CN1968962A - 新型可溶性cd14抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物体内的新型蛋白质，可提供可用作败血症诊断标志的具有下述1)－3)性质的可溶性CD14抗原、重组型可溶性CD14片段：1)非还原条件下的SDS－PAGE中，分子量为13±2kDa，2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及3)与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。

Description

新型可溶性CD14抗原
技术领域
本发明涉及可作为败血症诊断标志的生物体内的新型抗原。本发明还涉及以测定该抗原为特征的败血症的诊断方法、使用特定的抗体的该抗原的测定试剂盒及其测定方法。本发明又涉及可用作该测定试剂盒的标准物质的重组型可溶性片段、与该片段结合的抗体、该片段的生产方法、以及使用该片段筛选抗体的方法。
背景技术
CD14分子作为由识别在单核细胞的膜表面表达的糖蛋白的一组抗体鉴定的蛋白质，于1986年第3届白细胞分型会议(Leukocyte TypingConference)上得到命名。1990年，Wright等人明确了CD14分子是内毒素LPS的受体(Science(美国)、1990年、第249卷、1431-1433页)。通过cDNA分析，明确了该CD14分子是分子量为53-55kDa的糖蛋白，其mRNA约1.4kb大小，含有356个氨基酸(Nucleic Acids Research(英国)、1988年、第16卷、4173页)。
有报告指出：人CD14分子除膜结合型CD14之外，还有可溶型CD14，血液中存在分子量不同的多种可溶型CD14(European Journalof Immunology(德国)、1993年、第23卷、2144-2151页)。另外，Landmann等人报道：对败血症患者血清中的可溶型CD14进行蛋白质印迹分析，发现约55kDa的可溶型CD14在败血症死亡病例或阵发性睡眠性血红蛋尿症(PNH)患者中的数值高，而在正常人血清中未见该分子，而在正常人中检测出了分子量稍小的49kDa的可溶型CD14(The Journal ofInfectious Disease(美国)、1995年、第171卷、639-644页)。
关于该分子量不同的亚型，Stelter等人指出：这与糖链的不同有关，另外，即使除去N和O结合型糖链，血液中仍存在两种不同分子量的可溶型CD14(European Journal of Biochemistry(德国)、1996年、第236卷、457-464页)。另外，Bufler等人对可溶型CD14的C末端进行分析，指出GPI基与可溶型CD14的第327位的丝氨酸残基结合，具有约56kDa分子量的可溶型CD14是没有GPI锚定的分子种类的(European Journal of Immunology(德国)、1995年、第25卷、604-610页)。
关于重组型可溶性CD14的全长以及其片段，Juan等人报告：含有人CD14的N末端1位-152位的片段具有将LPS信号转导至细胞的功能(Journal of Biological Chemistry(美国)、1995年、第278卷、1382-1387页)，但含有N末端1位-124位的片段和含有N末端1位-98位的片段的表达并未成功。另外，Majerle等人指出：具有三个单元富亮氨酸重复LRR区、含有人CD14的N末端1位-152位的片段再折叠，只具有两个单元LRR区的、含有人CD14的N末端1位-134位的片段不发生再折叠，但是含有N末端1位-69位的片段的表达并未成功(Pflugers Arch-European Journal of Physiology(德国)、2000年、第439卷[Suppl]、R109-R110页)，在本报告中，N末端1位-69位的片段表达并没有成功。
人们制作了很多抗CD14抗体，其代表性的有：Bazil等人制备的MEM-18(European Journal of Immunology(德国)、1986年、第16卷、1583-1589页)、Shutt等人制备的RoMo-1(Allergie und Immunologie(德国)、1998年、第34卷、17-26页)、Steinman等人制备的3C10(Journalof Experimental Medicine(美国)、1983年、第158卷、126-145页)，它们用于CD14蛋白质的鉴定。
Shutt等人(西德专利公开第286876号)、Bazil等人(MolecularImmunology(英国)、1989年、第26卷、657-662页)；Grunwald等人(Journal of Immunological Methods(荷兰)、1992年、第155卷、225-232页)中报道了使用这些抗体的可溶型CD14的测定系统，可以测定人体液中的可溶型CD14。
并且，IBL-Hamburg、Medgenix、R&D Systems等公司销售了可溶型CD14-ELISA试剂盒，可以在以败血症为代表的多种疾病中进行可溶型CD14的测定(Clinical Immunology And Immunopathology(美国)、1996年、第80卷、307-310页；“临床检查”(日本)、1994年、第38卷、341-344页)。
但是，即使是败血症以外的疾病，伴随着疾病的进程，涉及上述约55kDa、49kDa的可溶型CD14(根据报告，其分子量不同，因此并不限于约55kDa、49kDa，以下也相同)的浓度上升，已明确可溶型CD14并不是败血症特异性标志物(Infection and Immunty(美国)、1999年、第67卷、417-420页；Clinical and Experimental Immunology(英国)、2000年、第120卷、483-487页；Clinical and Experimental Immunology(英国)、1994年、第96卷、15-19页)。另外，虽然可溶型CD14有望成为败血症重症的标志物，但是并未见到其与败血症性休克的相关性(Pediatric allergy and Immunology(丹麦)、1997年、第8卷、194-199页)，也未见其与全身性炎症反应综合征(SIRS)的相关性(EuropeanJournal of Clinical Investigation(英国)、1998年、第28卷、672-678页)，并不能成为败血症的诊断药。
与Landmann等人发现：与所报道的上述约55kDa和49kDa两种可溶型CD14(高分子量CD14(根据报告，其分子量不同，因此并不限于约55kDa、49kDa，以下也相同))不同的是，约36kDa的可溶型低分子量CD14存在于血液中，该低分子量CD14在正常人中少，在败血症患者中增加，并确认了可溶型低分子量CD14的测定在临床上有用。作为该可溶型低分子量CD14的测定方法，有人提出了从血液中可溶型CD14的总量中减去血液中高分子量CD14的量，间接求出血液中低分子CD14的量(国际公开第WO01/22085号)。
发明内容
在上述状况下，人们希望有一种生物体内的新型抗原，该抗原可可简便地检测、可作为败血症的诊断标志物。还希望获得使用特定抗体测定该抗原的测定试剂盒及其方法。又希望有对该抗原的测定有用的抗体的筛选方法。还希望有与该抗原的免疫功能类似的重组型可溶性片段及其片段的生产方法。
本发明人进行了深入地研究，结果发明了存在于人血液中、具有CD14序列的新型抗原。并且发明了通过测定该抗原进行的诊断败血症的方法或检测败血症的方法。
还发明了与该抗原具有免疫学类似的性质的重组型可溶性片段及其片段的生产方法，并发明了与该片段特异性结合的抗体。
又发明了可测定该抗原的试剂盒以及测定方法，所述试剂盒含有“与含有人全长可溶型CD14的特定氨基酸序列的肽特异性结合的抗体”或该抗体的片段、“以含有人全长可溶型CD14的特定氨基酸序列的肽作为抗原制备的抗体”或该抗体的片段、或者“与该片段特异性结合的抗体”或该抗体片段作为构成要素。
本发明人又发明了可用作该抗原测定的抗体的筛选方法。
本说明书中，“可溶性CD14抗原”可以称作“可溶性CD14蛋白质”。另外，“重组型可溶性CD14片段”可称作“重组型可溶性CD14蛋白质”，不过，由于具有人全长可溶型CD14的部分序列的含义，因此使用术语“片段”。“片段”可以按照常规技术用语解释。在本发明中，是含有对象蛋白质的氨基酸序列部分序列的蛋白质的一部分，与该蛋白质的立体结构、糖链或者脂质等附加物与对象蛋白质的区别无关。
即，本发明提供以下(1)-(13)。
(1)可溶性CD14抗原，该抗原具有下述1)-3)的性质：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)N末端序列中具有序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及
3)与含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
(2)重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质，由下述<1>-<3>步骤获得：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合；
<1>制备具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了规定的蛋白分解酶切断部位的序列；或者制备具有该部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区域有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
<2>将<1>中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤，以及
<3>回收<2>中切断的片段的N末端一侧的片段的步骤。
(3)重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
(4)败血症的诊断或检测方法，其特征在于：测定上述(1)的可溶性CD14抗原。
(5)可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其用于测定检体中所含的上述(1)的可溶性CD14抗原，所述试剂盒含有至少一种与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段。
(6)上述(1)的可溶性CD14抗原的免疫学测定方法，其特征在于：使至少一种与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合。
(7)抗体，该抗体与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合。
(8)抗体，该抗体与上述(2)的重组型可溶性CD14片段特异性结合。
(9)抗体，该抗体与上述(3)的重组型可溶性CD14片段特异性结合。
(10)可用于测定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗体的筛选方法，所述筛选方法包含以下步骤：
1)制备一种抗体作为筛选对象检体的步骤，其中所述抗体与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合，
2)制备含有CD14的测定对象液的步骤，
3)使用1)中制备的抗体或2)中制备的测定对象液，构成免疫测定系统的步骤，
4)通过3)中构成的免疫测定系统对测定对象液进行测定的步骤，以及
5)由4)所得的测定结果评价可用于测定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗体并选择的步骤。
(11)可用于测定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗体的筛选方法，该筛选方法包含以下步骤：
1)制备作为筛选对象检体的抗体的步骤，
2)制备上述(2)的重组型可溶性CD14片段的步骤，
3)将1)中制备的抗体与2)中制备的片段反应，评价1)中制备的抗体和2)中制备的片段的特异性结合的步骤，以及
4)选择在3)中能与2)中制备的片段特异性结合的抗体作为可用于测定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗体的步骤。
(12)上述(2)的重组型可溶性CD14片段的生产方法，该方法包含以下步骤：
<1>制备具有下述1)-4)的序列的重组型可溶性CD14片段的步骤：
1)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
2)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
3)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，
4)在SEQ ID No.3的59位-70位的后面取代或插入以附加规定的蛋白分解酶的切断部位序列；
<2>将<1>中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤；以及
<3>将<2>中切断的片段的N末端一侧的片段进行回收的步骤。
以下，对本发明的上述(1)-(13)进行详细描述。
即，本发明提供以下的新型可溶性CD14抗原、重组型可溶性CD14片段和新型的败血症诊断方法或检测方法。
(1)下述(1-1)或(1-2)所示的新型可溶性CD14抗原。
(1-1)具有下述1)-3)性质的可溶性CD14抗原：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及
3)与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
(1-2)4)可由人血浆得到的(1-1)的可溶性CD14抗原。
(2)下述(2-1)-(2-18)任一项所示的重组型可溶性CD14片段。
(2-1)重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质，由下述<1>-<3>的步骤得到：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与抗体特异性结合，该抗体以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽为抗原制备；
<1>制备具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了规定的蛋白分解酶切断部位的序列；或者制备具有该部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区域有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
<2>将<1>中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤，以及
<3>回收<2>中切断的片段的N末端一侧的片段的步骤；
(2-2)(2-1)的重组型可溶性CD14片段，其中，在上述(2-1)、<1>的步骤中，制备具有下述4)-7)序列的重组型可溶性CD14片段：
4)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
5)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
6)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，以及
7)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位的序列；
(2-3)(2-2)的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的7)中，规定的蛋白分解酶是ProScission Protease，切断部位的序列为Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro；
(2-4)(2-2)的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的7)中，规定的蛋白分解酶是凝血酶，切断部位的序列为Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser；
(2-5)(2-2)-(2-4)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的5)中，N末端为SEQ ID No.3的1位-6位的其中之一；
(2-6)(2-2)-(2-4)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的5)中，N末端为SEQ ID No.3的1位；
(2-7)(2-2)-(2-6)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的7)中，在SEQ ID No.3的59位-80位的任一位置后面取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位序列；
(2-8)(2-2)-(2-6)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的7)中，在SEQ ID No.3的64位-75位的任一位置后面取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位序列；
(2-9)(2-2)-(2-6)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的7)中，在SEQ ID No.3的64位后面取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位序列；
(2-10)(2-2)-(2-4)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在<1>步骤的5)中，N末端为SEQ ID No.3的1位，在7)中，在SEQ ID No.3的64位后面取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位序列；
(2-11)(2-1)或(2-10)的重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述8)-10)的序列：
8)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区域有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
9)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位的其中之一，以及
10)C末端为SEQ ID No.3的59位-90位的其中之一；
(2-12)(2-11)的重组型可溶性CD14片段，其中，在9)中，N末端为SEQ ID No.3的1位-6位其中之一；
(2-13)(2-11)的重组型可溶性CD14片段，其中，在9)中，N末端为SEQ ID No.3的1位。
(2-14)(2-11)-(2-13)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在10)中，C末端为SEQ ID No.3的59位-80位其中之一；
(2-15)(2-11)-(2-13)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在10)中，C末端为SEQ ID No.3的64位-75位其中之一；
(2-16)(2-11)-(2-13)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在10)中，C末端为SEQ ID No.3的64位；
(2-17)(2-11)的重组型可溶性CD14片段，其中，在9)中，N末端为SEQ ID No.3的1位，在10)中，C末端为SEQ ID No.3的64位；
(2-18)(2-1)-(2-18)的重组型可溶性CD14片段，该片段还具有下述11)的性质：
11)不与LPS结合。
(3)重组型可溶性CD14片段，该片段如下述(3-1)-(3-9)中任一项所示：
(3-1)重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合；
(3-2)(3-1)的重组型可溶性CD14片段，该片段还具有下述4)的性质：
4)不与LPS结合；
(3-3)(3-1)或(3-2)的重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述5)-7)的序列：
5)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
6)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，以及
7)C末端为SEQ ID No.3的59位-90位其中之一；
(3-4)(3-3)的重组型可溶性CD14片段，其中，在6)中，N末端为SEQ ID No.3的1位-6位其中之一；
(3-5)(3-3)的重组型可溶性CD14片段，其中，在6)中，N末端为SEQ ID No.3的1位；
(3-6)(3-3)-(3-5)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在7)中，C末端为SEQ ID No.3的59位-80位其中之一；
(3-7)(3-3)-(3-5)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在7)中，C末端为SEQ ID No.3的64位-75位其中之一；
(3-8)(3-3)-(3-5)中任一项的重组型可溶性CD14片段，其中，在6)中，N末端为SEQ ID No.3的1位，在7)中，C末端为SEQ ID No.3的64位-75位其中之一；
(3-9)(3-3)-(3-8)中任一项的重组型可溶性CD14片段，该片段具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列。
(4)败血症的诊断方法，该方法如下述(4-1)-(4-4)中任一项所示：
(4-1)败血症的诊断或检测方法，其特征在于：测定上述(1)的可溶性CD14抗原；
(4-2)(2-1)的败血症的诊断或检测方法，其特征在于：包含下述步骤：
1)对由受试者采集的血液中所含有上述(1)的可溶性CD14抗原进行测定，
2)将测定值与正常人的标准值进行比较，以及
3)评价受试者是否为败血症；
(4-3)(2-2)的败血症的诊断或检测方法，其特征在于：测定上述(1)的可溶性CD14抗原的步骤是免疫学测定。
(4-4)(2-2)的败血症的诊断或检测方法，其特征在于：测定上述(1)的可溶性CD14抗原的步骤是通过夹层免疫测定法测定。
本发明还提供以下的新型可溶性CD14抗原测定试剂盒和测定方法。
(5)上述(1)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该试剂盒如下述(5-1)-(5-8)中任一项所示：
(5-1)可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其用于测定检体中所含的上述(1)的可溶性CD14抗原，该试剂盒含有至少一种上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段；
(5-2)(5-1)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其特征在于：含有以下a)-d)中的任意抗体或该抗体的片段作为可与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段：
a)与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体，
b)以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
c)以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体；
d)与上述(2)或(3)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体；
(5-3)(5-1)或(5-2)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段是d)与上述(2)或(3)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体或该抗体的片段；
(5-4)(5-1)-(5-3)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段是以上述(2)或(3)的重组型可溶性CD14片段作为抗原而制备的抗体或该抗体的片段；
(5-5)(5-1)-(5-4)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段是以上述(2)或(3)的重组型可溶性CD14片段作为抗原而制备的单克隆抗体或该抗体的片段。
(5-6)(5-1)-(5-4)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该测定试剂盒如下述(5-6-1)-(5-6-19)中任一项所示，通过夹层免疫测定法测定上述(1)的可溶性CD14抗原：
(5-6-1)通过夹层免疫测定法测定上述(1)的可溶性CD14抗原，
(5-6-2)(5-6-1)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该试剂盒还含有与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的第二结合物质，
(5-6-3)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述第二结合物质是与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段，
(5-6-4)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述第二结合物质是与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的单克隆抗体，
(5-6-5)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述第二结合物质是与SEQ ID No.3的人全长可溶型CD14蛋白质的1位-52位氨基酸残基的任何区特异性结合的抗体或该抗体的片段，或者是与上述抗体竞争或显示交叉反应性的抗体或该抗体的片段，上述抗体是指与SEQ ID No.3的人全长可溶型CD14蛋白质的1位-52位氨基酸残基的任何区特异性结合的抗体，
(5-6-6)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述第二结合物质是与SEQ ID No.3的人全长可溶型CD14蛋白质的17位-26位氨基酸残基中任何区特异性结合的抗体或该抗体的片段，或者是与上述抗体竞争或显示交叉反应性的抗体或该抗体的片段，上述抗体是指与SEQ ID No.3的人全长可溶型CD14蛋白质的17位-26位氨基酸残基的任何区特异性结合的抗体，
(5-6-7)(5-6-1)-(5-6-6)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述a)-d)的任意抗体或该抗体的片段与不溶性载体结合。
(5-6-8)(5-6-2)-(5-6-6)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述第二结合物质与不溶性载体结合。
(5-6-9)(5-6-1)-(5-6-6)或(5-6-8)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述a)-d)的任意抗体或该抗体的片段被标记。
(5-6-10)(5-6-1)-(5-6-7)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述第二结合物质被标记。
(5-6-11)(5-6-2)-(5-6-10)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该测定试剂盒还含有形成第二特异结合的第二特异结合物质。
(5-6-12)(5-6-11)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，与第二特异结合物质结合的对象是上述a)-c)中任一项的抗体或该抗体的片段、或者是上述第二结合物质。
(5-6-13)(5-6-11)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，该测定试剂盒还含有与第二特异结合物质结合的第二特异结合物质的对象。
(5-6-14)(5-6-11)-(5-6-13)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，形成第二特异结合的第二特异结合物质或第二特异结合物质的对象与不溶性载体结合。
(5-6-15)(5-6-11)-(5-6-13)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，形成第二特异结合的第二特异结合物质或第二特异结合物质的对象被标记。
(5-6-16)(5-6-1)-(5-6-8)或(5-6-11)-(5-6-14)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，该测定试剂盒含有标记的上述(1)的可溶性CD14抗原或标记的上述(1)的可溶性CD14抗原的类似物，通过竞争法的夹层免疫测定法测定，
(5-6-17)(5-6-9)、(5-6-10)、(5-6-15)或(5-6-16)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，标记是通过酶、染料、胶体金、着色胶乳、化学发光物质、荧光物质或同位素的至少一种进行标记。
(5-6-18)(5-6-16)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，标记的上述(1)的可溶性CD14抗原的类似物是标记的上述(2)的重组可溶性CD14片段，
(5-6-19)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其中，上述a)-c)的任意抗体或该抗体的片段与不溶性载体结合，上述第二结合物质是上述d)的抗体或该抗体的片段；
(5-7)(5-1)-(5-6)中任一项的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该测定试剂盒通过凝聚法、直接固相法或竞争法测定；
(5-8)(5-1)-(5-7)的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该测定试剂盒还含有上述(2)或(3)的重组型可溶性CD14片段作为标准物质。
(6)上述(1)的可溶性CD14抗原的测定方法，该测定方法如下述(6-1)-(6-3)中任一项所示：
(6-1)上述(1)的可溶性CD14抗原的免疫学测定方法，其特征在于：使至少一种与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合；
(6-2)(6-1)的可溶性CD14抗原的免疫学测定方法，其特征在于：使用下述a)-d)的任意的抗体或该抗体的片段作为与上述(1)可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段：
a)与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体，
b)以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
c)以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
d)与上述(2)或(3)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体；
(6-3)(6-2)的可溶性CD14抗原的免疫学测定方法，其特征在于：使用与上述(1)的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质，通过上述a)-c)中任意的抗体或该抗体的片段和该第二结合物质的夹层免疫测定法，测定上述(1)的可溶性CD14抗原。
本发明又提供以下的新型抗体和可用于上述(1)的可溶性CD14抗原测定的抗体的筛选方法。
(7)与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体，该抗体如下述(7-1)-(7-4)所示：
(7-1)与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体；
(7-2)(7-1)的抗体，该抗体基本上不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质结合，而与上述(1)的可溶性CD14抗原特异性结合；
(7-3)(7-1)或(7-2)的抗体，其特征在于：该抗体以上述(2)的重组型可溶性CD14片段作为抗原进行制备；
(7-4)(7-1)-(7-3)中任一项的抗体，该抗体为单克隆抗体。
(8)与上述(2)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体，该抗体如下述(8-1)-(8-5)中任一项所示：
(8-1)与上述(2)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗；
(8-2)(8-1)的抗体，该抗体基本上不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质结合，而与上述(2)的重组型可溶性CD14片段结合；
(8-3)(8-1)或(8-2)的抗体，其特征在于：该抗体以上述(2)的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备；
(8-4)(8-1)-(8-3)中任一项的抗体，该抗体为单克隆抗体；
(8-5)(8-4)的抗体，该抗体为F1237-3-4抗体。
(9)与上述(3)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体，该抗体如下述(9-1)-(9-4)中任一项所示：
(9-1)与上述(3)的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体；
(9-2)(9-1)的抗体，该抗体基本上不与人血液中的全长可溶性CD14蛋白结合，而与上述(3)的重组型可溶性CD14片段结合；
(9-3)(9-1)或(9-2)的抗体，其特征在于：该抗体以上述(3)的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备；
(9-4)(9-1)-(9-3)中任一项的抗体，该抗体为单克隆抗体。
(10)可用于上述(1)的可溶性CD14抗原测定的抗体的筛选方法，该筛选方法如下述(10-1)-(10-13)中任一项所示：
(10-1)可用于上述(1)的可溶性CD14抗原测定的抗体的筛选方法，该方法包含以下步骤：
1)制备与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合的抗体作为筛选对象检体，
2)制备含有CD14的测定对象液的步骤，
3)使用1)中制备的抗体或2)中制备的测定对象液构成免疫测定系统的步骤，
4)通过3)中构成的免疫测定系统对测定对象液进行测定的步骤，以及
5)通过4)中得到的测定结果，对可用作上述(1)的可溶性CD14抗原的测定的抗体进行评价并选择的步骤；
(10-2)(10-1)的筛选方法，其特征在于：上述1)步骤中制备的抗体是与含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端选择1位-314位的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合的抗体；
(10-3)(10-1)的筛选方法，其特征在于：上述1)步骤中制备的抗体是以含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基的肽作为抗原而制备的抗体；
(10-4)(10-2)的筛选方法，其特征在于：上述1)步骤中制备的抗体是以下述的肽作为抗原而制备的抗体，该肽含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端选自1位-314位氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基；
(10-5)(10-1)的筛选方法，其特征在于：上述2)的步骤中制备的测定对象液是正常人的体液或人高分子量CD14的标准品；
(10-6)(10-1)-(10-5)中任一项的筛选方法，其特征在于：由上述3)的步骤构成的免疫测定系统是抗原固相法；
(10-7)(10-6)的筛选方法，其特征在于：进一步制备1)中所制备的抗体的标记抗体，由上述3)的步骤构成的抗原固相法是使2)中的测定对象液与不溶性载体结合构成，4)的步骤是通过3)中构成的抗原固相法，使1)中制备的抗体和该标记抗体与测定系统依次反应；
(10-8)(10-6)或(10-7)的筛选方法，其特征在于：上述5)的评价、选择步骤是对1)中制备的抗体不与高分子量CD14特异性结合进行评价并选择；
(10-9)(10-1)-(10-4)中任一项的筛选方法，该方法进一步含有以下步骤，并具有以下特征：
制备1)-(2)的另外一种与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合的抗体或抗CD14抗体的步骤，
上述2)步骤中制备的测定对象液是正常人的体液和败血症患者的体液，
上述3)步骤中构成的免疫测定系统是使用1)和1)-(2)中制备的两种抗体的夹层测定法，
对上述5)的抗体进行评价、选择的步骤是将正常人的体液测定结果与败血症患者的体液测定结果进行比较，根据所比较的测定结果的不同，评价并选择对败血症的诊断有用的、应用于夹层免疫测定法中的抗体；
(10-10)(10-9)的筛选方法，其特征在于：该方法是对可用于本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的、用于夹层免疫测定方法中的抗体的组合进行筛选的方法；
(10-11)(10-9)或(10-10)的筛选方法，其特征在于：上述2)步骤中制备的正常人和败血症患者的体液是血液样本；
(10-12)(10-9)或(10-10)的筛选方法，其特征在于：在由上述3)的步骤构成的夹层免疫系统中，使1)或1)-(2)中制备的抗体与不溶性载体结合；
(10-13)(10-9)或(10-10)的筛选方法，其特征在于：在由上述3)的步骤构成的夹层免疫系统中，对1)或1)-(2)中制备的抗体进行标记。
(11)可用于上述(1)的可溶性CD14抗原测定的抗体的筛选方法，该方法以如下述(11-1)-(11-5)中任一项所示：
(11-1)可用于测定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗体的筛选方法，该方法包含以下步骤：
1)制备作为筛选对象检体的抗体的步骤，
2)制备上述(2)的重组型可溶性CD14片段的步骤，
3)使1)中制备的抗体与2)中制备的片段反应，对1)中制备的抗体和2)中制备的片段的特异性结合进行评价的步骤，以及
4)在3)中，选择与2)中制备的片段特异性结合的抗体作为可用于上述(1)的可溶性CD14抗原测定的抗体的步骤；
(11-2)(11-1)的筛选方法，其特征在于：在1)的步骤中制备的抗体是与蛋白质特异性结合的抗体，该蛋白质含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-356个任意个数的氨基酸残基；
(11-3)(11-1)的筛选方法，其特征在于：在1)的步骤中制备的抗体是与蛋白质特异性结合的抗体，该抗体含有选自SEQ ID No.3的53位-68位的连续至少7个氨基酸残基；
(11-4)(11-1)-(11-3)中任一项的筛选方法，其特征在于：在3)的步骤中反应并进行特异性结合的评价的系统是抗原固相法；
(11-5)(11-1)-(11-3)中任一项的筛选方法，其特征在于：在3)的步骤中反应并进行特异性结合的评价的系统是夹层免疫测定法；
(11-6)(11-1)-(11-3)中任一项的筛选方法，其特征在于：在3)的步骤中反应并进行特异性结合的评价的系统是生物体分子间相互作用分析法。
本发明又提供以下特定的上述(2)的重组型可溶性CD14片段的生产方法。
(12)上述(2)的重组型可溶性CD14片段的生产方法，该方法如下述(12-1)-(12-3)中任一项所示。
(12-1)上述(2-3)的重组型可溶性CD14片段的生产方法，该方法包含下述步骤：
<1>制备具有下述1)-4)序列的重组型可溶性CD14片段的步骤：
1)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者为在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段、
2)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一、
3)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一、
4)在SEQ ID No.3的59位-70位的后面取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位序列，
<2>将1中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤，以及
<3>将2中切断的片段的N末端一侧的片段进行回收的步骤；
(12-2)(12-1)中的上述(2-3)的重组型可溶性CD14片段的生产方法，其中，在<1>步骤的4)中，规定的蛋白分解酶是ProScissionProtease，切断部位的序列为Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro；
(12-3)(12-1)中上述(2-3)的重组型可溶性CD14片段的生产方法，其中，在<1>步骤的4)中，规定的蛋白分解酶为凝血酶，切断部位的序列为Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser。
发明效果
本发明的新型可溶性CD14抗原可用作败血症患者的诊断标志物。该可溶性CD14抗原可作为该可溶性CD14抗原测定中使用的标准物质或竞争物质。
本发明的重组型可溶性CD14片段与该可溶性CD14抗原具有免疫学类似的性质，因此可作为该可溶性CD14抗原测定中使用的标准物质或竞争物质，还可以用于可在该可溶性CD14抗原测定中使用的抗体的筛选。
与该可溶性CD14抗原有免疫学类似的性质是表示本发明的重组型可溶性CD14片段在与公知的CD14抗体的结合性和与该可溶性CD14抗原所结合的抗体的结合性方面，该可溶性CD14抗原和本发明的重组型可溶性CD14片段大体一致。
本发明的该可溶性CD14抗原的测定试剂盒和测定方法可以高灵敏度、简便且特异性地对该可溶性CD14抗原进行定性或定量，可用于败血症患者的诊断。
本发明的筛选方法可用于对该新型可溶性CD14抗原测定中所使用的抗体的探索。
本发明的重组型可溶性CD14片段的生产方法可以进行目前在原核细胞或真核细胞、特别是酵母细胞中无法表达的重组型可溶性CD14片段的生产。
附图简述
图1是表示只有S68肽抑制S68肽多克隆抗体和本发明的可溶性CD14抗原的结合的结果图。(A)表示正常人血清中未结合的状态，(B)表示败血症患者血清中S68肽的结合抑制。
图2是表示使用sCD14(1-307)S286C蛋白质的实施例7-(1)的EIA试剂盒的标准曲线图。
图3是表示来自正常人血清的可溶性CD14抗原对于使用sCD14(1-307)S286C蛋白质的实施例7-(1)的EIA试剂盒的测定值没有影响的图。
图4是表示将通过凝胶过滤色谱得到的败血症患者血清中可用实施例7-(1)的EIA试剂盒检测的可溶性CD14抗原和高分子量CD14蛋白质分别用实施例7-(1)的EIA试剂盒和市售CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)进行分析的结果图。
图5是表示将通过凝胶过滤色谱得到的败血症患者血清中可用实施例7-(1)的EIA试剂盒检测的可溶性CD14抗原和高分子量CD14蛋白质分别用实施例7-(1)的EIA试剂盒和市售CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)进行分析的结果图。上方的黑箭头表示在校正曲线中使用的标志的位置。由左至右分别为BSA、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原A、核糖核酸酶A。
图6是表示将败血症患者血清过以F1024-1-3-SepharosTM4B作为预备柱的S68-琼脂糖TM4FF抗体柱，然后将组分通过凝胶过滤色谱进行分离，通过实施例7-(1)的EIA试剂盒和市售CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)对组分中可由实施例7-(1)的EIA试剂盒检测的可溶性CD14抗原和高分子量CD14蛋白质进行分析的结果图。上方的黑箭头与图5同样。
图7是表示将图6的凝胶过滤色谱分离组分10-16分别冷冻干燥，进行蛋白质印迹法测试的结果图。
图8是表示将正常人血清过以F1024-1-3-SepharosTM4B作为预备柱的S68-琼脂糖TM4FF抗体柱，然后将组分通过凝胶过滤色谱进行分离，将组分10-16分别冷冻干燥，进行蛋白质印迹法测试的结果图。
图9是将纯化的rsCD14-ST(2ST64)和(PSP64)进行SDS-PAGE电泳，然后通过银染法进行染色的图像。
图10是表示将sCD14-ST和PSP64用S68抗体进行染色所得到的蛋白质印迹图像。
图11是使用rs CD14-ST(2ST64)的实施例16的EIA试剂盒的标准曲线图。
图12是将给予了rs CD14-ST(PSP64)的兔抗血清的抗体滴度与正常兔血清进行比较的图。
图13是表示使用rs CD14-ST(2ST64)的实施例19的EIA测定系统的标准曲线图。
实施发明的最佳方式
以下，更详细地说明本发明。
存在于人血液中的主要可溶性CD14蛋白质有背景技术中记载的、由Landmann等人报告的约55kDa和约49kDa的可溶型CD14蛋白质。它们是人全长可溶型CD14蛋白质以及人全长可溶型CD14蛋白质C末端只缺失41个氨基酸或以下的蛋白质(以下可省略“人”，记为高分子量CD14)。WO01/22085号公报中确认了这些高分子量CD14与F1025-3-1抗体特异性结合。
除上述高分子量CD14之外，作为低分子量的CD14，还报道有分子量36kDa的蛋白质。
本发明人发现：上述高分子量CD14和WO01/22085号记载的分子量36kDa的CD14不同，与正常人比较，在败血症患者的血液中较多存在，是新型的可溶型CD14蛋白质。
本说明书中的“可溶型CD14蛋白质”是存在于人血浆中(或者人血清中)的蛋白质，也可以称为“可溶性CD14蛋白质”。特别是在与与细胞膜结合、不存在于血浆中的“膜结合型CD14蛋白质”对比使用时，要称为“可溶型CD14蛋白质”。
本发明中的“以肽或片段等“作为抗原制备的抗体””或““以肽或片段等作为抗原制备的抗体””是指将作为“抗原”的肽或片段免疫各种动物而要制备的或已制备的抗体。该抗体是将作为“抗原”的肽或片段作为表位或表位的一部分。另外，该抗体与作为“抗原”的肽或片段特异性结合。
“作为抗原要制备的抗体”或“作为抗原制备的抗体”中，为了使作为“抗原”的肽具有免疫原性，可以以附加有载体或载体蛋白、或者附加有其它氨基酸残基的肽作为免疫原而制备的抗体，只要表示出上述性质，它们也包含在“作为抗原要制备的抗体”或“作为抗原制备的抗体”中。
“特异性结合的抗体”是指与特异性结合对象免疫学结合的抗体、或者与特异性结合对象显示通常的抗原抗体反应的抗体。例如，显示抗原抗体反应时，这可通过凝聚法、夹层法、固相直接法或固相结合法、竞争法等进行确认。另外，“特异性结合的抗体”和要特异性结合的对象的结合以亲和性的形式表示时，通常解离常数(KD)低于10-7M。在结合实验上，如果不能测定解离常数，则可记为基本上不结合。另外，与“特异性结合”的情况相比，其结合能力只能确认为10倍或以下、优选100倍或以下、更优选1000倍或以下等的非特异性结合时，也记为基本上不结合。
“不与LPS结合”是指该重组型可溶性CD14片段与LPS的结合能力没有或几乎没有。生物体内全长CD14或者SEQ ID No.3的人全长可溶型CD14蛋白质在生物体或血清中具有与LPS的结合能力，该复合物激活细胞。“不与LPS结合”的该重组型可溶性CD14片段是指生物体内全长CD14或SEQ ID No.3的人全长可溶型CD14蛋白质与LPS的结合能力最多为1/100或以下。
本发明第一方案是具有下述1)-3)性质的可溶性CD14抗原：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及
3)与含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有上述1)的性质。即，通过非还原条件下的SDS-PAGE，在分子量为13±2kDa的位置上检测出来自本发明第一方案的可溶性CD14抗原的条带。
特别是在非还原条件下的12.5％ SDS-PAGE中，使用Precisionplus proteinTM双色标准品(Bio-Rad制备)计算分子量，则在分子量为13±2kDa的位置上检测出条带。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有上述2)的性质。SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列与SEQ ID No.3的人CD14 N末端氨基酸序列一致。由此可以确认：本发明第一方案的可溶性CD14抗原是人CD14的一种。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有上述3)的性质。作为上述3)的特征的、含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽相当于SEQID No.3的人CD14第53位-68位的16个氨基酸残基。目前在人蛋白质中，包含SEQ ID No.2序列的其它蛋白质除人CD14之外并无其它，因此可以说该序列特异性地含有CD14的序列。由此可以确认：本发明第一方案的可溶性CD14抗原是人CD14的一种。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原还优选通过下述4)的性质赋予其特征：
4)可由人血浆得到的(1-1)的可溶性CD14抗原。
具有上述4)的性质的特征的本发明第一方案的可溶性CD14抗原是存在于人血浆中的蛋白质。通过后述的纯化方法，本发明第一方案的可溶性CD14抗原可以以高纯度获得。本发明第一方案的可溶性CD14抗原在败血症患者体内呈现高浓度。由此可作为败血症的诊断或检测方法的标志物。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原可成为试剂盒中使用的标准物质或竞争物质，所述试剂盒用于测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原，所述抗原可用作败血症的诊断或检测。
关于本发明第一方案的可溶性CD14抗原的纯化方法如下所述。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原可通过人CD14相关抗体亲和柱层析、凝胶过滤色谱、SDS-PAGE的组合，由人血浆或人血清中纯化。通过使用后述本发明第五方案——本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，可以高效地检测作为柱层析的洗脱组分的、本发明第一方案的可溶性CD14抗原。
与人CD14相关的抗体是抗人CD14抗体、或来自人CD14的氨基酸序列的肽的抗体。例如，通过采用作为抗人CD14抗体的F1025-3-1抗体或F1024-1-3抗体的亲和柱层析，可以与高分子量CD14分离。此时，高分子量CD14与抗体吸附，本发明第一方案的可溶性CD14抗原分离到最初的流分中。再通过使用与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体的亲和柱层析，可以与血清中的其它蛋白分离。
本发明第一方案的可溶性CD14抗原与抗体吸附，通过使溶剂为酸性来洗脱。生成F1025-3-1抗体和F1024-1-3抗体的杂交瘤分别如WO01/22085号和WO01/72993号记载，以保藏号FERM BP-7296和保藏号FERM BP-7511，国际保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(IPOD)。
通过抗人CD14多克隆抗体的亲和柱层析，可以使血清中的可溶性CD14抗原与其它蛋白分离。然后通过上述抗人CD14单克隆抗体的亲和柱层析，可以与高分子量CD14分离。
将人血清或者通过上述亲和柱层析部分纯化的组分进行凝胶过滤色谱，由此可以进一步纯化本发明第一方案的可溶性CD14抗原。此时，如上所述，也可以使用本发明的第五方案的测定试剂盒，检测出本发明第一方案的可溶性CD14抗原的组分进行收集。还可通过使用分子量标志，收集分子量为35±10kDa的组分。
如上所述，可以将部分纯化的组分进行非还原SDS-PAGE，收集13±2kDa的位置，进一步纯化。所收集的组分中，本发明第一方案的可溶性CD14抗原作为主要蛋白质，可以高纯度纯化。
还可以通过阴离子交换柱层析、反相色谱、等电点电泳等进行纯化，由此可以获得更高纯度。例如，本发明第一方案的可溶性CD14抗原在pH 8.5的阴离子交换柱层析中，可以以0.3M附近的离子强度溶出。
本发明第二方案是具有下述1)-3)性质的重组型可溶性CD14片段：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段可例举具有下述5)-7)序列的重组型可溶性CD14片段：
5)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-63位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代而成的片段，
6)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
7)C末端为SEQ ID No.3的59位-90位的其中之一。
该例示中，优选6)中N末端为SEQ ID No.3的1位-6位其中之一的重组型可溶性CD14片段，更优选N末端为SEQ ID No.3的1位的重组型可溶性CD14片段。
还优选7)中C末端为SEQ ID No.3的59位-80位其中之一的重组型可溶性CD14片段，更优选C末端为SEQ ID No.3的64位-75位其中之一的重组型可溶性CD14片段，进一步优选C末端为SEQ ID No.3的64位的重组型可溶性CD14片段。
特别优选6)中N末端为SEQ ID No.3的1位、7)中C末端为SEQ IDNo.3的64位的(2-3)-(2-5)的任一项的重组型可溶性CD14片段。
优选具有5)中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段的重组型可溶性CD14片段。
以下对基因工程学生产本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的方法进行说明，其方法并不限于此，可采用常规方法。
通常已知，编码氨基酸的基因的DNA三联体(密码子)根据氨基酸的种类不同而存在一种至六种，因此，编码本发明片段的氨基酸序列的基因的DNA碱基序列并不限于一种。因此，只要是含有编码本发明片段的碱基序列的基因即可，可以含有任何碱基序列。该基因可以是cDNA、染色体DNA和它们的组合、以及适当拼接的包含内含子的cDNA，从基因工程学上容易处理的角度考虑，优选cDNA。
该基因可通过任何方法获得。例如可以是化学合成的，也可以是由适当的DNA文库获得的，还可以是以DNA为模板、通过PCR(聚合酶链反应)法获得。其中所述作为模板的DNA含有编码CD14全长或部分的基因的DNA。可以根据需要，将由这些方法获得的基因或其片段进行退火、连接，进行制备。
该基因的DNA可如下进行化学合成。具体如下：将该基因的DNA分成含有约20-30个碱基的片段，使用DNA化学合成仪(例如394型、Appliedバオオシステム制造)，合成多个片段，然后根据需要将各片段的5’末端磷酸化，将各片段退火，连接，得到目标DNA。
该基因还可以通过以基因组文库或cDNA文库等为模板的PCR法获得。采用PCR法时，以公知的碱基序列和编码本发明的片段或插入或取代有蛋白分解酶的切断部位的片段(以下可称为本发明的片段等)的基因的DNA等碱基序列为基础，还可根据需要组合限制酶识别序列等进行设计，制备有义引物和反义引物，对于任意的DNA文库等，可按照公知的方法(参照Michael AI.等编、Polymerase Chain Reaction，PCR Protocols，a guide to methods and applications、1990、AcademicPress)来获得。上述DNA文库只要含有该基因的DNA或其一部分即可，没有特别限定。因此，可以使用市售的DNA文库，也可以根据需要将由人的末梢血等得到的淋巴细胞、人的确立细胞株、或者杂交瘤等适当的细胞用适当的活化剂活化，按照Sambrook J.等人的方法制备cDNA。通常已知，编码氨基酸的基因的DNA三联体(密码子)根据氨基酸种类不同而存在一种至六种，因此，编码本发明片段等氨基酸序列的基因的DNA碱基序列不限于一种。因此，只要是含有编码本发明片段等的碱基序列的基因即可，可以含有任何碱基序列。
重组载体可以是环状或直链状等、单链或双链以及它们的复合链等任何形式，可以根据目的适当选择，从操作容易的角度或容易整合到宿主中的角度考虑，优选环状，从稳定性等角度考虑，优选双链。
“重组型可溶性CD14片段”是具有SEQ ID No.3的人全长CD14蛋白质的部分氨基酸序列、通过基因重组而制备的可溶性片段。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述1)的性质。即，通过非还原条件下的SDS-PAGE，在分子量13±2kDa的位置可以检测出来自本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的条带。
特别是在非还原条件下的12.5％SDS-PAGE中，使用Precisionplus proteinTM双色标准品(Bio-Rad制备)计算分子量，则在分子量为13±2kDa的位置上检测出条带。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述2)的性质。即，不与3C10和MEM-18特异性结合。
“不与3C10和MEM-18特异性结合”是指该重组型可溶性CD14片段不与3C10和MEM-18两种抗体免疫学结合，或者不显示通常的抗原抗体反应。“不与3C10和MEM-18特异性结合”的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段与生物体内全长CD14或SEQ ID No.3的人全长重组型可溶型CD14蛋白质比较，与3C10和MEM-18的结合能力分别为1/100或以下。优选1/1,000或以下。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述3)的性质。特别是与多克隆抗体特异性结合。上述3)的特征中所描述的含有SEQID No.2所示的氨基酸残基的肽相当于SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的16个氨基酸残基。该多克隆抗体识别7个氨基酸或以上长度的序列(参照后述实施例4)，因此第二方案的重组型可溶性CD14片段至少具有SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的任意连续的7个氨基酸或以上长度的序列。
3C10和MEM-18是非常著名的抗CD14抗体，CD14上的表位如果分别位于7位-14位和57位-64位，则可以识别。以往的来自人CD14的重组型可溶性CD14片段只要其序列具有上述表位部分的区域，则可与3C10或MEM-18结合，被识别。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述1)-3)的性质，由此，与本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有物性和免疫学类似的性质。特别是免疫学性质类似，这可以推定可作为表位的氨基酸残基序列的立体结构与本发明第一方案的可溶性CD14抗原类似。因此，特别适合作为测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原时的标准物质。测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原时的常规标准物质可以使用具有人CD14的N末端1位-307位的氨基酸、且将286位的丝氨酸取代成半胱氨酸的重组多肽(以下称为rsCD14(1-307)S286C)，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段由于其分子量近似，因此适合将免疫学反应换算成物质量。另外，即使溶剂的状态改变，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段与本发明第一方案的可溶性CD14抗原的反应性也类似。例如，在含柠檬酸的血液和含EDTA的血液的检体中，本发明第一方案的可溶性CD14抗原与rsCD14(1-307)S286C的免疫学反应性不同，但是本发明第一方案的可溶性CD14抗原和本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的免疫学反应性一致。同样，其可以作为通过竞争法等测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原时的类似物使用。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段与本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有免疫学类似的性质，因此在进行筛选用于测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原的抗体时，可以用作特异性结合的对象。本来，也可以使用本发明第一方案的可溶性CD14抗原作为特异性结合的对象，但是其在生物体内只有极微量存在，因此本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为其代用品特别有用。
如上所述，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有各种有用性，这是由于其具有上述1)-3)的性质。即，具有上述1)-3)性质的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段并不是通过其序列表达，而是通过CD14片段的物性和免疫学性质这些功能来表达。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述4)不与LPS结合的性质。国际公开第WO96/20956号中并未记载具体的肽，但是公开了具有8-60个含有人CD14的57位-64位的氨基酸、并与LPS结合的肽。该肽与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段并不一致，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特别具有上述4)的性质，由此可以理解其它们的明显不同。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段可以例举具有下述5)-7)序列的重组型可溶性CD14片段：
5)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代而成的片段，
6)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
7)C末端为SEQ ID No.3的59位-90位其中之一。
该例子中，优选6)中N末端为SEQ ID No.3的1位-6位其中之一的重组型可溶性CD14片段，更优选N末端为SEQ ID No.3的1位的重组型可溶性CD14片段。
还优选7)中C末端为SEQ ID No.3的59位-80位其中之一的重组型可溶性CD14片段，更优选C末端为SEQ ID No.3的64位-75位其中之一的重组型可溶性CD14片段，进一步优选C末端为SEQ ID No.3的64位的重组型可溶性CD14片段。
特别优选6)中N末端为SEQ ID No.3的1位、7)中C末端为SEQ IDNo.3的64位的(2-3)-(2-5)中任意的重组型可溶性CD14片段。
还优选为5)中具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段的重组型可溶性CD14片段。
以下对基因工程生产本发明的片段的方法进行说明，并没有特别限定，可以使用常规方法。
通常，已知编码氨基酸的基因的DNA三联体(密码子)根据氨基酸种类而存在一种至六种，因此，编码本发明片段的氨基酸序列的基因的DNA碱基序列不限为一种。因此，只要是含有编码本发明片段的碱基序列的基因即可，可以含有任何碱基序列。该基因可以是cDNA、染色体DNA以及它们的组合、以及可适当拼接的含有内含子的cDNA，从基因工程中容易应用的角度考虑，优选cDNA。
该基因可以通过任何方法获得。例如可以是化学合成的，也可以是由适当的DNA文库获得，还可以是以DNA为模板、通过PCR(聚合酶链反应)法获得。其中所述作为模板的DNA含有编码CD14全长或部分的基因的DNA。可以根据需要，将由这些方法获得的基因或其片段进行退火、连接，进行制备。
该基因的DNA可如下进行化学合成。具体如下：将该基因的DNA分成含有约20-30个碱基的片段，使用DNA化学合成仪(例如394型、Appliedバオオシステム制造)，合成多个片段，然后根据需要将备片段的5’末端磷酸化，将各片段退火，连接，得到目标DNA。
该基因还可以通过以基因组文库或cDNA文库等为模板的PCR法获得。采用PCR法时，以公知的碱基序列和编码本发明的片段或插入或取代有蛋白分解酶的切断部位的片段(以下可称为本发明的片段等)的基因的DNA等碱基序列为基础，还可根据需要组合限制酶识别序列等进行设计，制备有义引物和反义引物，对于任意的DNA文库等，可按照公知的方法(参照Michael AI.等编、Polymerase Chain Reaction，PCR Protocols，a guide to methods and applications、1990、AcademicPress)来获得。上述DNA文库只要含有该基因的DNA或其一部分即可，没有特别限定。因此，可以使用市售的DNA文库，也可以根据需要，将由人的末梢血等得到的淋巴细胞、人的确立细胞株、或者杂交瘤等适当的细胞用适当的活化剂活化，按照Sambrook J.等人的方法制备cDNA。通常已知，编码氨基酸的基因的DNA三联体(密码子)根据氨基酸种类不同而存在一种至六种，因此，编码本发明片段等氨基酸序列的基因的DNA碱基序列不限于一种。因此，只要是含有编码本发明片段等的碱基序列的基因即可，可以含有任何碱基序列。
重组载体可以是环状或直链状等、单链或双链以及它们的复合链等任何形式，可以根据目的适当选择，从操作容易的角度或容易整合到宿主中的角度考虑，优选环状，从稳定性等角度考虑，优选双链。
所连接的信号序列可以适当选择，优选编码人CD14的信号肽——Met Glu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val HisVal Ser Ala序列的信号序列(Goyer等人、Nuclic Acid Research、16卷、4173页、1988年)。
以内含体的形式表达时，优选附加甲硫氨酸或N末端含有甲硫氨酸的肽，其中所述内含体以大肠肝菌作为宿主。
从宿主的角度考虑，该重组载体的优选例子为可以使本发明的片段等转化动物细胞或酵母等真核细胞，使其表达的载体。因此，该重组载体的优选例子是：该重组载体除翻译启始密码子、终止密码子、选择标志基因之外，至少还具有polyA附加序列、在动物细胞中发挥功能的SV40的启动子、EF1α的启动子、SRα的启动子或在酵母中发挥功能的AOX1的启动子、以及SV40的复制起点等。
该重组载体可通过将该基因的DNA与具有任意碱基序列的其它DNA片段连接的方法、或者导入到任意的载体中的方法(参照Sambrook J.等、molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded.，ColdSpring Harbor Laboratory，New York、1989年)等获得。
转化体可通过将该重组载体导入到作为宿主的细胞或微生物中来获得。
该转化体可以是表达本发明的片段等的转化体，特别优选表达本发明的片段等、并且在培养上清中分泌的转化体。如果使用上述转化体，则可以容易地大量生产本发明的片段等。
培养该转化体，根据需要进行基因的扩增或表达诱导。接着将培养混合物回收，根据需要，将浓缩、增溶、透析、各种层析等操作适当组合，进行本发明的片段等的纯化。
“培养混合物”是指转化体、含有转化体的培养基、或者培养上清或溶胞产物等分泌物。
在该生产方法中使用的转化体只要是表达本发明片段等的转化体即可，没有特别限定，优选COS细胞、CHO细胞等哺乳动物细胞或者酵母、或选自大肠杆菌其中之一的细胞作为宿主的转化体。
以下，给出使用大肠杆菌、CHO细胞等哺乳动物细胞、毕赤属(Pichia)酵母细胞作为转化体时的培养和表达诱导的例子。
在用具有trp启动子的重组DNA分子转化的大肠肝菌中，在L-Broth中进行菌体预培养，然后将其以1/50的量接种于M9-CA培养基中，在37℃下进行培养。培养开始数小时后，在培养基的OD 550值达到1-4(即对数增殖期)时，添加3β-吲哚基丙烯酸，使终浓度为10μg/mL，进行表达诱导。再培养约1-2天，可得到含有目标蛋白质的培养混合物。
在使用用具有AOX1启动子的重组载体转化的毕赤属酵母时，在BMGY培养基上预备培养约2天，更换培养基，然后加入甲醇进行表达诱导。再在30℃培养约1-2天，可得到含有目标蛋白质的培养混合物。
用具有EF1α启动子的重组载体转化CHO细胞等哺乳动物细胞，所得的转化体在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。以约1-10×104细胞/mL的浓度接种细胞，在37℃、5％CO2/95％空气的条件下进行培养。通常2-3天后达到汇合状态，在此时将培养基更换成不含血清的D-MEM。接着再培养2-3天，由此可得到含有目标蛋白质的培养混合物。目标蛋白质的生产量少时，可以如上所述，通过氨甲碟呤扩增基因，使生产量增加。
由上述培养混合物纯化本发明的片段等的方法可以从常规的片段、蛋白质或多肽纯化所使用的方法中选择适当的方法进行。具体可从盐析法、超滤法、等电点沉淀法、凝胶过滤法、电泳法、离子交换色谱、疏水层析或抗体层析等各种亲和层析、层析聚焦法、吸附色谱和反相色谱等通常使用的方法中选择适当的方法并组合，还可以根据需要使用HPLC系统等进行纯化。
该生产方法中，本发明的片段等可以以大肠肝菌的β-半乳糖苷酶或与其它多肽的融合蛋白的形式表达，这种情况下，必须在纯化步骤的一个阶段中，进行将融合蛋白质用溴化氰或羟胺等化学物质或蛋白酶等酶进行处理、切取该蛋白质的操作。
所使用的转化体为大肠杆菌时，以不溶蛋白——内含体的形式生产本发明的片段等，则在纯化时，可以使内含体溶解、变性，在纯化的适当的阶段进行再折叠(Thomas E等，J.Molecular Biology，87，563-577，1974)。
具体来说，首先，将菌体破碎，通过离心回收颗粒。接着向颗粒中添加尿素或适量含有胍基盐酸、表面活性剂、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽的增溶缓冲液(例如含有5M胍基盐酸、0.005％吐温80、50mM Tris盐酸(pH 8.0)、5mM EDTA、2mM还原型谷胱甘肽、0.02mM氧化型谷胱甘肽的缓冲液)，加入2-巯基乙醇，进行变性，然后从上述增溶缓冲液中除去胍基盐酸，对所得溶液进行透析，进行再折叠。以融合蛋白的形式表达时，在这些操作之后，通过溴化氰等化学物质或蛋白酶等酶切断不需要的蛋白质部分，然后进行适当的层析。
本发明的片段可通过常规方法进行化学合成，由化学合成制备的片段也包含在本发明的片段中。例如，可通过市售的肽合成仪制备。另外，还可以通过肽合成仪合成本发明的片段的断片，再将其化学结合而制备。
本发明第三方案是重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质，由下述<1>-<3>步骤获得：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与抗体特异性结合，该抗体以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原而制备；
<1>制备具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了规定的蛋白分解酶切断部位的序列；或者制备具有该部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区域有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
<2>将<1>中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤，以及
<3>回收<2>中切断的片段的N末端一侧的片段的步骤。
本发明人如下推定本发明第一方案的可溶性CD14抗原在血液中存在的机理，使用与该推定的生产过程相同的方法尝试生产本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段。但并不是同过该推定的生产过程来约束或限定本发明。
如后所述，本发明第一方案的可溶性CD14抗原在败血症时在血液中特异性增加。即，通过在败血症的初期阶段、特别是生物体与内毒素等接触后立即发生的生物体内现象即可知其增加。
例如，生物体与内毒素等接触后立即发生的生物体内现象是指嗜中白细胞的活化，被活化的嗜中白细胞释放嗜中白细胞弹性蛋白酶等蛋白酶。此时，生物体内的可溶型全长CD14、模型CD14(以后可称为全长CD14)等高分子CD14被该弹性蛋白酶等分解，由此可以推定本发明第一方案的可溶性CD14抗原增加。弹性蛋白酶的切断的特异性低，因此可能产生各种片段，可推定最终产生本发明第一方案的可溶性CD14抗原。当然，通过与其它蛋白酶等的相互作用，也可以推定产生本发明第一方案的可溶性CD14抗原。
通过弹性蛋白酶等蛋白酶，全长CD14分解，产生的本发明第一方案的可溶性CD14抗原在生物体(血清中)中至少以可检测的程度稳定存在。
如后所述，本发明第一方案的可溶性CD14抗原可以与全长CD14区别地进行免疫学测定，这样就可以理解所产生的本发明第一方案的可溶性CD14抗原与全长的CD14在立体结构方面已经不同。
本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段是本发明第一方案的可溶性CD14抗原的重组型可溶性CD14片段，因此与本发明第一方案的可溶性CD14抗原立体结构类似的片段、即免疫学特异性类似的片段可尝试通过蛋白酶，从比较大的CD14片段中切断C末端的生产方法，结果成功的生产出本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段，并进行了分离纯化。
以下描述本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段的制备例。
在<1>的步骤中，制备具有下述8)-11)序列的重组型可溶性CD14片段：
8)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代而成的片段，
9)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
10)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，
11)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后面取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位的序列。
<1>步骤的11)中，规定的蛋白分解酶有ProScission Protease、凝血酶、Xa因子等。规定的蛋白分解酶为RroScission Protease时，切断部位的序列为Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro，可以例举将该8个氨基酸残基取代或插入在SEQ ID No.3的59位-70位的任一位置后面。当规定的蛋白质为凝血酶时，切断部位的序列为Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser，可以例举将该6个氨基酸残基取代或插入在SEQID No.3的59位-70位的任一位置后面。当规定的蛋白分解酶为Xa因子时，切断部位的序列为Ile、Glu、Gly、Arg，可以例举将该4个氨基酸残基取代或插入在SEQ ID No.3的59位-70位的任一位置后面。
在<1>的步骤中，优选为制成并生产在9)中N末端为SEQ ID No.3的1位-6位其中之一的片段的重组性可溶性CD14片段。进一步优选为制成并生产N末端为SEQ ID No.3的1位的片段的重组型可溶性CD14片段。
在<1>的步骤中，优选为制成并生产在11)中、在SEQ ID No.3的59位-68位的任一位置后面取代或插入规定蛋白分解酶的切断部位序列的片段的重组型可溶性CD14片段。
进一步优选为制成并生产将规定的蛋白分解酶的切断部位的序列取代或插入到SEQ ID No.3的64位后面的重组型可溶性CD14片段。
特别优选为N末端为SEQ ID No.3的1位-6位其中之一，在SEQ IDNo.3的64位后面取代或插入有规定蛋白分解酶的切断部位序列的片段的重组型可溶性CD14片段。
例如如上所述，如果确定了序列，<1>的步骤即可以按照本发明第二方案的记载，制备重组型可溶性CD14片段。
<2>的将插入或取代了规定的蛋白分解酶的切断部位的片段用该规定的蛋白分解酶进行切断的步骤可以采用该规定的蛋白分解酶的最佳条件，进行常规反应。例如，规定的蛋白分解酶为ProScission Protease时，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在4℃进行切断反应过夜。规定的蛋白分解酶为凝血酶时，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在22℃静置过夜，进行凝血酶的切断反应。规定的蛋白分解酶为Xa因子时，可以以酶∶底物比＝0.0008-8∶1(U∶μg)添加，进行切断反应过夜。
<3>的将切断的片段中N末端一侧的片段回收的步骤可与上述纯化本发明的片段等的方法同样进行。
根据该生产方法，可以均匀且高效率、工业化大量生产本发明的片段。
通过上述步骤即可理解本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段的具体序列。优选的片段与本发明第二方案的片段序列相同。本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段的C末端可以附加一部分规定蛋白分解酶的切断部位序列。
特别优选本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段的理由是：与不检测血液中的高分子CD14、只检测本发明第一方案的可溶性CD14抗原的试剂盒反应，通过蛋白质印迹进行检测，可以确认显示与本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有同等的反应性(参照后述实施例14-(2))，由此可以推定其与本发明第一实施方案的可溶性CD14抗原的立体结构基本上相同。
以下将本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段和本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段进行共同说明。(可将两者共同描述为本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段或本发明的重组型可溶性CD14片段)
“重组型可溶性CD14片段”是具有SEQ ID No.3的人全长CD14蛋白质的部分氨基酸序列、通过基因重组而制备的可溶性片段。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述1)的性质。即，非还原条件下的SDS-PAGE中，在分子量为13±2kDa的位置可以检测出本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的条带。
特别是在非还原条件下的12.5％SDS-PAGE中，使用Precisionplus proteinTM双色标准品(Bio-Rad制备)计算分子量，则在分子量为13±2kDa的位置上检测出条带。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述2)的性质。即，不与3C10和MEM-18特异性结合。
“不与3C10和MEM-18特异性结合”是指该重组型可溶性CD14片段不与3C10和MEM-18两种抗体免疫学结合，或者不显示通常的抗原抗体反应。“不与3C10和MEM-18特异性结合”的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段与生物体内全长CD14或者SEQ ID No.3的人全长重组型可溶型CD14蛋白质比较，与3C10和MEM-18的结合能力分别为1/100或以下。优选1/1,000或以下。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述3)的性质。特别是与多克隆抗体特异性结合。上述3)的特征中所描述的含有SEQID No.2所示的氨基酸残基的肽相当于SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的16个氨基酸残基。由于该多克隆抗体识别7个氨基酸或以上长度的序列(参照后述实施例4)，因此第二方案的重组型可溶性CD14片段至少具有SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的任意连续的7个氨基酸或以上长度的序列。
3C10和MEM-18是非常著名的抗CD14抗体，如果CD14上的表位分别位于7位-14位和57位-64位则可以识别。以往来自人CD14的重组型可溶性CD14片段只要其序列具有上述表位部分的区域，则与3C10或MEM-18结合，可识别。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述1)-3)的性质，由此，与本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有物性和免疫学类似的性质。特别是免疫学性质类似，这可以推定可作为表位的氨基酸残基序列的立体结构与本发明第一方案的可溶性CD14抗原类似。因此，可特别用作测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原时的标准物质。测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原时的常规标准物质可以使用具有人CD14 N末端1位-307位的氨基酸、且将286位的丝氨酸取代成半胱氨酸的重组多肽(以下称为rsCD14(1-307)S286C)，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段分子量与其近似，因此适合将免疫学反应换算成物质量。另外，即使溶剂状态变化，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段与本发明第一方案的可溶性CD14抗原的反应性也类似。例如，在含柠檬酸的血液和含EDTA的血液的检体中，本发明第一方案的可溶性CD14抗原与rsCD14(1-307)S286C的免疫学反应性不同，但是本发明第一方案的可溶性CD14抗原和本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的免疫学反应性一致。同样，其可以作为通过竞争法等测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原时的类似物使用。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段与本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有免疫学类似的性质，因此在筛选用于测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原的抗体时，可以用作特异性结合的对象。本来，也可以使用本发明第一方案的可溶性CD14抗原作为特异性结合的对象，但是其在生物体内只有极微量存在，因此本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为其代用品特别有用。
如上所述，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有各种有用性，这是由于其具有上述1)-3)的性质。即，具有上述1)-3)性质的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段并不是通过其序列表达，而是通过CD14片段的物性和免疫学性质这些功能来表达。
本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段具有上述4)不与LPS结合的性质。国际公开第WO96/20956号中并未记载具体的肽，但是公开了具有8-60个含有人CD14的57位-64位的氨基酸、并与LPS结合的肽。该肽与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段并不一致，本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特别具有上述4)的性质，由此可以理解其它们的明显不同。
将插入或取代了规定蛋白分解酶切断部位的片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤可以采用该规定蛋白分解酶的最佳条件，进行常规反应。例如，规定的蛋白分解酶为ProScission Protease时，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在4℃进行切断反应过夜。规定的蛋白分解酶为凝血酶时，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在22℃静置过夜，进行凝血酶的切断反应。规定的蛋白分解酶为Xa因子时，可以以酶∶底物比＝0.0008-8∶1(U∶μg)添加，进行切断反应过夜。
将切断的片段中N末端一侧的片段回收的步骤可与上述纯化本发明的片段等的方法同样进行。
根据该生产方法，可以均匀且高效率、工业化大量生产本发明的片段等。
本发明的片段可通过常规方法进行化学合成，由化学合成制备的片段也包含在本发明的片段中。例如，可通过市售的肽合成仪制备。另外，还可以通过肽合成仪合成本发明的片段的断片，再将其化学结合而制备。
本发明第四方案是败血症的诊断或检测方法，其特征在于：对本发明第一方案的可溶性CD14抗原进行测定。通过采用本发明第四方案的败血症诊断或检测方法，可以对受试者进行败血症的诊断或检测。
本方案的特征在于：优选包含下述1)-3)的步骤：
1)对由受试者采集的血液中所含有本发明第一方案的可溶性CD14抗原进行测定的步骤，
2)将测定的值与正常人的标准值进行比较的步骤，以及
3)评价受试者是否为败血症的步骤。
在1)的步骤中，由受试者采集的血液可以使用由受试者采集的血液、即全血，也可以将由受试者采集的血液制备成血浆或血清。优选制备成血浆或血清，进行本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定步骤。“对本发明第一方案的可溶性CD14抗原进行测定”是指测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原的量，如无特别说明，也可以测定单位溶液的量、即浓度。在2)的步骤中，结合要比较的标准值的单位，取得测定结果。
在1)的步骤中，通过夹层免疫测定法进行测定，这简便，因此优选。例如，可通过后述的本发明第六方案的测定方法进行。也可以通过使用本发明第五方案的测定试剂盒进行。不过，1)的步骤并不限于这些测定方法，例如，可以通过电泳，将由受试者采集的血液、血浆或血清中的本发明第一方案的可溶性CD14抗原分离并检测，通过光密度分析法测定要检测的条带的浓度或宽度等的方法。该方法的优选例子是：通过非还原下的SDS-PAGE进行分离，然后使用本发明第五方案的测定试剂盒中所使用的抗体，通过蛋白质印迹法检测条带。除此之外，测定方法还可以采用质谱法、HPLC、气相色谱法或TLC等的分离和检测等的方法。
2)的步骤是预先求出多名正常人的测定结果，通过该测定结果的平均值或取范围等，将标准化的正常人的值或正常人的值的范围作为正常人的标准值，与1)步骤中测定的值进行比较的步骤。例如，可将正常人的平均值+2SD或3SD作为截止值，求出正常人的标准值。也可以在2)的步骤中，预先求出败血症患者的基准值，与1)步骤中测定的值进行比较。将该步骤代替2)与正常人标准值进行比较的步骤进行。
3)的步骤是根据在2)步骤中进行比较的结果，评价受试者是败血症(阳性)或不是败血症(阴性)的步骤。除阳性、阴性之外，还可以进行假阳性的评价或预测性诊断。例如，正常人的标准幅度为0-0.1μg/mL，败血症患者的值为0.2μg/mL或以上，将测定值比较时，如果受试者的值为0-0.1μg/mL，则评价为阴性，如果是0.1-0.2μg/mL，则评价为假阳性，为0.2μg/mL以上时，评价为阳性；或者例如可以进行24小时内败血症发病的可能性高等诊断等。
在临床中，检体中的本发明第一方案的可溶性CD14抗原的稳定性是重要的因素。例如反复冻融、或长时间在室温下放置时，血清中的本发明第一方案的可溶性CD14抗原分解，可能无法测定，另外，血清中的高分子量CD14被分解为本发明第一方案的可溶性CD14抗原或与其相近的结构，这也可能引起测定结果的失误。
因此，为了保证本发明第一方案的可溶性CD14抗原和高分子量CD14的稳定性，可以在血清中添加各种添加剂。例如，采血时添加的添加剂有：血浆采血所使用的乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素、柠檬酸。还可以通过向血清中添加抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶、抑酶肽、亮异蛋白酶肽、α2-巨球蛋白、抑胃酶肽、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、氨肽霉抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、EGTA、E-64、苄脒、4-氟-(2-氨基乙基)苯磺酰氯(AEBSF)等各种蛋白酶抑制剂作为稳定剂来抑制蛋白的分解。还可以通过添加乳糖、蔗糖、海藻糖等糖或PEG等合成高分子等，使液体中本发明第一方案的可溶性CD14抗原和高分子量CD14的稳定性提高。
本发明第五方案是可溶性CD14抗原的测定试剂盒，该测定试剂盒至少含有一种与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段，用于测定检体中所含的本发明第一方案的可溶性CD14抗原。
本发明的试剂盒含有至少一种与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段，测定检体中所含的本发明第一方案的可溶性CD14抗原。另外，为了检测作为目标的本发明第一方案的可溶性CD14抗原，可以对本发明第一方案的可溶性CD14抗原进行直接测定。还优选该试剂盒只检测作为目标的本发明第一方案的可溶性CD14抗原，而不检测人高分子量可溶性CD14抗原和36kDa可溶型CD14蛋白质。实际上，如果不对人血清进行特别处理而直接作为检体用于测定，则本发明的测定试剂盒则不检测人高分子量可溶型CD14蛋白质和36kDa可溶型CD14蛋白质。特别处理是指向人血清中添加蛋白，或者使人血清中的蛋白改性等处理。该抗体的片段是指该抗体的Fab、Fab’、或者F(ab’)2。
本发明的测定试剂盒只要含有至少一种与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段，可以测定检体中所含的本发明第一方案的可溶性CD14抗原即可，没有特别限定。优选所述可溶性CD14抗原的测定试剂盒含有以下a)-d)的任意的抗体或该抗体片段作为与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段：
a)与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体；
b)以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个任意个数的氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
c)以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
d)与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段或本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。
更优选为含有上述a)、c)或d)的抗体或该抗体的片段的测定试剂盒。进一步优选含有d)的抗体或该抗体的片段的测定试剂盒。特别优选含有d)与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段结合的抗体或该抗体的片段的测定试剂盒。
d)的抗体也包含与a)与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体、b)以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续的8-16个任意个数的氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体、或者c)以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体、具有同样性质的抗体，一部分重复。因此，d)的抗体也可以含有上述a)-c)的抗体的一部分。另外，为了明确区别d)的抗体和上述a)-c)的抗体，可以从d)抗体中除去上述a)-c)的抗体。
与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体或该抗体的片段、特别是d)的抗体优选以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段或本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的抗体或该抗体的片段。还优选以本发明第一方案的可溶CD14抗原作为抗原制备的抗体或该抗体的片段。更优选以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的抗体或该抗体的片段。还优选以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体或该抗体的片段。特别优选基本上不与人高分子量CD14或具有人CD14的N末端1位-356位氨基酸的可溶性多肽(以下称为rsCD14(1-356))等重组型高分子量CD14结合的抗体。
关于测定原理，只要是使用该抗体或该抗体的片段，免疫学测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原的方法即可，没有特别限定。
测定原理的一个例子是使用a)抗体、即“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段为抗原制备的单克隆抗体”，通过夹层免疫测定法测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒(以下可称为夹层免疫测定系统试剂盒)，对其具体描述如下。
夹层免疫测定法可以采用公知的技术。关于测定法的原理、应用和改良方法，例如可参考“超高感度酵素免疫測定法”石川荣治著、学会出版センタ一(1993年)、“免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬·治療薬開発への応用”免疫测定法开发研究会、经营教育出版、酵素免疫测定法(第3版)石川荣治等编、医学书院(1987年)。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒含有与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体。该与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体的特征、以及制备方法等均如本发明第一实施方案所述。该抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，没有特别限定。
夹层免疫测定法是使用识别部位不同的两种或以上的抗体，通过形成抗体-抗原-抗体复合物，对通常要测定的蛋白质进行测定的方法。
首先，制备第一抗体所结合的不溶性载体，以其作为固相或反应场所。将检体添加到固相的该不溶性载体上，使其反应。反应一定时间后，洗涤，除去不与固相特异性结合的物质。接着添加标记的第二抗体。反应一定时间后，洗涤，除去未形成复合物的标记抗体，根据标记物，对特异性结合的复合物的量进行特异性定性或定量。夹层法可以采用上述以两阶段进行的方法(两步法)和同时加入抗原和标记抗体的一阶段法(一步法)的任何方法。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中，通过形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的第二结合物质”复合物来进行测定。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒的构成包含不溶性载体、标记的第二结合物质(以下简称为第二结合物质)，其中不溶性载体与“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”结合，标记的第二结合物质与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”结合；或者包含第二结合物质所结合的不溶性载体、以及“与含有SEQ IDNo.2的16个氨基酸残基的肽特异性结合的标记抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的标记单克隆抗体”。
第二结合物质的例子有：与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体。与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的该抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，没有特别限定，从夹层免疫测定法的适合性角度考虑，优选单克隆抗体。所述夹层免疫测定法使用了与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体。可以是该单克隆抗体的片段。抗体的片段为该单克隆抗体的Fab、Fab’或F(ab’)2。
与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体(以下可称为第二抗体)可以是与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体，也可以是与高分子量CD14特异性结合的抗体，没有特别限定，优选该第二抗体是与“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”和“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的区域不同的抗体。更优选上述第二结合物质为与人高分子量CD14的1位-52位氨基酸残基的任何区域特异性结合的抗体或该抗体的片断、或者与上述抗体竞争或显示交叉反应性的抗体或该抗体的片段，所述“上述抗体”是与人高分子量CD14的1位-52位氨基酸残基的任何区域特异性结合的抗体。特别优选上述第二结合物质为与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的17位-26位氨基酸残基的任何部分特异性结合的抗体或该抗体的片段、或者与上述抗体竞争(显示交叉反应性)的抗体或该抗体的片段，所述“上述抗体”是与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的17位-26位氨基酸残基的任何部分特异性结合的抗体或该抗体的片段。
上述抗体制备方法例如可以是以高分子量CD14、“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”、高分子量CD14和“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的混合物或者重组CD14作为抗原，与本发明第一方案的方法同样地制备多克隆抗体或单克隆抗体。以高分子量CD14和“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的混合物、以及重组CD14为抗原进行的第二抗体的制备方法举例如后述实施例3所示。
在进行实际测定之前，优选与后述实施例3同样，预备性地构成与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体和第二抗体的后补抗体以及夹层测定法的系统，确认测定精度，选择第二抗体。
抗体的片段Fab、Fab’、F(ab’)2可通过公知的方法(“超高感度酵素免疫  定法”石川荣治著、25-40页、学会出版センタ一、1993年)制备。
在上述夹层免疫测定法中，详细地描述了使抗体与不溶性载体结合的夹层免疫测定法，不过也可以不使用不溶性载体，而在溶液中进行。例如，是将抗原和标记抗体以及进行了第二标记的第二结合物质在液相中反应，测定该标记与该第二标记的相互作用的方法。
夹层免疫测定法中，作为上述其它方法，可通过竞争法进行测定。是在形成抗体-抗原-抗体复合物的过程中，通过使检体中的抗原与标记的抗原或者标记的抗原类似物竞争来进行测定的方法。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中，通过形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-标记的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”(或其类似物)-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”复合物来测定。
作为本发明的夹层免疫测定系统试剂盒的竞争法的构成，其含有“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”所结合的不溶性载体、第二结合物质、以及标记的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”或标记的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似物，或者含有“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”、第二结合物质所结合的不溶性载体、以及标记的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”或标记的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似物。
“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似物例如有：本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段、具有人CD14的N末端1位-285位氨基酸的可溶性多肽(以下称为rsCD14(1-285))和rsCD14(1-307)S286C。特别优选本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段。不过，只要是在测定系统中可以与检体中的本发明第一方案的可溶性CD14抗原竞争的物质即可，没有特别限定。关于rsCD14(1-285)和rsCD14(1-307)S286C的制备方法，在WO01/72993号公报中有记载。
在夹层免疫测定法中，作为另外一种方法，还可以利用第二特异结合进行测定。该方法是形成抗体-抗原-抗体-第二特异结合物质的复合物或者抗体-抗原-抗体-第二特异结合物质-第二特异结合物质的特异结合对象(以下可称为第二特异结合对象)的复合物来测定的方法。
在本发明的夹层免疫测定系试剂盒中，可通过形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-第二特异结合物质的复合物；形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-第二特异结合物质-第二特异结合对象的复合物；或者形成“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-第二特异结合物质-第二特异性结合对象的复合物来测定。
作为本发明的夹层免疫测定系试剂盒中利用第二特异结合的构成，例如当第二特异结合物质的对象为“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”或“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”时，还可以含有标记的第二特异结合物质。第二特异结合物质可以是上述第二特异结合物质的对象的抗体。
上述第二特异结合物质的对象为第二特异性结合对象时，可以含有“第二特异性结合物质所结合的、与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“第二特异结合物质所结合的、以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”、与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的标记的第二结合物质、以及第二特异结合对象所结合的不溶性载体；或者含有与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的标记抗体或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的标记单克隆抗体”、与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”结合的第二特异结合物质所结合的第二结合物质、以及第二特异结合对象所结合的不溶性载体。
作为第二特异性结合物质-第二特异结合对象的组合，可以是抗原及其抗体、配体及其受体、含糖链物质和凝集素、生物素和抗生物素蛋白或者链霉抗生物素等。
包括上述，夹层免疫测定法还可例举利用抗抗体、即抗免疫球蛋白抗体形成抗体-抗原-抗体-抗免疫球蛋白抗体复合物进行测定的方法；利用抗免疫球蛋白抗体和第二特异结合，形成抗免疫球蛋白抗体-抗体-抗原-抗体-第二特异结合物质-第二特异结合对象等进行测定的方法。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中，可通过形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-抗免疫球蛋白抗体的复合物；形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-抗免疫球蛋白抗体的复合物；或者形成抗免疫球蛋白抗体-“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-第二特异结合物质-第二特异结合对象；或者形成抗免疫球蛋白抗体-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-第二特异结合物质-第二特异结合对象等来测定。
任何夹层免疫测定法中，只要是通过形成含有“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原结合的第二结合物质”的复合物进行测定的测定方法即可，利用第二特异结合制备固相、标记物等，均包含在本发明的测定方法中。
即，任何夹层免疫测定法中，夹层免疫测定系统的试剂盒只要含有“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”，则均包含在本发明的试剂盒中。同样，只要包含上述a)-d)的任意抗体，则均包含在本发明的试剂盒中。(以下，“只要含有“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体””的描述也同样)。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中所使用的不溶性载体可以使用珠、胶乳颗粒、磁性颗粒、片、管或膜等。珠、板或管的材料可以使用聚苯乙烯、尼龙、玻璃、硅橡胶、不锈钢、塑料等。膜可以使用纤维素、纤维素衍生物、硝基纤维素、多孔性合成聚合物、石墨、布、非织造布、滤纸等。关于形状，珠、胶乳颗粒或磁性颗粒等可以使用球形。在保存时可以节约空间，因此优选。板或管可以使用中空筒状。它们可以对应市售的自动测定仪器、读板器等，因此优选。另外，膜可以用于后述的免疫色谱法、流透法。
与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体、第二结合物质、第二特异结合物质或其对象、或抗免疫球蛋白抗体与不溶性载体的结合可通过热吸附法、化学结合法等进行。
另外，对于上述物质与不溶性载体不结合的非吸附面，优选用不影响测定系统的物质进行封闭处理。这可以提高测定系统的特异性或灵敏度。不影响测定系统的物质有BSA、酪蛋白等蛋白质以及吐温20、NP-40等表面活性剂等。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中使用的标记可以使用过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、氧化酶和尿酸酶等酶，吖啶酯或其衍生物、或水母发光蛋白或其变性体等化学发光物质，FITC或者铕(Eu)或钐(Sm)等镧系等荧光物质，染料，胶体金、着色胶乳或同位素。
利用使用过氧化物酶作为酶时，显色底物使用3，3’，5，5’-四联苯胺或1，2-苯二胺等；使用碱性磷酸酶时，显色底物使用磷酸4-硝基苯酯等；使用β-D-半乳糖苷酶时，显色底物使用2-硝基苯基·β-D-半乳糖苷等。
对与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体、第二结合物质、第二特异结合物质或其对象、或抗免疫球蛋白抗体进行酶标记，这可以通过戊二醛两步交联法、高碘酸法、马来酰亚胺法、吡啶·二硫化物法等进行。
对于酶以外的标记，可以利用热吸附法、化学结合法等公知的技术进行。
酶标记如果上述例举的显色底物，则可以使用通常的吸光度测定系统进行测定，灵敏度也比较高，因此优选。
使用化学发光物质、荧光物质、着色标记或同位素作为标记时，可通过与其标记相适应的测定仪器测定。另外，使用穴状化合物(例如穴状Eu3+络合物)等荧光物质时，可以使用XL665等别藻蓝蛋白衍生物作为第二标记，测定荧光共振能量转移。
简易的测定试剂盒、例如后述的利用免疫色谱法、流透法的试剂盒中所使用的标记优选使用染料、胶体金或着色胶乳等可以目视观察的标记。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒的特征是：通过夹层免疫测定法进行测定，包含与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体。夹层免疫测定法可以利用上述公知的技术，除上述具体说明之外，如果是以夹层免疫测定法为特征的试剂盒，只要包含“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”，则均包含在本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中，没有特别限定。即，只要含有“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”以及夹层免疫测定法所必需的试剂即可，只要对基于该测定原理得到的测定结果没有阻碍，则不限定其所含。
例如，作为任意的构成要素，可以是检体或标记抗体等的缓冲液或稀释剂，在标记抗体中使用酶时适合酶的显色底物(参照上述)、封闭剂、反应中止剂或洗涤剂等。稀释剂没有特别限定，优选包含检体中所含的物质的稀释剂。检体为血清、在EDTA或柠檬酸存在下采血获得血清时，稀释剂中优选存在等量的EDTA或柠檬酸。例如优选稀释剂中含有0.2-1mg/mL的EDTA.
还可例举标准物质。标准物质有：“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”、“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似物。标准物质特别优选本发明的重组型可溶性CD14片段。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒也包含以夹层免疫测定法为测定原理、利用免疫色谱法或流透法的试剂盒。本发明的夹层免疫测定系统试剂盒也可以利用通过电化学测定标记信号的MEDIA法(日本特开平5-264552)进行的测定，通过使用微芯片的免疫测定法(バイオサイエンスとインダストリ一、第61卷、449-454页、2003年)、时间分解荧光免疫测定法(“Analytical biochemistry”(美国)、1984年、第137卷、335-343页)以及均相免疫测定法进行的测定。使用这些原理的测定试剂盒只要是以夹层免疫测定法测定为特征、包含“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”，则均包含在本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中。
本发明的夹层免疫测定系统试剂盒的特征在于：含有“与含有SEQID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”，可特异性测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原。本发明的夹层免疫测定系统试剂盒所使用的检体优选水性检体。特别优选血液、血清或血浆等血液成分，尿液、其它体液，细胞培养上清，或柱洗脱液等，可用作其中所包含的本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定。但是，对于人血液成分以外的检体、例如人尿液或其它体液，人以外其它种类的血液成分、尿液或其它体液、细胞培养上清或柱洗脱液等检体，不仅可以测定“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”，还可以测定“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似蛋白质、多肽等。只要包含“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”，则用于测定上述“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似蛋白质、多肽等的试剂盒也包含在本发明的夹层免疫测定系统试剂盒中。
以上说明中，也可以使用“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体片段Fab、Fab’、或(Fab’)2”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体的片段Fab、Fab’、或(Fab’)2”代替“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”。
上述中，夹层免疫测定系统试剂盒的一个例子是具体给出了使用a)的“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”的例子，也可以使用b)的“以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体”、c)的“以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体”或d)的“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的抗体”、或这些抗体的片段Fab、Fab’、或(Fab’)2。
测定的原理的例子除了夹层免疫测定法之外，还有凝聚法、固相结合法和溶液反应法，优选将至少一种与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体或该抗体的片段构成分别与含有本发明的抗体或该抗体的片段的这些方法相适应的试剂盒。特别是不使用第二结合物质、使用单独的抗体构成试剂盒时，作为与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体或该抗体的片段，优选使用人血液中的全长可溶型CD14蛋白质(以下称为人高分子量CD14)或具有人CD14的N末端1位-356位氨基酸的可溶性多肽(以下称为rsCD14(1-356))等重组型高分子量CD14基本上不结合的抗体。
凝聚法是使抗体与颗粒的表面结合，通过存在抗原，产生颗粒的凝聚，以该颗粒的凝聚程度为指标，对抗原进行特异性定性或定量。
本发明的凝聚法免疫测定系统试剂盒中，例如可通过形成“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”并使其凝聚来测定。
本发明的凝聚系免疫测定系统试剂盒的构成包含本发明的抗体与其表面结合的颗粒。
颗粒可以使用胶乳、红细胞(例如羊红细胞)、明胶、微珠或碳颗粒等通常采用的颗粒。
固相结合法是通过在固相上形成抗体和抗原的复合物进行测定的方法。将含有抗原的检体吸附在不溶性载体(即固相、以下也相同)上。接着添加标记抗体使其反应，根据标记物，对与固相结合的复合物的量进行特异性定性或定量。
竞争法是使抗原类似物吸附于不溶性载体上，通过使标记抗体与检体中的抗原进行竞争反应，来测量与抗原类似物特异性结合的标记抗体的量的方法。竞争法的另一种方法是使抗体吸附在不溶性载体上，通过标记抗原类似物来竞争抗体与检体中的抗原的反应，测定与抗体特异性结合的标记抗原类似物的量的方法。
本发明的固相结合法免疫测定系统试剂盒中，通过形成“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的复合物；形成“与含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”-标记的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”(或其类似物)复合物；或者形成“与含有标记的SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的标记的单克隆抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”(或其类似物)复合物来测定。
关于不溶性载体、“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的类似物，标记以及吸附的试剂，如夹层免疫测定系统试剂盒的说明中所述。
溶液反应法是使抗原和标记抗体在液相中反应，然后通过使用抗体的凝聚沉淀法或物理化学方法，使抗原、抗体和抗原抗体复合物分离，对“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”进行特异性定性或定量的方法。
以上说明中，可以使用“以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体”、“以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体”、“以本发明第一方案的可溶性CD14抗原作为抗原制备的抗体”或“以本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原而制备的抗体”或者“这些抗体的片段Fab、Fab’、(Fab’)2”代替“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”。
以上是根据测定原理描述本发明的测定试剂盒的例子，但本发明的试剂盒并不限于这些原理。只要是含有至少一种与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体或该抗体的片段、可直接测定检体中含有的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”，则均包含在本发明的测定试剂盒中。关于免疫测定法的原理，可以利用公知的技术。也可参考上述“超高感度酵素免疫測定法”石川荣治著、学会出版センタ一(1993年)、“免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬·治療薬開発への応用”免疫测定法开发研究会、经营教育出版、酵素免疫测定法(第3版)石川荣治等编、医学书院(1987年)。
可通过本发明的试剂盒特异性测定的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”在败血症患者体内增加。因此，测定“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”，这成为败血症的诊断指标，本发明的试剂盒可用于败血症的诊断。
“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”或“以本发明的重组型可溶性CD14片段作为抗原制备的单克隆抗体”以对该肽或“本发明的重组型可溶性CD14片段”的亲和性表示时，优选解离常数(KD)低于10-7M。更优选为10-8M或以下，进一步优选10-9M或以下的抗体。
在“与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”的制备中，作为抗原的肽是含有连续的8个或以上SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的氨基酸的肽，优选连续10个或以上，更优选连续12个或以上，特别优选为含有连续的16个氨基酸的肽。并且，肽只要含有连续8个或以上SEQ ID No.2中的任意氨基酸残基的氨基酸即可，对于其它的氨基酸序列没有限定，优选肽的全部氨基酸序列均来自SEQ ID No.2中的任意的氨基酸序列。
优选为以含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的连续8个或以上的氨基酸的肽作为抗原制备的抗体。优选以连续10个或以上、更优选以连续12个或以上、特别优选以含有连续的16个氨基酸的肽作为抗原制备的抗体。
在“以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体”的制备中，作为抗原的肽只要是含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽即可，对氨基酸残基数没有特别限定。优选以连续的10个或以上、更优选以连续12个或以上、特别优选以含有连续的16个氨基酸的肽作为抗原制备的抗体。即，“以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体”。
“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”与高分子量CD14的分子量不同，氨基酸序列比高分子量CD14的短。因此，血液中的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的结构与高分子量CD14不同，对抗体的反应性也不同，可以认为本发明第五方案的测定试剂盒中所包含的与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体的优选例子——上述a)-d)的抗体(以下简称为“上述a)-d)的抗体”)与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”强力结合，即亲和性高。
上述a)-d)的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。本发明的抗体的来源动物种没有特别限定。从容易制作抗体的角度考虑，优选兔、山羊等。对于分子种类也没有特别限定。可以是任何分类为类、亚类或亚型的免疫球蛋白。
作为免疫原的肽的制备方法可以有通常采用的使用肽合成仪(ペプチドシンセサイザ一433A型、パ一キン一エルマ一ジヤパン制造)等的方法、基因重组法(东京大学医科学研究所制癌研究部编、新细胞工学プロトコ一ル、秀润社)等。
例如，含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的连续8个或以上氨基酸的肽可以使用433A型肽合成仪，通过Fmoc法合成，然后进行TFA的脱保护，从树脂上切取，然后使用C18 HPLC柱(Capcell-pak、资生堂)进行纯化，制备目标肽。
抗原为蛋白质时，可以直接作为免疫原，但为8-30个氨基酸残基或以下的肽时，由于分子量小，可能不具有通常的免疫原性。此时，可以使其与载体结合，或者使用多抗原肽(MAP)法，制备MAP肽，使其具有可产生免疫原性的分子量，作为免疫原使用。
与上述肽结合的载体有载体蛋白、聚合物。载体蛋白有牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白或卵清蛋白等不同种白蛋白。这些载体蛋白可以利用肽或载体蛋白的氨基酸中所含的支链的官能团，或者导入马来酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)或醛基，与上述肽结合。聚合物有：甘露聚糖或壳聚糖等糖类、聚乙烯吡咯烷酮(PVA)。这些聚合物可通过吸附或上述化学结合与上述肽结合。
作为抗原的本发明的重组型可溶性CD14片段的制备方法如本发明第二方案和第三方案的说明所述。以该片段作为抗原时，可以直接作为免疫原使用，也可以与上述同样地，使其与载体等结合，制成免疫原。
本发明的抗体可采用公知技术进行制备(例如参照免疫实验操作法、日本免疫学会编、日本免疫学会发行)。例如，多克隆抗体可按照下述方法制备。
将20-1000μg上述制备的免疫原与氟氏完全佐剂、RIBI佐剂、ALUM等佐剂混合，免疫各种动物。各种动物可以使用马、羊、山羊、猪、兔、大鼠、小鼠等。免疫方法可以采用肌内给予、皮内给予、皮下给予、腹腔内给予、淋巴结给予等方法，初次给予后间隔1-4周，可将与氟氏不完全佐剂、RIBI佐剂、ALUM等佐剂混合的免疫原同样地给予，或者将免疫原直接给予静脉内，由此进行追加免疫。抗血清可通过通常的采血方法例如颈动脉、耳静脉、心脏、爪的静脉等由免疫动物中采集血液，通过离心等分离血清来制备。所得抗血清可通过添加硫酸铵、硫酸钠等的盐析法，使γ球蛋白组分沉淀，用适当的缓冲液透析，然后采用可特异性的纯化蛋白A、蛋白G等γ球蛋白的亲和基质(affinity matrix)法制备与目标肽相对应的IgG组分的纯化多克隆抗体。还可通过选择与上述抗原特异性结合的抗体进行特异性纯化。
单克隆抗体可通过下述方法制备。
使被免疫的哺乳动物的免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤，然后从该杂交瘤中选择生成抗体的克隆，从而可以制备本发明的抗体。其中所述抗体是与上述肽特异性结合的抗体。优选以含有53位-68位氨基酸残基的连续10个或以上的肽作为免疫原。更优选以含有连续12个或以上、特别优选连续16个或以上氨基酸的肽作为免疫原。
被免疫的哺乳动物没有特别限定，优选考虑与细胞融合中所使用的骨髓瘤细胞的适应性进行选择，优选小鼠、大鼠或仓鼠等。骨髓瘤细胞可以使用各种公知的细胞。其中包含P3、P3U1、SP2/O、NS-1、YB2/0和Y3-Ag1、2、3等骨髓瘤细胞。
免疫可通过公知的方法进行。例如可以将抗原给予腹腔内、皮下、静脉内或爪垫进行。该抗原的给予可以结合佐剂使用，优选多次给予。免疫细胞优选是在最终给予抗原的数天后，例如3天后，来自摘除的脾细胞或淋巴结的细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可采用Milstein等方法(Methods in Enzymol.，73卷3页)等公知的方法进行。例如有使用聚乙二醇(PEG)作为融合剂的方法或电融合法等。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的混合比只要是它们可以融合的比例即可，没有特别限定，优选相对于免疫细胞，使用1/10量至等量的骨髓瘤细胞。在使用PEG(平均分子量为1,000-4,000)进行细胞融合的方法中，对于PEG浓度没有特别限定，但优选以50％进行。另外，可以添加二甲基亚砜(DMSO)等助剂作为融合效率促进剂。融合可通过将加热至37℃的PEG溶液添加到混合的细胞中开始，反应1-5分钟后，通过添加培养基使其结束。通过该融合形成的杂交瘤可以在含有次黄嘌呤、胸苷、氨基蝶呤的培养基(HAT培养基)等选择培养基中培养1-7天，与未融合的细胞分离。
还可以通过所生成的抗体进一步选择所得杂交瘤。将选择的杂交瘤按照公知的有限稀释法进行单一克隆，构建单一克隆性抗体生成杂交瘤。检测杂交瘤所产生的抗体的活性的方法可使用公知的方法。例如有ELISA法、凝聚反应法、放射免疫测定法。将构建的杂交瘤通过公知的方法培养，可以由该培养上清获得单克隆抗体。还可以通过将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物进行增殖，由其腹水获得。抗体的纯化可以使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法或亲和层析法等公知的纯化手段进行。
如本发明第四方案的诊断方法所述，可以推定受到本发明的可溶性CD14抗原和高分子量CD14的稳定性的影响，测定值会发生变化。为提高试剂盒的性能，更优选使用与可溶性CD14抗原的特异性高、与保存中发生变化并使测定值发生变动的原因物质的反应性低的抗体。可筛选得到用于构成不发生所述变化的试剂盒的抗体。
本发明的第六方案是上述“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的免疫学测定方法，其特征在于：使至少一种与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体或该抗体的片段与上述“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合。
本发明第六方案的测定方法是“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的免疫学测定方法，该方法是为了不检测人高分子量CD14，而测定“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”，使用至少一种与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”特异性结合的抗体，直接测定检体中所含的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”。该测定方法的优选方案的特征是使用以下a)-d)的任意抗体或该抗体的片段：
a)与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体，
b)以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，或者
c)以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，或者
d)与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段或本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。
更优选的测定方法的特征是使用上述a)、c)或d)的抗体或该抗体的片段。进一步优选含有d)的抗体或该抗体片段的测定试剂盒。以上说明中，抗体的片段是指该单克隆抗体的Fab、Fab’或F(ab’)2。
还优选下述“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的测定方法：使用与“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”结合的第二结合物质，通过上述a)-d)中任意的抗体或该抗体的片段与该第二结合物质的夹层免疫测定法，测定“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”。
可以将上述a)-d)中任意的抗体作为固相抗体或标记抗体等使用。另外，也包含利用第二特异结合、抗免疫球蛋白抗体的测定方法。这种情况下，上述a)-d)中任意的抗体可作为游离抗体、第二特异结合物质或与第二特异结合对象结合的抗体等使用。
本发明的测定方法可以是夹层免疫测定法的非竞争法或竞争法，另外，也包含通过免疫色谱法或流透法进行的测定。
本发明的测定方法的原理并不限于夹层免疫测定法，其它例子有凝聚法、固相结合法和溶液反应法等。
详细的测定方法的优选例子如本发明第五方案的试剂盒所述。
本发明第七方案是与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体。其中也包含本中请优先权主张日之后公布的国际公开WO2004/44005号的实施例中所记载的下述a)-d)的抗体，它们有一部分重复。因此，与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体可以包含下述a)-d)抗体的一部分。为了明确区别本发明第二方案的抗体和下述a)-d)的抗体，可以从本发明第二方案的抗体中除掉下述a)-d)的抗体。
a)以含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
b)以含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸残基的肽作为抗原制备的多克隆抗体，
c)F1031-8-3抗体，以及
d)F1106-13-3抗体。
国际公开WO2004/44005号中对与含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸残基的肽结合的抗体，以含有选自SEQ ID No.6氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体进行了说明，与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体可以包含这些抗体的一部分，为了明确区分，可以从与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体中除掉这些抗体。
本发明第七方案的“与本发明第一方案的可溶性CD14抗原特异性结合的抗体”优选基本上不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质或rsCD14(1-356)结合，而与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。还优选为单克隆抗体的抗体。
本发明的抗体以本发明第一方案的可溶性CD14抗原作为抗原进行制备。
可以使用本发明第七方案的抗体测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原，可以构成本发明第五方案的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒”。
本发明第八方案是与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。也包含本申请优先权主张日后公布的国际公开WO2004/44005号的实施例中记载的下述a)-d)的抗体，一部分重复。因此，与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体可以含有下述a)-d)抗体的一部分。为了明确区分本发明第二方案的抗体和下述a)-d)的抗体，可以从本发明第二方案的抗体中除掉下述a)-d)的抗体。
a)以含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
b)以含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸残基的肽作为抗原制备的多克隆抗体，
c)F1031-8-3抗体，以及
d)F1106-13-3抗体。
国际公开WO2004/44005号中对与含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸残基的肽结合的抗体，以含有选自SEQ ID No.6氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体进行了说明，与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体也可包含这些抗体的一部分，但为了明确区分，可以从与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体中除掉这些抗体。
本发明第八方案的“与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体”优选为基本上不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质或rsCD14(1-356)结合、而与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。还优选该抗体为多克隆抗体。
本发明的抗体可以以本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原进行制备。
特别优选的抗体是F1237-3-4抗体。生产F1237-3-4抗体的杂交瘤于2005年4月27日国际保藏于日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(保藏号FERMABP-10330)。
使用本发明第八方案的抗体，可以测定本发明第一方案的可溶性CD14抗原，也可以构成本发明第五方案的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒”。
本发明第五方案的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒”不测定高分子量CD14。因此这成为优选实质不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质结合的抗体的理由。用于测定试剂盒，因此单克隆抗体成为优选的理由。并且，实质不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质或rsCD14(1-356)结合的抗体可以不采用夹层免疫测定法，不使用第二结合物质，可以使用单独的抗体。
如上所述，国际公开WO2004/44005号中对与含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸残基的肽结合的抗体，以含有选自SEQ ID No.6氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，以及抗CD14抗体F1031-8-3抗体和F1106-13-3抗体进行了说明。其有用性可以应用于对败血症的诊断有效的低分子量CD14测定试剂盒中。不过，这并不能证明国际公开WO2004/44005号中的抗体与本发明第一方案的可溶性CD14抗原有直接关系，只是涉及在以该肽或CD14作为抗原制备时，可用作对败血症的诊断有效的低分子量CD14测定试剂盒的发明。
另一方面，本发明的抗体可以应用在本发明第五方案的“本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒”中。“本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段”与本发明第一方案的可溶性CD14抗原的免疫学性质类似，如果不是与该片段结合的抗体(即本发明的抗体)，则无法应用在“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的测定试剂盒中。
目前在公知的抗体中，可以应用于“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”的测定试剂盒中的抗体只有国际公开WO2004/44005号中记载的上述抗体，另外，与“本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段”结合的抗体也只有上述抗体，已经明确各种抗CD14抗体不与“本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段”结合。
即，本发明的抗体是概括性地发明了可应用于“本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定试剂盒”中的抗体并予以公布。并且，以“本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段”作为抗原制备的抗体与“发明第一方案的可溶性CD14抗原”的免疫学反应性高，特别有用。
本发明第九方案是与本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。
本发明第九方案的抗体可以以本发明第三方案的重组型可溶性CD14片段作为抗原进行制备。
本发明第九方案的抗体的优选例子与本发明第八方案所述相同，其有用性、其它描述均相同。
本发明第十方案为可用于本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的抗体的筛选方法，该方法包含下述步骤：
1)制备与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个任意个数的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体的步骤，
2)制备含有CD14的测定对象液的步骤，
3)使用1)中制备的抗体或2)中制备的测定对象液，构成免疫测定系统的步骤，
4)通过3)中构成的免疫测定系统，测定与测定对象液中的1)中所制备的抗体特异性结合的物质的步骤，以及
5)通过4)所得的测定结果，对可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的抗体进行评价、选择的步骤。
本发明第十方案的筛选方法是抗体的筛选方法，该抗体可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定，所述抗原可作为败血症诊断的标志。即，是对可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原的抗体进行选别的方法，所述抗原可作为败血症诊断的标志。还是选别可用于本发明第五方案的试剂盒的抗体的方法。
本发明第十方案的筛选方法的特征在于：以上述1)步骤中制备的“与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个任意个数的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”作为筛选对象检体。要制备的筛选对象检体只要是“与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个任意个数的氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”即可，没有特别限定。另外，只要具有与抗原之间产生抗原抗体反应的功能即可，也可以将该抗体片段作为筛选对象检体。(以下关于抗体的说明也包含关于抗体片段的说明)
2)的测定对象液只要是含有CD14的液体即可，没有特别限定，优选至少含有高分子量CD14的液体。
3)中构成的免疫测定系统只要是可以测定作为筛选对象检体的抗体是否与测定对象液中所含的CD14特异性反应即可。例如有抗原固相法、夹层法或生物体分子间相互作用分析法等。也可以是本发明第五方案或第六方案中所说明的免疫学测定法的任何系统，对此并没有特别限定。
4)的步骤只要是按照3)的步骤中构成的免疫测定方法，以测定对象液为对象，测定与1)中制备的抗体特异性结合的物质即可。
5)的步骤是通过4)的步骤测定的结果，评价作为筛选对象检体的抗体是否可用于在对败血症的诊断有用的免疫测定法中应用，如果有用则选择该抗体的步骤。并没有特别限定指标。
如上所述，本发明第六方案的筛选方法具有如下特征：以上述1)步骤中制备的“与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”作为筛选对象检体，对于其它步骤则没有特别的限定。
上述1)步骤中制备的抗体优选为以下抗体：与下述的肽特异性结合的抗体，该肽含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端1位-314位的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基；以含有选自SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体；或者以下述肽作为抗原制备的抗体，该肽含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端1位-314位的氨基酸序列的连续8-30个氨基酸残基。
上述1)步骤中，可以制备并使用下述<1>-<4>的抗体代替“与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合的抗体”。<1>根据CD14全长序列，按照常规方法合成肽，制备免疫抗原，制备抗体。<2>将血清中的纯化可溶性CD14进行纯化，以其作为免疫原制备抗体。<3>使用COS细胞或大肠肝菌，制备重组CD14蛋白质，以其作为免疫原制备抗体。<4>将制备的各种CD14抗原通过热变性或DNP化等处理，以其作为免疫原制备抗体。
以下进一步说明本发明3)中构成的免疫测定法为抗原固相法时的例子。
这种情况下，需要进一步制备上述1)步骤中制备的抗体的标记抗体，例如标记抗免疫球蛋白抗体。
上述2)步骤中，优选所制备的测定对象液的检体为正常人的体液或人高分子量CD14的标准品。人高分子量CD14的标准品例如可以制备正常人的体液中3C10抗体亲和柱吸附组分等。
还可以在不溶性载体上例如形成“测定对象液中的高分子量CD14”-“1)步骤中制备的抗体”-“标记抗免疫球蛋白抗体”的复合物，由此构成免疫测定系统，通过标记测定“1)步骤中制备的抗体”与“测定对象液中的高分子量CD14”的特异结合性。例如，在3)的步骤中，使测定对象液与不溶性载体结合进行构成，在4)的步骤中，可使1)中制备的抗体和上述“标记抗免疫球蛋白抗体”依次与在3)中构成的斑点印迹法系统反应。然后通过标记的强度，测定上述复合物的形成比例，即测定与对象液与1)中制备的抗体特异性结合的物质。
5)的步骤中，例如，标记强度弱或不显示强度的1)中制备的抗体被评价为与正常人的体液或人高分子量CD14标准品中的高分子量CD14特异性结合性弱或没有，可以选择作为败血症诊断有用的免疫测定法中使用的抗体。例如，在使用可评价为与血液中的高分子量CD14特异性结合性强的抗体，测定与人体液中的该抗体特异性结合的物质时，所测定的主要蛋白质是高分子量CD14。这种情况下，在测定比高分子量CD14更微量的蛋白质——本发明第一方案的可溶性CD14抗原时，可以选择不与高分子量CD14特异性结合的抗体。
抗原固相法中，如果用酶标记，则形成抗原固相EIA法；如果上述不溶性载体使用膜时，则形成斑点印迹法。
下面进一步对本发明的在3)中构成的免疫测定法为夹层测定法时的例子进行说明。
关于夹层免疫测定法的说明如本发明第五方案的试剂盒或本发明第五测定法所述。
这种情况下，还要制备另外一种抗体或抗CD14抗体(可称为第二抗体)，所述抗体或抗CD14抗体与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽特异性结合。
上述2)步骤中制备的测定对象液优选正常人的体液或败血症患者的体液。其中，更优选两种体液的来源相同。即，更优选例如都为正常人的血液样本和败血症患者的血液样本、或者是正常人的尿液样本或败血症患者的尿液样本等，使其两种体液的来源相同，进一步优选为血液样本。特别优选血清。
然后，在不溶性载体上形成例如“1)的步骤中制备的抗体”-“本发明第一方案的可溶性CD14抗原”-“第二抗体”的复合物，由此构成夹层免疫系统。
例如在3)的步骤中，使“1)的步骤中制备的抗体”或“第二抗体”其中之一与不溶性载体结合，对另一方进行标记，构成夹层免疫系统。
在4)的步骤中，使测定对象液、标记的抗体依次与3)中构成的夹层免疫系统反应，进行测定。
5)的步骤中，将正常人体液的测定结果和败血症患者体液的测定结果进行比较，根据所比较的测定结果的不同，评价可用作对败血症的诊断有用的本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的抗体，并选择。
3)中构成的免疫测定法为夹层测定法时，所选择的抗体优选选择1)中制备的抗体和“第二抗体”的抗体组合。即，优选为对用于测定可作为败血症诊断的标志的血液蛋白质的抗体、可用作对败血症的诊断有用的夹层免疫测定法中使用的抗体的组合进行筛选的方法。
本发明的筛选方法中所使用的抗体的制备可按照本发明第五方案的测定试剂盒的说明进行。材料等的说明也按照该说明进行。
生物体分子间相互作用分析法并没有特别限定，其例子有表面等离子体共振法。例如可使用Biacore装置(Biacore制造)进行。
本发明第十一方案是可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的抗体的筛选方法，该方法包含下述步骤：
1)制备作为筛选对象检体的抗体的步骤，
2)制备本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的步骤，
3)使1)中制备的抗体与2)中制备的片段进行反应，对1)中制备的抗体与2)中制备的片段的特异性结合进行评价的步骤，以及
4)在3)中，选择与2)中制备的片段特异性结合的抗体作为可用于本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的抗体。
本发明第十一方案的筛选方法是抗体的筛选方法，该抗体可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原的测定，所述抗原可作为败血症诊断的标志。即，是对可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原的抗体进行选别的方法，所述抗原可作为败血症诊断的标志。还是选别可用于本发明第五方案的试剂盒的抗体的方法。
本发明第十一方案的筛选方法的特征在于：使作为筛选对象检体的抗体与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段反应，评价两者是否特异性结合、即，是否显示抗原抗体反应。本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段如本发明第二方案的说明所述，不与3C10和MEM-18特异性结合，而与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。与本发明第一方案的可溶性CD14抗原具有相同的免疫学性质。由此，对作为筛选对象检体的抗体与本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的反应进行评价，这可以选别可用作本发明第一方案的可溶性CD14抗原测定的抗体。
在1)的步骤中，所制备的筛选对象检体只要是抗体即可，没有特别限定。只要具有与抗原之间发生抗原抗体反应的功能即可，也可以将抗体的片段作为筛选对象检体。(以下关于抗体的说明也包括关于抗体片段的说明)
为了提高筛选效率，特别优选制备“与蛋白质特异性结合的抗体，该蛋白质含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-356个任意个数的氨基酸残基”作为筛选对象检体。更优选制备“与蛋白质特异性结合的抗体，该蛋白质含有选自SEQ ID No.3的53位-68位的连续至少7个氨基酸残基”。
在2)的步骤中，所制备的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段只要是本发明第二方案的说明中所描述的重组型可溶性CD14片段即可，没有特别限定。
3)的步骤中，对于使1)中制备的抗体与2)中制备的片段反应，对1)中制备的抗体和2)中制备的片段的特异性结合进行评价的方法，只要是可以评价两者是否特异性结合、即是否发生抗原抗体反应的方法即可，没有特别限定。其例子有抗原固相法、夹层测定法、或生物体分子间相互作用分析法。关于这些方法，如本发明第十方案的说明所述。如果可通过使用第二抗体的夹层免疫测定法评价其特异性结合，则可以对夹层测定法中的抗体的组合进行评价。
本发明的第十二方案是具有下述5)-7)序列的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的生产方法：
5)为具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者为在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
6)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，以及
7)C末端为SEQ ID No.3的59位-70位其中之一；
该方法包含下述<1>-<3>的步骤：
<1>制备具有下述1)-4)序列的重组型可溶性CD14片段的步骤：
1)为具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者为在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段、
2)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一、
3)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一、
4)在SEQ ID No.3的59位-70位的后面被取代或插入了规定的蛋白质分解酶的切断部位序列，
<2>将1中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白质分解酶切断的步骤，以及
<3>将在<2>中切断的片段的N末端一侧的片段回收的步骤。
根据本发明第十二方案的“本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段的生产方法”，可以生产具有规定的氨基酸序列的本发明第二方案的重组型可溶性CD14片段。详细的生产方法如本发明第二方案的说明所述。
例如规定的蛋白质分解酶为ProScission Protease时，<1>步骤的4)中，切断部位的序列为Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro。
规定的蛋白质分解酶为凝血酶时，<1>步骤的4)中，切断部位的序列为Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser。
实施例
以下，根据实施例进一步具体说明本发明，但这些实施例只是例举，本发明并不受其任何限定。以下描述中所使用的简略符号均依据本领域常用的简略符号。
以下实施例中使用的正常人血清和败血症患者血清购自ProMedDx公司、Samplex公司和Sera Care Life Science公司。
(实施例1)以合成肽作为抗原的多克隆抗体的制备
1-(1)作为抗原的肽的制备
为了将具有SEQ ID No.2的序列(相当于SEQ ID No.3的53位-68位的序列)的肽(以下称为S68肽)在N末端经由SH基团与载体蛋白结合，向N末端插入半胱氨酸。即，使用肽合成仪ABI433A(Applied)，根据氨基酸序列排列氨基酸柱，在N末端设置半胱氨酸的氨基酸柱，进行自动合成。合成的肽按照规定方法由树脂中切取，用乙醚沉淀并回收，然后再次用蒸馏水溶解，冷冻干燥。将所得粗纯化肽溶解，用C18反相HPLC(CAPCELL-PAK、资生堂)、以5-70％乙腈浓度的线性梯度洗脱，回收含有目标肽的组分。将回收的组分冷冻干燥，得到2-3mg纯化肽。
1-(2)使用合成肽制备肽载体抗原
将1-(1)中制备的肽用蒸馏水溶解为10mg/mL，与10mg/mL的马来酰亚胺化匙孔血蓝蛋白(KLH)(PIERCE)等量混合。在室温下反应2小时，然后用生理盐水平衡NAP-10柱(Amersham Bioscience)，用该柱进行脱盐，得到1mg S68肽载体抗原(以下称为S68肽-KLH)。以下实施例中所述蛋白质浓度是将所使用的KLH量除以溶液总量所得数值。
1-(3)以合肽作为抗原制备多克隆抗体
为了制备1-(2)中制备的S68肽-KLH的多克隆抗体，使用S68肽-KLH对兔进行免疫。即，将各100μg S68肽-KLH用500μL生理盐水稀释，与500μL的氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予2.1-2.2kg雌性新西兰白兔(北山ラベス)的背部皮下。2周后，将各100μg S68肽-KLH用500μL生理盐水稀释，与500μL氟氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，给予背部皮下。再过2周后，将100μg S68肽-KLH用1mL生理盐水稀释，给予耳静脉内。
给予结束1周后，由耳静脉采血，按照规定方法分离抗血清，纯化抗体。首先向抗血清中添加硫酸铵，使最终饱和浓度为33％，在4℃搅拌1小时，然后将析出的沉淀离心。接着将沉淀用76mM磷酸缓冲液(以下称为PBS(pH6.4))溶解，透析过夜。将透析液过滤，然后过蛋白A柱(Procep-A Millipore)，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所结合的IgG组分，得到纯化抗体。用PBS(pH 6.4)透析，然后由280nm的吸光度计算蛋白浓度(换算值：0.533mg/mL)。以下，将所得抗体称为S68肽多克隆抗体。
1-(4)特异性纯化多克隆抗体的制备
为了从S68肽多克隆抗体中只纯化S68肽的抗体，按照以下方法进行特异性纯化。首先，为了经由SH基团使插入了半胱氨酸的S68肽(以下称为C-S68肽)与载体结合，按照说明书，将1mL SulfoLinkCoupling Gel(PIERCE)与200μg C-S68肽混合，反应。反应终止后，将残余的活性基团封闭，制备结合有S68肽的亲和柱。接着，将7.92mg1-(3)的纯化IgG组分过柱，用磷酸缓冲液(pH 7.4)(Dulbecco、以下称为D-PBS(pH7.4))洗涤柱，接着，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所结合的抗S68肽抗体。洗脱后将pH值恢复为中性，用PBS透析，由280nm的吸光度计算蛋白质的浓度(换算值：0.533mg/mL)，得到0.52mg抗S68肽抗体(以下称为S68抗体)。
(实施例2)以合成肽作为抗原的单克隆抗体的制备
将20μg实施例1-(2)中制备的S68肽-KLH溶解于100μL生理盐水中，与氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，分别对8周龄雌性Wistar大鼠的各后爪垫给予100μL。2周后摘除髂骨淋巴结，进行细胞融合。细胞融合按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)进行。即，使用细胞筛网(Falcon)，由淋巴结中分离淋巴细胞，以5∶1与骨髓瘤细胞(Sp2/0-Ag14)混合，使用聚乙二醇进行细胞融合。将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，选别杂交瘤，然后对生产目标抗体的杂交瘤进行筛选。
筛选采用将rsCD14(1-307)S286C直接固相化于板上的ELISA法。即，用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)将rsCD14(1-307)S286C稀释为1μg/mL，向免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中添加50μL，在37℃静置1小时。接着将板用离子交换水洗涤5次，向各孔中添加100μL含有0.1％BSA的PBS(pH6.4)，在室温下静置1小时进行封闭。向各孔中添加从所得杂交瘤中采集的培养上清，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤3次。
接着，将过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)用含有10％兔血清的PBS稀释为1000倍，将该溶液以50μL添加到各孔中。在37℃反应1小时，然后同样洗涤5次，将四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)添加到各孔中。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应。用读板仪(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)测定450nm下的吸光度，选择含有产生与rsCD14(1-307)S286C结合的抗体杂交瘤的孔。
接着，按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)，通过有限稀释法，由所选择的孔进行克隆。10天后，以对rsCD14(1-307)S286C的反应性为指标同样地进行筛选，选择了6种杂交瘤。将所选择的杂交瘤在10％FCS/RPMI1640培养基(Sigma制备)中培养，然后用杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen制备)培养，使其产生抗体，用蛋白G柱(Prosep-G)纯化抗体。用大鼠分型试剂盒(ZYMED)确定所纯化的F1146-17-2抗体的亚型，亚型为大鼠IgG2b·κ。
rsCD14(1-307)S286C是采用WO01/72993号实施例9中记载的方法制备的。
(实施例3)对夹层EIA法测定系统的研究
使用实施例1和实施例2的抗体，研究夹层EIA法的测定系统。
3-(1)重组人CD14的制备
首先，为了制备夹层ELISA法中作为第二抗体的rsCD14(1-285)的单克隆抗体，在大肠肝菌中制备其免疫原rsCD14(1-285)。为了使rsCD14(1-285)在大肠肝菌中表达，按照以下方法构建表达质粒pTrp1659。
首先，合成寡聚体8，linkS(5’-agc tta gga att t-3’)(SEQ ID No.7)和寡聚体8，linkA(5’-cta gaa att cct a-3’)(SEQ ID No.8)。
将这些寡聚体等量混合，在99℃加热1分钟，然后缓慢冷却至室温，进行退火。再通过T4多核苷酸激酶，使5末端磷酸化，制备接头。
接着，合成有义引物A(5’-aca tct aga tga cca cgc cag aac ct-3’)(SEQ ID No.9)和反义引物(5’-ttt gga tcc tta cta gag atc gag cac tct-3’)A(SEQ ID No.10)，以WO01/72993号公报实施例8中的质粒pM1659为模板，使用Pyrodest DNA聚合酶进行PCR。
将反应液在90℃加热2分钟，然后将98℃10秒、55℃30秒、72℃1分钟的循环重复进行30次。
将所得约900bp的扩增产物用XbaI和BamHI进行双消化，回收DNA片段。将日本特开平06-025289号公报中实施例10的载体pM710用HindIII和BamHI进行双消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收。将上述磷酸化接头、PCR扩增DNA片段/XbaI+BamHI消化片段以及载体/HindIII+BamHI片段进行三元连接(tree-way ligation)，然后转化大肠肝菌感受态细胞(JM109(TOYOBO))，得到含有目标质粒的克隆。通过规定方法制备质粒DNA。
接着，通过电穿孔法制备用于生产rsCD14(1-285)的JE7924转化株。
首先，将大肠杆菌JE7924(J.Bacteriol 173，4799页(1991))从甘油储液中恢复，在LB培养基、37℃培养过夜。接种于50mL的LB培养基中，持续培养至600nm的吸光度为0.5-0.6，然后将培养瓶进行30分钟的冰冷却。接着收集大肠肝菌，用冰冷却的无菌蒸馏水洗涤2次，用冰冷却的10％甘油溶液洗涤一次，然后悬浮于100μL冰冷却的10％甘油溶液中。各以50μL分注到两支试管中，在液氮下骤冷，制备感受态细胞(JE7924)，使用之前一直保持在-80℃。
接着，用电穿孔法向50μL JE7924感受态细胞中导入约30ngpTrp1659。仪器使用BIO-RAD公司的Gene Pulser。此时的设定如下：电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF。然后，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养过夜，得到导入了pTrp1659的转化细胞株。将该克隆在LB培养基中、37℃培养过夜。然后接种于新的培养基中，再培养5小时。确认600nm下的吸光度为2-3，添加3β-吲哚丙烯酸(Sigma制备)，使终浓度为100μg/mL的浓度，在37℃培养4小时，使rsCD14(1-285)诱导表达。接着，回收大肠肝菌，使用Bug Buster蛋白质提取试剂(Novagen制备)制备包含体。然后用SDS-PAGE缓冲液溶解，进行SDS-PAGE，通过抗CD14抗体的蛋白质印迹测定，确认了rsCD14(1-285)的表达。
用作免疫原的rsCD14(1-285)同样是将JE7924转化细胞株在1L的LB培养基中培养制备。首先将培养液离心，收集大肠肝菌，然后将菌体用D-PBS洗涤，向收集的菌体中加入50mL Bug Buster蛋白质提取试剂(Novagen制备、以下称为BugBuster)，使其悬浮，在室温下放置30分钟。菌体溶解后，进行10分钟的超声处理(US-3、井内盛荣堂)，以10000×g、4℃进行20分钟离心，除去上清。再次同样进行超声处理，将所得沉淀悬浮于50mL BugBuster。向悬浮液中加入1mL 10mg/mL溶菌酶(生化学工业)，缓慢搅拌，然后在室温下放置10分钟，接着加入200mL 1/10量的高浓度BugBuster，搅拌，同样进行离心，除去上清。向所得沉淀中加入200mL 1/10浓度的BugBuster，使其悬浮，同样进行离心，将该操作重复数次。最终向所得沉淀中加入100mL D-PBS，得到内含体。
rsCD14(1-285)的制备是首先将内含体溶解于含有1％TritonX100的TE缓冲液(pH 8.0、Nippon Gene)，进行三次冻融，离心并回收沉淀。再次溶解于含有1％TritonX100的TE缓冲液(pH 8.0、Nippon Gene)，冰冷却后，以250μA、以10秒的间隔进行12分钟超声波处理，离心后回收沉淀。将沉淀溶解于含有1％TritonX100、0.2M氢氧化钠的TE缓冲液(pH 8.0、Nippon Gene)中，在37℃下处理10分钟，离心，再溶解，重复进行三次，然后回收沉淀。将所得沉淀溶解于含有6M胍基盐酸的水溶液中，制备纯化rsCD14(1-285)。以BSA为标准品，通过Bradford蛋白质测定法计算浓度。
3-(2)抗CD14单克隆抗体的制备
[1] F1106-13-3抗体的制备
以上述来自大肠杆菌的rsCD14(1-285)作为给予抗原制备单克隆抗体。首先，将20μg纯化rsCD14(1-285)与氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，将200μL给予6周龄雌性ddy小鼠的腹腔内。2周后，将20μg纯化rsCD14(1-285)与氟氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，将200μL给予腹腔内。进行细胞融合的三天前，将50μg抗原给予小鼠腹腔。三天后无菌摘除脾脏，由脾脏分离淋巴细胞，按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)，以10∶1与骨髓瘤细胞(P3×63-Ag.8.U·1)混合，用聚乙二醇进行细胞融合。通过HAT培养基选择杂交瘤，然后通过ELISA法进行生成与rsCD14(1-285)结合的抗体的杂交瘤筛选。
首先，将rsCD14(1-285)用PBS(pH 6.4)稀释为0.4μg/mL，向免疫板(Maxisorb、NUNC)的备孔中添加50μL。在4℃反应过夜，然后用离子交换水洗涤5次。将100μL含有0.5％BSA的PBS(pH 6.4)添加到各孔中，进行封闭。将采集的培养上清添加到各孔中，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。接着将过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)用含有10％兔血清的PBS稀释为1000倍，将所得溶液以50μL添加到各孔中。在37℃反应1小时，然后同样地洗涤5次，将四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)添加到各孔中。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应。用读板仪(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)测定450nm的吸光度，选择含有杂交瘤的孔，所述杂交瘤生成与rsCD14(1-285)结合的抗体。接着，按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)，通过有限稀释法，由所选择的孔进行克隆。10天后，以对rsCD14(1-285)的反应性作为指标，同样地进行筛选，选择杂交瘤，结果得到了12种抗rsCD14(1-285)单克隆抗体生成杂交瘤。
将所选择的杂交瘤在10％FCS/RPMI1640培养基(Sigma制备)中培养，然后用杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen制备)培养，使其生成抗体，用蛋白A(Prosep-A)纯化抗体。
通过IsoStrip小鼠单克隆抗体亚型分型试剂盒(Roche)确定反应性高的抗体F1106-13-3抗体的亚型，结果亚型为IgG2b·κ。
[2]F1031-8-3抗体的制备
F1031-8-3抗体使用WO01/22085号公报实施例7的方法制备。简单地说，将20μg人血液中的CD14蛋白质溶解于生理盐水，与氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，初次和两周后的第二次免疫是给予小鼠腹腔内，一周后，与WO01/22085号公报实施例5同样，通过ELISA法确认血清中的抗体滴度上升，确认与重组人CD14蛋白质的反应性。向小鼠腹腔给予100μG抗原，进行最终给予，3天后摘除脾脏。由脾脏分离淋巴细胞，以10∶1与骨髓瘤细胞(P3×63-Ag.8.U.1)混合，用聚乙二醇进行细胞融合。通过HAT培养基选择杂交瘤。一周后通过上述ELISA法进行生成目标抗体的杂交瘤的筛选。通过有限稀释法对与固相化可溶性CD14抗原反应的杂交瘤进行克隆，10天后同样地进行筛选，得到抗CD14蛋白质单克隆抗体。以其作为代表性的抗体，使用IsoStrip小鼠单克隆抗体亚型分类试剂盒(Roche)确定亚型，得到了亚型为IgG2b·κ的F1031-8-3抗体。
3-(3)夹层EIA系统的研究
为了制备可特异性地检测较多存在于败血症患者体内的蛋白质的系统，使用实施例1、2、3-(2)的抗体制备夹层ELA系统。
[1]过氧化物酶标记抗体的制备
过氧化物酶标记抗体按照中根等人的方法(J.HistochemCytochem.，22卷、1084页、1974年)，将4mg过氧化物酶(东洋纺)溶解于蒸馏水中，添加100mM的高碘酸，在25℃反应20分钟。反应终止后，加1.5％乙二醇，在25℃反应10分钟，用1mM乙酸缓冲液(pH4.4)进行透析。将纯化的F1031-8-3抗体和F1106-13-3抗体分别用10mM碳酸缓冲液(pH 9.5)透析，相对于4mg，添加70μL 0.2M碳酸缓冲液(pH 9.5)，将活化的4mg过氧化物酶与抗体等量混合，在25℃反应2小时。接下来，添加4mg/mL的氢化硼钠，继续在4℃下反应2小时。接着将反应液用PBS透析，得到过氧化物酶标记F1031-8-3抗体(以下可称为F1031-8-3-HRP)和过氧化物酶标记F1106-13-3抗体(以下可称为F1106-13-3-HRP)。测定液量，由所使用的抗体量计算抗体浓度。
[2]夹层EIA系统的制备
使用实施例1中制备的S68抗体作为固相抗体，使用实施例3-(2)[1]和[2]中制备的抗体作为标记抗体，制备两步夹层EIA系统。即，将S68抗体用D-PBS(pH 7.4)稀释为10μg/mL，将50μL添加到免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中。在4℃反应过夜，然后用离子交换水洗涤五次，将100μL含有0.1％StabilGuard(SurModics制备)和0.1％吐温20的D-PBS添加到各孔中，进行封闭。接着，以含有1％正常人血清(使用3C10除去了可溶性CD14抗原的血清，以下称为CD14吸收血清，3C10由取自AmericanTypeCultureCollection的ATCC228-TIB杂交瘤制备)、0.1％BSA的PBS(pH 7.4)作为稀释液，将正常人血清和人败血症患者血清稀释为20倍，制备稀释检体。每孔中添加50μL稀释检体，在37℃反应2小时。
反应终止后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次，用含有5％大鼠血清、1％小鼠血清、0.1％吐温20的76mM PBS(pH 8.0)将F1031-8-3-HRP或F1106-13-3-HRP稀释为0.6μg/mL，向各孔中添加50μL。在37℃反应2小时，然后同样洗涤5次，向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室温下反应20分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应，用读板仪(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)测定450nm的吸光度。结果如表1所示，在来自S68肽的抗体组合而成的系统中，正常人的结果并未上升，败血症患者则特异性上升，由此可以测定血液中的可溶型蛋白质。
[3]夹层EIA系统的制备<2>
使用实施例2中制备的F1146-17-2抗体作为固相抗体，使用实施例3-(2)[2]中制备的抗体作为标记抗体，制备两步夹层EIA系统。即，将F1146-17-2抗体用PBS(pH 6.4)稀释为120μg/mL，将50μL添加到免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中。在56℃反应30分钟，然后用离子交换水洗涤五次，将100μL含有0.1％StabilGuard(SurModics制备)和0.1％吐温20的PBS添加到各孔中，进行封闭。接着，以含有1％BSA的PBS(pH 6.4)作为稀释液，将人正常血清和人败血症患者血清稀释为10倍，制备稀释检体。每孔中添加50μL稀释检体，在25℃反应2小时。
反应终止后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次，用含有5％大鼠血清、1％小鼠血清、0.1％吐温20的76mM磷酸缓冲液(pH 8.0)将过氧化物酶标记F1031-8抗体稀释为0.5μg/mL，向各孔中添加50μL。在25℃反应2小时，然后同样洗涤5次，向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室温下反应20分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应，用读板仪(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)测定450nm的吸光度。结果如表1所示，S68肽特异性单克隆抗体与S68抗体同样，在正常人血清中几乎没有，在败血症患者血清中可以测定到显示高数值的血液蛋白。即，与S68肽结合的抗体不管是多克隆抗体还是单克隆抗体，均可以通过夹层测定系统测定。
表1中的++表示其450nm的吸光度为稀释液单独吸光度的4倍或以上，+表示2倍或以上，-表示与稀释液同等的吸光度。
[表1]
表1
抗体组合   测定值
固相侧   标记侧   败血症患者   正常人
S68抗体   F1031-8-3抗体   ++   -
S68抗体   F1106-13-3抗体   ++   -
F1146-17-2抗体   F1031-8-3抗体   +   -
(实施例4)S68抗体的特异性
为了对实施例1中制备的S68抗体的特异性进行确认，研究在与实施例3-(3)同样的测定中是否受到肽的抑制。即，向25μL败血症患者血清和正常人血清的50倍稀释溶液中分别添加25μL稀释为0、0.1、1、10μg/mL的S68肽(氨基酸序列53位-68位)、与实施例1同样制备的合成肽(氨基酸序列53位-58位、氨基酸序列57位-62位、氨基酸序列59位-64位)或负对照用肽(Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu SerArg Glu Ala Cys)，与S68抗体混合，使其进行竞争反应，然后测定未被抑制地与S68抗体结合的败血症患者血清和正常人血清中该可溶型蛋白质量。
结果如图1所示，显示低数值的正常人血清和显示高数值的败血症患者血清中，S68肽抑制了S68抗体与血清中该可溶型蛋白质的结合，其它的部分肽(各6个氨基酸)和负对照用肽则未抑制。由以上结果表明：通过S68抗体在血清中检测的蛋白质是S68抗体特异性识别的蛋白质。另外，S68肽的部分肽——三种合成肽(氨基酸数为6个)未见抑制，由此表明抗体的识别序列最少需要7个氨基酸或以上的长度。
(实施例5)所制备的抗体的反应速度常数
使用Biacore3000(Biacore制造)对实施例1中制备的S68抗体和实施例2中制备的F1146-17-2抗体的特异性和反应速度常数进行分析。首先，与实施例1的方法同样地，使用马来酰亚胺化BSA(PIERCE)制备固定的S68肽-BSA。接着，使用胺偶联试剂盒，将S68肽-BSA固定在传感器芯片CM5(Biacore制造)上。测定使用HBS-EP(Biacore制备)作为起始缓冲液，通过将F1146-17-2抗体的稀释系列(50、100、150、200、300nM)注射到流式细胞分选仪中进行。数据分析是使用biaevaluatin soft wear 3.0版(Biacore制造)，由S68肽-BSA的流式细胞分选仪测定数据中减去背景细胞数据实施。计算解离常数(KD)，结果，F1146-17-2抗体为4.8×10-9M，显示高亲和性。同样测定的特异性纯化兔S68肽多克隆抗体的KD为2.2×10-10M。
(实施例6)抗CD14单克隆抗体的特异性
6-(1)F1106-13-3抗体的分析
为了明确F1106-13-3抗体的结合区(表位)，使用将CD14的氨基酸序列由N末端一侧以10个氨基酸为一组合成的肽文库膜(CustomSPOTs、Genosys)对CD14的氨基酸序列进行分析。即，按照说明对膜进行封闭，然后与F1106-13-3抗体反应，洗涤后与β-半乳糖苷酶结合抗小鼠抗体反应。洗涤膜后，使用X-gal检测抗体所结合的肽的序列。肽文库膜的肽序列是将1位-154位的氨基酸序列以将C末端的两个氨基酸重叠的形式，每10个氨基酸一组地合成，共对19个肽进行分析。肽按照与实施例1-(1)同样的方法制备。
结果得知，F1106-13-3抗体是与相当于高分子量CD14的N末端的17-26位的氨基酸序列(CNFSEPQPDW)的区域结合的。
6-(2)F1031-8-3抗体的分析<1>
为确认F1031-8-3抗体的特异性，使用实施例3-(1)的来自大肠肝菌的rsCD14(1-285)和WO01/72993号公报实施例8和实施例9的方法，使用由COS细胞制备的rsCD14(1-356)、rsCD14(1-307)S286C，进行结合活性测定。
首先，将各250ng/斑点的rsCD14(1-356)、rsCD14(1-307)S286C、rsCD14(1-285)或BSA固定在Hybond-C extra(Amersham Biosciences)上，干燥后用含有0.05g/mL的脱脂乳(明治乳业)的0.05％吐温20、PBS(pH 6.4)进行封闭。在室温下静置1小时，然后加入F1031-8-3抗体，该抗体用含有0.5％BSA的0.05％吐温20、PBS(pH 6.4)稀释为3μg/mL，在室温下反应1小时，用0.05％吐温20、PBS(pH 6.4)洗涤。
接着，添加过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)，该抗体用含有10％兔血清的0.05％吐温20、PBS(pH 6.4)稀释成500倍的在37℃反应30分钟，然后同样地进行洗涤，通过ECL试剂盒(AmershamBiosciences)确认结合活性。结果如表2所示，F1031-8-3抗体与来自大肠肝菌的rsCD14(1-285)、rsCD14(1-307)S286C、rsCD14(1-356)结合，但不与BSA结合，由此可以明确其特异性识别全部类型的CD14蛋白质。表2的+表示通过ECL检测出薄膜上的斑点，-号表示未检测出斑点。
[表2]
表2
 rsCD14(1-356) rsCD14(1-307)S286C  rsCD14(1-285) BSA
结合活性 + + + -
6-(3)F1031-8-3抗体的分析<2>
对F1031-8-3抗体的结合区(表位)进行分析。即，在固相上通过使用F1031-8-3-HRP作为标记抗体的实施例3-(3)[2]的夹层ELA系统，进行F1106-1-3抗体对S68抗体的抑制实验。
首先，与实施例3-(3)[2]同样地，向S68抗体固相板中添加100ng/mL标准品并使其反应。洗涤板，在添加F1031-8-3-HRP之前，添加25μL 6μg/mL的F1106-13-3抗体、小鼠IgG抗体或不含抗体的缓冲液，然后添加25μL F1031-8-3-HRP，与实施例3-(3)[2]同样地进行测定。
如表3所示，在小鼠IgG抗体添加系统中并没受到抑制，而F1106-13-3抗体则抑制了F1031-8-3与标准品的结合。由此可认为：在F1031-8-3抗体所识别的区域的至少一部分存在F1106-13-3抗体所识别的区域。表3的“抑制率”是以只有缓冲液时的吸光度为100％，由各减少的吸光度计算得出。
[表3]
表3
    添加物     抑制率(％)
    小鼠IgG抗体     2
    F1106-13-3抗体     70
(实施例7)可溶型蛋白质测定试剂盒
7-(1)夹层EIA系统测定试剂盒的构成例
在实施例3-(3)中，给出了使用固相抗体、标记抗体组合的可溶型蛋白质试剂盒，该组合对于败血症患者的测定显示高值、对于正常人的测定显示低数值。
<1>固相抗体：将S68抗体固相化的板
<2>标记抗体：过氧化物酶标记F1031-8-3抗体
<3>底物溶液(四甲基联苯胺溶液)
其它附属品
板系统的构成例
<4>板洗涤液(0.9％NaCl、0.05％吐温20溶液)
<5>试样稀释液(含有0.1％BSA的PBS溶液)
<6>反应中止液(0.5M硫酸溶液)
<7>标准品(CD14(1-307)S286C)
使用上述测定试剂盒进行测定时的测定仪器<参考例>
<8>读板仪(例如E-Max(Molecular Devices Corporation制造))
7-(2)-(11)夹层EIA系测定试剂盒的构成例
除7-(1)之外，表4中又给出了夹层EIA系统的测定试剂盒构成例。<1>表示固定在板上的结合物质。<2>表示标记的结合的物质。构成要素<3>-<7>和参考例的测定仪器<8>与7-(1)相同。<9>表示第二特异结合物质所结合的抗体。“-”表示未记载。
[表4]
表4
<1> <2> <9>
(2) F1146-17-2抗体 F1031-8-3-HRP -
(3) S68抗体 F1106-13-3-HRP -
(4) F1146-17-2抗体 F1106-13-3-HRP -
(5) F1031-8-3抗体 S68抗体-HRP -
(6) F1031-8-3抗体 F1146-17-2-HRP -
(7) F1106-13-3抗体 S68抗体-HRP -
(8) F1106-13-3抗体 F1146-17-2-HRP -
(9) F1031-8-3抗体 SA-HRP Bio-S68抗体
(10) Str F1031-8-3-HRP Bio-S68抗体
(11) S68抗体 SA-HRP Bio-F1031-8-3
7-(12)夹层EIA系统的测定试剂盒的标准曲线
按照与实施例3-(3)[2]同样的方法，用(1)的测定试剂盒进行了测定。即，将S68抗体用D-PBS(pH 7.4)稀释为10μg/mL，以50μL添加到免疫板的各孔中。在4℃反应过夜，用离子交换水洗涤五次，将100μL含有0.1％StabilGuard(SurModics制备)和0.1％吐温20的D-PBS添加到各孔中进行封闭。接着以含有1％CD14吸收血清、0.1％BSA的76mM PBS(pH 7.4)作为稀释液，制备0、3、25、60、100、150ng/mL的CD14(1-307)S286C蛋白质标准品稀释系列。每孔中添加50μL标准品稀释系列，在37℃反应2小时。反应终止后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次，用含有0.1％吐温20的76mM PBS(pH 8.0)将5％大鼠血清、1％小鼠血清、过氧化物酶标记F1031-8-3抗体稀释为0.6μg/mL，向各孔中添加50μL稀释的标记抗体。在37℃反应2小时，然后同样洗涤五次。向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)，在室温下反应20分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应，用读板仪(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)测定450nm的吸光度。图2表示所制备的标准曲线。可以实现测定灵敏度达到0.6ng/mL(空白+3SD)的高灵敏度、简便的测定系统。
7-(13)夹层EIA系的特异性
为了研究存在于人血清中的高分子量CD14对于所制备的测定系统的影响，将0-4μg/mL浓度的来自正常人血清的可溶性CD14抗原添加到CD14(1-307)S286C标准品中，与(12)同样地进行测定，结果如图3所示，来自正常人血清的可溶性CD14抗原即使为4μg/mL，对于测定值也没有影响。由该结果可知：在该夹层EIA系统中，与高分子量CD14的交叉反应性为0.3％或以下。即，该系统不检测人血清高分子量CD14，对于在败血症患者的血清中显示高数值的可溶型蛋白质具有特异性。
7-(14)对夹层EIA系的测定试剂盒的评价
对于(1)的试剂盒的测定结果再现性进行评价。与(12)同样地，使用三种检体进行的同时再现性的变动系数(CV)为5.8、3.6、3.5％，测定期间的再现性为6.2、5.2、5.1％，获得了良好的结果。另外，添加回收实验的回收率为88-109％，良好，未见抗凝固剂(肝素、柠檬酸、EDTA)的影响。以上结果显示：本试剂盒具有充分的性能可以测定血液中该可溶型蛋白质。
(实施例8)血液中可溶型蛋白质的鉴定
8-(1)凝胶过滤色谱<1>
为了对实施例7-(1)的测定试剂盒所检测出的败血症患者血清中的物质进行分析，通过凝胶过滤色谱柱Superdex 200PC3.2/30(Amersham Biosciences)、通过SMART SYSTEM(AmershamBiosciences)、以D-PBS作为展开溶剂，分离败血症患者的血清，使用实施例7-(1)的测定试剂盒和市售CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)测定各组分。分子量的计算使用LMW校正曲线试剂盒和HMW校正曲线试剂盒(Amersham Biosciences)中的醛缩酶(158kDa)、BSA(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、胰凝乳蛋白酶(25kDa)，校正柱进行。
结果如图4所示。在市售CD14-EIA试剂盒中，检测出分子量约57kDa的可溶性CD14抗原，判断其为以往报道的49-55kDa的高分子量可溶性CD14抗原。而通过实施例7-(1)的试剂盒，在分子量35-45kDa附近检测出峰，在57kDa附近未检测出峰，因此可以确认实施例7-(1)的试剂盒只特异性地检测存在于血液中的该可溶型蛋白质。
8-(2)凝胶过滤色谱<2>
与(2)-<1>同样地，通过凝胶过滤色谱柱Superdex 75 10/300GL(Amersham Biosciences)、使用200mM乙酸铵(pH6.8)作为展开溶剂分离50μL败血症患者的血清，使用各试剂盒进行测定。分子量的计算是使用LMV校正试剂盒和HMW校正试剂盒(Amersham Biosciences)中的BSA(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、胰凝乳蛋白酶原(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)对柱进行校正进行。
结果如图5所示。通过实施例7-(1)的试剂盒，在分子量25-35kDa附近检测出来自该可溶型蛋白质的峰。
8-(3)F1025-3-1抗体亲和柱层析
将(2)-<2>中所得的、来自该可溶型蛋白质的峰的组分(例如组分12)供给F1025-3-1抗体亲和柱层析，则来自该可溶型蛋白质的峰被洗脱到亲和柱未吸附成分中。F1025-3-1抗体亲和柱的调节以及实施可按照WO01/220385号公报实施例10记载的方法进行。
(实施例9)由败血症患者血清中纯化血液中的可溶型蛋白质
9-(1)F1024-1-3-琼脂糖4B载体的制备
将55mg根据WO01/72993号实施例2中记载制备的F1024-1-3抗体(如上所述，杂交瘤以保藏号FERM BP-7511保藏)添加到20mLECH-Scpharose 4B(Amersham Biosciences制备)中，加入水溶性碳二亚胺((株)同仁化学研究所)，使终浓度为0.1M，在4℃实施偶联反应过夜。接着用0.1M乙酸钠(pH 5.0)洗涤，然后回收未反应的F1024-1-3抗体。分别测定偶联反应前的抗体溶液和洗液在280nm下的吸光度，求出偶联效率(换算值：0.714mg/mL)。结果，F1024-1-3抗体的偶联效率为55％，1mL载体可结合1.5mg F1024-1-3抗体。
接着添加1M乙醇胺(pH7.4)，在室温下进行1小时封闭反应，用100mL 0.1M乙酸钠/0.5M NaCl(pH 4.0)、接着用100mL 0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl(pH 8.0)洗涤载体。再将该操作实施两次，制备20mLF1024-1-3琼脂糖4B载体。
9-(2)S68-琼脂糖4FF载体的制备
使用具有10kDa截止分子量的透析膜(Spectrum制备)，以2.5L含有0.5M NaCl的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)作为透析液，在4℃对18mg实施例1-(4)中制备的S68抗体透析过夜。透析液更换三次。接着，将预先用含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)平衡的8mL NHS-活化琼脂糖4Fast Flow(Amersham Biosciences)添加到经透析的S68抗体溶液中，在4℃下进行偶联反应过夜。偶联反应终止后，用含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)洗涤未反应的S68抗体并回收。分别测定偶联反应前的抗体溶液和偶联反应后的抗体溶液在280nm下的吸光度，求出偶联效率(换算值：0.714mg/mL)。结果，S68抗体的偶联效率为79％，表明1mL载体可以结合1.8mg S68抗体。接着，将含有0.5M氯化钠的0.5M一甲醇胺(pH 8.3)加入到载体中，在4℃下进行封闭反应过夜。封闭反应终止后，用300mL含有0.5M氯化钠的0.1M乙酸钠(pH 4)洗涤载体，然后用300mL含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)洗涤载体。再将该操作重复两次，制备8mL S68-琼脂糖4Fast Flow。
9-(3)SDS-PAGE
SDS-PAGE使用12.5％凝胶，按照Laemmli的方法(Laemmli UKCleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4.nature.1979 Aug 15；227(259)：680-5)，在非还原条件下实施。即，向2容量试样中添加1容量的Tris-SDS-Seprasol(第一化学药品(株))，在100℃加热处理5分钟，然后过12.5％的ePAGEL凝胶(ATTO Corporation)，通过Laemmli的不连续缓冲系统，以25mA进行90分钟定电流电泳。电泳结束后，用银染试剂盒2D银染试剂·II“第一”(第一化学药品株式会社)，对凝胶进行染色。计算分子量时，使用Precision plus proteinTM双色标准品(Bio-Rad)作为分子量标志。
9-(4)蛋白质印迹
预先将切成SDS-PAGE凝胶大小的滤纸浸泡在5％甲醇/25mMTris/40mMε氨基己酸溶液中，放置在铂电极半干转印BE330(BiocraftLtd.)的阴极电极盘上，接着，按照上述(3)实施SDS-PAGE，然后将凝胶浸泡在相同的溶液中，与滤纸重叠，注意中间不要混入气泡。然后，将预先用5％甲醇/25mM Tris平衡的硝基纤维素膜(转移印迹的转印介质、Bio-Rad)重叠在凝胶上面，注意不要有气泡混入。再将预先浸泡在相同溶液中的滤纸重叠其上，注意不要有气泡混入，最后，将浸泡在5％甲醇/300mM Tris的滤纸重叠其上，注意不要有气泡混入。在其上放置阳极电极，以2mA/cm2、在室温下转印2小时。转印结束后，将硝基纤维素膜浸泡在Block-Ace封闭液(大日本制药株式会社)中，在37℃进行1小时的封闭操作。然后在37℃下、使硝基纤维素膜与10mL 6.8μg/mL F1031-8-3抗体反应2小时，用0.05％吐温20/PBS洗涤，然后在37℃与抗小鼠IgG抗体-HRP共轭物(DAKO A/S)反应1小时。反应终止后，用0.05％吐温20/PBS洗涤硝基纤维素膜。洗去未反应的共轭物，然后浸泡在50mL用蒸馏水稀释为2倍的TMB-H(Moss制备)，在4℃下、在暗处使其发光过夜。
9-(5)由败血症患者血清中纯化血液中可溶型蛋白质
将1mL 9-(1)中制备的F1024-1-3-琼脂糖4FF填充内径为1cm的econo-columm柱(Bio-Rad)，用含有0.05％吐温20的D-PBS(pH 7.4)平衡。同时，将1mL实施例9-(2)中制备的S68-琼脂糖4FF同样地填充内径为1cm的econo-columm(BIO-RAD)，用含有0.05％吐温20的D-PBS(pH 7.4)平衡。接着将两根柱串联连接，在S68-琼脂糖TM4FF柱的前端配置F1024-1-3-琼脂糖TM4B柱。将18mL败血症患者血清以0.02mL/分钟的流速供给该串联柱。用含有0.05％吐温20的D-PBS(pH7.4)洗涤未吸附在柱上的蛋白质，然后撤去S68-琼脂糖4FF柱，将与S68-琼脂糖4FF柱吸附的蛋白质通过含有0.05％吐温20的10mM盐酸、以0.2mL/分钟的流速洗脱，取到10支分离管中，每支管中取2mL。向各分离容器中预先添加200μL 500mM碳酸氢铵，使洗脱液的pH值立即恢复中性。测定各组分中通过实施例7-(1)试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质的浓度，收集含有该蛋白质的组分，进行冷冻干燥。
冷冻干燥结束后，向冻干粉末中加入0.2mL含有0.05％吐温20的150mM乙酸铵溶液，使其溶解，以3,500×g离心10分钟，然后用Superdex 75 10/300GL(Amersham Biosciences制造)，将该上清进行凝胶过滤。使用含有0.05％吐温20的150mM乙酸铵溶液作为展开溶液，将0.2mL试样过柱，以0.8mL/分钟的流速添加，添加试样后，在7.8分钟之后取到40支分离管中，各取0.45mL。
通过实施例7-(1)的试剂盒和市售CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg制造)测定各组分。结果，由实施例7-(1)的试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质是在组分12中具有峰的组分11-13，由18mL败血症患者血清中得到了1.1μg血液中可溶型蛋白质。该蛋白质的峰在29±5kDa的位置。分子量标志使用Gel Filtration LMV校正曲线试剂盒(AmershamBiosciences制造)中的BSA(67.0kDa)、卵清蛋白(43.0kDa)、胰凝乳蛋白酶原A(25.0kDa)和核糖核酸A (13.7kDa)。
接着，将这些凝胶过滤组分进行实施例9-(4)的蛋白质印迹分析，使用Precision plus proteinTM双色标准品(Bio-Rad制备)，进行由实施例7-(1)的试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质的鉴定和分子量的测定。结果，上述凝胶过滤组分与实施例7-(1)试剂盒的测定结果一致地增减，组分12中具有峰的血液中可溶型蛋白质检测出分子量为13±2kDa的条带。(图6、图7)
(实施例10)由正常人血清纯化血液中可溶型蛋白质
10-(1)由正常人血清中纯化血液中可溶型蛋白质
通过实施例7-(1)的试剂盒，对购自日本Biotest(株)的人正常血清进行定量，结果得到了61ng/mL的值。
将20mL实施例9-(1)制备的F1024-1-3-琼脂糖4B载体填充XK柱26/20柱(Amersham Biosciences制造)，用含有0.05％吐温20的D-PBS(pH 7.4)平衡。将8mL实施例9-(2)中制备的S68-琼脂糖4FF载体填充XK柱16/20柱(Amersham Biosciences制造)，同样的用含有0.05％吐温20的D-PBS(pH 7.4)平衡。
接着将两根柱串联连接，在S68-琼脂糖4FF柱的上端配置F1024-1-3-琼脂糖4B柱。将1.3L上述人正常血清以0.5mL/分钟的流速供给该串联柱。用含有0.05％吐温20的D-PBS(pH7.4)洗涤未吸附的蛋白质，然后撤去连接的柱，将与S68-琼脂糖4FF柱吸附的蛋白质通过含有0.05％吐温20的10mM盐酸、以1mL/分钟的流速洗脱160分钟，取到10支分离管中，每支管中取20mL。向各制备容器中预先添加2mL 500mM碳酸氢铵，使洗脱液的pH值立即恢复中性。测定各组分中由实施例7-(1)试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质的浓度，收集含有该蛋白质的组分，进行冷冻干燥。
向冻干粉末中加入1mL含有0.05％吐温20的150mM乙酸铵溶液，使其溶解，用孔径为0.22μm的滤器(Mylex GV13、Millipore)过滤，然后供给使用Superdex 75 10/300GL(Amersham Biosciences制造)柱的凝胶过滤。使用含有0.05％吐温20的150mM乙酸铵溶液作为展开溶液，将0.5mL试样过柱，以0.8mL/分钟的流速实施凝胶过滤。添加试样后，在7.8分钟之后取到40支分离管中，各取0.45mL。将该凝胶过滤实施2次。
通过实施例7-(1)的试剂盒和市售CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg制造)测定各组分。结果，由实施例7-(1)的试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质是在组分12中具有峰的组分11-13。于是实力9-(4)同样地求出的该蛋白质的峰在29±5kDa的位置。
接着，将这些凝胶过滤组分进行实施例9-(4)的蛋白质印迹分析，使用Precision plus proteinTM双色标准品(Bio-Rad制备)，进行由实施例7-(1)的试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质的鉴定和分子量的测定。结果，上述凝胶过滤组分与实施例7-(1)试剂盒的测定结果一致地增减，组分12中具有峰的血液中可溶型蛋白质检测出分子量为13±2kDa的条带。(图8)
收集上述组分，进行冷冻干燥。向所得冷冻干燥标准品中添加100μL含有0.05％吐温20的150mM乙酸铵溶液使其溶解，通过实施例7-(1)的试剂盒求出该血液中可溶型蛋白质的回收量。结果，由1.3L人正常血清中得到了19μg血液中可溶型蛋白质。
10-(2)氨基酸序列的鉴定
[1]电印迹
通过实施例9-(3)的SDS-PAGE，将实施例10-(1)中冷冻干燥的由实施例7-(1)的试剂盒检测的血液中可溶型蛋白质在丙烯酰胺凝胶上展开，然后向聚偏氟乙烯(以下称为PVDF)膜上进行电印迹。即，在转印装置——铂电极半干转印仪(Biocraft Ltd.)的阴极上放置浸泡有20％甲醇/25mM Tris/40mMε氨基己酸溶液的滤纸，在其上重叠放置电泳后的丙烯酰胺凝胶、再放置PVDF(clear Blot Membrane P(ATTOCorporation))膜。再将浸泡于20％甲醇/25mM Tris的滤纸和浸泡于20％甲醇/0.3M Tris的滤纸依次重叠，最后放置阳极装置。转印以约2mA/cm2的定电流进行1小时。
[2]转印蛋白的检测
电印迹后，将PVDF膜在0.1％考马斯亮蓝G250/10％乙酸/30％乙腈溶液中浸泡约5分钟，然后用10％乙酸/30％乙腈溶液适当脱色，检测蛋白质。
[3]氨基酸序列分析
用干净的切刀将在PVDF膜上检测出的分子量为13±2kDa的蛋白质条带切出，转移到1.7mL微量离心管中。将切出的PVDF膜片段用0.1％三氟乙酸/50％甲醇溶液洗涤三次，再用甲醇洗涤，使其完全干燥。氨基酸序列分析使用蛋白质测序仪Procise494cLC(AppliedBiosciencesJapan)。将洗净后的PVDF膜片段设置在蛋白质测序仪上，设定必要的分析周期进行分析。结果可以确认N末端具有Thr Thr Pro Glu ProXaa Glu Leu Asp Asp Glu氨基酸序列作为主要序列。
由蛋白质测序仪的性质看，Xaa可能是Cys、Asn、Ser、Thr或其它改性氨基酸，考虑到分析的蛋白质是来自CD14的蛋白质，可以认为它是Cys。另外，通过还原烷基化法进行的氨基酸分析中，也可以求出Xaa为Cys。
由上述结果可知：对于凝胶过滤组分，在非还原下12.5％DSD-PAGE下得到的分子量为13±2kDa的组分纯度好，实施例7-(1)的试剂盒检测的血液中可溶型蛋白质得到了纯化。
由实施例7-(1)的试剂盒检测出的血液中可溶型蛋白质是在N末端具有由CD14的第一个残基开始的氨基酸序列Thr Thr Pro Glu ProCys Glu Leu Asp Asp Glu、在非还原条件下的SDS-PAGE中为分子量13±2kDa的新型蛋白质。由实施例7-(1)的试剂盒检测出来，表明可以与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
由实施例9和10的结果可知：在败血症患者血清中确认的、由实施例7-(1)的试剂盒检测出的血中可溶型蛋白质也存在于人正常血清中。该蛋白质在败血症患者血清中可以以更多的比例回收。
使用用标记的3C10作为标记抗体、用MEM-18(Monosan制备)作为固相抗体的夹层测定系统代替实施例8-10中使用的IBL-试剂盒，也可以得到与IBL-试剂盒同样的结果。
标记按照实施例3-(3)进行，夹层测定系统按照实施例7-(1)构成。
(实施例11)各种疾病患者的测定
败血症患者血清使用已经鉴定了分离菌的10例病例(表5)。使用实施例7-(1)的测定试剂盒，对正常人52例(男性31例、女性21例)、和各种疾病患者(20种疾病、60例)进行测定。
[表5]
表5
序号 性别 年龄 菌
1 男 41 凝固酶阴性菌
2 女 44 凝固酶阴性菌
3 女 61 屎肠球菌(Faecium bacteria)
4 男 52 沙雷氏菌
5 男 37 大肠杆菌
6 女 67 大肠杆菌
7 男 70 金黄葡萄球菌
8 男 51 成团泛菌(Pantoea agglomerans)
9 女 81 大肠杆菌
10 男 77 大肠杆菌
血清中通过实施例7-(1)的试剂盒检测的可溶型蛋白质的浓度在正常人中以0.008-0.100μg/mL分布，平均值为0.04μg/mL。在败血症患者中以0.190-7.260μg/mL分布，平均值为2.0μg/mL。该可溶型蛋白质浓度在败血症患者中比正常人和各种疾病患者中均显示高的数值，与正常人相比较，在各种疾病患者中并未发现显示高数值的疾病。
(实施例12)与市售的血液中可溶型CD14蛋白质ELISA试剂盒的比较
12-(1)各种疾病患者血液中可溶型CD14蛋白质的测定
使用市售的CD14-EIA试剂盒(IBL-Hamburg)对实施例11的检体进行测定。血清中的可溶型CD14蛋白质浓度在正常人中以5.6-11.2μg/mL分布，在败血症患者中可见高数值的例子。但是，在各种疾病患者血清中可见很多可溶型CD14蛋白质显示高数值的例子，与败血症患者血清之间未见差异。
12-(2)与使用S68抗体的试剂盒进行的比较
与实施例11中测定的该可溶型蛋白质的测定值进行了比较研究。如表6所示，使用市售CD14-EIA试剂盒，则在正常、各种疾病、败血症之间只有最大1.7倍左右的差异，而在实施例7-(1)的测定试剂盒中，正常人和各种疾病之间未见差异，但正常人与败血症之间有50倍的差异，由此表明实施例7-(1)的测定试剂盒的测定值在败血症中特异性上升。
[表6]
表6
以正常人的平均值+3S.D.作为阈值(实施例7-(1)的测定试剂盒：0.134μg/mL、市售CD14-EIA：11.14μg/mL)，分为阳性例(败血症)和阴性例(正常、各种疾病)进行分析，结果如表7所示。根据该结果计算两试剂盒的一致率((EIA 阳性一致数-EIA 阳性一致数)/总数×100)、灵敏度(EIA 阳性一致数/阳性例×100)、特异度(EIA 阴性一致数/阴性例×100)，结果如表8所示，对于实施例7-(1)的试剂盒，一致率为94.3％、灵敏度为100.0％、特异度为93.8％，可知通过设定阈值，可以用作败血症的鉴别诊断.另一方面，对于市售的CD14-EIA，灵敏度、特异度均未见其可以诊断败血症的特异性和有用性。
[表7]
表7
分类 阳性例       阴性例 合计
疾病 败血症 正常 各种疾病
实施例9-(1)的测定试剂盒 10 51 54 115
市售CD14-EIA 6 51 45 102
合计 10 52 60 122
[表8]
表8
(实施例13)重组型可溶性CD14片段的制备
为了使实施例10中制备的血液中可溶型蛋白质(以下可称为可溶性CD14亚型、或者以其简略符号称为低分子sCD14-ST)作为重组蛋白质表达而进行制备。
13-(1)CD14C末端缺失变异体表达质粒的构建
为了制备重组型可溶性CD14片段(以下称为重组型可溶性CD14亚型、或者以简略符号称为rsCD14-ST)，构建质粒，该质粒生产CD14的C末端缺失的蛋白质。
使SEQ ID No.3的人CD14分子的
1)由66位至C末端缺失的分子(以下称为CD14(1-65)，以下相同)、
2)由71位至C末端缺失的分子(CD14(1-70))、
3)由76位至C末端缺失的分子(CD14(1-75))、
4)由81位至C末端缺失的分子(CD14(1-80))、
5)由86位至C末端缺失的分子(CD14(1-85))、
6)由91位至C末端缺失的分子(CD14(1-90))、
7)由96位至C末端缺失的分子(CD14(1-95))、
8)由101位至C末端缺失的分子(CD14(1-100))、
9)由106位至C末端缺失的分子(CD14(1-105))、
10)由111位至C末端缺失的分子(CD14(1-110))
在哺乳细胞中表达的质粒、pCAG65、pCAG70、pCAG75、pCAG80、pCAG85、pCAG90、pCAG95、pCAG100、pCAG105和pCAG110按照以下方法构建。分别设计并合成下述引物：
有义引物1(5’-TTT CCT ACA GCT CCT GGG-3’)(SEQ ID No.11)
和反义引物1(5’-GG GGT ACC TTA GTC AGC ATA CTG CCG CGGGTC-3’)(SEQ ID No.12)、反义引物2(5’-GG GGT ACC TTA GAGAGC CTT GAC CGT GTC AGC-3’)(SEQ ID No.13)、反义引物3(5’-GG GGT ACC TTA GAG CCG CCG CAC GCG GAG AGC-3’)(SEQ ID No.14)、
反义引物4(5’-GG GGT ACC TTA TGC GGC TCC CAC TGT GAGCCG-3’)(SEQ ID No.15)、反义引物5(5’-GG GGT ACC TTA CTGAGC AGG AAC CTG TGC GGC-3’)(SEQ ID No.16)、反义引物6(5’-GG GGT ACC TTA GGC GCC TAC CAG TAG CTG AGC-3’)(SEQ ID No.17)、
反义引物7(5’-GG GGT ACC TTA CGC TAG CAC ACG CAG GGCGCC-3’)(SEQ ID No.1 8)、反义引物8(5’-GG GGT ACC TTA CTTGAG GCG GGA GTA CGC TAG-3’)(SEQ ID No.1 9)、反义引物9(5’-GG GGT ACC TTA CTC GAG CGT CAG TTC CTT GAG-3’)(SEQ ID No.20)和反义引物10(5’-GG GGT ACC TTA GGT TAT CTT TAG GTCCTC GAG-3’)(SEQ ID No.21)
接着，以pCAG356为模板，以有义引物1和反义引物1、有义引物1和反义引物2、有义引物1和反义引物3、有义引物1和反义引物4、有义引物1和反义引物5、有义引物1和反义引物6、有义引物1和反义引物7、有义引物1和反义引物8、有义引物1和反义引物9、或有义引物1和反义引物10的引物对，分别进行PCR。PCR的反应条件是在90℃加热2分钟，然后将<1>98℃10秒、<2>50℃30秒、<3>72℃1分钟的循环重复30次。将所得产物用限制酶EcoRI和KpnI双消化，分别回收0.4kb-0.5kb的片段。将pCAG356用限制酶EcoRI和KpnI切断，将所得的约4.8kb片段与上述扩增产物片段连接，按照规定方法转化E.coli JM109，得到各表达质粒。pCAG356是在pCGAAS(GENE，15卷，269-277页(1989))中插入WO98/39438中记载的来自质粒pUCH14P-4的CD14基因得到的质粒。
13-(2)插入了蛋白分解酶的切断序列的CD14表达质粒的构建
在使用实施例13-(1)的质粒进行的rsCD14-ST的生产方法中，生产量非常低，因此可以判断使用实施例1-(1)的质粒生产rsCD14-ST的生产方法中，以所表达的片段作为标准品，无法纯化至很纯的纯度。因此，插入蛋白分解酶的切断序列，该蛋白分解酶的切断序列特异性切断具有356长度的CD14的64位，然后使其以全长表达，然后用蛋白分解酶特异性切断，分离纯化SEQ ID No.3的1位-64位部分和余下的部分，由此制备rsCD14-ST。蛋白分解酶的切断序列使用ProScissionProtease识别序列和凝血酶识别序列两种。
13-(2)-1rsCD14-ST(PSP64/356)表达质粒的构建
使在SEQ ID No.3人CD14的64位Ala和65位Ast氨基酸之间插入了ProScission Protease识别序列(LEVLFQGP共8个氨基酸残基、用单字母表示)的rsCD14(以下称为rsCD14-ST(PSP64/356))表达的质粒可按照以下方法构建。分别设计并合成下述引物：
有义引物1 (5’-TTT CCT ACA GCT CCT GGG-3’)、有义引物2 (5’-GCT CTG GAA GTTCTG TTC CAG GGG CCC GAC ACG GTC AAG GCT CTC CGC GTG CGG-3’)(SEQ ID No.22)、反义引物11 (5’-GTCGGG CCC CTG GAA CAG AAC TTC CAG AGC ATA CTG CCG CGG GTC GGC GTC CGC-3’)(SEQ ID No.23)和反义引物12(5’-TCT CCA TTC CTG TGT TGC GC-3’)(SEQ ID No.24)
以插入了SEQ ID No.3的可溶型人CD14结构基因序列的质粒pCAG356为模板，使用A：有义引物1和反义引物11、B：有义引物2和反义引物12进行PCR。PCR的反应条件为A：在90℃加热2分钟，然后将<1>98℃10秒、<2>50℃30秒、<3>72℃1分钟的循环重复30次；B：在90℃加热2分钟，然后将<1>98℃10秒、<2>46℃30秒、<3>72℃1分钟的循环重复30次。回收所得PCR扩增产物A：约0.5kb、B：约0.5kb，接着，以这两种混合物为模板，使用有义引物1和反应引物12进行PCR。PCR反应条件与上述A相同。回收所得约0.9kb的PCR扩增产物，用限制酶EcoRI和XhoI切断。将pCAG356用限制酶EcoRI和XhoI切断，将所得约5.2kb的片段与上述片段连接，按照规定方法转化E.coli JM109。所得表达质粒为pCAG356(PSP64/356)。再将pCAG356用限制酶EcoRI和KpnI消化，回收约1.3kb的片段。将具有人EF-1α启动子的哺乳细胞表达载体pTK-2043用EcoRI和KpnI消化，将所得约4.4kb的片段与上述片段连接，按照规定方法转化E.coliJM109，得到pTK356(PSP64/356)。
13-(2)-2rsCD14-ST(2ST64/356)表达质粒的构建
使在SEQ ID No.3人CD14第64位Ala和第65位Asp氨基酸之间插入了凝血酶识别序列(LVPRGS共6个氨基酸残基)的rsCD14(以下可称为rsCD14-ST(2ST64/356))表达的质粒可按照如下方法构建。分别设计并合成下述引物：
有义引物3(5’-CTG GTT CCG CGT GGT TCC GACACG GTC AAG-3’)(SEQ ID No.25)、反义引物13(5’-GAA CCA CGC GGA ACC AGA GCA TAC TGC CGC-3’)(SEQ IDNo.26)、反义引物14 (5’-CGC GAT CCT CAA TGA TGATGA TGA TGA TGG-3’)(SEQ ID No.27)
以pCAG356-His为模板，使用A：有义引物1和反义引物13、B：有义引物3和反义引物14进行PCR。其中所述pCAG356-His是在质粒pCAG356的可溶型人CD14的C末端附加有His标志物(His×6个)分子的结构基因序列。PCR的反应条件是在96℃加热2分钟，然后将<1>96℃30秒、<2>55℃30秒、<3>72℃1分钟的循环重复25次。回收所得PCR扩增产物A：约0.5kb、B：约0.9kb，接着，以这两种混合物作为模板，使用有义引物1和反义引物4进行PCR。PCR反应条件与上述A同样。回收所得约1.4kb的PCR扩增产物。插入到pT7-Blue(T)载体中，确认碱基序列。然后用限制酶EcoRI和BamHI切断，得到约1.3kb片段。将pTK-2043用EcoRl和BamHI消化，将所得约4.4kb的片段与上述所得的约1.3kb的片段连接，按照规定方法转化E.coliJM109，得到pTK356H(TB64)。
13-(3)rsCD14-ST的制备
13-(3)-1rsCD14-ST的制备
使用Fugene6(Roche)，将(1)中的各质粒转染COS-1细胞(ATTC：CRL-1650)。即，按照使用说明，将1.7μL/mL转染试剂和4μg/mL质粒混合，添加到培养基中，然后添加到COS-1细胞中，在37℃培养。72小时后回收培养上清，将培养上清离心，然后用0.22μm的滤器过滤。
13-(3)-2rsCD14的制备
使用Fugene6(Roche)，将质粒(pTK356(PSP64/356)和pTK356H(TB64))转染COS-1细胞，所述质粒分别含有编码(2)-1和(2)-2的rsCD14-ST序列的基因。即，根据使用说明，将1.7μL转染试剂和4μg/mL质粒混合，添加到培养基中，然后添加到COS-1细胞中，在37℃培养。72小时后回收培养上清，添加新的培养基，再培养96小时，也回收该培养上清。培养上清离心后，用0.22μm的滤器过滤，用于纯化。
13-(3)-3rsCD14-ST的制备(2)
由(3)-2中生产的各培养上清纯化rsCD14-ST(PSP64/356)、rsCD14-ST(2ST64/356)，用蛋白分解酶切断，然后纯化rsCD14-ST。
<1>rsCD14-ST(2ST64)的纯化
以下的操作如无特别说明，均在4℃下实施。
向Chelating-琼脂糖FF(Amersham Biosciences)载体上等容量通入0.1M硫酸镍水溶液，接着加入3容量的蒸馏水冲洗，洗去未反应的镍，制备镍-琼脂糖载体。
将1000mL(3)-2所得的COS-1培养上清以8mL/分钟的流速添加到经PBS平衡的40mL镍-琼脂糖柱中，用PBS洗涤未吸附的蛋白质。接着，用含有20mM咪唑的PBS洗脱非特异性吸附的蛋白质，然后用含有500mM咪唑的PBS洗脱目标蛋白质。用PBS对该洗脱液透析过夜。
可按照后述实施例15-(3)所示的方法测定透析液的蛋白浓度。根据该结果，添加凝血酶蛋白酶(Amersham Biosciences)，使酶∶底物＝1∶50(U∶μg)，在22℃静置过夜，实施凝血酶切断反应。
添加1/10容量的100mM苄脒水溶液，中止酶促反应，接着添加2倍容量的含8M尿素的50mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液。将该溶液以3mL/分钟的流速供给预先用含有8M尿素的50mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡的3mL Q-琼脂糖HP柱(Amersham Biosciences)。用该缓冲液洗涤未吸附的蛋白质，通过0-500mM氯化钠直线浓度梯度(50分钟)洗脱吸附的蛋白质。将洗脱液分别取3mL，通过实施例7-(3)的试剂盒测定各组分中相当于将rsCD14-ST(2ST64/356)65位以后被切断得到的rsCD14-ST(以下可称为rsCD14-ST(2ST64))组分的含量。
收集含有rsCD14-ST(2ST64)的组分，用150mM碳酸氢铵水溶液透析过夜，然后冷冻干燥。将所得冷冻干燥标准品用含有8M尿素的PBS溶解，以0.4mL/分钟的流速过预先用该缓冲液平衡的Superdex 7510/300GL柱(Amersham Biosciences)。将柱溶液各取0.45μL取40组，通过SDS-PAGE确认各组分中rsCD14-ST(2ST64)的纯度，然后收集。即，向各组分中添加等容量的Tris-SDS-Seprasol(第一化学药品株式会社)，在100℃加热处理5分钟，然后供给5-20％的e-PAGEL凝胶(ATTOCorporation)，按照Laemmli的方法，在非还原条件下，以25mA进行90分钟电泳。电泳结束后，使用银染试剂盒2D银染试剂·II“第一”(第一化学药品株式会社)对凝胶进行染色。将该2ST64标品用蒸馏水透析过夜，得到最终纯化标准品。按照后述实施例15-(3)所示的方法，测定最终纯化标准品的蛋白浓度。通过以上操作，由1000mL COS-1培养上清得到452μg rsCD14-ST(2ST64)。通过SDS-PAGE确认所得纯化标准品的纯度，如图9所示，检测出单一条带。
<2>rsCD14-ST(PSP64)的纯化
以下操作如无特别说明，均在4℃下进行。
将(3)-2所得COS-1培养上清以9mL/分钟的流速过预先经PBS平衡的3C10-琼脂糖4FF柱，用PBS洗涤未吸附的蛋白质，然后用10mMHCl洗脱吸附蛋白质。向洗脱组分中添加1/10容量的500mM重碳酸氢铵，使pH值恢复为中性，然后冷冻干燥。3C10-琼脂糖4FF柱如下制备。使用具有10kDa截止分子量的透析膜，以2.5L含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)作为透析液，在4℃下对3C10抗体透析过夜。透析液更换三次。接着，将预先用含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)平衡的NHS-活化琼脂糖4Fast Flow(AmershamBiosciences)添加到透析过的3C10抗体溶液中，在4℃进行偶联反应过夜。接着，向载体中加入含有0.5M氯化钠的0.5M一甲醇胺(pH 8.3)，在4℃进行封闭反应过夜。封闭反应结束后，用含有0.5M氯化钠的0.1M乙酸钠(pH 4)洗涤载体，然后用含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH 8.3)洗涤载体。
将所得冷冻干燥标准品溶解于含有1mM EDTA和150mM氯化钠的50mM Tris-HCl(pH 7)缓冲液中，按照后述实施例15-(3)所示方法测定蛋白浓度。然后添加PreScission Protease(AmershamBiosciences)，使酶∶底物比＝1∶3(U∶μg)，在4℃下实施切断反应过夜。反应终止后，添加2倍容量的含有8M尿素的50mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液，以1mL/分钟的流速过2mL Q-琼脂糖HP柱。用相同的缓冲液洗涤未吸附的蛋白质，然后通过0-500mM氯化钠的直线浓度梯度(100分钟)洗脱吸附的蛋白质。各取3mL洗脱液，通过实施例7-(3)的试剂盒测定各组分中相当于将rsCD14-ST(PSP64-356)从65位以后切断得到的rsCD14-ST(以下可称为rsCD14-ST(PSP64))的组分的含量。
收集含有rsCD14-ST(PSP64)的组分，用150mM碳酸氢铵水溶液透析过夜，然后冷冻干燥。将所得冷冻干燥标准品溶解于含有8M尿素的PBS中，以0.4mL/分钟的流速过预先用相同缓冲液平衡的Superdex 75 10/300GL柱(Amersham Biosciences)。各取0.45mL共40组分，通过<1>中所示的SDS-PAGE确认各组分的rsCD14-ST(PSP64)纯度，然后收集。将该rsCD14-ST(PSP64)标准品用蒸馏水透析过夜，得到最终纯化标准品。按照后述实施例15-(3)所示方法测定最终纯化标准品的蛋白浓度。通过以上操作，由13,000mL的COS-1培养上清中得到368μg PSP64。通过SDS-PAGE确认所得纯化标准品的纯度，如图9所示，检测出单一条带。
(实施例14)rsCD14-ST的评价
14-(1)使用实施例7-(3)的试剂盒进行浓度测定
为了确认在实施例13-(3)-1中制备的培养上清中产生了rsCD14-ST，使用实施例7-(3)的试剂盒，测定各培养上清中的rsCD14-ST浓度。结果如表9所示。通过实施例9-(4)的方法，对各培养上清进行蛋白质印迹分析，结果完全未检测出条带。由此可以判断，产生了rsCD14-ST，用可高灵敏度检测的试剂盒可以检测，但是实际蛋白量非常少。
[表9]
表9
缺失体 1-65 1-70 1-75 1-80 1-85 1-90 1-95 1-100 1-105 1-110
浓度(μg/ml) 195 500 273 100 55 16 0.43 0.21 0.29 0.18
缺失体标记例：1-65表示SEQ ID No.3的1位-65位的片段(rsCD14(1-65))
14-(2)蛋白质印迹法检测rsCD14-ST
确认实施例10-(1)中制备的rsCD14-ST和实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(PSP64)对F1106-13-3、F1031-8-3抗体和S68抗体的反应性。即，SDS-PAGE使用12.5％凝胶，按照Laemmli的方法，在非还原条件下实施。向试样中加入等容量的Tris-SDS-Seprasol(第一化学药品株式会社)，在4℃进行SDS处理过夜，然后过12.5％的e-PAGEL凝胶(ATTO Corporation)，通过Laemmli的不连续缓冲液系统，以40mA电泳40分钟。
将预先切成SDS-PAGE凝胶大小的滤纸浸泡在5％甲醇/25mMTris/40mMε氨基己酸溶液中，放置在铂电极半干转印BE330(BiocraftLtd.)的阴极电极盘上，接着，将凝胶浸泡在相同的溶液中，与滤纸重叠，注意中间不要混入气泡。然后，将预先用5％甲醇/25mM Tris平衡的硝基纤维素膜(转移印迹的转印介质、Bio-Rad)重叠在凝胶上面，注意不要有气泡混入。再将预先浸泡在相同溶液中的滤纸重叠其上，注意不要有气泡混入，最后，将浸泡在5％甲醇/300mM Tris的滤纸重叠其上，注意不要有气泡混入。在其上放置阳极电极，以2mA/cm2、在室温下转印2小时。转印结束后，将硝基纤维素膜浸泡在Block-Ace封闭液(大日本制药株式会社)中，在37℃进行80分钟的封闭操作。然后在37℃下、使硝基纤维素膜与6.8μg/mL F1106-13-3抗体、6.8μg/mLF1031-8-3抗体或6.8μg/mL S68抗体反应80分钟，用0.05％吐温20/PBS洗涤，然后在37℃下、与F1106-13-3抗体和F1031-8-3抗体反应的硝基纤维素膜与抗兔IgG抗体-HRP共轭物(DAKO)、与S68抗体反应的硝基纤维素膜与抗兔IgG抗体-HRP共轭物(DAKO)分别反应1小时。反应终止后，将硝基纤维素膜用0.05％吐温20/PBS洗涤。洗去未反应的共轭物，然后加入4mL ECL(Plus)(Amersham Biosciences)，在室温下反应5分钟，然后重叠在HyperfilmTM ECL (AmershamBiosciences)上，曝光90秒。
结果，sCD14-ST和PSP64队三种抗体均显示大致同等的反应性。
(实施例15)rsCD14-ST的物性分析
对实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(2ST64)和rsCD14-ST(PSP64)的物性进行了分析。两种片段在切断时所使用的蛋白分解酶不同，除此之外最终纯化品没有差别，基本上均为rsCD14-ST，为同一物质。
15-(1)N末端氨基酸序列分析
N末端氨基酸序列分析使用蛋白质测序仪Procise494cLC(AppliedBiosystems Japan Ltd.)。对rsCD14-ST(2ST64)纯化标准品进行分析，结果确认：从CD14第一个残基开始的氨基酸序列(TTPEPCELDDG)(SEQ ID No.1)是主要成分。未见有CD14以外的氨基酸序列。
15-(2)质量分析
rsCD14-ST(2ST64)纯化标准品是在20mM磷酸钠缓冲液中添加N-葡糖苷酶F(Roche Diagnostics K.K.)，在37℃温育4小时，除去糖链。所得到的除去了糖链的2ST64用ZipTip C18(Millipore)脱盐，以此作为质量分析用的试样。质量分析装置使用autoflexII TOF(BrukerDaltonics Inc.)。底物溶液是将芥子酸用0.1％三氟乙酸∶乙腈＝2∶1混合溶液溶解，使其饱和。质量分析用的试样和底物溶液按1∶4的比例混合。使用1μL进行质量分析。质量分析的结果如下：主峰检测出与rsCD14-ST(2ST64)的肽部分的理论分子量7663.5一致的分子量峰。结合N末端氨基酸序列分析结果考虑，如所设计的那样，如所设计，得到了具有一级结构的分子(含有CD14的1位-64位的氨基酸序列的分子)。
15-(3)蛋白浓度的测定
蛋白浓度的测定使用BRP测定试剂盒(Bio-Rad)，使用BSA(Bio-Rad)标准品，按照所符说明书进行测定。即，向BSA标准溶液和30μL用PBS稀释成各种倍率的试样中添加1.5mL用蒸馏水稀释为5倍的Dye-Reagent，在室温下静置15分钟，然后用分光光度计DU-7400(Beckmann)测定595nm下的吸光度，由BSA的校正曲线测定试样中的蛋白浓度。
15-(4)分子量的计算
为了确认实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST与由败血症患者或正常人中纯化得到的sCD14-ST是类似的蛋白质，通过蛋白质印迹法比较分子量。
由正常人血清得到的sCD14-ST的纯化标准品是将实施例10-(1)所得到的冻干标准品溶解于100μL蒸馏水中使用。
使用Precision plus proteinTM双色标准品(Bio-Rad制备)，通过实施例14-(2)所示的、使用F1031-8-3抗体的蛋白质印迹法进行分子量比较，结果如图10所示，来自人血清的sCD14-ST分子量为12.9kDa，rsCD14-ST(2ST64)为12.6kDa，rsCD14-ST(PSP64)为12.6kDa。
15-(5)与rsCD14(1-307)S286C标准品的比活性的比较
使用实施例7-(1)的试剂盒和rsCD14(1-307)S286C标准品，测定实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(2ST64)的浓度，计算单位蛋白浓度的EIA值。即，用试剂盒的检体稀释液将rsCD14-ST(2ST64)稀释为100pg/mL，然后再制备成50、25pg/mL，用试剂盒测定。结果，1pgsCD14-ST(2ST64)换算为rsCD14(1-307)S286C的换算值为352pg，显示本试剂盒对rsCD14-ST(2ST64)的反应性非常高。
15-(6)LPS结合能力以及对生成IL-6的影响
对于rsCD14-ST是否与全长CD14同样具有LPS结合能力、以及是否具有国际公开WO01/72993号的抑制IL-6生成的作用进行研究。
15-(6)-1 rsCD14-ST(PSP64)抑制IL-6生成的活性
为了研究sCD14-ST(PSP64)抑制IL-6的生成的活性进行研究，进行了以下实验。用含有2％失活FBS的RPMI1640培养基(Sigma)，以2×104细胞/孔将人脐带血管内皮细胞HUVEC(三光纯药)接种于96孔板中，在5％二氧化碳、37℃培养过夜。第二天，制备含有2％人血清的RPMI1640培养基(以下称为2％非FBS/RPMI)，用2％非FBS/RPMI将rsCD14-ST(PSP64)或抗CD14抗体3C10稀释为目标浓度的2倍浓度，制备样品。另外，用2％非FBS/RPMI将LPS(E.Coli 055：B5、DIFCO)稀释为20ng/mL。将培育过夜的HUVEC细胞的培养上清去掉，用含有0.1％HSA(Sigma)的RPMI1640培养基洗涤两次，分别以50μL/孔添加上述样品和LPS稀释液，再在5％二氧化碳、37℃下培养约18小时。然后，用人IL-6检测试剂盒(Eli-PAIR hIL-6；Invitrogen)对培养上清中的IL-6的量进行定量。结果，3C10以约0.1μg/mL抑制50％的IL-6生成，而rsCD14-ST(PSP64)即使添加到10μg/mL浓度也完全不显示抑制活性。
15-(6)-2rsCD14-ST(PSP64)与LPS的结合活性
参考J.B.C 270卷No.3(1995)，1382-1387页，“Soluble CD14Truncated at Amino Acid 152 Binds LPS and Enables Cellular Responseto LPS”，使用Endospecy试剂盒(生化学工业)研究rsCD14ST(PSP64)与LPS的结合能力。即，用含有0.01％BSA的PBS-(以下称为0.01％BSA/PBS)稀释LPS(E.Coli 055：B5、DIFCO)，制备0.6ng/mL的LPS溶液。用含有0.1％HSA的PBS-将rhLBP(R&D系统)稀释为100μg/mL，与上述LPS溶液混合，制备LPS/LBP溶液(LPS浓度约为0.6ng/mL、LBP浓度约为0.3nM)。接着，用0.01％BSA/PBS将rsCD14-ST(PSP64)或rsCD14(1-356)稀释为目标浓度，与LPS/LBP溶液等量混合。在37℃反应1小时，然后添加Endospecy C溶胞产物(EndospecyES-24S set；生化学工业)，在室温下静置20分钟。然后添加25％乙酸，终止反应，用405nm测定吸光度，计算反应液中的LPS浓度(以下称为游离LPS浓度)。另外，校正曲线如下制作：只将LPS稀释溶液在37℃反应1小时，然后与上述样品同样操作。结果，rsCD14(1-356)与添加浓度相关性地使游离LPS量低，可知rsCD14(1-356)与LPS结合，但是rsCD14-ST(PSP64)即使添加至100nM，游离LPS量也不变化，表明rsCD14-ST(PSP64)不具有与LPS结合的能力。
(实施例16)对rsCD14-ST标准品的研究
16-(1)通过rsCD14-ST标准品制备标准曲线
使用实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(2ST64)制作标准曲线。即，用实施例7-(12)的稀释液将rsCD14-ST(2ST64)稀释，制备成0.06、0.5、1.2、2、3ng/mL的浓度系列，使用实施例7-(1)的试剂盒测定。空白使用稀释液。如图11所示，吸光度与浓度相关性地提高，可以将rsCD14-ST(2ST64)用作试剂盒的标准品。
16-(2)通过rsCD14-ST标准品制备标准曲线
使用实施例7-(3)中制备的试剂盒，进行正常人血清中rsCD14-ST和含EDTA血浆中rsCD14-ST的测定，在含EDTA血浆中，sCD14-ST浓度与血清中的浓度相比，其数值约高2倍。原因可能是EDTA对于测定系统的影响，因此向稀释液中添加EDTA，使浓度为0.2mg/mL，此时血清的测定值上升，与含EDTA的血浆没有差别。不过，可知使用rsCD14(1-307)S286C标准品制作的标准曲线中，反应性降低，EDTA的有无对其数值有影响。另一方面，以rsCD14-ST为标准品时，添加EDTA对于标准曲线没有影响，由此可判断rsCD14-ST更适合用作标准品。
(实施例17)使用rsCD14-ST制备抗体
17-(1)rsCD14-ST特异性多克隆抗体的制备
为了制备实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(PSP64)的多克隆抗体，对兔进行免疫。即，将20μg rsCD14-ST(PSP64)用500μL生理盐水稀释，与500μL的氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予2.0-2.4kg雌性新西兰白兔(北山ラベス)背部皮下。两周后，将20μgrsCD14-ST(PSP64)用500μL生理盐水稀释，与500μL的氟氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予背部皮下。两周后同样地给予20μgrsCD14-ST(PSP64)。给予结束一周后，由耳静脉采血，按照规定方法分离抗血清，纯化抗体。首先，向抗血清中添加硫酸铵，使最终饱和浓度为33％，在4℃搅拌1小时，将析出的沉淀离心。接着将沉淀用Dulbecco-PBS缓冲液(以下称为PBS(pH 7.4))溶解，透析过夜。将透析液过滤，过蛋白A柱(Procep-A Millipore)，通过0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0)将所结合的IgG组分洗脱，得到纯化抗体。用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度计算蛋白浓度(吸光系数：0.714mg/mL)。以下将所得抗体称为抗PSP64多克隆抗体或抗PSP64抗体。
17-(2)sCD14-ST特异性单克隆抗体的制备
为提高实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(PSP64)的抗原性，向rsCD14-ST(PSP64)中添加二硝基氟化苯(和光纯药)，使终浓度为0.1％，在室温下温育1小时，然后用PBS(pH 7.4)透析，以此作为给予抗原(以下可称为DNP-PSP64抗原)。将30μg DNP-PSP64抗原溶解于100μL生理盐水中，与氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，分别以100μL给予8周龄雌性Wistar大鼠各后爪垫。两周后，摘除髂骨淋巴结，进行细胞融合。细胞融合按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)进行。即，使用细胞滤过器(Falcon)，由淋巴结分离淋巴细胞，与骨髓瘤细胞(Sp2/O-Ag14)以5∶1混合，用聚乙二醇进行细胞融合。将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，选别杂交瘤，然后筛选生产目标抗体的杂交瘤。
筛选采用将rsCD14-ST(PSP64)直接固定于板上的ELISA法。即，用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)将rsCD14-ST(PSP64)稀释为2.5μg/mL，将50μL添加到免疫板的各孔中，在4℃下静置过夜。接着用离子交换水将免疫板洗涤五次，然后向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的PBS(pH 7.4)，在室温下静置1小时进行封闭。将由各杂交瘤采集得到的培养上清添加到各孔中，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。接着将过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)用含有10％兔血清的PBS(pH 7.4)稀释为1000倍，将该溶液以50μL添加到各孔中。在37℃反应1小时，然后同样洗涤五次，向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应。用读板仪(Multi-Scan JX Thermo Electron Corporation制造)测定450nm的吸光度，选择含有杂交瘤的孔，该杂交瘤生成与2ST64蛋白质结合的抗体。接着按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)，通过有限稀释法，由选择的孔进行克隆。10天后，以对2ST64蛋白质的反应性作为指标，同样地进行筛选，选择了6种杂交瘤，将选择的杂交瘤用10％ FCS/RPMI-1640培养基(Sigma)培养，然后用杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen)培养，生成抗体，用蛋白G柱(Prosep-G、Millipore)纯化抗体。通过大鼠分型试剂盒(ZYMED)确定纯化的F1237-3-4抗体和F1237-4-4抗体的亚型，亚型分别为大鼠IgG2a·κ、大鼠IgG2b·κ。
17-(3)与不高分子量CD14结合的rsCD14-ST特异性抗rsCD14-ST多克隆抗体的制备
为了制备与存在于败血症患者体内的sCD14-ST特异性结合、但不与高分子量CD14结合的多克隆抗体，将实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(PSP64)免疫兔。即，将20μg rsCD14-ST(PSP64)用500μL生理盐水稀释，与500μL氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予2.0-2.4kg雌性新西兰白兔(北山ラベス)的背部皮下。两周后，将20μgrsCD14-ST(PSP64)用500μL生理盐水稀释，与500μL氟氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予背部皮下。两周后，同样给予20μgrsCD14-ST(PSP64)，给予结束一周后，由耳静脉采血，按照规定方法分离抗血清，纯化抗体。首先，向抗血清中加入硫酸铵，使最终饱和浓度为33％，在4℃下搅拌1小时，然后将析出的沉淀离心。接着将沉淀用Dulbecco-磷酸缓冲液(以下称为PBS(pH 7.4))溶解，透析过夜，将透析液过滤，然后过蛋白A柱(Prosep-G、Millipore)，通过0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱所结合的IgG组分，得到纯化抗体。用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm吸光度计算蛋白浓度(吸光系数：0.714mg/mL)。使用结合有实施例22中制备的高分子量CD14或实施例6中制备的rsCD14(1-356)的树脂，对所得纯化抗PSP64多克隆抗体进行特异性纯化，得到只与rsCD14-ST结合的抗体。即，按照说明，使5mg高分子量CD14或rsCD14(1-356)与HiTrap NHS-活化HP柱(AmershamBioscience)结合，制备特异性纯化用亲和柱。接着，将用蛋白A柱纯化的抗体过特异性纯化用亲和柱，回收不与高分子量CD14或rsCD14(1-356)结合的抗体。将所得抗体浓缩，用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度计算蛋白浓度(吸光系数：0.714mg/mL)。
17-(4)不与高分子量CD14结合的rsCD14-ST特异性抗rsCD14-ST单克隆抗体的制备
为了提高实施例13-(3)-3中制备的rsCD14-ST(PSP64)的抗原性，向rsCD14-ST(PSP64)中添加二硝基氟化苯(和光纯药)，使终浓度为0.1％，在室温下温育1小时，然后用PBS(pH 7.4)透析，由此制成给予抗原(以下可称为DNP-PSP64抗原)。将30μg DNP-PSP64抗原溶解于100μL生理盐水中，与氟氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，分别以100μL给予Wistar大鼠或8周龄雌性ddY小鼠各后爪垫。两周后摘除髂骨淋巴结进行细胞融合。细胞融合按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)进行。即，使用细胞筛网(Falcon)，从淋巴结中分离淋巴细胞，以5∶1与骨髓瘤细胞(Sp2/O-Ag14)混合，使用聚乙二醇进行细胞融合。将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，选别杂交瘤，然后筛选生产目标抗体的杂交瘤。
筛选采用将rsCD14-ST(PSP64)、高分子量CD14或rsCD14(1-356)直接固定于板上的ELISA法。即，用PBS(pH 7.4)将 rsCD14-ST(PSP64)、高分子量CD14或rsCD14(1-356)稀释为2.5μg/mL，将50μL该稀释液添加到免疫板的各孔中，在4℃下静置过夜。接着用离子交换水将板洗涤五次，然后向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的PBS(pH 7.4)，在室温下静置1小时，进行封闭。将由所得杂交瘤采集得到的培养上清添加到各孔中，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。接着将过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)或过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)用含有10％兔血清的PBS(pH 7.4)稀释1000倍，向各孔中添加50μL所得溶液。在37℃反应1小时，然后同样的洗涤五次，向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应。用读板仪(Multi-Scan JX ThermoElectron Corporation制造)测定450nm的吸光度，选择含有杂交瘤的孔，该杂交瘤生成与rsCD14-ST结合但不与高分子量CD14或rsCD14(1-356)结合的抗体。接着，按照安东民卫、千叶丈著“单克隆抗体实验操作入门”83页、1991年(講談社)，通过有限稀释法，由所选择的孔进行克隆。10天后，以对2ST64的反应性为指标同样地筛选，选择杂交瘤。将选择的杂交瘤用10％FCS/RPMI-1640培养基(Sigma)培养，然后用杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen)培养，生成抗体，使用蛋白G柱(Prosep-G、Millipore)或蛋白A柱(Prosep-A、Millipore)纯化抗体。用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm吸光度计算蛋白浓度(吸光系数：0.714mg/mL)。使用市售试剂盒对纯化的抗体的亚型进行确定。
17-(5)与检体的保存方法不相关的rsCD14-ST特异性抗rsCD14-ST单克隆抗体的选择
得到了保存状态对测定结果没有影响的试剂盒用单克隆抗体。即，由实施例17-(4)中制备的rsCD14-ST的单克隆抗体中测定sCD14-ST，以此作为实施例22的夹层系统的标记抗体，在选择具有在败血症患者中上升的性能的抗体后，测定检体中的sCD14-ST。测定冷冻保存的检体和24小时室温下保存的检体两者，选择测定值差异小的抗体的组合。
(实施例18)抗sCD14-ST(PSP64)多克隆抗体的反应性
确认了实施例17-(1)中制备的抗PSP64多克隆抗体的反应性。与实施例17-(2)同样，固定rsCD14-ST(PSP64)。将含有实施例17-(1)中制备的抗PSP64多克隆抗体的抗血清和作为对照的正常兔血清用PBS(pH 7.4)稀释500倍，然后翻倍稀释，制备稀释至32000倍的稀释系列。将各稀释液添加到封闭后的孔中，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。接着将过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白抗体(DAKO)用含有10％山羊血清的PBS(pH 7.4)稀释1000倍，向各孔中添加50μL所得稀释溶液。在37℃反应1小时，然后同样地洗涤五次，向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应。用读板仪(Multi-Scan JX Thermo Electron Corporation制造)测定450nm的吸光度，确认与rsCD14-ST(PSP64)的结合，如图12所示，在给予了rsCD14-ST(PSP64)的兔中，吸光度与稀释倍率相关性地提高，而在正常兔血清中则不上升，由此可确认生成了rsCD14-ST(PSP64)蛋白质特异性抗体。
(实施例19)制备使用抗rsCD14-ST抗体的sCD14-ST测定系统
将S68肽多克隆抗体用D-PBS(pH 7.4)稀释为10μg/mL，向免疫板的各孔中添加50μL。在4℃反应过夜，用离子交换水洗涤五次，向各孔中添加100μL含有0.1％Stabi1Guard(SurModics制备)和0.1％吐温20的D-PBS，进行封闭。接着，以含有1％CD14吸收血清、1％BSA的76mM PBS(pH 7.4)作为稀释液，制备0、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1.2ng/mL rsCD14-ST(2ST64)蛋白质标准品稀释系列。向每孔中添加50μL标准品稀释系列，在37℃反应2小时，反应终止后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次，添加50μL含有F1237-3-4抗体的1％胎牛血清/杂交瘤-SFM溶液。在37℃反应1小时，然后同样地洗涤三次，用含有10％兔血清的D-PBS(pH 7.4)将过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)稀释为干分之一，向各孔中添加50μL。在37℃反应1小时，然后同样地洗涤五次，向各孔中添加四甲基联苯胺溶液(TMB、BioFix)，在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应，用读板仪(Multi-Scan JX Thermo Electron Corporation制造)测定450nm下的吸光度。图13中给出了制备的标准曲线。
(实施例20)通过新型sCD14-ST测定系统测定血清
使用实施例1 9中制备的夹层EIA系统，测定了5例正常人和5例败血症患者的血清。结果如表10所示，正常人血清中，sCD14-ST浓度为1ng/mL，而败血症患者为6.47ng/mL，浓度约高6倍，与实施例11同样，显示可以鉴别败血症患者。如实施例16所示，与实施例11浓度的不同是由于标准品的区别而引起的。
[表10]
表10
检体序号 分类 浓度(ng/mL)
N1 正常 0
N2 正常 1.7
N3 正常 0.76
N4 正常 3.16
N5 正常 0
S1 败血症 8.44
S2 败血症 5.02
S3 败血症 9.02
S4 败血症 4.26
S5 败血症 5.6
(实施例21)对sCD14-ST蛋白质特异性单克隆抗体的评价
为了明确sCD14-ST抗体的特异性，测定了对各种CD14蛋白质的亲和性。通过抗原固相EIA系统测定对各种抗原的反应性。
21-(1)使用BIACORE测定解离常数(KD)
使用Biacore3000(Biacore)，分析与实施例17-(2)中制备的F1237-3-4抗体和作为抗CD14抗体的3C10抗体(ATCC TIB-228)的反应速度常数。首先，分别使用胺偶联试剂盒(Biacore)，将rsCD14-ST(2ST64)和rsCD14-ST(1-356)固定在传感器芯片CM5(Biacore)上。测定使用HBS-EP(Biacore)作为起始缓冲液，通过将各抗体的稀释系列(1.25nM-640nM，根据抗体改变浓度)注射到流式细胞分选仪中进行。数据分析是由固定各抗原的流式细胞分选仪的测定数据减去背景数据，再减去只有起始缓冲液的数据，使用biaevaluatin soft wear 4.1版(Biacore)实施。使用Bivalent分析仪计算解离常数(KD)，结果如表11所示。F1237-3-4抗体显示对rsCD14-ST的高亲和性，由于基本上不与rsCD14(1-356)结合，因此KD无法计算。3C10基本上不与rsCD14-ST结合，对rsCD14(1-356)显示高亲和性。
[表11]
表11
抗体名     解离常数KD(M)
    rsCD14-ST   rsCD14(1-356)
  F1237-3-4抗体     5.75×10-8   无法计算
  3C10抗体     无法计算   6.69×10-10
21-(2)使用抗原固相EIA系统分析抗原特异性
通过抗原固相EIA系统测定对实施例17-(2)中制备的F1237-3-4抗体和作为抗CD14抗体的3C10抗体与高分子量CD14的反应性。即，与实施例13-(2)同样的调节免疫板(Maxisorb、NUNC)，用D-PBS(pH 7.4)将高分子量CD14稀释为2.5μg/mL，向各孔中添加50μL，在4℃下静置过夜。接着将板用离子交换水洗涤五次，然后向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的PBS(pH 7.4)，在室温下静置1小时，进行封闭。用PBS(pH 7.4)将F1237-3-4抗体、3C10抗体稀释为1μg.mL，添加到各孔中，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。接着对各抗体的过氧化物酶标记抗免疫球蛋白抗体(DAKO)用含有10％血清的PBS(pH 7.4)稀释为1000倍，向各孔中添加50μL所得溶液。在37℃反应1小时，然后同样洗涤五次，向各孔中添加四甲基联苯胺(TMB、BioFix)溶液。在室温下反应10分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应。用读板仪(Multi-Scan JX ThermoElectron Corporation制造)测定450nm的吸光度。结果，3C10与高分子量CD14强力结合，而F1237-3-4抗体实质不结合。
(实施例22)使用抗rsCD14-ST抗体的sCD14-ST测定系统的制备(2)
22-(1)夹层EIA法
按照实施例3-(3)的方法制备表12所示的由抗体的各种组合构建的夹层EIA系统。如表12所示，对于使用实施例17中制备的单克隆抗体的sCD14测定系统，在正常人中均未上升，对败血症患者特异性上升。
[表12]
表12
抗体组合 测定值
固相   标记 败血症患者   正常人
S68肽多克隆抗体   F1237-3-4抗体 +   -
S68肽多克隆抗体   F1237-4-4抗体 +   -
22-(2)竞争EIA法
用PBS将F1237-3-4抗体稀释为10μg/mL，添加到孔中。在4℃下静置过夜，使其结合，接着用2％StabilGuard/PBS(pH 7.4)封闭。将25μL败血症患者血清和正常人血清添加到板中，接着用含有1％BSA、0.1％吐温20的PBS(pH 7.4)将过氧化物酶标记sCD14-ST抗原稀释为0.5μg/mL，添加到板中，在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。添加TMB溶液(BioFix)，使其显色，再用0.5M硫酸水溶液终止反应，以450nm测定吸光度。吸光度与血液中的sCD14-ST浓度相关性地降低，因此测定的值反应了血液中sCD14-ST的量，可以确认：sCD14-ST浓度在正常人中低，在败血症患者中特异性增高。另外，标记物可以使用其它酶、放射性化合物、荧光物质、化学发光物质、胶体金、染料或胶乳等。
(实施例23)用于测定该血液中可溶型蛋白质的抗体的筛选方法
为了制备在实施例9中纯化并鉴定的血液中可溶型蛋白质的测定系统，构建了两种可用于测定的筛选方法。
23-(1)制备作为筛选对象的抗体
作为筛选对象的抗体可按照实施例1的记载，制备与含有选自SEQID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽结合的抗体。可如下制备。<1>根据CD14全长序列，按照常规方法合成肽，制备免疫抗原，制备抗体。<2>纯化血清中的纯化可溶性CD14抗原，以其作为免疫原制备抗体。<3>使用COS细胞或大肠杆菌制备重组CD14蛋白质，以其作为免疫原制备抗体。<4>将制备的各种CD14抗原通过热改性或DNP化等处理，以其作为免疫原制备抗体。
例如，P001抗体(以含有SEQ ID No.4氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体)、P002抗体(以含有SEQ ID No.5氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体)可如下制备：通过实施例1的方法制备，使其与载体蛋白结合，然后给予，制备抗体。并且，实施例1-(4)中制备的S68抗体、实施例2中制备的F1146-17-2抗体、实施例3-(2)[2]中制备的F1031-8-3抗体、实施例3-(2)[1]中制备的F1106-13-3抗体、实施例17-(2)中制备的F1237-3-4抗体和实施例17-(1)中制备的抗PSP64抗体也可用作筛选检体。如上所述，制备与含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基的肽结合的抗体，使用该抗体，按照以下顺序，筛选可特异性检测该血液中可溶型蛋白质的抗体。
23-(2)抗原固相法
这是用于测定血液中可溶型蛋白质的抗体的筛选方法，其特征在于：利用来自正常人的高分子量CD14蛋白质与抗体的反应性差异。通过抗原固相法对与高分子量CD14蛋白质的反应性的差异进行分析，由此筛选不与存在于正常人血清中的高分子量CD14结合、但与该血液中可溶型蛋白质结合的抗体。
[1]高分子量CD14的制备
首先，如下制备高分子量CD14蛋白质。将人血清(日本Biotest)添加到3C10抗体结合树脂柱(5mL)中，用PBS洗涤，然后用6M尿素水溶液洗脱。将洗脱液用PBS透析，然后冷冻干燥，接着用凝胶过滤柱(Superdex 75 10/300GL、Amershamバイオサイエンス)分组。用市售可溶性CD14蛋白质试剂盒(IBL-试剂盒)鉴定所得各组分，收集与IBL-试剂盒反应的高分子量CD14组分，冷冻干燥。将冻干物溶解，再次用IBL试剂盒测定，计算浓度。
[2]抗原固相EIA法
抗原固相EIA法如下进行。首先，将高分子量CD14以2.5μg/mL在免疫板上、在4℃下静置过夜，使其与免疫板结合。接着，用2％StabilGuard/PBS(pH 7.4)进行封闭，用PBS将各抗体稀释为1μg/mL。各抗原添加到固相化的各孔中。在37℃反应1小时，然后用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次。接着用含有10％兔血清、0.05％吐温20的PBS(pH 7.4)将各抗体的过氧化物酶标记抗γ球蛋白抗体(DAKKO制备)稀释，在室温下反应1小时。同样地洗涤五次，添加TMB溶液(BioFix)，使其显色，再用0.5M硫酸水溶液终止反应。接着，以450nm测定抗体的吸光度，选择对于高分子量CD14吸光度不升高的抗体。通过上述方法选择了F1237-3-4抗体。
如果使用sCD14-ST代替上述与板结合的抗体，则可以选择不与sCD14-ST结合的抗体。
如下进行斑点印迹法。首先，在转移印迹的转印介质上以约400ng/斑点进行高分子量CD14的点样并干燥。接着使用100％Block-Ace(雪印乳业)进行封闭。将两种固定化CD14和用含有10％Block-Ace、0.05％吐温20的PBS(pH 7.4)稀释的各种抗CD14抗体在室温下反应1小时。接着用含有0.05％吐温20的PBS(pH 7.4)洗涤5分钟，共洗涤五次。接着用含有10％Block-Ace、0.05％吐温20的PBS(pH 7.4)稀释过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白抗体(DAKKO制备、P448)，将各膜在室温下反应1小时。同样洗涤五次，使用ECL-PLUS(Amersham)，使用化学发光检测装置(CoolSaver AE-6955、ATTO)，以发光的形式检测有无抗体结合。在用于筛选的抗体中，选择在高分子量CD14处未检测出斑点的抗体。
23-(3)夹层免疫测定法
该方法是用于测定血液中可溶型蛋白质的抗体的筛选方法，其特征在于：利用正常人血清和败血症患者血清中检测的量的差异。将两种抗CD14抗体组合，制备夹层ELISA系统。测定正常人和败血症患者检体。
[1]过氧化物酶标记抗体的制备
按照实施例3-(3)，对12-(1)中制备的抗体制备其过氧化物酶标记抗体。
[2]夹层EIA系统的制备
将作为筛选对象的各抗体用D-PBS(pH 7.4)稀释为10μg/mL，向免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中添加50μL。在4℃下反应过夜，然后用离子交换水洗涤五次，向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(SurModics)的D-PBS，进行封闭。接着以含有0.1％BSA的PBS(pH 7.4)作为稀释液，制备0、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200ng/mL的CD14(1-307)S286C蛋白质标准品稀释系列和10倍稀释的检体。向各孔中添加50μL标准品稀释系列和稀释检体，在37℃反应1小时，反应终止后，用含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤三次，用含有2％大鼠血清、1％小鼠血清、0.1％吐温20的PBS(pH 7.4)将过氧化物酶标记抗体稀释为1μg/mL，向各孔中添加50μL。在37℃下反应1小时，然后同样洗涤五次。向各孔中添加四甲基联苯胺(TMB、BioFix)溶液。在室温下反应20分钟，然后用0.5M硫酸溶液终止反应，用读板仪(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)测定450nm的吸光度。
[3]通过夹层EIA系统筛选抗体
下面，对于在本系统中可制作标准曲线的组合，筛选其是否可以特异性检测该血液中可溶型蛋白质。通过[1]中制备的测定系统，对2例败血症患者和2例正常人血清进行测定，通过选择在正常人中显示低数值、在败血症患者中显示高数值的测定系统的抗体组合，筛选了可特异性检测败血症患者的抗体组合。结果选择了实施例7-(1)-(8)和实施例12的抗体组合。预先通过IBL-试剂盒求出各血清中高分子量CD14的测定值，则可以选择不能测定高分子量CD14的测定系统中的抗体组合。
(实施例24)使用rsCD14-ST进行的抗体筛选方法
关于使用rsCD14-ST筛选抗体的方法，研究了两种方法。
24-(1)抗原固相EIA法
用于筛选可特异性检测rsCD14-ST的抗体的方法可通过使用实施例17-(2)的抗体筛选方法、即、将rsCD14-ST(PST64)直接固定于板上的ELISA法进行。
表13中给出了各种抗体的筛选结果。其中，MY4(Colter制备)、MEM18(Monosan制备)、61D3(Southern Biotechnology Associates，Inc.)和各种γ球蛋白使用市售商品。
[表13]
表13
抗体  与rsCD14-ST(PSP64)的结合
 F1237-3-4  ++
 S68  ++
 F1106-13-3  ++
 F1031-8-3  ++
 P001  +
 P002  ++
 MY4  -
 3C10  -
 MEM18  -
 61D3  -
 小鼠γ球蛋白  -
 大鼠γ球蛋白  -
 兔γ球蛋白  -
24-(2)夹层EIA法
用于筛选可特异性检测sCD14-ST的抗体的方法，制备了实施例23-(2)的夹层EIA系统。即，将作为筛选对象检体的各种抗体固定在板上，以rsCD14-ST(PSP64)作为抗原，再通过使用过氧化物酶标记F1106-13-3抗体或过氧化物酶标记F1031-8-3抗体的夹层ELISA法进行。
表14给出了各种抗体的筛选结果。抗HCG抗体采用市售商品。
[表14]
表14
抗体   与rsCD14-ST(PSP64)的结合
    F1237-3-4   ++
    S68   ++
    F1106-13-3   -
    F1031-8-3   -
    P001   +
    P002   +
    3C10   -
    61D3   -
    抗HCG抗体   -
    大鼠γ球蛋白   -
    兔γ球蛋白   -
(实施例25)sCD14-ST的化学合成
化学合成了具有人CD14的N末端1位-70位氨基酸的可溶性多肽(以下称为sCD14(1-70))。
使用肽合成仪ABI433A(Applied)，按照氨基酸序列排列氨基酸柱，进行自动合成。合成的肽按照规定方法由树脂切出，用乙醚沉淀并回收，然后再次用蒸馏水溶解，冷冻干燥。所得粗纯化肽溶解后，用C18反相HPLC(CAPCELL-PAK、资生堂)、用5-70％的乙腈浓度线性梯度洗脱，回收含有目标肽的组分。回收的组分冷冻干燥，制成纯化肽。使用实施例17-(12)的稀释液溶解纯化肽，通过实施例7-(3)的试剂盒测定，显示与实施例7-(3)的试剂盒强烈反应，显示由化学合成制备的sCD14-ST也可以作为标准品。
(实施例26)由弹性酶处理的PHP-1细胞表达的sCD14-ST的测定
将用维生素D3刺激的1×106个PHP-1细胞悬浮于含有0.1％BSA的RPMI1640培养基中，添加人白细胞弹性酶(Elastin Products制备)，终浓度为1μM，制备最终液量为200μL的反应液。将反应液在37℃温育1、3、10、30或60分钟，然后添加苯甲基磺酰氟，中止酶促反应。回收各反应液的上清，通过实施例7-(1)的试剂盒测定上清中所含的sCD14-ST。结果，添加弹性酶3分钟后，sCD14-ST浓度上升，之后缓慢减少。
产业实用性
本发明提供一种新型的抗原，该抗原具有存在于人血液中的CD14序列。本法明还提供败血症的诊断方法或败血症的检测方法，该方法通过测定该抗原实现。
本发明还提供与该抗原的免疫功能类似的重组型可溶性片段。又提供生产该重组型可溶性片段的方法。还提供与该片段结合的新型抗体。
本发明还提供试剂盒和测定方法，所述试剂盒含有“与含有人全长可溶型CD14蛋白质的特定氨基酸序列的肽结合的抗体”、“以含有人全长可溶型CD14的特定氨基酸序列的肽作为抗原制备的抗体”或“与该片段结合的抗体”或该抗体的片段作为构成要素，可测定该抗原。
本发明又提供可用作该蛋白质测定的抗体的筛选方法。
序列表
<110>Mochida Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>新型可溶性CD14抗原
<130>MD0734
<160>27
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>1
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Gl u Leu Asp Asp Glu
1               5                    10
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>2
Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1                   5               10                  15
<210>3
<211>356
<212>PRT
<213>人
<400>3
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val
1               5                   10                  15
Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys
            20                  25                  30
Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu
        35                  40                  45
Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala Ala
65                  70                  75                  80
Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala Tyr
                85                  90                  95
Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly Thr
            100                 105                 110
Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser Leu
        115                 120                 125
Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln
145                 150                 155                 160
Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg Gly
            180                 185                 190
Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn Leu
        195                 200                 205
Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ile Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala Ala
    210                 215                 220
Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His Asn
225                 230                 235                 240
Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp Ser
                245                 250                 255
Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln Val
            260                 265                 270
Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys Asn
        275                 280                 285
Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp Asn
    290                 295                 300
Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser
                325                 330                 335
Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala
            340                 345                 350
Arg Gly Phe Ala
        355
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>4
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val
1               5                   10                  15
Cys
<210>5
<211>19
<212>PRT
<213>人
<400>5
Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala
1               5                   10                  15
Phe Gln Cys
<210>6
<211>68
<212>PRT
<213>人
<400>6
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val
1               5                   10                  15
Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys
            20                  25                  30
Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu
        35                  40                  45
Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Thr Val Lys
65
<210>7
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(Oligomer：8linkS)
<400>7
agcttaggaa ttt                                                   13
<210>8
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(Oligomer：8linkA)
<400>8
ctagaaattc cta                                                   13
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(有义引物A)
<400>9
acatctagat gaccacgcca gaacct                                     26
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 A)
<400>10
tttggatcct tactagagat cgagcaatct                                 30
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(有义引物 1)
<400>11
tttcctacag ctcctggg                                              18
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 1)
<400>12
ggggtacctt agtcagcata ctgccgcggg tc                              32
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 2)
<400>13
ggggtacctt agagagcctt gaccgtgtca gc                              32
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 3)
<400>14
ggggtacctt agagccgccg cacgcggaga gc                              32
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 4)
<400>15
ggggtacctt atgcggctcc cactgtgagc cg                              32
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 5)
<400>16
ggggtacctt actgagcagg aacctgtgcg gc                              32
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 6)
<400>17
ggggtacctt aggcgcctac cagtagctga gc                              32
<210>18
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 7)
<400>18
ggggtacctt acgctagcac acgcagggcg cc                              32
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 8)
<400>19
ggggtacctt acttgaggcg ggagtacgct ag                              32
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 9)
<400>20
ggggtacctt actcgagcgt cagttccttg ag                              32
<210>21
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 10)
<400>21
ggggtacctt aggttatctt taggtcctcg ag                              32
<210>22
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(有义引物 2)
<400>22
gctctggaag ttctgttcca ggggcccgac acggtcaagg ctctccgcgt gcgg      54
<210>23
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 11)
<400>23
gtcgggcccc tggaacagaa cttccagagc atactgccgc gggtcggcgt ccgc      54
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 12)
<400>24
tctccattcc tgtgttgcgc                                            20
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(有义引物 3)
<400>25
ctggttccgc gtggttccga cacggtcaag                                 30
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 13)
<400>26
gaaccacgcg gaaccagagc atactgccgc                                 30
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反义引物 14)
<400>27
cgggatcctc aatgatgatg atgatgatgg                                 30

Claims (18)

1.可溶性CD14抗原，该抗原具有下述1)-3)的性质：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及
3)与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
2.重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质，由下述<1>-<3>的步骤获得：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合；
<1>制备具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了规定的蛋白分解酶切断部位的序列；或者制备具有该部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区域有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
<2>将<1>中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤，以及
<3>回收<2>中切断的片段的N末端一侧的片段的步骤。
3.权利要求2的重组型可溶性CD14片段，其中，在上述<1>的步骤中，制备具有下述4)-7)的序列的重组型可溶性CD14片段：
4)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
5)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
6)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，以及
7)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位的序列。
4.权利要求2或3的重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述8)-10)的序列：
8)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区域有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
9)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位的其中之一，以及
10)C末端为SEQ ID No.3的59位-90位的其中之一。
5.重组型可溶性CD14片段，该片段具有下述1)-3)的性质：
1)非还原条件下的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa，
2)不与3C10和MEM-18特异性结合，以及
3)与以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体特异性结合。
6.败血症的诊断或检测方法，其特征在于：测定权利要求1的可溶性CD14抗原。
7.权利要求6的败血症的诊断或检测方法，其特征在于：含有下述步骤：
1)对由受试者采集的血液中所含的权利要求1的可溶性CD14抗原进行测定的步骤，
2)将测定值与正常人的标准值进行比较的步骤，以及
3)评价受试者是否为败血症的步骤。
8.可溶性CD14抗原测定试剂盒，其用于测定检体中所含的权利要求1的可溶性CD14抗原，该测定试剂盒含有至少一种与权利要求1的可溶性CD14抗原结合的抗体或该抗体的片段。
9.权利要求8的可溶性CD14抗原的测定试剂盒，其特征在于：其含有作为与权利要求1的可溶性CD14抗原结合的抗体或该抗体的片段的、以下a)-d)任一项的抗体或该抗体的片段：
a)与含有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基的肽结合的抗体，
b)以含有选自SEQ ID No.2氨基酸序列的连续8-16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
c)以含有SEQ ID No.2的16个氨基酸残基的肽作为抗原制备的抗体，
d)与权利要求2的重组型可溶性CD14片段或权利要求5的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体。
10.权利要求8或9的可溶性CD14抗原测定试剂盒，其中，与上述权利要求1的可溶性CD14抗原结合的抗体或该抗体的片段为d)与权利要求2的重组型可溶性CD14片段特异性结合的抗体或该抗体的片段。
11.权利要求1的可溶性CD14抗原的免疫学测定方法，其特征在于：将至少一种与权利要求1的可溶性CD14抗原结合的抗体或该抗体的片段与权利要求1的可溶性CD14抗原特异性结合。
12.抗体，该抗体与权利要求1的可溶性CD14抗原特异性结合。
13.抗体，该抗体与权利要求2的重组型可溶性CD14片段特异性结合。
14.权利要求13的抗体，该抗体基本上不与人血液中的全长可溶型CD14蛋白质结合，而与权利要求2的重组型可溶性CD14片段结合。
15.权利要求13的抗体，该抗体为F1237-3-4抗体。
16.可用于测定权利要求1的可溶性CD14抗原的抗体的筛选方法，该方法包含下述步骤：
1)制备作为筛选对象检体的与肽结合的抗体，所述的肽含有选自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的连续6-20个氨基酸残基，
2)制备含有CD14的测定对象液，
3)使用1)中制备的抗体或2)中制备的测定对象液，构成免疫测定系统，
4)通过3)中构成的免疫测定系统，对测定对象液进行测定，以及
5)根据4)中得到的测定结果，对可用于测定权利要求1的可溶性CD14抗原的抗体进行评价、选择。
17.可用于测定权利要求1的可溶性CD14抗原的抗体的筛选方法，该方法包含以下步骤：
1)制备作为筛选对象检体的抗体的步骤，
2)制备权利要求2的重组型可溶性CD14片段的步骤，
3)使1)中制备的抗体和2)中制备的片段反应，评价1)中制备的抗体与2)中制备的片段的特异性结合的步骤，以及
4)在3)中，选择与2)中制备的片段特异性结合的抗体作为可用于测定权利要求1的可溶性CD14抗原的抗体的步骤。
18.权利要求4的重组型可溶性CD14片段生产方法，该方法包含以下步骤：
<1>制备具有下述1)-4)序列的重组型可溶性CD14片段的步骤：
1)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有该部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的区有1-10个氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，
2)N末端为SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，
3)C末端为SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，以及
4)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后取代或插入了规定的蛋白分解酶的切断部位的序列；
<2>将<1>中制备的重组型可溶性CD14片段用该规定的蛋白分解酶切断的步骤，以及
<3>回收<2>中切断的片段的N末端一侧的片段的步骤。
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