CN102713636B - 人sCD14-ST的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供：即使在使用全血样本的情况下也可以准确地测定人sCD14-ST的分析方法。在上述分析方法中，自采集全血样本起6小时以内分析上述样本中的人sCD14-ST。
Description
技术领域
本发明涉及作为败血症诊断的标志物而已知的人sCD14-ST的分析方法。
需要说明的是，本说明书中的“分析”包括：判定是否存在作为分析对象物质的人sCD14-ST的“检测”和定量或半定量地确定分析对象物质的量的“测定”。
背景技术
CD14分子作为通过识别在单核细胞的膜表面上表达的糖蛋白的一组抗体鉴定的蛋白，在1986年第3届白细胞分型研讨会(Leukocyte Typing Conference)上被命名。1990年，Wright等人明确了该CD14分子是作为内毒素的LPS的受体(非专利文献1)。通过cDNA分析明确了：该CD14分子是分子量为53～55kDa的糖蛋白，mRNA为约1.4kb的大小，由356个氨基酸组成(非专利文献2)。
已知在人CD14分子中，除膜结合型CD14之外还有可溶型CD14，在血中存在分子量不同的多种可溶型CD14。作为这样的可溶型CD14，已知有约55kDa和49kDa的两种可溶型CD14 (可溶型高分子量CD14)、约13kDa的可溶型低分子量CD14亚型(以下称作人sCD14-ST)，人sCD14-ST作为败血症的诊断标志物，在临床上有用(专利文献1)。
关于该人sCD14-ST，专利文献1中公开了：当反复进行血清样本的冷冻融解、或者在室温下长时间放置时，假设血清样本中的人sCD14-ST分解而无法测定的情形；或者，假设血清样本中的高分子量CD14分解成人sCD14-ST或与其接近的结构，测定结果出错的情形(段落“0151”)。另一方面，专利文献1中还公开了：人sCD14-ST通过弹性硬蛋白酶等蛋白酶分解产生全长的CD14；产生的人sCD14-ST在生物体内(血清中)至少以可以检测的程度稳定存在(段落“0126”)。
如上所述，在专利文献1中，虽然假设通过血清样本的冷冻融解或者室温下的长时间放置，测定结果会出错的情形，但并没有唤起特殊处理的记载，而这是关于普通样本保管条件的内容。专利文献1不过是公开了人sCD14-ST在生物体内血清中是稳定的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：“サイエンス(Science)”(美国)，1990年，第249卷，第1431-1433页；
非专利文献2：“ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucleic Acids Research)”(英国)，1988年，第16卷，第4173页；
专利文献
专利文献1：日本专利第4040666号说明书。
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述，虽然已知人sCD14-ST在血清中比较稳定地存在，但包括血浆样本或全血样本在内，在潜心开发人sCD14-ST的更准确的分析方法中，本发明人意外发现：使用全血样本时，对人sCD14-ST的测定值有影响。
本发明鉴于上述状况而设，其课题在于提供：即使在使用全血样本的情况下，也可以准确地测定人sCD14-ST的分析方法。
解决课题的方法
上述课题可以通过本发明的人sCD14-ST的分析方法来解决，所述分析方法的特征在于：自采取全血样本起6小时以内分析上述样本中的人sCD14-ST。
在本说明书中，“人sCD14-ST”(别名为Presepsin (プレセプシン)(注册商标))是指日本专利第4040666号说明书中记载的“第1方案的可溶性CD14抗原”，更具体而言，是指具有下述1)～3)的性质的可溶性CD14抗原：
1) 非还原条件下在SDS-PAGE中分子量为13±2kDa；
2) N末端序列具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；以及
3) 与以由SEQ ID NO: 2中记载的16个氨基酸残基组成的肽为抗原制作的抗体特异性结合，
。
发明效果
根据本发明，对于即使在血清样本或血浆样本中稳定、但在全血样本中随着时间的推移测定值会发生变动的人sCD14-ST，不必制备血清样本或血浆样本，使用全血样本即可实施准确的分析。
附图说明
图1是显示使用肝素采血管制备的全血样本和血浆样本(样本1)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图2是显示使用肝素采血管制备的全血样本和血浆样本(样本2)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图3是显示使用肝素采血管制备的全血样本和血浆样本(样本3)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图4是显示使用EDTA采血管制备的全血样本和血浆样本(样本1)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图5是显示使用EDTA采血管制备的全血样本和血浆样本(样本2)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图6是显示使用EDTA采血管制备的全血样本和血浆样本(样本3)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图7是显示将血清样本(样本1～样本3)在室温下静置保存规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时)后各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图8是显示为了研究全血样本的不稳定性的要因而在各种条件(条件1～条件3)下静置保存的各样本中的人sCD14-ST的测定结果的曲线图。
图9是显示使用肝素采血管制备的全血样本(样本1～样本3)在室温下静置保存规定时间(0小时、2小时、4小时、8小时)后各样本中的CRP的测定结果的曲线图。
图10是显示使用EDTA采血管制备的全血样本(样本1～样本3)在室温下静置保存规定时间(0小时、2小时、4小时、8小时)后各样本中的CRP的测定结果的曲线图。
具体实施方式
本发明的分析方法，除了使用全血样本作为被检试样，并自采取该全血样本起6小时以内进行该分析以外，可以直接应用人sCD14-ST的公知的分析方法。
人sCD14-ST的分析可以通过蛋白的各种公知的分析方法、例如使用抗体的免疫学分析方法、电泳等生化学分析方法来实施，还可以使用临床检查用的自动分析仪。
例如，日本专利第4040666号说明书中公开了人sCD14-ST的测定方法，更具体而言，是指使用以由SEQ ID NO: 2中记载的16个氨基酸残基组成的肽(日本专利第4040666号说明书中记载的S68肽)为抗原制作的多克隆抗体(S68抗体)、单克隆抗体(F1146-17-2抗体)和抗CD14抗原单克隆抗体(例如F1031-8-3抗体、F1106-13-3抗体等)的组合的夹层EIA系统[日本专利第4040666号说明书的实施例7-(1)]，可适用于本发明的分析方法。
另外，在后述的实施例中使用下述方法：使样本中的人sCD14-ST和抗sCD14-ST小鼠单克隆抗体(F1106-13-3抗体)致敏磁性胶乳以及ALP(碱性磷酸酶)标记抗sCD14-ST兔多克隆抗体(S68抗体)结合，然后除去过剩的ALP标记抗sCD14-ST兔多克隆抗体，之后利用使用发光底物(CDP-Star；トロピックス公司制)的化学发光酶免疫测定法(CLEIA；Chemiluminescent Enzyme Immunoassay)测定通过抗原抗体反应形成的免疫复合物的ALP酶活性，求出样本中的人sCD14-ST浓度。
在本发明的分析方法中，使用全血样本作为被检试样。在本说明书中，“使用全血样本”是指，使用在采集全血后到开始分析该样本的期间(以下称作采血后保存期间)或其大部分期间以全血原有的状态保存的样本。全血样本可以通过普通的采血操作、即使用含抗凝剂(例如肝素、EDTA、枸橼酸)的采血管进行采集。
使用采血管采集的全血样本通过多次颠倒混和等搅拌后，既可以直接用于测定，也可以分离血浆后使用。“分离血浆后使用”包括下述情形：在通过离心分离分成血浆和血球两层的状态下使用血浆成分的情形；以及进一步只分注血浆成分后使用的情形。在本发明的分析方法中，虽然使用全血样本作为被检试样，但在采血后的保存期间结束后分离血浆后使用的情形也包含在“使用全血样本”的方案中。另外，根据包括本实施例在内的本发明人的经验，在测定全血样本中的人sCD14-ST时，有时测定值会随时间而变动，有时制备样本时或运输时的过度的物理冲击会成为影响测定值的要因。
在本发明的分析方法中，采集全血样本后6小时以内(优选4小时以内)进行分析。需要说明的是，在本说明书中，“6小时以内进行分析”是指在6小时以内开始分析。
更具体而言，使用EDTA采血管采集全血样本时，优选在6小时以内进行分析；使用肝素采血管采集全血样本时，优选在4小时以内进行分析。
如后述实施例中的具体数据所示，即使是在血浆样本或血清样本中没有确认到测定值变动的、采血后6～8小时后的测定，在健康人的全血样本中也确认到人sCD14-ST的测定值的上升。已知在健康人和败血症患者之间，人sCD14-ST测定值确认到50倍的差异，健康人血中的人sCD14-ST浓度极低。由此，通过设定适当的截断值，可以以高灵敏度和特异性诊断败血症(专利文献1的实施例12)。但是，在全血样本中，当健康人的人sCD14-ST测定值随时间经过而上升时，根据测定时间有可能在较截断值低的值或高的值的判断中产生差异。在这种状况下，本发明人等发现：即使在全血样本中，只要是在采集样本后6小时以内(优选4小时以内)，人sCD14-ST的测定值就不会变动，在本发明的分析方法中，由于是在采集全血样本后6小时以内进行分析，所以可在不会受到测定值上升的影响的情形下，进行准确的人sCD14-ST的测定。
实施例
以下，通过实施例来具体说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的范围。
《实施例1：样本中的人sCD14-ST的测定方法》
关于用于测定人sCD14-ST的各样本，使用人sCD14-ST测定用试剂进行测定。该试剂包含作为第1抗体溶液的抗sCD14-ST小鼠单克隆抗体(F1106-13-3抗体；日本专利第4040666号说明书)致敏磁性胶乳溶液、作为第2抗体溶液的ALP(碱性磷酸酶)标记抗sCD14-ST兔多克隆抗体(S68抗体)溶液、B/F分离用清洗液、底物溶液等，将该试剂封入柱体(cartridge)中，以收载在后述的自动免疫发光测定装置中。
测定中使用与日本专利第3115501号公报等中公开的装置相同的可以使用磁性颗粒自动进行免疫测定的自动免疫发光测定装置(パスファースト；三菱化学Medience公司制)。该装置可以在作为液体的吸引、喷出管线而配设的芯片内利用磁力有效进行B/F分离，显示出高的清洗效率。该装置的测定步骤如下。
需要说明的是，底物使用化学发光底物“CDP-Star” (トロピックス公司制)，以利用光电倍增管(PMT)检测的发光计数作为测定结果。
将试样、试样稀释液、磁性颗粒溶液(担载第1抗体)、B/F分离用清洗液、第2抗体溶液、底物溶液等充填在自动测定用柱体中，安装在装置上。
以下，按照通常的运行方法进行各操作。
(1) 将使用稀释液调整至任意稀释倍率的试样溶液、磁性颗粒溶液和第2抗体溶液混合，进行抗原抗体反应，生成免疫复合物。
(2) 进行B/F分离以除去未反应的物质。首先，通过作为液体吸引管线而安装的芯片吸引反应液，使磁石与芯片外壁面接触以捕获磁性颗粒。接下来，在磁性颗粒吸附保持在芯片内壁面的状态下喷出溶液进行分离，之后吸引、喷出填充在另一反应容器中的B/F分离用清洗液进行清洗。
(3) 使磁石从上述芯片的外壁面上脱离以消除磁力的影响，之后吸引、喷出底物溶液，使吸附保持在芯片内壁面的磁性颗粒分散，进行酶反应。
(4) 通过PMT测定发光量。
《实施例2：关于全血样本、血浆样本、血清样本在短时间保存时的测定值的研究》
对于全血样本、血清样本、血浆样本，在室温下静置保存规定时间后，按照实施例1的测定方法进行人sCD14-ST的测定。
具体而言，将使用含抗凝剂(肝素或EDTA)的采血管采自3名健康人的全血样本、血浆样本、血清样本在室温下静置保存0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时或10小时(仅全血样本和血浆样本)，这次通过进行测定确认各样本的测定值随时间的变化。作为血清样本，使用通过真空采血管(テルモ公司制)采集后离心进行血清分离的试样来进行。EDTA血浆样本使用EDTA采血管(テルモ公司制)进行制备，肝素血浆样本使用肝素采血管(テルモ公司制)进行制备。关于全血样本，使用上述采血管采集后，不必进行血浆分离而直接使用。
使用肝素采血管制备的全血样本和血浆样本的结果见图1～图3 (样本1～样本3)，使用EDTA采血管制备的全血样本和血浆样本的结果见图4～图6 (样本1～样本3)。分别以采集后立即进行处理后测定的样本的值为100%，相对于此的增减以%表示。另外，90%～110%以内的值评价为稳定。全血样本自采血后5～8小时以后起测定值处于上升的趋势，而在相同条件下静置保存的血浆样本的测定值未见变化。另外，使用EDTA采血管制备的全血样本的测定值只在6小时以内稳定，而使用肝素采血管制备的全血样本的测定值只在4小时以内稳定。
需要说明的是，虽然没有给出数据，但若对全血样本实施过度的物理冲击、例如搅拌操作，则确认到测定值显著上升。
血清样本的结果见图7。在相同条件下静置保存的血清样本的测定值未见变化。
另外，虽然没有给出数据，但确认在室温下静置至少直至24小时的情况下，血清样本和血浆样本的测定值显示出充分的稳定性。
《实施例3：全血样本的稳定性的研究》
研究全血样本的测定值的不稳定性源于何处。
条件1：全血样本
条件2：将全血样本在室温下静置保存各时间，并于测定前进行血浆分离的血浆
条件3：血浆样本
样本的制备方法和测定方法均使用肝素采血管按照实施例2进行。结果见图8。与实施例1一样，全血样本(条件1)在4小时以后确认到测定值上升，但血浆样本(条件3)直至8小时都稳定。另一方面，从在条件2下保存各时间的全血样本中分离的血浆样本与全血样本(条件1)一样，确认到测定值的上升。
以上结果暗示：测定值的上升不是来自血浆成分而是来自血球成分。必须在采集全血样本后4小时以内直接测定，而且若在采集全血样本后4小时以内不分离血浆，则确认到分离后的测定值上升，由此可知：为了得到准确的测定值，必须在采集后4小时以内分离血浆。
《参考例1》
使用含抗凝剂(肝素或EDTA)的采血管从3名健康人采集全血样本，在室温下静置保存0小时、2小时、4小时、8小时，这次使用市售的CRP测定试剂(PATHFAST hs CRP测定试剂；三菱化学Medience公司制)确认测定值随时间的变化。关于样本的制备方法和测定方法，除试剂为CRP测定试剂外，与实施例2同样地进行。
结果见图9 (肝素采血管)和图10 (EDTA采血管)。如实施例2的人sCD14-ST的情形那样，采血后4小时以后测定值没有上升的趋势，确认CRP在全血样本中稳定。
产业实用性
本发明的分析方法例如可以用于败血症的诊断。
以上，虽然是按照特定方案来说明本发明，但本领域技术人员所自明的变形或改良也包含在本发明的范围内。
Claims (4)
1.抗sCD14-ST抗体在制备人sCD14-ST测定用的试剂中的应用，其特征在于：使用EDTA采血管采集全血样本时，自采集全血样本起6小时以内分析上述样本中的人sCD14-ST，其中，所述全血样本是指在采集全血后到开始分析该样本的期间以全血原有的状态保存的样本，所述人sCD14-ST是指可溶型低分子量CD14亚型。
2.抗sCD14-ST抗体在制备人sCD14-ST测定用的试剂中的应用，其特征在于：使用肝素采血管采集全血样本时，自采集全血样本起4小时以内分析上述样本中的人sCD14-ST，其中，所述全血样本是指在采集全血后到开始分析该样本的期间以全血原有的状态保存的样本，所述人sCD14-ST是指可溶型低分子量CD14亚型。
3.权利要求1所述的抗sCD14-ST抗体在制备人sCD14-ST测定用的试剂中的应用，其中，对使用采血管采集的全血样本通过多次颠倒混合进行搅拌后、不需要分离血浆以全血样本原有的状态进行分析。
4.权利要求2所述的抗sCD14-ST抗体在制备人sCD14-ST测定用的试剂中的应用，其中，对使用采血管采集的全血样本通过多次颠倒混合进行搅拌后、不需要分离血浆以全血样本原有的状态进行分析。
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