CN106255751A - 新的抗普莱晒谱星抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题是提供一种新的单克隆抗体或其抗原结合性抗体片段，所述单克隆抗体或其抗原结合性抗体片段与普莱晒谱星的反应性优异，适于对检测体中的普莱晒谱星进行检测。提供对由序列号1的氨基酸序列构成的表位进行特异性识别的抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段。
Description
技术领域
本发明涉及一种对检测体中的普莱晒谱星(プレセプシン)测定有用的抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段。
背景技术
众所周知，CD14分子是一种表达于单核细胞的膜表面的糖蛋白，并具有作为LPS(脂多糖)的受体的功能。CD14分子具有两种存在形式：表达于细胞表面上的膜结合型CD14(mCD14)和可溶型CD14(sCD14)。作为sCD14，已知分子量约55kDa和约49kDa的sCD14(下面，称作“高分子量sCD14”)，已报告了sCD14在败血症(SEPSIS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、系统性红斑狼疮(SLE)等许多疾病的患者血液中显示出高的值。因此，认为这些高分子量sCD14不是疾病特异性标记(非专利文献1～2)。
另一方面，报告了在败血症患者中，存在作为一种新的sCD14分子的sCD14-ST(可溶性CD14抗原亚型，也称作普莱晒谱星)，其在血液中的浓度特征性地上升。
所谓sCD14-ST(普莱晒谱星)，其特征在于，在sCD14中，在非还原条件下进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)中，其迁移至分子量为13±2kDa的位置，并且，保持CD14的N端部。对sCD14-ST而言，与高分子量sCD14相比，其具有C端侧显著缺失的氨基酸序列，而与高分子量sCD14不同的是，其不具有LPS结合能。另外，普莱晒谱星显示出与高分子量sCD14不同的免疫原性，因而能够使用抗体来对两者进行区分。在败血症患者中，普莱晒谱星在血液中的浓度特异性地升高(专利文献1)。另外，报告了：相比于显示出难以与败血症进行判别的全身性炎症反应(SIRS)的患者，普莱晒谱星在败血症患者血液中显示出更高的值，认为普莱晒谱星是败血症的特异性诊断标记(非专利文献3)。
已公开了可特异性识别普莱晒谱星的来自兔的多克隆抗体(S68抗体)以及来自大鼠的单克隆抗体(F1146-17-2)(专利文献1、2)。
目前，在普莱晒谱星的测定中，使用来自兔的多克隆抗体作为针对普莱晒谱星的特异性抗体的测定系统已投入实际应用中，测定试剂盒已在欧洲和日本的市场上销售(PATHFAST(R)普莱晒谱星，三菱化学Medience株式会社)
至今为止，一直在尝试获取能实用化的抗人普莱晒谱星单克隆抗体，但是，还未能获得具有令人满意的性能的抗体。
现有技术文献
专利文献：
专利文献1：国际公报WO2005/108429；
专利文献2：国际公报WO2004/044005。
非专利文献1：Hayashi等，Infection and Immunity，67：417-420,1999年；
非专利文献2：Lawn等，Clinical&Experimental Immunology，120：483-487，2000年；
非专利文献3：Yaegashi等，Journal of Infection and Chemotherapy，11：234-238，2005年。
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是提供一种新的单克隆抗体或其抗原结合性抗体片段，它们与普莱晒谱星的反应性优异、且适用于测定检测体中的普莱晒谱星。
另外，本发明的课题是提供一种单克隆抗体或其抗原结合性抗体片段，普莱晒谱星的测定值与S68抗体(WO2004/044005的实施例1所述的、以S68肽作为给药抗原并对兔进行免疫而获得的多克隆抗体)的测定值之间的相关性良好。
另外，本发明的课题是，提供一种单克隆抗体或其抗原结合性抗体片段，使用该抗体测定的普莱晒谱星测定值难以受到检测体中干扰物质(例如，甘油三酯)的影响，即使针对具有各种背景因素的受试者的检测体，也能以良好的精度来测定普莱晒谱星。
解决课题的方法
从使用S68肽对兔进行免疫而获得的多个杂交瘤中，经过对S68肽的结合活性、对普莱晒谱星的结合活性等多个筛选工序，获得了多个单克隆抗体。构建用于普莱晒谱星测定的ELISA系统，对与普莱晒谱星的反应性进行研究，可知：与使用了F1146-17-2(WO2004/044005的实施例2所述的、使用S68肽对大鼠进行免疫而获得的单克隆抗体：序列号42～47)的ELISA系统相比，获得了与普莱晒谱星的反应性提高了约1万倍的抗体。
在使用所述各兔单克隆抗体的ELISA系统中，对多个败血症患者血液中的普莱晒谱星值进行测定，对与基于使用S68抗体的ELISA系统获得的测定值的相关性进行分析，发现了存在相关性优异的抗体、以及相关性较差的抗体。进一步进行探究时，发现了检测体中的甘油三酯(TG)的干扰与所述差异有关。在继续进行研究以获得与使用S68抗体获得的普莱晒谱星测定值的相关性良好、很难受到检测体中TG的干扰、适用于测定检测体中的普莱晒谱星的单克隆抗体时，发现：由于抗体识别的表位不同，所述抗体在性能方面产生差异。即，发现了：检测体中的甘油三酯(也记作TG)的干扰和/或表位与所述差异有关。
另外发现，具备普莱晒谱星测定所优选的性能的抗体将普莱晒谱星中的由序列号1表示的氨基酸序列(krvdadadpr：相当于序列号3(人全长可溶性CD14)的第52位～第61位的区域：也被称作P03序列)作为表位。该表位是本发明首次发现的新的表位。
通过由P03序列构成的氨基酸残基，以所述P03序列作为表位而识别的抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制。另一方面，通过序列号35～41的各氨基酸残基，该抗体与普莱晒谱星的反应的竞争抑制低于20％。即，通过由序列号36(相当于人全长可溶性CD14的第49位～第58位：也称作P02序列)构成的氨基酸残基、由序列号37(相当于人全长可溶性CD14的第55位～第64位：也称作P04序列)构成的氨基酸残基、或由序列号38(相当于人全长可溶性CD14的第58位～第67位：也称作P05序列)构成的氨基酸残基，该抗体与普莱晒谱星的反应的竞争抑制低于20％。根据上述结果，可知以该P03序列作为表位而识别的抗体对P03序列的特异性高。
同时，可知在由杂交瘤获得的抗体中，以普莱晒谱星中的P04序列和P05序列作为表位而识别的抗体在进行普莱晒谱星测定时易于受到检测体中的TG的干扰等，不适于普莱晒谱星测定。如此，出乎意料的是，抗体识别的表位位置的细微差别会对用于测定普莱晒谱星的抗体的性能产生影响。
另外，在P03序列(序列号1)中的第8位天冬氨酸置换为丙氨酸的氨基酸残基中，前述抗体与普莱晒谱星的反应的竞争抑制低于20％。另一方面，可知将P03序列(序列号1)的第2位至第7位、第9位及第10位中的任意的氨基酸置换为丙氨酸(或甘氨酸)的氨基酸残基对前述抗体与普莱晒谱星的反应造成50％以上的竞争抑制。
进而，为了制备具有普莱晒谱星测定所优选的性能的抗体，基于以P03序列作为表位而识别的抗体的序列，对CDR序列进行修饰。另外，使用噬菌体展示法来制备抗体。以一定的基准对所得到的抗体进行筛选，从而获得与由杂交瘤获得的抗体性能相同或更好的抗体。
确认了由杂交瘤获得的、以P03序列作为表位而识别的抗体以及选择的变体对普莱晒谱星的亲和性非常高，在用于测定普莱晒谱星的夹心ELISA体系中难以受到检测体中的干扰物质(特别是甘油三酯)的影响，与基于S68抗体的测定系统之间具有良好的相关性，并且适用于测定检测体中的普莱晒谱星的抗体。
即，本发明如下所述。
1.一种抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段，其特异性识别由序列号1的氨基酸序列构成的表位。
2.如前述1所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，所述抗体或其抗原结合性抗体片段包括：
(i)重链可变区(VH)互补性决定区(CDR)1：X1X2X3MX4；
(ii)VH CDR2：IX5X6X7X8YAX9X10X11X12X13；及
(iii)VH CDR3：X14X15X16；以及，
(iv)轻链可变区(VL)CDR1：X17X18X19X20X21X22X23X24；
(v)VH CDR2：KX25X26X27X28X29S；及
(vi)VH CDR3：X30X31X32YX33X34X35X36X37；
X1～X37是下述表1～表6中记载的1个或多个氨基酸序列。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
3.如前述2所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，
X1＝R、S、A、M、P、V、I、D、E、H、T、Q、Y、G、K、N或W。
4.如前述1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，所述抗体或其抗原结合性抗体片段包括VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3、以及，VL CDR1、VL CDR2及VLCDR3；VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3是选自表7中记载的氨基酸序列，VL CDR1、VL CDR2及VLCDR3是选自表8中记载的氨基酸序列。
表7
表8
5.如前述1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗体或其抗原结合性抗体片段含有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及，VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3选自表9-1、表9-2以及表9-3中记载的氨基酸序列。
表9-1
表9-2
表9-3
6.一种抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段，其含有：
(a)含有由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号97的氨基酸序列构成的VH CDR2和由序列号9的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH；以及，含有由序列号22的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；或者，
(b)含有由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号8的氨基酸序列构成的VH CDR2和由序列号94的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH；以及，含有由序列号22的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL。
7.一种抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段，其含有：
(a)含有由序列号4的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号5的氨基酸序列构成的VH CDR2和由序列号6的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH；以及，含有由序列号19的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号20的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号21的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；
(b)含有由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号8的氨基酸序列构成的VH CDR2和由序列号9的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH；以及，含有由序列号22的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；或者，
(c)含有由序列号10的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号11的氨基酸序列构成的VH CDR2和由序列号12的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH；以及，含有由序列号25的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号26的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号27的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL。
8.如前述1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗体或片段以低于10-8M的亲和性(KD)与普莱晒谱星结合。
9.如前述1至8中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，为了抑制前述抗体或片段与普莱晒谱星的结合，在使由序列号1的序列构成的氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，前述抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制。
10.如前述9所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，前述反应体系是使用(a)前述抗体或片段以及(b)F1106-13-3抗体或F1031-8-3抗体的夹心ELISA。
11.如前述1至10中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，为了抑制前述抗体与普莱晒谱星的结合，在使氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，借助由序列号35、36、37、38、39、40或41中任一序列构成的氨基酸残基，前述抗体与普莱晒谱星的结合的竞争抑制率小于20％。
12.如前述1至11中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，为了抑制前述抗体与普莱晒谱星的结合，在使氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，借助由序列号1中的第8位天冬氨酸置换为丙氨酸的序列构成的氨基酸残基，前述抗体与普莱晒谱星的结合的竞争抑制率小于20％。
13.如前述1至12中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，为了抑制前述抗体与普莱晒谱星的结合，在使氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，借助由下述序列构成的氨基酸残基，前述抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制，该序列是序列号1中第2位至第7位、第9位以及第10位中任意氨基酸置换为丙氨酸(或甘氨酸)而成的序列。
14.如前述1至13中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，前述抗体具有与由固定化于固相的序列号1的序列构成的氨基酸残基的结合活性。
15.如前述1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，其是将序列号2所述的肽作为给药抗原而进行制备的。
16.如前述1至15中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗体不与高分子量可溶型CD14特异性地结合。
17.如前述1至16中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，在使用前述抗体对多个检测体进行甘油三酯(TG)的干扰试验时，检测体中的TG浓度为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度显示为±20％以下的检测体的比率为50％以上。
18.如前述1至17中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，在使用前述抗体对多个检测体进行TG干扰试验时，当检测体中TG浓度为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度的平均值为±20％以下。
19.如前述1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，在使用前述抗体对多个检测体进行TG干扰试验时，检测体为正常人血清，检测体中的TG浓度为10mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度显示为±100％以下的检测体的比率为50％以上。
20.如前述1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，使用前述抗体而获得的检测体中的普莱晒谱星的测定值与使用S68抗体而获得的检测体中的普莱晒谱星的测定值的相关系数显示为0.9以上。
21.如前述20所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述相关系数为0.95以上。
22.如前述1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗体以低于1.08E-08的亲和性(KD值)与rsCD14ST-Fc结合。
23.如前述1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，相比于大鼠来源的抗普莱晒谱星抗体(F1146-17-2)与普莱晒谱星的结合活性，由普莱晒谱星浓度比表示的前述抗体与普莱晒谱星的结合活性升高10000倍以上。
24.如前述1至23中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗体与固定化于固相的rsCD14ST-Fc的结合活性(吸光度)是S68抗体与固定化于固相的rsCD14ST-Fc的结合活性的2倍以上。
25.如前述1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗体或片段是单克隆抗体。
26.如前述1至25中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，前述抗原结合性抗体片段是选自由Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(二聚抗体)、二硫键稳定性V区(dsFv)、sc(Fv)2、含有CDR的多肽、含有重链可变区的多肽以及含有轻链可变区的多肽所组成的组中的抗原结合性抗体片段。
27.一种多核苷酸，其编码前述1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段。
28.一种重组载体，其含有前述27所述的多核苷酸。
29.一种转化体，其是将前述28所述的重组载体导入宿主细胞中而获得的。
30.如前述29所述的转化体，其中，前述宿主细胞为CHO细胞。
31.一种抗体或其抗原结合性抗体片段的制备方法，其包括培养前述29或30所述的转化体。
32.一种普莱晒谱星测定用试剂盒，其至少包含前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段。
33.一种用于检测败血症的试剂盒或者用于对败血症的检测或诊断进行辅助的试剂盒，其至少包含前述1至26中任一项所述的抗体或片段。
34.如前述32所述的普莱晒谱星测定用试剂盒，前述普莱晒谱星测定用试剂盒用于选自由败血症与全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome、SIRS)的判别、败血症的严重化的风险评价、败血症的预后预测(死亡率预测)、败血症的严重度的评价、术后传染病的检测、弥散性血管内凝血(disseminated intravascularcoagulation、DIC)的检测、感染性DIC的检测、心脏疾病的检测、伴随细菌感染的呼吸道传染病的检测、炎症性肠疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)的检测、粒细胞减少性发热(febrileneutropenia、FN)的检测、噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome、HPS)的检测以及吞噬细胞的功能评价所组成的组中的至少一种疾病的检测或评价。
35.前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段在普莱晒谱星测定用试剂盒中的应用。
36.一种普莱晒谱星的测定方法，其至少包括接触工序，该接触工序使含普莱晒谱星的检测体与前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段进行接触。
37.一种败血症的检测方法、或对败血症的检测或诊断进行辅助的方法，所述方法至少包括下述工序：
1)测定工序，该测定工序使用前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段对检测体中的普莱晒谱星浓度进行测定；以及，
2)判定工序，该判定工序将在1)中获得的普莱晒谱星浓度与临界值进行比较，判定所述普莱晒谱星浓度是否高于所述临界值。
38.一种疾病的检测或评价方法，该疾病的检测或评价为选自由败血症与全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome、SIRS)的判别、败血症的严重化的风险评价、败血症的预后预测(死亡率预测)、败血症的严重度的评价、术后传染病的检测、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation、DIC)的检测、感染性DIC的检测、心脏疾病的检测、伴随细菌感染的呼吸道传染病的检测、炎症性肠疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)的检测、粒细胞减少性发热(febrile neutropenia、FN)的检测、噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome、HPS)的检测以及吞噬细胞的功能评价所组成的组中的至少一种，前述方法至少包括下述工序：
1)测定工序，该测定工序使用前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段对检测体中的普莱晒谱星浓度进行测定；以及，
2)判定工序，该判定工序将由1)获得的普莱晒谱星浓度与临界值进行比较，判定所述普莱晒谱星浓度是否高于所述临界值。
39.一种抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段的筛选方法，其至少包括下述工序：
1)构建工序，该构建工序使用候选的抗体或抗原结合性抗体片段来构建普莱晒谱星测定系统，以及
2)确定工序，该确定工序使用该测定系统来确定检测体中的TG浓度对普莱晒谱星测定值产生的影响。
40.一种抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段的筛选方法，其至少包括下述工序：
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段；以及，
2)选择工序，该选择工序是为了抑制该抗体与普莱晒谱星的结合，在使由序列号1构成的氨基酸残基进行竞争反应的反应体系中，选择前述抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制的前述抗体或抗原结合性抗体片段。
41.一种抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段的筛选方法，其至少包括下述工序：
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段；以及，
2)选择工序，该选择工序选择以普莱晒谱星中序列号1的氨基酸序列作为表位而特异性识别的前述抗体或抗原结合性抗体片段。
42.一种败血症的治疗方法，通过使用前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段对受试者的检测体中的普莱晒谱星的浓度进行测定，由此对进行了败血症检测的患者、或者进行了败血症检测或诊断的辅助的患者实施败血症治疗。
43.一种受试药的筛选方法，其包括确定工序，该确定工序使用前述1至26中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段来确定给药受试药的受试者的检测体中的普莱晒谱星的浓度。
44.rsCD14ST-Fc，其包含序列号3(人全长可溶性CD14)的第1位至第64位的序列、以及抗体的重链Fc区。
45.如前述44所述的rsCD14ST-Fc，在序列号3(人全长可溶性CD14)的第1位至第64位的序列与抗体的重链Fc区之间插入了易于切断的序列。
46.如前述45所述的rsCD14ST-Fc，其中，前述易于切断的序列是凝血酶识别序列。
47.如前述44至46中任一项所述的rsCD14ST-Fc，其中，前述抗体的重链Fc区是人源IgG1抗体重链Fc区。
48.一种rsCD14ST-Fc的制备方法，其包括培养工序：将包含序列号3(人全长可溶性CD14)的第1位至第64位的序列以及抗体的重链Fc区的序列的载体导入宿主细胞，并培养该宿主细胞。
49.一种rsCD14-ST的制备方法，其包括将前述48所述的rsCDST-Fc的Fc区切断的工序。
发明的效果
根据本发明，通过提供与普莱晒谱星的反应性优异、且适于对检测体中的普莱晒谱星进行测定的抗体及其抗原结合性抗体片段，能提高普莱晒谱星测定的质量和精度。能够提供对普莱晒谱星的亲和性高的抗体，由此，该抗体能适用于对正常人水平的微量的普莱晒谱星进行定量，并能提高灵敏度。另外，能够提供难以受到检测体中干扰物质的影响的抗体，由此，夹心ELISA系统的测定值会难以受到血清样品的个体差异(受试者的背景因素)的影响，从而能进行高精度测定。在夹心ELISA系统中，能进行高特异性测定，即，仅与普莱晒谱星特异性地结合、而不与人血液中存在的高分子量sCD14特异性结合。
能提供解决基于多克隆抗体进行的普莱晒谱星测定的课题(确保批次间的均一性、生产难度、成本等)、实用性优异的抗体。即，单克隆抗体具有以下优势：能够以低价、稳定且有效的方式来生产，并且能够保持抗体的均一品质。
附图说明
图1是表示使用F1466-26(A)、F1466-5(B)以及F1466-19(C)的抗体来进行的正常人血清的TG干扰试验的结果的图。
图2是表示在实施例8和实施例12中获得的各变体的图。
图2-1是表示在实施例8和实施例12中获得的各变体的图。其是续图2的图。
图2-2是表示在实施例8和实施例12中获得的各变体的图。其是续图2、图2-1的图。
具体实施方式
下面，对发明进行更详细的说明。
1.特异性地识别由序列号1的氨基酸序列构成的表位的抗普莱晒谱星抗体或其抗
原结合性抗体片段
本发明的第一方式是一种抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段，其特异性地识别作为普莱晒谱星上的新的表位的序列号1的氨基酸序列。
所谓“特异性地识别由序列号1的氨基酸序列构成的表位”是指，在普莱晒谱星的序列中，抗体将相当于序列号1的氨基酸序列的序列作为表位而进行特异性识别。
“抗原结合性抗体片段”是指，在对由序列号1的氨基酸序列构成的表位进行特异性识别的抗体的部分片段中，具有与原抗体相同的抗原结合性的片段。
“序列的同一性”或“序列的同源性(homology)”是针对2个或多于2个的多核苷酸序列或氨基酸序列之间的关系而言的，即，是针对参考序列、以及作为要与参考序列进行对比的对象序列之间的关系而言的。为了创建通过序列间的一致而确定的高度的序列相似性，在将序列调节至最佳后，通过将对象序列与参考序列进行对比来确定序列同一性或同源性。关于这种调节，在每个位置确定序列同一性。例如，在某个位置上，当核酸或氨基酸相同时，则认为在特定的位置处序列相同。将显示出这种同一性的位置的总数除以参考序列的核酸或残基的总数，由此，获得序列同一性％。序列同一性能够通过公知的方法来简便计算，对所述方法没有特别的限定，但是，这些方法记载在Computational MolecularBiology,Lesk A.N.,ed.,Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,GrifEn A.M.,and GrifEn H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinge G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov M.andDevereux J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991)；和Carillo H.,and Lipman D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)等中。确定序列同一性所优选的方法是在进行试验的序列之间以赋予最大一致的方式设计的。序列同一性的确定方法在能公开利用的计算机程序中加以系统化，确定所给的序列间的序列同一性。对这种程序的实例没有特别限定，但是，可列举GCG程序包(Devereux et al.,Nuc.Ac.Res.,12(1):387(1984)),BLASTP,BLASTNand FASTA(Altschul et al,J.Molec.Biol,215:403-410(1990)).等。NCBI等的BLASTX程序能公开利用。
在本发明中，对表位的确定方法没有特别的限定，但是，例如，可通过实施例6所述的方法进行确认。
本发明的抗体的特征在于，为了抑制该抗体与普莱晒谱星的结合，在使P03肽(由序列号1表示的氨基酸序列)进行竞争反应(优选利用吸光度)的反应体系中，抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制。该反应体系优选为夹心ELISA系统。更优选的是使用(a)本发明的抗体或片段、以及(b)F1106-13-3抗体或F1031-8-3抗体的夹心ELISA。序列号1的氨基酸序列相当于人全长可溶性CD14的氨基酸序列(序列号3)的第52位～第61位。优选：对于本发明的抗体与普莱晒谱星的结合，基于P01肽(由序列号3的第46位～第55位表示的氨基酸序列)、P02肽(由同一序列的第49位～第58位表示的氨基酸序列)、P05肽(同一序列的第58位～第67位)、P06肽(同一序列的第61位～第70位)、或者P07肽(同一序列的第64位～第73位)、P08肽(同一序列的第67位～第76位)导致的竞争抑制小于20％。优选：对于本发明的抗体与普莱晒谱星的结合，基于P04肽(同一序列的第55位～第64位)导致的竞争抑制小于20％。
另外，作为用于确定表位的其他方法，例如，如实施例9-(4)所述地，能对作为目标的抗原的部分序列(例如，P03肽)与抗体的结合活性进行观察。
在本发明的一个实施方式中，提供一种抗普莱晒谱星抗体，其与下述序列结合：P03序列(序列号1)中，除第8位天冬氨酸以外的氨基酸序列中的1或多个被取代的序列。被取代的氨基酸的数目优选2个氨基酸以内，进一步优选1个氨基酸。
例如，在本发明的一个方式中，提供抗普莱晒谱星抗体，该抗普莱晒谱星抗体与P03序列或其具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列相结合。对象表位可以是与P03序列具有90％以上、优选91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％的同一性的序列。在某个实施方式中，对与P03序列具有90％以上的同一性的序列特异性的抗普莱晒谱星抗体可以是单克隆抗体。
本发明的抗体是特异性识别普莱晒谱星的抗体。
普莱晒谱星(sCD14-ST)是CD14的可溶型片段，并具有下述1)～3)的性质。
1)在非还原条件下进行的SDS-PAGE中，分子量为13±2kDa；
2)N末端序列具有序列号3的第1位～第11位的氨基酸序列；以及，
3)与以含有序列号2的16个氨基酸残基的肽作为抗原而制备的抗体特异性结合。
即，在本发明中，对于普莱晒谱星而言，只要没有特别说明，即指人普莱晒谱星。
另外，在本发明中，作为普莱晒谱星，不仅可以使用普莱晒谱星标准品(WO2005/108429的实施例16所述的rsCD14-ST)，还可以使用rsCD14ST-Fc(实施例9-(2)所述)等具有普莱晒谱星活性的物质。
在本发明中，所谓“对….特异性识别的抗体”是指：对特异性识别的对象进行免疫识别的抗体和/或与特异性识别的对象显示出通常的抗原抗体反应的抗体。在将特异性识别的对象与该抗体的结合作为亲和性来表示的情况下，通常，平衡解离常数(KD)小于10-7M。本发明的抗体仅特异性识别普莱晒谱星。在存在于人血液的主要的可溶性CD14中，有约55kDa和约49kDa的可溶性CD14(高分子量sCD14)。本发明的抗体不与高分子量sCD14特异性结合。对于高分子量sCD14而言，可以使用由序列号3的氨基酸序列构成的人全长可溶性CD14，另外，例如，还可以通过正常人体液的3C10抗体亲和柱吸附来制备(参见WO2005/108429实施例23)。
本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段与普莱晒谱星的反应性优异，适于对检测体中的普莱晒谱星进行测定。例如，使用本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段来构建夹心ELISA系统，能测定检测体中的普莱晒谱星。
对于本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段而言，与F1146-17-2(WO2004/044005的实施例2所述的大鼠来源的单克隆抗体)相比，其在夹心ELISA系统中与普莱晒谱星的反应性提高约1万倍(实施例4)，从而适于对检测体中的微量普莱晒谱星进行检测。即，本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段的特征是，与F1146-17-2相比，以普莱晒谱星的浓度比计，其与普莱晒谱星的反应性提高1万倍以上。
对于败血症患者，报告了普莱晒谱星的血液中浓度特征性地升高，本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段优选用于对败血症进行检测。本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段优选：如实施例1所示，在使用本抗体来构建夹心ELISA、对败血症患者检测体与正常人检测体进行测定时，在普莱晒谱星测定值方面观察到差异的抗体或其抗原结合性抗体片段。
本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段优选以下抗体：在构建测定系统来测定检测体中的普莱晒谱星时，由检测体中的干扰物质造成的影响不会产生问题的程度的抗体。
在本发明中，干扰物质是指该物质的存在有可能对普莱晒谱星的测定值产生影响(下面，也称作干扰)的物质，例如，可举出甘油三酯(Triglycerides：也称作TG)、胆红素、血色素、类风湿因子、胆固醇等。在本发明中，用于进行抗体评价的优选干扰物质为甘油三酯(TG)。
作为干扰试验的评价指标之一，能够将下述偏差作为解离度(％)来表示、使用，该偏差是在检测体中添加了一定量的干扰物质时的普莱晒谱星测定值相对于没有添加干扰物质的同一检测体的普莱晒谱星测定值的偏差。由于添加干扰物质而导致的测定值的解离度如下所示。
解离度(％)＝{(添加干扰物质后的普莱晒谱星测定值)-(不添加干扰物质的普莱晒谱星测定值)}/(不添加干扰物质的普莱晒谱星测定值)×100
所谓由干扰物质造成的影响不会产生问题的程度能够通过下述来表示：例如，在使用多个检测体进行的干扰试验中，由添加一定量的干扰物质而导致普莱晒谱星测定值的解离度为±20％以下、更优选为±10％以下的检测体的比率高。多个检测体中的“检测体的比率高”通常是指，多个检测体中的50％以上，优选60％以上，更优选70％以上，进一步优选80％以上，特别优选90％以上。
在TG的干扰试验中，例如，针对多个检测体进行干扰试验，可以将以下设为一个指标：通过添加TG使检测体中的TG浓度成为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度显示为±20％以下、更优选为±10％以下的检测体的比率高。本发明的抗体的一个优选方式是：在通过使用该抗体的测定系统来实施TG干扰试验时，当检测体中的TG浓度设为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度显示为±20％以下、更优选为±10％以下的检测体的比率高的抗体。
或者，例如，可将以下设为一个指标：通过多个检测体，求出当检测体中的TG浓度为20mg/mL时的普莱晒谱星测定值的解离度，其解离度的平均值为±20％以下、更优选为±10％以下。本发明的抗体的一个优选方案是：在通过使用该抗体的测定系统对多个检测体来进行TG干扰试验时，当检测体中的TG浓度为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度的平均值显示为±20％以下的抗体，更优选解离度的平均值显示为±10％以下的抗体。
根据美国血脂异常指南NCEP-ATPIII，TG小于150mg/dL为正常，TG150～200mg/dL为边界值，TG200～499mg/dL为高值(high)，500mg/dL以上为显著的高值(very high)。检测体中的TG浓度20mg/mL(＝2000mg/dL)，如果参考上述标准，则可认为TG浓度处于极高的状态。
对于本实施例中的TG干扰试验而言，在检测体的TG浓度为6.7mg/mL、13.3mg/mL、20mg/mL这3点处测定普莱晒谱星测定值的解离度。当检测体的TG浓度为20mg/mL时，与解离度大的抗体(测定系)相比，对于解离度小的抗体而言，当检测体中TG浓度为6.7mg/mL和13.3mg/mL时，观察到解离度为较小的倾向。
TG干扰试验可使用正常人血清来实施。由于正常人的检测体中的普莱晒谱星浓度低，因而如果受到TG干扰，测定值的解离度容易变大。通过本试验，能够试验是否能以良好的精度来测定检测体中微量的普莱晒谱星。例如，对于检测体中TG浓度为10mg/mL时的普莱晒谱星测定值的解离度而言，优选±100％以下，更优选±70％以下，进一步优选±50％以下，特别优选±20％以下。优选与前述试验同样地使用多个检测体来进行试验。
另外，本发明的抗体或抗原结合性抗体片段可通过比较该抗体由于添加干扰物质而导致的普莱晒谱星测定值的解离度与S68抗体在相同条件下的解离度来进行评价。在一个优选的方式中，对于本发明的抗体与S68抗体而言，该解离度相似。
对于TG干扰试验而言，例如，还可以通过下述方式来评价：在使用本发明的抗体的测定系统中，在通过添加TG而将检测体中的TG浓度调节为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度与S68抗体在相同条件下的解离度的差为20％以下、更优选为10％以下的检测体的比率高。对于解离度的差而言，例如，当使用本发明的抗体而获得的测定值的解离度为+5％、使用S68抗体而获得的测定值的解离度为-10％时，计算出解离度的差为15％。
在干扰试验中使用的检测体能够使用本发明的第二方式所述的检测体。在进行TG干扰试验时，检测体优选血清或血浆。
对于本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段而言，在构建测定系统以对检测体中的普莱晒谱星进行测定时，优选与使用S68抗体获得的测定值相关性良好的抗体。相关性良好是指相关系数优选为0.9以上、更优选为0.95以上。
本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段与普莱晒谱星特异性结合，与普莱晒谱星的亲和性(平衡解离常数，KD值)优选小于10-7M，更优选小于10-8M，进一步优选小于10-9M，特别优选小于10-10M，最优选10-11M以下。本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段与普莱晒谱星的平衡解离常数优选10-7M～10-14M，更优选10-8M～10-13M的范围。普莱晒谱星可使用rsCD14ST-Fc。
对于亲和性(平衡解离常数、KD值)，例如，能够使用BIACORE(GE医疗集团)进行测定。
本发明优选的实施方式之一是，与S68抗体对普莱晒谱星的亲和性相比，本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段与普莱晒谱星的亲和性(KD值)更优异。本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段与rsCD14ST-Fc(普莱晒谱星：实施例9-(2)所述)的亲和性(KD值)优选：与S68抗体对rsCD14ST-Fc的亲和性(KD值)1.08E-08相同程度的数值、或者低于该1.08E-08的数值，更优选S68抗体的KD值的1/2(5.40E-09)以下，进一步优选S68抗体的KD值的1/10(1.08E-09)以下。
本发明优选的实施方式之一是，与S68抗体相比，本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段与普莱晒谱星的结合活性更优异。
例如，如实施例10-(2)所示，可将rsCD14ST-Fc(普莱晒谱星)固定于固相，使其与抗体进行反应，通过吸光度等来评价抗体与普莱晒谱星的结合活性。
例如，基于实施例10进行试验，在使S68抗体与rsCD14ST-Fc进行反应时的吸光度为1时，使本发明的抗体与rsCD14ST-Fc进行反应时的吸光度比优选1以上，更优选2以上，进一步优选4以上，特别优选5.5以上。
本发明提供以下任一项所述的抗体。
以下是抗普莱晒谱星抗体。由于下述(a)(b)(c)的抗体或其抗原结合性抗体片段特异性识别普莱晒谱星上的由序列号1的氨基酸序列构成的表位，因而它们是第一实施方式中优选的实例。更优选(a)或(b)的抗体或其抗原结合性抗体片段。
(a)抗体或其抗原结合性抗体片段，其包含VH与VL，所述VH包含由序列号4的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号5的氨基酸序列构成的VH CDR2、以及由序列号6的氨基酸序列构成的VH CDR3；所述VL包含由序列号19的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号20的氨基酸序列构成的VL CDR2、以及由序列号21的氨基酸序列构成的VL CDR3。
(b)抗体或其抗原结合性抗体片段，其包含VH与VL，所述VH包含由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号8的氨基酸序列构成的VH CDR2、以及由序列号9的氨基酸序列构成的VH CDR3；所述VL包含由序列号22的氨基酸序列构成的VL DR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2、以及由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3。
(c)抗体或其抗原结合性抗体片段，其包含VH与VL，所述VH包含由序列号10的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号11的氨基酸序列构成的VH CDR2、以及由序列号12的氨基酸序列构成的VH CDR3；所述VL包含由序列号25的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号26的氨基酸序列构成的VL CDR2、以及由序列号27的氨基酸序列构成的VL CDR3。
另外，本发明提供包含图2～图2-2所述的CDR序列的抗体或其抗原结合性抗体片段。这些抗体特异性识别普莱晒谱星上的由序列号1的氨基酸序列构成的表位。更优选包含5793、5810、5864、5979、5983、5988、6028的CDR序列的抗体或其抗原结合性抗体片段。
本发明提供包含以下任一项所述的CDR的多肽。更优选(i)(ii)(iv)或(v)的多肽。
(i)包含由序列号4的序列构成的VH CDR1、由序列号5的序列构成的VH CDR2以及由序列号6的序列构成的VH CDR3的多肽。
(ii)包含由序列号7的序列构成的VH CDR1、由序列号8的序列构成的VH CDR2以及由序列号9的序列构成的VH CDR3的多肽。
(iii)包含由序列号10的序列构成的VH CDR1、由序列号11的序列构成的VH CDR2以及由序列号12的序列构成的VH CDR3的多肽。
(iv)包含由序列号19的序列构成的VL CDR1、由序列号20的序列构成的VL CDR2以及由序列号21的序列构成的VL CDR3的多肽。
(v)包含由序列号22的序列构成的VL CDR1、由序列号23的序列构成的VL CDR2以及由序列号24的序列构成的VL CDR3的多肽。
(vi)包含由序列号25的序列构成的VL CDR1、由序列号26的序列构成的VL CDR2以及由序列号27的序列构成的VL CDR3的多肽。
另外，本发明提供包含由图2～图2-2所述的序列构成的VH CDR1、VH CDR 2以及VHCDR3的多肽。
另外，本发明提供包含由图2～图2-2所述的序列构成的VL CDR1、VL CDR2、VLCDR3的多肽。
更优选：包含由序列号7的序列构成的VH CDR1、由序列号8的序列构成的VH CDR2以及由序列号94的序列构成的VH CDR3的多肽(5793)，或者包含由序列号7的序列构成的VHCDR1、由序列号97的序列构成的VH CDR2以及由序列号9的序列构成的VH CDR3的多肽(5810)。
本发明提供包含以下任一项记载的可变区的多肽。更优选含有(i)(ii)(iv)或(v)的多肽。
(i)包含由序列号4的序列构成的CDR1、由序列号5的序列构成的CDR2、由序列号6的序列构成的CDR3的重链可变区(VH)。
(ii)包含由序列号7的序列构成的CDR1、由序列号8的序列构成的CDR2、由序列号9的序列构成的CDR3的VH。
(iii)包含由序列号10的序列构成的CDR1、由序列号11的序列构成的CDR2、由序列号12的序列构成的CDR3的VH。
(iv)包含由序列号19的序列构成的CDR1、由序列号20的序列构成的CDR2、由序列号21的序列构成的CDR3的轻链可变区(VL)。
(v)包含由序列号22的序列构成的CDR1、由序列号23的序列构成的CDR2、由序列号24的序列构成的CDR3的VL。
(vi)包含由序列号25的序列构成的CDR1、由序列号26的序列构成的CDR2、由序列号27的序列构成的CDR3的VL。
另外，本发明提供包含下述重链可变区的多肽，该重链可变区包含由图2～图2-2所述的序列构成的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3。
另外，本发明提供包含下述轻链可变区的多肽，该轻链可变区包含由图2～图2-2所述的序列构成的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3。
在本发明中，优选前述多肽是具有与普莱晒谱星的结合活性的抗原结合物。
对上述的抗体或多肽而言，在CDR序列中，1个或多个氨基酸可被置换、缺失、附加和/或插入等(称作置换等)。对于其与抗原的结合活性、普莱晒谱星测定时的特征等，优选1个或多个氨基酸置换等后的抗体或多肽具有与置换等前相同的活性或性能。其中，在具有与置换等前相同活性或性能的、置换等后的抗体或多肽中，包含通过公知的基因工程方法进行人工修饰的变异体、以及自然形成的变异体(所谓等位基因变异)。被置换的氨基酸数目可以是多个，只要是大于1的数目，就没有特别的限定，但是，优选每个CDR中被置换的数目为3个氨基酸以内，进一步优选2个氨基酸以内，更优选1个氨基酸。在某个实施方式中，本发明的抗体或多肽可以具有下述CDR序列：该CDR序列相对于如上述地由序列号所特定的CDR的氨基酸序列，显示出90％以上的同一性。所述同一性可以是92％以上、95％以上、97％以上或99％以上。这种抗体或多肽优选具备与具有由序列号所特定的CDR酸序列的抗体或多肽相同的活性或性能。
与CDR进行连接的抗体的骨架区(framework region：FR)选择CDR可形成良好的抗原结合部位的骨架区。对本发明中的用于可变区的FR没有特别的限定，可以使用任意的FR。根据需要，为使CDR可形成合适的抗原结合部位，在FR中，1个或多个氨基酸可被置换、缺失、附加和/或插入等。在某个实施方式中，FR可以是相对于由各序列号所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。该同一性可以为85％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上。例如，通过对使用置换了氨基酸的FR的抗体与抗原的结合活性进行测定、评价，可选择具有所需性质的变异FR序列。
在本发明中，抗体的FR区能够使用由数据库(例如，GenBank)等获得的公知的FR(作为氨基酸序列，例如，可举出AAO06511.1、AAT02391.1、AAG13973.1、AGT29816.1等，作为碱基序列，例如，可举出AY596429.1、AY171772.1、KC020056.1、AF294966.1等)、由本发明获得的抗体的FR等。本领域技术人员能够基于技术常识来选择理想的FR。在本发明中，对于优选使用的抗体的FR而言，例如，可举出序列号48～84的FR。这些FR是由数据库等获得的FR、或者由本发明获得的抗体的FR。在本发明的抗体中，能利用来源于各种动物的FR，但是，特别优选来源于兔的抗体的FR。其中，优选序列号64～84，更优选序列号65或66、序列号68或69、序列号71或72、序列号73、序列号75或76、序列号78或79、序列号81、82或83、序列号84的FR。
在某个实施方式中，本发明的抗体的可变区的优选例如下。
(1)(i)重链可变区，其具有：图2～图2-2所述的变体的重链CDR序列(例如，抗体5810的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3)，以及，包含序列号64、序列号67、序列号70和序列号73的序列的FR；
(ii)轻链可变区，其具有：图2～图2-2所述的变体的轻链CDR序列(例如，抗体5810的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3)，以及，包含序列号74、序列号77、序列号80和序列号84的序列的FR。
(2)(i)重链可变区，其具有：F1466-5、F1466-26或F1466-16的重链CDR序列(例如，F1466-26的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3)，以及，包含序列号64、序列号67、序列号70和序列号73的序列的FR；
(ii)轻链可变区，其具有：F1466-5、F1466-26或F1466-16的轻链CDR序列(例如，F1466-26的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3)，以及，包含序列号74、序列号77、序列号80和序列号84的序列的FR。
(3)(i)重链可变区，其具有：图2～图2-2所述的变体的重链CDR序列(例如，抗体5810的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3)，以及，包含序列号65(或66)、序列号68(或69)、序列号71(或72)和序列号73的FR；
(ii)轻链可变区，其具有：图2～图2-2所述的变体的轻链CDR序列(例如，抗体5810的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3)，以及，包含序列号75(或76)、序列号78(或79)、序列号81(或82、或83)和序列号84的FR。
(4)(i)重链可变区，其具有：F1466-5、F1466-26或F1466-16的重链CDR序列(例如，F1466-26的VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3)，以及，包含序列号65(或66)、序列号68(或69)、序列号71(或72)和序列号73的FR；
(ii)轻链可变区，其具有：F1466-5、F1466-26或F1466-16的轻链CDR序列(例如，F1466-26的VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3)，以及，包含序列号75(或76)、序列号78(或79)、序列号81(或82、或83)和序列号84的FR。
对可变区而言，1个或多个(例如，5个氨基酸以内，优选3个氨基酸以内)的氨基酸可被置换、缺失、附加和/或插入。对于其与抗原的结合活性、普莱晒谱星测定时的特征等，优选1个或多个氨基酸置换等后的抗体或多肽与置换等前具有相同的活性或性能。在某个实施方式中，当可变区是如上所述地由氨基酸序列所特定的情况下，可变区可具有下述氨基酸序列：相对于由序列号所特定的序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。该同一性可为85％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上。这种可变区优选具有与通过序列号所特定的可变区相同的活性或性能。
对在本发明的抗体中使用的恒定区没有特别的限定，可使用任意的恒定区。作为在本发明的抗体中使用的恒定区的优选例，例如，能使用来源于小鼠、大鼠、兔或人的IgG的恒定区等。对于恒定区，可以在不影响所述抗体与抗原的结合活性、普莱晒谱星测定时的特征等的范围内置换、缺失、附加和/或插入1个或多个氨基酸。
本发明的抗体优选单克隆抗体，即，优选抗普莱晒谱星单克隆抗体。单克隆抗体是单克隆的产生抗体的细胞分泌的抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有可获得具备均一的抗原特异性、高效价的抗体等效果。理论上，单克隆抗体具有以下优势：与多克隆抗体相比，抗原测定所需的抗体重量可以较少。本说明书中的“抗体”一词有时意指“抗体或其抗原结合性抗体片段”。
优选将序列号2所示的S68肽作为给药抗原来制备本发明的单克隆抗体。例如，本发明的单克隆抗体能够通过下述方式来获得：使用S68肽对动物进行免疫，使用免疫动物中的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞来制备杂交瘤，接着选择单细胞化的杂交瘤，并对该杂交瘤进行培养，对培养上清液进行纯化而获得。
对抗体所来源的动物品种没有特别的限定，但是，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。优选兔。即，本发明抗体优选是来源于兔的抗普莱晒谱星单克隆抗体(也称作兔抗普莱晒谱星单克隆抗体)。
骨髓瘤细胞能使用公知的各种细胞。例如，来源于人的SKO-007、人鼠杂交骨髓瘤SHM-D33、来源于小鼠的P3、NS-1、P3U1、SP2/0、来源于大鼠的YB2/0、Y3-Ag1、2、3等。也可使用来源于兔的永生B淋巴细胞等。
在本发明中，优选：通过融合兔脾细胞与来源于兔的永生B淋巴细胞来制备兔-兔杂交瘤，或者通过融合兔脾细胞与来源于永生小鼠细胞株的细胞来制备兔-鼠杂交瘤。
产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞的融合能够通过公知的方法进行，作为融合促进剂，例如，能够使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等。对于在细胞融合中使用的培养液而言，例如，能够使用RPMI1640培养液、MEM培养液等。
对通过融合而形成的杂交瘤进行几天～3周左右的培养，例如，使用含有次黄嘌呤、胸苷以及氨基蝶呤的培养基(HAT培养基)等选择性培养基，分离未融合的细胞。通过产生的抗体对所得到的杂交瘤进行进一步选择。根据公知的有限稀释法对所选择的杂交瘤进行单克隆化培养，并确立其为产生抗体的杂交瘤。
对于抗体的纯化而言，例如，能够通过离子交换层析、亲和层析(蛋白A柱、蛋白G柱等)、盐析法、醇沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、离心法、凝胶过滤法等公知的方法进行。
本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段能够使用本领域技术人员能使用的基因重组技术来进行制备。例如，能够基于所得到的抗普莱晒谱星抗体的序列来构建编码抗体或其中一部分的多核苷酸，将该多核苷酸导入表达载体后，在适当的宿主中进行表达。
对于构建编码抗体或其中一部分的多核苷酸而言，例如，能够从产生本发明的抗体的杂交瘤中提取mRNA，并合成cDNA。这些操作能使用市售的试剂盒等来实施。
另外，使用本领域技术人员可使用的基因重组技术，并基于抗普莱晒谱星抗体的序列，能够制备对其中一部分序列进行了改变的抗体。能够制备包含目标序列的载体，使其在合适的宿主内进行表达。
对本发明中使用的载体没有特别的限定，但是，优选适用于抗体基因表达的载体和/或表达载体。例如，可举出含有EF-1α启动子和/或CMV增强子的载体等。
作为载体，可以使用来源于大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来源于枯草菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来源于酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等病毒等。
对于在本发明中使用的启动子而言，只要其是与基因表达中使用的宿主相应的适当的启动子，就可以使用任意一种。例如，当宿主为动物细胞时，能够使用来自SV40的启动子、逆转录病毒的启动子、热休克启动子、巨细胞病毒启动子、EF1α启动子等。
对于载体而言，可根据需要，包含增强子、剪接信号、poly-A添加信号、选择标记、SV40复制起点等。
作为选择标记，例如，能够使用二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、甲氨蝶呤(MTX)抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。
对本发明使用的宿主细胞没有特别的限定，但是，例如，可使用细菌细胞(大肠菌等)、酵母、两栖动物细胞(美国蟾卵母细胞等)、昆虫或昆虫细胞(sf9等)、动物细胞等。作为动物细胞，例如，可使用COS-1细胞、COS-7细胞、CHO细胞、DHFR基因缺陷型CHO细胞(dhfr-CHO细胞)、小鼠3T3细胞、人HEK293细胞、骨髓瘤细胞等。
对于将表达载体导入宿主细胞的方法而言，能通过公知的方法来实施，例如，可举出脂转染法、磷酸钙法、电穿孔药水法、微注射法等。
在将表达载体导入宿主细胞后，使用适合各宿主细胞的培养基来对细胞进行培养。例如，对于动物细胞，能够使用PMI1640培养基、GIT培养基等动物细胞培养用培养基，或者能够使用在这些培养基中加入了FCS等各种添加物的培养基等。通过在培养基中对所得到的转化细胞进行培养，能够在培养上清液中表达、积累抗体。对培养上清液中的抗体的纯化，可使用前述的方法。另外，能够通过ELISA等对抗体的表达量以及抗原抗体活性进行测定。
本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段可以使用噬菌体展示法来进行制备。基于噬菌体展示法来获得抗体，能够通过本领域技术人员可使用的技术来实施(参见CARLOSF.BARBAS等，Phage Display：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)等)。例如，能够使用本发明的实施例11所述的方法。使用S68肽对动物进行免疫而获得脾脏淋巴细胞，从该脾脏淋巴细胞中提取基因并将其与噬菌体载体等进行连接等，然后可通过常规方法进行制备。
另外，为了制备仅更改特定的CDR(例如，VH CDR3)的序列的变体，也能使用噬菌体展示法。也可使用包含作为模板的抗体的重链和轻链的质粒与特定的引物，使用本领域技术人员可使用的技术来实施。例如，能够使用实施例12所述的方法。
作为本发明的抗原结合性抗体片段，可举出Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(二聚抗体)、二硫键稳定性V区(dsFv)、sc(Fv)2、包含CDR的多肽、含重链可变区的多肽以及含轻链可变区的多肽等。任意的抗体片段与识别由序列号1的氨基酸序列构成的表位的本发明的抗体具有相同的抗原结合性。这些抗体片段能够使用本领域技术人员可使用的基因重组技术等来制备。
Fab是在将IgG通过蛋白质分解酶木瓜蛋白酶进行处理而获得的片段中，由H链的N末端侧约一半与整个L链通过二硫键而结合的、具有抗原结合活性的抗体片段。
F(ab′)2是在通过蛋白质分解酶胃蛋白酶对IgG进行处理而获得的片段中，Fab通过铰链区的二硫键结合而成。
Fab′是通过对F(ab′)2中铰链区的二硫键进行切断而获得的具有抗原结合活性的抗体片段。Fab′能够通过对F(ab′)2进行还原剂二硫苏糖醇处理而获得。
scFv是通过合适的连接肽将1条VH与1条VL连接而形成的多肽，其是具有抗原结合活性的抗体片段。
二聚抗体是scFv形成二聚体、并具有二价的抗原结合活性的抗体片段。
dsFv是使VH和VL中的各1个氨基酸残基置换为半胱氨酸残基的多肽通过该半胱氨酸残基间的二硫键结合而成的抗体片段。
sc(Fv)2是通过连接子等将2个VH和2个VL结合而形成单链的抗原片段。对于sc(Fv)2而言，例如，能够通过用连接子将scFv进行结合的方式来制备。
对于包含CDR的多肽而言，其优选的形式如前所述，其是具有抗原结合活性的片段。能够使多个含有CDR的肽直接进行结合、或通过合适的连接子进行结合。
含有重链可变区的多肽和含有轻链可变区的多肽如前述所示。
在本发明中，连接子能够使用可通过基因工程导入的任意的连接肽。本发明优选的连接子为连接肽。对连接肽的长度没有特别的限定，能根据目的进行适当选择，但是，通常为1～100个氨基酸，优选为3～50个氨基酸，更优选为5～20个氨基酸。在将4个抗体可变区进行结合的情况下，通常需要3个连接子。多个连接子可以相同，也可以使用不同的连接子。
本发明的抗体中含有嵌合抗体及人源化抗体。嵌合抗体是将2种或多于2种的不同抗体分子中的每一部分进行组合而制备的抗体分子。本发明优选的嵌合抗体是具有来源于本发明的兔单克隆抗体的可变区以及其他物种(例如，人)的恒定区的抗体。人源化抗体是将非人源抗体的CDR移植至人抗体而成。嵌合抗体以及人源化抗体能够按照常规方法来进行制备。
本发明的抗体还包括：在本发明的氨基酸序列中附加了1个或多个氨基酸残基的抗体。另外，还包括：这些抗体与其他肽或多肽融合而成的融合蛋白质。融合蛋白质的制备能使用本领域技术人员公知的方法来进行，例如，能够将编码本发明的抗体的核苷酸与编码其他肽或多肽的多核苷酸以阅读窗相一致的方式进行连接并导入表达载体中，使其在宿主中进行表达。对于在与本发明的抗体进行结合时使用的其他肽或多肽而言，没有特别的限定，但是，例如，可举出FLAG、由6个组氨酸(His)残基构成的6×His、聚组氨酸段、流感血凝素(HA)、T7-tag、HSV-tag、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白质等。
2.普莱晒谱星的测定方法
本发明的第二方式是至少使用本发明的抗体或其抗原结合性抗体片段、对普莱晒谱星进行免疫学测定的方法，该方法至少包括接触工序，该接触工序使本发明的抗体或抗原结合性抗体片段与包含普莱晒谱星的检测体进行接触。在本发明中，“测定”一词能够与“检测”、“定量”、“分析”等用语相互变换地使用，意指包含定量的和定性的确定。普莱晒谱星的测定优选在体外进行。
普莱晒谱星作为用于检测败血症的标记物而众所周知，因此，该方法还能够称为用于检测败血症的方法，所述方法至少包括使含有普莱晒谱星的检测体与本发明的抗体或抗原亲和性抗体片段进行接触的工序。
即，还能称为检测败血症的方法、或者称为用于辅助检测或诊断败血症的方法，所述方法至少包括1)测定工序：使用本发明的抗体来测定受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度，以及2)判定工序：将在1)中获得的普莱晒谱星浓度与临界值进行比较，判定普莱晒谱星浓度是否是高于临界值的值。此时的临界值为314～600pg/mL，优选400～580pg/mL，更优选450～550pg/mL，进一步优选500pg/mL。
在本发明中，“疾病的检测”可以更替为“疾病检测的辅助”或“疾病诊断的辅助”来加以使用。
另外，例如，抗体或抗原结合性抗体片段能够用于下述疾病的检测或评价，该疾病的检测或评价是选自由败血症与全身性炎症反应综合症(systemic inflammatoryresponse syndrome、SIRS)的判别、败血症的严重化的风险评价、败血症的预后预测(死亡率预测)、败血症的严重度的评价、术后传染病的检测、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascular coagulation、DIC)的检测、感染性DIC的检测、心脏疾病的检测、伴随细菌感染的呼吸道传染病的检测、炎症性肠疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)的检测、粒细胞减少性发热(febrile neutropenia、FN)的检测、噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome、HPS)的检测以及吞噬细胞的功能评价所组成的组中的至少一种。
术后传染病是在手术后发病的传染病的总称，是指由手术以及其所需的辅助疗法导致的全部传染病。另外，术后传染病包括基于Guideline for prevention of surgicalsite infection,1999(CDC)而诊断为术后传染病的全部疾病。
作为心脏疾病，例如，可举出急性冠状动脉综合症(ACS)、急性心脏衰竭、急性失代偿性心脏衰竭(ADHF)、慢性心脏衰竭、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性脑卒中、出血性脑卒中以及短暂性脑缺血发作。
作为伴随细菌感染的呼吸道传染病，可举出下呼吸道传染病或肺炎。下呼吸道传染病包括急性下呼吸道传染病和慢性下呼吸道传染病。急性下呼吸道传染病包括：急性气管炎、急性支气管炎、急性细支气管炎，大多是通过上呼吸道的病毒感染波及到下呼吸道而发病，但有一部分是由细菌引起的二次感染的继发。发现细菌二次感染的征兆时，适合抗生素给药。慢性下呼吸道传染病是指，在支气管扩张症或慢性阻塞性肺病等中，在具有器质性障碍的下呼吸道中细菌的持续感染成立的病态，存在持续感染和急性恶化。发生下呼吸道的器质性障碍的疾病包括：支气管扩张症、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、弥漫性泛细支气管炎、陈旧性肺结核、尘肺、非结核性抗酸菌症、变应性支气管肺曲霉菌病、肺纤维症、慢性支气管哮喘等。持续感染、急性恶化均适合抗生素给药。肺炎包括社区获得性肺炎、院内感染性肺炎。优选为社区获得性肺炎。
作为吞噬细胞的功能评价，可举出(a)中性粒细胞、颗粒细胞和/或白血球的吞噬作用能的测定、(b)通过测定中性粒细胞、颗粒细胞和/或白血球的吞噬作用能来对免疫功能进行的评价、(c)自体细胞移植或他体细胞移植时的移植用细胞的品质评价、以及(d)吞噬细胞的吞噬作用相关疾病的检测等。作为吞噬细胞的吞噬作用相关疾病，例如，可举出自身免疫疾病、类风湿性关节炎、乳腺炎、痛风、肾小球肾炎、溃疡性结肠炎、地中海热、中耳炎、鼻炎、肺炎、结核、膀胱炎、羊水传染病以及脓性精液症。作为在对吞噬细胞的吞噬作用相关疾病进行检测时使用的检测体，可以使用组织液、淋巴液、关节液、乳汁、脑脊髓液、脓、唾液、泪液、粘液、鼻水、痰、尿、腹水、羊水、精液等体液，或者对鼻腔、支气管、肺、皮肤、腹腔、各种脏器、关节、骨等进行洗涤后的洗涤液。
作为使用本发明的抗体或抗原结合性抗体片段来对普莱晒谱星进行免疫学测定的方法，例如，可举出酶免疫测定法(下面，也记作EIA或ELISA)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、荧光抗体法(FAT)、荧光酶免疫测定法(FEIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫层析法、凝集法、竞争法等，但是，并不限于这些方法。在本发明中，可以使用直接法或间接法。还可以使用使生物素—抗生物素蛋白(链霉)复合体形成以进行检测的增感方法。
EIA是使用酶标记抗体进行的免疫测定法之一，可举出直接法、间接法等。作为优选例，有夹心ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)。
所谓夹心ELISA是指下述方法：使用抗原识别部位不同的2种以上的抗体，预先将其中之一的抗体固定化于固相，并使用2种抗体来夹持要进行检测的抗原，从而形成抗体-抗原-抗体复合体，由此来进行检测。
化学发光酶免疫测定法(CLEIA：Chemiluminescent Enzyme Immunoassay)是指如下方法：使检测体中的抗原与固定于磁性粒子、磁珠等中的抗体进行反应后，与酶标记抗体进行反应，并在洗涤(B/F分离)后加入化学发光底物进行酶反应，然后测定发光强度。
例如，可以使检测体中的抗原与结合了生物素的抗体在液相中进行反应，并将抗体捕获于结合有链霉的磁性粒子，洗涤(B/F分离)后，与酶标记抗体进行反应，并进行与上述同样的处理。
在使用碱性磷酸酶(ALP)作为标记酶时，对于化学发光底物而言，优选使用CDP-StarTM、AMPPD(R)、CSPD(R)。当标记酶为HRP时，化学发光底物优选使用鲁米诺(luminol)。
对于检测灵敏度而言，通常按照化学发光＞荧光＞吸光(呈色)的顺序依次递减，可根据所需的灵敏度来选择测定法。
化学发光免疫测定法(CLIA：Chemiluminescent Immunoassay)是如下所述的方法：使固定于磁性粒子等的抗体与检测体中的抗原进行反应后，使由化学发光物质标记的抗体进行反应，在洗涤(B/F分离)后测定发光強度。标记物质可使用吖啶酯。
荧光酶免疫测定法(FEIA：Fluorescent Enzyme Immunoassay)是一种如下所述的方法：使已固定化的抗体与检测体中的抗原进行反应后，使酶标记抗体进行反应，在洗涤(B/F分离)后添加荧光底物以进行酶反应，然后测定荧光强度。在标记酶中可使用HRP、ALP等。对于荧光底物而言，当标记酶为HRP时，可优选使用Amplex(R)Red等，当标记酶为ALP时，可优选使用4-MUP(4-甲基伞花基磷酸盐，4-Methylumbelliphenyl phosphate)、AttoPhos(R)等。
电化学发光免疫测定法(ECLIA：Electro Chemiluminescence Immunoassay)是一种如下所述的方法：使固定于磁性粒子的抗体以及由电化学发光物质标记的抗体与检测体中的抗原进行反应后，进行洗涤(B/F分离)，并测定由电能所导致的发光强度。在标记物质中可使用钌等。在标记物质中可使用Ru(bpy)3等，通过由电极带电所导致的氧化、和由三丙胺(TPA)等导致的还原反应，反复进行激发发光。
放射免疫测定法((RIA：Radioimmunoassay)是一种使用基于放射性同位素的标记体的测定方法。例如，能够在使固定于磁珠等的抗体与检测体中的抗原进行反应后，使由放射性同位素(125I等)标记的抗体进行反应，在洗涤(B/F分离)后测定125I的放射线量。
免疫层析法是利用了毛细管现象的免疫测定法，所述毛细管现象是在溶解试剂的同时，被检测体沿试纸条移动的现象。检测体中的抗原、试纸条上的标记抗体及捕获抗体这3者形成免疫复合体，并确认标记物颜色的方法。对于抗体的标记而言，可使用金胶体、酶、荧光物质等。在使用酶标记抗体时，在试纸条上设置酶底物，使其进行显色。
渗滤法(flow through method)是检测体中的溶液与作为被检测物质的抗原一同在作为不溶性载体的膜上形成抗体-抗原-抗体复合体的方法。此时，未被固定于膜上的物质通常垂直地从膜的表面穿透至背面而除去。
凝集法是使检测体中的抗原与试剂中的抗体进行反应，并观察凝集的方法。可举出不使用固相的方法、使用人工制备的粒子作为固相的粒子凝集法(particleagglutination：PA)、在PA中使用胶乳粒子的胶乳凝集法(latex agglutination：LA)等。
对于竞争法而言，例如，能够使抗体与固相结合，并使一定量的标记抗原与被检测试样同时进行反应，根据所结合的标记物的量来测定试样中的抗原的量。
第一方式所述的本发明的抗体或片段可优选用于上述测定方法。
对于在普莱晒谱星测定中使用的检测体而言，没有特别地限定，但是，优选水性检测体，例如，可举出血液(全血、血浆、血清等)、尿、组织液、淋巴液、关节液、乳汁、脑脊髓液、脓、唾液、泪液、粘液、鼻水、痰、腹水、用水、精液等体液，另外，还可举出对鼻腔、支气管、肺、皮肤、腹腔、各种脏器、关节、骨等进行洗涤后的洗涤液，或者，细胞培养上清液，或柱洗脱液等。这些试样可以保持原样地用于测定中，或者使用各种缓冲液等进行稀释或萃取后进行浓缩，再用于测定中。
另外，在使用全血检测体作为检测体的情况下，可在采集全血检测体以后72小时、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、或者4小时内进行分析。另外，可以通过EDTA采血管或肝素采血管来采集全血检测体。优选地，可举出：通过EDTA采血管来采集全血检测体，并在6小时内进行分析，或者通过肝素采血管来采集全血检测体并在4小时内进行分析。
3.sCD 14-ST测定用试剂盒
本发明的第三方式是一种普莱晒谱星测定用试剂盒，其以第一方式的抗体或其抗原结合性抗体片段为必须的构成要素。
本发明的测定试剂盒优选含有用于普莱晒谱星测定的辅助试剂。作为辅助试剂，例如，可举出一次抗体、二次抗体、标记抗体、标记酶、金胶体等标记物质；显色底物、荧光底物(Amplex(R)Red，AttoPhos(R)，4-MUP等)、化学发光底物(鲁米诺，CDP-StarTM，AMPPD(R)，CSPD(R)等)、生物素-链霉等特异性结合物质、不溶性载体、阻断剂、稀释液、洗涤液、标准物质等，但是，并不限于上述试剂。
根据第二方式的普莱晒谱星测定法来适当组合使用。
一次抗体优选与普莱晒谱星进行结合的抗体，更优选对与本发明的抗体不同的表位进行识别的抗体。例如，可举出WO2004/044005的实施例3所述的F1106-13-3抗体、F1031-8-3抗体等。
可以将本发明的抗体或一次抗体作为标记抗体。当本发明的抗体和一次抗体都未进行标记时，可以使用经标记的二次抗体。
作为不溶性载体，例如，可举出磁性粒子、磁珠、玻璃、纤维素、硝基纤维素、多孔性合成聚合物、玻璃纤维、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、塑料板、胶乳粒子、无纺布、滤纸等。
对于抗体的标记物而言，优选使用辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖酶等酶、金胶体等，但是，并不限于上述标记物。
例如，在使用HRP的情况下，作为显色底物，可举出3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)等。在使用ALP的情况下，作为显色底物，可举出对硝基苯磷酸盐(pNPP)等。在使用β-半乳糖酶时，作为显色底物，可例举邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside：ONPD)等。
例如，夹心ELISA法用测定试剂盒可包含本发明的抗体及一次抗体(任意抗体都可进行酶标记)、显色底物、稀释液、标准物质等。当本发明的抗体及一次抗体未被标记时，可以包含已被标记的二次抗体。
例如，化学发光酶免疫测定法(CLEIA)用测定试剂盒可包含固定于磁性粒子等的抗体、酶标记抗体、化学发光底物、稀释液、洗涤液等。
例如，荧光酶免疫测定法(FEIA)的测定试剂盒可包含固定于磁性粒子等的抗体、酶标记抗体、荧光底物、稀释液、洗涤液等。
例如，电化学发光免疫测定法(ECLIA)的测定试剂盒可包含生物素化抗体、Ru(bpy)3标记抗体、链霉亲和素包覆的磁性粒子、三丙胺等。
免疫层析法的测定试剂盒是设置了试样添加部、试剂部、检测部以及吸收部以使添加于试样添加部的液性检测体按上述顺序进行移动的试纸条。例如，能够使标记的第二抗体浸渍于试剂部，并在检测部设置结合了第一抗体的不溶性载体。
对于试纸条而言，可示例使用多孔性载体等。对于多孔性载体，例如，可举出硝基纤维素、纤维素、纤维素衍生物、尼龙、尼龙纤维、玻璃纤维、多孔性合成聚合物等。对于吸收部而言，可举出水吸收性材料的海绵等可吸收聚合物、纤维素滤纸、滤纸等。
对于败血症患者而言，由于报告了普莱晒谱星的血液中浓度特征性上升的事实，因而本发明的第三方式的普莱晒谱星测定用试剂盒可以是败血症检测用试剂盒，或者是对败血症的检测或诊断进行辅助的试剂盒。
另外，本发明的第三方式的普莱晒谱星测定用试剂盒能够用作败血症的诊断药或者败血症诊断的辅助药。对于普莱晒谱星测定用试剂盒而言，在以这种检测败血症等作为目的时，当使用本发明的抗体测定的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度比临界值更高时，能够判定受试者可能患有败血症，并能够对检测或诊断进行辅助。此时，临界值为314～600pg/mL，优选为400～580pg/mL，更优选为450～550pg/mL，进一步优选为500pg/mL。
另外，例如，普莱晒谱星测定用试剂盒能够用于下述疾病的检测或评价，该疾病的检测或评价为选自由败血症与全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory responsesyndrome、SIRS)的判别、败血症的严重化的风险评价、败血症的预后预测(死亡率预测)、败血症的严重度的评价、术后传染病的检测、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascular coagulation、DIC)的检测、感染性DIC的检测、心脏疾病的检测、伴随细菌感染的呼吸道传染病的检测、炎症性肠疾病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)的检测、粒细胞减少性发热(febrile neutropenia、FN)的检测、噬血细胞综合症(hemophagocytic syndrome、HPS)的检测以及吞噬细胞的功能评价所组成的组中的至少一种。普莱晒谱星测定用试剂盒可以是用于检测或评价上述至少一种疾病的试剂盒。
4.对第一方式所述的抗体或其抗原结合性抗体片段进行编码的多核苷酸
作为本发明的第四方式，提供一种编码本发明的第一方式的抗体或其抗原结合性抗体片段的氨基酸序列的多核苷酸或核酸。在该多核苷酸中含有DNA(基因组DNA、cDNA、合成DNA等)和RNA(mRNA等)。多核苷酸可以是单链(有义链(模板链)或反义链)或双链。例如，能够使用市售的试剂盒，从产生本发明的抗体的杂交瘤提取mRNA来合成cDNA。可以通过PCR法等来对目标基因进行扩增。
在某个实施方式中，需要本发明的抗体相对于编码可变区的重链或轻链的碱基序列具有至少80％以上的同一性。另外，对于CDR序列而言，也需要其相对于编码抗体的整个CDR(VH CDR1～3以及VL CDR1～3)的碱基序列具有至少80％以上的同一性。从检测灵敏度的观点出发，可以为85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。
另外，在某个实施方式中，本发明的抗体还包含下述抗体：由可与编码可变区的重链或轻链的碱基序列的互补链在严格条件下进行杂交的碱基序列所编码的抗体。
杂交能够根据公知的方法或类似的方法来进行，例如，能够根据MolecularCloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)所述的方法等来进行。
所谓严格条件，是指形成特异性杂交、而不形成非特异性杂交的条件。作为通常的严格条件，例如，可举出：在钾浓度为约25mM～约50mM、镁浓度为约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。本领域技术人员通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，能够容易地选择这样的条件。
5.包含第四方式所述的多核苷酸的重组载体
第五方式是一种载体，该载体中导入了编码本发明的抗体或抗体结合性抗体片段的氨基酸的多核苷酸。载体优选适于第一方式所述的抗体基因的表达的载体和/或表达载体，其能够使用本领域技术人员可使用的技术来制备。
6.产生第一方式所述的抗体或抗原结合性抗体片段的细胞
作为本发明的第六方式，提供一种产生本发明的第一抗体或其抗原结合性抗体片段的细胞。作为这种细胞的例子，可举出杂交瘤、转化体、或导入了本发明的抗体的基因的基因重组细胞等。
作为产生抗体的杂交瘤，具体而言，可举出实施例1所示的克隆体。
对于转化体而言，例如，其能够通过在第一方式所述的宿主细胞(例如，COS-1细胞、CHO细胞等)中导入载体来获得，所述载体中导入了前述记载的编码本发明的抗体或其抗体结合性抗体片段的氨基酸的多核苷酸。
杂交瘤、转化体的制备方法如第一方式所述。
7.使用转化体进行的抗体或抗原结合性抗体片段的制备方法
本发明的第七方式是一种抗体或抗原结合性抗体片段的制备方法，其包括培养转化体的工序，所述转化体含有导入了编码第一方式的抗体或其抗原结合性抗体片段的核苷酸的载体。
在转化体的培养物中，使第一方式的抗体或抗原结合性抗体片段生成，从培养物中采集抗体或抗原结合性抗体片段。详细内容如第一方式所述。
8.抗普莱晒谱星抗体的筛选方法
本发明的第八方式是一种抗体筛选方法，其用于获得对测定检测体中的普莱晒谱星有用的抗普莱晒谱星抗体，所述方法至少包括下述工序：
1)构建工序，该构建工序使用候选的抗体来构建普莱晒谱星测定系统；
2)确定工序，该确定工序使用该测定系统来确定检测体中的TG浓度对普莱晒谱星测定值产生的影响；
即，该方法的特征在于，通过使用抗体的测定系统来进行TG的干扰试验。获取候选的抗体(优选抗普莱晒谱星抗体)的方法如本发明的第一方式或第七方式所述。对于普莱晒谱星测定系统而言，只要是可用于测定检测体的普莱晒谱星值的测定系统即可，没有特别的限定，但是，例如，可举出第二方式所述的测定系统，例如，可使用夹心ELISA等。
对于确定检测体中的TG浓度对普莱晒谱星测定值产生的影响的确定工序而言，例如，可将不添加TG时的检测体的普莱晒谱星测定值与在同一检测体中添加了一定量的TG时的普莱晒谱星测定值进行比较，根据两个测定值的解离度来确定上述影响。例如，作为一个例子，使用多个检测体进行TG干扰试验，当相对于不添加TG时的普莱晒谱星测定值，检测体中的TG浓度调节为20mg/mL时的普莱晒谱星测定值的解离度显示为±20％以下、更优选显示为±10％以下的检测体的比率高时，可确认检测体中的TG对普莱晒谱星测定值产生的影响小，该抗体很难受到TG干扰，可确定该抗体是对普莱晒谱星测定有用的抗体。
或者，作为其他评价方法，可使用候选的抗体与S68抗体来进行TG干扰试验，通过比较它们的解离度来进行评价。作为优选的方式之一，当使用候选的抗体进行TG干扰试验时的普莱晒谱星测定值的解离度与S68抗体在相同条件下的解离度类似时，可确定该抗体是对测定检测体中的普莱晒谱星有用的抗体。例如，作为一个例子，使用多个检测体进行TG干扰试验，在使用候选的抗体的测定系统中，根据通过添加TG而将检测体中的TG浓度调节为20mg/mL时的解离度与使用S68抗体的测定系统在相同条件下的解离度来确定解离度的差，当解离度的差显示为20％以下、优选10％以下的检测体的比率高时，可确定该抗体是对测定检测体中的普莱晒谱星有用的抗体。
本发明的筛选方法可任意地包括确定工序，该确定工序确定候选的抗体与S68肽或普莱晒谱星的结合活性。另外，本发明的筛选方法可任意地包括比较工序，该比较工序通过使用候选抗体的普莱晒谱星测定系统对正常人与败血症患者的检测体进行测定，并比较测定值的差。这些可根据实施例1中的记载来实施。
前述筛选方法的优选方式之一至少包括下述工序：
1)获取工序，该获取工序用来获取候选的抗普莱晒谱星抗体；以及
2)选择工序，该选择工序使用该候选的抗体来构建普莱晒谱星测定系统，选择在通过添加TG将检测体中的TG浓度调节为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度显示为±20％以下的检测体的比率为50％以上的前述抗体。
在前述方法中，能对检测体中的TG浓度(此处为20mg/mL)、普莱晒谱星测定值的解离度(此处为±20％)、以及检测体比率进行适当改变。另外，前述2)的工序即使替换成本发明的第一方式所述的其他TG干扰试验和/或评价方法也能实施。
本发明的第八方式是一种本发明的抗体的筛选方法，另一优选方式至少包括下述工序。
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体；以及，
2)选择工序，该选择工序选择下述抗体：该抗体在普莱晒谱星的序列中，以序列号1的氨基酸序列作为表位而特异性识别。
在前述方法中，在2)的工序中，没有特别的限定，但是，能够使用本发明的第一方式所述的表位确定方法。
例如，2)可以是下述工序。
2)选择工序，该选择工序为为了抑制该抗体与普莱晒谱星的结合，在使由序列号1构成的氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，选择该抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制的前述抗体。
上述表位的确定方法可以任意加入下述3)工序。
3)选择工序，为了抑制该抗体与普莱晒谱星的结合，在使氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，选择下述抗体：借助由序列号35、36、37、38、39、40、41的序列构成的氨基酸残基中的至少一种，该抗体与普莱晒谱星的结合的竞争抑制小于20％。
另外，在本发明的第八方式中，另一优选的方式是至少包括下述工序的本发明的抗体的筛选方法。
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体；以及，
2)选择工序，该选择工序选择下述抗体：使用所述候选抗体而获得的检测体中的普莱晒谱星测定值与使用S68抗体而获得的同一检测体中的普莱晒谱星测定值的相关系数为0.9以上的抗体。
前述方法能根据本发明的第一方式以及实施例5所述内容来实施。相关系数也能适当改变。
另外，在本发明的第八方式中，另一优选方式是至少包括下述工序的本发明的抗体的筛选方法。
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体；以及，
2)选择工序，该选择工序选择以小于10-8M的亲和性(平衡解离常数、KD值)与普莱晒谱星结合的抗体。
前述2)的工序可置换为下述工序。
2)选择工序，该选择工序选择下述抗体：该抗体与普莱晒谱星的结合活性比S68抗体与普莱晒谱星的结合活性更优异。
亲和性(平衡解离常数，KD值)、结合活性的测定能根据本发明的第一方式所述的内容来实施。结合活性可通过吸光度比来进行评价。优选：在将S68抗体与普莱晒谱星进行反应时的吸光度设为1时，使本发明的抗体与普莱晒谱星进行反应时的吸光度的比为2以上。
上述本发明的抗体的筛选方法可组合各工序来实施。对于优选的组合而言，例如，如下所述。
一种至少包括下述工序的抗普莱晒谱星抗体的筛选方法，
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体；
2)选择工序，该选择工序是为了抑制该抗体与普莱晒谱星的结合，在使由序列号1构成的氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，选择下述抗体：该抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制；以及，
3)选择工序，该选择工序选择下述抗体：该抗体对普莱晒谱星的结合活性比S68抗体对普莱晒谱星的结合活性更优异。
9.败血症患者的治疗方法
本发明的第九方式是一种败血症患者的治疗方法，其使用本发明的第一方式的抗体或抗原结合性抗体片段对实施了用以辅助检测败血症的方法的受试者进行败血症的治疗。
用于对败血症的检测进行辅助的方法如本发明的第二方式所述。对败血症的治疗没有特别的限定，但是，例如，可举出抗菌药、类固醇的给药、升压药、输液、氧给药、人工呼吸管理、连续血液透析过滤、血浆置换等。
10.受试药(或治疗药)的筛选方法
本发明的第十方式是一种受试药(或治疗药)的筛选方法，其包括下述确定工序，该确定工序使用本发明的第一方式中的抗体或其抗原结合性抗体片段或第三方式的试剂盒，确定给药受试药(或治疗药)的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度。对于受试药所要应对的疾病而言，只要是受试者检测体中的普莱晒谱星浓度上升的疾病即可，没有特别的限定。优选：将受试药给药前与给药后的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度进行比较，确定受试药给药后的普莱晒谱星浓度是否相比于给药前有所下降。或者，可以确定受试药给药后的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度是否降低至正常人水平。
即，一种包括下述工序的受试药的筛选方法。
1)确定工序，该确定工序确定给药受试药的受试者的检测体中的普莱晒谱星浓度。
11.rsCD 14ST-Fc
rsCD14ST-Fc具备：包括序列号3(人全长可溶性CD14)的第1位至第64位的序列以及抗体重链Fc区的结构。
对于rsCD14ST-Fc的制备而言，例如，如实施例9-(2)所述，能够通过将用于表达rsCD14ST-Fc的瞬时表达用质粒转染至如COS-1细胞那样的宿主细胞中，并对该宿主细胞进行培养，回收所得到的培养上清液并进行纯化来获得，所述用于表达rsCD14ST-Fc的瞬时表达用质粒具有：人sCD14中第1位至第64位的序列的下游具有凝血酶识别序列的序列、以及人源IgG1抗体重链Fc区的序列。
优选在人sCD14中的第1位至第64位的序列与Fc之间插入便于切割的序列，对于该序列没有特别的限定，但是，除凝血酶识别序列以外，例如，还可以使用Factor Xa识别序列、PreScission Protease识别序列等。rsCD14ST-Fc不是必须具有便于切割的序列。
对于抗体重链Fc区而言，除来源于人的IgG1抗体以外，还能使用所有抗体的Fc区。对宿主细胞也没有特别限定。
rsCD14ST-Fc具有以下制造上的优势：由于rsCD14ST-Fc能通过培养COS-1细胞等宿主细胞来获得，因而能容易地进行表达，另外，Fc可与蛋白质A特异性地结合，能够使用蛋白质A柱进行纯化，因而也易于纯化。在切断Fc区后进行纯化时，除蛋白质A柱以外，还能使用常规方法进行纯化，例如，可以使用WO2005/108429的实施例13所述的方法等进行纯化。
对于rsCD14ST-Fc，能够切断Fc区而作为rsCD14-ST来使用，也能够不切断Fc区而保持rsCD14ST-Fc的状态来使用，两者都与抗普莱晒谱星抗体特异性结合。
对于在实施例9-(2)中制备的rsCD14ST-Fc而言，在rsCD14ST与Fc之间插入与制备rsCD14-ST标准品时相同的凝血酶序列。使用凝血酶切断Fc区而获得的rsCD14ST具有与rsCD14ST标准品相同的序列，并且具有相同的特性(参见WO2005/108429)。
对于由rsCD14ST-Fc制备rsCD14而言，在切断Fc区后，通过蛋白质A柱能容易地仅除去Fc，也容易进行制备。对rsCD14ST-Fc的Fc区的切断方法，能根据已插入的易于切断的序列来适当加以选择。
对于rsCD14ST-Fc而言，即使不切割Fc区而保持rsCD14ST-Fc的状态也具有rsCD14-ST的活性，因而能用作抗原。
现有的rsCD14-ST标准品通过下述方式获得：使在人sCD14的第64位与第65位之间插入了凝血酶识别部位的rsCD14在宿主细胞中表达，在凝血酶识别部位进行切断而获得。rsCD14结构虽然包含rsCD14-ST，但是，在保持原样的状态下基本上不显示rsCD14-ST的反应性，在切断并纯化后，能获得rsCD14-ST的活性，从而能加以使用。另一方面，对于rsCD14ST-Fc而言，即使不切断Fc区也能够与rsCD14-ST同样地使用，因而能够削减切断所耗费的工夫劳动，从而便于使用。
实施例
(实施例1)以合成肽作为抗原的单克隆抗体的制备
1-(1)兔的免疫
按照WO2004/044005中实施例1所述的方法制备给药抗原，并对兔进行免疫。即，制备在由序列号2的序列(对应于序列号3的第53位至第68位的序列)构成的肽(下面，记作S68肽)的N末端插入了半胱氨酸的肽。将KLH(PIERCE)与该肽结合，作为给药抗原(下面，记作S68肽-KLH)。
将S68肽-KLH100μg与等量的弗氏完全佐剂(DIFCO)混合后，在新西兰白兔(3月龄)的背部皮内给药。分别在2周后、以及2周后再经过1周后，将S68肽-KLH100μg与弗氏不完全佐剂(DIFCO)进行等量混合，然后在背部皮内给药。进而在耳静脉内给药2次S68肽-KLH20μg。
给药结束1周后，进行耳静脉采血，按照常规方法与抗血清分离，使用夹心ELISA确认了抗体效价以及与普莱晒谱星的反应性。即，将F1106-13-3固定化于免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341，丹麦能肯公司制)后，进行封闭。使用D-PBS(pH7.4)对兔的各抗血清进行稀释，并制备从×1/1000倍至×1/32000倍的各倍数的稀释系列(8点)。使用稀释液(0.1％BSA/D-PBS)对普莱晒谱星标准品(WO2005/108429的实施例16所述的rsCD14-ST)进行稀释，制备3ng/mL的标准液。将抗血清稀释系列添加至微孔板，接着添加3ng/mL的标准液。使微孔板进行1小时反应，接着使用含有0.05％吐温(Tween)20的生理盐水洗涤微孔板5次。接着，添加稀释了抗兔Igs-HRP(丹科(DAKO)公司、P448)的溶液100μL，在25℃反应1小时。同样地洗涤微孔板5次，然后，添加四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)，在室温反应10分钟。反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应。通过酶标仪Multiskan JX(雷勃公司(Thermolab Systems))测定450/650nm处的吸光度。基于吸光度测定的结果，选择抗体效价高的个体。
在进行脾脏采集的4天前，将S68肽-KLH400μg给药耳静脉内，以无菌的方式采集脾脏，回收淋巴细胞。
1-(2)细胞融合及克隆
按照美国专利第7429487号所述的方法，将2×108淋巴细胞与来源于兔的永生B淋巴细胞融合伴侣1×108细胞进行混合，分2次进行细胞融合。将融合的细胞接种于96孔板，并按照常规方法加以培养。
针对所得到的286个克隆的培养上清液，使用S68肽-BSA确认与给药抗原的结合活性，选择已确认了结合活性的72个克隆体。
对于与给药抗原的结合活性已被确认的72个克隆体，通过与1-(1)相同的夹心ELISA系统，确认与普莱晒谱星标准品的结合活性，选择结合活性已确认的克隆体。
对于与普莱晒谱星标准品的结合活性已确认的克隆体，确认其对患者血液中普莱晒谱星的特异性。即，使用稀释液将3例正常人血清(普美德克斯(ProMedDx)公司)和3例败血症患者血清(生物再生(Bioreclamation)公司)稀释5倍，使用与1-(1)相同的夹心ELISA系统进行同样的测定。其结果是，选择与普莱晒谱星标准品的反应性良好、且吸光度在正常人检测体中不上升、而在败血症患者检测体中上升的5个克隆。通过有限稀释法对各克隆体进行克隆后，分别制备冷冻安瓿。
1-(3)基于BIACORE对结合方式进行分析
为了确认由选择的克隆体而得到的各抗体与普莱晒谱星的结合方式，使用BIACORE3000(生物大分子相互作用分析仪)(GE医疗集团)进行了分析。按照常规方法将F1106-13-3抗体固定于CM5芯片(GE医疗集团)，在其中添加普莱晒谱星标准品(1μg/mL)。进一步添加稀释的培养上清液(0.5μg/mL)，绘制传感图。显示出了良好的结合方式，没有观察到任何克隆体与解离相发生解离。
1-(4)兔单克隆抗体的制备
使用制备的产生兔抗普莱晒谱星单克隆抗体的杂交瘤来制备兔单克隆抗体。即，按照常规方法对冷冻安瓿进行解冻，使用含10％胎牛血清、8％添加物A(艾博抗公司(Abcam))的RPMI1640培养基(西格玛公司(Sigma))进行培养后，回收细胞并按照CELLine(瑞士因特瑞公司(Integra Bioscience))的方法，使用IS-MAB-CD培养基(欧文公司(Irvine))进行培养，回收含有抗体的培养上清液。接着，对于所得到的培养上清液，使用重组蛋白A琼脂糖凝胶FF(rmp-Protein A Sepharose FF)(GE医疗集团)对抗体进行纯化。对含有纯化抗体的溶出液进行浓缩，接着进行对D-PBS(PH7.4)的透析。抗体的蛋白浓度是以牛IgG(伯乐公司(BioRad))作为标准品、通过考马斯蓝染色法(Bradford法)来求出的。通过SDS-PAGE对所得到的抗体进行分析，确认了分子量约150kDa的单一谱带，另外，也确认了通过还原得到的约50kDa的重链以及约25kDa的轻链。
(实施例2)重组抗体的制备
2-(1)兔单克隆抗体的可变区氨基酸序列的确定和表达用质粒的构建
使用RNA提取试剂盒(RNeasy Mine Kit(凯杰(QIAGEN)公司))，从由实施例1获得的各杂交瘤中提取总RNA，通过cDNA合成试剂盒(SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(英杰公司(Invitrogen))合成单链cDNA。以得到的单链cDNA为模板，通过基于Rabbit Ig-Primer Set(Rader C,et al.JBC 2000；275：13668-76，以及，Lang I，et al.Gene 1996；172：295-8)的PCR对可变区进行扩增，并按照常规方法来确定重链和轻链的各可变区的碱基序列。
在数据库上检索除可变区以外的序列信息，设计5’侧引物及3’侧引物。通过使用这些引物来进行PCR，分别对重链全长和轻链全长进行扩增并将其克隆至pTK-2433，所述pTK-2433是哺乳细胞中的瞬时表达用载体，是具有EF-1α启动子和CMV增强子的pTK-2433。按照常规方法，确定重链全长和轻链全长的碱基序列、以及由所述序列编码的氨基酸序列。将抗体的可变区的CDR部分的氨基酸序列示于表10和表11中。
表10
表11
2-(2)瞬时表达重组抗体的制备
将在前述2-(1)中制备的瞬时表达用质粒(包含重链序列的表达质粒与包含轻链序列的表达质粒)进行等量混合，并转染COS-1细胞(ATCC：CRL-1650)。即，将转染试剂2μL/mL与质粒4μg/mL进行混合，将其添加至培养基后，添加COS-1细胞，在37℃温度进行培养。72小时后，回收培养上清液，进而添加新的培养基。96小时后，回收培养上清液，混合2次的量后，使用0.22μm的滤膜(Sterivac，密里博公司)进行过滤。对于所得到的培养上清液，按照前述1-(4)所述的方法进行纯化，并通过SDS-PAGE进行分析，确认了约150kDa的单一谱带的重组抗体。
2-(3)重组抗体稳定表达用质粒的构建
对于在前述2-(2)中制备的瞬时表达用质粒，使用限制性内切酶以切割出编码重链的基因片段以及编码轻链的基因片段，将其组合在具有EF-1α启动子以及小鼠DHFR表达单元(作为启动子的SV40启动子(不包含增强子区)、来自SV40的PolyA信号)的质粒(pTK-2577；日本特开2007-215546所述)中，制备在哺乳动物细胞中的稳定表达用质粒。
(实施例3)通过CHO细胞制备抗体
3-(1)产生兔单克隆抗体的基因重组抗体的CHO细胞的制备
将在前述2-(3)中构建的稳定表达用质粒转染DHFR基因缺陷的CHO细胞(CHODXB11)，从而确立产生兔抗体的转化体CHO。即，在转染CHO DXB11的当天进行离心，然后以8×106细胞/150cm2Roux的浓度植入到烧瓶中，所述CHO DXB11是通过包括HT mediaSupplement(50×)Hybri-Max(西格玛(Sigma)公司制；最终浓度使用1×)及200mM L-Glutamine(西格玛(Sigma)公司；最终浓度使用4mM)的EX-CELL 302 PF CHO(JRHBioscience)进行驯化培养的。使用FuGENE6(普洛麦格(Promega)公司)125μL，基于附在FuGENE6中的方法制备表达质粒12.5μg，导入前述CHO DXB11中。在5％CO2、37℃温度的条件下培养2天后，回收细胞，使用不含HT、而含4mM L-谷氨酰胺的EX-CELL 302PF CHO培养基(下面，记作EX-CELL(HT-))进行2次洗涤，重悬于EX-CELL(HT-)中。接着，以12500～50000细胞/孔的浓度再将细胞接种于96孔板，继续在5％CO2、37℃温度的条件下进行培养，每3天或4天将培养基的一半更换成新的EX-CELL(HT-)。继续培养约2周后，将生成了菌落的孔内的细胞转移至新的微孔板中。
通过将S68肽抗原用于固相的ELISA法，对CHO细胞的培养上清液中的抗体进行筛选，选择5种可产生与S68肽结合的抗体的CHO细胞。
3-(2)使用甲胺喋呤(Methotrexate)的基因扩增
对于由3-(1)获得的重组抗体表达用转化体CHO，使用含甲胺喋呤(Methotrexate)(下面，记作MTX)的EX-CELL(HT-)的培养基进行选择培养，由此，进行基因扩增操作，选择目标重组抗体的生产量上升的克隆体。即，将实施例3-(1)中获得的转化体悬浮于含30nM MTX的EX-CELL(HT-)培养基，植入96孔板中。每3天或4天将培养基的一半更换为新的含30nMMTX的EX-CELL(HT-)，在5％CO2、37℃温度的条件下继续进行培养直至产生菌落为止。通过EIA法确认所得到的菌落的培养上清液中的IgG浓度，选择生产量增加的克隆体。其结果是，能够获得生产量上升约2至10倍的转化体。此外，使用MTX的浓度增加了3至10倍的培养基对该进行了基因扩增的转化体反复进行选择培养，能够获得生产量进一步增加的克隆体。
3-(3)通过CHO细胞产生重组抗体
将3-(2)中获得的克隆体以1×105细胞/mL的浓度植入含30nM MTX的CHO-SFM(HT-)培养基(GIBCO)中，在37℃温度培养7天。将所得到的培养上清液用于下述纯化中。对于培养上清液，使用蛋白质A柱(Prosep-A，密里博公司)对抗体进行纯化。通过SDS-PAGE对纯化的重组抗体进行分析，确认了显示出与来源于杂交瘤的抗体相同的分子量的抗体。
(实施例4)使用夹心ELISA系统对各抗体的反应性进行评价
对于在实施例2中制备的5种兔单克隆抗体、WO2004/044005的实施例1所述的S68抗体(使用S68肽对兔进行免疫而获得的多克隆抗体)以及WO2004/044005的实施例2所述的F1146-17-2(使用S68肽对大鼠进行免疫而获得的单克隆抗体)，对它们与普莱晒谱星的反应性进行评价。
即，使用PBS(pH7.4)将各抗体稀释至5μg/mL，在免疫检测微孔板(Maxisorb，丹麦能肯(NUNC)公司)的各孔中添加50μL。在4℃温度反应一夜，然后使用离子交换水洗涤5次，在各孔中添加200μL的含有0.1％StabilGuard(苏莫蒂克斯(SurModics,Inc)公司)与0.1％吐温(Tween)20(和光纯药)的PBS，并进行封闭。接着，使用稀释液将普莱晒谱星标准品稀释至1000ng/mL，接着以3倍公比进行稀释，制备标准品的稀释系列。在每孔中添加50μL的标准品稀释系列，在25℃温度反应1小时。反应结束后，使用含0.05％吐温(Tween)20的生理盐水洗涤5次，在各孔中添加50μL的已稀释至0.25μg/mL的过氧化物酶标记F1106-13-3抗体。在25℃温度反应2小时，然后以同样的方式洗涤5次，在各孔中添加TMB溶液。在室温条件下反应20分钟后，使用0.5M硫酸溶液停止反应，使用微孔板分光光度计(分子仪器公司)对450nm(副波长650nm)处的吸光度进行测定。
将测定结果示于表12中。使用在实施例2中制备的各兔单克隆抗体的测定系统与普莱晒谱星标准品的反应性都很优异，并显示出与使用S68抗体的测定系统大致相同的反应性。
另一方面，对于使用F1146-17-2的测定系统而言，其反应性低，当普莱晒谱星浓度为1000ng/mL时，吸光度为0.368。对于该吸光度而言，在使用兔单克隆抗体的测定系统中，与普莱晒谱星浓度为0.03～0.1ng/mL时的吸光度大致相同。由此，显而易见的是，与使用F1146-17-2的测定系统相比，使用兔单克隆抗体的测定系统的反应性提高了约1万倍。这也显示了，由于正常人检测体的普莱晒谱星浓度通常约为50～300pg/mL，因而在使用F1146-17-2的测定系统中无法进行测定。
表12
各抗体的反应性比较
(实施例5)患者检测体的测定与干扰试验
使用在实施例2中制备的各抗体，通过实施例4所述的夹心ELISA系统对30例败血症患者检测体的血液中普莱晒谱星值进行测定，并对该测定值与通过使用S68抗体的夹心ELISA系统获得的测定值的相关性进行分析。
其结果是，在使用各兔单克隆抗体的ELISA系统中，存在与通过使用S68抗体的ELISA系统获得的测定值相关性良好的系统、以及与所述测定值相关性差的系统。兔单克隆抗体的F1466-12、F1466-19的相关系数与其他相比结果较差。各抗体的相关系数分别是：F1466-12为0.89、F1466-19为0.93、F1466-26为0.98。
接着，在使用各兔单克隆抗体、以及S68抗体分别制备的夹心ELISA系统中，对血液中的干扰物质(胆红素F、胆红素C、血色素、类风湿因子以及甘油三酯)对普莱晒谱星测定值产生的影响进行研究。在添加有一定量普莱晒谱星的健康人血清中，加入梯度性的浓度的各干扰物质，对普莱晒谱星浓度进行测定，以不添加干扰物质时的测定值为基准，评价各干扰物质对测定值的影响。
其结果是，无论在使用哪一种抗体的测定系统中，胆红素F、胆红素C、血色素以及类风湿因子造成的干扰都处于不会产生问题的水平。
另一方面，甘油三酯(TG)对使用一部分抗体的测定系统产生了影响。TG干扰试验以如下方式进行。检测体使用添加了一定量的普莱晒谱星的正常人血清。使用脂肪输液20％((费森尤斯(Fresenius))公司)，梯度式地制备稀释样本直至检测体中的TG浓度成为20mg/mL。该TG浓度不考虑检测体的血清中本来所含的TG。使用检测体稀释液将稀释样本稀释20倍，通过ELISA测定普莱晒谱星值。针对多个检测体来实施所述TG干扰试验。
其结果是，对于使用了F1466-12、F1466-19的抗体的测定系统而言，添加TG可对普莱晒谱星测定值产生影响，当检测体中的TG浓度为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度大于±20％的检测体的比率高。
另外，检测体中的TG浓度为20mg/mL时的普莱晒谱星测定值的解离度通过多个检测体来求出，针对各抗体计算所述解离度的平均值。其结果是，解离度的平均值显示为±20％以下的是使用S68抗体、F1466-5以及F1466-26的测定系统。
另一方面，在使用F1466-12、F1466-19以及F1466-16的抗体的测定系统中，结果是解离度的平均值大于±20％。
进而，在使用各兔单克隆抗体的分析系统与使用S68抗体的分析系统之间，对于由添加TG所导致的普莱晒谱星测定值的解离度进行对比。由此，在通过添加TG使检测体中的TG浓度为20mg/mL时，无论是使用F1466-12的测定系统的解离度与使用S68抗体的测定系统的解离度的差、还是使用F1466-19的测定系统的解离度与使用S68抗体的测定系统的解离度的差，显示出大于20％的差的检测体的比率都很高。
由此，暗示了TG干扰试验中抗体性能的差异可能会对前述相关分析的结果产生影响。
针对F1146-17-2也尝试进行了干扰物质的试验，但是，由于反应性低，未得到数据。
(实施例6)抗体的特异性表位分析
对在实施例2中制备的各兔单克隆抗体以及F1146-17-2(使用S68肽对大鼠免疫而获得的单克隆抗体)的表位进行分析。
合成8种含有在实施例1中作为给药抗原的序列号2的肽序列的部分片段、并且由10个氨基酸构成的肽(参见表13)，通过实施例4所述的夹心ELISA系统，通过观察与普莱晒谱星标准品的竞争抑制反应来研究表位序列。即，按照实施例4所示的方法，制备固定化各抗体的微孔板。接着，在微孔板中添加400pg/mL的普莱晒谱星标准品、以及表13所示的20μg/mL的合成肽(P01～P08)各25μL进行反应。作为阴性对照，使用不添加肽(记作PBS)、以及阴性对照用肽(记作NC：序列CGDKTTATDIKGKE(序列号34))。另外，作为阳性对照，使用S68肽。反应结束后，使用TMB使其显色。一旦合成肽与抗体进行反应，则普莱晒谱星标准品与抗体的结合就会受到抑制，因此，吸光度下降。以PBS的吸光度为100％，计算各肽的抑制率。
如表14所示，结果确认了仅识别P03的抗体、识别从P03至P04的抗体、识别从P04至P05的抗体。另外，表明了F1146-17-2是识别从P04至P05的抗体。其结果表明，获得了以P03的位置作为表位而识别的单克隆抗体。在实施例5中，TG干扰试验结果差、而且与使用S68抗体的测定系统的相关性差的F1466-12、F1466-19，与大鼠单克隆抗体(F1146-17-2)同样地识别从P04至P05，而不以P03为表位。其他抗体则以P03作为表位识别。由此，暗示了：抗体具有适于进行普莱晒谱星测定的性能、以及抗体与识别的表位的关联性。另外，普莱晒谱星具有高分子量sCD14的C端部显著缺失的氨基酸序列，推测所述氨基酸的长度存在变化。还考虑抗体的特异性差异可能会对与实施例5中使用S68抗体获得的测定值的相关性造成影响。
表13
表14
| F1466-5 | F1466-26 | F1466-16 | F1466-12 | F1466-19 | F1146-17-2 | |
| P01 | - | - | - | - | - | - |
| P02 | - | - | - | - | - | - |
| P03 | ++ | ++ | ++ | - | - | - |
| P04 | - | - | ++ | ++ | ++ | ++ |
| P05 | - | - | - | ++ | ++ | ++ |
| P06 | - | - | - | - | - | - |
| P07 | - | - | - | - | - | - |
| P08 | - | - | - | - | - | - |
| S68 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
残留反应性(％)
-：80％以上；+：50％以上且小于80％；++：小于50％
(实施例7)表位的详细分析
对于识别P03肽的兔单克隆抗体，对其与分别修改P03肽中每个氨基酸而成的肽的反应性进行探究。
在P03肽(对应于序列号1的氨基酸序列、并且对应于由序列号3的序列的第52位至第61位构成的氨基酸序列)中，对于从第53位至第61位的氨基酸，使用丙氨酸(当原氨基酸为丙氨酸时，使用甘氨酸)分别置换其中的每个氨基酸来制备肽(P031～P039肽)，按照实施例4所述，使用夹心ELISA系统对P031～P039肽与抗体的反应性进行了确认。
其结果是，在将P03肽中的序列号3的第59位的天冬氨酸(对应于序列号1的第8位)置换成丙氨酸时，其与抗体的结合活性消失。
即使将P03肽中的序列号3的第53位～第58位(对应于序列号1的第2位～第7位)、序列号3的第60位以及第61位(序列号1的第9位及第10位)的氨基酸置换成丙氨酸(或甘氨酸)，与抗体的结合活性也得以保持。
由上所述，确认了对于以P03肽作为表位而识别的抗体而言，也以下述肽作为表位而识别：在P03肽中将序列号3的第53位～第58位、第60位以及第61位的每个氨基酸分别置换成丙氨酸(或甘氨酸)而成的肽。
(实施例8)兔来源的抗普莱晒谱星单克隆抗体的变体的制备
基于实施例1所述的由兔获得的抗普莱晒谱星单克隆抗体的序列，制备变体。
8-(1)CDR序列分析
对实施例1中获得的5种抗普莱晒谱星抗体的CDR序列进行分析，推测各抗体的序列中存在对抗体的活性产生影响的序列、以及不会对活性产生影响的序列。其中，作为在实施例6中表明的以P03(序列号1)的序列作为表位而识别的抗体的之一的F1466-26，基于该F1466-26抗体的CDR序列，对各CDR序列的氨基酸进行改变，从而制备变体，并对变体的活性进行了评价。制备了约100个变体。对于氨基酸的改变而言，能够进行氨基酸的置换、插入或缺失、或者多个氨基酸序列的置换等。
另外，制备包含F1466-26抗体的重链全长与F1466-5抗体的轻链全长的变体，同样地进行评价。
8-(2)重链变体制备用质粒的制备
重链变体用质粒以下述方式来制备。仅示出了质粒pTK-5793，但是，其他质粒也使用同样的方法来构建。以在实施例2中获得的包含F1466-26的重链全长的重链瞬时表达用质粒(pTK-5605)为模板，使用一对引物(rabbit IgG(14-12)-e：3’侧引物以及Aor13HI-rabbit IgV2：5’侧引物)进行PCR。进而，以所得到的扩增片段为模板，使用一对引物(rabbit IgG(14-12)-e、Aor13HI-rabbit IgV2)进行PCR。将所得到的扩增片段克隆至质粒pT7-Blue，使用限制性内切酶Aor13HI制备包含目标序列的片段。另外，使用限制性内切酶Aor13HI将作为哺乳细胞中的瞬时表达用载体的pTK-4273(本公司制造)切断，制备载体片段，所述瞬时表达用载体pTK-4273具有EF-1α启动子以及CMV增强子，并且具有包含兔IgG中除H链可变区以外的部位的基因序列。将制备的包含目标序列的片段克隆至载体片段中，从而制备pTK-5793。
8-(3)轻链变体制备用质粒的制备
轻链变体用质粒以下述方式进行制备。示出了质粒pTK-5844，但是，其他质粒也使用同样的方法来构建。以实施例2中获得的含有F1466-26的轻链全长的轻链瞬时表达用质粒(pTK-5608)为模板，使用一对引物(pEF2ce-28：3’侧引物以及pEF2ce-49：5’侧引物)进行PCR。进而，以所得到的扩增片段为模板，使用一对引物(pEF2ce-28、pEF2ce-49)进行PCR。将所得到的扩增片段克隆至质粒pT7-Blue，使用限制性内切酶BamHI以及XbaI来制备包含目标序列的片段。另外，使用限制性内切酶BamHI、XbaI将作为哺乳细胞中的瞬时表达用载体的pTK-2433(本公司制造)切断，从而制备载体片段。将制备的包含目标序列的片段克隆至载体片段，制备pTK-5844。
引物的序列
rabbit IgG(14-12)-e：5’GGG GGT CCG GAG GTC GCC TGG TCA CGC CTG G 3’(序列号85)
Aor13HI-Rabbit IgV2：5’GGG TCC GGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3’(序列号86)
pEF2ce-28：5’TTC ATT CTC AAG CCT CAG AC3’(序列号87)
pEF2ce-49：5’TTT TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT 3’(序列号88)
8-(4)瞬时表达重组抗体的制备
下面，示出作为代表例的、使用重链变体制备用质粒pTK-5793进行的抗体的瞬时表达的方法。将实施例8-(2)中制备的重链变体制备用质粒(pTK-5793)与实施例8-(3)所述的轻链瞬时表达用质粒(pTK-5608)等量混合，使用转染试剂(FuGENE(注册商标)6，普洛麦格公司)转染COS-1细胞(ATCC：CRL-1650)。即，将Opti-MEM(注册商标)低血清培养基(Reduced Serum Medium)(美国生命技术公司制造)作为稀释液，制备转染试剂0.96μL/25μL以及质粒0.48μg/25μL，将它们混合并添加至培养基后，添加COS-1细胞，在37℃温度进行培养。72小时后，回收培养上清液。
同样地，各重链变体制备用质粒与轻链瞬时表达用质粒(pTK-5608)混合而使用。各轻链变体制备用质粒与重链瞬时表达用质粒(pTK-5605)混合而使用。包含F1466-26抗体的重链全长和F1466-5抗体的轻链全长的变体与包含pTK-5605和F1466-5的轻链全长的轻链瞬时表达用质粒混合而制备。
(实施例9)变体的评价(1)
对实施例8中的16种在COS-1细胞中进行表达而获得的变体(IgG抗体)进行纯化，对各抗体与普莱晒谱星的反应性、特异性、亲和性(KD值)进行评价。
9-(1)抗体的纯化
回收在8-(4)中获得的COS-1细胞的培养上清液，并使用0.22μm的滤膜(Sterivac，密里博公司)进行过滤。使用Prosep vA(密里博公司)对所得到的培养上清液进行纯化。对含有提纯物的溶出液进行浓缩，接着进行对D-PBS(pH7.4)的透析。蛋白质浓度是以IgG(伯乐(BioRaD)公司)作为标准品、通过劳里(Lowry)法来求出。通过SDS-PAGE对所得到的抗体进行分析，确认了约150kDa的单一谱带的重组抗体。
9-(2)瞬时表达rsCD14ST-Fc的制备
首先，以pTK356H(TB64)(WO2005/108429的实施例13所述的具有编码rsCD14的序列的质粒)为模板，通过一对引物(hCD14-a，hCD14-d)与Taq酶(宝生物工程株式会社)进行PCR反应。将所得到的扩增片段(包含信号序列的序列号3的人sCD14的第1位～第64位序列的下游具有凝血酶识别序列，两端具有限制性内切酶的酶切位点)进行TA克隆至pT7Blue载体(密里博公司)，并对序列进行确认，将其设为pTK-3047。接着，将通过限制性内切酶EcoRI和BamHI切断pTK-3047而获得的片段插入在预先通过EcoRI和BAmHI切断pTK-2233(哺乳细胞用表达质粒，其具有编码人源IgG1抗体重链Fc区的序列)而制备的载体片段中，将所得到的克隆体设为pTK-3053。
hCD14-a的序列
5′-GGGAATTCGCCGCCACCATGGAGCGCGCGTCCTGC-3′(序列号89)hCD14-d的序列
5′-GGGATCCACGCGGAACCAGAGCATACTGCCGCGGG-3′(序列号90)
将用于表达rsCD14ST-Fc的瞬时表达用质粒pTK-3053转染COS-1细胞(ATCC：CRL-1650)。即，将转染试剂2μL/mL与质粒4μg/mL进行混合，并将其添加至培养基中，然后，添加COS-1细胞，在37℃温度进行培养。72小时后，回收培养上清液，进而添加新的培养基。96小时后，回收培养上清液，混合2次的量后，使用0.22μm的滤膜(Sterivac，密里博公司)进行过滤。使用Prosep vA(密里博公司)对所得到的培养上清液进行纯化。对含有提纯物的溶出液进行浓缩，接着进行对D-PBS(pH7.4)的透析。蛋白浓度是以BSA(伯乐(BioRad)公司)作为标准品、使用劳里(Lowry)法求出的。通过SDS-PAGE对所得到的rsCD14ST-Fc进行分析，确认了分子量约75kDa的单一谱带。制备的rsCD14ST-Fc与抗普莱晒谱星抗体的结合活性通过抗原固定化于固相的ELISA来进行确认。
9-(3)夹心ELISA的构建
使用在9-(1)中纯化的变体来构建夹心ELISA。即，将各变体固定化于丹麦能肯(Nunc)公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)，并进行封闭。接着，添加普莱晒谱星标准品(0～300pg/mL)，使微孔板在25℃温度反应1小时，接着使用含0.05％吐温(Tween)20的生理盐水将微孔板洗涤5次。接着，在各孔中添加已稀释的F1106-13-3F(ab′)2-HRP溶液，在25℃温度反应2小时。同样地将板洗涤5次，然后，添加TMB溶液，在室温条件下反应20分钟。反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应。通过酶标仪对450/650nm处的吸光度进行测定。
9-(4)特异性的评价(1)
为了对在9-(1)中纯化的变体的特异性进行评价，使用固定有P03肽(在实施例6中制备，序列号1)的微孔板来实施ELISA。为了进行比较，也对F1466-26进行评价。
即，将BSA、或P03肽-BSA分别固定化于丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)，进行封闭。
根据在9-(1)中获得的蛋白浓度的结果，使用D-PBS进行稀释，制成500ng/mL浓度。在各孔中添加各稀释液50μL，使微孔板反应1小时，接着，使用含0.05％吐温(Tween)20的生理盐水将微孔板洗涤5次。接着，在各孔中添加已稀释的抗兔Igs-HRP(丹科(DAKO)公司，P448)溶液，在室温进行1小时的反应。同样地将微孔板洗涤后，添加TMB溶液，在室温条件下反应3-5分钟。反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应。使用酶标仪(分子仪器公司)对450/650nm处的吸光度进行测定。将结果与变体中改变的CDR序列一同示于表16～表22中。
其结果可知，变体的87％与P03肽结合，并暗示了其以P03的位置作为表位识别。即，暗示了在所得到的变体中，5795、5803、5811、5810、5784、5793、5858、5878、5875、5876、5844、5874以及5684以P03的位置作为表位识别。
9-(5)亲和性的评价
对变体与普莱晒谱星(使用在9-(2)中制备的rsCD14ST-Fc)、P03肽和S68肽的亲和性(KD)进行评价。另外，对S68抗体、来源于大鼠的单克隆抗体(F1146-17-2)以及F1146-26也同样地进行评价。
亲和性的测定使用BIACORE3000(GE医疗集团)进行。通过常规方法将rsCD14ST-Fc、P03-BSA以及S68-BSA分别在CM5芯片(GE医疗集团)上固定化，添加各抗体稀释系列(1.6-1000nM)，测定对各抗原的结合方式。绘制传感图，求出结合速度常数(Ka)以及解离速度常数(Kd)，计算平衡解离常数(KD)。
将S68抗体、来源于大鼠的单克隆抗体(F1146-17-2)以及F1146-26对rsCD14ST-Fc的亲和性(KD)的测定结果示于表15中。
其结果可知，以KD值计，与S68抗体(KD值为1.08E-08)相比，F1146-26(KD值为1.48E-09)对普莱晒谱星的亲和性高约10倍。另外，与来源于大鼠的单克隆抗体(F1146-17-2：KD值为1.08E-05)相比，F1146-26对普莱晒谱星的亲和性(KD值)高约10000倍。
将各变体对rsCD14ST-Fc的亲和性(KD)的测定结果、与改变的CDR序列一同示于表16～表22中。其结果可知，变体的80％具有与S68抗体同等以上的亲和性。由于对F1146-26的CDR序列进行改变，获得了相比于F1146-26，与普莱晒谱星的亲和性(KD值)升高约1000倍的变体(5810)。
本发明的一个优选方式是，抗体对普莱晒谱星的亲和性相比于S68抗体对普莱晒谱星的亲和性更优异，如果使用KD值进行比较，作为优选的抗体，例如，可举出F1466-26、变体5795、5803、5810、5784、5793、5858、5844、5684。另外，也优选抗体的KD值小于10-8的抗体，可举出F1466-26、5795、5803、5810、5784、5793、5858、5844、5684。另外，优选抗体的KD值是S68抗体的KD值的1/2以下、并且与普莱晒谱星的亲和性优异的抗体，可举出F1466-26、5795、5803、5810、5784、5793。显示出特别优异的KD值的抗体是5793(7.3E-10)和5810(6.52E-12)。
可知，组合了F1146-26的重链全长以及F1146-5的轻链全长的变体5684保持了P03特异性以及与普莱晒谱星的结合活性。暗示了由于F1146-26与F1146-5是以相同的P03的位置作为表位而识别的抗体，因而即使在具有相同特异性的抗体间置换序列，也能保持抗体的活性。
如实施例2所示，认为本抗体的特征之处是，以P03作为表位而识别的F1146-5和F1146-26的重链CDR3序列均为GDF，由3个氨基酸这类的较短的序列构成。
另外，在变体的5793中，通过改变重链CDR3的第3个氨基酸，观察到亲和性的上升，由此，暗示了重链CDR3的第3个氨基酸可能对抗体的活性产生影响。
表15
表16
改变区域 重链CDR1
表17
改变区域 重链CDR2
5810是在第2位的I和第3位的N之间插入A。
表18
改变区域 重链CDR3
表19
改变区域 轻链CDR1
表20
改变区域 轻链CDR2
表21
改变区域 轻链CDR3
5844是在第9位的N和第10位的Y之间插入A。
表22
改变区域 轻链全长
| 抗体 | VL | P03(OD) | rs CD 14ST-Fc(KD) |
| F1146-26 | - | 0.822 | 1.48E-09 |
| 5684 | - | 1.137 | 7.37E-09 |
9-(6)特异性的评价(2)肽竞争抑制反应
基于实施例6，基于从P01至P08的肽，对各变体与普莱晒谱星的反应进行竞争抑制反应试验。
试验使用变体固定化于固相的ELISA来进行实施。即，将变体固定化于丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)后，进行封闭。在每孔中添加普莱晒谱星标准品(300pg/mL)25μL。接着添加稀释的各肽(0.01-10μg/mL)25μL。将微孔板在25℃温度反应1小时，接着使用含0.05％吐温(Tween)20的生理盐水对板洗涤5次。接着，在各孔中添加50μL的已稀释的F1106-13-3F(ab′)2-HRP的溶液，在25℃温度反应2小时。同样地对板洗涤5次后，添加TMB溶液，使其在室温反应30-40分钟。反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应。通过酶标仪对450/650nm处的吸光度进行测定。作为阴性对照组，不添加肽(记作PBS)，作为阳性对照组，使用S68肽。以PBS的吸光度为100％，对各肽的抑制率进行计算。其结果是，如表23所示，确认了进行试验的全部变体都特异性地识别P03序列。
表23
| 5793 | 5795 | 5803 | 5810 | 5811 | 5858 | 5874 | |
| P01 | - | - | - | - | - | - | - |
| P02 | - | - | - | - | - | - | - |
| P03 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| P04 | - | - | - | - | - | - | - |
| P05 | - | - | - | - | - | - | - |
| P06 | - | - | - | - | - | - | - |
| P07 | - | - | - | - | - | - | - |
| P08 | - | - | - | - | - | - | - |
| S68 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
残留反应率(％)
-：80％以上；+：50％以上且小于80％；++：小于50％
(实施例10)变体的评价(2)
在实施例8中制备的变体中，针对在实施例9中未进行评价的变体，对变体与普莱晒谱星的结合活性以及特异性进行评价。
10-(1)通过ELISA对抗体浓度进行测定
为了确认在实施例8-(4)中获得的培养上清液中的IgG浓度，使用夹心ELISA对IgG浓度进行了测定。即，将抗兔抗体(丹科(DAKO)公司，Z196)固定化于丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)，然后进行封闭。将纯化的兔单克隆抗体作为标准品，使用稀释液(0.1％BSA/D-PBS)进行稀释，制备100-1.56ng/mL的标准液。接着，使用稀释液(0.1％BSA/D-PBS)对回收的培养上清液进行稀释。在孔中添加培养上清稀释液或标准品稀释系列，使微孔板反应1小时，接着使用含有0.05％吐温(Tween)20的生理盐水对微孔板洗涤5次。接着，在各孔中添加已稀释的抗兔Igs-HRP(丹科(DAKO)公司，P399)溶液，在室温进行1小时的反应。同样地对微孔板洗涤5次后，添加四甲基联苯胺溶液(TMB，BioFix)，在室温条件下反应10分钟。反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应，使用酶标仪(分子仪器公司)对450/650nm处的吸光度进行测定。各培养上清液中的抗体浓度使用标准品浓度稀释系列的校正曲线来进行计算。
10-(2)对普莱晒谱星的结合活性以及特异性的评价
为了对变体与普莱晒谱星的结合活性以及特异性进行评价，使用抗原固定于固相的微孔板来实施ELISA。
即，将BSA、rsCD14ST-Fc或P03肽-BSA分别固定化于丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)，然后进行封闭。
根据培养上清液的IgG浓度的结果，使用D-PBS稀释培养上清液，制成500ng/mL的浓度(抗体浓度低时，使用原倍培养上清液)。在每个孔中添加50μL的各上清稀释液，使微孔板进行1小时反应，接着，使用含有0.05％吐温(Tween)20的生理盐水对板洗涤5次。接着，将已稀释的抗兔Igs-HRP(丹科(DAKO)公司，P448)溶液添加至各孔中，在室温条件下反应1小时。同样地对板进行洗涤，然后，添加TMB溶液，在室温条件下反应3-5分钟。在反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应。通过酶标仪(分子仪器公司)对450/650nm处的吸光度进行测定。
在对与普莱晒谱星的结合活性进行评价时，为了进行比较，也对S68抗体进行评价。与普莱晒谱星的结合活性，是在将S68抗体与sCD14ST-Fc进行反应时的吸光度设为1时，使用各抗体与rsCD14ST-Fc进行反应时的吸光度的比来表示。将结果与各变体中改变的序列一同示于表24～表29中。
其结果确认了基本上全部的抗体都与P03结合，并暗示了76％的抗体以P03作为表位而识别。
另外，与S68抗体相比，F1466-26以及大多数变体具有更优异的与普莱晒谱星的结合活性，以吸光度比计高约4～5倍。如果与F1466-26对普莱晒谱星的KD值以及吸光度比进行对比，认为这些抗体对普莱晒谱星的KD值为与实施例9中测定的抗体对普莱晒谱星的优选的KD值相同的程度。
本发明的一个优选方式是：抗体对普莱晒谱星的结合活性比S68抗体对普莱晒谱星的结合活性更优异的抗体。例如，在基于本实施例使用吸光度的情况下，认为是显示出高于S68抗体的吸光度的抗体，优选显示出S68抗体的2倍以上的吸光度的抗体。
在所得到的抗体中，显示出S68抗体的5倍以上的吸光度、并且与普莱晒谱星的结合活性特别优异的抗体是5934、5935、5939、5944、5808、5809、5824、5979，5980、5983、5984、5987、5988、5860、5864、5863。其中，5979、5983、5988、5864显示出S68抗体的5.5倍以上的吸光度，并且对普莱晒谱星具有特别优异的结合活性。
表24
改变区域 重链CDR1
表25
改变区域 重链CDR2
表26
改变区域 重链CDR3
表27
改变区域 轻链CDR1
表28
改变区域 轻链CDR2
表29
改变区域 轻链CDR3
(实施例11)
以合成肽为抗原并使用噬菌体展示法制备单克隆抗体
能使用在实施例1-(1)中以S68肽-KLH作为给药抗原对兔进行免疫而回收的来自脾脏的淋巴细胞，通过噬菌体展示法来制备单克隆抗体。
11-(1)免疫F(ab)噬菌体抗体文库的构建
能按照CARLOS F.BARBASIII等著Phage Display a Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press)所述的方法来进行。使用总RNA提取试剂TRIZOLReagent(美国生命技术公司)，从实施例1-(1)回收的淋巴细胞中提取总RNA，通过“用于RT-PCR的III第一链合成系统”(Superscript III First-Strand SynthesisSystem For RT-PCR)(美国生命技术公司)来合成单链cDNA。使用BARBARSIII等报告的兔抗体基因特异性引物，由该cDNA来制备包含重链可变区的片段和包含轻链可变区的片段。以所得到的兔重链可变区以及人重链CH1的扩增片段为模板，通过PCR对兔/人嵌合重链片段进行扩增，以兔轻链可变区(Kappa型或Lambda型)以及人轻链恒定区的扩增片段为模板，对兔/人嵌合轻链片段进行扩增。所得到的所述兔/人嵌合重链以及兔/人嵌合轻链的片段为模板，最终制备兔/人嵌合Fab片段。接着，使用限制性内切酶SacI和SpeI对作为抗体表达用噬菌粒的pCDisplay-4(创新-生物基因公司(CREATIVE BIOGENE))进行切断，制备噬菌粒片段。同样地使用Sacl以及Spel对兔/人嵌合Fab片段进行切断，在制备的噬菌粒片段中插入cDNA片段，制备噬菌体文库表达用质粒。
11-(2)噬菌体展示技术用噬菌体溶液的制备
通过常规方法，使11-(1)制备的质粒转化大肠杆菌TG1株(安朗科技公司(AlientTechnologies))，将含有大肠杆菌的溶液接种于添加有氨苄青霉素的LB培养基的微孔板中。在37℃温度进行培养，然后回收形成的菌落，制备大肠杆菌文库。培养该文库中的一部分，在该大肠杆菌悬浮液中添加氨苄青霉素(Ampicillin)以及葡萄糖(Glucose)，在37℃温度震动培养1小时。然后，使辅助噬菌体M13KO7(美国生命技术公司)对其进行感染，进而继续震动培养1小时。通过离心来收集菌体，并丢弃培养液，然后悬浮于10mL的2×YT培养液中，在37℃温度进行震动培养。次日，对培养上清液进行离心，然后，将8mL的上清液转移至另一个离心管中，添加2mL的PEG/NaCl溶液并混合，在冰上静置1小时后，通过离心分离来回收沉淀的噬菌体，将其作为噬菌体展示用的噬菌体溶液。
11-(3)基于淘选法对目标抗体进行选择
通过淘选(panning)法，从11-(2)制备的噬菌体溶液中选择抗体。淘选通过两种方法来实施。作为第一种方法，基于BARBAS等记载的方法来实施。即，在丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)中，将S68-BSA固相化于微孔板后，对板进行封闭。在每孔中添加50μL的含4％脱脂乳和0.2％TritonX-100的D-PBS后，添加11-(2)获得的噬菌体溶液50μL。使微孔板进行1小时的反应，接着，使用含0.1％TritonX-100的D-PBS洗涤微孔板。接着，使用100mM的甘氨酸盐酸盐(Glycine-HCl)(pH2.2)进行10分钟溶出，并将回收的溶液使用1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH7.4)进行中和。将该溶出液与大肠杆菌TG1株进行混合，在37℃温度进行反应，将与S68肽抗原结合的噬菌体再次感染TG1株。在培养液中添加氨苄青霉素、M13K07辅助噬菌体，在37℃温度进行反应后，回收大肠杆菌，添加培养基以及卡那霉素并培养一夜。通过离心分离，由培养液回收上清液，通过PEG处理来制备噬菌体液。反复进行3次相同的操作，对与S68肽结合的特异性的噬菌体进行浓缩。
作为第二种方法，使用实施例12-(2)所述的方法同样地进行3次淘选，浓缩对普莱晒谱星特异性的噬菌体。
11-(4)抗体的结合活性的测定以及CDR序列的分析
将11-(3)中的使噬菌体感染的TG1培养液接种于含有氨苄青霉素的LB微孔板中，使菌落形成。由各菌落再次制备噬菌体溶液，使用EIA对反应性进行确认。即，将BSA、S68-BSA、P03-BSA以及sCD14ST-Fc分别固定化于丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)，然后进行封闭。添加含有4％脱脂乳、0.2％TritonX-100的D-PBS，然后添加回收的噬菌体液。使微孔板进行1小时反应，接着使用含0.05％吐温(Tween)20的生理盐水对板洗涤5次。接着，将已稀释的HRP/Anti-M13单克隆偶联物(GE医疗集团)溶液添加至各孔中，在室温进行1小时的反应。同样地对板洗涤5次，然后添加TMB溶液，在室温反应10-20分钟。反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应。使用酶标仪(Thermomax，Molecular Devices)对450/650nm处的吸光度进行测定。其结果确认了多个噬菌体结合。从这些菌落中分离出噬菌粒，并对序列进行确认。
通过噬菌体展示法，能获得与P03以及普莱晒谱星特异性结合的抗普莱晒谱星抗体，其具有与由杂交瘤法获得的CDR序列不同的序列。
(实施例12)使用噬菌体展示法制备重链CDR3序列的变体
由于预测了重链CDR3序列会对抗体的活性产生影响，因而使用噬菌体展示法，制备并评价重链CDR3序列的变体。
12-(1)使用噬菌体展示法制备VH链CDR3序列的变体
为了制备VH CDR3随机突变文库，以含有F1466-26的重链和轻链的质粒pTK-5956为模板，使用一对引物(p-nnk3-2s；5’磷酸化-GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACCCTG GTC ACC GTC T-3’：序列号91，p-nnk3-2a；5’磷酸化-GCC ACA AAA ATA AGT GGC CGTGTC CTC GGT TGT CGG ACT G-3’序列号92(N表示G、A、T、C中的任一个，K表示G或T))以及耐热性DNA聚合酶(宝生物工程株式会社)进行PCR反应，使所得到的扩增片段通过DNA连接酶进行自我结合。将其转化为大肠杆菌XL1-Blue(安捷伦科技)，在LB/氨苄青霉素(Amplicillin)/四环素(Tetracycline)琼脂板上进行培养，次日，使用2×YT培养液回收生成的菌落。在该大肠杆菌悬浮液中添加氨苄青霉素(Ampicillin)、四环素(Tetracycline)以及葡萄糖(Glucose)，在37℃温度进行1小时震动培养。然后，使辅助噬菌体M13KO7(美国生命技术公司)感染上述大肠杆菌，进而继续1小时的震动培养。通过离心分离收集菌体，丢弃培养液，然后悬浮于10mL的2×YT培养液中，在32℃温度进行震荡培养。次日，对培养上清液进行离心分离，然后，将8mL的上清液转移至另一离心管中，并加入2mL的PEG/NaCl溶液进行混合，在冰上静置1小时后，通过离心分离来回收沉淀的噬菌体，将其作为VH CDR3随机突变文库的噬菌体熔液。
12-(2)基于淘选法选择目标抗体
根据在12-(1)中制备的文库来实施淘选，选择抗体。即，使12-(1)获得的噬菌体液(2mL)与6μg的sCD14ST-Fc在37℃温度进行反应，2小时后，添加蛋白质A树脂(Prosep-vA、密里博公司)200μL，并进行20分钟的反应。使用含0.05％吐温(Tween)20的PBS洗涤5次，然后在树脂中添加溶出液(Tris-HCl，甘氨酸(pH2.2))并静置8分钟后，回收溶出的噬菌体液，中和溶液。将该回收液与大肠杆菌XL-1Blue培养液进行混合，在37℃温度进行反应。1小时后，添加L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、氨苄青霉素以及辅助噬菌体M13K07(英杰生命技术公司(Invitrogen))，在37℃温度进行反应。进而，1小时后，将培养基更换为2×YT培养基，培养一夜，回收与rsCD14ST-Fc特异性结合的噬菌体。反复进行3次上述操作，浓缩目标抗体。
12-(3)含有普莱晒谱星特异性序列的噬菌体的制备及CDR序列的确定
使在12-(2)中最终获得的噬菌体液再次感染XL-1Blue，将其培养上清液接种于2×YT的平板，从而制备菌落。将该菌落再次与XL-1Blue进行培养，添加辅助噬菌体，制备含有单一噬菌体的噬菌体溶液。接着，使用所得到的噬菌体液，通过ELISA对反应性进行确认。即，在丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)中，将sCD14ST-Fc固相化于微孔板后，进行封闭。使用含有4％脱脂乳、0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的D-PBS将噬菌体液稀释2倍，使微孔板中进行1小时反应。接着，使用含有0.05％吐温(Tween)20的生理盐水将微孔板洗涤5次，并在各孔中添加50μL的已稀释的HRP/Anti-M13单克隆偶联物(GE医疗集团)，在室温进行1小时反应。以同样的方式洗涤微孔板5次后，添加TMB溶液，在室温进行反应。在反应结束后，使用1M硫酸溶液停止反应，通过酶标仪(ThermoMax，分子仪器公司(Molecular Devices))对450/650nm处的吸光度进行测定。使结合活性已确认的噬菌体液感染大肠杆菌，通过常规方法来回收质粒，确认基因序列。
12-(4)IgG抗体的制备
从所得到的候选噬菌体回收噬菌粒，制备编码重链可变区的片段。按照实施例8所述的方法，制备重链变体制备用质粒，与含有F1466-26的轻链全长的轻链瞬时表达用质粒(pTK-5608)一同转染COS-1细胞。将COS-1细胞在37℃温度条件下进行培养，72小时后，回收培养上清液。
12-(5)重链CDR3序列的变体的评价
针对所得到的变体，与实施例10-(2)进行相同的试验，评价与普莱晒谱星(rsCD14ST-Fc)的结合活性以及P03特异性。将其结果与改变的重链CDR3的CDR序列一同示于表30中。
其结果是，对于重链CDR3的3个氨基酸均被置换的变体6027而言，与其他变体相比，对普莱晒谱星的反应性稍低，但是，与S68抗体相比则具有大致相同的反应性。对于变体6026、6028以及6029而言，虽然2个氨基酸被置换，但是，其对普莱晒谱星的反应性优异。由此，暗示了当重链CDR3由3个氨基酸构成时，即使2氨基酸被置换，也能保持抗体的活性。变体6028与普莱晒谱星的结合活性特别优异。
表30
改变区域 重链CDR3
(实施例13)甘油三酯(TG)干扰试验
在实施例5和实施例6中，暗示了：使用以P04-05作为表位来识别的抗体进行的普莱晒谱星的测定容易受到检测体中TG的干扰，但是，使用以P03作为表位来识别的抗体进行的普莱晒谱星的测定则很难受到TG的干扰。
13-(1)使用正常人血清进行TG干扰试验(1)
为了进一步进行确认，确认了正常人检测体中TG产生的影响。针对F1466-26(特异性：P03)、F1466-5(P03)以及F1466-19(P04-05)，使用正常人血清来实施TG干扰试验。
在正常人检测体(8检测体)(EDTA血浆，TENECEE BLOOD SERVICIES)中添加TG，使其最终浓度为10mg/mL，比较添加前后的普莱晒谱星测定值。此时的TG浓度不考虑检测体中本来所含的TG。使用各抗体分别固定化于固相的微孔板，使用实施例9-(3)所述的夹心ELISA系统进行评价。将结果示于图1中。
其结果是，对于以P03作为表位而识别的抗体即F1466-26和F1466-5而言，在添加TG前后，基本上没有观察到测定值的变动，相对于此，对于以P04-05作为表位而识别的抗体即F1466-19而言，测定值较大程度地受到了添加TG的影响。使用普莱晒谱星测定值较大程度地受到检测体中的TG的影响的抗体进行测定，如F1466-19所示，可以预测：本来显示出较低值的健康人的测定值会显示出较高的值。在此情况下，正常值与异常值的差异将会难以产生。因而认为这种抗体不适于对检测体中的普莱晒谱星进行测定。另一方面，确认了对于以P03作为表位识别的抗体而言，其很难受到检测体中的TG的影响，是适用于对检测体中的普莱晒谱星进行测定的抗体。
另外，使用该正常人血清进行的试验证实了，在使用以P03作为表位而识别的抗体的分析系统中，与高分子量sCD14的交叉反应不会产生问题。
在正常人血清中，普莱晒谱星为几百pg/mL，相对于此，高分子量sCD14为5.6～11.2μg/mL左右(WO2005/108429，实施例12)，如果该抗体与高分子量sCD14进行反应，则不能测定微量的普莱晒谱星。
根据本实施例，确认了在使用以P03作为表位而识别的抗体的分析系统中，不会产生抗体与高分子量sCD14的交叉反应，并且能进行几百pg/mL左右的微量的普莱晒谱星的测定(图1)。
13-(2)变体的TG干扰试验(2)
对于新得到的变体，与实施例5同样地实施TG干扰试验，确认了检测体中的TG的影响。对变体进行纯化而使用。
即，将变体固定化于丹麦能肯公司制的免疫检测微孔板(MAXISORP，C96，430341)后，进行封闭。使用稀释液对普莱晒谱星标准品进行稀释，制备普莱晒谱星的浓度系列(15.6-500pg/mL)。在3种人检测体中添加甘油三酯(脂肪乳，日本费森尤斯卡比公司(フレゼニウスカービジャパン))，制成最终浓度6.7mg/mL、13.3mg/mL、20mg/mL。人检测体使用败血症患者的血清1例、以及在正常人血清中添加了一定量的普莱晒谱星的检测体2例。另外，该TG浓度不考虑检测体中本来所含的TG。使用稀释液将检测体稀释20倍，将未添加TG的样品或添加了各浓度的TG的检测体、或者标准品稀释系列添加至各孔中。与实施例9-(3)同样地使用夹心ELISA系统进行测定。在表31中示出：检测体中TG浓度为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度为±20％以下的检测体的比率(％)。
其结果确认了，以P03作为表位而识别的抗体很难受到甘油三酯的影响。
表31
(实施例14)具有优选性能的变体的列表
将在本发明的实施例8和12中获得的、具有优选的性能的抗体的CDR序列示于图2～图2-2(序列号93～156)中。在实施例8和12中制备的抗体数目的总和为109个，优选的抗体数目为65个。
将抗体对普莱晒谱星的亲和性(KD值)小于10-8M的抗体评价为○、小于10-9M的抗体评价为◎。将KD值小于10-7M，但是，具有与S68抗体对普莱晒谱星的亲和性大致相同的亲和性的抗体评价为△。根据基于KD值进行的评价，与普莱晒谱星的结合活性特别优异的抗体是5793和5810。
对于抗体与普莱晒谱星的结合活性的评价而言，使用在将S68抗体与sCD14ST-Fc进行反应时的吸光度设为1时、各抗体与rsCD14ST-Fc进行反应时的吸光度的比来进行评价。对于抗体而言，吸光度比为4以上的抗体评价为○，吸光度比为5.5以上的抗体评价为◎。根据基于吸光度比进行的评价，与普莱晒谱星的结合活性特别优异的抗体是5864、5979、5983、5988以及6028。
Claims (22)
1.一种抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段，其特异性地识别由序列号1的氨基酸序列构成的表位，
所述抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段包括：
(i)重链可变区(VH)互补性決定区(CDR)1：X1X2X3MX4；
(ii)VH CDR2：IX5X6X7X8YAX9X10X11X12X13；和
(iii)VH CDR3：X14X15X16；以及，
(iv)轻链可变区(VL)CDR1：X17X18X19X20X21X22X23X24；
(v)VH CDR2：KX25X26X27X28X29S；和
(vi)VH CDR3：X30X31X32YX33X34X35X36X37；
X1～X37是下述作为选择项记载的1个或多个氨基酸序列；X1＝任意1个氨基酸，X2＝Y或F，X3＝T、A或W，X4＝G或S；
X5＝I或V，X6＝NSGA、YRNIK、ANSGA、SSDGG、SDIDQ或SDIDD，X7＝T、I或L，X8＝Y、V或F，X9＝S或T，X10＝W或A，X11＝A或G，X12＝K或A，X13＝G或A；
X14＝G、A、L或S，X15＝D、F、S、P、H、I、N、R、V、G或L，X16＝F、A、S、P、H、D、I、N、R、L、E或H；
X17＝Q或A，X18＝A或G，X19＝S或A，X20＝QS、ED或QN，X21＝I或A，X22＝GSN、ISN、GSD或SNY，X23＝L或A，X24＝A或S；
X25＝A或T，X26＝S或A，X27＝K或T，X28＝L或A，X29＝A或E；
X30＝Q或A，X31＝C或S，X32＝S或T，X33＝T或Y，X34＝AIGNY、ESTTF、AIGNAY或RSTTTY，X35＝G或A，X36＝H或N，X37＝V、A或T。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，
所述抗体或其抗原结合性抗体片段包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3是下述作为选择项记载的多个氨基酸序列，
(a)VH CDR1＝RYAMG、RYTMG、SFWMS、SYTMG、AYTMG、MYTMG、PYTMG、VYTMG、IYTMG、DYTMG、EYTMG、HYTMG、TYTMG、QYTMG、YYTMG、GYTMG、KYTMG、NYTMG或WYTMG；
(b)VH CDR2＝IIANSGATYYASWAKG、IINSGATYYASAAKG、IINSGATYYASWAAG、IINSGATYYASWAKA、IINSGATYYASWGKG、IIYRNIKTYYATWAKG、IINSGATYYASWAKG、IVSSDGGIYYASWAKG、IISDIDQIVYATWAKG或IISDIDDLFYASWAKG；和
(c)VH CDR3＝GDF、GGL、ADF、GDA、LDF、SDF、GFF、GSF、GPF、GHF、GIF、GNF、GRF、GDS、GDP、GDH、GDD、GDI、GDN、GDR、GVL、GGE或GLH；以及，
(d)VL CDR1＝QASEDIISNLA、QASQSIGSNLA、QASQSAGSNLA、QASQSISNYLA、QAAQSIGSNLA、QGSQSIGSNLA、QASQSIGSNAA、AASQSIGSNLA或QASQNIGSDLS；
(e)VL CDR2＝KASTLAS、KASKLAS、KTSTLES、KASKAAS或KAAKLAS；和
(f)VL CDR3＝QSSYTESTTFGHV、QCSYTAIGNYGHV、QSTYYRSTTTYGNT、QCSYTAIGNAYGHV、QCSYTAIGNYGHA、QCSYTAIGNYAHV或ACSYTAIGNYGHV。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，
所述抗体或其抗原结合性抗体片段包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3是下述1)～68)中的任意一种，
1)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号97、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
2)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号94、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
3)VH CDR1由序列号4、VH CDR2由序列号5、VH CDR3由序列号6、VL CDR1由序列号19、VLCDR2由序列号20、VL CDR3由序列号21的各氨基酸序列构成；
4)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VLCDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
5)VH CDR1由序列号10、VH CDR2由序列号11、VH CDR3由序列号12、VL CDR1由序列号25、VL CDR2由序列号26、VL CDR3由序列号27的各氨基酸序列构成；
6)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号93、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
7)VH CDR1由序列号95、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
8)VH CDR1由序列号96、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
9)VH CDR1由序列号98、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
10)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号99的各氨基酸序列构成；
11)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号100、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
12)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号101的各氨基酸序列构成；
13)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号102、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
14)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号103、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
15)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号122、VL CDR2由序列号121、VL CDR3由序列号101的各氨基酸序列构成；
16)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号104、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
17)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号105、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
18)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号106、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
19)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号107、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
20)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号108、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
21)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号109、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
22)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号110、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
23)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号111、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
24)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号112的各氨基酸序列构成；
25)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号113的各氨基酸序列构成；
26)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号114、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
27)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号115、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
28)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号116的各氨基酸序列构成；
29)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号117、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
30)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号118、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
31)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号119、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
32)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号120、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
33)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号121、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
34)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号122、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
35)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号123、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
36)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号124、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
37)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号125、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
38)VH CDR1由序列号126、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
39)VH CDR1由序列号127、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
40)VH CDR1由序列号128、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
41)VH CDR1由序列号129、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
42)VH CDR1由序列号130、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
43)VH CDR1由序列号131、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
44)VH CDR1由序列号132、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
45)VH CDR1由序列号133、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
46)VH CDR1由序列号134、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
47)VH CDR1由序列号135、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
48)VH CDR1由序列号136、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
49)VH CDR1由序列号137、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
50)VH CDR1由序列号138、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
51)VH CDR1由序列号139、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号9、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
52)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号140、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
53)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号141、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
54)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号142、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
55)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号143、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
56)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号144、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
57)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号145、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
58)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号146、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
59)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号147、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
60)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号148、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
61)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号149、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
62)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号150、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
63)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号151、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
64)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号152、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
65)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号153、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
66)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号154、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；
67)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号155、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成；或
68)VH CDR1由序列号7、VH CDR2由序列号8、VH CDR3由序列号156、VL CDR1由序列号22、VL CDR2由序列号23、VL CDR3由序列号24的各氨基酸序列构成。
4.一种抗普莱晒谱星抗体或其抗原结合性抗体片段，其包括：
(a)包含由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号97的氨基酸序列构成的VHCDR2和由序列号9的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH，以及包含由序列号22的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；
(b)包含由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号8的氨基酸序列构成的VHCDR2和由序列号94的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH，以及包含由序列号22的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；
(c)包含由序列号4的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号5的氨基酸序列构成的VHCDR2和由序列号6的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH，以及包含由序列号19的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号20的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号21的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；
(d)包含由序列号7的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号8的氨基酸序列构成的VHCDR2和由序列号9的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH，以及包含由序列号22的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号23的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号24的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL；或
(e)包含由序列号10的氨基酸序列构成的VH CDR1、由序列号11的氨基酸序列构成的VHCDR2和由序列号12的氨基酸序列构成的VH CDR3的VH，以及包含由序列号25的氨基酸序列构成的VL CDR1、由序列号26的氨基酸序列构成的VL CDR2和由序列号27的氨基酸序列构成的VL CDR3的VL。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，所述抗体或片段以小于10-8M的亲和性(KD)与普莱晒谱星结合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，为了抑制所述抗体或片段与普莱晒谱星的结合，在使由序列号1的序列构成的氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，所述抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗体结合性抗体片段，其中，为了抑制所述抗体或片段与普莱晒谱星的结合，在使氨基酸残基进行竞争反应的反应体系(吸光度)中，借助由序列号1的第8位天冬氨酸置换成丙氨酸而得的序列构成的氨基酸残基，所述抗体与普莱晒谱星的结合的竞争抑制率小于20％。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其是将序列号2所述的肽作为给药抗原而进行制备的。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，所述抗体不与高分子量可溶型CD14特异性地结合。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，使用所述抗体对多个检测体进行甘油三酯(TG)干渉试验时，检测体中的TG浓度为20mg/mL时，普莱晒谱星测定值的解离度显示为±20％以下的检测体的比率为50％以上。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，使用所述抗体而获得的检测体中的普莱晒谱星测定值与使用S68抗体而获得的检测体中的普莱晒谱星测定值的相关系数显示为0.9以上。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段，其中，所述抗原结合性抗体片段是选自由Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(二聚抗体)、二硫键稳定性V区(dsFv)、sc(Fv)2、包含CDR的多肽、包含重链可变区的多肽以及包含轻链可变区的多肽所组成的组中的抗原结合性抗体片段。
13.一种多核苷酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合性抗体片段。
14.一种重组载体，其含有权利要求13所述的多核苷酸。
15.一种转化体，其是将权利要求14所述的重组载体导入宿主细胞中而获得的。
16.如权利要求15所述的转化体，其中，所述宿主细胞为CHO细胞。
17.一种抗体或其抗原结合性抗体片段的制造方法，所述方法包括培养权利要求14或15所述的转化体。
18.一种普莱晒谱星测定用试剂盒，其至少包含所述权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段。
19.一种用于检测败血症的试剂盒或用于对败血症的检测或诊断进行辅助的试剂盒，其至少包含所述权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段。
20.一种普莱晒谱星的测定方法，其至少包括接触工序，所述接触工序使所述权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段与含普莱晒谱星的检测体进行接触。
21.一种败血症的检测方法或对败血症的检测或诊断进行辅助的方法，其至少包括以下工序：
1)测定工序，该测定工序使用所述权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合性抗体片段，对检测体中的普莱晒谱星浓度进行测定，以及，
2)判定工序，该判定工序将由1)得到的普莱晒谱星浓度与临界值进行比较，判定所述普莱晒谱星浓度是否高于所述临界值。
22.一种抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段的筛选方法，其至少包括下述工序：
1)获取工序，该获取工序获取候选的抗普莱晒谱星抗体或抗原结合性抗体片段；以及，
2)选择工序，该选择工序是为了抑制该抗体与普莱晒谱星的结合，在使由序列号1构成的氨基酸残基进行竞争反应的反应体系中，选择所述抗体与普莱晒谱星的结合的50％以上受到竞争抑制的所述抗体或抗原结合性抗体片段。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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