WO2015129774A1 - 新規抗プレセプシン抗体 - Google Patents

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WO2015129774A1
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-preceptin antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof useful for measuring preceptin in a specimen.
  • the CD14 molecule is a glycoprotein expressed on the membrane surface of mononuclear cells and is known to have a function as a receptor for LPS (lipopolysaccharide).
  • LPS lipopolysaccharide
  • CD14 molecules membrane-bound CD14 (mCD14) and soluble CD14 (sCD14) expressed on the cell surface.
  • sCD14 As sCD14, sCD14 having a molecular weight of about 55 kDa and about 49 kDa (hereinafter referred to as “high molecular weight sCD14”) is known, and sepsis (SEPSIS), acquired immune deficiency syndrome (AIDS), acute respiratory distress syndrome (ARDS), whole body It has been reported to show high levels in the blood of patients with many diseases such as sex lupus erythematosus (SLE). Therefore, these high molecular weight sCD14 are considered not to be disease-specific markers (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • sCD14-ST soluble CD14 antigen subtype, also referred to as preceptin
  • sCD14-ST Presepsin
  • sCD14-ST is characterized in that it migrates to a molecular weight of 13 ⁇ 2 kDa in SDS-PAGE under non-reducing conditions, and retains the N-terminal part of CD14.
  • sCD14 has an amino acid sequence that is largely deleted on the C-terminal side, and unlike high molecular weight sCD14, it does not have LPS binding ability.
  • preceptin shows immunogenicity different from high molecular weight sCD14, both can be distinguished using an antibody. Presepsin specifically increases blood concentration in patients with sepsis (Patent Document 1).
  • Non-patent Document 3 there is a report that it is high in the blood of sepsis patients compared to patients with systemic inflammatory response (SIRS), which is difficult to distinguish from sepsis, and presepsin is a specific diagnostic marker for sepsis.
  • a rabbit-derived polyclonal antibody that specifically recognizes preceptin (S68 antibody) and a rat-derived monoclonal antibody (F1146-17-2) have been disclosed (Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof which is excellent in reactivity with presepsin and suitable for measurement of presepsin in a specimen.
  • the monoclonal antibody or the measured value of preceptin having a good correlation with the measured value of the S68 antibody (a polyclonal antibody obtained by immunizing a rabbit with the S68 peptide described in Example 1 of WO2004 / 044005) It is to provide the antigen-binding antibody fragment.
  • the preceptin measured value measured using an antibody is not easily affected by an interfering substance (for example, triglyceride) in the sample, and it is possible to accurately measure preceptin even in samples of subjects having various background factors.
  • an interfering substance for example, triglyceride
  • a plurality of monoclonal antibodies were obtained from a plurality of hybridomas obtained by immunizing rabbits with S68 peptide through a plurality of selection steps such as binding activity to S68 peptide and binding activity to preceptin.
  • An ELISA system for measuring presepsin was constructed, and the reactivity with presepsin was examined.
  • Monoclonal antibody obtained by immunizing rats with the S68 peptide described in Example 2 of WO12004-17400 (WO 2004/044005) It was found that an antibody having an approximately 10,000-fold improvement in reactivity with preceptin was obtained compared to the ELISA system using SEQ ID NOs: 42 to 47).
  • An antibody having preferable performance for preceptin measurement is a region corresponding to positions 52 to 61 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (krvdadadpr: SEQ ID NO: 3 (human full-length soluble CD14): P03 sequence in preceptin. It was found to be an epitope. This epitope is a novel epitope first discovered in the present invention.
  • the binding between the antibody recognizing the P03 sequence as an epitope and preceptin was competitively inhibited by 50% or more by the amino acid residue consisting of the P03 sequence.
  • competitive inhibition of the reaction between the antibody and preceptin by each amino acid residue of SEQ ID NOs: 35 to 41 was less than 20%.
  • an amino acid residue consisting of SEQ ID NO: 36 (corresponding to positions 49 to 58 of human full-length soluble CD14: also referred to as P02 sequence), SEQ ID NO: 37 (corresponding to positions 55 to 64 of human full-length soluble CD14) :
  • SEQ ID NO: 38 (corresponding to positions 58 to 67 of human full-length soluble CD14: also referred to as P05 sequence)
  • the reaction inhibition of the reaction was less than 20%. From this result, it was found that an antibody that recognizes this P03 sequence as an epitope has high specificity for the P03 sequence.
  • the CDR sequence was modified based on the sequence of the antibody that recognizes the P03 sequence as an epitope.
  • the antibody was produced using the phage display method. The obtained antibodies were selected according to certain criteria, and antibodies equivalent to or better in performance than the antibodies obtained from hybridomas were obtained.
  • the antibody that recognizes the P03 sequence obtained from the hybridoma as an epitope and the selected variant have extremely high affinity for preceptin, and in a sandwich ELISA system for preceptin measurement, interfering substances (especially triglycerides) It was confirmed that the antibody is suitable for measurement of presepsin in a sample and has a good correlation with the measurement system using the S68 antibody.
  • the present invention is as follows. 1. An anti-preceptin antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof, which specifically recognizes an epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 2. The antibody or antigen-binding antibody fragment thereof, (I) heavy chain variable region (VH) complementarity determining region (CDR) 1: X 1 X 2 X 3 MX 4 ; (Ii) VH CDR2: IX 5 X 6 X 7 X 8 YAX 9 X 10 X 11 X 12 X 13 ; and (iii) VH CDR3: X 14 X 15 X 16 ; and (iv) light chain variable region (VL) CDR1: X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 X 22 X 23 X 24; (V) VH CDR2: KX 25 X 26 X 27 X 28 X 29 S; and (vi) VH CDR3: X 30 X 31 X 32 YX 33
  • X1 R, S, A, M, P, V, I, D, E, H, T, Q, Y, G, K, N, or W fragment. 4).
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof includes VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, and VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3, and VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 are derived from the amino acid sequences shown in Table 7. 4.
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof includes VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, and VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, and VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 is the antibody according to any one of 1 to 4 or an antigen-binding antibody fragment thereof selected from the amino acid sequences described in Tables 9-1, 9-2 and 9-3. 6).
  • VH CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, VH CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97, VH including VH CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22
  • VL CDR1, VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and VL comprising VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24
  • VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, VH CDR2 consisting of amino acid sequence and VH including VH CDR3 consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, VL CDR1 consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, VL CDR2 consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and sequence Including VL CDR3 consisting of the amino acid sequence of number 24 L
  • VH CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, VH CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and VH including VH CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 VL CDR1, VL CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, and VL including VL CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
  • VH CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, VH CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and VH including VH CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 VL, including VL CDR1, VL CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and VL CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or
  • the reaction system is a sandwich ELISA in which (a) the antibody or fragment and (b) the F1106-13-3 antibody or the F1031-8-3 antibody are used.
  • a reaction system in which amino acid residues are competitively reacted so that the binding between the antibody and preceptin is blocked, it consists of any of the sequences of SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39, 40, or 41.
  • the antibody or the antibody-binding antibody fragment thereof according to any one of 1 to 10, wherein the competitive inhibition of binding between the antibody and preceptin by an amino acid residue is less than 20%.
  • a triglyceride (TG) interference test is performed on a plurality of specimens using the antibody, the ratio of specimens in which the degree of dissociation of the preceptin measured value when the TG concentration in the specimen is 20 mg / mL is ⁇ 20% or less is 50 % Or more of the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to any one of 1 to 16 above. 18.
  • the average degree of dissociation of the preceptin measurement value when the TG concentration in the specimen is 20 mg / mL is ⁇ 20% or less.
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to any one of the above. 19.
  • the degree of dissociation of the preceptin measured value when the specimen is normal human serum and the TG concentration in the specimen is 10 mg / mL is ⁇ 100% or less. 19.
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to any one of 1 to 18, wherein the ratio of the sample to be shown is 50% or more. 20.
  • a correlation coefficient between a measured value of preceptin in a sample obtained using the antibody and a measured value of preceptin in a sample obtained using the S68 antibody is 0.9 or more. Or the antigen-binding antibody fragment thereof. 21. 21. The antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to 20, wherein the correlation coefficient is 0.95 or more. 22. The antibody or the antigen-binding antibody fragment thereof according to any one of 1 to 21, wherein the antibody binds to rsCD14ST-Fc with an affinity (KD value) of less than 1.08E-08. 23.
  • the binding activity between the antibody and preceptin is 10,000 times or more in the ratio of preceptin concentration as compared with the binding activity between the rat-derived anti-preceptin antibody (F1146-17-2) and preceptin.
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to any one of the above. 24. 1 to 23, wherein the binding activity (absorbance) between the antibody and rsCD14ST-Fc immobilized on a solid phase is at least twice the binding activity between the S68 antibody and rsCD14ST-Fc immobilized on a solid phase.
  • the antigen-binding antibody fragment thereof is a monoclonal antibody.
  • the antigen-binding antibody fragment includes Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, single chain antibody (scFv), dimerized V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv), sc (Fv 2)
  • the antigen-binding antibody fragment selected from the group consisting of 2, a polypeptide comprising a CDR, a polypeptide comprising a heavy chain variable region and a polypeptide comprising a light chain variable region, Or an antigen-binding antibody fragment thereof.
  • 27. 27. A polynucleotide encoding the antibody according to any one of 1 to 26 or an antigen-binding antibody fragment thereof. 28. 28.
  • 31. A method for producing an antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof, comprising culturing the transformed strain described in 29 or 30 above.
  • 32. A kit for measuring presepsin, comprising at least the antibody or antigen-binding antibody fragment of any one of 1 to 26 above.
  • 33. A kit for detecting sepsis or a kit for assisting in the detection or diagnosis of sepsis, comprising at least the antibody or fragment according to any one of 1 to 26 above. 34.
  • the presepsin measurement kit is capable of distinguishing between sepsis and systemic inflammatory response syndrome (SIRS), risk assessment of sepsis severity, prediction of sepsis prognosis (mortality prediction), severity assessment of sepsis, Detection of postoperative infection, detection of disseminated intravascular coagulation (DIC), detection of infectious DIC, detection of heart disease, detection of respiratory infection with bacterial infection, inflammatory bowel disease ( At least one selected from detection of Crohn's disease, ulcerative colitis), detection of febrile neutropenia (FN), detection of hemophagocytic syndrome (HPS), and functional evaluation of phagocytes
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • a method for measuring preceptin comprising a step of contacting at least the antibody or antigen-binding antibody fragment according to any one of 1 to 26 above and a specimen containing preceptin.
  • a method for detecting sepsis, or a method for assisting in detection or diagnosis of sepsis comprising at least the following steps: 1) a step of measuring a preceptin concentration in a specimen using the antibody or antigen-binding antibody fragment according to any one of 1 to 26, and 2) The said method including the process of determining whether the preceptin density
  • a method for detection or evaluation of a disease comprising at least the following steps, wherein the detection or evaluation of the disease distinguishes between sepsis and systemic inflammatory response syndrome (SIRS), the severity of sepsis Risk assessment, sepsis prognosis prediction (mortality prediction), sepsis severity assessment, postoperative infection detection, disseminated intravascular coagulation (DIC) detection, infectious DIC detection, Detection of heart disease, detection of respiratory infection with bacterial infection, detection of inflammatory bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis), detection of febrile neutropenia (FN), hemophagocytosis At least one selected from the detection of syndrome (hemophagocytic syndrome, HPS) and functional evaluation of phagocytic cells, 1) a step of measuring a preceptin concentration in a specimen using the antibody or antigen-binding antibody fragment according to any one of 1 to 26, and 2) The said method including the process of determining whether the preceptin density
  • a method for screening an anti-preceptin antibody or an antigen-binding antibody fragment comprising at least the following steps: 1) constructing a preceptin measurement system using a candidate antibody or antigen-binding antibody fragment 2) using the measurement system to determine the effect of the TG concentration in the specimen on the preceptin measurement value, Said method.
  • a method for screening an anti-preceptin antibody or an antigen-binding antibody fragment comprising at least the following steps: 1) a step of obtaining a candidate anti-preceptin antibody or antigen-binding antibody fragment; and 2) a reaction system in which the amino acid residue consisting of SEQ ID NO: 1 is competitively reacted so that the binding between the antibody and preceptin is blocked.
  • the method comprising the step of selecting the antibody or antigen-binding antibody fragment in which binding between the antibody and preceptin is competitively inhibited by 50% or more.
  • a method for screening an anti-preceptin antibody or an antigen-binding antibody fragment comprising at least the following steps: 1) obtaining a candidate anti-preceptin antibody or antigen-binding antibody fragment; and 2) selecting the antibody or antigen-binding antibody fragment that specifically recognizes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in preceptin as an epitope. , Said method. 42.
  • a patient who has been detected for sepsis, or has been aided in detection or diagnosis A method for treating sepsis, wherein sepsis treatment is performed.
  • 43. 27. A screening method for a test drug, comprising a step of determining a preceptin concentration in a sample of a subject to which the test drug is administered using the antibody or antigen-binding antibody fragment described in any one of 1 to 26 above.
  • 44. RsCD14ST-Fc comprising the sequence of positions 1 to 64 of SEQ ID NO: 3 (human full-length soluble CD14) and the heavy chain Fc region of the antibody. 45. 45.
  • the rsCD14ST-Fc of the above 44 wherein a sequence that facilitates cleavage is inserted between the sequence of positions 1 to 64 of SEQ ID NO: 3 (human full-length soluble CD14) and the heavy chain Fc region of the antibody. . 46. 46. The rsCD14ST-Fc of 45 above, wherein the sequence that facilitates cleavage is a thrombin recognition sequence. 47. 47. The rsCD14ST-Fc according to any one of 44 to 46, wherein the heavy chain Fc region of the antibody is an Fc region of a human-derived IgG1 antibody heavy chain. 48.
  • a method for producing rsCD14ST-Fc comprising a step of cleaving the Fc region of rsCDST-Fc according to 48.
  • the present invention it is possible to improve the quality and precision of preceptin measurement by providing an antibody and an antigen-binding antibody fragment thereof that are excellent in reactivity with preceptin and are suitable for measurement of preceptin in a specimen.
  • the antibody is suitable for quantification of a small amount of presepsin at a normal level, and can be highly sensitive.
  • the ability to provide antibodies that are less susceptible to the effects of interfering substances in the specimen makes it possible for the measurement values in the sandwich ELISA system to be less susceptible to individual differences in serum samples (subject's background factors) and to perform highly accurate measurements. Become. In the sandwich ELISA system, a highly specific measurement is possible, which specifically binds only to preceptin and does not specifically bind to high molecular weight sCD14 present in human blood.
  • the monoclonal antibody has the advantages that it can be stably and efficiently produced at low cost and the uniform quality of the antibody can be maintained.
  • FIG. 3 is a diagram continuing from FIG. 2. It is a figure which shows each modification obtained in Example 8 and Example 12.
  • FIG. 2 is a diagram continuing from FIG. 2 and FIG. 2-1.
  • the first aspect of the present invention is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is a novel epitope on preceptin Is an anti-preceptin antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof.
  • Specifically recognizing an epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means that the antibody specifically recognizes a sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an epitope among the sequences of preceptin. .
  • Antigen-binding antibody fragment refers to a fragment having the same antigen-binding property as the original antibody among partial fragments of an antibody that specifically recognizes an epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity or “sequence homology” is a sequence between two or more polynucleotide or amino acid sequences, ie, a reference sequence and the sequence to be compared to the reference sequence. Reference is made to the relationship between. After the sequences have been optimally adjusted to create a high degree of sequence similarity, determined by match between sequences, sequence identity or homology is determined by comparing the subject sequence with a reference sequence. The For such adjustments, sequence identity is determined for each position. For example, when a nucleic acid or amino acid is the same at a certain position, the sequence is the same at a specific position. Dividing the total number of such identity positions by the total number of nucleic acids or residues of the reference sequence yields% sequence identity.
  • sequence identity can be easily calculated by known methods, and is not particularly limited, but they are not limited to Computational Molecular Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome. Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, GrifEn A. M., and GrifEn H. G., eds., Humana Press, (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. and Devereux J., eds., M.
  • the method for determining an epitope is not particularly limited, but can be confirmed by, for example, the method described in Example 6.
  • the antibody of the present invention is a reaction system in which a P03 peptide (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) is competitively reacted (preferably using absorbance) so that the binding between the antibody and preceptin is blocked. It may be characterized by 50% or more competitive inhibition of binding between the antibody and preceptin.
  • the reaction system is preferably a sandwich ELISA. More preferred is a sandwich ELISA in which (a) the antibody or fragment of the present invention and (b) the F1106-13-3 antibody or the F1031-8-3 antibody are used.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to positions 52 to 61 of the amino acid sequence of human full-length soluble CD14 (SEQ ID NO: 3).
  • P01 peptide amino acid sequence represented by positions 46 to 55 of SEQ ID NO: 3
  • P02 peptide amino acid represented by positions 49 to 58 of the same sequence
  • P05 peptide positions 58 to 67 of the same sequence
  • P06 peptide positions 61 to 70 of the same sequence
  • P07 peptide positions 64 to 73 of the same sequence
  • P08 peptide of the same sequence 67th to 76th
  • competitive inhibition by the P04 peptide positions 55-64 of the same sequence for binding of the antibody of the invention to preceptin is less than 20%.
  • the binding activity between the target antigen partial sequence (eg, P03 peptide) and the antibody is examined. It is also possible.
  • an anti-preceptin antibody that binds to a sequence in which one or more amino acid sequences other than aspartic acid at position 8 of the P03 sequence (SEQ ID NO: 1) are substituted.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably within 2 amino acids, more preferably 1 amino acid.
  • an anti-preceptin antibody that binds to the P03 sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity.
  • the epitope of interest is 90% or more of the P03 sequence, preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more Or a sequence with 100% identity.
  • an anti-preceptin antibody specific for a sequence having 90% or greater identity to the P03 sequence may be a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically recognizes preceptin.
  • Preceptin sCD14-ST
  • sCD14-ST is a soluble fragment of CD14 and has the following properties 1) to 3).
  • -SDS-PAGE under non-reducing conditions molecular weight 13 ⁇ 2 kDa
  • the N-terminal sequence has the amino acid sequence of positions 1 to 11 of SEQ ID NO: 3, and -It specifically binds to an antibody prepared using a peptide consisting of 16 amino acid residues described in SEQ ID NO: 2 as an antigen. That is, in the present invention, presepsin is human preceptin unless otherwise specified.
  • preceptin standard products rsCD14-ST described in Example 16 of WO2005 / 108429
  • rsCD14ST-Fc described in Example 9- (2)
  • the “specifically recognizing antibody” is an antibody that immunologically recognizes a target that is specifically recognized and / or an antibody that shows a normal antigen-antibody reaction with a target that is specifically recognized.
  • the equilibrium dissociation constant (KD) is usually less than 10 ⁇ 7 M.
  • the antibody of the present invention specifically recognizes only preceptin.
  • the main soluble CD14 present in human blood includes soluble CD14 (high molecular weight sCD14) of about 55 kDa and about 49 kDa.
  • the antibody of the present invention does not specifically bind to high molecular weight sCD14.
  • the high molecular weight sCD14 may be human full-length soluble CD14 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, or may be prepared, for example, by adsorbing a normal human body fluid with a 3C10 antibody affinity column (WO2005 / 108429 See Example 23).
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof is excellent in reactivity with preceptin and is suitable for measurement of preceptin in a specimen.
  • a sandwich ELISA system can be constructed using the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof, and presepsin in a sample can be measured.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof has a reactivity with preceptin in a sandwich ELISA system. Since it improved 10,000 times (Example 4), it is suitable for detection of a small amount of preceptin in a specimen. That is, the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof may be characterized in that the reactivity with preceptin is improved by 10,000 times or more in the concentration ratio of preceptin compared to F1146-17-2. Good.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof is preferably used for detection of sepsis.
  • the antibody of the present invention or its antigen-binding antibody fragment is different from the measured value of presepsin when a sandwich ELISA is constructed using this antibody and a sepsis patient sample and a normal human sample are measured.
  • An antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof is preferred.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof is preferably an antibody that does not cause a problem of the influence of an interfering substance in a sample when a measurement system is constructed and presepsin in the sample is measured.
  • the interfering substance means a substance whose presence of the substance may affect the measured value of preceptin (hereinafter also referred to as interference).
  • preceptin hereinafter also referred to as interference
  • triglycerides also referred to as TG
  • bilirubin bilirubin
  • Hemoglobin Hemoglobin
  • rheumatoid factor cholesterol and the like.
  • the preferred interfering substance for antibody evaluation is triglyceride (TG).
  • the deviation of the preceptin measurement value when a certain amount of the interference substance is added to the sample with respect to the preceptin measurement value of the sample without the interference substance is expressed as a dissociation degree (%) and used. be able to.
  • the degree of dissociation of the preceptin measurement value by adding a certain amount of interference substance is ⁇ 20% or less, more preferably ⁇ 10% or less.
  • the high ratio of the specimens indicating “The ratio of the specimen is high” in a plurality of specimens is usually 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, further preferably 80% or more, and particularly preferably 90% in the plurality of specimens. % Or more.
  • the TG interference test for example, an interference test is performed on a plurality of specimens, and the degree of dissociation of the preceptin measurement value when the TG concentration in the specimen is 20 mg / mL by adding TG is ⁇ 20% or less, more preferably ⁇ 10%.
  • a high ratio of the following specimens may be used as one index.
  • One of preferred embodiments of the antibody of the present invention is that when a TG interference test is carried out by a measurement system using the antibody, the degree of dissociation of the preceptin measurement value when the TG concentration in the sample is 20 mg / mL is ⁇ 20%.
  • antibodies having a high ratio of specimens showing ⁇ 10% or less are more preferable.
  • the degree of dissociation of the measured value of preceptin when the TG concentration in the sample is 20 mg / mL is obtained from a plurality of samples, and the average value of the degree of dissociation is ⁇ 20% or less, more preferably ⁇ 10% or less. It is good also as one index.
  • One of the preferred embodiments of the antibody of the present invention is that when a TG interference test is performed on a plurality of specimens by a measurement system using the antibody, the presepsin measurement value is dissociated when the TG concentration in the specimen is 20 mg / mL. It is an antibody having an average degree of ⁇ 20% or less, more preferably ⁇ 10% or less.
  • NCEP-ATPIII which is a guideline for dyslipidemia in the United States
  • TG less than 150 mg / dL is normal
  • TG 150-200 mg / dL is borderline
  • TG 200-499 mg / dL is high (high)
  • 500 mg / dL or more is significantly high (Very high).
  • the degree of dissociation of the preceptin measurement value is measured at three points of the TG concentration of the specimen: 6.7 mg / mL, 13.3 mg / mL, and 20 mg / mL.
  • An antibody (measurement system) having a low dissociation degree when the sample has a TG concentration of 20 mg / mL is also dissociated when the sample has a TG concentration of 6.7 mg / mL and 13.3 mg / mL, compared to an antibody having a high degree of dissociation. The tendency was small.
  • TG interference test may be performed using normal human serum. Since normal human specimens have a low preceptin concentration, the degree of dissociation of measured values tends to increase when subjected to TG interference. This test makes it possible to test whether a minute amount of preceptin in a sample can be measured with high accuracy. For example, when the TG concentration in the sample is 10 mg / mL, the degree of dissociation of the preceptin measurement value is preferably ⁇ 100% or less, more preferably ⁇ 70% or less, still more preferably ⁇ 50% or less, particularly preferably ⁇ 20% or less. Similar to the above test, it is desirable to perform the test using a plurality of specimens.
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment of the present invention may be evaluated by comparing the degree of dissociation of the preceptin measurement value obtained by adding an interference substance to the antibody and the degree of dissociation of the S68 antibody under the same conditions.
  • the degree of dissociation is similar between the antibody of the present invention and the S68 antibody.
  • the dissociation degree of the preceptin measured value when the TG concentration in the sample is 20 mg / mL by adding TG
  • the same conditions of the S68 antibody You may evaluate by the ratio of the specimen which shows the difference with a dissociation degree 20% or less, more preferably 10% or less being high.
  • the difference in the degree of dissociation was calculated as, for example, 15% when the degree of dissociation measured by the antibody of the present invention was + 5% and the degree of dissociation measured by the S68 antibody was ⁇ 10%.
  • the sample described in the second aspect of the present invention can be used as the sample used for the interference test.
  • serum or plasma is preferable.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof is preferably an antibody having a good correlation with the measured value using the S68 antibody when a measurement system is constructed and presepsin in a sample is measured.
  • the good correlation preferably means that the correlation coefficient is 0.9 or more, and more preferably 0.95 or more.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof specifically binds to preceptin, and the affinity for preceptin (equilibrium dissociation constant, KD value) is preferably less than 10 ⁇ 7 M, more preferably Is less than 10 ⁇ 8 M, more preferably less than 10 ⁇ 9 M, particularly preferably less than 10 ⁇ 10 M, and most preferably 10 ⁇ 11 M or less.
  • the equilibrium dissociation constant of the antibody of the present invention or the antigen-binding antibody fragment thereof for preceptin is preferably in the range of 10 ⁇ 7 M to 10 ⁇ 14 M, more preferably 10 ⁇ 8 M to 10 ⁇ 13 M.
  • rsCD14ST-Fc may be used as the preceptin.
  • Affinity (equilibrium dissociation constant, KD value) can be measured using, for example, BIACORE (GE Healthcare).
  • the affinity (KD value) of the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof for preceptin is superior to the affinity of the S68 antibody for preceptin.
  • the affinity (KD value) of the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof to rsCD14ST-Fc is the affinity (KD value) of the S68 antibody to rsCD14ST-Fc. It is desirable to show a numerical value comparable to or lower than 1.08E-08, more preferably 1/2 or less of the KD value of the S68 antibody (5.40E-09), more preferably the KD of the S68 antibody. It is desirable to show 1/10 (1.08E-09) or less of the value.
  • One of the preferred embodiments of the present invention is that the binding activity of the antibody of the present invention or its antigen-binding antibody fragment to preceptin is superior to that of the S68 antibody.
  • rsCD14ST-Fc preceptin
  • rsCD14ST-Fc may be immobilized on a solid phase and reacted with an antibody, and the binding activity of the antibody to preceptin may be evaluated by absorbance or the like.
  • the ratio of the absorbance when the antibody of the present invention was reacted with rsCD14ST-Fc, when the test was performed according to Example 10 and the absorbance when the S68 antibody was reacted with rsCD14ST-Fc was 1, Is preferably 1 or more, more preferably 2 or more, still more preferably 4 or more, and particularly preferably 5.5 or more.
  • the present invention provides the antibody described in any of the following. These are anti-preceptin antibodies.
  • the following antibodies (a), (b) and (c) or antigen-binding antibody fragments thereof specifically recognize the epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 on precepts, and are therefore preferred examples in the first aspect. It is. More preferred is the antibody (a) or (b) or an antigen-binding antibody fragment thereof.
  • VH CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • VH CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • VH including VH CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19
  • An antibody or antigen-binding antibody fragment thereof comprising a VL CDR1, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • VH CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • VH CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
  • VH including VH CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22
  • An antibody or antigen-binding antibody fragment thereof comprising a VL CDR1, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • VH CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • VH CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • VH including VH CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25
  • An antibody or antigen-binding antibody fragment thereof comprising VL CDR1, VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the present invention also provides an antibody comprising the CDR sequences described in FIGS. 2 to 2-2 or an antigen-binding antibody fragment thereof. These antibodies specifically recognize an epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 on preceptin. More preferred is an antibody or antigen-binding antibody fragment thereof comprising the CDR sequences of 5793, 5810, 5864, 5979, 5983, 5988, 6028.
  • the present invention provides a polypeptide comprising any of the following CDRs. More preferably, it is a polypeptide of (i) (ii) (iv) or (v).
  • VH CDR1 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 10
  • VH CDR2 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 11
  • VH CDR3 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • a polypeptide comprising VL CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 19, VL CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 20, and VL CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 21.
  • V A polypeptide comprising VL CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 22, VL CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 23, and VL CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 24.
  • a polypeptide comprising VL CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 25, VL CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 26, and VL CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising VH CDR1, VH CDR 2 and VH CDR3 comprising the sequences described in FIGS. 2 to 2-2.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 comprising the sequences shown in FIGS. 2 to 2-2.
  • VH CDR1 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 7
  • VH CDR2 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 8
  • VH CDR3 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 94 (5793)
  • a polypeptide comprising VH CDR1, VH CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 97, and VH CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 9 (5810).
  • the present invention provides a polypeptide comprising the variable region described in any of the following. More preferably, it is a polypeptide comprising (i) (ii) (iv) or (v).
  • VH A heavy chain variable region (VH) comprising CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 4, CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 5, and CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 6.
  • VH containing CDR1 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 10, CDR2 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 11, and CDR3 consisting of the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • VL A light chain variable region comprising CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 19, CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 20, and CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 21.
  • V A VL comprising CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 22, CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 23, and CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 24.
  • Vi A VL comprising CDR1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 25, CDR2 comprising the sequence of SEQ ID NO: 26, and CDR3 comprising the sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising a heavy chain variable region comprising VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3 comprising the sequences shown in FIGS. 2 to 2-2.
  • the present invention also provides a polypeptide comprising a light chain variable region comprising VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 comprising the sequences shown in FIGS. 2 to 2-2.
  • the polypeptide is preferably an antigen-binding substance having a binding activity to preceptin.
  • one or more amino acids may be substituted, deleted, added, and / or inserted (referred to as substitution) in the CDR sequence.
  • the antibody or polypeptide after substitution or the like of one or more amino acids has activity or performance equivalent to that before substitution, etc. with respect to antigen binding activity, preceptin measurement characteristics, etc. preferable.
  • the antibody or polypeptide after substitution, etc., having the same activity or performance as before substitution or the like is a mutant artificially modified by a known genetic engineering technique, naturally occurring mutation Any body (so-called allelic variant) is included.
  • the number of amino acids to be substituted is not particularly limited as long as the number is more than 1, but is preferably within 3 amino acids, more preferably within 2 amino acids, more preferably within 1 amino acid per CDR. It is.
  • the antibody or polypeptide of the present invention may have a CDR sequence that shows 90% or more identity to the amino acid sequence of the CDR specified by SEQ ID NO as described above. Its identity may be 92% or higher, 95% or higher, 97% or higher, or 99% or higher.
  • Such an antibody or polypeptide preferably has an activity or performance equivalent to that of the antibody or polypeptide having the CDR acid sequence specified by SEQ ID NO.
  • the framework region (FR) of the antibody to be linked to the CDR a region in which the CDR forms a favorable antigen binding site is selected.
  • the FR used in the variable region of the present invention is not particularly limited, and any FR may be used. If necessary, one or more amino acids of FR may be substituted, deleted, added and / or inserted so that the CDR forms an appropriate antigen-binding site.
  • the FR may be an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. The identity may be 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more.
  • a mutant FR sequence having a desired property may be selected by measuring and evaluating the binding activity of an antibody to an antigen using an FR substituted with an amino acid.
  • the FR region of an antibody is a known FR (for example, AAO 06511.1, AAT 02391.1, AAG 13973.1, AGT 29986.1, etc.) obtained from a database (eg, GenBank) or the like.
  • a database eg, GenBank
  • the FR of the antibody obtained in the present invention can be used.
  • a person skilled in the art can select a desired FR based on common general technical knowledge.
  • Examples of the FR of the antibody preferably used in the present invention include those of SEQ ID NOs: 48 to 84. These are FR obtained from a database or the like, or FR of an antibody obtained in the present invention.
  • FRs derived from various animals can be used, and in particular, FRs of antibodies derived from rabbits are preferable.
  • SEQ ID NOs: 64-84 are preferable, and more preferably, SEQ ID NO: 65 or 66, SEQ ID NO: 68 or 69, SEQ ID NO: 71 or 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 or 76, SEQ ID NO: 78 or 79, SEQ ID NO: It is FR of 81, 82, or 83 and sequence number 84.
  • variable regions of the antibodies of the invention are as follows: (1) (i) Heavy chain CDR sequences of the variants described in FIGS. 2 to 2-2 (eg, VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3 of antibody 5810) and SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70, and a heavy chain variable region having an FR comprising the sequence of SEQ ID NO: 73; (Ii) the light chain CDR sequences of the variants described in FIGS.
  • SEQ ID NO: 75 (or 76), SEQ ID NO: 78 (or 79), a light chain variable region having an FR comprising SEQ ID NO: 81 (or 82 or 83), and SEQ ID NO: 84.
  • variable region one or a plurality of amino acids (for example, within 5 amino acids, preferably within 3 amino acids) may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • the antibody or polypeptide after substitution or the like of one or more amino acids has the same activity or performance as before substitution, etc. with respect to antigen binding activity, preceptin measurement characteristics, etc. Is preferred.
  • the variable region when a variable region is specified by an amino acid sequence as described above, the variable region may have an amino acid sequence having 80% or more identity to the sequence specified by the SEQ ID NO. . The identity may be 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more.
  • Such a variable region preferably has the same activity or performance as the variable region specified by the SEQ ID NO.
  • the constant region used in the antibody of the present invention is not particularly limited, and any constant region may be used.
  • the constant region used in the antibody of the present invention for example, the constant region of IgG derived from mouse, rat, rabbit or human can be used.
  • the constant region one or a plurality of amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted within a range that does not affect the antigen binding activity, preceptin measurement characteristics, and the like.
  • the antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody, that is, an anti-preceptin monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by a single clone of antibody-producing cells.
  • Monoclonal antibodies have characteristics such as uniform antibody specificity and high titer antibodies compared to polyclonal antibodies. Theoretically, monoclonal antibodies have the advantage that less antibody weight is required for antigen measurement than polyclonal antibodies.
  • the term “antibody” may be used to mean “an antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof”.
  • the monoclonal antibody of the present invention is preferably produced using the S68 peptide shown in SEQ ID NO: 2 as the administration antigen.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by, for example, immunizing an animal with the S68 peptide, producing a hybridoma between antibody-producing cells and myeloma cells of the immunized animal, and then selecting a single hybridoma and culturing it. It can be obtained by purifying the culture supernatant.
  • the animal species from which the antibody is derived is not particularly limited, and examples include mouse, rat, hamster, rabbit and the like. Preferably, it is a rabbit. That is, the antibody of the present invention is preferably a rabbit-derived anti-preceptin monoclonal antibody (also referred to as a rabbit anti-preceptin monoclonal antibody).
  • myeloma cells can be used as the myeloma cells.
  • human-derived SKO-007 human mouse heteromyeloma SHM-D33, mouse-derived P3, NS-1, P3U1, SP2 / 0, rat-derived YB2 / 0, Y3-Ag1, 2, 3 and the like It is done.
  • Rabbit-derived immortalized B lymphocytes and the like may be used.
  • a rabbit-mouse hybridoma is prepared by fusion with a rabbit spleen cell and a rabbit-derived immortalized B lymphocyte, or a cell derived from an immortalized mouse cell line. Also good.
  • Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be performed by a known method, and for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, or the like can be used as a fusion promoter.
  • PEG polyethylene glycol
  • Sendai virus or the like
  • the culture solution used for cell fusion for example, RPMI 1640 culture solution, MEM culture solution, or the like can be used.
  • the hybridoma formed by the fusion is cultured for several days to 3 weeks, and separated from unfused cells using a selective medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium).
  • a selective medium such as a medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT medium).
  • HAT medium a selective medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin
  • the obtained hybridoma is further selected according to the antibody produced.
  • the selected hybridoma is single-cloned according to a known limiting dilution method and established as an antibody-producing hybridoma.
  • Antibody purification includes, for example, ion exchange chromatography, affinity chromatography (protein A column, protein G column, etc.), salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, centrifugation, gel filtration method It can carry out by well-known methods, such as.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof can also be prepared using a gene recombination technique that can be used by those skilled in the art.
  • a polynucleotide encoding the antibody or a part thereof can be constructed based on the sequence of the obtained anti-preceptin antibody, introduced into an expression vector, and then expressed in a suitable host.
  • mRNA can be extracted from the hybridoma producing the antibody of the present invention, and cDNA can be synthesized. These can be carried out using a commercially available kit or the like.
  • an antibody in which a part of the sequence is modified based on the sequence of the anti-preceptin antibody can be prepared using a gene recombination technique that can be used by those skilled in the art.
  • a vector containing the target sequence can be prepared and expressed in a suitable host.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited, but a vector and / or expression vector suitable for expression of an antibody gene is preferable. Examples thereof include a vector containing an EF-1 ⁇ promoter and / or a CMV enhancer.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage, etc.
  • Viruses such as phages, retroviruses, vaccinia viruses, and baculoviruses may be used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • a promoter derived from SV40, a retrovirus promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an EF1 ⁇ promoter, or the like can be used.
  • the vector can contain an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin, etc., as necessary.
  • selection marker for example, dihydrofolate reductase (dhfr), methotrexate (MTX) resistance gene, ampicillin resistance gene and the like can be used.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited.
  • bacterial cells such as Escherichia coli
  • yeasts such as amphibian cells (such as Xenopus oocytes), insects or insect cells (such as sf9)
  • animal cells include COS-1 cells, COS-7 cells, CHO cells, DHFR gene-deficient CHO cells (dhfr-CHO cells), mouse 3T3 cells, human HEK293 cells, myeloma cells, and the like.
  • the method of introducing the expression vector into the host cell can be carried out by a known method, and examples thereof include a lipofection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and a microinjection method.
  • the cell After introducing the expression vector into the host cell, the cell is cultured in a culture medium suitable for each host cell.
  • a culture medium suitable for each host cell for example, in the case of animal cells, a medium for animal cell culture such as RPMI 1640 medium and GIT medium, or a medium obtained by adding various additives such as FCS to these can be used.
  • the antibody By culturing the obtained transformed cells in a medium, the antibody can be expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the method described above can be used for purification of the antibody in the culture supernatant.
  • the expression level of the antibody and the antigen-antibody activity can be measured by ELISA or the like.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof may be prepared using a phage display method.
  • Antibody acquisition by the phage display method can be performed by techniques that can be used by those skilled in the art (see CARLOS F. BARBAS, etc., Page Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press), etc.).
  • the method described in Example 11 of the present invention can be used.
  • a gene can be obtained from spleen lymphocytes obtained by immunizing animals with S68 peptide, and ligated with a phagemid vector or the like, and thereafter prepared by a conventional method.
  • a phage display method in order to produce a modified product in which only the sequence of a specific CDR (for example, VH CDR3) is changed.
  • This can also be performed using techniques that can be used by those skilled in the art, using a plasmid containing a heavy chain and a light chain of a template antibody and specific primers. For example, the method described in Example 12 can be used.
  • antigen-binding antibody fragment of the present invention examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, single chain antibody (scFv), dimerization V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv), Examples include sc (Fv) 2, CDR-containing polypeptides, heavy chain variable region polypeptides, and light chain variable region polypeptides.
  • Each antibody fragment has the same antigen-binding property as the antibody of the present invention that recognizes an epitope consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • These antibody fragments can be prepared using gene recombination techniques that can be used by those skilled in the art.
  • Fab is an antibody fragment having an antigen-binding activity in which about half of the H chain and the entire L chain are bound by a disulfide bond, among fragments obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain.
  • F (ab ′) 2 is a fragment in which Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region among fragments obtained by treating IgG with proteolytic enzyme pepsin.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity obtained by cleaving a disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2.
  • Fab ′ can be obtained by treating F (ab ′) 2 with a reducing agent dithiothreitol.
  • ScFv is a polypeptide in which one VH and one VL are linked by an appropriate peptide linker, and is an antibody fragment having antigen binding activity.
  • Diabody is an antibody fragment that has a bivalent antigen binding activity by dimerizing scFv.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • Sc (Fv) 2 is an antigen fragment in which two VHs and two VLs are joined together with a linker or the like to form a single chain.
  • sc (Fv) 2 can be prepared, for example, by binding scFv with a linker.
  • polypeptide containing CDR is a fragment having antigen-binding activity as described above.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable linker.
  • polypeptide containing the heavy chain variable region and the polypeptide containing the light chain variable region are as described above.
  • any peptide linker that can be introduced by genetic engineering can be used as the linker.
  • a preferred linker in the present invention is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is usually 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 20 amino acids. When linking four antibody variable regions, usually three linkers are required.
  • the plurality of linkers may be the same or different linkers may be used.
  • the antibodies of the present invention include chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • a chimeric antibody is an antibody molecule produced by combining a part of two or more different antibody molecules.
  • Preferred chimeric antibodies in the present invention are antibodies having a variable region derived from the rabbit monoclonal antibody of the present invention and a constant region of another species (eg, human).
  • a humanized antibody is an antibody obtained by grafting CDRs from a non-human species into a human antibody. Chimeric antibodies and humanized antibodies can be prepared according to conventional methods.
  • the antibody of the present invention includes an antibody in which one or more amino acid residues are added to the amino acid sequence of the present invention. Also included are fusion proteins in which these antibodies are fused with other peptides or polypeptides.
  • the fusion protein can be prepared using a technique known to those skilled in the art. For example, the polynucleotide encoding the antibody of the present invention and the polynucleotide encoding another peptide or polypeptide match in frame. Thus, it can be ligated and introduced into an expression vector and expressed in a host. Other peptides or polypeptides used for binding to the antibody of the present invention are not particularly limited.
  • FLAG 6 ⁇ His comprising 6 His (histidine) residues, polyhistidine segment, influenza agglutinin (HA), T7-tag, HSV-tag, GST (glutathione-S-transferase), immunoglobulin constant region (Fc region), ⁇ -galactosidase, maltose binding protein and the like.
  • the second aspect of the present invention is a method for immunologically measuring preceptin using at least the antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof, and at least the antibody or antigen-binding property of the present invention. Contacting the specimen containing the antibody fragment with preceptin.
  • the term “measurement” can be used interchangeably with the terms “detection”, “quantification”, “assay”, etc., and is used in the meaning including quantitative and qualitative determination.
  • the measurement of preceptin is preferably performed in vitro.
  • this method comprises a step of contacting at least an antibody or antigen-binding antibody fragment of the present invention with a specimen containing presepsin. It can also be called a method.
  • the step of measuring the preceptin concentration in the sample of the subject using the antibody of the present invention and 2) whether the preceptin concentration obtained in 1) is higher than the cut-off value. It can also be referred to as a method for detecting sepsis, or a method for assisting in the detection or diagnosis of sepsis, including the step of determining whether or not.
  • the cut-off value at this time is 314 to 600 pg / mL, preferably 400 to 580 pg / mL, more preferably 450 to 550 pg / mL, and still more preferably 500 pg / mL.
  • disease detection may be used interchangeably with “disease detection assistance” or “disease diagnosis assistance”.
  • antibodies or antigen-binding antibody fragments for example, discrimination between sepsis and systemic inflammatory response syndrome (SIRS), risk assessment of the severity of sepsis, prognosis prediction of septicemia (mortality prediction), Severity assessment of sepsis, detection of postoperative infection, detection of disseminated intravascular coagulation (DIC), detection of infectious DIC, detection of heart disease, detection of respiratory infection with bacterial infection , Detection of inflammatory bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis), detection of febrile neutropenia (FN), detection of hemophagocytic syndrome (HPS) and functional evaluation of phagocytes It can be used for the detection or evaluation of at least one disease selected from.
  • Postoperative infection is a general term for infections that develop after surgery, and means all infections caused by surgery and adjunct therapy necessary for it.
  • postoperative infections include all diseases diagnosed as postoperative infections based on Guideline for prevention of surgical site infection, 1999C (CDC).
  • heart diseases include acute coronary syndrome (ACS), acute heart failure, acute decompensated heart failure (ADHF), chronic heart failure, coronary artery disease, angina, myocardial infarction, ischemic stroke, hemorrhagic stroke and transient Examples include cerebral ischemic attacks.
  • ACS acute coronary syndrome
  • ADHF acute decompensated heart failure
  • chronic heart failure coronary artery disease
  • coronary artery disease angina
  • myocardial infarction ischemic stroke
  • hemorrhagic stroke hemorrhagic stroke
  • transient Examples include cerebral ischemic attacks.
  • Respiratory tract infections with bacterial infections include lower respiratory tract infections or pneumonia.
  • Lower respiratory tract infections include acute lower respiratory tract infections and chronic lower respiratory tract infections.
  • Acute lower respiratory tract infections include acute tracheitis, acute bronchitis, and acute bronchiolitis, mostly caused by viral infection of the upper respiratory tract that spreads to the lower respiratory tract, but in some cases secondary to bacteria Infection continues. Antibiotics are indicated for signs of secondary bacterial infection.
  • Chronic lower respiratory tract infection is a pathological condition in which persistent infection of bacteria is established in the lower respiratory tract having an organic disorder such as bronchiectasis or chronic obstructive pulmonary disease, and persistent infection and acute ashamed exist.
  • bronchiectasis chronic obstructive pulmonary disease
  • chronic bronchitis diffuse panbronchiolitis
  • old pulmonary tuberculosis pneumoconiosis
  • nontuberculous mycobacterial disease allergy Bronchopulmonary aspergillosis, pulmonary fibrosis, chronic bronchial asthma and the like are included.
  • Antibiotics are indicated for both persistent infection and acute exacerbation.
  • Pneumonia includes community-acquired pneumonia and nosocomial pneumonia. Preferred is community-acquired pneumonia.
  • the functional evaluation of phagocytic cells includes: (a) measurement of phagocytic ability of neutrophils, granulocytes and / or leukocytes; and (b) immunity by measuring phagocytic ability of neutrophils, granulocytes and / or leukocytes. Examples include evaluation of function, (c) quality evaluation of cells for transplantation during autologous cell transplantation or allogeneic cell transplantation, and (d) detection of diseases associated with phagocytosis by phagocytic cells.
  • Diseases associated with phagocytic phagocytosis include, for example, autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, mastitis, gout, glomerulonephritis, ulcerative colitis, Mediterranean fever, otitis media, rhinitis, pneumonia, tuberculosis, cystitis, amniotic fluid infection And purulosis.
  • Samples used to detect phagocytic phagocytic diseases include tissue fluid, lymph fluid, joint fluid, milk, cerebrospinal fluid, pus, saliva, tear fluid, mucus, runny nose, sputum, urine, ascites, amniotic fluid, A body fluid such as semen, or a rinsing fluid after washing nasal cavity, bronchial, lung, skin, abdominal cavity, various organs, joints, bones, etc. can be used.
  • Examples of a method for immunologically measuring preceptin using the antibody or antigen-binding antibody fragment of the present invention include, for example, enzyme immunoassay (hereinafter also referred to as EIA or ELISA), chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA). Chemiluminescence immunoassay (CLIA), fluorescent antibody method (FAT), fluorescent enzyme immunoassay (FEIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), radioimmunoassay (RIA), immunochromatography, aggregation method, Examples include, but are not limited to, competition methods, etc. In the present invention, either direct method or indirect method may be used Sensitization method in which biotin-avidin (streptavidin) complex is formed and detected May be used.
  • EIA is one of immunoassays using enzyme-labeled antibodies, and includes direct methods and indirect methods.
  • a preferred example is a sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • Sandwich ELISA uses two or more types of antibodies with different antigen recognition sites, one of which is immobilized on a solid phase in advance, and the antigen to be detected is sandwiched between the two types of antibodies. It is a method of measuring by forming.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) reacts an antigen in a specimen with an antibody immobilized on a magnetic particle or bead, and then reacts with an enzyme-labeled antibody, followed by washing (B / F separation). ) Thereafter, a chemiluminescent substrate is added, and after the enzyme reaction, the luminescence intensity is measured. For example, an antigen-biotin-bound antibody in a specimen is reacted in a liquid phase, the antibody is trapped on magnetic particles bound with streptavidin, washed (B / F separation), reacted with an enzyme-labeled antibody, You may perform the process similar to the above.
  • alkaline phosphatase ALP
  • CDP-Star TM TM
  • AMPPD® AMPPD®
  • CSPD® CSPD®
  • the labeling enzyme is HRP
  • luminol is preferably used as the chemiluminescent substrate.
  • the detection sensitivity is generally said to be higher in the order of chemiluminescence> fluorescence> absorption (coloration), and the measurement method can be selected according to the required sensitivity.
  • chemiluminescent immunoassay CLIA
  • the antigen in the sample is reacted with the antibody immobilized on the magnetic particles, and then the antibody labeled with the chemiluminescent substance is reacted, followed by washing (B / F separation). Then, it is a method of measuring luminescence intensity.
  • Acridinium or the like is used as the labeling substance.
  • Fluorescent enzyme immunoassay is a method of reacting an antigen in a specimen with an immobilized antibody, then reacting with an enzyme-labeled antibody, washing (B / F separation), and adding a fluorescent substrate. In this method, the fluorescence intensity is measured after the enzyme reaction.
  • a labeling enzyme HRP, ALP, or the like is used.
  • the fluorescent substrate Amplex (R) Red or the like is used when the labeling enzyme is HRP, and 4-MUP (4-Methyllumphenylphenyl phosphate), AttoPhos (R) or the like is used when the labeling enzyme is ALP. preferable.
  • Electrochemiluminescence immunoassay is a method of reacting an antigen in a specimen with an antibody immobilized on a magnetic particle and an antibody labeled with an electrochemiluminescent substance, followed by washing (B / F separation). This is a method for measuring the emission intensity by electric energy. Ruthenium or the like is used as the labeling substance. Ru (bpy) 3 or the like is used as the labeling substance, and excitation light emission is repeated by oxidation due to charging of the electrode and reduction reaction by tripropylamine (TPA) or the like.
  • TPA tripropylamine
  • Radioimmunoassay is a measurement method using a label with a radioisotope. For example, after reacting an antigen in a specimen with an antibody immobilized on a bead or the like, a radioisotope (RIA) The antibody labeled with 125I and the like is reacted, and after washing (B / F separation), the radiation dose of 125I can be measured.
  • Immunochromatography is an immunoassay method that applies capillary action in which a specimen moves while dissolving a reagent on a test strip.
  • the antigen in the specimen forms an immune complex with the labeled antibody and the capture antibody on the test strip, and the color of the label is confirmed.
  • colloidal gold, an enzyme, a fluorescent substance, or the like is used for labeling the antibody. If an enzyme-labeled antibody is used, an enzyme substrate is placed on the test strip and colored.
  • the flow-through method is a method in which an antigen as a test substance forms an antibody-antigen-antibody complex together with a solution in a specimen on a membrane that is an insoluble carrier. At this time, the substances not fixed to the membrane are usually removed vertically from the front and back of the membrane.
  • the agglutination method is a method of observing agglutination by reacting an antigen in a specimen with an antibody in a reagent. Examples include a method that does not use a solid phase, a particle agglutination (PA) using particles artificially produced as a solid phase, and a latex agglutination (latex agglutination: LA) using latex particles among PAs. .
  • PA particle agglutination
  • LA latex agglutination
  • an antibody is bound to a solid phase, a test sample and a certain amount of labeled antigen are reacted simultaneously, and the amount of antigen in the sample can be measured from the amount of bound label.
  • the antibody or fragment of the present invention described in the first aspect is preferably used in the above-described measurement method.
  • the specimen used for preceptin measurement is not particularly limited, but an aqueous specimen is preferable, for example, blood (whole blood, plasma, serum, etc.), urine, tissue fluid, lymph fluid, joint fluid, milk, cerebrospinal fluid, pus, saliva Body fluids such as tears, mucus, runny nose, sputum, ascites, irrigation water, semen, nasal cavity, bronchi, lung, skin, abdominal cavity, various organs, joints, bones, etc. Examples thereof include a clean or column eluate. These samples are used as they are or after dilution or extraction with various buffers and the like, and are concentrated.
  • a whole blood sample may be collected by an EDTA blood collection tube or a heparin blood collection tube.
  • a whole blood sample is collected in an EDTA blood collection tube and analyzed within 6 hours, or a whole blood sample is collected in a heparin blood collection tube and analyzed within 4 hours.
  • Kit for measuring sCD14-ST A third aspect of the present invention is a kit for measuring presepsin comprising the antibody of the first aspect or an antigen-binding antibody fragment thereof as an essential component.
  • the measurement kit of the present invention preferably contains an auxiliary reagent for measuring presepsin.
  • auxiliary reagents include primary antibodies, secondary antibodies, labeled antibodies, labeled enzymes, labeling substances such as gold colloid, chromogenic substrates, fluorescent substrates (Amplex (R) Red, AttoPhos (R), 4-MUP, etc.), Examples include chemiluminescent substrates (luminol, CDP-Star TM , AMPPD (R), CSPD (R), etc.), specific binding substances such as biotin-streptavidin, insoluble carriers, blocking agents, diluents, washing solutions, standard substances, etc. However, it is not limited to these.
  • the primary antibody is preferably an antibody that binds to preceptin, and more preferably an antibody that recognizes an epitope different from the antibody of the present invention. Examples thereof include the F1106-13-3 antibody and the F1031-8-3 antibody described in Example 3 of WO2004 / 044005.
  • Either the antibody of the present invention or the primary antibody may be used as a labeled antibody.
  • a labeled secondary antibody may be used.
  • insoluble carriers include magnetic particles, beads, glass, cellulose, nitrocellulose, porous synthetic polymers, glass fibers, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene, plastic plates, latex particles, non-woven fabric, filter paper, and the like. Can be mentioned.
  • enzymes such as peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), ⁇ -galactosidase, colloidal gold and the like are preferably used, but are not limited thereto.
  • examples of the chromogenic substrate include 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), o-phenylenediamine (OPD), and the like.
  • TMB 5,5′-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • examples of the chromogenic substrate in the case of using ⁇ -galactosidase include o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (o-Nitrophenyl - ⁇ -D-Galactopyranoside: ONPD).
  • a measurement kit for the sandwich ELISA method may contain the antibody of the present invention and a primary antibody (any antibody may be enzyme-labeled), a chromogenic substrate, a diluent, a standard substance, and the like.
  • a labeled secondary antibody may be contained.
  • a measurement kit for chemiluminescent enzyme immunoassay can contain, for example, an antibody immobilized on magnetic particles, an enzyme-labeled antibody, a chemiluminescent substrate, a diluent, a washing solution, and the like.
  • a fluorescent enzyme immunoassay (FEIA) measurement kit can contain, for example, an antibody immobilized on magnetic particles, an enzyme-labeled antibody, a fluorescent substrate, a diluent, a washing solution, and the like.
  • the measurement kit for electrochemiluminescence immunoassay can contain, for example, biotinylated antibody, Ru (bpy) 3-labeled antibody, streptavidin-coated magnetic particles, tripropylamine and the like.
  • the measurement kit by immunochromatography is a test strip provided with a sample addition part, a reagent part, a detection part, and an absorption part so that the liquid sample added to the test addition part moves in the above order.
  • an insoluble carrier in which the second antibody labeled is impregnated in the reagent part and the first antibody is bound to the detection part can be installed.
  • the test strip is exemplified by using a porous carrier or the like.
  • the porous carrier include nitrocellulose, cellulose, cellulose derivatives, nylon, nylon fibers, glass fibers, and porous synthetic polymers.
  • the absorption part include an absorption polymer such as a sponge of a water-absorbing material, cellulose filter paper, filter paper, and the like.
  • the kit for measuring presepsin according to the third aspect of the present invention is a kit for detecting sepsis or detecting or diagnosing sepsis. It may be a kit for assisting.
  • the presepsin measurement kit according to the third aspect of the present invention can be used as a sepsis diagnostic agent or an auxiliary agent for sepsis diagnosis.
  • the preceptin measurement kit is used for the detection of such sepsis, etc.
  • the subject is measured when the preceptin concentration in the subject's sample measured using the antibody of the present invention is higher than the cut-off value. It can be determined that there is a possibility of sepsis, and detection or diagnosis can be assisted.
  • the cut-off value is 314 to 600 pg / mL, preferably 400 to 580 pg / mL, more preferably 450 to 550 pg / mL, and still more preferably 500 pg / mL.
  • Presepsin measurement kits for example, distinguish between sepsis and systemic inflammatory response syndrome (SIRS), risk assessment of severe sepsis, prognosis of sepsis (predict mortality), severe sepsis Assessment, detection of postoperative infection, detection of disseminated intravascular coagulation (DIC), detection of infectious DIC, detection of heart disease, detection of respiratory infection with bacterial infection, inflammatory Selected from detection of bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis), detection of febrile neutropenia (FN), detection of hemophagocytic syndrome (HPS), and functional evaluation of phagocytes It can be used for the detection or evaluation of at least one disease.
  • the kit for measuring presepsin may be a kit for detecting or evaluating at least one disease described above.
  • polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to the first aspect As a fourth aspect of the present invention, the amino acid sequence of the antibody or antigen-binding antibody fragment thereof according to the first aspect of the present invention is encoded.
  • a polynucleotide or nucleic acid is provided.
  • the polynucleotide includes DNA (genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, etc.) and RNA (mRNA, etc.).
  • a polynucleotide may be single-stranded (coding or antisense) or double-stranded.
  • mRNA can be extracted from a hybridoma producing the antibody of the present invention, and cDNA can be synthesized.
  • the target gene may be amplified by PCR or the like.
  • the antibody of the present invention is required to have at least 80% identity to the base sequence encoding the variable region heavy chain or light chain.
  • the CDR sequence also needs to have at least 80% identity to the base sequence encoding the entire antibody CDR (VH CDR1 to 3 and VL CDR1 to 3). From the viewpoint of detection sensitivity, these are 85% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, 96% or more identity, 97% or more identity, 98% or more identity Alternatively, 99% or more identity may be shown.
  • the antibody of the present invention also includes an antibody encoded by a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a complementary chain of the nucleotide sequence encoding the variable region heavy chain or light chain. Is done.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method according thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).
  • Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Typical stringent conditions include, for example, conditions for performing hybridization in a potassium concentration of about 25 mM to about 50 mM and a magnesium concentration of about 1.0 mM to about 5.0 mM. Those skilled in the art can easily select such conditions by changing the hybridization reaction, the salt concentration of the hybridization reaction solution, and the like.
  • a recombinant vector containing the polynucleotide according to the fourth aspect is a vector into which a polynucleotide encoding the amino acid of the antibody or antibody-binding antibody fragment of the present invention is introduced.
  • the vector is preferably a vector and / or an expression vector that is compatible with the expression of the antibody gene described in the first aspect, and can be prepared using techniques that can be used by those skilled in the art.
  • Cells producing the antibody or antigen-binding antibody fragment according to the first aspect As a sixth aspect of the present invention, a cell producing the first antibody of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof is provided. Examples of such cells include hybridomas, transformed strains, or genetically modified cells into which the gene of the antibody of the present invention has been introduced.
  • hybridomas that produce antibodies include the clones shown in Example 1.
  • the transformed strain is, for example, a polynucleotide that encodes the amino acid of the antibody of the present invention or the antibody-binding antibody fragment thereof described above in the host cell (for example, COS-1 cell, CHO cell, etc.) described in the first aspect. It can be obtained by introducing a vector into which a nucleotide has been introduced.
  • the method for preparing hybridomas and transformed strains is as described in the first aspect.
  • the seventh aspect of the present invention is a transformation comprising a vector into which a nucleotide encoding the antibody of the first aspect or an antigen-binding antibody fragment thereof is introduced.
  • the antibody or antigen-binding antibody fragment of the first aspect is produced, and the antibody or antigen-binding antibody fragment is collected from the culture. Details are as described in the first embodiment.
  • the eighth aspect of the present invention is an antibody screening method for obtaining an anti-preceptin antibody useful for measuring preceptin in a sample, comprising at least the following steps.
  • a process for constructing a preceptin measurement system using candidate antibodies The step of determining the effect of the TG concentration in the specimen on the preceptin measurement value using the measurement system. That is, this method is characterized in that a TG interference test is performed in a measurement system using an antibody.
  • a method for obtaining a candidate antibody preferably, an anti-preceptin antibody
  • the presepsin measurement system is not particularly limited as long as it is a measurement system that measures the preceptin value of the specimen.
  • the measurement system described in the second embodiment can be used, and for example, a sandwich ELISA can be used.
  • the step of determining the effect of the TG concentration in the sample on the preceptin measurement value is, for example, comparing the preceptin measurement value of the sample without TG and the preceptin measurement value when a certain amount of TG is added to the sample,
  • the effect can be determined from the dissociation of both measurements.
  • the degree of dissociation of the preceptin measurement value when a TG interference test is performed using a plurality of samples and the TG concentration in the sample is 20 mg / mL with respect to the preceptin measurement value when TG is not added.
  • the ratio of specimens showing ⁇ 20% or less, more preferably ⁇ 10% or less is high, it may be determined that the effect of TG in the specimen on the preceptin measurement value is small, and the antibody is less susceptible to TG interference. It may be determined that the antibody is useful for preceptin measurement.
  • evaluation may be performed by performing a TG interference test between the candidate antibody and the S68 antibody and comparing the degree of dissociation.
  • the dissociation of the presepsin measurement value when the TG interference test is performed using the candidate antibody is similar to the dissociation degree of the S68 antibody under the same conditions, the antibody is used for the measurement of preceptin in the specimen. It can be determined to be a useful antibody.
  • a TG interference test is performed using a plurality of specimens, and in a measurement system using candidate antibodies, the degree of dissociation when the TG concentration in the specimen is 20 mg / mL by adding TG, and S68
  • the difference in the degree of dissociation is determined from the degree of dissociation under the same conditions in the measurement system using an antibody, and the difference in the degree of dissociation is 20% or less, preferably 10% or less
  • the antibody is a sample It may be determined that the antibody is useful for measuring presepsin.
  • the screening method of the present invention may optionally include a step of determining the binding activity between the candidate antibody and the S68 peptide or preceptin.
  • the screening method of the present invention may optionally include a step of measuring a specimen of a normal person and a sepsis patient by a preceptin measurement system using a candidate antibody, and comparing a difference in measured values. These can be carried out as described in Example 1.
  • One preferred embodiment of the screening method is a method comprising at least the following steps. 1) Step of obtaining a candidate anti-preceptin antibody, and 2) When a preceptin measurement system is constructed using the candidate antibody and the TG concentration in the sample is 20 mg / mL by adding TG, the degree of dissociation of the measured value of preceptin A step of selecting the antibody having a specimen ratio of 50% or more, wherein is 20% or less.
  • the TG concentration in the specimen here 20 mg / mL
  • the dissociation degree of the preceptin measurement value here ⁇ 20%
  • the specimen ratio can be changed as appropriate. Further, the step 2) can be carried out even if it is replaced with another TG interference test and / or evaluation method described in the first aspect of the present invention.
  • another preferred aspect is the antibody screening method of the present invention comprising at least the following steps. 1) a step of obtaining a candidate anti-preceptin antibody, and 2) a step of selecting the antibody that specifically recognizes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an epitope among the sequences of preceptin.
  • the step 2) is not particularly limited, but the epitope determination method and the like described in the first aspect of the present invention can be used.
  • 2) may be the following steps. 2) In the reaction system (absorbance) in which the amino acid residue consisting of SEQ ID NO: 1 is competitively reacted so that the binding between the antibody and preceptin is blocked, the binding between the antibody and preceptin is blocked by 50% or more. Selecting the antibody.
  • the method of determining the epitope may optionally include the following step 3).
  • another preferred aspect is the antibody screening method of the present invention comprising at least the following steps. 1) obtaining a candidate anti-preceptin antibody; and 2) The antibody having a correlation coefficient between a preceptin measurement value in a sample obtained using the candidate antibody and a preceptin measurement value in the sample obtained using the S68 antibody is 0.9 or more. Process to select.
  • the method can be carried out according to the description of the first aspect of the present invention and Example 5.
  • the correlation coefficient can also be changed as appropriate.
  • another preferred aspect is the antibody screening method of the present invention comprising at least the following steps. 1) obtaining a candidate anti-preceptin antibody, and 2) selecting an antibody that binds to preceptin with an affinity (equilibrium dissociation constant, KD value) of less than 10 ⁇ 8 M.
  • the step 2) may be replaced with the following steps. 2) A step of selecting an antibody in which the binding activity of the antibody to preceptin is superior to the binding activity of the S68 antibody to preceptin.
  • Measurement of affinity (equilibrium dissociation constant, KD value) and binding activity can be performed according to the description of the first aspect of the present invention.
  • the binding activity may be evaluated by the absorbance ratio.
  • the ratio of the absorbance when the antibody of the present invention is reacted with preceptin, when the absorbance when the S68 antibody is reacted with preceptin is 1, is 2 or more.
  • a method for screening an anti-preceptin antibody comprising at least the following steps: 1) Step of obtaining a candidate anti-preceptin antibody 2) In a reaction system (absorbance) in which the amino acid residue consisting of SEQ ID NO: 1 is competitively reacted so that the binding between the antibody and preceptin is blocked, the antibody and preceptin Selecting said antibody that is competitively inhibited from binding by 50%, and 3) A step of selecting an antibody in which the binding activity of the antibody to preceptin is superior to that of S68 antibody to preceptin.
  • a ninth aspect of the present invention relates to a subject who has been subjected to a method for assisting the detection of sepsis using the antibody or antigen-binding antibody fragment of the first aspect of the present invention. This is a method for treating a septic patient.
  • the method for assisting in the detection of sepsis is as described in the second aspect of the present invention.
  • the treatment for sepsis is not particularly limited, and examples thereof include administration of antibacterial drugs and steroids, pressor agents, fluid replacement, oxygen administration, artificial respiration management, continuous hemofiltration dialysis, and plasma exchange.
  • the tenth aspect of the present invention is a test drug using the antibody of the first aspect of the present invention or an antigen-binding antibody fragment thereof, or the kit of the third aspect.
  • a screening method for a test drug (or therapeutic drug) comprising a step of determining a preceptin concentration in a sample of a subject to whom (or a therapeutic drug) is administered.
  • the disease targeted by the test drug is not particularly limited as long as the preceptin concentration in the sample of the subject increases.
  • the preceptin concentration in the subject's specimen is compared before and after administration of the test drug to determine whether the preceptin concentration after administration of the test drug is lower than before administration. Or you may determine whether the presepsin density
  • test drug is a screening method for a test drug including the following steps. 1) A step of determining a preceptin concentration in a sample of a subject to whom a test drug is administered
  • rsCD14ST-Fc has a structure comprising the sequence from positions 1 to 64 of SEQ ID NO: 3 (human full-length soluble CD14) and the Fc region of the antibody heavy chain.
  • SEQ ID NO: 3 human full-length soluble CD14
  • Fc region of the antibody heavy chain For example, as described in Example 9- (2), the production of rsCD14ST-Fc is carried out by using a sequence having a thrombin recognition sequence downstream of the sequence from positions 1 to 64 of human sCD14 and a human-derived IgG1 antibody heavy chain.
  • a transient expression plasmid that expresses rsCD14ST-Fc having the sequence of Fc region is transfected into a host cell such as COS-1 cells, the host cell is cultured, and the obtained culture supernatant is It can be obtained by collecting and purifying.
  • a sequence that facilitates cleavage is inserted between the sequence from position 1 to position 64 of human sCD14 and Fc.
  • thrombin recognition sequence for example, Factor Xa recognition sequence PreScission-Protease recognition sequence or the like may be used. It is not essential that rsCD14ST-Fc have a sequence that facilitates cleavage.
  • any antibody Fc region can be used besides human-derived IgG1 antibody.
  • the host cell is not particularly limited.
  • rsCD14ST-Fc is obtained by culturing host cells such as COS-1 cells, it is easy to express, and Fc specifically binds to protein A, and a protein A column can be used for purification. Therefore, it has a manufacturing advantage that purification is easy.
  • Purification after cleaving the Fc region can be performed using a conventional method in addition to the protein A column. For example, the purification may be performed using the method described in Example 13 of WO2005 / 108429.
  • RsCD14ST-Fc can be used as rsCD14-ST by cleaving the Fc region, or can be used as rsCD14ST-Fc without cleaving the Fc region, both of which specifically bind to the anti-preceptin antibody.
  • the same thrombin sequence as that used in the preparation of the rsCD14-ST standard product is inserted between rsCD14ST and Fc.
  • the rsCD14ST obtained by cleaving the Fc region with thrombin has the same sequence as the rsCD14ST standard product and has equivalent characteristics (see WO2005 / 108429).
  • rsCD14 In preparation of rsCD14 from rsCD14ST-Fc, only Fc can be easily removed by passing through a protein A column after cleavage of the Fc region, and preparation is also easy.
  • the means for cleaving the Fc region of rsCD14ST-Fc can be appropriately selected according to the sequence that facilitates the inserted cleavage.
  • RsCD14ST-Fc can be used as an antigen because it has the activity of rsCD14-ST even if it remains rsCD14ST-Fc without cleaving the Fc region.
  • a conventional rsCD14-ST standard product is obtained by expressing rsCD14 in which a thrombin recognition site is inserted between positions 64 and 65 of human sCD14 in a host cell and cleaving it at the thrombin recognition site.
  • rsCD14 contains rsCD14-ST, it shows almost no reactivity as rsCD14-ST as it is, and after cleavage and purification, the activity of rsCD14-ST is obtained and can be used.
  • rsCD14ST-Fc can be used in the same manner as rsCD14-ST without cutting the Fc region.
  • Example 1 Production of monoclonal antibody using synthetic peptide as antigen 1-
  • Immunization of Rabbit According to the method described in Example 1 of WO2004 / 044005, administration of an antigen for administration and immunization of a rabbit were performed. That is, a peptide in which a cysteine was inserted at the N-terminus of a peptide (hereinafter referred to as S68 peptide) consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 (corresponding to the sequence from position 53 to position 68 shown in SEQ ID NO: 3) was prepared. KLH (PIERCE) was bound to this peptide to obtain an administration antigen (hereinafter referred to as S68 peptide-KLH).
  • S68 peptide-KLH (100 ⁇ g) was mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant (DIFCO) and then administered into the back skin of a New Zealand white rabbit (3 months old). Two weeks later and one week later, 100 ⁇ g of S68 peptide-KLH was mixed with an equal amount of Freund's incomplete adjuvant (DIFCO) and then administered intradermally. Two more times, S68 peptide-KLH 20 ⁇ g was administered into the ear vein.
  • DIFCO Freund's complete adjuvant
  • a preceptin standard product (rsCD14-ST described in Example 16 of WO2005 / 108429) was diluted with a diluent (0.1% BSA / D-PBS) to prepare a 3 ng / mL standard solution.
  • An antiserum dilution series was added to the plate, followed by 3 ng / mL standard solution.
  • the plate was allowed to react for 1 hour, and the plate was subsequently washed 5 times with saline containing 0.05% Tween20.
  • 100 ⁇ L of a diluted solution of anti-rabbit Igs-HRP (DAKO, P448) was added and reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • BioFix tetramethylbenzidine solution
  • 1M sulfuric acid solution Absorbance at 450/650 nm was measured with Multiskan JX (Thermolab Systems). Based on the results of absorbance measurement, individuals with high antibody titers were selected.
  • S68 peptide-KLH 400 ⁇ g was administered into the ear vein, the spleen was collected aseptically, and lymphocytes were collected.
  • the resulting culture supernatant of 286 clones was confirmed for binding activity with the administered antigen using S68 peptide-BSA, and 72 clones with confirmed binding activity were selected.
  • the 72 clones confirmed to have the binding activity with the administered antigen were confirmed for the binding activity with the preceptin standard product by the sandwich ELISA system similar to 1- (1), and the clone with the confirmed binding activity was selected.
  • a rabbit monoclonal antibody was prepared using the prepared rabbit anti-preceptin monoclonal antibody-producing hybridoma. That is, a frozen ampoule was thawed according to a conventional method, cultured in RPMI 1640 (Sigma) containing 10% fetal bovine serum and 8% supplement A (Abcam), and then the cells were recovered and IS-MAB-CD was collected according to the protocol of CELLine (Integra Bioscience). The culture supernatant containing the antibody was collected by culturing in a medium (Irvine). Next, the antibody was purified from the obtained culture supernatant using rmp-Protein A Sepharose FF (GE Healthcare).
  • the eluate containing the purified antibody was concentrated and subsequently dialyzed against D-PBS (pH 7.4).
  • the antibody protein concentration was determined by the Bradford method using bovine IgG (BioRad) as a standard.
  • a single band having a molecular weight of about 150 kDa was confirmed, and by reduction, a heavy chain of about 50 kDa and a light chain of about 25 kDa were confirmed.
  • Example 2 Production of recombinant antibody 2- (1) Determination of variable region amino acid sequence of rabbit monoclonal antibody and construction of expression plasmid Total RNA was extracted from each hybridoma obtained in Example 1 using RNeasy Mini Kit (Qiagen), and SuperScript VILO Single-stranded cDNA was synthesized using cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). PCR by Rabbit Ig-Primer Set (Rader C, et al. JBC 2000; 275: 13668-76, and Lang I, et al. Gene 1996; 172: 295-8) using the obtained single-stranded cDNA as a template The variable regions were amplified by the following procedures, and the base sequences of the variable regions of the heavy chain and the light chain were determined according to a conventional method.
  • the sequence information other than the variable region was searched on the database, and the 5 'side primer and 3' side primer were designed. PCR is carried out using these primers to amplify the full length of the heavy chain and the full length of the light chain, respectively, to pTK-2433, which is a vector for transient expression in mammalian cells and has the EF-1 ⁇ promoter and CMV enhancer. Cloned. According to a conventional method, the base sequences of the full length of the heavy chain and the full length of the light chain and the amino acid sequence encoded by them were determined. Tables 10 and 11 show the amino acid sequences of the CDR portions of the antibody variable region.
  • transient expression plasmids expression plasmid containing heavy chain sequence and expression plasmid containing light chain sequence
  • 2- (1) above COS-1 cells (ATCC: CRL-1650) were transfected.
  • 2 ⁇ L / mL transfection reagent and 4 ⁇ g / mL plasmid were mixed, added to the medium, added to COS-1 cells, and cultured at 37 ° C.
  • the culture supernatant was collected, and new medium was added.
  • the culture supernatant was collected, mixed twice, and filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Sterivac, Millipore).
  • the obtained culture supernatant was purified according to the method described in 1- (4) above and analyzed by SDS-PAGE. As a result, a single-band recombinant antibody of about 150 kDa was confirmed.
  • Example 3 Preparation of Antibody Using CHO Cells 3- (1) Preparation of Rabbit Monoclonal Antibody Recombinant Antibody-Producing CHO Cells
  • the DHFR gene-deficient CHO cells (CHO DXB11) were constructed according to 2- (3) above. A plasmid for expression was transfected, and a rabbit antibody-producing transformed CHO strain was established. That is, in EX-CELL 302 PF CHO (JRH Bioscience) containing HT media Supplement (50 ⁇ ) Hybrid-Max (Sigma; used at a final concentration of 1 ⁇ ) and 200 mM L-Glutamine (Sigma; used at a final concentration of 4 mM).
  • Conditioned cultured CHO DXB11 was centrifuged on the day of transfection, and then implanted into a flask at a concentration of 8 ⁇ 10 6 cells / 150 cm 2 Roux. Using 125 ⁇ l of FuGENE6 (Promega), 12.5 ⁇ g of the expression plasmid was prepared according to the protocol attached to FuGENE6, and introduced into the above CHO DXB11. After culturing at 37 ° C. for 2 days at 5% CO 2 , the cells were collected and washed twice with HT-free EX-CELL 302 PF CHO medium containing 4 mM L-Glutamine (hereinafter referred to as EX-CELL (HT-)).
  • EX-CELL HT-
  • EX-CELL resuspended in EX-CELL (HT-).
  • HT- EX-CELL
  • the antibodies in the culture supernatant of CHO cells were screened by ELISA using S68 peptide antigen as a solid phase, and 5 types of CHO cells producing antibodies that bind to S68 peptide were selected.
  • Example 4 Reactivity evaluation of each antibody in sandwich ELISA system
  • the plate was washed 5 times with ion-exchanged water, and 200 ⁇ L of PBS containing 0.1% StabilGuard (SurModics, Inc) and 0.1% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries) was added to each well for blocking.
  • PBS containing 0.1% StabilGuard (SurModics, Inc) and 0.1% Tween20 (Wako Pure Chemical Industries) was added to each well for blocking.
  • the preceptin standard product was diluted to 1000 ng / mL with a diluent and subsequently diluted with a common ratio of 3 to prepare a dilution series of standard products. 50 ⁇ L of a standard dilution series was added per well and reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed 5 times with physiological saline containing 0.05% Tween 20, and 50 ⁇ L of peroxidase-labeled F1106-13-3 antibody diluted to 0.25 ⁇ g / mL was added to each well. After reacting at 25 ° C. for 2 hours, the plate was washed five times in the same manner, and a TMB solution was added to each well. After the reaction at room temperature for 20 minutes, the reaction was stopped with a 0.5 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450 nm (subwavelength 650 nm) was measured with a plate spectrophotometer (Molecular Devices).
  • Table 12 shows the measurement results. All the measurement systems using each rabbit monoclonal antibody prepared in Example 2 were excellent in reactivity with the preceptin standard product, and showed almost the same reactivity as the measurement system using the S68 antibody.
  • the measurement system using F1146-17-2 had low reactivity, and the absorbance when the preceptin concentration was 1000 ng / mL was 0.368. This absorbance was almost equal to the absorbance when the preceptin concentration was 0.03 to 0.1 ng / mL in the measurement system using the rabbit monoclonal antibody. From this, it was revealed that the measurement system using the rabbit monoclonal antibody improved the reactivity about 10,000 times compared to the measurement system using F1146-17-2. Since the concentration of presepsin in normal human specimens is usually about 50 to 300 pg / mL, it was shown that measurement was impossible with the measurement system using F1146-17-2.
  • Example 5 Measurement of patient specimen and interference test Using each antibody prepared in Example 2, the sandwich ELISA system described in Example 4 was used to measure blood preceptin levels in 30 specimens of septic patients. Correlation analysis with the measured value by sandwich ELISA system using S68 antibody was performed.
  • blood interference substances (bilirubin F, bilirubin C, hemoglobin, rheumatoid factor, and triglyceride) give the preceptin measurement value.
  • the impact was examined. Measurement of preceptin concentration by adding stepwise concentrations of each interfering substance to the serum of a healthy person with a certain amount of preceptin added, and measuring the effect of each interfering substance on the measured value when no interfering substance is added The value was evaluated based on the standard.
  • triglyceride affected the measurement system using some antibodies.
  • the TG interference test was performed as follows. The specimen used was normal human serum supplemented with a certain amount of preceptin. Using Intralipid infusion 20% (Fresenius), diluted samples were prepared stepwise to a TG concentration of 20 mg / mL in the specimen. This TG concentration does not take into account the TG originally contained in the serum of the specimen. The diluted sample was diluted 20 times with the specimen diluent, and the preceptin value was measured by ELISA. This TG interference test was performed on a plurality of specimens.
  • the dissociation degree of the measured value of preceptin when the TG concentration in the specimen was 20 mg / mL was obtained for a plurality of specimens, and the average value of the degree of dissociation was calculated for each antibody. As a result, it was a measurement system using the S68 antibody, F1466-5, and F1466-26 that showed an average value of the degree of dissociation of ⁇ 20% or less.
  • the degree of dissociation of the preceptin measured value by the addition of TG was compared between the assay system using each rabbit monoclonal antibody and the assay system using the S68 antibody. Then, when the TG concentration in the specimen is 20 mg / mL by adding TG, the difference between the dissociation degree of the measurement system of F1466-12 and the dissociation degree of the measurement system of the S68 antibody, and the dissociation degree of the measurement system of F1466-19 The difference in the degree of dissociation between the measurement system for the S68 antibody and the S68 antibody was high in the proportion of specimens showing a difference of more than 20%.
  • Example 6 Specificity of antibody Epitope analysis Analysis of epitope of each rabbit monoclonal antibody and F1146-17-2 (monoclonal antibody obtained by immunizing rat with S68 peptide) prepared in Example 2 Went.
  • peptides consisting of 10 amino acids including a partial fragment of the peptide sequence of SEQ ID NO: 2 as the administration antigen in Example 1 (see Table 13) were synthesized with the preceptin standard product by sandwich ELISA system described in Example 4. The epitope sequence was examined by looking at the competitive inhibition reaction. That is, according to the method described in Example 4, an immobilized plate for each antibody was prepared. Next, 400 pg / mL of preceptin standard product and 20 ⁇ g / mL of the synthetic peptides (P01 to P08) shown in Table 13 were added to each 25 ⁇ L plate and allowed to react.
  • preceptin has a performance suitable for preceptin measurement and the relationship between the epitope recognized by the antibody.
  • preceptin has an amino acid sequence in which the C-terminal portion of the high molecular weight sCD14 is largely deleted, and the amino acid length is assumed to vary. The possibility that the difference in the specificity of the antibody affected the correlation with the measured value using the S68 antibody in Example 5 was also considered.
  • Example 7 Detailed analysis of epitope Reactivity of a rabbit monoclonal antibody recognizing the P03 peptide with a peptide obtained by modifying the P03 peptide by one amino acid was examined.
  • the amino acids at positions 53 to 61 are each alanine (original amino acid).
  • A is alanine
  • a peptide (P031 to P039 peptide) substituted with glycine was prepared, and the reactivity of the P031 to P039 peptide and the antibody was confirmed by sandwich ELISA as described in Example 4.
  • amino acids at positions 53 to 58 of SEQ ID NO: 3 are alanine ( Alternatively, the binding activity to the antibody was maintained even after substitution with glycine.
  • an antibody that recognizes the P03 peptide as an epitope is also a peptide in which the amino acids at positions 53 to 58, 60 and 61 in SEQ ID NO: 3 in the P03 peptide are substituted with alanine (or glycine) one amino acid at a time. It was confirmed that it was recognized as an epitope.
  • Example 8 Production of a modified variant of a rabbit-derived anti-preceptin monoclonal antibody A modified product was produced based on the sequence of the anti-preceptin monoclonal antibody obtained from the rabbit described in Example 1.
  • a plasmid for heavy chain variant was prepared as follows. Although the plasmid pTK-5793 is shown, other plasmids were constructed in the same manner. Using the heavy chain transient expression plasmid (pTK-5605) containing the full length of F1466-26 obtained in Example 2 as a template, a primer pair (rabbit IgG (14-12) -e: 3 ′ primer And Aor13HI-rabbit IgV2: 5 ′ primer). Further, PCR was carried out with a primer pair (rabbit IgG (14-12) -e, Aor13HI-rabbit IgV2) using the obtained amplified fragment as a template.
  • the obtained amplified fragment was cloned into plasmid pT7-Blue, and a fragment containing the target sequence was prepared with restriction enzyme Aor13HI.
  • pTK-4273 in-house
  • a vector fragment was prepared by digestion with the enzyme Aor13HI.
  • the prepared fragment containing the target sequence was cloned into a vector fragment to prepare pTK-5793.
  • plasmid for light chain variant preparation was prepared as follows. Although the plasmid pTK-5844 is shown, other plasmids were constructed in the same manner. Using the plasmid for light chain transient expression (pTK-5608) containing the full-length light chain of F1466-26 obtained in Example 2 as a template, a primer pair (pEF2ce-28: 3 ′ primer and pEF2ce-49: 5 PCR was performed with the 'side primer'. Furthermore, PCR was performed with a primer pair (pEF2ce-28, pEF2ce-49) using the obtained amplified fragment as a template.
  • the obtained amplified fragment was cloned into plasmid pT7-Blue, and a fragment containing the target sequence was prepared using restriction enzymes BamHI and XbaI.
  • pTK-2433 in-house
  • a vector for transient expression in mammalian cells was cleaved with restriction enzymes BamHI and XbaI to prepare a vector fragment.
  • the prepared fragment containing the target sequence was cloned into a vector fragment to prepare pTK-5844.
  • transfection reagent 0.96 ⁇ L / 25 ⁇ L of transfection reagent and 0.48 ⁇ g / 25 ⁇ L of transfection reagent were prepared and mixed with Opti-MEM (registered trademark) Reduced Serum Medium (manufactured by Life Technologies), and added to the medium. COS-1 cells were added and cultured at 37 ° C. After 72 hours, the culture supernatant was collected.
  • Opti-MEM registered trademark
  • Reduced Serum Medium manufactured by Life Technologies
  • each heavy chain variant preparation plasmid was mixed with a light chain transient expression plasmid (pTK-5608).
  • Each light chain variant preparation plasmid was used by mixing with a heavy chain transient expression plasmid (pTK-5605).
  • a variant containing the full length of the heavy chain of the F1466-26 antibody and the full length of the light chain of the F1466-5 antibody is obtained by mixing pTK-5605 with a light chain transient expression plasmid containing the full length of the light chain of F1466-5.
  • Example 9 Evaluation of variant (1)
  • 16 types of variants (IgG antibodies) obtained by expression in COS-1 cells were purified, and the reactivity, specificity, and affinity (KD value) of each antibody with preceptin were evaluated.
  • pTK356H (TB64) (plasmid having a sequence encoding rsCD14 described in Example 13 of WO2005 / 108429) was used as a template, and a primer pair (hCD14-a , HCD14-d) and Taq enzyme (Takara Bio).
  • the obtained amplified fragment (having a thrombin recognition sequence downstream of the sequence of positions 1 to 64 of human sCD14 of SEQ ID NO: 3 including the signal sequence and having a restriction enzyme site at both ends) TA cloning into pT7Blue vector (Millipore)
  • the sequence was confirmed and designated pTK-3047.
  • pTK-3053 a fragment obtained by cleaving pTK-3047 with restriction enzymes EcoRI and BamHI was previously converted into pTK-2233 (expression plasmid for mammalian cells having a sequence encoding the Fc region of a human-derived IgG1 antibody heavy chain). And inserted into a vector fragment prepared by cutting with BamHI, and the resulting clone was designated as pTK-3053.
  • a transient expression plasmid pTK-3053 expressing rsCD14ST-Fc was transfected into COS-1 cells (ATCC: CRL-1650). Specifically, 2 ⁇ L / mL transfection reagent and 4 ⁇ g / mL plasmid were mixed, added to the medium, added to COS-1 cells, and cultured at 37 ° C. After 72 hours, the culture supernatant was collected, and new medium was added. After 96 hours, the culture supernatant was collected, mixed twice, and filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Sterivac, Millipore). The obtained culture supernatant was purified using Prosep vA (Millipore).
  • the eluate containing the purified product was concentrated and subsequently dialyzed against D-PBS (pH 7.4).
  • the protein concentration was determined by the Lowry method using BSA (BioRad) as a standard product.
  • BSA BioRad
  • a single band having a molecular weight of about 75 kDa was confirmed.
  • the binding activity of the prepared rsCD14ST-Fc with the anti-preceptin antibody was confirmed by ELISA in which the antigen was immobilized on a solid phase.
  • the solution was diluted with D-PBS to prepare 500 ng / mL. 50 ⁇ L of each dilution was added per well, the plate was allowed to react for 1 hour, and the plate was subsequently washed 5 times with saline containing 0.05% Tween20. Next, a diluted solution of anti-rabbit Igs-HRP (DAKO, P448) was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Similarly, after washing the plate, a TMB solution was added and allowed to react at room temperature for 3-5 minutes. After completion of the reaction, the reaction was stopped with 1M sulfuric acid solution. Absorbance at 450/650 nm was measured with a plate reader (molecular device). The results are shown in Tables 16 to 22 together with the modified CDR sequences of the variants.
  • Table 15 shows the results of the affinity (KD) measurement of S68 antibody, rat-derived monoclonal antibody (F1146-17-2), and F1146-26 to rsCD14ST-FC.
  • F1146-26 (KD value is 1.48E-09) and its affinity with preceptin was about 10 times higher in KD value than S68 antibody (KD value is 1.08E-08). Further, F1146-26 was found to have an affinity (KD value) with preceptin of about 10,000 times higher than that of the rat-derived monoclonal antibody (F1146-17-2: KD value is 1.08E-05).
  • One desirable aspect of the present invention is an antibody in which the affinity of the antibody for preceptin is superior to the affinity of the S68 antibody for preceptin.
  • the variants 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844, 5684 were listed. Further, antibodies exhibiting a KD value of less than 10 ⁇ 8 are also preferable, and examples thereof include F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844, and 5684.
  • antibodies excellent in affinity with presepsin in which the KD value of the antibody shows 1/2 or less of the KD value of the S68 antibody are also preferable, and examples thereof include F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, and 5793. Particularly excellent KD values were 5793 (7.3E-10) and 5810 (6.52E-12).
  • the variant 5684 which combines the full length of F1146-26 and the full length of F1146-5, maintains P03 specificity and preceptin binding activity. Since F1146-26 and F1146-5 are antibodies that recognize the same P03 position as an epitope, it is suggested that the antibody activity may be maintained even if the sequences are replaced between antibodies having the same specificity. It was done.
  • the heavy chain CDR3 sequences of F1146-5 and F1146-26 that recognize P03 as an epitope are both GDFs, and are composed of a relatively short sequence of 3 amino acids. It was considered a characteristic point.
  • the affinity was increased by the third modification of the heavy chain CDR3, suggesting that the third amino acid of the heavy chain CDR3 may affect the activity of the antibody. .
  • the plate was allowed to react for 1 hour at 25 ° C., and the plate was subsequently washed 5 times with saline containing 0.05% Tween20. Next, 50 ⁇ L of a solution diluted with F1106-13-3 F (ab ′) 2-HRP was added to each well and reacted at 25 ° C. for 2 hours. Similarly, after washing the plate 5 times, TMB solution was added and allowed to react at room temperature for 30-40 minutes. After completion of the reaction, the reaction was stopped with 1M sulfuric acid solution. Absorbance at 450/650 nm was measured with a plate reader. As a negative control, no peptide was added (described as PBS), and S68 peptide was used as a positive control. The inhibition rate of each peptide was calculated with the absorbance of PBS as 100%. As a result, as shown in Table 23, it was confirmed that all the variants tested were specifically recognizing the P03 sequence.
  • Example 10 Evaluation of variant (2) Among the variants prepared in Example 8, the variants not evaluated in Example 9 were evaluated for binding activity and specificity for preceptin.
  • Example 8- (4) Measurement of antibody concentration by ELISA
  • the IgG concentration was measured using a sandwich ELISA. That is, an anti-rabbit antibody (DAKO, Z196) was immobilized on a Nunc immunoplate (MAXISORP, C96, 430341) and blocked. A purified rabbit monoclonal antibody was diluted as a standard with a diluent (0.1% BSA / D-PBS) to prepare a standard solution of 100-1.56 ng / mL. Next, the collected culture supernatant was diluted with a diluent (0.1% BSA / D-PBS).
  • a culture supernatant dilution or a standard dilution series was added to the wells, the plate was allowed to react for 1 hour, and then the plate was washed 5 times with physiological saline containing 0.05% Tween20.
  • a diluted solution of anti-rabbit Igs-HRP (DAKO, P399) was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • a tetramethylbenzidine solution TMB, BioFix
  • TMB tetramethylbenzidine solution
  • the reaction was stopped with a 1 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450/650 nm was measured with a plate reader (molecular device).
  • the antibody concentration in each culture supernatant was calculated using a calibration curve in a standard concentration dilution column.
  • the culture supernatant was diluted with D-PBS to prepare 500 ng / mL (the original culture supernatant was used for those with low antibody concentration). 50 ⁇ L of each supernatant dilution was added per well, the plate was allowed to react for 1 hour, and the plate was subsequently washed 5 times with saline containing 0.05% Tween20. Next, a diluted solution of anti-rabbit Igs-HRP (DAKO, P448) was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Similarly, after washing the plate, a TMB solution was added and allowed to react at room temperature for 3-5 minutes. After completion of the reaction, the reaction was stopped with 1M sulfuric acid solution. Absorbance at 450/650 nm was measured with a plate reader (molecular device).
  • the S68 antibody was also evaluated for comparison.
  • the binding activity to preceptin was expressed as the ratio of the absorbance at the time of reaction between each antibody and rsCD14ST-Fc when the absorbance at the time of reaction of S68 antibody and sCD14ST-Fc was 1.
  • the results are shown in Tables 24 to 29 together with the modified sequences of the respective variants.
  • F1466-26 and the variants had an excellent binding activity to preceptin, which was about 4 to 5 times higher in the absorbance ratio than the S68 antibody.
  • the KD value for preceptin of these antibodies was considered to be comparable to the preferred KD value of antibody for preceptin as measured in Example 9.
  • One of the desirable embodiments of the present invention is an antibody in which the binding activity of the antibody to preceptin is superior to that of the S68 antibody.
  • the absorbance when used according to the present example, it is considered that an antibody exhibiting an absorbance of S68 antibody or higher, preferably an antibody exhibiting an absorbance twice or more that of S68 antibody is desirable.
  • antibodies with excellent binding activity whose binding activity to preceptin is 5 times or more that of the S68 antibody are 5934, 5935, 5939, 5944, 5808, 5809, 5824, 5979, 5980.
  • 5979, 5983, 5988, and 5864 showed an absorbance that was 5.5 times or more that of the S68 antibody, and had particularly excellent binding activity to preceptin.
  • Example 11 Preparation of monoclonal antibody using phage display method using synthetic peptide as antigen
  • Example 1- (1) using lymphocytes from the spleen recovered by immunizing rabbits with S68 peptide-KLH as the administration antigen, Monoclonal antibodies can be produced by the display method.
  • a rabbit / human chimeric heavy chain fragment was amplified by PCR to obtain a rabbit light chain variable region (kappa type or lambda type) and human light chain constant region
  • a rabbit / human chimera light chain fragment is amplified using the amplified fragment as a template.
  • a rabbit / human chimeric Fab fragment is finally prepared using the obtained rabbit / human chimeric heavy chain and rabbit / human chimeric light chain fragments as templates.
  • pCDDisplay-4 (Creative Biogene), which is a phagemid for antibody expression, is cleaved with restriction enzymes SacI and SpeI to prepare a phagemid fragment.
  • a rabbit / human chimeric Fab fragment is cleaved with SacI and SpeI, and a cDNA fragment is inserted into the prepared phagemid fragment to prepare a plasmid for expression of a phage library.
  • 11- (2) Preparation of phage solution for phage display
  • the plasmid prepared in 11- (1) is transformed into Escherichia coli TG1 strain (Orient Technologies) by a conventional method, and a solution containing Escherichia coli is added to a plate of LB medium to which ampicillin is added. Sow. After culturing at 37 ° C., the formed colonies are recovered and an E. coli library is prepared. A part of the library is cultured, and to this E. coli suspension, Ampicillin and Glucose are added, and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, helper phage M13KO7 (Life Technologies) is infected, and shaking culture is continued for another hour.
  • the cells are collected by centrifugation and the culture solution is discarded. Then, the cells are suspended in 10 mL of 2 ⁇ YT culture solution and cultured at 37 ° C. with shaking. The next day, after centrifuging the culture supernatant, transfer 8 mL of the supernatant to another tube, add 2 mL of PEG / NaCl solution, mix, and let stand on ice for 1 hour, and then collect the precipitated phage by centrifugation. This is used as a phage solution for phage display.
  • An antibody is selected by the panning method from the phage solution prepared in 11- (2).
  • Panning is performed in two ways. The first method is carried out according to the method described in BARBAS or the like. Specifically, S68-BSA is immobilized on a Nunc immunoplate (MAXISORP, C96, 430341) and then blocked. After adding 50 ⁇ L of D-PBS containing 4% skim milk 0.2% Triton X-100 per well, add 50 ⁇ L of the phage solution obtained in 11- (2). The plate is allowed to react for 1 hour, and the plate is subsequently washed with D-PBS containing 0.1% Triton X-100.
  • panning is performed three times in the same manner using the method described in Example 12- (2), and phages specific for presepsin are concentrated.
  • TG1 culture solution infected with phage 11- (3) is seeded on an LB plate containing Ampicillin to form colonies.
  • a phage solution is prepared again from each colony, and the reactivity is confirmed by EIA. That is, BSA, S68-BSA, P03-BSA and sCD14ST-Fc are immobilized on a Nunc immunoplate (MAXISORP, C96, 430341), respectively, and then blocked. After adding D-PBS containing 4% skim milk and 0.2% Triton X-100, the recovered phage solution is added.
  • the plate is allowed to react for 1 hour, and the plate is subsequently washed 5 times with saline containing 0.05% Tween20.
  • a diluted solution of HRP / Anti-M13 Monoclonal Conjugate (GE Healthcare) is added to each well and allowed to react for 1 hour at room temperature.
  • TMB solution is added and allowed to react for 10-20 minutes at room temperature.
  • the reaction is stopped with 1M sulfuric acid solution.
  • Absorbance at 450/650 nm is measured with a plate reader (ThermoMax, Molecular Devices). As a result, binding is confirmed with a plurality of phages. Phagemids are isolated from these colonies and the sequence is confirmed.
  • an anti-preceptin antibody that specifically binds to P03 and preceptin having a sequence different from the CDR sequence obtained by the hybridoma method can be obtained.
  • Example 12 Production of modified heavy chain CDR3 sequence using phage display method Since heavy chain CDR3 sequence was predicted to affect the activity of the antibody, the phage display method was used for the analysis of heavy chain CDR3 sequence. Variants were made and evaluated.
  • Primer pair (p-nnk3-2s; 5 ′ phosphorylated-GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC T-3 ′: SEQ ID NO: 91, p-nnk3-2a; 5 ′ phosphorylated-GCCACA AAA ATA AGT GGC CGT GTC CTC GGT TGT CGG ACT G-3 ′ SEQ ID NO: 92 (N represents G, A, T, or C, K represents G or T)) and thermostable DNA polymerase (Takara Bio) ) To obtain a DNA ligase. Therefore, they were self-bonded. This was transformed into E.
  • coli XL-1 Blue culture solution were mixed and reacted at 37 ° C. After 1 hour, L-Glutamine, ampicillin and helper phage M13K07 (Invitrogen) were added and reacted at 37 ° C. After an additional hour, the medium was replaced with 2 ⁇ YT medium, and cultured overnight, and phages specifically bound to rsCD14ST-Fc were collected. This operation was repeated three times to concentrate the target antibody.
  • the phage solution was diluted 2-fold with D-PBS containing 4% skim milk and 0.2% Triton X-100, and allowed to react on the plate for 1 hour. Subsequently, the plate was washed 5 times with physiological saline containing 0.05% Tween 20, and 50 ⁇ L of diluted HRP / Anti-M13 Monoclonal Conjugate (GE Healthcare) was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Similarly, after washing the plate 5 times, a TMB solution was added and allowed to react at room temperature. After completion of the reaction, the reaction was stopped with 1 M sulfuric acid solution, and the absorbance at 450/650 nm was measured with a plate reader (ThermoMax, Molecular Devices). The phage solution whose binding activity was confirmed was infected with E. coli, and the plasmid was recovered by a conventional method, and the gene sequence was confirmed.
  • IgG Antibody Phagemid was recovered from the obtained candidate phage, and a fragment encoding the variable region of the heavy chain was prepared.
  • a plasmid for preparing a heavy chain variant was prepared according to the method described in Example 8, and transferred to COS-1 cells together with a light chain transient expression plasmid containing the full-length light chain of F1466-26 (pTK-5608). Erected. COS-1 cells were cultured at 37 ° C., and after 72 hours, the culture supernatant was collected.
  • the variant 6027 in which all three amino acids of the heavy chain CDR3 were substituted was slightly less reactive to presepsin than the other variants, but had almost the same reactivity as the S68 antibody.
  • Variants 6026, 6028, and 6029 had two amino acid substitutions, but were excellent in reactivity to presepsin. This suggests that when the heavy chain CDR3 is composed of 3 amino acids, the antibody activity may be maintained even when 2 amino acids are substituted.
  • the modified 6028 was particularly excellent in binding activity with presepsin.
  • Triglyceride (TG) interference test In Examples 5 and 6, preceptin measurement using an antibody that recognizes P04-05 as an epitope is susceptible to interference by TG in the specimen, but P03 is recognized as an epitope. It was suggested that the preceptin measurement by the antibody to be resistant to TG interference.
  • TG was added to normal human specimens (8 specimens) (EDTA plasma, TENEEEE BLOOD SERVICES) so as to have a final concentration of 10 mg / mL, and the preceptin measured values before and after the addition were compared. The TG concentration at this time does not consider the TG originally contained in the specimen.
  • Each antibody was evaluated using the sandwich ELISA system described in Example 9- (3) using a plate in which each antibody was immobilized on a solid phase. The results are shown in FIG.
  • F1466-26 and F1466-5 which are antibodies that recognize P03 as an epitope, showed almost no change in measured values before and after the addition of TG, whereas antibodies that recognized P04-05 as an epitope In F1466-19, the measured value was strongly influenced by the addition of TG.
  • Measurement with an antibody in which the preceptin measurement value is strongly influenced by TG in the specimen is expected to increase the measurement value of a healthy person who originally shows a low value, such as F1466-19. In this case, the difference between the normal value and the abnormal value is less likely to occur.
  • Such an antibody is not suitable for measuring presepsin in a specimen.
  • the antibody recognizing P03 as an epitope is less susceptible to TG in the sample and is suitable for preceptin measurement in the sample.
  • Example 14 List of variants having preferred performance
  • the CDR sequences of antibodies having preferred performance obtained in Examples 8 and 12 of the present invention are shown in Figs. 2 to 2-2 (SEQ ID NOs: 93 to 156). ).
  • the total number of antibodies produced in Examples 8 and 12 was 109, and the preferred number of antibodies was 65.
  • An antibody having an affinity for preceptin (KD value) of less than 10 ⁇ 8 M was evaluated as ⁇ , and an antibody of less than 10 ⁇ 9 M was evaluated as ⁇ .
  • An antibody having a KD value of less than 10 ⁇ 7 M but having an affinity almost equal to the affinity of S68 antibody for preceptin was evaluated as ⁇ .
  • the antibodies with particularly excellent binding activity to preceptin were 5793 and 5810 as evaluated by the KD value.
  • the binding activity to preceptin was evaluated by the ratio of the absorbance at the time of reaction between each antibody and rsCD14ST-Fc, where the absorbance at the time of reaction between S68 antibody and sCD14ST-Fc was 1.
  • the antibody was evaluated as ⁇ for an antibody with an absorbance ratio of 4 or more and ⁇ for an antibody with 5.5 or more.
  • the antibodies having particularly excellent binding activity to preceptin as evaluated by the absorbance ratio were 5864, 5979, 5983, 5988, and 6028.

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Abstract

　本発明の課題は、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する、新規なモノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を提供することである。　配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。

Description

新規抗プレセプシン抗体
本発明は、検体中のプレセプシン測定に有用な、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片に関する。
ＣＤ１４分子は、単核球細胞の膜表面に発現している糖タンパク質であり、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）のレセプターとしての機能を有することが知られている。ＣＤ１４分子には、細胞表面上に発現している膜結合型ＣＤ１４（ｍＣＤ１４）と、可溶型ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）の２種類が存在する。ｓＣＤ１４として、分子量約５５ｋＤａおよび約４９ｋＤａのｓＣＤ１４（以下「高分子量ｓＣＤ１４」という。）が知られており、敗血症（ＳＥＰＳＩＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等、多くの疾患における患者の血中で高値を示す事が報告されている。そのため、これらの高分子量ｓＣＤ１４は疾患特異的なマーカーではないと考えられている（非特許文献１～２）。
一方、敗血症患者において特徴的に血中濃度が上昇する、新たなｓＣＤ１４の分子種として、ｓＣＤ１４－ＳＴ（可溶性ＣＤ１４抗原サブタイプ，プレセプシンともいう）が存在することが報告されている。
ｓＣＤ１４－ＳＴ（プレセプシン）とは、ｓＣＤ１４のうち、非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分子量１３±２ｋＤａに泳動されることを特徴とし、ＣＤ１４のＮ端部を保持しているものである。高分子量ｓＣＤ１４と比べると、Ｃ端側が大きく欠失したアミノ酸配列を有しており、高分子量ｓＣＤ１４とは異なりＬＰＳ結合能を有していない。また、プレセプシンは高分子量ｓＣＤ１４とは異なる免疫原性を示すため、抗体を用いて両者を区別できる。プレセプシンは敗血症患者において特異的に血中濃度が上昇する（特許文献１）。また、敗血症との判別が難しい、全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）を示す患者と比較しても、敗血症患者の血中で高値を示すという報告があり、プレセプシンは敗血症の特異的な診断マーカーであると考えられている（非特許文献３）。
プレセプシンを特異的に認識するウサギ由来ポリクローナル抗体（Ｓ６８抗体）及びラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６－１７－２）が開示されている（特許文献１、２）。
現在、プレセプシンの測定には、プレセプシンに対する特異抗体としてウサギ由来ポリクローナル抗体を用いた測定系が実用化され、測定キットが欧州及び日本で上市されている（ＰＡＴＨＦＡＳＴ(R)　Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎ，三菱化学メディエンス株式会社）
　これまで、実用化し得る抗ヒトプレセプシンモノクローナル抗体の取得が試みられてきたが、満足いく性能を備えた抗体は得られていなかった。
国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９ 国際公報ＷＯ２００４／０４４００５
Ｈａｙａｓｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７：４１７－４２０、１９９９年 Ｌａｗｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２０：４８３－４８７，２０００年 Ｙａｅｇａｓｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，　１１：２３４－２３８、２００５年
本発明の課題は、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する、新規なモノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を提供することである。
　また、プレセプシンの測定値が、Ｓ６８抗体（ＷＯ２００４／０４４００５の実施例１に記載のＳ６８ペプチドを投与抗原としてウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体）による測定値との相関のよい、モノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を提供することである。
　また、抗体を用いて測定したプレセプシン測定値が、検体中の干渉物質（例えば、トリグリセライド）の影響を受けにくく、様々な背景因子をもつ被験者の検体であっても、精度よくプレセプシンを測定しうる、モノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を提供することである。
　Ｓ６８ペプチドでウサギを免疫して得られた複数のハイブリドーマから、Ｓ６８ペプチドへの結合活性、プレセプシンに対する結合活性など複数の選別工程を経て、複数のモノクローナル抗体を得た。プレセプシン測定のためのＥＬＩＳＡ系を構築し、プレセプシンとの反応性を検討したところ、Ｆ１１４６－１７－２（ＷＯ２００４／０４４００５の実施例２に記載のＳ６８ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体：配列番号４２～４７）を用いたＥＬＩＳＡ系と比較して、プレセプシンとの反応性が約１万倍改善した抗体が得られたことが分かった。
　これらの各ウサギモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系において、複数の敗血症患者の血中プレセプシン値を測定し、Ｓ６８抗体を用いたＥＬＩＳＡ系による測定値との相関分析を行ったところ、相関性に優れる抗体と劣る抗体が存在することが判明した。さらに検討を進めたところ、その違いには、検体中のトリグリセライド（ＴＧ）の干渉が関与していることを見出した。Ｓ６８抗体によるプレセプシン測定値との相関がよく、検体中のＴＧ干渉を受けにくい、検体中のプレセプシン測定に適するモノクローナル抗体を得るべく研究を続けたところ、抗体が認識するエピトープによって、その抗体の性能に差が生じることを見出した。すなわち、その違いには検体中のトリグリセライド（ＴＧとも記す）の干渉及び／又はエピトープが関与していることを見出した。
　プレセプシン測定に好ましい性能を有する抗体は、プレセプシンにおける、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ｋｒｖｄａｄａｄｐｒ：配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の５２位～６１位に相当する領域：Ｐ０３配列ともいう）をエピトープとすることを見出した。このエピトープは、本発明で初めて見出された新規なエピトープである。
このＰ０３配列をエピトープとして認識する抗体とプレセプシンとの結合は、Ｐ０３配列からなるアミノ酸残基により５０％以上競合阻止された。一方、配列番号３５～４１の各アミノ酸残基による該抗体とプレセプシンとの反応の競合阻止は２０％未満であった。すなわち、配列番号３６（ヒト全長可溶型ＣＤ１４の４９位～５８位に相当：Ｐ０２配列ともいう）からなるアミノ酸残基、配列番号３７（ヒト全長可溶型ＣＤ１４の５５位～６４位に相当：Ｐ０４配列ともいう）からなるアミノ酸残基、又は、配列番号３８（ヒト全長可溶型ＣＤ１４の５８位～６７位に相当：Ｐ０５配列ともいう）からなるアミノ酸残基による、該抗体とプレセプシンとの反応の競合阻止は２０％未満であった。この結果から、このＰ０３配列をエピトープとして認識する抗体は、Ｐ０３配列に対する特異性が高いことが分かった。
　同時にハイブリドーマから取得した抗体のうち、プレセプシンにおけるＰ０４配列及びＰ０５配列をエピトープとして認識する抗体は、プレセプシン測定時に検体中のＴＧの干渉を受けやすい等、プレセプシン測定には適さないことが分かった。このように、抗体が認識するエピトープ位置のわずかな違いが、抗体のプレセプシン測定のための性能に影響を与えることは予想外であった。
また、Ｐ０３配列（配列番号１）の８位のアスパラギン酸をアラニンに置換したアミノ酸残基では、前記抗体とプレセプシンとの反応の競合阻止が２０％未満となった。一方、Ｐ０３配列（配列番号１）の２位から７位、９位及び１０位のいずれかのアミノ酸をアラニン（又はグリシン）に置換したアミノ酸残基は、前記抗体とプレセプシンとの反応を５０％以上競合阻止することが分かった。
　さらに、プレセプシン測定に好ましい性能を有する抗体を作製すべく、Ｐ０３配列をエピトープとして認識する抗体の配列をもとに、ＣＤＲ配列の改変を行った。また、ファージディスプレイ法を用いて抗体を作製した。得られた抗体を一定の基準で選別し、ハイブリドーマから得られた抗体と同等又はより性能のよい抗体を得た。
ハイブリドーマから得られたＰ０３配列をエピトープとして認識する抗体、及び、選択された改変体は、プレセプシンに対する親和性が極めて高く、プレセプシン測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ系において、検体中の干渉物質（特に、トリグリセリド）の影響を受けにくい、Ｓ６８抗体による測定系との相関のよい、検体中のプレセプシン測定に適する抗体であることが確認された。
つまり、本発明は以下のとおりである。
１．配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２．前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４；
（ｉｉ）ＶＨ　ＣＤＲ２：ＩＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３；及び
（ｉｉｉ）ＶＨ　ＣＤＲ３：Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６；並びに
（ｉｖ）軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１：Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４；
（ｖ）ＶＨ　ＣＤＲ２：ＫＸ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｓ；及び
（ｖｉ）ＶＨ　ＣＤＲ３：Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２ＹＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７；を含み、
Ｘ１～Ｘ３７は、以下の表１～表６に記載の１または複数個のアミノ酸配列である、上記１）に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
３．Ｘ１＝Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｔ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｋ、Ｎ又はＷである、前記２に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
４．前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３を含み、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３は表７に記載のアミノ酸配列から選択され、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３は表８に記載のアミノ酸配列から選択される、前記１ないし３のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
５．前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３を含み、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３は、表９－１、表９－２および表９－３に記載のアミノ酸配列から選択される、前記１ないし４のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
６．（ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号９７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号９４のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
７．（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；または
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
８．前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して１０－８Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する、前記１ないし７のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
９．前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１の配列からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される、前記１ないし８のいずれか１に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
 
１０．前記反応系が、（ａ）前記抗体又は断片と、（ｂ）Ｆ１１０６－１３－３抗体又はＦ１０３１－８－３抗体とが用いられるサンドイッチＥＬＩＳＡである、前記９に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
 
１１．前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１のいずれかの配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止は２０％未満である、前記１ないし１０のいずれか１に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
 
１２．前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、配列番号１の８位のアスパラギン酸をアラニンに置換した配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止が２０％未満である、前記１ないし１１のいずれか１に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
 
１３．前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、配列番号１の２位から７位、９位及び１０位のいずれかのアミノ酸をアラニン（又はグリシン）に置換した配列からなるアミノ酸残基により、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される、前記１ないし１２のいずれか１に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
 
１４．前記抗体が、固相に固定化された配列番号１の配列からなるアミノ酸残基との結合活性を有する、前記１ないし１３のいずれか１に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
 
１５．配列番号２に記載のペプチドを投与抗原として作製される、前記１ないし１４のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
１６．前記抗体は、高分子量可溶型ＣＤ１４とは特異的には結合しない、前記１ないし１５のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
１７．前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド（ＴＧ）干渉試験を行うとき、検体中のＴＧ濃度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし１６のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
１８．前記抗体を用いて、複数の検体についてＴＧ干渉試験を行うとき、検体中のＴＧ濃度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度の平均が±２０％以下である、前記１ないし１７のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
１９．前記抗体を用いて、複数の検体についてＴＧ干渉試験を行うとき、検体が正常人ヒト血清であり、検体中のＴＧ濃度が１０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±１００％以下を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし１８のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２０．前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、０．９以上を示す、前記１ないし１９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２１．前記相関係数が、０．９５以上である、前記２０に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２２．前記抗体は、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃに対して、１．０８Ｅ－０８未満の親和性（ＫＤ値）で結合する、前記１ないし２１のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２３．前記抗体とプレセプシンとの結合活性が、ラット由来抗プレセプシン抗体（Ｆ１１４６－１７－２）とプレセプシンとの結合活性と比較して、プレセプシン濃度比で１００００倍以上の向上を示す、前記１ないし２２のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２４．前記抗体と、固相に固定化したｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃとの結合活性（吸光度）が、Ｓ６８抗体と、固相に固定化したｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃとの結合活性の２倍以上である、前記１ないし２３のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２５．前記抗体または断片が、モノクローナル抗体である、前記１ないし２４のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２６．前記抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、前記１ないし２５のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
 
２７．前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
 
２８．前記２７に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
 
２９．前記２８に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
 
３０．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、前記２９に記載の形質転換株。
 
３１．前記２９又は３０に記載の形質転換株を培養することを含む、抗体またはその抗原結合性抗体断片の製造方法。
 
３２．少なくとも前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を含む、プレセプシン測定用キット。
 
３３．少なくとも前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または断片を含む、敗血症を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するためのキット。
 
３４．前記プレセプシン測定用キットが、敗血症と全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪食症候群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも１つの疾患の検出又は評価のためのキットである、前記３２に記載のプレセプシン測定用キット。
 
３５．プレセプシン測定用キットにおける、前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片の使用。
 
３６．少なくとも前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプシンの測定方法。
 
３７．少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するための方法であって、
１）前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
２）　１）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、前記方法。
 
３８．少なくとも以下の工程を含む、疾患の検出又は評価のための方法であって、該疾患の検出又は評価が、敗血症と全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪食症候群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも１つであり、
１）前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
２）　１）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、前記方法。
 
３９．少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
１）候補の抗体または抗原結合性抗体断片を用いてプレセプシン測定系を構築する工程
２）該測定系を用いて、検体中のＴＧ濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する工程をを含む、前記方法。
 
４０．少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
 
４１．少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
２）プレセプシンにおける配列番号１のアミノ酸配列をエピトープとして特異的に認識する前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
 
４２．前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて被験者の検体中のプレセプシン濃度を測定することにより、敗血症の検出、又は、検出若しくは診断の補助がなされた患者に対して敗血症治療が施される、敗血症の治療方法。
 
４３．前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、被検薬が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程を含む、被検薬のスクリーニング方法。
 
４４．配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と、抗体の重鎖Ｆｃ領域を含む、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ。
 
４５．配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と、抗体の重鎖Ｆｃ領域の間に、切断を容易にする配列が挿入された、前記４４に記載のｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ。
 
４６．前記切断を容易にする配列が、トロンビン認識配列である、前記４５に記載のｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ。
 
４７．前記抗体の重鎖Ｆｃ領域が、ヒト由来ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域である、前記４４ないし４６のいずれか１に記載のｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ。
 
４８．配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と、抗体の重鎖Ｆｃ領域の配列を含むベクターを、宿主細胞へ導入し、その宿主細胞を培養する工程を含む、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの製造方法。
 
４９．前記４８に記載のｒｓＣＤＳＴ－ＦｃのＦｃ領域を切断する工程を含む、ｒｓＣＤ１４－ＳＴの製造方法。
 
　本発明により、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する抗体及びその抗原結合性抗体断片が提供されることにより、プレセプシン測定の質および精度を高めることが可能となる。プレセプシンに対する親和性の高い抗体を提供できることにより、該抗体は、正常人レベルの微量なプレセプシンの定量にも適し、高感度化が可能となる。また、検体中の干渉物質の影響を受けにくい抗体を提供できることにより、サンドイッチＥＬＩＳＡ系での測定値が血清サンプルの個体差（被験者の背景因子）の影響を受けにくく、精度の高い測定が可能となる。サンドイッチＥＬＩＳＡ系において、プレセプシンのみと特異的に結合し、ヒト血中に存在する高分子量ｓＣＤ１４とは特異的には結合しない、特異性の高い測定が可能である。
　ポリクローナル抗体によるプレセプシン測定の課題（ロット間の均一性の確保、生産困難性・コスト等）を解決し、実用性に優れる抗体の提供が可能となる。すなわち、モノクローナル抗体は、安価で安定的に効率よく生産ができ、抗体の均一な品質が維持できるという利点を有する。
Ｆ１４６６－２６（Ａ）、Ｆ１４６６－５（Ｂ）及び、Ｆ１４６６－１９（Ｃ）の抗体を用いて、正常人ヒト血清のＴＧ干渉試験を実施した結果を示す図である。 実施例８及び実施例１２で得られた各改変体を示す図である。 実施例８及び実施例１２で得られた各改変体を示す図である。図２から続いている図である。 実施例８及び実施例１２で得られた各改変体を示す図である。図２、図２－１から続いている図である。
以下に、より詳細に発明を説明する。
１．配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片
　本発明の第一の態様は、プレセプシン上の新規なエピトープである、配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、抗プレセプシン抗体またはその抗原結合性抗体断片である。
　「配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する」とは、抗体が、プレセプシンの配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列に相当する配列をエピトープとして特異的に認識することをいう。
　「抗原結合性抗体断片」は、配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する抗体の部分断片の中で、元の抗体と同じ抗原結合性を有する断片のことをいう。
　「配列の同一性」又は「配列の相同性（ホモロジー）」は、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間、すなわち、参照配列と、参照配列と比較されるべき対象となる配列との間の関係に対して言及される。配列間の一致により決定される、高度な配列類似性を作り出すように、配列が最適に調整された後、配列同一性又は相同性は、対象となる配列と参照配列を比較することにより決定される。そのような調整に関し、配列同一性は、位置毎に決定される。例えば、ある位置で、核酸又はアミノ酸が同一であるとき、特定の位置で配列は同一である。このような同一性を示す位置の総数を、参照配列の核酸又は残基の総数で割ることにより、配列同一性％が得られる。配列同一性は、公知の方法により簡易に計算でき、特に限定されないが、それらは、Computational Molecular Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, GrifEn A. M., and GrifEn H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. and Devereux J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo H., and Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)などに記載されている。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で、最大の一致を与えるように設計される。配列同一性の決定方法は、公然に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化され、与えた配列間の配列同一性を決定する。そのようなプログラムの例は、特に限定されないが、the GCG program package (Devereux et al., Nuc. Ac. Res., 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul et al, J. Molec. Biol, 215:403-410 (1990)). 等が挙げられる。 NCBIらのBLASTX プログラムは、公然に利用可能である。
　本発明においてエピトープの決定方法は、特に限定されないが、例えば、実施例６に記載の方法により確認しうる。
　本発明の抗体は、該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、Ｐ０３ペプチド（配列番号１で表されるアミノ酸配列）を競合反応させる（好ましくは、吸光度を利用する）反応系において、抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止されることで特徴づけられてもよい。当該反応系は、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡである。より好ましくは、（a）本発明の抗体又は断片と、(b)Ｆ１１０６－１３－３抗体又はＦ１０３１－８－３抗体が用いられるサンドイッチＥＬＩＳＡである。配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト全長可溶型ＣＤ１４のアミノ酸配列（配列番号３）の５２位～６１位に相当する。好ましくは、本発明の抗体とプレセプシンとの結合に対する、Ｐ０１ペプチド（配列番号３の４６位～５５位で表されるアミノ酸配列）、Ｐ０２ペプチド（同配列の４９位～５８位で表されるアミノ酸配列）、Ｐ０５ペプチド（同配列の５８位～６７位）、Ｐ０６ペプチド（同配列の６１位～７０位）、又は、Ｐ０７ペプチド（同配列の６４位～７３位）、Ｐ０８ペプチド（同配列の６７位～７６位）による競合阻止は２０％未満である。好ましくは、本発明の抗体とプレセプシンとの結合に対する、Ｐ０４ペプチド（同配列の５５位～６４位）による競合阻止は２０％未満である。
　また、エピトープ決定のための他の方法としては、例えば、実施例９－（４）に記載するように、目的とする抗原の部分配列（例えば、Ｐ０３ペプチド）と、抗体との結合活性をみることも可能である。
　本発明のひとつの態様では、Ｐ０３配列（配列番号１）の８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸配列が１又は複数個置換された配列に結合する抗プレセプシン抗体を提供する。置換されるアミノ酸の数は、好ましくは２アミノ酸以内、さらに好ましくは１アミノ酸である。
　例えば、本発明のひとつの態様では、Ｐ０３配列又はその９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列に結合する抗プレセプシン抗体を提供する。対象となるエピトープは、Ｐ０３配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一性を有する配列であってもよい。ある態様では、Ｐ０３配列と９０％以上の同一性を有する配列に特異的な抗プレセプシン抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。
　本発明の抗体は、プレセプシンを特異的に認識する抗体である。
　プレセプシン（ｓＣＤ１４－ＳＴ）は、ＣＤ１４の可溶型の断片であって、以下の１）～３）の性質を有する物質をいう。
　　　・　非還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
　　　・　Ｎ末端配列に配列番号３の１位～１１位のアミノ酸配列を有する、及び、
　　　・　配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
　すなわち、本発明において、プレセプシンとは、特に説明しない限り、ヒトプレセプシンである。
　また、本発明においては、プレセプシンとして、プレセプシン標準品（ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１６に記載のｒｓＣＤ１４－ＳＴ）だけでなく、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ（実施例９－（２）に記載）など、プレセプシンとしての活性を有する物質が用いられてもよい。
　本発明において、「特異的に認識する抗体」とは、特異的に認識する対象を免疫学的に認識する抗体および／または特異的に認識する対象と通常の抗原抗体反応を示す抗体である。特異的に認識する対象と該抗体との結合を親和性として表した場合、通常、平衡解離定数（ＫＤ）は、１０－７Ｍ未満である。本発明の抗体は、プレセプシンのみを特異的に認識する。ヒト血中に存在する主要な可溶型ＣＤ１４には、約５５ｋＤａ及び約４９ｋＤａの可溶型ＣＤ１４（高分子量ｓＣＤ１４）がある。本発明の抗体は、高分子量ｓＣＤ１４と特異的には結合しない。高分子量ｓＣＤ１４は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるヒト全長可溶型ＣＤ１４を用いてもよく、また、例えば、正常人の体液の３Ｃ１０抗体アフィニティーカラム吸着により作製してもよい（ＷＯ２００５／１０８４２９実施例２３参照）。
　本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築し、検体中のプレセプシンを測定しうる。
　本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、Ｆ１１４６－１７－２（ＷＯ２００４／０４４００５の実施例２に記載のラット由来モノクローナル抗体）と比較して、サンドイッチＥＬＩＳＡ系においてプレセプシンとの反応性が約１万倍向上したことから（実施例４）、検体中の微量のプレセプシンの検出に適する。すなわち、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、Ｆ１１４６－１７－２と比較して、プレセプシンとの反応性が、プレセプシンの濃度比で１万倍以上向上することで特徴づけられてもよい。
　敗血症患者では、特徴的にプレセプシン血中濃度が上昇することが報告されており、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、敗血症の検出のために好ましく用いられる。本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、実施例１で示されるように、本抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、敗血症患者検体と正常人検体を測定したとき、プレセプシン測定値に差がみられる抗体又はその抗原結合性抗体断片が好ましい。
　本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、測定系を構築して検体中のプレセプシンを測定するとき、検体中の干渉物質の影響が問題とならない程度である抗体が好ましい。
　本発明において、干渉物質とは、その物質の存在が、プレセプシンの測定値に影響を与える（以下、干渉ともいう）可能性のある物質をいい、例えば、トリグリセライド（Triglycerides：ＴＧともいう）、ビリルビン、ヘモグロビン、リウマチ因子、コレステロール等が挙げられる。本発明において、抗体の評価のために好ましい干渉物質はトリグリセライド（ＴＧ）である。
　干渉の試験の評価指標の一つとして、干渉物質無添加の検体のプレセプシン測定値に対する、同検体に干渉物質を一定量添加したときのプレセプシン測定値のずれを解離度（％）として表し、用いることができる。干渉物質添加による測定値の解離度は次のように表す。
　解離度（％）＝｛（干渉物質添加後のプレセプシン測定値）－（干渉物質無添加のプレセプシン測定値）｝／（干渉物質無添加のプレセプシン測定値）×１００
　干渉物質の影響が問題とならない程度とは、例えば、複数の検体を用いた干渉試験において、一定量の干渉物質添加によるプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高いことで示すことができる。複数の検体中の「検体の比率が高い」とは、通常、複数の検体中の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、とりわけ好ましくは９０％以上である。
　ＴＧの干渉試験では、例えば、複数の検体について干渉試験を行い、ＴＧ添加により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高いことを一つの指標としてもよい。本発明の抗体の好ましい態様の一つは、該抗体を用いた測定系によりＴＧ干渉試験を実施するとき、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高い抗体である。
あるいは、例えば、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度を、複数の検体で求め、その解離度の平均値が±２０％以下、より好ましくは±１０％以下であることを一つの指標としてもよい。本発明の抗体の好ましい態様の一つは、該抗体を用いた測定系により、複数の検体についてＴＧ干渉試験を実施するとき、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度の平均値が±２０％以下、より好ましくは±１０％以下を示す抗体である。
　米国の脂質異常症のガイドラインであるＮＣＥＰ‐ＡＴＰIIIでは、ＴＧ１５０ｍｇ／ｄＬ未満は正常、ＴＧ１５０～２００ｍｇ／ｄＬがボーダーライン、ＴＧ２００～４９９ｍｇ／ｄＬは高値（high）、５００ｍｇ／ｄＬ以上は、顕著な高値（very high）とされている。検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬ（＝２０００ｍｇ／ｄＬ）とは、上記基準に照らすと、極めてＴＧ濃度が高い状態であるといえる。
　本実施例におけるＴＧ干渉試験は、検体のＴＧ濃度６．７ｍｇ／ｍＬ、１３．３ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬの３点で、プレセプシン測定値の解離度を測定している。検体のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときに解離度が小さい抗体（測定系）は、解離度が大きい抗体と比較して、検体のＴＧ濃度６．７ｍｇ／ｍＬ及び１３．３ｍｇ／ｍＬのときも解離度が小さい傾向がみられた。
　ＴＧ干渉試験は、正常人ヒト血清を用いて実施されてもよい。正常人の検体は、プレセプシン濃度が低いため、ＴＧ干渉を受けると、測定値の解離度が大きくなりやすい。本試験により、検体中の微量なプレセプシンを精度よく測定できるかを試験することができる。例えば、検体中のＴＧ濃度１０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が、±１００％以下であることが好ましく、より好ましくは±７０％以下、さらに好ましくは±５０％以下、とりわけ好ましくは±２０％以下である。前記試験と同様に、複数検体を用いて試験を行うことが望ましい。
　また、本発明の抗体または抗原結合性抗体断片は、該抗体の干渉物質添加によるプレセプシン測定値の解離度とＳ６８抗体の同条件下の解離度との比較により評価されてもよい。好ましい態様の一つでは、本発明の抗体とＳ６８抗体において、該解離度は類似する。
　ＴＧの干渉試験については、例えば、本発明の抗体を用いた測定系において、ＴＧ添加により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度と、Ｓ６８抗体の同条件での解離度との差が、２０％以下、より好ましくは１０％以下を示す検体の比率が高いことで評価されてもよい。解離度の差は、例えば、本発明の抗体による測定値の解離度が＋５％、Ｓ６８抗体による測定値の解離度が－１０％のとき、解離度の差は１５％と計算した。
　干渉試験に用いる検体は、本発明の第二の態様に記載の検体を用いることができる。ＴＧ干渉試験の場合は、好ましくは、血清又は血漿である。
　本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、測定系を構築して、検体中のプレセプシンを測定するとき、Ｓ６８抗体を用いた測定値との相関のよい抗体が好ましい。相関がよいとは、好ましくは、相関係数が０．９以上であり、より好ましくは、０．９５以上である。
　本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、プレセプシンに対して特異的に結合し、プレセプシンに対する親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）は、１０－７M未満であることが好ましく、より好ましくは１０－８M未満、さらに好ましくは１０－９M未満、とりわけ好ましくは１０－１０M未満、最も好ましくは１０－１１M以下である。本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のプレセプシンに対する平衡解離定数は、好ましくは、１０－７M～１０－１４M、より好ましくは、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍの範囲である。プレセプシンは、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃが用いられてもよい。
　親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケア）を用いて測定することができる。
　本発明の好ましい態様のひとつは、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のプレセプシンに対する親和性（ＫＤ値）は、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する親和性と比較して優れる。本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ（プレセプシン：実施例９－（２）に記載）に対する親和性（ＫＤ値）は、Ｓ６８抗体のｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃに対する親和性（ＫＤ値）の１．０８Ｅ－０８と同程度か、より低い数値を示すことが望ましく、より好ましくは、Ｓ６８抗体のＫＤ値の１／２（５．４０Ｅ－０９）以下、さらに好ましくは、Ｓ６８抗体のＫＤ値の１／１０（１．０８Ｅ－０９）以下を示すことが望ましい。
　本発明の好ましい態様のひとつは、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のプレセプシンに対する結合活性は、Ｓ６８抗体と比較して優れる。
　例えば、実施例１０－（２）に記載するように、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ（プレセプシン）を固相に固定して抗体と反応させ、吸光度等により、抗体のプレセプシンに対する結合活性を評価してもよい。
　例えば、実施例１０に準じて試験を実施し、Ｓ６８抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃを反応させたときの吸光度を１としたときの、本発明の抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃを反応させたときの吸光度の比は、好ましくは１以上であり、より好ましくは２以上、さらに好ましくは４以上、とりわけ好ましくは５．５以上である。
　本発明は、以下のいずれかに記載の抗体を提供する。
　これらは、抗プレセプシン抗体である。以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、プレセプシ上の、配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識するため、第一の態様における好ましい例である。より好ましくは、（ａ）又は（ｂ）の抗体又はその抗原結合性抗体断片である。
（ａ）　配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
（ｂ）　配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
（ｃ）　配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
　また、本発明は、図２～図２－２に記載のＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合性抗体断片を提供する。これらの抗体は、プレセプシン上の配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する。より好ましくは、５７９３、５８１０、５８６４、５９７９、５９８３、５９８８、６０２８のＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合性抗体断片である。
　本発明は、以下のいずれかに記載のＣＤＲを含むポリペプチドを提供する。より好ましくは、（ｉ）（ｉｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）のポリペプチドである。
（ｉ）配列番号４の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号５の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号６の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号７の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号９の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１０の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号１１の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号１２の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１９の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２０の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２１の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｖ）配列番号２２の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２４の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｖｉ）配列番号２５の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２６の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２７の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
　また、本発明は、図２～図２－２に記載の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ　２及びＶＨ　ＣＤＲ３を含むポリペプチドを提供する。
また、本発明は、図２～図２－２に記載の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２、ＶＬ　ＣＤＲ３を含むポリペプチドを提供する。
より好ましくは、配列番号７の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２及び配列番号９４の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むポリペプチド（５７９３）、又は、配列番号７の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号９７の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２及び配列番号９の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むポリペプチドである（５８１０）。
　本発明は、以下のいずれかに記載の可変領域を含むポリペプチドを提供する。より好ましくは、（ｉ）（ｉｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）を含むポリペプチドである。
（ｉ）配列番号４の配列からなるＣＤＲ１、配列番号５の配列からなるＣＤＲ２、配列番号６の配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）。
（ｉｉ）配列番号７の配列からなるＣＤＲ１、配列番号８の配列からなるＣＤＲ２、配列番号９の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ。
（ｉｉｉ）配列番号１０の配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１の配列からなるＣＤＲ２、配列番号１２の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ。
（ｉｖ）配列番号１９の配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０の配列からなるＣＤＲ２、配列番号２１の配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）。
（ｖ）配列番号２２の配列からなるＣＤＲ１、配列番号２３の配列からなるＣＤＲ２、配列番号２４の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ。
（ｖｉ）配列番号２５の配列からなるＣＤＲ１、配列番号２６の配列からなるＣＤＲ２、配列番号２７の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ。
　また、本発明は、図２～図２－２に記載の配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。
　また、本発明は、図２～図２－２に記載の配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。
　本発明において、前記ポリペプチドは、プレセプシンへの結合活性を有する抗原結合物質であることが好ましい。
　上述の抗体又はポリペプチドは、ＣＤＲ配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入等（置換等という）されていてもよい。１又は複数のアミノ酸を置換等された後の抗体又はポリペプチドは、抗原との結合活性、プレセプシン測定時の特徴等について、置換等を行う前と同等の活性又は性能を有していることが好ましい。ここで、置換等を行う前と同等の活性又は性能を有する、置換等された後の抗体又はポリペプチドには、公知の遺伝工学的手法によって人工的に改変した変異体、天然に生じた変異体（いわゆるアレル変異体）のいずれもが含まれている。置換等されるアミノ酸の数が複数であることは、１より多い数であれば、特に限定されないが、好ましくは、１つのＣＤＲにつき３アミノ酸以内、さらに好ましくは２アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸である。ある実施態様では、本発明の抗体又はポリペプチドは、上記のように配列番号で特定されるＣＤＲのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すＣＤＲ配列を有してもよい。その同一性は、９２％以上, ９５％以上, ９７％以上, 又は９９%以上であってもよい。このような抗体又はポリペプチドは、配列番号で特定されるＣＤＲ酸配列を有する抗体又はポリペプチドと同等の活性又は性能を有していることが好ましい。
　ＣＤＲと連結される抗体のフレームワーク領域（framework region：ＦＲ）は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるＦＲは特に限定されず、いかなるＦＲが用いられてもよい。必要に応じて、ＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、ＦＲの１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入等されていてもよい。ある実施態様では、ＦＲは、各配列番号で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。その同一性は、８５％以上, ９０％以上, ９５％以上, ９７％以上、又は９９％以上であってもよい。例えば、アミノ酸を置換したＦＲを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択してもよい。
　本発明において、抗体のＦＲ領域は、データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）等から得られる公知のＦＲ（アミノ酸配列としては、例えば、ＡＡＯ０６５１１．１、ＡＡＴ０２３９１．１、ＡＡＧ１３９７３．１、ＡＧＴ２９８１６．１等、塩基配列としては、例えば、ＡＹ５９６４２９．１、ＡＹ１７１７７２．１、ＫＣ０２００５６．１、ＡＦ２９４９６６．１等）、本発明で得られた抗体のＦＲ等を用いることができる。当業者は、技術常識に基づいて、望ましいＦＲを選択することができる。本発明において、好ましく用いられる抗体のＦＲは、例えば、配列番号４８～８４のＦＲが挙げられる。これらは、データベース等で得られるＦＲ、又は、本発明で得られた抗体のＦＲである。本発明の抗体には、様々な動物由来のＦＲが利用可能であるが、特に、ウサギ由来の抗体のＦＲが好ましい。中でも、配列番号６４～８４が好ましく、より好ましくは、配列番号６５又は６６、配列番号６８又は６９、配列番号７１又は７２、配列番号７３、配列番号７５又は７６、配列番号７８又は７９、配列番号８１、８２又は８３、配列番号８４のＦＲである。
　ある実施態様では、本発明の抗体の可変領域の好ましい例は以下のとおりである。
（１）（ｉ）図２～図２－２に記載の改変体の重鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０のＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３）並びに、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、及び配列番号７３の配列を含むＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）図２～図２－２に記載の改変体の軽鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０のＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３）並びに、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、及び配列番号８４の配列を含むＦＲを有する軽鎖可変領域。
（２）（ｉ）Ｆ１４６６－５、Ｆ１４６６－２６、又はＦ１４６６－１６の重鎖ＣＤＲ配列（例えば、Ｆ１４６６－２６のＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３）、並びに、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、及び配列番号７３の配列を含むＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）Ｆ１４６６－５、Ｆ１４６６－２６、又はＦ１４６６－１６の軽鎖ＣＤＲ配列（例えば、Ｆ１４６６－２６のＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３）、並びに、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、及び配列番号８４の配列を含むＦＲを有する軽鎖可変領域。
（３）（ｉ）図２～図２－２に記載の改変体の重鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０のＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３）並びに、配列番号６５（又は６６）、配列番号６８（又は６９）、配列番号７１（又は７２）、及び配列番号７３を含むＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）図２～図２－２に記載の改変体の軽鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０のＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３）並びに、配列番号７５（又は７６）、配列番号７８（又は７９）、配列番号８１（又は８２又は８３）、及び配列番号８４を含むＦＲを有する軽鎖可変領域。
（４）（ｉ）Ｆ１４６６－５、Ｆ１４６６－２６、又はＦ１４６６－１６の重鎖ＣＤＲ配列（例えば、Ｆ１４６６－２６のＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３）、並びに、配列番号６５（又は６６）、配列番号６８（又は６９）、配列番号７１（又は７２）、及び配列番号７３を含むＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）Ｆ１４６６－５、Ｆ１４６６－２６、又はＦ１４６６－１６の軽鎖ＣＤＲ配列（例えば、Ｆ１４６６－２６のＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３）、並びに、配列番号７５（又は７６）、配列番号７８（又は７９）、配列番号８１（又は８２又は８３）、及び配列番号８４を含むＦＲを有する軽鎖可変領域。
　可変領域は１又は複数（例えば５アミノ酸以内、好ましくは３アミノ酸以内）のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。１又は複数のアミノ酸を置換等されたた後の抗体又はポリペプチドは、抗原との結合活性、プレセプシン測定時の特徴等について、置換等を行う前と同等の活性又は性能を有していることが好ましい。ある実施態様では、可変領域が上記のようにアミノ酸配列で特定される場合、可変領域は、配列番号により特定された配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。その同一性は、８５％以上, ９０％以上, ９５％以上, ９７%以上、又は９９％以上であってもよい。このような可変領域は、配列番号により特定された可変領域と同等の活性又は性能を有していることが好ましい。
　本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、いかなる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヒト由来のＩｇＧの定常領域などを使用しうる。定常領域は、抗原との結合活性、プレセプシン測定時の特徴等に影響を与えない範囲で、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してもよい。
　本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、すなわち、抗プレセプシンモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体である。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比較して、均一な抗原特異性をもつ、高力価の抗体が得られる等の特性を有する。理論的には、モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比較して、抗原測定に必要な抗体重量が少なくてよいという利点がある。本明細書における「抗体」の語は、「抗体又はその抗原結合性抗体断片」の意味で用いられる場合がある。
　本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、配列番号２に記載のＳ６８ペプチドを投与抗原として作製される。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、Ｓ６８ペプチドを動物に免疫し、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製し、次いで単一細胞化したハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清を精製することにより得ることができる。
　抗体が由来する動物種は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が挙げられる。好ましくは、ウサギである。すなわち、本発明の抗体は、好ましくは、ウサギ由来抗プレセプシンモノクローナル抗体（ウサギ抗プレセプシンモノクローナル抗体ともいう）である。
　ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。例えば、ヒト由来のＳＫＯ－００７、ヒトマウスヘテロミエローマのＳＨＭ－Ｄ３３，マウス由来のＰ３、ＮＳ－１，Ｐ３Ｕ１，ＳＰ２／０、ラット由来のＹＢ２／０、Ｙ３－Ａｇ１，２，３等が挙げられる。ウサギ由来不死化Ｂリンパ球等が用いられてもよい。
　本発明においては、好ましくは、ウサギ脾細胞とウサギ由来不死化Ｂリンパ球との融合によりウサギ－ウサギハイブリドーマ、または不死化したマウス細胞株由来の細胞との融合によりウサギ－マウスハイブリドーマを作製してもよい。
　抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合は、公知の方法により行うことができ、融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等を使用することができる。細胞融合に用いる培養液は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等を用いることができる。
　融合により形成されたハイブリドーマは数日～３週間程度培養され、例えば、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地を用いて、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマは、その産生する抗体により更に選択される。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
　抗体の精製は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等）、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、遠心分離、ゲルろ過法等の公知の方法により行うことができる。
　本発明の抗体またはその抗原結合性抗体断片は、当業者が用いうる遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。例えば、得られた抗プレセプシン抗体の配列を基に、抗体又はその一部をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主で発現させることができる。
　抗体又はその一部をコードするポリヌクレオチドの構築は、例えば、本発明の抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することができる。これらは市販のキット等を用いて実施可能である。
　また、当業者が用いうる遺伝子組換え技術を用いて、抗プレセプシン抗体の配列を基に、その配列の一部を改変した抗体を作製することもできる。目的の配列を含むベクターを調製し、適当な宿主で発現させることができる。
　本発明に用いられるベクターは、特に限定されないが、抗体遺伝子の発現に適合するベクター及び／または発現ベクターが好ましい。例えば、ＥＦ－１αプロモーター及び／またはＣＭＶエンハンサーを含有するベクター等が挙げられる。
　ベクターとして、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス等が用いられてもよい。
　本発明に用いられるプロモーターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等を用いることができる。
　ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を含有しうる。
　選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等を用いることができる。
　本発明に用いられる宿主細胞は、特に限定されないが、例えば、細菌細胞（大腸菌等）、酵母、両生類細胞（アメリカツメガエル卵母細胞等）、昆虫または昆虫細胞（ｓｆ９等）、動物細胞等が用いられる。動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞）、マウス３Ｔ３細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞、ミエローマ細胞等が用いられる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、公知の方法により実施可能であり、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入後、各宿主細胞に適した培養培地で細胞を培養する。例えば、動物細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＧＩＴ培地等の動物細胞培養用培地、または、これらにＦＣＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中に抗体を発現蓄積することができる。培養上清中の抗体の精製は、前記に記載した方法を使用しうる。また、抗体の発現量および抗原抗体活性はＥＬＩＳＡ等により測定できる。
　本発明の抗体またはその抗原結合性抗体断片は、ファージディスプレイ法を用いて作製されてもよい。ファージディスプレイ法による抗体取得は、当業者が用いうる技術により実施できる（ＣＡＲＬＯＳ　Ｆ．ＢＡＲＢＡＳ等　Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等参照）。例えば、本発明の実施例１１に記載の方法を用いることができる。Ｓ６８ペプチドを動物に免疫して得られた脾臓リンパ球から遺伝子を取得してファージミドベクター等と連結する等して、その後は常法により作製しうる。
　また、特定のＣＤＲ（例えば、ＶＨ　ＣＤＲ３）の配列のみ変更した改変体を作製するため、ファージディスプレイ法を用いることも可能である。これも鋳型とする抗体の重鎖および軽鎖を含むプラスミドと特定のプライマーを用いて、当業者が用いうる技術を用いて実施しうる。例えば、実施例１２に記載の方法を用いることができる。
　本発明の抗原結合性抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチド等が挙げられる。いずれの抗体断片も、配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する本発明の抗体と同じ抗原結合性を有している。これらの抗体断片は、当業者が用いうる遺伝子組換え技術等を用いて作製することができる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆ（ａｂ´）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものである。
　Ｆａｂ´は、Ｆ（ａｂ´）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ´は、Ｆ（ａｂ´）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーで連結したポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量化し、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。
　ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨ及び２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした抗原断片である。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、ｓｃＦｖをリンカーで結合することにより作製できる。
　ＣＤＲを含むポリペプチドは、好ましい態様は前述のとおりであり、抗原結合活性を有する断片である。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なリンカーを介して結合させることができる。
　重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドは、前記に記載のとおりである。
　本発明において、リンカーは、遺伝子工学により導入しうる任意のペプチドリンカーを用いることができる。本発明において好ましいリンカーは、ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて適宜選択することが可能であるが、通常、１～１００アミノ酸、好ましくは３～５０アミノ酸、より好ましくは５～２０アミノ酸である。４つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、３つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは同じでもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。
　本発明の抗体には、キメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。キメラ抗体は、２種類またはそれ以上の種の異なった抗体分子の一部ずつを組合せて作製された抗体分子である。本発明において好ましいキメラ抗体は、本発明のウサギモノクローナル抗体由来の可変領域及び他の種（例えばヒト）の定常領域を有する抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト種からのＣＤＲをヒト抗体へ移植した抗体である。キメラ抗体及びヒト化抗体は、常法に従い作製することができる。
　本発明の抗体には、本発明のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これらの抗体と他のペプチド又はポリペプチドが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質の作製は、当業者に公知の手法を用いて作製することが可能であり、例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させることができる。本発明の抗体との結合に用いられる他のペプチド又はポリペプチドは、特に限定されないが、例えば、ＦＬＡＧ，６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジンセグメント、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、Ｔ７－ｔａｇ，ＨＳＶ－ｔａｇ，ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、β－ガラクトシダーゼ、マルトース結合性タンパク質等が挙げられる。
２．プレセプシンの測定方法
　本発明の第二の態様は、少なくとも本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片を用いて、プレセプシンを免疫学的に測定する方法であり、少なくとも本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片とプレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む。本発明において「測定」の語は、「検出」「定量」「アッセイ」等の語と相互に変換して用いることができ、定量的及び定性的な決定を含む意味で用いられる。プレセプシンの測定は、好ましくは、in vitroで行う。
　プレセプシンは敗血症の検出に用いられるマーカーとして知られているため、この方法は、少なくとも本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片とプレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、敗血症を検出するための方法ということもできる。
　すなわち、少なくとも、１）本発明の抗体を用いて、被験者の検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、２）１）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、敗血症を検出する方法、あるいは、敗血症の検出若しくは診断を補助するための方法ということもできる。このときのカットオフ値は、３１４～６００ｐｇ／ｍＬであり、好ましくは４００～５８０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは４５０～５５０ｐｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００ｐｇ／ｍＬである。
　本発明において、「疾患の検出」は、「疾患の検出の補助」あるいは「疾患の診断の補助」に読み替えて用いられてもよい。
　また、抗体又は抗原結合性抗体断片は、例えば、敗血症と全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪食症候群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも１つの疾患の検出又は評価のために使用することができる。
　術後感染症は、術後に発症した感染症を総称し、手術およびそれに必要な補助療法による全ての感染症を意味する。また、術後感染症は、Guideline for prevention of surgical site infection,1999 (CDC)に基づき術後感染症と診断される疾患全てを含むものである。
　心疾患としては、例えば、急性冠症候群（ACS）、急性心不全、急性非代償性心不全（ADHF）、慢性心不全、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中及び一過性脳虚血発作が挙げられる。
　細菌感染を伴う呼吸器感染症としては、下気道感染症又は肺炎が挙げられる。下気道感染症には急性下気道感染症と慢性下気道感染症が含まれる。急性下気道感染症には急性気管炎、急性気管支炎、急性細気管支炎が含まれ、多くは上気道へのウイルス感染が下気道に波及することにより発症するが、一部で細菌による二次感染が続発する。細菌二次感染の兆候が見られた場合は抗生剤投与の適応となる。慢性下気道感染症は、気管支拡張症や慢性閉塞性肺疾患などで器質的障害を有する下気道に細菌の持続的な感染が成立した病態であり、持続感染と急性憎悪が存在する。下気道の器質的障害を発生させる疾患には、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、びまん性汎細気管支炎、陳旧性肺結核、じん肺、非結核性抗酸菌症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺線維症、慢性気管支喘息などが含まれる。持続感染、急性憎悪ともに抗生剤投与の適応となる。肺炎には市中肺炎、院内肺炎が含まれる。好ましくは市中肺炎である。
　食細胞の機能評価としては、（ａ）好中球、顆粒球および／または白血球の貪食能の測定、（ｂ）好中球、顆粒球および／または白血球の貪食能の測定することによる、免疫機能の評価、（ｃ）自家細胞移植又は他家細胞移植の際の移植用細胞の品質評価、及び、（ｄ）食細胞による貪食が関連する疾患の検出等が挙げられる。食細胞による貪食が関連する疾患としては、例えば、自己免疫疾患、関節リウマチ、乳房炎、痛風、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎、地中海熱、中耳炎、鼻炎、肺炎、結核、膀胱炎、羊水感染症、及び膿精液症が挙げられる。食細胞による貪食が関連する疾患を検出する際に用いる検体としては、組織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、羊水、精液などの体液、また、鼻腔、気管支、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨などを洗浄した後の洗浄液を用いうる。
　本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を用いて、プレセプシンを免疫学的に測定する方法としては、例えば、エンザイムイムノアッセイ（（以下、ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡとも記す）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ），蛍光抗体法（ＦＡＴ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、イムノクロマト法、凝集法、競合法等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明においては、直接法と間接法のいずれが用いられてもよい。ビオチン－アビジン（ストレプトアビジン）複合体を形成させて検出する増感法が用いられてもよい。
　ＥＩＡは、酵素標識抗体を用いた免疫測定法の一つであり、直接法、間接法等が挙げられる。好ましい例としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）である。
　サンドイッチＥＬＩＳＡとは、抗原認識部位の異なる２種類以上の抗体を用いて、あらかじめ一方の抗体は固相に固定し、検出したい抗原を２種類の抗体で挟んで、抗体－抗原－抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。
　化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ：Chemiluminescent Enzyme Immunoassay）は、検体中の抗原と、磁性粒子やビーズ等に固相した抗体を反応させた後、酵素標識抗体を反応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、化学発光基質を加えて酵素反応後、発光強度を測定する方法である。
　例えば、検体中の抗原とビオチンを結合させた抗体を液相で反応させ、ストレプトアビジンを結合させた磁性粒子へ抗体をトラップし、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、酵素標識抗体を反応させ、上記同様の処理を行ってもよい。
　標識酵素としてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いるとき、化学発光基質は、ＣＤＰ－ＳｔａｒＴＭ，ＡＭＰＰＤ(R)，ＣＳＰＤ(R)が用いられることが好ましい。標識酵素がＨＲＰのときは、化学発光基質は、ルミノールが用いられることが好ましい。
　検出感度は、一般的に、化学発光＞蛍光＞吸光（呈色）の順に高いといわれ、求める感度に応じて測定法を選択しうる。
　化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ：Chemiluminescent Immunoassay）は、検体中の抗原と磁性粒子などに固相した抗体を反応させた後、化学発光物質で標識した抗体を反応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、発光強度を測定する方法である。標識物質は、アクリジニウム等が用いられる。
　蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ：Fluorescent Enzyme Immunoassay）は、検体中の抗原と固相化した抗体を反応させた後、酵素標識抗体を反応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、蛍光基質を加えて酵素反応後、蛍光強度を測定する方法である。標識酵素には、ＨＲＰやＡＬＰ等が用いられる。蛍光基質は、標識酵素がＨＲＰのときは、Ａｍｐｌｅｘ(R)Ｒｅｄ等が用いられ、標識酵素がＡＬＰのときは、４－ＭＵＰ（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＡｔｔｏＰｈｏｓ(R)等が用いられることが好ましい。
　電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ：Electro Chemiluminescence Immunoassay）は、検体中の抗原と磁性粒子に固相した抗体及び電気化学発光物質で標識した抗体を反応させた後、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）し、電気エネルギーによる発光強度を測定する方法である。標識物質にはルテニウム等が用いられる。標識物質には、Ｒｕ（ｂｐｙ）３等が用いられ、電極への荷電による酸化と、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）等による還元反応により励起発光を繰り返す。
　放射免疫測定法（（ＲＩＡ：Radioimmunoassay）は、放射性同位元素による標識体を用いた測定方法である。例えば、検体中の抗原とビーズ等に固相した抗体を反応された後、放射性同位元素（１２５Ｉ等）で標識した抗体を反応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、１２５Ｉの放射線量を測定することができる。
　イムノクロマト法は、被検体が、試験ストリップ上を試薬を溶解しながら移動する毛細管現象を応用した免疫測定法である。検体中の抗原が、試験ストリップ上の標識抗体及びキャプチャー抗体の３者と免疫複合体を形成し、標識物の色を確認する方法である。抗体の標識は、金コロイド、酵素、蛍光物質等が用いられる。酵素標識抗体を用いる場合は、試験ストリップ上に酵素基質を配置し発色させる。
　フロースルー法は、不溶性担体であるメンブレン上で、検体中の溶液と共に被験物質である抗原が、抗体－抗原－抗体複合体を形成させる方法である。このとき、メンブレンに固定されなかった物質は、通常は垂直にメンブレンの表から裏を通って除去される。
　凝集法は、検体中の抗原と試薬中の抗体を反応させ、凝集を観察する方法である。固相を用いない方法、固相として人工的に作製された粒子を用いる粒子凝集法（particle agglutination：ＰＡ）、ＰＡの中でもラテックス粒子を用いたラテックス凝集法（latex agglutination：ＬＡ）等が挙げられる。
　競合法は、例えば、固相に抗体を結合させ、被検試料と一定量の標識抗原を同時に反応させ、結合した標識物の量から試料中の抗原の量を測定することができる。
　第一の態様に記載の本発明の抗体又は断片は、上述の測定方法に好ましく用いられる。
　プレセプシン測定に用いられる検体は、特に限定されないが、水性の検体が好ましく、例えば、血液（全血、血漿、血清等）、尿、組織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、腹水、用水、精液などの体液、また、鼻腔、気管支、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨などを洗浄した後の洗浄液、あるいは、細胞培養上清、またはカラム溶出液等が挙げられる。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液等で希釈あるいは抽出後濃縮され、測定に用いられる。
　また、検体として、全血検体を用いる場合には、全血検体を採取してから72時間、48時間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、又は4時間以内に分析を実施されてもよい。また、EDTA採血管又はヘパリン採血管により全血検体を採取されてもよい。好ましくは、EDTA採血管に全血検体を採取して6時間以内に分析すること、又は、ヘパリン採血管により全血検体を採取して4時間以内に分析することが挙げられる。
３．ｓＣＤ１４－ＳＴ測定用キット
　本発明の第三の態様は、第一の態様の抗体またはその抗原結合性抗体断片を必須の構成要素するプレセプシン測定用キットである。
　本発明の測定キットは、好ましくは、プレセプシン測定のための補助試薬を含む。補助試薬としては、例えば、一次抗体、二次抗体、標識抗体、標識酵素、金コロイド等の標識物質、発色基質、蛍光基質（Ａｍｐｌｅｘ(R)　Ｒｅｄ，ＡｔｔｏＰｈｏｓ(R)，４－ＭＵＰ等）、化学発光基質（ルミノール、ＣＤＰ－ＳｔａｒＴＭ，ＡＭＰＰＤ(R)，ＣＳＰＤ(R)等）、ビオチン－ストレプトアビジン等の特異結合物質、不溶性担体、ブロッキング剤、希釈液、洗浄液、標準物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　第二の態様の、プレセプシン測定法に合わせて、適宜組み合わせて用いられる。
　一次抗体は、好ましくは、プレセプシンに結合する抗体であり、より好ましくは、本発明の抗体と異なるエピトープを認識する抗体が好ましい。例えば、ＷＯ２００４／０４４００５の実施例３に記載のＦ１１０６－１３－３抗体やＦ１０３１－８－３抗体などが挙げられる。
　本発明の抗体と一次抗体のいずれを標識抗体としてもよい。本発明の抗体と一次抗体のいずれも標識されていない場合は、標識された二次抗体を用いてもよい。
　不溶性担体としては、例えば、磁性粒子、ビーズ、ガラス、セルロース、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、ポリプロピレン、プラスチックプレート、ラテックス粒子、不織布、濾紙等が挙げられる。
　抗体の標識は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ等の酵素、金コロイド等、好ましく用いられるが、これらに限定されない。
　例えば、ＨＲＰを用いる場合は、発色基質として、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）等が挙げられる。ＡＬＰを用いる場合は、発色基質としてｐ－ニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）等が挙げられる。β－ガラクトシダーゼを用いる場合の発色基質としては、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ｏ－Nitrophenyl －β－D-Galactopyranoside：ＯＮＰＤ）等が例示される。
　例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法用の測定キットは、本発明の抗体及び一次抗体（いずれかの抗体が酵素標識されていてもよい）、発色基質、希釈液、標準物質等を含有しうる。本発明の抗体及び一次抗体が標識されていない場合、標識された二次抗体を含有してもよい。
　化学発光酵素免疫法（ＣＬＥＩＡ）用の測定キットは、例えば、磁性粒子等に固相化した抗体、酵素標識抗体、化学発光基質、希釈液、洗浄液等を含有しうる。
　蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）の測定キットは、例えば、磁性粒子等に固相化した抗体、酵素標識抗体、蛍光基質、希釈液、洗浄液等を含有しうる。
　電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）の測定キットは、例えば、ビオチン化抗体、Ｒｕ（ｂｐｙ）３標識抗体、ストレプトアビジンコーティング磁性粒子、トリプロピルアミン等を含有しうる。
　イムノクロマト法による測定キットは、試料添加部、試薬部、検出部及び吸収部を、試験添加部に添加される液性検体が上記の順に移動するように設けた試験ストリップである。例えば、試薬部に標識した第二の抗体を含浸させ、検出部に第一の抗体が結合した不溶性担体を設置することができる。
　試験ストリップは、多孔性担体等を用いることが例示される。多孔性担体は、例えば、ニトロセルロース、セルロース、セルロース誘導体、ナイロン、ナイロン繊維、ガラス線維、多孔性合成ポリマー等が挙げられる。吸収部は、水吸収性材料のスポンジ等の吸収ポリマー、セルロース濾紙、濾紙等が挙げられる。
　敗血症患者では、特徴的にプレセプシン血中濃度が上昇することが報告されているため、本発明の第三の態様のプレセプシン測定用キットは、敗血症の検出用キット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するためのキットであってもよい。
　また、本発明の第三の態様のプレセプシン測定用キットは、敗血症の診断薬、あるいは、敗血症診断の補助薬として用いることができる。プレセプシン測定用キットは、このような敗血症の検出等を目的とするとき、本発明の抗体を用いて測定した、被験者の検体中のプレセプシン濃度が、カットオフ値より高値であるときに、被験者を敗血症の可能性があると判定し、検出又は診断を補助することができる。このとき、カットオフ値は、３１４～６００ｐｇ／ｍＬであり、好ましくは４００～５８０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは４５０～５５０ｐｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００ｐｇ／ｍＬである。
　また、プレセプシン測定用キットは、例えば、敗血症と全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪食症候群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも１つの疾患の検出又評価のために使用することができる。プレセプシン測定用キットは、上記に記載の少なくとも１つの疾患の検出又は評価のためのキットであってもよい。
４．第一の態様に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコードするポリヌクレオチド
　本発明の第四の態様として、本発明の第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは核酸が提供される。該ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ等）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）が含まれる。 ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってもよい。例えば、市販のキットを用いて、本発明の抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することができる。ＰＣＲ法等により目的とする遺伝子を増幅してもよい。
　ある実施態様では、本発明の抗体は、可変領域の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有することを要する。また、ＣＤＲ配列についても、抗体のＣＤＲ全体（ＶＨ　ＣＤＲ１～３及びＶＬ　ＣＤＲ１～３）をコードする塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有することを要する。これらは、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
　また、ある実施態様では、本発明の抗体は、可変領域の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる抗体も包含される。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）　に記載の方法等に従って行うことができる。
　ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ～約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ～約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
５．第四の態様に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
　第五の態様は、本発明の抗体又は抗体結合性抗体断片のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを導入したベクターである。ベクターは、好ましくは、第一の態様に記載した抗体遺伝子の発現に適合するベクター及び／または発現ベクターであり、当業者が用いうる技術を用いて作製することができる。
６．第一の態様に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を産生する細胞
　本発明の第六の態様として、本発明の第一の抗体又はその抗原結合性抗体断片を産生する細胞が提供される。このような細胞の例としては、ハイブリドーマ、形質転換株、または、本発明の抗体の遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞等がある。
　抗体を産生するハイブリドーマとしては、具体的には、実施例１に示されたクローンが挙げられる。
　形質転換株は、例えば、第一の態様に記載した宿主細胞（例えば、ＣＯＳ－１細胞、ＣＨＯ細胞等）に、前記記載の本発明の抗体又はその抗体結合性抗体断片のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを導入したベクターを導入することにより得ることができる。
　ハイブリドーマや形質転換株の作製方法は、第一の態様に記載のとおりである。
７．形質転換株を用いる抗体または抗原結合性抗体断片の製造方法
　本発明の第七の態様は、第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片をコードするヌクレオチドが導入されたベクターを含む形質転換株を培養する工程を含む、抗体又は抗原結合性抗体断片の製造方法である。
　形質転換株の培養物中に、第一の態様の抗体又は抗原結合性抗体断片を生成させ、培養物中から抗体又は抗原結合性抗体断片を採取する。詳細は、第一の態様で説明したとおりである。
８．抗プレセプシン抗体のスクリーニング方法
　本発明の第八の態様は、少なくとも下記の工程を含む、検体中のプレセプシン測定に有用な抗プレセプシン抗体を得るための、抗体のスクリーニング方法である。
　　　　・　候補の抗体を用いてプレセプシン測定系を構築する工程、
　　　　・　該測定系を用いて、検体中のＴＧ濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する工程
　すなわち、この方法は、抗体を用いた測定系でＴＧの干渉試験を行うことを特徴としている。候補の抗体（好ましくは、抗プレセプシン抗体）を得る方法は、本発明の第一の態様あるいは第七の態様に記載のとおりである。プレセプシン測定系は、検体のプレセプシン値を測定する測定系であればよく特に限定されないが、例えば、第二の態様に記載した測定系が挙げられ、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ等を用いうる。
　検体中のＴＧ濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する工程は、例えば、ＴＧ無添加の検体のプレセプシン測定値と、同検体にＴＧを一定量添加したときのプレセプシン測定値とを比較し、両測定値の解離から影響を決定しうる。例えば、一つの例としては、複数の検体を用いてＴＧ干渉試験を行い、ＴＧ無添加時のプレセプシン測定値に対し、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高いときに、検体中のＴＧがプレセプシン測定値に与える影響は小さいと決定してもよく、当該抗体はＴＧ干渉を受けにくく、プレセプシン測定に有用な抗体であると決定してもよい。
　あるいは、別の評価方法として、候補の抗体とＳ６８抗体とでＴＧ干渉試験を実施して解離度を比較することにより評価してもよい。好ましい態様の一つとして、候補の抗体を用いてＴＧ干渉試験を実施したときのプレセプシン測定値の解離が、Ｓ６８抗体の同条件における解離度と類似するとき、当該抗体は検体中のプレセプシン測定に有用な抗体であると決定しうる。例えば、一つの例としては、複数の検体を用いてＴＧ干渉試験を行い、候補の抗体を用いた測定系において、ＴＧ添加により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときの解離度と、Ｓ６８抗体を用いた測定系における同条件下の解離度とから解離度の差を決定し、解離度の差が２０％以下、好ましくは１０％以下を示す検体の比率が高いとき、当該抗体は検体中のプレセプシン測定に有用な抗体であると決定してもよい。
　本発明のスクリーニング方法は、任意に、候補の抗体とＳ６８ペプチドあるいはプレセプシンとの結合活性を決定する工程を含んでもよい。また、本発明のスクリーニング方法は、任意に、候補の抗体を用いたプレセプシン測定系により正常人と敗血症患者の検体を測定し、測定値の差を比較する工程を含んでもよい。これらは実施例１の記載に従い、実施しうる。
　前記スクリーニング方法の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の工程を含む方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および
２）当該候補の抗体を用いてプレセプシン測定系を構築し、ＴＧ添加により検体中のＴＧ濃度を２０ｍｇ／ｍＬとしたとき、プレセプシン測定値の解離度が±２０％以下を示す検体比率が５０％以上である前記抗体を選択する工程。
　前記方法において、検体中のＴＧ濃度（ここでは２０ｍｇ／ｍＬ）、プレセプシン測定値の解離度（ここでは±２０％）、及び、検体比率は適宜変更可能である。また、前記２）の工程は、本発明の第一の態様に記載の、他のＴＧ干渉試験及び／又は評価方法に置き換えても実施可能である。
　本発明の第八の態様において、別の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の工程を含む本発明の抗体のスクリーニング方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および
２）当該抗体が、プレセプシンの配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列をエピトープとして特異的に認識する前記抗体を選択する工程。
　前記方法において、２）の工程では、特に限定されないが、本発明の第一の態様に記載のエピトープの決定方法等を用いることができる。
例えば、２）は、以下の工程であってもよい。
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される前記抗体を選択する工程。
上記エピトープの決定方法は、任意で以下の３）の工程を加えてもよい。
３）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１の配列からなるアミノ酸残基の少なくとも１つによる、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止は２０％未満である前記抗体を選択する工程。
　また、本発明の第八の態様において、別の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の工程を含む本発明の抗体のスクリーニング方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および、
２）当該候補の抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用いて得られた同検体中のプレセプシン測定値との相関係数が０．９以上を示す前記抗体を選択する工程。
　前記方法は、本発明の第一の態様、及び、実施例５の記載に従い、実施可能である。相関係数も適宜変更可能である。
　また、本発明の第八の態様において、別の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の工程を含む本発明の抗体のスクリーニング方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る、および
２）プレセプシンに対して、１０－８Ｍ未満の親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）で結合する抗体を選択する工程。
　前記　２）の工程は、以下の工程に置き換えられてもよい。
２）該抗体のプレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する結合活性と比較して優れる抗体を選択する工程。
　親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）や結合活性の測定は、本発明の第一の態様の記載に従い実施可能である。結合活性は、吸光度比で評価してもよい。好ましくは、Ｓ６８抗体とプレセプシンを反応させたときの吸光度を１としたときの、本発明の抗体とプレセプシンを反応させたときの吸光度の比は２以上である。
　以上の本発明の抗体のスクリーニング方法は、各工程を組み合わせて実施されてもよい。好ましい組み合わせは、例えば、以下のとおりである。
　少なくとも以下の工程を含む、抗プレセプシン抗体のスクリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される前記抗体を選択する工程、および、
３）該抗体のプレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する結合活性と比較して優れる抗体を選択する工程。
９．敗血症患者の治療方法
　本発明の第九の態様は、本発明の第一の態様の抗体又は抗原結合性抗体断片を用いて、敗血症の検出を補助するための方法が施行された被験者に対して、敗血症治療を行う、敗血症患者の治療方法である。
　敗血症の検出を補助するための方法は、本発明の第二の態様に記載のとおりである。敗血症治療は、特に限定されないが、例えば、抗菌薬やステロイドの投与、昇圧剤、補液、酸素投与、人工呼吸管理、持続的血液濾過透析、血漿交換などが挙げられる。
１０．被験薬（又は治療薬）のスクリーニング方法
　本発明の第十の態様は、本発明の第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片、あるいは、第三の態様のキットを用いて、被験薬（又は治療薬）が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程を含む、被験薬（又は治療薬）のスクリーニング方法である。被験薬が対象とする疾患は、被験者の検体中のプレセプシン濃度が上昇する疾患であれば特に限定されない。好ましくは、被験薬の投薬前と投与後で被験者の検体中のプレセプシン濃度を比較して、被験薬投与後のプレセプシン濃度が投与前と比較して低下するか否かを決定する。あるいは、被験薬投与後の被験者の検体中のプレセプシン濃度が正常人レベルまで低下するか否かを決定してもよい。
　すなわち、以下の工程を含む被検薬のスクリーニング方法である。
１)被検薬が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程
１１．ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と抗体重鎖のＦｃ領域を含む構造を有する。
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの作製は、例えば、実施例９－（２）に記載するように、ヒトｓＣＤ１４の１位から６４位の配列の下流にトロンビン認識配列を有する配列、及び、ヒト由来ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域の配列を有する、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃを発現する一過性発現用プラスミドを、ＣＯＳ－１細胞のような宿主細胞にトランスフェクションし、その宿主細胞を培養し、得られた培養上清を回収して精製することにより得ることができる。
　ヒトｓＣＤ１４の１位から６４位の配列とＦｃの間には、切断を容易にする配列が挿入されることが望ましく、特に限定されないが、トロンビン認識配列の他にも、例えば、Factor Xa認識配列、PreScission Protease認識配列などが用いられてもよい。ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、切断を容易にする配列を有することは必須ではない。
　抗体重鎖のＦｃ領域は、ヒト由来ＩｇＧ１抗体由来の他にも、あらゆる抗体のＦｃ領域が使用可能である。宿主細胞も特に限定されない。
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、ＣＯＳ－１細胞等の宿主細胞を培養することで得られるため発現が容易であり、また、ＦｃはプロテインＡと特異的に結合し、精製にプロテインＡカラムを用いることができるため、精製も容易であるという製造上の利点を有する。Ｆｃ領域を切断後の精製は、プロテインＡカラムの他にも常法を用いて精製が可能であり、例えば、ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１３に記載の方法等を用いて精製してもよい。
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、Ｆｃ領域を切断してｒｓＣＤ１４－ＳＴとして用いることもできるし、Ｆｃ領域を切断しないでｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃのまま用いることもでき、両者とも抗プレセプシン抗体と特異的に結合する。
　実施例９－（２）で作製したｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、ｒｓＣＤ１４ＳＴとＦｃの間に、ｒｓＣＤ１４－ＳＴ標準品調製時と同じトロンビン配列を挿入している。Ｆｃ領域をトロンビンで切断して得られるｒｓＣＤ１４ＳＴは、ｒｓＣＤ１４ＳＴ標準品と同一配列を有し、同等の特性を有する（ＷＯ２００５／１０８４２９参照）。
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－ＦｃからのｒｓＣＤ１４の調製は、Ｆｃ領域の切断後、プロテインＡカラムを通すことでＦｃのみを容易に除去することができ、調製も容易である。ｒｓＣＤ１４ＳＴ－ＦｃのＦｃ領域の切断手段は、挿入した切断を容易にする配列に合わせて適宜選択しうる。
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、Ｆｃ領域を切断しないでｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃのままでも、ｒｓＣＤ１４－ＳＴの活性を有するため、抗原として利用可能である。
　従来のｒｓＣＤ１４－ＳＴ標準品は、ヒトｓＣＤ１４の６４位と６５位の間にトロンビン認識部位を挿入したｒｓＣＤ１４を宿主細胞で発現させて、トロンビン認識部位で切断して得られる。ｒｓＣＤ１４の構造は、ｒｓＣＤ１４－ＳＴを含むが、そのままではｒｓＣＤ１４－ＳＴとしての反応性をほとんど示さず、切断して精製した後、ｒｓＣＤ１４－ＳＴの活性が得られ、使用可能となる。一方、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃは、Ｆｃ領域を切断しなくてもｒｓＣＤ１４－ＳＴと同様に用いることができるため、切断の手間を削減でき、簡易に使用できる。
（実施例１）合成ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の作製
１－（１）ウサギの免疫
　ＷＯ２００４／０４４００５の実施例１に記載の方法に従い、投与抗原の作製、ウサギの免疫を行った。すなわち、配列番号２に記載の配列（配列番号３に記載の５３位から６８位の配列に該当）からなるペプチド（以下、Ｓ６８ペプチドと記載）のＮ末端にシステインを挿入したペプチドを作製した。このペプチドにＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ）を結合し、投与抗原とした（以下、Ｓ６８ペプチド－ＫＬＨと記載）。
　Ｓ６８ペプチド－ＫＬＨ１００μｇを等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混合後、ニュージーランド白色ウサギ（３月齢）の背部皮内に投与した。その２週間後とさらにその１週間後にそれぞれ、Ｓ６８ペプチド－ＫＬＨ１００μｇをフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮内に投与した。さらに２回Ｓ６８ペプチド－ＫＬＨ２０μｇを耳静脈内に投与した。
　投与終了１週間後耳静脈より採血し、定法に従い抗血清を分離し、抗体価及びプレセプシンに対する反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて確認した。すなわち、イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１、Ｎｕｎc社）に、Ｆ１１０６－１３－３を固定化後、ブロッキングした。ウサギの各抗血清をＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、×1/1000～×1/32000倍までの倍々希釈列（8ポイント）を調製した。プレセプシン標準品（ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１６に記載のｒｓＣＤ１４－ＳＴ）を希釈液（0.1％ＢＳＡ/Ｄ-ＰＢＳ）で希釈し3ng/mLの標準液を調製した。抗血清希釈列をプレートに添加し、続いて3ng/mLの標準液を添加した。プレートを1時間反応させ、続けてプレートを0.05％Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。次に抗ウサギIgs-HRP（DAKO、P448）を希釈した溶液を100μL添加し、25℃で1時間反応させた。同様に5回プレートを洗浄後、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を添加し、室温10分間反応させた。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止した。450/650nmの吸光度をＭｕｌｔｉｓｋａｎＪＸ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。吸光度測定の結果に基づき、抗体価の高い個体を選択した。
　脾臓の採取4日前にＳ６８ペプチド－ＫＬＨ４００μｇを耳静脈内に投与し、脾臓を無菌的に採取し、リンパ球を回収した。
１－（２）細胞融合およびクローニング
　米国特許第７４２９４８７号に記載の方法に従って、２×１０８cellsのリンパ球とウサギ由来不死化Ｂリンパ球融合パートナーの１×１０８cellsとを混合し、２回に分けて細胞融合を実施した。融合した細胞を９６穴プレートに播種し、常法に従って培養した。
　得られた２８６クローンの培養上清について、投与抗原との結合活性をS６８ペプチド-ＢＳＡを用いて確認し、結合活性が確認された７２クローンを選択した。
　投与抗原との結合活性が確認された７２クローンについて、１－（１）と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡ系により、プレセプシン標準品との結合活性を確認し、結合活性が確認されたクローンを選択した。
　プレセプシン標準品との結合活性が確認されたクローンについて、患者の血中のプレセプシンに対する特異性の確認を行った。すなわち、正常人血清３例（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社）及び敗血症患者血清３例（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）を希釈液で5倍希釈し、１－（１）と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて同様に測定した。その結果、プレセプシン標準品との反応性が良好であり、かつ、正常人検体で吸光度が上昇せず、敗血症患者検体で吸光度が上昇する５クローンを選択した。各クローンを限界希釈法にてクローニングしたのち、凍結アンプルをそれぞれ調製した。
１－（３）ＢＩＡＣＯＲＥによる結合様式の解析
　選択したクローンから得られる各抗体とプレセプシンとの結合様式を確認するため、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥヘルスケア）を用いて解析を行った。ＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア）にＦ１１０６－１３－３抗体を定法により固定化し、そこにプレセプシン標準品（１μｇ／ｍｌ）を添加した。さらに希釈した培養上清（0.5μg/mｌ）を添加し、センサーグラムをプロットした。どのクローンも解離相での解離が認められない良好な結合様式を示した。
１－（４）ウサギモノクローナル抗体の調製
　作製したウサギ抗プレセプシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを用いてウサギモノクローナル抗体を調製した。すなわち、定法に従い凍結アンプルを解凍し、１０％牛胎児血清、８％サプリメントＡ（Ａｂｃａｍ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）で培養後、細胞を回収しＣＥＬＬｉｎｅ（Ｉｎｔｅｇｒａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のプロトコールに従いＩＳ－ＭＡＢ-ＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ）で培養し抗体を含む培養上清を回収した。次に得られた培養上清からｒｍｐ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ＧＥヘルスケア）を用いて抗体を精製した。精製抗体を含む溶出液を濃縮し、続けてＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。抗体のタンパク濃度は牛ＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を標準品としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で求めた。得られた抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、分子量約１５０ｋＤａの単一バンドが確認され、また還元することで約５０ｋＤａの重鎖と約２５ｋＤａの軽鎖が確認された。
（実施例２）組換え抗体の作製
２－（１）ウサギモノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列の決定と発現用プラスミドの構築
　実施例１で得られた、各ハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＲａｂｂｉｔ　Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ（Ｒａｄｅｒ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．　ＪＢＣ　２０００；２７５：１３６６８－７６、および　Ｌａｎｇ　Ｉ，　ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ　１９９６；１７２：２９５－８）によるＰＣＲで可変領域を増幅し、常法に従い、重鎖および軽鎖の各可変領域の塩基配列を決定した。
　可変領域以外の配列情報はデータベース上を検索し、５’側プライマーおよび３’側プライマーを設計した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、重鎖全長および軽鎖全長をそれぞれ増幅し、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであり、ＥＦ－１αプロモーター及びＣＭＶエンハンサーを有するｐＴＫ－２４３３へクローニングした。常法に従い、重鎖全長および軽鎖全長の塩基配列及びそれらにコードされるアミノ酸配列を決定した。抗体の可変領域のＣＤＲ部分のアミノ酸配列を表１０および表１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
２－（２）一過性発現組換え抗体の調製
　前記２－（１）で作成した一過性発現用プラスミド（重鎖配列を含む発現プラスミドと軽鎖配列を含む発現プラスミド）を等量混合しＣＯＳ―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１６５０）に、トランスフェクションした。すなわち、トランスフェクション試薬２μＬ/ｍＬ及びプラスミド４μg/ｍＬを混合し、培地に添加した後、ＣＯＳ―１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収し、さらに新しい培地を添加した。９６時間後、培養上清を回収し２回分を混合後、０．２２μｍのフィルター（Ｓｔｅｒｉｖａｃ、ミリポア）でろ過した。得られた培養上清は、前記１－（４）に記載の方法に従って精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、約１５０ｋＤａの単一バンドの組換え抗体が確認された。
２－（３）組換え抗体安定発現用プラスミドの構築
　前記２－（２）で作成した一過性発現用プラスミドから制限酵素を用いて重鎖をコードする遺伝子断片と軽鎖をコードする遺伝子断片を切り出し、ＥＦ－１αプロモーター、およびマウスＤＨＦＲ発現ユニット〔プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター（エンハンサー領域は含まない）、ＳＶ４０由来ｐｏｌｙＡシグナル〕を有するプラスミド（ｐＴＫ-２５７７；特開２００７－２１５５４６に記載）に組み込み、哺乳動物細胞での安定発現用プラスミドを作製した。
（実施例３）ＣＨＯ細胞による抗体の作製
３－（１）ウサギモノクローナル抗体の遺伝子組換え抗体産生ＣＨＯ細胞の調製
　ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ　ＤＸＢ１１）に、前記２－（３）で構築した安定発現用プラスミドをトランスフェクションし、ウサギ抗体産生形質転換ＣＨＯ株を樹立した。即ち、ＨＴ　ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　（５０×）　Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ；終濃度１×で使用）及び２００ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ；終濃度４ｍＭで使用）を含むＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２　ＰＦ　ＣＨＯ（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて馴化培養したＣＨＯ　ＤＸＢ１１をトランスフェクション当日に遠心後、８×１０６ｃｅｌｌｓ／１５０ｃｍ２　Ｒｏｕｘの濃度でフラスコに植え込んだ。ＦｕＧＥＮＥ６（プロメガ）１２５μｌを用いて、発現プラスミド１２．５μｇをＦｕＧＥＮＥ６添付プロトコールに準じ調製し、先のＣＨＯ　ＤＸＢ１１へ導入した。５％ＣＯ２で３７℃、２日間培養した後に、細胞を回収し、ＨＴ不含４ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ含有ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２　ＰＦ　ＣＨＯ培地（以下ＥＸ－ＣＥＬＬ（ＨＴ－）と記載）で二度洗浄し、ＥＸ－ＣＥＬＬ（ＨＴ－）に再度懸濁した。次に１２，５００～５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに細胞を蒔き直し、５％ＣＯ２、３７℃で培養を続け、３日あるいは４日毎に培地の半量を新しいＥＸ－ＣＥＬＬ（ＨＴ－）に交換した。約２週間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細胞を新しいプレートに移した。
　ＣＨＯ細胞の培養上清中の抗体を、Ｓ６８ペプチド抗原を固相に使用したＥＬＩＳＡ法でスクリーニングしＳ６８ペプチドと結合する抗体を産生するＣＨＯ細胞を５種類選択した。
３－（２）Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅを用いた遺伝子増幅
　３－（１）で得られた組換え抗体発現形質転換ＣＨＯ株を、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（以下ＭＴＸと表記）を含むＥＸ－ＣＥＬＬ（ＨＴ－）培地で選択培養することにより、遺伝子増幅作業を行い目的の組換え抗体の生産量が上昇しているクローンの選択を行った。　即ち、実施例３－（１）で得られた形質転換株を３０ｎＭ　ＭＴＸ含有ＥＸ－ＣＥＬＬ（ＨＴ－）培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに巻き込んだ。３日あるいは４日毎に培地の半量を新しい３０ｎＭ　ＭＴＸ含有ＥＸ－ＣＥＬＬ（ＨＴ－）に交換し、コロニーが生じるまで５％ＣＯ２、３７℃で培養を続けた。得られたコロニーの培養上清中へのＩｇＧ濃度をＥＩＡ法で確認し、生産量の増加しているクローンを選択した。その結果、生産量が約２ないし１０倍上昇した形質転換株を得ることができた。尚、この遺伝子増幅した形質転換株を、ＭＴＸ濃度を３ないし１０倍上げた培地で選択培養を繰り返すことにより、さらに生産量が増加するクローンを得ることができる。
３－（３）ＣＨＯ細胞による組換え抗体の生産
　３－（２）で得られたクローンを３０ｎＭ　ＭＴＸ含有ＣＨＯ－ＳＦＭ（ＨＴ－）培地（ＧＩＢＣＯ）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで植え込み、３７℃で７日間培養した。得られた培養上清を以下の精製に用いた。培養上清を、プロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ－Ａ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。精製した組換え抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところハイブリドーマ由来の抗体と同等の分子量を示す抗体が確認された。
（実施例４）サンドイッチＥＬＩＳＡ系での各抗体の反応性評価
実施例２で調製したウサギモノクローナル抗体５種、ＷＯ２００４／０４４００５の実施例１に記載のＳ６８抗体（Ｓ６８ペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体）及びＷＯ２００４／０４４００５の実施例２に記載のＦ１１４６－１７－２（Ｓ６８ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体）について、プレセプシンとの反応性評価を行った。
すなわち、各抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一夜反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．1％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬）を含むＰＢＳを各ウエルに２００μＬ添加しブロッキングした。次に、プレセプシン標準品を希釈液で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈し、続けて３倍公比により希釈し、標準品の希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当たり５０μＬ添加し、２５℃で１時間反応した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１１０６－１３－３抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。２５℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、ＴＭＢ溶液を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍ（副波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　測定結果を表１２に示す。実施例２で調製した各ウサギモノクローナル抗体を用いた測定系はいずれもプレセプシン標準品との反応性に優れ、Ｓ６８抗体を用いた測定系とほぼ同等の反応性を示した。
　一方、Ｆ１１４６－１７－２を用いた測定系は反応性が低く、プレセプシン濃度が１０００ｎｇ／ｍＬのときの吸光度は０．３６８であった。この吸光度は、ウサギモノクローナル抗体を用いた測定系では、プレセプシン濃度が０．０３～０．１ｎｇ／ｍＬのときの吸光度とほぼ同等であった。このことから、ウサギモノクローナル抗体を用いた測定系は、Ｆ１１４６－１７－２を用いた測定系と比較して、約１万倍反応性を改善したことが明らかとなった。正常人検体のプレセプシン濃度は、通常、約５０～３００ｐｇ／ｍＬであるため、Ｆ１１４６－１７－２を用いた測定系では測定不能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
（実施例５）患者検体の測定と干渉試験
　実施例２で作製した各抗体を用いて、実施例４に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ系により、敗血症患者検体３０例の血中プレセプシン値の測定を行い、Ｓ６８抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系による測定値との相関分析を行った。
　その結果、各ウサギモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系において、Ｓ６８抗体を用いたＥＬＩＳＡ系による測定値と相関のよい系と劣る系が存在した。ウサギモノクローナル抗体のＦ１４６６－１２、Ｆ１４６６－１９の相関係数は、他と比較して劣る結果であった。それぞれの抗体の相関係数は、Ｆ１４６６－１２は０．８９、Ｆ１４６６－１９は０．９３、Ｆ１４６６－２６は０．９８であった。
　次に、各ウサギモノクローナル抗体、及び、Ｓ６８抗体を用いて、それぞれ作製したサンドイッチＥＬＩＳＡ系において、血中の干渉物質（ビリルビンF、ビリルビンC、ヘモグロビン、リウマチ因子、及びトリグリセライド）がプレセプシン測定値に与える影響を検討した。一定量のプレセプシンを添加した健常人の血清に、段階的な濃度の各干渉物質を添加してプレセプシン濃度を測定し、各干渉物質が測定値に与える影響を、干渉物質無添加のときの測定値を基準として評価した。
　その結果、いずれの抗体を用いた測定系においても、ビリルビンＦ、ビリルビンＣ、ヘモグロビン及びリウマチ因子の干渉は問題とならないレベルであった。
　一方、トリグリセリド（ＴＧ）については、一部の抗体を用いた測定系に影響を与えた。ＴＧ干渉試験は次のように実施した。検体は一定量のプレセプシンを添加した正常人ヒト血清を用いた。イントラリピッド輸液２０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社）を用いて検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬまで段階的に希釈サンプルを作製した。このＴＧ濃度は検体の血清に元々含まれるＴＧは考慮していない。希釈サンプルを検体希釈液で２０倍希釈し、ＥＬＩＳＡによりプレセプシン値を測定した。複数の検体についてこのＴＧ干渉試験を実施した。
　この結果、Ｆ１４６６－１２、Ｆ１４６６－１９の抗体を用いた測定系については、ＴＧ添加がプレセプシン測定値に影響を与え、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度は±２０％より大きい検体の比率が高かった。
　また、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度を、複数の検体で求め、その解離度の平均値を各抗体について算出した。その結果、解離度の平均値が±２０％以下を示すのは、Ｓ６８抗体、Ｆ１４６６－５、及び、Ｆ１４６６－２６を用いた測定系であった。
　一方、Ｆ１４６６－１２、Ｆ１４６６－１９、及びＦ１４６６－１６の抗体を用いた測定系においては、解離度の平均値は±２０％を超える結果であった。
　さらに、各ウサギモノクローナル抗体を用いたアッセイ系とＳ６８抗体を用いたアッセイ系の間で、ＴＧ添加によるプレセプシン測定値の解離度を比較した。すると、ＴＧ添加により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときの、Ｆ１４６６－１２の測定系の解離度とＳ６８抗体の測定系の解離度の差、及び、Ｆ１４６６－１９の測定系の解離度とＳ６８抗体の測定系の解離度の差は、いずれも２０％より大きい差を示す検体の比率が高かった。
　このことから、ＴＧ干渉試験における抗体の性能の違いが、前記相関分析の結果に影響を与えている可能性が示唆された。
　Ｆ１１４６－１７－２についても干渉物質の試験を試みたが、反応性が低いため、データが得られなかった。
（実施例６）抗体の特異性　エピトープ解析
実施例２で作製した各ウサギモノクローナル抗体及びＦ１１４６－１７－２（Ｓ６８ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体）のエピトープの解析を行った。
　実施例１で投与抗原とした配列番号２のペプチド配列の部分断片を含む１０アミノ酸からなるペプチドを８種類合成し（表１３参照）、実施例４に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ系によりプレセプシン標準品との競合阻止反応を見ることでエピトープ配列を検討した。すなわち、実施例４に記載の方法にしたがって、各抗体の固定化プレートを調製した。次にプレセプシン標準品４００ｐｇ／ｍＬと表１３に示した合成ペプチド（Ｐ０１～Ｐ０８）２０μｇ／ｍＬを各２５μＬプレートに添加し、反応させた。陰性コントロールとしてペプチド無添加（ＰＢＳと記載）及びネガティブコントロール用ペプチド（ＮＣと記載：配列ＣＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥ（配列番号３４））を用いた。また、陽性コントロールとしてＳ６８ペプチドを用いた。反応終了後、ＴＭＢで発色させた。合成ペプチドが抗体と反応すると、プレセプシン標準品の抗体への結合が阻害されることから、吸光度が低下した。ＰＢＳの吸光度を１００％として各ペプチドの阻止率を計算した。
　その結果、表１４に示すようにＰ０３のみを認識する抗体、Ｐ０３からＰ０４を認識する抗体、Ｐ０４からＰ０５を認識する抗体が確認された。また、Ｆ１１４６－１７－２はＰ０４からＰ０５を認識することが明らかになった。この結果、Ｐ０３の位置をエピトープとして認識するモノクローナル抗体が得られたことが明らかとなった。実施例５において、ＴＧ干渉試験及びＳ６８抗体を用いた測定系との相関に劣る結果であったＦ１４６６－１２、Ｆ１４６６－１９は、ラットモノクローナル抗体（Ｆ１１４６－１７－２）と同じくＰ０４からＰ０５を認識し、Ｐ０３をエピトープとしないことが分かった。その他の抗体は、Ｐ０３をエピトープとして認識していた。このことから、抗体がプレセプシン測定に適する性能を有することと、抗体が認識するエピトープとの関連性が示唆された。また、プレセプシンは、高分子量ｓＣＤ１４のＣ端部を大きく欠損したアミノ酸配列を有しており、そのアミノ酸の長さにはバリエーションがあると想定される。抗体の特異性の違いが、実施例５におけるＳ６８抗体を用いた測定値との相関に影響を与えた可能性も考察された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
（実施例７）エピトープの詳細解析
　Ｐ０３ペプチドを認識するウサギモノクローナル抗体について、Ｐ０３ペプチドを１アミノ酸ずつ改変したペプチドとの反応性を検討した。
　Ｐ０３ペプチド（配列番号１のアミノ酸配列、かつ、配列番号３の配列の５２位から６１位からなるアミノ酸配列に該当）において、５３位から６１位のアミノ酸を、１アミノ酸ずつ、アラニン（元のアミノ酸がアラニンの場合にはグリシン）で置換したペプチド（Ｐ０３１～Ｐ０３９ペプチド）を作製し、Ｐ０３１～Ｐ０３９ペプチドと抗体の反応性を、実施例４の記載に従い、サンドイッチＥＬＩＳＡ系により確認した。
　その結果、Ｐ０３ペプチドにおける配列番号３の５９位のアスパラギン酸（配列番号１の８位に該当）をアラニンに置換したとき、抗体との結合活性が消失した。
　Ｐ０３ペプチドにおける配列番号３の５３位～５８位（配列番号１の２～７位に該当）、配列番号３の６０位及び６１位（配列番号１の９位及び１０位）のアミノ酸をアラニン（又はグリシン）に置換しても、抗体との結合活性は維持された。
　以上より、Ｐ０３ペプチドをエピトープとして認識する抗体は、Ｐ０３ペプチドにおける配列番号３に記載の５３位～５８位、６０位及び６１位のアミノ酸を１アミノ酸ずつアラニン（又はグリシン）に置換したペプチドもまたエピトープとして認識することが確認された。
（実施例８）ウサギ由来抗プレセプシンモノクローナル抗体の改変体の作製
　実施例１に記載のウサギから得られた抗プレセプシンモノクローナル抗体の配列をもとに改変体を作製した。
８－（１）ＣＤＲ配列の解析
実施例１で得た抗プレセプシン抗体５種類のＣＤＲ配列を解析したところ、各抗体の配列には、抗体の活性に影響する配列と、影響しない配列があることが推測された。そこで、実施例６でＰ０３（配列番号１）の配列をエピトープとして認識していることが明らかとなった抗体のひとつであるＦ１４６６－２６抗体のＣＤＲ配列を基本に、各ＣＤＲ配列のアミノ酸の改変を行って改変体を調製し、改変体の活性を評価した。約１００個の改変体を作製した。アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失、あるいは、数個のアミノ酸配列の置換等を行った。
　また、Ｆ１４６６－２６抗体の重鎖全長とＦ１４６６－５抗体の軽鎖全長を含む改変体も調製し、同様に評価した。
８－（２）重鎖改変体調製用プラスミドの調製
重鎖改変体用プラスミドを以下のように調製した。プラスミドｐＴＫ－５７９３について示すが、他のプラスミドも同様の方法で構築した。実施例２で得られたＦ１４６６－２６の重鎖全長を含む重鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ－５６０５）を鋳型とし、プライマー対（ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（１４－１２）－ｅ：３‘側プライマーおよびＡｏｒ１３ＨＩ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＶ２：５’側プライマー）でＰＣＲを行った。さらに得られた増幅断片を鋳型にしてプライマー対（ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（１４－１２）－ｅ、Ａｏｒ１３ＨＩ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＶ２）でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をプラスミドｐＴ７－Ｂｌｕｅへクローニングし、制限酵素Ａｏｒ１３ＨＩで目的の配列を含む断片を調製した。また、ＥＦ－１αプロモーター及びＣＭＶエンハンサーを有し、ウサギＩｇＧのＨ鎖可変領域以外の部位を含む遺伝子配列を有する、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであるｐＴＫ－４２７３（自社）を制限酵素Ａｏｒ１３ＨＩで切断し、ベクター断片を調製した。調製した目的の配列を含む断片をベクター断片にクローニングし、ｐＴＫ－５７９３を調製した。
８－（３）軽鎖改変体調製用プラスミドの調製
軽鎖改変体用プラスミドを以下のように調製した。プラスミドｐＴＫ－５８４４について示すが、他のプラスミドも同様の方法で構築した。実施例２で得られたＦ１４６６－２６の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ－５６０８）を鋳型とし、プライマー対（ｐＥＦ２ｃｅ－２８：３‘側プライマーおよびｐＥＦ２ｃｅ－４９：５’側プライマー）でＰＣＲを行った。さらに得られた増幅断片を鋳型にしてプライマー対（ｐＥＦ２ｃｅ－２８、ｐＥＦ２ｃｅ－４９）でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をプラスミドｐＴ７－Ｂｌｕｅへクローニングし、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで目的の配列を含む断片を調製した。また、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであるｐＴＫ－２４３３（自社）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、ベクター断片を調製した。調製した目的の配列を含む断片をベクター断片にクローニングし、ｐＴＫ－５８４４を調製した。
プライマーの配列
ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（１４－１２）－ｅ　：　５’ＧＧＧ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＧＴＣ　ＧＣＣ　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＣＧＣ　ＣＴＧ　Ｇ　３’(配列番号８５)
Ａｏｒ１３ＨＩ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＶ２　：　５’ＧＧＧ　ＴＣＣ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣ　ＧＧＴ　ＧＡＣ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＧＣＣ　３’ (配列番号８６)
ｐＥＦ２ｃｅ－２８　：　５’ ＴＴＣ　ＡＴＴ　ＣＴＣ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣ　３’ (配列番号８７)
ｐＥＦ２ｃｅ－４９　：　５’ ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　ＡＧＴ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　３’ (配列番号８８)
８－（４）一過性発現組換え抗体の調製
以下、代表例として重鎖改変体調製用プラスミドｐＴＫ－５７９３を用いた抗体の一過性発現の方法を示した。実施例８－（２）で調製した重鎖改変体調製用プラスミド（ｐＴＫ－５７９３）と、実施例８－（３）記載の軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ－５６０８）とを等量混合し、ＣＯＳ―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１６５０）に、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６、プロメガ社）を用いてトランスフェクションした。すなわち、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ製）を希釈液として、トランスフェクション試薬０．９６μＬ／２５μＬ及びプラスミド０．４８μg／２５μLを調製して混合し、培地に添加した後、ＣＯＳ―１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収した。
　同様に、各重鎖改変体調製用プラスミドは、軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ－５６０８）と混合して用いた。各軽鎖改変体調製用プラスミドは、重鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ－５６０５）と混合して用いた。Ｆ１４６６－２６抗体の重鎖全長とＦ１４６６－５抗体の軽鎖全長を含む改変体は、ｐＴＫ－５６０５と、Ｆ１４６６－５の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミドとを混合して作製した。
（実施例９）改変体の評価（１）
　実施例８において、ＣＯＳ－１細胞で発現させて得られた改変体（ＩｇＧ抗体）１６種類を精製し、各抗体のプレセプシンとの反応性、特異性、親和性（ＫＤ値）を評価した。
９－（１）抗体の精製
　８－（４）で得られたＣＯＳ－１細胞の培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター（Ｓｔｅｒｉｖａｃ、ミリポア）でろ過した。得られた培養上清からＰｒｏｓｅｐ　ｖＡ（ミリポア）を用いて精製した。精製物を含む溶出液を濃縮し、続けてＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。タンパク濃度はＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を標準品としてＬｏｗｒｙ法で求めた。得られた抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、約１５０ｋＤａの単一バンドの組換え抗体が確認された。
９－（２）一過性発現ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの調製
　まず、ｐＴＫ３５６Ｈ（ＴＢ６４）（ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１３に記載のｒｓＣＤ１４をコードする配列を有するプラスミド）を鋳型とし、プライマー対（ｈＣＤ１４‐ａ，ｈＣＤ１４‐ｄ）とＴａｑ酵素（タカラバイオ）によりＰＣＲ反応を行った。得られた増幅断片（シグナル配列を含む配列番号３のヒトｓＣＤ１４の１～６４位の配列の下流にトロンビン認識配列を有し、両端に制限酵素部位をもつ）をｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ミリポア）にＴＡクローニングし、配列を確認し、これをｐＴＫ‐３０４７とした。次に、ｐＴＫ‐３０４７を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して得られた断片を、予めｐＴＫ‐２２３３（ヒト由来ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域をコードする配列を有する哺乳細胞用発現プラスミド）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して調製しておいたベクター断片に挿入し、得られたクローンをｐＴＫ‐３０５３とした。
ｈＣＤ１４‐ａの配列　５´‐ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣ‐３´(配列番号８９)
ｈＣＤ１４‐ｄの配列　５´‐ＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＧ‐３´(配列番号９０)
　ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃを発現する一過性発現用プラスミドｐＴＫ－３０５３をＣＯＳ―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１６５０）に、トランスフェクションした。すなわち、トランスフェクション試薬２μＬ/ｍＬ及びプラスミド４μg/ｍＬを混合し、培地に添加した後、ＣＯＳ－１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収し、さらに新しい培地を添加した。９６時間後、培養上清を回収し２回分を混合後、０．２２μｍのフィルター（Ｓｔｅｒｉｖａｃ、ミリポア）でろ過した。得られた培養上清を、Ｐｒｏｓｅｐ　ｖＡ（ミリポア）を用いて精製した。精製物を含む溶出液を濃縮し、続けてＤ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。タンパク濃度は、ＢＳＡ（ＢｉｏＲａｄ）を標準品としてＬｏｗｒｙ法で求めた。得られたｒｓＣＤ１４ＳＴ－ＦｃをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、分子量約７５ｋＤａの単一バンドが確認された。調製したｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの抗プレセプシン抗体との結合活性は、抗原を固相に固定化したＥＬＩＳＡにより確認した。
９－（３）サンドイッチＥＬＩＳＡの構築
　９－（１）で精製した改変体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に各改変体を固定化し、ブロッキングした。次に、プレセプシン標準品（０～３００ｐｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを２５℃で１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次にＦ１１０６－１３－３　Ｆ（ａｂ´）２－ＨＲＰを希釈した溶液を各ウェルに添加し、２５℃で２時間反応させた。同様に５回プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温２０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。
９－（４）特異性の評価（１）
９－（１）で精製した改変体の特異性を評価するため、Ｐ０３ペプチド（実施例６で作製、配列番号１）を固定したプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。比較のため、Ｆ１４６６－２６の評価も行った。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＢＳＡ、又は、Ｐ０３ペプチド－ＢＳＡをそれぞれプレートに固定化後、ブロッキングした。
　９－（１）で得られたタンパク濃度の結果よりＤ－ＰＢＳで希釈し、５００ｎｇ／ｍＬに調製した。各希釈液を１ウェル当たり５０μＬ添加し、プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次に抗ウサギＩｇｓ－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ４４８）を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。同様にプレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温３－５分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で測定した。改変体の改変したＣＤＲ配列とともに、結果を表１６～表２２に示す。
　その結果、改変体の８７％が、Ｐ０３ペプチドと結合することが分かり、Ｐ０３の位置をエピトープとして認識していることが示唆された。すなわち、得られた改変体のうち、５７９５、５８０３、５８１１、５８１０、５７８４、５７９３、５８５８、５８７８、５８７５、５８７６、５８４４、５８７４、及び、５６８４は、Ｐ０３の位置をエピトープとして認識していることが示唆された。
９－（５）親和性の評価
改変体の、プレセプシン（９－（２）で調製したｒｓＣＤ１４ＳＴ－ＦＣを用いた）、Ｐ０３ペプチドおよびＳ６８ペプチドとの親和性（ＫＤ）を評価した。また、Ｓ６８抗体、ラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６－１７－２）、及び、Ｆ１１４６－２６についても同様に評価を行った。
　親和性の測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥヘルスケア）を用いて行った。ＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア）にｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ、Ｐ０３－ＢＳＡおよびＳ６８－ＢＳＡを常法によりそれぞれ固定化し、各抗体希釈列（１．６－１０００ｎＭ）を添加し、それぞれの抗原に対する結合様式を測定した。センサーグラムをプロットし、結合速度定数（Ｋａ）及び解離速度定数（Ｋｄ）を求め、平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。　
　Ｓ６８抗体、ラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６－１７－２）、及びＦ１１４６－２６のｒｓＣＤ１４ＳＴ－ＦＣに対する親和性（ＫＤ）測定の結果を表１５に示した。
　その結果、Ｆ１１４６－２６は（ＫＤ値は１．４８Ｅ－０９）、Ｓ６８抗体（ＫＤ値は１．０８Ｅ－０８）と比較して、プレセプシンとの親和性がＫＤ値で約１０倍高かった。また、Ｆ１１４６－２６は、ラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６－１７－２：ＫＤ値は１．０８Ｅ－０５）と比較すると、プレセプシンとの親和性（ＫＤ値）が約１００００倍高いことが分かった。
　各改変体のｒｓＣＤ１４ＳＴ－ＦＣに対する親和性（ＫＤ）測定の結果を、改変したＣＤＲ配列とともに表１６～表２２に示した。その結果、改変体の８０％が、Ｓ６８抗体と比較して同等以上の親和性を有することが分かった。Ｆ１１４６－２６のＣＤＲ配列の改変により、プレセプシンとの親和性（ＫＤ値）が、Ｆ１１４６－２６に比して、約１０００倍上昇した改変体（５８１０）が得られた。
　本発明の望ましい態様のひとつは、抗体のプレセプシンに対する親和性が、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する親和性と比較して優れる抗体であり、ＫＤ値で比較すると、好ましい抗体としては、例えば、Ｆ１４６６－２６，改変体の５７９５、５８０３、５８１０、５７８４、５７９３、５８５８、５８４４、５６８４が挙げられた。また、抗体のＫＤ値が、１０－８未満を示す抗体も好ましく、Ｆ１４６６－２６、５７９５、５８０３、５８１０、５７８４、５７９３、５８５８、５８４４、５６８４が挙げられた。また、抗体のＫＤ値が、Ｓ６８抗体のＫＤ値の１／２以下を示すプレセプシンとの親和性に優れる抗体も好ましく、Ｆ１４６６－２６、５７９５、５８０３、５８１０、５７８４、５７９３が挙げられる。特に優れたＫＤ値を示したのは、５７９３（７．３Ｅ－１０）と５８１０（６．５２Ｅ－１２）であった。
　Ｆ１１４６－２６の重鎖全長とＦ１１４６－５の軽鎖全長を組み合わせた改変体５６８４は、Ｐ０３特異性及びプレセプシンとの結合活性が維持されることが分かった。Ｆ１１４６－２６とＦ１１４６－５は、同じＰ０３の位置をエピトープとして認識する抗体であることから、同じ特異性をもつ抗体間で配列を置換しても、抗体の活性は維持される可能性が示唆された。
　実施例２で示したとおり、Ｐ０３をエピトープとして認識するＦ１１４６－５及びＦ１１４６－２６の重鎖ＣＤＲ３配列は、いずれもＧＤＦであり、３アミノ酸という比較的短い配列により構成されており、本抗体の特徴的な点と考えられた。
　また、改変体の５７９３では、重鎖ＣＤＲ３の３番目の改変により親和性の上昇がみられたことから、重鎖ＣＤＲ３の３番目のアミノ酸は、抗体の活性に影響する可能性が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
９－（６）特異性の評価（２）　ペプチド競合阻止反応
　実施例６に準じて、各改変体とプレセプシンとの反応に対する、Ｐ０１からＰ０８ペプチドによる競合阻止反応試験を行った。
　試験は、改変体を固相に固定化したＥＬＩＳＡを用いて実施した。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に改変体を固定化後、ブロッキングした。プレセプシン標準品（３００ｐｇ／ｍＬ）を１ウェル当たり２５μＬ添加した。続いて希釈した各ペプチドを（０．０１－１０μｇ／ｍＬ）を２５μＬ添加した。プレートを２５℃で１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次にＦ１１０６－１３－３　Ｆ（ａｂ´）２－ＨＲＰを希釈した溶液を各ウェル５０μＬ添加し、２５℃で２時間反応させた。同様に５回プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温３０－４０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。陰性コントロールとしてペプチド無添加（ＰＢＳと記載）、陽性コントロールとしてＳ６８ペプチドを用いた。ＰＢＳの吸光度を１００％として各ペプチドの阻止率を計算した。その結果、表２３に示すように、試験を実施した改変体は全てＰ０３配列を特異的に認識していることが確認された。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
（実施例１０）改変体の評価（２）
　実施例８で調製した改変体のうち、実施例９で評価を行っていない改変体について、プレセプシンに対する結合活性及び特異性の評価を行った。
１０－（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
実施例８－（４）で得られた培養上清中のＩｇＧ濃度を確認するため、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ濃度を測定した。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ、Ｚ１９６）をプレートに固定化後、ブロッキングした。精製ウサギモノクローナル抗体を標準品として希釈液（０．１％ＢＳＡ/Ｄ-ＰＢＳ）で希釈し１００－１．５６ ｎｇ／ｍＬの標準液を調製した。次に、回収した培養上清を希釈液（０．１％ＢＳＡ/Ｄ-ＰＢＳ）で希釈した。培養上清希釈液又は標準品希釈列をウェルに添加し、プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次に抗ウサギＩｇｓ－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ３９９）を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温１時間反応させた。同様に５回プレートを洗浄後、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を添加し、室温１０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で測定した。各培養上清中の抗体濃度は標準品濃度希釈列の検量線を用いて算出した。
１０－（２）プレセプシンに対する結合活性及び特異性の評価
　改変体のプレセプシンに体する結合活性及び特異性を評価するため、抗原を固相に固定したプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＢＳＡ、ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ、又はＰ０３ペプチド－ＢＳＡをそれぞれプレートに固定化後、ブロッキングした。
　培養上清のＩｇＧ濃度の結果より培養上清をＤ－ＰＢＳで希釈し、５００ｎｇ／ｍＬに調製した（抗体濃度が薄いものは培養上清の原倍を使用した）。各上清希釈液を１ウェル当たり５０μＬ添加し、プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次に抗ウサギＩｇｓ－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ４４８）を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。同様にプレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温３－５分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で測定した。
　プレセプシンに対する結合活性の評価では、比較のため、Ｓ６８抗体の評価も行った。プレセプシンに対する結合活性は、Ｓ６８抗体とｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの反応時の吸光度を１としたときの、各抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの反応時の吸光度の比で表した。結果を、各改変体の改変した配列とともに表２４～表２９に示す。
　その結果、抗体のほとんどがＰ０３と結合することが確認され、７６％の抗体がＰ０３をエピトープとして認識していることが示唆された。
　また、Ｆ１４６６－２６及び改変体の多くは、Ｓ６８抗体と比較して、吸光度比で約４～５倍高い、プレセプシンに対する優れた結合活性を有していた。Ｆ１４６６－２６のプレセプシンに対するＫＤ値及び吸光度比と比較すると、これらの抗体のプレセプシンに対するＫＤ値は、実施例９で測定された、抗体のプレセプシンに対する好ましいＫＤ値と同程度と考えられた。
　本発明の望ましい態様のひとつは、抗体のプレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体の同活性と比較して優れる抗体である。例えば、本実施例に準じて吸光度を用いる場合、Ｓ６８抗体以上の吸光度を示す抗体、好ましくは、Ｓ６８抗体の２倍以上の吸光度を示す抗体が望ましいと考えられた。
　得られた抗体のうち、プレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体の５倍以上の吸光度を示す、特に結合活性に優れた抗体は、５９３４、５９３５、５９３９、５９４４、５８０８、５８０９、５８２４、５９７９，５９８０、５９８３、５９８４、５９８７、５９８８、５８６０、５８６４、５８６３であった。中でも、５９７９、５９８３、５９８８、５８６４は、Ｓ６８抗体の５．５倍以上の吸光度を示し、特に優れたプレセプシンに対する結合活性を有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
  
（実施例１１）
合成ペプチドを抗原としたファージディスプレイ法を用いたモノクローナル抗体の作製
　実施例１－（１）において、Ｓ６８ペプチド－ＫＬＨを投与抗原としてウサギに免疫して回収した脾臓からのリンパ球を用いて、ファージディスプレイ法によりモノクローナル抗体を作製しうる。
１１－（１）免疫Ｆ（ａｂ）ファージライブラリーの構築
ＣＡＲＬＯＳ　Ｆ．　ＢＡＲＢＡＳIII等　Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って実施しうる。実施例１－（１）で回収したリンパ球よりＴＲＩＺＯＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡからＢＡＲＢＡＲＳIII等より報告されているウサギ抗体遺伝子特異的プライマーを用いて重鎖可変領域を含む断片と軽鎖可変領域を含む断片を調製する。得られたウサギ重鎖可変領域およびヒト重鎖ＣＨ１の増幅断片を鋳型にしてＰＣＲによりウサギ／ヒトキメラ重鎖断片を増幅し、ウサギ軽鎖可変領域（カッパ型又はラムダ型）およびヒト軽鎖定常領域の増幅断片を鋳型にしてウサギ／ヒトキメラ軽鎖断片を増幅する。得られたこれらウサギ／ヒトキメラ重鎖およびウサギ／ヒトキメラ軽鎖の断片を鋳型にして最終的にウサギ／ヒトキメラＦａｂ断片を調製する。次に、抗体発現用ファージミドであるｐＣＤｉｓｐｌａｙ－４（Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｇｅｎｅ）を制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断し、ファージミド断片を調製する。同様にウサギ／ヒトキメラＦａｂ断片をＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断し、調製したファージミド断片にｃＤＮＡ断片を挿入し、ファージライブラリー発現用プラスミドを調製する。
１１－（２）ファージディスプレイ用ファージ溶液の調製
１１－（１）で調製したプラスミドを大腸菌ＴＧ１株（Ａｌｉｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に常法により形質転換させ、大腸菌を含む溶液をアンピシリンを添加したＬＢ培地のプレートに播種する。３７℃で培養後、形成されたコロニーを回収し大腸菌のライブラリーを調製する。ライブラリーの一部を培養し、この大腸菌懸濁液に、ＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎおよびＧｌｕｃｏｓｅを添加し、３７℃で１時間、振とう培養する。その後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ライフテクノロジーズ）を感染させ、さらに１時間、振とう培養を続ける。遠心分離により集菌し、培養液を捨てた後、１０ｍＬの２×ＹＴ培養液に懸濁し、３７℃で振とう培養する。翌日、培養上清を遠心分離後、上清８ｍＬを別のチューブへ移し、２ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加えて混合し、氷上に１時間静置した後に、沈殿したファージを遠心分離により回収し、これをファージディスプレイ用のファージ溶液とする。
１１－（３）パンニング法による目的抗体の選択
　１１－（２）で調製したファージ溶液からパンニング法により抗体を選択する。パンニングは２種類の方法で実施する。第一の方法としてＢＡＲＢＡＳ等の記載の方法に準じて実施する。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＳ６８－ＢＳＡをプレートに固相化後、ブロッキングする。４％スキムミルク０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＤ－ＰＢＳを１ウエル当たり５０μＬ添加後、１１－（２）で得たファージ液を５０μＬ添加する。プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＤ－ＰＢＳで洗浄する。次に１００ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で１０分間溶出し、回収した溶液を１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和する。この溶出液と大腸菌ＴＧ１株を混合し、３７℃で反応させ、Ｓ６８ペプチド抗原に結合したファージをＴＧ１株に再感染させる。培養液にアンピシリン、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加し、３７℃で反応させた後、大腸菌を回収し、培地及びカナマイシンを添加し、一晩培養する。培養液から遠心分離により上清を回収し、ＰＥＧ処理によりファージ液を調製する。同様な操作を３回繰り返し、Ｓ６８ペプチドに結合する特異的なファージを濃縮する。
　第２の方法として実施例１２－（２）記載の方法を用いて同様にパンニングを３回行い、プレセプシンに特異的なファージを濃縮する。
１１－（４）抗体の結合活性の測定とＣＤＲ配列の解析
１１－（３）の、ファージを感染させたＴＧ１培養液を、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢプレートに播種しコロニーを形成させる。それぞれのコロニーから再度ファージ溶液を調製し、ＥＩＡで反応性の確認を行う。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＢＳＡ、Ｓ６８－ＢＳＡ、Ｐ０３－ＢＳＡ及びｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃをプレートにそれぞれ固定化後、ブロッキングする。４％スキムミルク、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＤ－ＰＢＳを添加後、回収したファージ液を添加する。プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄する。次にＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を希釈した溶液を各ウエルに添加し、室温１時間反応させる。同様に５回プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温１０－２０分間反応させる。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止する。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定する。その結果、複数のファージで結合が確認される。それらコロニーからファージミドを単離し、配列を確認する。
　ファージディスプレイ法により、ハイブリドーマ法で得られたＣＤＲ配列とは異なる配列を有する、Ｐ０３及びプレセプシンと特異的に結合する抗プレセプシン抗体が得られる。
（実施例１２）ファージディスプレイ法を用いた重鎖ＣＤＲ３配列の改変体の作製
　重鎖ＣＤＲ３配列は、抗体の活性に影響することが予測されたため、ファージディスプレイ法を用いて、重鎖ＣＤＲ３配列の改変体を作製し、評価した。
１２－（１）ファージディスプレイ法を用いたＶＨ鎖ＣＤＲ３配列の改変体の調製
ＶＨ　ＣＤＲ３ランダムミューテーションライブラリーを調製するため、Ｆ１４６６－２６の重鎖と軽鎖を含むプラスミドｐＴＫ‐５９５６を鋳型とし、プライマー対（ｐ‐ｎｎｋ３‐２ｓ；５’リン酸化‐ＧＧＴ　ＮＮＫ　ＮＮＫ　ＮＮＫ　ＴＧＧ　ＧＧＣ　ＣＡＡ　ＧＧＣ　ＡＣＣ　ＣＴＧ　ＧＴＣ　ＡＣＣ　ＧＴＣ　Ｔ‐３’：配列番号９１，ｐ‐ｎｎｋ３‐２ａ；５’リン酸化‐ＧＣＣ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＡＧＴ　ＧＧＣ　ＣＧＴ　ＧＴＣ　ＣＴＣ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＣＧＧ　ＡＣＴ　Ｇ‐３’配列番号９２（ＮはＧ，Ａ，Ｔ，Ｃのいずれかを、ＫはＧあるいはＴを表す））と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅断片をＤＮＡリガーゼによって自己結合させた。これを大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ（アジレントテクノロジー）に形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ／Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ寒天プレート上で培養し、翌日生じたコロニーを、２×ＹＴ培養液で回収した。この大腸菌懸濁液に、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、およびＧｌｕｃｏｓｅを添加し、３７℃で１時間、振とう培養を行った。その後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ライフテクノロジーズ）を感染させ、さらに１時間、振とう培養を続けた。遠心分離により集菌し、培養液を捨てた後、１０ｍＬの２×ＹＴ培養液に懸濁し、３２℃で振とう培養を行った。翌日、培養上清を遠心分離後、上清８ｍＬを別のチューブへ移し、２ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加えて混合し、氷上に１時間静置した後に、沈殿したファージを遠心分離により回収し、これをＶＨ　ＣＤＲ３ランダムミューテーションライブラリーのファージ溶液とした。
１２－（２）パンニング法による目的抗体の選択
１２－（１）で調製したライブラリーよりパンニングを実施し、抗体を選択した。すなわち、１２－（１）で得られたファージ液（２ｍＬ）とｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ　６μｇと３７℃で反応させ、２時間後プロテインＡ樹脂（Ｐｒｏｓｅｐ－ｖＡ、ミリポア）２００μＬを添加し、２０分間反応させた。０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した後、樹脂に溶出液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．２））を添加し８分間静置後、溶出したファージ液を回収し、溶液を中和した。この回収液と大腸菌ＸＬ－１　Ｂｌｕｅ培養液を混合し、３７℃で反応させた。１時間後、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、アンピシリンおよびヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（インビトロジェン）を添加し、３７℃で反応させた。さらに１時間後、培地を２ｘＹＴ培地に交換し、一晩培養しｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃに特異的に結合したファージを回収した。この操作を３回くり返し、目的の抗体を濃縮した。
１２－（３）プレセプシン特異的配列を含むファージの調製およびＣＤＲ配列の決定
１２－（２）で最終的に得られたファージ液を再度ＸＬ－１　Ｂｌｕｅに感染させ、その培養上清を２×ＹＴのプレートに播種し、コロニーを作製した。このコロニーを再度ＸＬ－1　Ｂｌｕｅと培養し、ヘルパーファージを添加し単一ファージを含むファージ溶液を調製した。次に得られたファージ液を用いて、ＥＬＩＳＡで反応性の確認をおこなった。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃをプレートに固定化後、ブロッキングした。４％スキムミルク、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＤ－ＰＢＳでファージ液を２倍希釈し、プレートで１時間反応させた。続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄し、希釈したＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥヘルスケア）を各ウェル５０μＬ添加し、室温１時間反応させた。同様に５回プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温で反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。結合活性の確認できたファージ液を大腸菌に感染させ、プラスミドを常法により回収し、遺伝子配列を確認した。
１２－（４）ＩｇＧ抗体の調製
　得られた候補ファージからファージミドを回収し、重鎖の可変領域をコードする断片を調製した。実施例８に記載の方法に従って、重鎖改変体調製用プラスミドを調製し、Ｆ１４６６－２６の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ－５６０８）とともに、ＣＯＳ－１細胞にトランスフェクションした。ＣＯＳ－１細胞を３７℃で培養し、７２時間後、培養上清を回収した。
１２－（５）重鎖ＣＤＲ３配列の改変体の評価
得られた改変体について、実施例１０－（２）と同様の試験を実施し、プレセプシン（ｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃ）に対する結合活性及びＰ０３特異性を評価した。改変した重鎖ＣＤＲ３のＣＤＲ配列とともに、結果を表３０に示す。
　その結果、重鎖ＣＤＲ３の３アミノ酸とも置換された改変体６０２７は、他の改変体と比較して、プレセプシンに対する反応性がやや低かったが、Ｓ６８抗体との比較ではほぼ同等の反応性を有していた。改変体の６０２６、６０２８及び６０２９は、２アミノ酸が置換されたが、プレセプシンに対する反応性に優れていた。このことから、重鎖ＣＤＲ３が３アミノ酸で構成されるとき、２アミノ酸が置換された場合でも抗体の活性が維持される可能性が示唆された。改変体の６０２８は、プレセプシンとの結合活性が特に優れていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
  
（実施例１３）トリグリセライド（ＴＧ）干渉試験
　実施例５及び実施例６では、Ｐ０４－０５をエピトープとして認識する抗体によるプレセプシン測定は、検体中のＴＧによる干渉を受けやすいが、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体によるプレセプシン測定は、ＴＧ干渉を受けにくいことが示唆された。
１３－（１）正常人ヒト血清を用いたＴＧ干渉試験（１）
　さらに確認を進めるため、正常人検体におけるＴＧの影響を確認した。Ｆ１４６６－２６（特異性：Ｐ０３）、Ｆ１４６６－５（Ｐ０３）及び、Ｆ１４６６－１９（Ｐ０４－０５）について、正常人ヒト血清を用いてＴＧ干渉試験を実施した。
　正常人検体（８検体）（ＥＤＴＡ血漿、ＴＥＮＥＣＥＥ　ＢＬＯＯＤ　ＳＥＲＶＩＣＩＥＳ）に、ＴＧを最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、添加前後のプレセプシン測定値を比較した。このときのＴＧ濃度は、検体中の元々含まれるＴＧは考慮していない。各抗体をそれぞれ固相に固定化したプレートを用いて、実施例９－（３）に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて評価した。結果を図１に示す。
　その結果、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体であるＦ１４６６－２６及びＦ１４６６－５は、ＴＧ添加前後で、測定値の変動がほとんど見られなかったのに対して、Ｐ０４-０５をエピトープとして認識する抗体であるＦ１４６６－１９では、測定値がＴＧ添加の影響を強く受けた。プレセプシン測定値が検体中のＴＧの影響を強く受ける抗体による測定は、Ｆ１４６６－１９のように、本来、低値を示す健常者の測定値が高めに出ることが予想される。この場合、正常値と異常値の差がつきにくくなる。このような抗体は、検体中のプレセプシン測定には適さないといえる。一方、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体は、検体中のＴＧの影響を受けにくく、検体中のプレセプシン測定に適する抗体であることが確認された。
　また、この正常人ヒト血清を用いた試験は、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体を用いたアッセイ系では、高分子量ｓＣＤ１４との交差反応は問題とならない程度であることを裏付けるものである。
　正常人ヒト血清中、プレセプシンは数百ｐｇ／ｍＬであるのに対して、高分子量ｓＣＤ１４は５．６～１１．２μｇ／ｍＬ程度存在しており（ＷＯ２００５／１０８４２９、実施例１２）、もし当該抗体が高分子量ｓＣＤ１４と反応するのであれば微量なプレセプシンは測定不可能である。
　本実施例により、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体を用いたアッセイ系では、高分子量ｓＣＤ１４との交差反応を起こさず、数百ｐｇ／ｍＬ程度の微量のプレセプシンの測定が可能であることが確認された（図１）。
１３－（２）改変体のＴＧ干渉試験（２）
　新規に得られた改変体について、実施例５と同様にＴＧ干渉試験を実施し、検体中のＴＧの影響を確認した。改変体は精製して用いた。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に改変体を固定化後、ブロッキングした。プレセプシン標準品を希釈液で希釈しプレセプシンの濃度系列（１５．６－５００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。ヒト検体３種類にトリグリセライド（イントラピッド、フレゼニウス　カービ　ジャパン）を添加し、最終濃度６．７、１３．３、２０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。ヒト検体は、敗血症患者の血清１例と正常人ヒト血清に一定量のプレセプシンを添加した検体２例を用いた。また、このＴＧ濃度は、検体に元々含まれるＴＧは考慮していない。検体を希釈液で２０倍希釈し、ＴＧ無添加若しくは各濃度のＴＧを添加したサンプル、又は標準品希釈列を各ウエルに添加した。実施例９－（３）と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて測定を実施した。検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下の検体の割合（％）を表３１に示す。
その結果、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体はトリグリセライドの影響を受けにくいことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
（実施例１４）好ましい性能を有する改変体のリスト
　本発明の実施例８および１２で得られた、好ましい性能を有する抗体のＣＤＲ配列を図２～図２－２に示す（配列番号９３～１５６）。実施例８および１２において作製した抗体の数の合計は１０９個であり、好ましい抗体の数は６５個であった。
　抗体のプレセプシンに対する親和性（ＫＤ値）が１０－８Ｍ未満の抗体は○、１０－９Ｍ未満の抗体は◎として評価した。ＫＤ値が１０－７Ｍ未満であるが、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する親和性とほぼ同等の親和性を有する抗体は△として評価した。ＫＤ値による評価で、特にプレセプシンとの結合活性に優れる抗体は、５７９３と５８１０であった。
プレセプシンに対する結合活性は、Ｓ６８抗体とｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの反応時の吸光度を１としたときの、各抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ－Ｆｃの反応時の吸光度の比で評価された。抗体は、吸光度比が４以上の抗体は○、５．５以上の抗体は◎として評価した。吸光度比による評価で、特にプレセプシンとの結合活性に優れる抗体は、５８６４、５９７９、５９８３、５９８８、及び、６０２８であった。

Claims (22)

  1. （ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４；
    （ｉｉ）ＶＨ　ＣＤＲ２：ＩＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３；及び
    （ｉｉｉ）ＶＨ　ＣＤＲ３：Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６；並びに
    （ｉｖ）軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１：Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４；
    （ｖ）ＶＨ　ＣＤＲ２：ＫＸ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｓ；及び
    （ｖｉ）ＶＨ　ＣＤＲ３：Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２ＹＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７；を含み、
    Ｘ１～Ｘ３７は、以下に選択肢として記載の１または複数個のアミノ酸配列であり、Ｘ１＝任意の１個のアミノ酸、Ｘ２＝Ｙ又はＦ、Ｘ３＝Ｔ、Ａ又はＷ、Ｘ４＝Ｇ又はＳ；
    Ｘ５＝Ｉ又はＶ、Ｘ６＝ＮＳＧＡ、ＹＲＮＩＫ、ＡＮＳＧＡ、ＳＳＤＧＧ、ＳＤＩＤＱ又はＳＤＩＤＤ、Ｘ７＝Ｔ、Ｉ又はＬ、Ｘ８＝Ｙ、Ｖ又はＦ、Ｘ９＝Ｓ又はＴ，Ｘ１０＝Ｗ又はＡ、Ｘ１１＝Ａ又はＧ、Ｘ１２＝Ｋ又はＡ、Ｘ１３＝Ｇ又はＡ；
    Ｘ１４＝Ｇ、Ａ、Ｌ又はＳ、Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｇ又はＬ、Ｘ１６＝Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、Ｅ又はＨ；
    Ｘ１７＝Ｑ又はＡ、Ｘ１８＝Ａ又はＧ、Ｘ１９＝Ｓ又はＡ、Ｘ２０＝ＱＳ、ＥＤ又はＱＮ、Ｘ２１＝Ｉ又はＡ、Ｘ２２＝ＧＳＮ、ＩＳＮ、ＧＳＤ又はＳＮＹ、Ｘ２３＝Ｌ又はＡ、Ｘ２４＝Ａ又はＳ；
    Ｘ２５＝Ａ又はＴ、Ｘ２６＝Ｓ又はＡ、Ｘ２７＝Ｋ又はＴ、Ｘ２８＝Ｌ又はＡ、Ｘ２９＝Ａ又はＥ；
    Ｘ３０＝Ｑ又はＡ、Ｘ３１＝Ｃ又はＳ、Ｘ３２＝Ｓ又はＴ、Ｘ３３＝Ｔ又はＹ、Ｘ３４＝ＡＩＧＮＹ、ＥＳＴＴＦ、ＡＩＧＮＡＹ又はＲＳＴＴＴＹ、Ｘ３５＝Ｇ又はＡ、Ｘ３６＝Ｈ又はＮ、Ｘ３７＝Ｖ、Ａ又はＴ；
    配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  2. 前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３を含み、
    ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３は、以下に選択肢として記載の複数個のアミノ酸配列である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
    （ａ）ＶＨ　ＣＤＲ１＝ＲＹＡＭＧ、ＲＹＴＭＧ、ＳＦＷＭＳ、ＳＹＴＭＧ、ＡＹＴＭＧ、ＭＹＴＭＧ、ＰＹＴＭＧ、ＶＹＴＭＧ、ＩＹＴＭＧ、ＤＹＴＭＧ、ＥＹＴＭＧ、ＨＹＴＭＧ、ＴＹＴＭＧ、ＱＹＴＭＧ、ＹＹＴＭＧ、ＧＹＴＭＧ、ＫＹＴＭＧ、ＮＹＴＭＧ又はＷＹＴＭＧ；
    （ｂ）ＶＨ　ＣＤＲ２＝ＩＩＡＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＡＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＡＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＡ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＧＫＧ、ＩＩＹＲＮＩＫＴＹＹＡＴＷＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＶＳＳＤＧＧＩＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＩＳＤＩＤＱＩＶＹＡＴＷＡＫＧ又はＩＩＳＤＩＤＤＬＦＹＡＳＷＡＫＧ；及び
    （ｃ）ＶＨ　ＣＤＲ３＝ＧＤＦ、ＧＧＬ、ＡＤＦ、ＧＤＡ、ＬＤＦ、ＳＤＦ、ＧＦＦ、ＧＳＦ、ＧＰＦ、ＧＨＦ、ＧＩＦ、ＧＮＦ、ＧＲＦ、ＧＤＳ、ＧＤＰ、ＧＤＨ、ＧＤＤ、ＧＤＩ、ＧＤＮ、ＧＤＲ、ＧＶＬ、ＧＧＥ又はＧＬＨ；並びに
    （ｄ）ＶＬ　ＣＤＲ１＝ＱＡＳＥＤＩＩＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＡＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＳＮＹＬＡ、ＱＡＡＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＧＳＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＧＳＮＡＡ、ＡＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡ又はＱＡＳＱＮＩＧＳＤＬＳ；
    （ｅ）ＶＬ　ＣＤＲ２＝ＫＡＳＴＬＡＳ、ＫＡＳＫＬＡＳ、ＫＴＳＴＬＥＳ、ＫＡＳＫＡＡＳ又はＫＡＡＫＬＡＳ；及び
    （ｆ）ＶＬ　ＣＤＲ３＝ＱＳＳＹＴＥＳＴＴＦＧＨＶ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＶ、ＱＳＴＹＹＲＳＴＴＴＹＧＮＴ　、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＡＹＧＨＶ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＡ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＡＨＶ又はＡＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＶである、前記抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  3. 前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３を含み、ＶＨ　ＣＤＲ１、ＶＨ　ＣＤＲ２及びＶＨ　ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ　ＣＤＲ１、ＶＬ　ＣＤＲ２及びＶＬ　ＣＤＲ３は、以下の１）～　６８）のいずれかである、請求項１又は２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
    １）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号９７、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９４、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号４、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号５、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号６、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１９、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２０、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２１の各アミノ酸配列からなる；
    ４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１０、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１１、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１２、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２５、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２６、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２７の各アミノ酸配列からなる；
    ６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９３、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号９５、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号９６、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ９）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号９８、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １０）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号９９の各アミノ酸配列からなる；
    １１）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１００、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号１０１の各アミノ酸配列からなる；
    １３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号１０２、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１０３、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号１２１、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号１０１の各アミノ酸配列からなる；
    １６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１０４、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１０５、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１０６、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    １９）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１０７、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２０）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１０８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２１）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１０９、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１１０、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号１１１、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号１１２の各アミノ酸配列からなる；
    ２５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号１１３の各アミノ酸配列からなる；
    ２６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１１４、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１１５、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ２８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号１１６の各アミノ酸配列からなる；
    ２９）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号１１７、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３０）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号１１８、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３１）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１１９、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１２０、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号１２１、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号１２３、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１２４、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１２５、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１２６、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ３９）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１２７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４０）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１２８、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４１）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１２９、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３０、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３１、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３２、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３３、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３４、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３５、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３６、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ４９）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５０）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３８、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５１）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号１３９、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４０、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４１、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４２、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４３、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４４、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４５、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４６、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ５９）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４７、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６０）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４８、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６１）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１４９、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６２）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５０、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６３）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５１、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６４）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５２、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６５）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５３、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６６）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５４、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
    ６７）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５５、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；または、
    ６８）ＶＨ　ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ　ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ　ＣＤＲ３が配列番号１５６、ＶＬ　ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ　ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ　ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる、である、前記抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  4. （ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号９７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号９４のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；
    （ｄ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ；または
    （ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ　ＣＤＲ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＬ　ＣＤＲ３を含むＶＬ、
    を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  5. 前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して１０－８Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  6. 前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１の配列からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
  7. 前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、配列番号１の８位のアスパラギン酸をアラニンに置換した配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止が２０％未満である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
  8. 配列番号２に記載のペプチドを投与抗原として作製される、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  9. 前記抗体は、高分子量可溶型ＣＤ１４とは特異的には結合しない、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  10. 前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド（ＴＧ）干渉試験を行うとき、検体中のＴＧ濃度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  11. 前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、０．９以上を示す、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  12. 前記抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
  13. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
  14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  15. 請求項１４記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  16. 前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の形質転換株。
  17. 請求項１４または請求項１５に記載の形質転換株を培養することを含む、抗体またはその抗原結合性抗体断片の製造方法。
  18. 少なくとも前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を含む、プレセプシン測定用キット。
  19. 少なくとも前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を含む、敗血症を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するためのキット。
  20. 少なくとも前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプシンの測定方法。
  21. 少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するための方法であって、
    １）前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
    ２）　１）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、前記方法。
  22. 少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
    １）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
    ２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
     
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