFP11-HBc质粒10ng，引物F amp(10μM)及R G11M7(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag 10。分别用引物组合F G11M7-1+R amp，FG11M7-2+R amp，F G11M7-3+R amp，F G11M7-4+R amp，F G11M7-5+R amp，F G11M7-6+Ramp，F G11M7-7+R amp，F G11M7-8+R amp扩增pGFP11-HBc，各PCR反应体系为：pGFP11-HBc质粒10ng，引物R amp(10μM)及F G11M7的系列引物(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃45s，35个循环。将得到的8个PCR反应产物分别胶回收，回收产物分别取100ng混合，所得混合物命名为frag11。将frag11与frag10做Golden gate，反应体系如下：BsmB I酶0.75μl、Tangobuffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag10 1μl(50ng)、frag11 2μl(100ng)、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，挑取60个克隆，测序鉴定，根据测序结果确定突变体的突变性质。
将各种突变体GFP11M7-HBc(20ng)分别与质粒PCH-GFP 1-9(60ng)和pGFP10-HBc(20ng)共转染接种于96孔板中的HEK293细胞，48h后通过荧光显微镜观测荧光，与对照组pGFP11-HBc(20ng)+PCH-GFP 1-9(60ng)+pGFP10-HBc(20ng)比较荧光强度。其它位点的饱和突变体制备方法与GFP11M7-HBc的制备方法类似，仅PCR扩增时所用的引物序列根据突变位点的不同而不同。
第二轮筛选中，我们共获得了135种突变体，转染实验显示，这些突变体有5种突变体可在普通荧光显微镜下观测到荧光，但仍无一种突变体较原来的三分段sfGFP表现出显著增强的荧光信号。
实施例二、通过高亲和分子对提高三分段sfGFP系统的信号强度
由于实施例一未能成功，因此我们继续尝试前述的策略二。我们希望通过在GFP1-9和GFP11上分别融合一对高亲和力分子，从而提高GFP1-9和GFP11的亲和力，增加整个系统的信号强度，原理如图3A所示：通过将一对具有高亲和力的分子对P1和P2分别融合到GFP1-9和GFP11上，增加GFP1-9-P1和GFP11-P2-B之间的亲和力，从而增强最终的荧光信号。我们选用了两对具有亲和力的分子对，它们的分子量不相同，分子对之间的亲和力大小也不同，Kd为pM级和fM级，分别是N11S和C10(参见文献Dixson等，NanoLuc ComplementationReporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions inCells.ACS Chemical Biology,2015)，CL7和IM7(参见文献Marina等，Efficient,ultra-high-affinity chromatography in a one-step purification of complexproteins.PNAS.2017)，原理如图3C所示，图上显示了其分子量和亲和力的大小。另外，由于GFP1-9和GFP11之间亲和力的极致，就是将二者直接融合起来(共价连接)，从而变成一种新的两分段sfGFP系统，我们在实验研究中也将这一方式包括了进来，原理如图3B所示：GFP1-9和GFP11之间的最大亲和力是将二者共价连接，即融合表达，然后与待测分子A融合，此时变成了一种新的两分sfGFP系统。
为了评价上述各种方式的效果，我们首先构建了基于FKBP12蛋白与FRB蛋白相互作用的三分sfGFP模型。由于FKBP12和FRB之间的相互作用，需要在雷帕霉素(rapamycin，RAP)存在时才能发生，因此可以方便地用RAP来控制这种相互作用，从而能可靠地反映不同检测系统的效果。在此基础上，我们将不同的亲和分子对融合到GFP1-9和GFP11上，再比较其与原来的三分sfGFP系统的检测效果。
1.基于FKBP12/FRB模型评价改进的三分sfGFP系统
本实验需要如下表2中所示的7种表达质粒，质粒结构示意图如图4A所示。
表2.
序号 质粒名称 表达蛋白
1 pGFP10-FKBP12 GFP10-FKBP12
2 pGFP11-FRB GFP11-FRB
3 pGFP1-9-N11S GFP1-9-N11S
4 pGFP11-C10-FRB GFP11-C10-FRB
5 pGFP1-9-CL7 GFP1-9-CL7
6 pGFP11-IM7-FRB GFP11-IM7-FRB
7 pGFP1-9-11-FRB GFP1-9-GFP11-FRB
以下为具体构建过程：
1.1质粒pGFP10-FKBP12的构建
以质粒pGFP10-HBc为模板，用引物F SV40GG2+R amp扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP10-HBc 10ng，引物F SV40GG2(10μM)及R amp(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃30s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag12。
以质粒pGFP10-HBc为模板，用引物F amp+R G4SGG扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP10-HBc 10ng，引物F amp(10μM)及R G4SGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃30s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag13。
基因FKBP12由成都擎科生物技术有限公司合成，用引物F FKBP12+R FKBP12-2扩增该基因，PCR反应体系为：带有FKBP12的质粒10ng，引物F FKBP12(10μM)及R FKBP12-2(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag14。
将以上得到的3个片段frag12、frag13和frag14做Golden gate连接反应，反应体系：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag12 1μl(60ng)、frag13 1μl(60ng)、frag14 0.5μl(30ng)、ddH2O补齐至10μl、总体积10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为pGFP10-FKBP12。
1.2质粒pGFP11-FRB的构建
基因FRB(基因序列如SEQ ID No:55所示)由北京擎科生物技术有限公司合成并克隆得到带有FRB的质粒，用引物F FRB+R FRB-2扩增该基因，PCR反应体系为：带有FRB的质粒10ng，引物F FRB(10μM)及R FRB-2(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag15。
将以上得到的frag12、frag13、frag15做Golden gate连接反应，反应体系：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag12 1μl(60ng)、frag13 1μl(60ng)、frag15 0.5μl(30ng)、ddH2O补齐至10μl，总体积10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为pGFP11-FRB。
1.3质粒pGFP1-9-N11S的构建
质粒pGFP1-9-N11S的构建分两步进行，首先构建了一个过渡质粒pGFP1-9-GS-HBc，构建过程如下：以质粒pGFP10-HBc为模板，用引物F G4SGG7+R Bsmb1vect扩增，反应体系：模板pGFP10-HBc，引物F G4SGG7(10μM)及R Bsmb1 vect(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HSMix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min，94℃15s，55℃15s，72℃1min 30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段(命名为frag16)。以质粒PCH-GFP 1-9为模板，用引物R G1-9+F amp扩增，反应体系：模板PCH-GFP 1-9，引物F amp(10μM)及RG1-9(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min，94℃15s，55℃15s，72℃1min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段(命名为frag17)。
将以上得到的两个片段frag16、frag17做Golden gate连接反应，反应体系为：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag16 1.5μl(50ng)、frag17 2μl(100ng)、ddH2O补齐至10μl，总体积10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pGFP1-9-GS-HBc。
接下来，以质粒pNanoluc(由北京擎科生物技术有限公司合成和克隆，Nanoluc荧光素酶基因序列参见：Dixson等，NanoLuc Complementation Reporter Optimized forAccurate Measurement of Protein Interactionsin Cells.ACS Chemical Biology,2015)为模板，用引物F N11S+R N11S扩增，反应体系：模板Nanoluc 10ng，引物F N11S(10μM)及R N11S(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min，94℃15s，55℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段(命名为frag18)。以质粒pGFP1-9-GS-HBc为模板，用引物R G4SGG+F amp扩增，得到的片段命名为frag19。再以质粒PCH-GFP 1-9为模板，用引物F SV40GG2+R amp扩增，得到的片段命名为frag20。以上三个片段frag18、frag19、frag20做Golden gate连接反应，得到质粒pGFP1-9-N11S。
1.4质粒pGFP11-C10-FRB的构建
首先构建过渡质粒C10-FRB。以上文构建的质粒pGFP11-FRB为模板，用引物F C10-G4S+R amp扩增，得到片段frag21；再用引物F amp+R C10-Bsmb扩增该质粒，得到片段frag22。这两个片段做Golden gate连接，得到质粒C10-FRB。
以质粒pGFP11-HBc为模板，用引物R G4SGG+F amp扩增，得到片段frag23；以质粒C10-FRB为模板，用引物F C10-3+R amp扩增，得到片段frag24。这两个片段做Golden gate连接，得到质粒pGFP11-C10-FRB。
1.5质粒pGFP1-9-CL7的构建
基因CL7(序列参见文献Marina等，Efficient,ultra-high-affinitychromatography in a one-step purification of complex proteins.PNAS.2017)由成都擎科生物技术有限公司合成，用引物F CL7+R CL7扩增该基因，PCR反应体系为：带有CL7的质粒10ng，引物F CL7(10μM)及R CL7(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag25。
以上文构建的质粒pGFP1-9-N11S为模板，用引物F SV40GG2+R G4SGG扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP1-9-N11S 10ng，引物F SV40GG2(10μM)及R G4SGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag26。
将以上得到的两个片段frag25、frag26做Golden gate连接反应，反应体系为：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7ligase 0.25μl、ATP 1μ、frag25 1μl(30ng)、frag26 2μl(100ng)、ddH2O补齐至10μl，总体积10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pGFP1-9-CL7。
1.6质粒pGFP11-IM7-FRB的构建
基因IM7(序列参见文献Marina等，Efficient,ultra-high-affinitychromatography in a one-step purification of complex proteins.PNAS.2017)由北京擎科生物技术有限公司合成，用引物F IM7+R IM7扩增该基因，PCR反应体系为：带有IM7的质粒10ng，引物F IM7(10μM)及R IM7(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃20s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag27。
以质粒pGFP11-FRB为模板，用引物F GS FRB+R amp扩增，得到片段frag28，再用引物R G4SGG+R amp扩增，得到片段frag29。将以上得到的frag27、frag28和frag29做Goldengate连接反应，反应体系：BsmBI酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag27 1μl(60ng)、frag28 1.5μl(80ng)、frag29 0.5μl(30ng)、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为pGFP11-IM7-FRB。
1.7质粒pGFP1-9-11-HBc的构建
首先，以上文构建的质粒pGFP1-9-N11S为模板，用引物F amp+R GS G1-9扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP1-9-N11S 10ng，引物F amp(10μM)及R GS G1-9(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃30S，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag30。
以上文构建的质粒pGFP11-HBc为模板，用引物F G11 GG+R amp扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP11-HBc 10ng，引物F G11 GG(10μM)及R amp(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HSMix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15S，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag31。
将以上得到的两个片段frag30、frag31做Golden gate连接反应，反应体系为：BsmB I酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag30 1.5μl(80ng)、frag31 1μl(60ng)、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pGFP1-9-11-HBc。
1.8质粒pGFP1-9-11-FRB的构建
首先，以上文构建的质粒pGFP1-9-11-HBc为模板，用引物F amp+R G4SGG扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP1-9-11-HBc 10ng，引物F amp(10μM)及R G4SGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃30S，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag32。
以上文构建的质粒pGFP11-HBc为模板，用引物F FRB+R amp扩增。PCR反应体系为：质粒pGFP11-HBc 10ng，引物F FRB(10μM)及R amp(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15S，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag33。
将以上得到的两个片段frag32、fra33做Golden gate连接反应，反应体系为：BsmBI酶0.75μl、Tango buffer 1μl、DTT 1μl、T7 ligase 0.25μl、ATP 1μl、frag32 2μl(90ng)、fra33 1μl(60ng)、ddH2O补齐至10μl。反应条件：37℃5min，20℃5min，循环20次。80℃20min灭活反应。
Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒pGFP1-9-11-FRB。
1.9质粒pGFP11-C10-HBc的构建
以上文构建的质粒pGFP11-C10-FRB为模板，用引物R C10+F amp扩增得到片段frag34；以质粒pGFP10-HBc为模板，用引物F G4SGG7+R amp扩增得到片段frag35。将得到的这两个片段做Golden gate连接反应，得到质粒pGFP11-C10-HBc。
1.10改进型分段sfGFP表征RAP介导的FKBP12/FRB相互作用的细胞转染实验
1.10.1流式细胞分析实验
将HEK293细胞接种到24孔板，第二天转染以下4组质粒：
1.PCH-GFP 1-9(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-FRB(167ng)
2.pGFP1-9-N11S(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-C10-FRB(167ng)
3.pGFP1-9-CL7(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-IM7-FRB(167ng)
4.pGFP1-9-11-FRB(250ng)+pGFP10-FKBP12(250ng)
转染后加入200nM雷帕霉素(Rapamycin，RAP)，以转染后不加RAP的孔为阴性对照。转染后48小时，用流式细胞仪(Becton Dickinson,美国)检测各孔荧光细胞占总细胞的比例以及荧光细胞中的平均荧光强度。结果如表3所示，融合高亲和蛋白CL7与IM7后，在荧光细胞数量上的改善最大，但同时背景荧光也是最强的，其他两个实验组，高亲和蛋白N11S和C10组及GFP1-9-11组信号强度得到显著增强的同时，背景荧光也相对较低。如图4C所示，原来的三分sfGFP系统，其在荧光细胞数量方面的信噪比(S/N)为7.0，而N11S与C10这对亲和蛋白的融合使S/N提高到13.7，GFP1-9和GFP11融合在一起使系统的S/N提高到15.5。如图4D所示，在平均荧光强度方面，N11S与C10亲和蛋白的融合使系统的S/N从99％提高到237％，GFP1-9和G11融合在一起使系统的S/N提高到185％。
表3.
1.10.2激光共聚焦显微分析实验
由于流式细胞分析实验显示，N11S和C10组及GFP1-9-11组对系统的改善作用较好，因此我们继续用激光共聚焦显微镜观测这两组的效果。
将HEK293细胞接种到放置了玻片的24孔板，第二天转染以下3组质粒：
1.PCH-GFP1-9(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-FRB(167ng)
2.pGFP1-9-N11S(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-C10-FRB(167ng)
3.pGFP1-9-11-FRB(250ng)+pGFP10-FKBP12(250ng)
转染后加入RAP 200nM。阴性对照为转染后不加RAP的孔。转染后48小时，取出玻片，做DAPI染色并封片，然后用激光共聚焦显微镜(Leica,德国)观察。结果如图4B所示，在相同激发激光强度下，相对于原来的三分段sfGFP系统，用N11S和C10改进的三分段sfGFP系统以及GFP1-9与GFP11直接融合改进的分段sfGFP系统的荧光信号，得到了显著的提高，而且没有明显可见的背景荧光。
2.改进型分段sfGFP系统表征HBc单体的相互作用的实验
前述结果表明，改进型的分段sfGFP系统能够显著改善RAP介导的FKBP12/FRB相互作用检测效果，为了进一步检测该改进型系统的适用性，我们将该系统用于HBc单体的相互作用检测分析。本测试需要用到的质粒有如下表4中所示的7个：
表4.
序号 质粒名称 表达蛋白
1 PCH-GFP 1-9 GFP 1-9
2 pGFP10-HBc GFP10-HBc
3 pGFP11-HBc GFP11-HBc
4 pGFP1-9-N11S GFP1-9-N11S
5 pGFP11-C10-HBc GFP11-C10-HBc
6 pGFP1-9-11-HBc GFP1-9-11-HBc
7 pGFP10-FKBP12 GFP10-FKBP12
这些质粒均为前面已构建好的质粒，其结构示意图见图5A。
编码蛋白GFP1-9-N11S的核酸序列如SEQ ID No:56所示，编码蛋白GFP11-C10的核酸序列如SEQ ID No:57所示，编码蛋白GFP1-9-11的核酸序列如SEQ ID No:58所示，编码蛋白GFP11-C10-HBc的核酸序列如SEQ ID No:59所示，编码蛋白GFP1-9-11-HBc的核酸序列如SEQ ID No:60所示。
2.1流式细胞分析实验
将HEK293细胞接种到24孔板，第二天转染以下6组质粒：
实验组：
1.PCH-GFP 1-9(167ng)+pGFP10-HBc(167ng)+pGFP11-HBc(167ng)
2.pGFP1-9-N11S(167ng)+pGFP10-HBc(167ng)+pGFP11-C10-HBc(167ng)
3.pGFP1-9-11-HBc(250ng)+pGFP10-HBc(250ng)
阴性对照组：
4.PCH-GFP 1-9(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-HBc(167ng)
5.pGFP1-9-N11S(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-C10-HBc(167ng)
6.pGFP1-9-11-HBc(250ng)+pGFP10-FKBP12(250ng)
转染后48小时，用流式细胞仪检测各孔荧光细胞占总细胞的比例以及细胞中的平均荧光强度，如表5所示，相对于原来的三分段sfGFP系统，两种改进方案转染孔的荧光细胞比例和细胞的平均荧光强度均有显著提高，并且背景荧光较低。具体地，在荧光细胞比例方面，原有三分段sfGFP系统的S/N为4.0，而融合了N11S与C10的改进型S/N提高到12.7，GFP1-9-11改进型的S/N提高到21(图5C)。在平均荧光强度方面(图5D)，原有系统的S/N为119％，而N11S+C10改进型提高到373％，GFP1-9-11改进型提高到538％。由此可见，这两种改进后的分段sfGFP系统在分析HBc单体的相互作用上，较原有三分段sfGFP系统的荧光信号强度显著提高，同时有较低的背景荧光。
表5.
2.2激光共聚焦显微分析实验
将HEK293细胞接种到放置了玻片的24孔板，第二天转染以下6组质粒：
实验组
1.PCH-GFP 1-9(167ng)+pGFP10-HBc(167ng)+pGFP11-HBc(167ng)
2.pGFP1-9-N11S(167ng)+pGFP10-HBc(167ng)+pGFP11-C10-HBc(167ng)
3.pGFP1-9-11-HBc(250ng)+pGFP10-HBc(250ng)
阴性对照组：
4.PCH-GFP 1-9(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-HBc(167ng)
5.pGFP1-9-N11S(167ng)+pGFP10-FKBP12(167ng)+pGFP11-C10-HBc(167ng)
6.pGFP1-9-11-HBc(250ng)+pGFP10-FKBP12(250ng)
转染后48小时，取出玻片并固定封片，然后用激光共聚焦显微镜观察。结果如图5B所示，在相同激发激光强度下，N11S+C10改进型及GFP1-9-11改进型分段sfGFP系统的荧光信号相对于原来的三分sfGFP系统，得到了显著的提高，而且没有明显可见的背景荧光，与流式细胞仪分析结果一致。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgtctctca tgagaaaagg agaagaactg t 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgtctctgt taaggaagaa gtaccggacc gt 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgaccgtc tctcatgccc caaagccacc caa 33
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actcaccgtc tcttaactgg ccgcgactct agatcat 37
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgtctctgt aatgatcatc aggaagatcc atgccccaaa gccacccaa 49
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttacctttcg actcaaacta ttctttcgaa agatcttaac 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgagttaag atctttcgaa agaatagttt gagtcgaaag 40
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcgtctctaa ccatatgatc tcttttttcc atgccccaaa gccacccaa 49
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggttcttctt gaatacgtaa ctgctgccgg aattactgat gcttcg 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgacgaagc atcagtaatt ccggcagcag ttacgtattc aagaag 46
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcgtctctag atccgccacc gcctgatcca gacgaaggaa gaagt 45
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgtctctat ctgtgagcgg ctggcggctg ttca 34
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgcgtccgtc tctagatcca cctcctccag atcca 35
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgcgtccgtc tccttcgttc cactgagcgt caga 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctgaccgtc tctcgaaaac tcacgttaag ggat 34
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
actcaccgtc tcttcgtctg gatcaggcgg tggcggt 37
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgtctctat ctggagtgca ggtggaaacc a 31
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcgtctctac gaaggaagaa gtaccggacc gtct 34
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgtctctat ctatcctctg gcatgagatg t 31
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcgtctcgat ctgaaaaaag agatcatatg gttcttct 38
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acgtctctgt tattccagtt ttagaagctc ca 32
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgtctctgt tactttgaga ttcgtcggaa ca 32
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acgtctcttt caggaggtgg tggctcaatc ctctggcatg agatgtg 47
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcgtctctat cttctaaatc taatgagcca ggc 33
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgtctctgt tatccttcaa tatcaatatt cctt 34
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tcgtctctat ctgaattgaa aaattctata tctg 34
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acgtctcttg aaccgccacc gcctgatccg ccttgtttaa agccaggtt 49
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
accgtctctc atggcctcct ccgaggacgt ca 32
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgcgtccgtc tctgttatca gttatctaga tccggt 36
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tcgtctctat ctcttttttc catgccccaa ag 32
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> s=c或g
<400> 31
acgtctctag atsssatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> w=a或t
<400> 32
acgtctctag atsswatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> s=c或g
<400> 33
acgtctctag atswsatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> w=a或t
<400> 34
acgtctctag atswwatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> s=c或g
<400> 35
acgtctctag atwssatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> w=a或t
<400> 36
acgtctctag atwswatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> s=c或g
<400> 37
acgtctctag atwwsatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> w=a或t
<400> 38
acgtctctag atwwwatggt tcttcttgaa tacgtaact 39
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gctgaccgtc tctcgaaaac tcacgttaag ggat 34
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
tgcgtccgtc tccttcgttc cactgagcgt caga 34
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tcgtctctca tagcatctct tttttccatg c 31
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> s=c或g
<400> 42
acgtctctta tgssscttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> w=a或t
<400> 43
acgtctctta tgsswcttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> s=c或g
<400> 44
acgtctctta tgswscttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> w=a或t
<400> 45
acgtctctta tgswwcttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 46
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> s=c或g
<400> 46
acgtctctta tgwsscttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 47
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> s=c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> w=a或t
<400> 47
acgtctctta tgwswcttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w=a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> s=c或g
<400> 48
acgtctctta tgwsscttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 49
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> w=a或t
<400> 49
acgtctctta tgwwwcttct tgaatacgta actgctg 37
<210> 50
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
acgtctctca tggtcttcac actcgaaga 29
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tcgtctctgt tagctgttga tggttactcg ga 32
<210> 52
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acgtctcttg ttcaagaaga ttagccgttc gtctggatca ggcggtggcg gttcag 56
<210> 53
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tcgtctctaa cagccgccag ccgctcacca tgccccaaag ccacccaagg ctaa 54
<210> 54
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tcgtctctac gaacggctaa tcttcttgaa cagc 34
<210> 55
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
atgatcctct ggcatgagat gtggcatgaa ggcctggaag aggcatctcg tttgtacttt 60
ggggaaagga acgtgaaagg catgtttgag gtgctggagc ccttgcatgc tatgatggaa 120
cggggccccc agactctgaa ggaaacatcc tttaatcagg cctatggtcg agatttaatg 180
gaggcccaag agtggtgcag gaagtacatg aaatcaggga atgtcaagga cctcctccaa 240
gcctgggacc tctattatca tgtgttccga cgaatctcaa ag 282
<210> 56
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
atgagaaaag gagaagaact gtttaccggt gttgtgccaa ttttgattga actcgatggt 60
gatgtcaacg gacataagtt cttcgtgaga ggcgaaggag aaggtgacgc caccattgga 120
aaattgtcgc ttaaattcat ctgtactact ggtaaacttc ctgtaccatg gccgactctc 180
gtaacaacgc ttacgtacgg agttcagtgc ttttcgagat acccagacca tatgaaaaga 240
catgactttt ttaagtcggc tatgcctgaa ggttacgtgc aagaaagaac aatttacttc 300
aaagatgatg gaaaatataa aactagagca gaagttaaat ttgaaggaga tactttggtt 360
aaccgcattg aactgaaagg aattgatttt aaagaagatg gtaatattct tggacacaaa 420
ctcgaataca attttaacag tcataaagta tacatcactg ctgataagca aaacaacgga 480
attaaagcga atttcacaat ccgccataat gtagaagatg gcagtgttca acttgccgac 540
cattaccaac aaaacacccc tattggagac ggtccggtac ttcttccttc gtctggatca 600
ggcggtggcg gttcaggagg tggtggctca ggcggaggag gttccggtgg cggcggcagt 660
ggtggtggag gctctggtgg tggaggctct ggaggcggag gttcaggagg tggtggatct 720
ggaggaggtg gatctgtctt cacactcgaa gatttcgttg gggactggga acagacagcc 780
gcctacaacc tggaccaagt ccttgaacag ggaggtgtgt ccagtttgct gcagaatctc 840
gccgtgtccg taactccgat ccaaaggatt gtccggagcg gtgaaaatgc cctgaagatc 900
gacatccatg tcatcatccc gtatgaaggt ctgagcgccg accaaatggc ccagatcgaa 960
gaggtgttta aggtggtgta ccctgtggat gatcatcact ttaaggtgat cctgccctat 1020
ggcacactgg taatcgacgg ggttacgccg aacatgctga actatttcgg acggccgtat 1080
gaaggcatcg ccgtgttcga cggcaaaaag atcactgtaa cagggaccct gtggaacggc 1140
aacaaaatta tcgacgagcg cctgatcacc cccgacggct ccatgctgtt ccgagtaacc 1200
atcaacagct aa 1212
<210> 57
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
atggaaaaaa gagatcatat ggttcttctt gaatacgtaa ctgctgccgg aattactgat 60
gcttcgtcgt cgtctggatc aggcggtggc ggttcaggag gtggtggctc aggcggagga 120
ggttccggtg gcggcggcag tggtggtgga ggctctggtg gtggaggctc tggaggcgga 180
ggttcaggag gtggtggatc tggaggaggt ggatctgtga gcggctggcg gctgttcaag 240
aagattagc 249
<210> 58
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
atgagaaaag gagaagaact gtttaccggt gttgtgccaa ttttgattga actcgatggt 60
gatgtcaacg gacataagtt cttcgtgaga ggcgaaggag aaggtgacgc caccattgga 120
aaattgtcgc ttaaattcat ctgtactact ggtaaacttc ctgtaccatg gccgactctc 180
gtaacaacgc ttacgtacgg agttcagtgc ttttcgagat acccagacca tatgaaaaga 240
catgactttt ttaagtcggc tatgcctgaa ggttacgtgc aagaaagaac aatttacttc 300
aaagatgatg gaaaatataa aactagagca gaagttaaat ttgaaggaga tactttggtt 360
aaccgcattg aactgaaagg aattgatttt aaagaagatg gtaatattct tggacacaaa 420
ctcgaataca attttaacag tcataaagta tacatcactg ctgataagca aaacaacgga 480
attaaagcga atttcacaat ccgccataat gtagaagatg gcagtgttca acttgccgac 540
cattaccaac aaaacacccc tattggagac ggtccggtac ttcttccttc gtctggatca 600
ggcggtggcg gatctgaaaa aagagatcat atggttcttc ttgaatacgt aactgctgcc 660
ggaattactg atgcttcg 678
<210> 59
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
atggaaaaaa gagatcatat ggttcttctt gaatacgtaa ctgctgccgg aattactgat 60
gcttcgtcgt cgtctggatc aggcggtggc ggttcaggag gtggtggctc aggcggagga 120
ggttccggtg gcggcggcag tggtggtgga ggctctggtg gtggaggctc tggaggcgga 180
ggttcaggag gtggtggatc tggaggaggt ggatctgtga gcggctggcg gctgttcaag 240
aagattagcc gttcgtctgg atcaggcggt ggcggttcag gaggtggtgg ctcaggcgga 300
ggaggttccg gtggcggcgg cagtggtggt ggaggctctg gtggtggagg ctctggaggc 360
ggaggttcag gaggtggtgg atctggagga ggtggatctt cgtctggatc aggcggtggc 420
ggttcaggag gtggtggctc aggcggagga ggttccggtg gcggcggcag tggtggtgga 480
ggctctggtg gtggaggctc tggaggcgga ggttcaggag gtggtggatc tggaggaggt 540
ggatctgaca tcgaccctta taaagaattt ggagctactg tggagttact ctcgtttttg 600
ccttctgact tctttccttc agtacgagat cttctagata ccgcctcagc tctgtatcgg 660
gaagccttag agtctcctga gcattgttca cctcaccata ctgcactcag gcaagcaatt 720
ctttgctggg gggaactaat gactctagct acctgggtgg gtgttaattt ggaagatcca 780
gcgtctagag acctagtagt cagttatgtc aacactaata tgggcctaaa gttcaggcaa 840
ctcttgtggt ttcacatttc ttgtctcact tttggaagag aaacagttat agagtatttg 900
gtgtctttcg gagtgtggat tcgcactcct ccagcttata gaccaccaaa tgcccctatc 960
ctatcaacac ttccggagac tactgttgtt agacgacgag gcaggtcccc tagaagaaga 1020
actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa tcgccgcgtc gcagaagatc tcaatctcgg 1080
gaatctcaat gttag 1095
<210> 60
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
atgagaaaag gagaagaact gtttaccggt gttgtgccaa ttttgattga actcgatggt 60
gatgtcaacg gacataagtt cttcgtgaga ggcgaaggag aaggtgacgc caccattgga 120
aaattgtcgc ttaaattcat ctgtactact ggtaaacttc ctgtaccatg gccgactctc 180
gtaacaacgc ttacgtacgg agttcagtgc ttttcgagat acccagacca tatgaaaaga 240
catgactttt ttaagtcggc tatgcctgaa ggttacgtgc aagaaagaac aatttacttc 300
aaagatgatg gaaaatataa aactagagca gaagttaaat ttgaaggaga tactttggtt 360
aaccgcattg aactgaaagg aattgatttt aaagaagatg gtaatattct tggacacaaa 420
ctcgaataca attttaacag tcataaagta tacatcactg ctgataagca aaacaacgga 480
attaaagcga atttcacaat ccgccataat gtagaagatg gcagtgttca acttgccgac 540
cattaccaac aaaacacccc tattggagac ggtccggtac ttcttccttc gtctggatca 600
ggcggtggcg gatctgaaaa aagagatcat atggttcttc ttgaatacgt aactgctgcc 660
ggaattactg atgcttcgtc gtcgtctgga tcaggcggtg gcggttcagg aggtggtggc 720
tcaggcggag gaggttccgg tggcggcggc agtggtggtg gaggctctgg tggtggaggc 780
tctggaggcg gaggttcagg aggtggtgga tctggaggag gtggatcctc gtctgacatc 840
gacccttata aagaatttgg agctactgtg gagttactct cgtttttgcc ttctgacttc 900
tttccttcag tacgagatct tctagatacc gcctcagctc tgtatcggga agccttagag 960
tctcctgagc attgttcacc tcaccatact gcactcaggc aagcaattct ttgctggggg 1020
gaactaatga ctctagctac ctgggtgggt gttaatttgg aagatccagc gtctagagac 1080
ctagtagtca gttatgtcaa cactaatatg ggcctaaagt tcaggcaact cttgtggttt 1140
cacatttctt gtctcacttt tggaagagaa acagttatag agtatttggt gtctttcgga 1200
gtgtggattc gcactcctcc agcttataga ccaccaaatg cccctatcct atcaacactt 1260
ccggagacta ctgttgttag acgacgaggc aggtccccta gaagaagaac tccctcgcct 1320
cgcagacgaa ggtctcaatc gccgcgtcgc agaagatctc aatctcggga atctcaatgt 1380
tag 1383

Claims (4)

1.一种蛋白片段，其特征在于：编码所述蛋白片段的核酸序列如SEQ ID No:56所示，或SEQ ID No:57所示，或SEQ ID No:58所示。
2.一种用于蛋白相互作用检测的分段绿色荧光蛋白系统，包括三分sfGFP系统中的GFP10，其特征在于：还包括由SEQ ID No:58所示核酸序列编码的蛋白，或者还包括由SEQID No:56和SEQ ID No:57所示核酸序列编码的蛋白。
3.含有权利要求1中所述核酸序列的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
4.权利要求1所述蛋白片段在检测蛋白质之间是否相互作用中的应用；或权利要求1中所述核酸序列在检测蛋白质之间是否相互作用中的应用。
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