JPWO2015129774A1 - 新規抗プレセプシン抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
1.配列番号1のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
2.前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、
(i)重鎖可変領域(VH)相補性決定領域(CDR)1:X1X2X3MX4;
(ii)VH CDR2:IX5X6X7X8YAX9X10X11X12X13;及び
(iii)VH CDR3:X14X15X16;並びに
(iv)軽鎖可変領域(VL)CDR1:X17X18X19X20X21X22X23X24;
(v)VH CDR2:KX25X26X27X28X29S;及び
(vi)VH CDR3:X30X31X32YX33X34X35X36X37;を含み、
X1〜X37は、以下の表1〜表6に記載の1または複数個のアミノ酸配列である、上記1)に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
3.X1=R、S、A、M、P、V、I、D、E、H、T、Q、Y、G、K、N又はWである、前記2に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
4.前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は表7に記載のアミノ酸配列から選択され、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は表8に記載のアミノ酸配列から選択される、前記1ないし3のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
5.前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、表9−1、表9−2および表9−3に記載のアミノ酸配列から選択される、前記1ないし4のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
6.(a)配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号97のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;又は
(b)配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号8のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号94のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
7.(a)配列番号4のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号5のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号6のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号19のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号20のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号21のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(b)配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号8のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;または
(c)配列番号10のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号11のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号12のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号25のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号26のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号27のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
8.前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して10−8M未満の親和性(KD)で結合する、前記1ないし7のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
9.前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号1の配列からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される、前記1ないし8のいずれか1に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
10.前記反応系が、(a)前記抗体又は断片と、(b)F1106−13−3抗体又はF1031−8−3抗体とが用いられるサンドイッチELISAである、前記9に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
11.前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、配列番号35、36、37、38、39、40又は41のいずれかの配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止は20%未満である、前記1ないし10のいずれか1に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
12.前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、配列番号1の8位のアスパラギン酸をアラニンに置換した配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止が20%未満である、前記1ないし11のいずれか1に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
13.前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、配列番号1の2位から7位、9位及び10位のいずれかのアミノ酸をアラニン(又はグリシン)に置換した配列からなるアミノ酸残基により、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される、前記1ないし12のいずれか1に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
14.前記抗体が、固相に固定化された配列番号1の配列からなるアミノ酸残基との結合活性を有する、前記1ないし13のいずれか1に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
15.配列番号2に記載のペプチドを投与抗原として作製される、前記1ないし14のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
16.前記抗体は、高分子量可溶型CD14とは特異的には結合しない、前記1ないし15のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
17.前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド(TG)干渉試験を行うとき、検体中のTG濃度が20mg/mLのときのプレセプシン測定値の解離度が±20%以下を示す検体の比率が50%以上である、前記1ないし16のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
18.前記抗体を用いて、複数の検体についてTG干渉試験を行うとき、検体中のTG濃度が20mg/mLのときのプレセプシン測定値の解離度の平均が±20%以下である、前記1ないし17のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
19.前記抗体を用いて、複数の検体についてTG干渉試験を行うとき、検体が正常人ヒト血清であり、検体中のTG濃度が10mg/mLのときのプレセプシン測定値の解離度が±100%以下を示す検体の比率が50%以上である、前記1ないし18のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
20.前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、S68抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、0.9以上を示す、前記1ないし19のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
21.前記相関係数が、0.95以上である、前記20に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
22.前記抗体は、rsCD14ST−Fcに対して、1.08E−08未満の親和性(KD値)で結合する、前記1ないし21のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
23.前記抗体とプレセプシンとの結合活性が、ラット由来抗プレセプシン抗体(F1146−17−2)とプレセプシンとの結合活性と比較して、プレセプシン濃度比で10000倍以上の向上を示す、前記1ないし22のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
24.前記抗体と、固相に固定化したrsCD14ST−Fcとの結合活性(吸光度)が、S68抗体と、固相に固定化したrsCD14ST−Fcとの結合活性の2倍以上である、前記1ないし23のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
25.前記抗体または断片が、モノクローナル抗体である、前記1ないし24のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
26.前記抗原結合性抗体断片は、Fab、Fab´、F(ab´)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)、sc(Fv)2、CDRを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、前記1ないし25のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
27.前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
28.前記27に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
29.前記28に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
30.前記宿主細胞がCHO細胞である、前記29に記載の形質転換株。
31.前記29又は30に記載の形質転換株を培養することを含む、抗体またはその抗原結合性抗体断片の製造方法。
32.少なくとも前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を含む、プレセプシン測定用キット。
33.少なくとも前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または断片を含む、敗血症を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するためのキット。
34.前記プレセプシン測定用キットが、敗血症と全身性炎症反応症候群(systemic inflammatory response syndrome、SIRS)との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測(死亡率予測)、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation、DIC)の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患(クローン病、潰瘍性大腸炎)の検出、発熱性好中球減少症(febrile neutropenia、FN)の検出、血球貪食症候群(hemophagocytic syndrome、HPS)の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも1つの疾患の検出又は評価のためのキットである、前記32に記載のプレセプシン測定用キット。
35.プレセプシン測定用キットにおける、前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片の使用。
36.少なくとも前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプシンの測定方法。
37.少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するための方法であって、
1)前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
2) 1)で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、前記方法。
38.少なくとも以下の工程を含む、疾患の検出又は評価のための方法であって、該疾患の検出又は評価が、敗血症と全身性炎症反応症候群(systemic inflammatory response syndrome、SIRS)との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測(死亡率予測)、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation、DIC)の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患(クローン病、潰瘍性大腸炎)の検出、発熱性好中球減少症(febrile neutropenia、FN)の検出、血球貪食症候群(hemophagocytic syndrome、HPS)の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも1つであり、
1)前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
2) 1)で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、前記方法。
39.少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
1)候補の抗体または抗原結合性抗体断片を用いてプレセプシン測定系を構築する工程
2)該測定系を用いて、検体中のTG濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する工程をを含む、前記方法。
40.少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
1)候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
2)当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号1からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
41.少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
1)候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
2)プレセプシンにおける配列番号1のアミノ酸配列をエピトープとして特異的に認識する前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
42.前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて被験者の検体中のプレセプシン濃度を測定することにより、敗血症の検出、又は、検出若しくは診断の補助がなされた患者に対して敗血症治療が施される、敗血症の治療方法。
43.前記1ないし26のいずれか1に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、被検薬が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程を含む、被検薬のスクリーニング方法。
44.配列番号3(ヒト全長可溶型CD14)の1位から64位の配列と、抗体の重鎖Fc領域を含む、rsCD14ST−Fc。
45.配列番号3(ヒト全長可溶型CD14)の1位から64位の配列と、抗体の重鎖Fc領域の間に、切断を容易にする配列が挿入された、前記44に記載のrsCD14ST−Fc。
46.前記切断を容易にする配列が、トロンビン認識配列である、前記45に記載のrsCD14ST−Fc。
47.前記抗体の重鎖Fc領域が、ヒト由来IgG1抗体重鎖のFc領域である、前記44ないし46のいずれか1に記載のrsCD14ST−Fc。
48.配列番号3(ヒト全長可溶型CD14)の1位から64位の配列と、抗体の重鎖Fc領域の配列を含むベクターを、宿主細胞へ導入し、その宿主細胞を培養する工程を含む、rsCD14ST−Fcの製造方法。
49.前記48に記載のrsCDST−FcのFc領域を切断する工程を含む、rsCD14−STの製造方法。
本発明の第一の態様は、プレセプシン上の新規なエピトープである、配列番号1のアミノ酸配列を特異的に認識する、抗プレセプシン抗体またはその抗原結合性抗体断片である。
プレセプシン(sCD14−ST)は、CD14の可溶型の断片であって、以下の1)〜3)の性質を有する物質をいう。
・ 非還元条件下SDS−PAGEでは、分子量13±2kDa、
・ N末端配列に配列番号3の1位〜11位のアミノ酸配列を有する、及び、
・ 配列番号2に記載の16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
すなわち、本発明において、プレセプシンとは、特に説明しない限り、ヒトプレセプシンである。
解離度(%)={(干渉物質添加後のプレセプシン測定値)−(干渉物質無添加のプレセプシン測定値)}/(干渉物質無添加のプレセプシン測定値)×100
これらは、抗プレセプシン抗体である。以下の(a)(b)(c)の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、プレセプシ上の、配列番号1のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識するため、第一の態様における好ましい例である。より好ましくは、(a)又は(b)の抗体又はその抗原結合性抗体断片である。
(a) 配列番号4のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号5のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号6のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号19のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号20のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号21のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVLを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
(b) 配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号8のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVLを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
(c) 配列番号10のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号11のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号12のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号25のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号26のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号27のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVLを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
(i)配列番号4の配列からなるVH CDR1、配列番号5の配列からなるVH CDR2、及び配列番号6の配列からなるVH CDR3を含むポリペプチド。
(ii)配列番号7の配列からなるVH CDR1、配列番号8の配列からなるVH CDR2、及び配列番号9の配列からなるVH CDR3を含むポリペプチド。
(iii)配列番号10の配列からなるVH CDR1、配列番号11の配列からなるVH CDR2、及び配列番号12の配列からなるVH CDR3を含むポリペプチド。
(iv)配列番号19の配列からなるVL CDR1、配列番号20の配列からなるVL CDR2、及び配列番号21の配列からなるVL CDR3を含むポリペプチド。
(v)配列番号22の配列からなるVL CDR1、配列番号23の配列からなるVL CDR2、及び配列番号24の配列からなるVL CDR3を含むポリペプチド。
(vi)配列番号25の配列からなるVL CDR1、配列番号26の配列からなるVL CDR2、及び配列番号27の配列からなるVL CDR3を含むポリペプチド。
また、本発明は、図2〜図2−2に記載の配列からなるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3を含むポリペプチドを提供する。
より好ましくは、配列番号7の配列からなるVH CDR1、配列番号8の配列からなるVH CDR2及び配列番号94の配列からなるVH CDR3を含むポリペプチド(5793)、又は、配列番号7の配列からなるVH CDR1、配列番号97の配列からなるVH CDR2及び配列番号9の配列からなるVH CDR3を含むポリペプチドである(5810)。
(i)配列番号4の配列からなるCDR1、配列番号5の配列からなるCDR2、配列番号6の配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域(VH)。
(ii)配列番号7の配列からなるCDR1、配列番号8の配列からなるCDR2、配列番号9の配列からなるCDR3を含むVH。
(iii)配列番号10の配列からなるCDR1、配列番号11の配列からなるCDR2、配列番号12の配列からなるCDR3を含むVH。
(iv)配列番号19の配列からなるCDR1、配列番号20の配列からなるCDR2、配列番号21の配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)。
(v)配列番号22の配列からなるCDR1、配列番号23の配列からなるCDR2、配列番号24の配列からなるCDR3を含むVL。
(vi)配列番号25の配列からなるCDR1、配列番号26の配列からなるCDR2、配列番号27の配列からなるCDR3を含むVL。
また、本発明は、図2〜図2−2に記載の配列からなるVL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。
(1)(i)図2〜図2−2に記載の改変体の重鎖CDR配列(例えば、抗体5810のVH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3)並びに、配列番号64、配列番号67、配列番号70、及び配列番号73の配列を含むFRを有する重鎖可変領域;
(ii)図2〜図2−2に記載の改変体の軽鎖CDR配列(例えば、抗体5810のVL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3)並びに、配列番号74、配列番号77、配列番号80、及び配列番号84の配列を含むFRを有する軽鎖可変領域。
(2)(i)F1466−5、F1466−26、又はF1466−16の重鎖CDR配列(例えば、F1466−26のVH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3)、並びに、配列番号64、配列番号67、配列番号70、及び配列番号73の配列を含むFRを有する重鎖可変領域;
(ii)F1466−5、F1466−26、又はF1466−16の軽鎖CDR配列(例えば、F1466−26のVL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3)、並びに、配列番号74、配列番号77、配列番号80、及び配列番号84の配列を含むFRを有する軽鎖可変領域。
(3)(i)図2〜図2−2に記載の改変体の重鎖CDR配列(例えば、抗体5810のVH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3)並びに、配列番号65(又は66)、配列番号68(又は69)、配列番号71(又は72)、及び配列番号73を含むFRを有する重鎖可変領域;
(ii)図2〜図2−2に記載の改変体の軽鎖CDR配列(例えば、抗体5810のVL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3)並びに、配列番号75(又は76)、配列番号78(又は79)、配列番号81(又は82又は83)、及び配列番号84を含むFRを有する軽鎖可変領域。
(4)(i)F1466−5、F1466−26、又はF1466−16の重鎖CDR配列(例えば、F1466−26のVH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3)、並びに、配列番号65(又は66)、配列番号68(又は69)、配列番号71(又は72)、及び配列番号73を含むFRを有する重鎖可変領域;
(ii)F1466−5、F1466−26、又はF1466−16の軽鎖CDR配列(例えば、F1466−26のVL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3)、並びに、配列番号75(又は76)、配列番号78(又は79)、配列番号81(又は82又は83)、及び配列番号84を含むFRを有する軽鎖可変領域。
本発明の第二の態様は、少なくとも本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片を用いて、プレセプシンを免疫学的に測定する方法であり、少なくとも本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片とプレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む。本発明において「測定」の語は、「検出」「定量」「アッセイ」等の語と相互に変換して用いることができ、定量的及び定性的な決定を含む意味で用いられる。プレセプシンの測定は、好ましくは、in vitroで行う。
例えば、検体中の抗原とビオチンを結合させた抗体を液相で反応させ、ストレプトアビジンを結合させた磁性粒子へ抗体をトラップし、洗浄(B/F分離)後、酵素標識抗体を反応させ、上記同様の処理を行ってもよい。
プレセプシン測定に用いられる検体は、特に限定されないが、水性の検体が好ましく、例えば、血液(全血、血漿、血清等)、尿、組織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、腹水、用水、精液などの体液、また、鼻腔、気管支、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨などを洗浄した後の洗浄液、あるいは、細胞培養上清、またはカラム溶出液等が挙げられる。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液等で希釈あるいは抽出後濃縮され、測定に用いられる。
本発明の第三の態様は、第一の態様の抗体またはその抗原結合性抗体断片を必須の構成要素するプレセプシン測定用キットである。
一次抗体は、好ましくは、プレセプシンに結合する抗体であり、より好ましくは、本発明の抗体と異なるエピトープを認識する抗体が好ましい。例えば、WO2004/044005の実施例3に記載のF1106−13−3抗体やF1031−8−3抗体などが挙げられる。
本発明の第四の態様として、本発明の第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは核酸が提供される。該ポリヌクレオチドには、DNA(ゲノムDNA、cDNA、合成DNA等)及びRNA(mRNA等)が含まれる。 ポリヌクレオチドは、一本鎖(コードもしくはアンチセンス)または二本鎖であってもよい。例えば、市販のキットを用いて、本発明の抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、cDNAを合成することができる。PCR法等により目的とする遺伝子を増幅してもよい。
また、ある実施態様では、本発明の抗体は、可変領域の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる抗体も包含される。
第五の態様は、本発明の抗体又は抗体結合性抗体断片のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを導入したベクターである。ベクターは、好ましくは、第一の態様に記載した抗体遺伝子の発現に適合するベクター及び/または発現ベクターであり、当業者が用いうる技術を用いて作製することができる。
本発明の第六の態様として、本発明の第一の抗体又はその抗原結合性抗体断片を産生する細胞が提供される。このような細胞の例としては、ハイブリドーマ、形質転換株、または、本発明の抗体の遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞等がある。
本発明の第七の態様は、第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片をコードするヌクレオチドが導入されたベクターを含む形質転換株を培養する工程を含む、抗体又は抗原結合性抗体断片の製造方法である。
本発明の第八の態様は、少なくとも下記の工程を含む、検体中のプレセプシン測定に有用な抗プレセプシン抗体を得るための、抗体のスクリーニング方法である。
・ 候補の抗体を用いてプレセプシン測定系を構築する工程、
・ 該測定系を用いて、検体中のTG濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する工程
すなわち、この方法は、抗体を用いた測定系でTGの干渉試験を行うことを特徴としている。候補の抗体(好ましくは、抗プレセプシン抗体)を得る方法は、本発明の第一の態様あるいは第七の態様に記載のとおりである。プレセプシン測定系は、検体のプレセプシン値を測定する測定系であればよく特に限定されないが、例えば、第二の態様に記載した測定系が挙げられ、例えば、サンドイッチELISA等を用いうる。
1)候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および
2)当該候補の抗体を用いてプレセプシン測定系を構築し、TG添加により検体中のTG濃度を20mg/mLとしたとき、プレセプシン測定値の解離度が±20%以下を示す検体比率が50%以上である前記抗体を選択する工程。
1)候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および
2)当該抗体が、プレセプシンの配列のうち、配列番号1のアミノ酸配列をエピトープとして特異的に認識する前記抗体を選択する工程。
例えば、2)は、以下の工程であってもよい。
2)当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号1からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される前記抗体を選択する工程。
上記エピトープの決定方法は、任意で以下の3)の工程を加えてもよい。
3)当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、配列番号35、36、37、38、39、40、41の配列からなるアミノ酸残基の少なくとも1つによる、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止は20%未満である前記抗体を選択する工程。
1)候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および、
2)当該候補の抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、S68抗体を用いて得られた同検体中のプレセプシン測定値との相関係数が0.9以上を示す前記抗体を選択する工程。
1)候補の抗プレセプシン抗体を得る、および
2)プレセプシンに対して、10−8M未満の親和性(平衡解離定数、KD値)で結合する抗体を選択する工程。
前記 2)の工程は、以下の工程に置き換えられてもよい。
2)該抗体のプレセプシンに対する結合活性が、S68抗体のプレセプシンに対する結合活性と比較して優れる抗体を選択する工程。
少なくとも以下の工程を含む、抗プレセプシン抗体のスクリーニング方法であって、
1)候補の抗プレセプシン抗体を得る工程
2)当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号1からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される前記抗体を選択する工程、および、
3)該抗体のプレセプシンに対する結合活性が、S68抗体のプレセプシンに対する結合活性と比較して優れる抗体を選択する工程。
本発明の第九の態様は、本発明の第一の態様の抗体又は抗原結合性抗体断片を用いて、敗血症の検出を補助するための方法が施行された被験者に対して、敗血症治療を行う、敗血症患者の治療方法である。
本発明の第十の態様は、本発明の第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片、あるいは、第三の態様のキットを用いて、被験薬(又は治療薬)が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程を含む、被験薬(又は治療薬)のスクリーニング方法である。被験薬が対象とする疾患は、被験者の検体中のプレセプシン濃度が上昇する疾患であれば特に限定されない。好ましくは、被験薬の投薬前と投与後で被験者の検体中のプレセプシン濃度を比較して、被験薬投与後のプレセプシン濃度が投与前と比較して低下するか否かを決定する。あるいは、被験薬投与後の被験者の検体中のプレセプシン濃度が正常人レベルまで低下するか否かを決定してもよい。
1)被検薬が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程
rsCD14ST−Fcは、配列番号3(ヒト全長可溶型CD14)の1位から64位の配列と抗体重鎖のFc領域を含む構造を有する。
rsCD14ST−Fcの作製は、例えば、実施例9−(2)に記載するように、ヒトsCD14の1位から64位の配列の下流にトロンビン認識配列を有する配列、及び、ヒト由来IgG1抗体重鎖のFc領域の配列を有する、rsCD14ST−Fcを発現する一過性発現用プラスミドを、COS−1細胞のような宿主細胞にトランスフェクションし、その宿主細胞を培養し、得られた培養上清を回収して精製することにより得ることができる。
1−(1)ウサギの免疫
WO2004/044005の実施例1に記載の方法に従い、投与抗原の作製、ウサギの免疫を行った。すなわち、配列番号2に記載の配列(配列番号3に記載の53位から68位の配列に該当)からなるペプチド(以下、S68ペプチドと記載)のN末端にシステインを挿入したペプチドを作製した。このペプチドにKLH(PIERCE)を結合し、投与抗原とした(以下、S68ペプチド−KLHと記載)。
米国特許第7429487号に記載の方法に従って、2×108cellsのリンパ球とウサギ由来不死化Bリンパ球融合パートナーの1×108cellsとを混合し、2回に分けて細胞融合を実施した。融合した細胞を96穴プレートに播種し、常法に従って培養した。
選択したクローンから得られる各抗体とプレセプシンとの結合様式を確認するため、BIACORE3000(GEヘルスケア)を用いて解析を行った。CM5チップ(GEヘルスケア)にF1106−13−3抗体を定法により固定化し、そこにプレセプシン標準品(1μg/ml)を添加した。さらに希釈した培養上清(0.5μg/ml)を添加し、センサーグラムをプロットした。どのクローンも解離相での解離が認められない良好な結合様式を示した。
作製したウサギ抗プレセプシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを用いてウサギモノクローナル抗体を調製した。すなわち、定法に従い凍結アンプルを解凍し、10%牛胎児血清、8%サプリメントA(Abcam)を含むRPMI1640(Sigma)で培養後、細胞を回収しCELLine(Integra Bioscience)のプロトコールに従いIS−MAB-CD培地(Irvine)で培養し抗体を含む培養上清を回収した。次に得られた培養上清からrmp−Protein A Sepharose FF(GEヘルスケア)を用いて抗体を精製した。精製抗体を含む溶出液を濃縮し、続けてD−PBS(pH7.4)に対して透析した。抗体のタンパク濃度は牛IgG(BioRad)を標準品としてBradford法で求めた。得られた抗体をSDS−PAGEで分析したところ、分子量約150kDaの単一バンドが確認され、また還元することで約50kDaの重鎖と約25kDaの軽鎖が確認された。
2−(1)ウサギモノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列の決定と発現用プラスミドの構築
実施例1で得られた、各ハイブリドーマから、RNeasy Mini Kit(キアゲン)を用いてトータルRNAを抽出し、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)にて一本鎖cDNAを合成した。得られた一本鎖cDNAを鋳型としたRabbit Ig−Primer Set(Rader C, et al. JBC 2000;275:13668−76、および Lang I, et al.Gene 1996;172:295−8)によるPCRで可変領域を増幅し、常法に従い、重鎖および軽鎖の各可変領域の塩基配列を決定した。
前記2−(1)で作成した一過性発現用プラスミド(重鎖配列を含む発現プラスミドと軽鎖配列を含む発現プラスミド)を等量混合しCOS―1細胞(ATCC:CRL−1650)に、トランスフェクションした。すなわち、トランスフェクション試薬2μL/mL及びプラスミド4μg/mLを混合し、培地に添加した後、COS―1細胞に添加し37℃で培養した。72時間後、培養上清を回収し、さらに新しい培地を添加した。96時間後、培養上清を回収し2回分を混合後、0.22μmのフィルター(Sterivac、ミリポア)でろ過した。得られた培養上清は、前記1−(4)に記載の方法に従って精製し、SDS−PAGEで分析したところ、約150kDaの単一バンドの組換え抗体が確認された。
前記2−(2)で作成した一過性発現用プラスミドから制限酵素を用いて重鎖をコードする遺伝子断片と軽鎖をコードする遺伝子断片を切り出し、EF−1αプロモーター、およびマウスDHFR発現ユニット〔プロモーターとしてSV40プロモーター(エンハンサー領域は含まない)、SV40由来polyAシグナル〕を有するプラスミド(pTK-2577;特開2007−215546に記載)に組み込み、哺乳動物細胞での安定発現用プラスミドを作製した。
3−(1)ウサギモノクローナル抗体の遺伝子組換え抗体産生CHO細胞の調製
DHFR遺伝子欠損CHO細胞(CHO DXB11)に、前記2−(3)で構築した安定発現用プラスミドをトランスフェクションし、ウサギ抗体産生形質転換CHO株を樹立した。即ち、HT media Supplement (50×) Hybri−Max(Sigma;終濃度1×で使用)及び200mM L−Glutamine(Sigma;終濃度4mMで使用)を含むEX−CELL 302 PF CHO(JRH Bioscience)にて馴化培養したCHO DXB11をトランスフェクション当日に遠心後、8×106cells/150cm2 Rouxの濃度でフラスコに植え込んだ。FuGENE6(プロメガ)125μlを用いて、発現プラスミド12.5μgをFuGENE6添付プロトコールに準じ調製し、先のCHO DXB11へ導入した。5%CO2で37℃、2日間培養した後に、細胞を回収し、HT不含4mM L−Glutamine含有EX−CELL 302 PF CHO培地(以下EX−CELL(HT−)と記載)で二度洗浄し、EX−CELL(HT−)に再度懸濁した。次に12,500〜50,000cells/wellで96well−plateに細胞を蒔き直し、5%CO2、37℃で培養を続け、3日あるいは4日毎に培地の半量を新しいEX−CELL(HT−)に交換した。約2週間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細胞を新しいプレートに移した。
3−(1)で得られた組換え抗体発現形質転換CHO株を、Methotrexate(以下MTXと表記)を含むEX−CELL(HT−)培地で選択培養することにより、遺伝子増幅作業を行い目的の組換え抗体の生産量が上昇しているクローンの選択を行った。 即ち、実施例3−(1)で得られた形質転換株を30nM MTX含有EX−CELL(HT−)培地に懸濁し、96well−plateに巻き込んだ。3日あるいは4日毎に培地の半量を新しい30nM MTX含有EX−CELL(HT−)に交換し、コロニーが生じるまで5%CO2、37℃で培養を続けた。得られたコロニーの培養上清中へのIgG濃度をEIA法で確認し、生産量の増加しているクローンを選択した。その結果、生産量が約2ないし10倍上昇した形質転換株を得ることができた。尚、この遺伝子増幅した形質転換株を、MTX濃度を3ないし10倍上げた培地で選択培養を繰り返すことにより、さらに生産量が増加するクローンを得ることができる。
3−(2)で得られたクローンを30nM MTX含有CHO−SFM(HT−)培地(GIBCO)に1×105cells/mlで植え込み、37℃で7日間培養した。得られた培養上清を以下の精製に用いた。培養上清を、プロテインAカラム(Prosep−A、ミリポア)を用いて抗体を精製した。精製した組換え抗体をSDS−PAGEで分析したところハイブリドーマ由来の抗体と同等の分子量を示す抗体が確認された。
実施例2で調製したウサギモノクローナル抗体5種、WO2004/044005の実施例1に記載のS68抗体(S68ペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体)及びWO2004/044005の実施例2に記載のF1146−17−2(S68ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体)について、プレセプシンとの反応性評価を行った。
すなわち、各抗体を、PBS(pH7.4)で5μg/mLに希釈し、イムノプレート(Maxisorb、NUNC)の各ウエルに50μL添加した。4℃で一夜反応後、イオン交換水で5回洗浄し、0.1%StabilGuard(SurModics,Inc)と0.1%Tween20(和光純薬)を含むPBSを各ウエルに200μL添加しブロッキングした。次に、プレセプシン標準品を希釈液で1000ng/mLに希釈し、続けて3倍公比により希釈し、標準品の希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当たり50μL添加し、25℃で1時間反応した。反応終了後、0.05%Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄し、0.25μg/mLに希釈したペルオキシダーゼ標識F1106−13−3抗体を各ウエルに50μL添加した。25℃で2時間反応後、同様に5回洗浄し、TMB溶液を各ウエルに添加した。室温で20分間反応後、0.5M硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計(Molecular Devices)で450nm(副波長650nm)の吸光度を測定した。
実施例2で作製した各抗体を用いて、実施例4に記載のサンドイッチELISA系により、敗血症患者検体30例の血中プレセプシン値の測定を行い、S68抗体を用いたサンドイッチELISA系による測定値との相関分析を行った。
実施例2で作製した各ウサギモノクローナル抗体及びF1146−17−2(S68ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体)のエピトープの解析を行った。
P03ペプチドを認識するウサギモノクローナル抗体について、P03ペプチドを1アミノ酸ずつ改変したペプチドとの反応性を検討した。
P03ペプチド(配列番号1のアミノ酸配列、かつ、配列番号3の配列の52位から61位からなるアミノ酸配列に該当)において、53位から61位のアミノ酸を、1アミノ酸ずつ、アラニン(元のアミノ酸がアラニンの場合にはグリシン)で置換したペプチド(P031〜P039ペプチド)を作製し、P031〜P039ペプチドと抗体の反応性を、実施例4の記載に従い、サンドイッチELISA系により確認した。
実施例1に記載のウサギから得られた抗プレセプシンモノクローナル抗体の配列をもとに改変体を作製した。
実施例1で得た抗プレセプシン抗体5種類のCDR配列を解析したところ、各抗体の配列には、抗体の活性に影響する配列と、影響しない配列があることが推測された。そこで、実施例6でP03(配列番号1)の配列をエピトープとして認識していることが明らかとなった抗体のひとつであるF1466−26抗体のCDR配列を基本に、各CDR配列のアミノ酸の改変を行って改変体を調製し、改変体の活性を評価した。約100個の改変体を作製した。アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失、あるいは、数個のアミノ酸配列の置換等を行った。
重鎖改変体用プラスミドを以下のように調製した。プラスミドpTK−5793について示すが、他のプラスミドも同様の方法で構築した。実施例2で得られたF1466−26の重鎖全長を含む重鎖一過性発現用プラスミド(pTK−5605)を鋳型とし、プライマー対(rabbit IgG(14−12)−e:3‘側プライマーおよびAor13HI−rabbit IgV2:5’側プライマー)でPCRを行った。さらに得られた増幅断片を鋳型にしてプライマー対(rabbit IgG(14−12)−e、Aor13HI−rabbit IgV2)でPCRを行った。得られた増幅断片をプラスミドpT7−Blueへクローニングし、制限酵素Aor13HIで目的の配列を含む断片を調製した。また、EF−1αプロモーター及びCMVエンハンサーを有し、ウサギIgGのH鎖可変領域以外の部位を含む遺伝子配列を有する、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであるpTK−4273(自社)を制限酵素Aor13HIで切断し、ベクター断片を調製した。調製した目的の配列を含む断片をベクター断片にクローニングし、pTK−5793を調製した。
軽鎖改変体用プラスミドを以下のように調製した。プラスミドpTK−5844について示すが、他のプラスミドも同様の方法で構築した。実施例2で得られたF1466−26の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミド(pTK−5608)を鋳型とし、プライマー対(pEF2ce−28:3‘側プライマーおよびpEF2ce−49:5’側プライマー)でPCRを行った。さらに得られた増幅断片を鋳型にしてプライマー対(pEF2ce−28、pEF2ce−49)でPCRを行った。得られた増幅断片をプラスミドpT7−Blueへクローニングし、制限酵素BamHIおよびXbaIで目的の配列を含む断片を調製した。また、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであるpTK−2433(自社)を制限酵素BamHIおよびXbaIで切断し、ベクター断片を調製した。調製した目的の配列を含む断片をベクター断片にクローニングし、pTK−5844を調製した。
rabbit IgG(14−12)−e : 5’GGG GGT CCG GAG GTC GCC TGG TCA CGC CTG G 3’(配列番号85)
Aor13HI−Rabbit IgV2 : 5’GGG TCC GGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3’ (配列番号86)
pEF2ce−28 : 5’ TTC ATT CTC AAG CCT CAG AC 3’ (配列番号87)
pEF2ce−49 : 5’ TTT TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT 3’ (配列番号88)
以下、代表例として重鎖改変体調製用プラスミドpTK−5793を用いた抗体の一過性発現の方法を示した。実施例8−(2)で調製した重鎖改変体調製用プラスミド(pTK−5793)と、実施例8−(3)記載の軽鎖一過性発現用プラスミド(pTK−5608)とを等量混合し、COS―1細胞(ATCC:CRL−1650)に、トランスフェクション試薬(FuGENE(登録商標)6、プロメガ社)を用いてトランスフェクションした。すなわち、Opti−MEM(登録商標)Reduced Serum Medium(ライフテクノロジーズ製)を希釈液として、トランスフェクション試薬0.96μL/25μL及びプラスミド0.48μg/25μLを調製して混合し、培地に添加した後、COS―1細胞に添加し37℃で培養した。72時間後、培養上清を回収した。
実施例8において、COS−1細胞で発現させて得られた改変体(IgG抗体)16種類を精製し、各抗体のプレセプシンとの反応性、特異性、親和性(KD値)を評価した。
8−(4)で得られたCOS−1細胞の培養上清を回収し、0.22μmのフィルター(Sterivac、ミリポア)でろ過した。得られた培養上清からProsep vA(ミリポア)を用いて精製した。精製物を含む溶出液を濃縮し、続けてD−PBS(pH7.4)に対して透析した。タンパク濃度はIgG(BioRad)を標準品としてLowry法で求めた。得られた抗体をSDS−PAGEで分析したところ、約150kDaの単一バンドの組換え抗体が確認された。
まず、pTK356H(TB64)(WO2005/108429の実施例13に記載のrsCD14をコードする配列を有するプラスミド)を鋳型とし、プライマー対(hCD14‐a,hCD14‐d)とTaq酵素(タカラバイオ)によりPCR反応を行った。得られた増幅断片(シグナル配列を含む配列番号3のヒトsCD14の1〜64位の配列の下流にトロンビン認識配列を有し、両端に制限酵素部位をもつ)をpT7Blueベクター(ミリポア)にTAクローニングし、配列を確認し、これをpTK‐3047とした。次に、pTK‐3047を制限酵素EcoRIおよびBamHIで切断して得られた断片を、予めpTK‐2233(ヒト由来IgG1抗体重鎖のFc領域をコードする配列を有する哺乳細胞用発現プラスミド)をEcoRIおよびBamHIで切断して調製しておいたベクター断片に挿入し、得られたクローンをpTK‐3053とした。
hCD14‐dの配列 5´‐GGGATCCACGCGGAACCAGAGCATACTGCCGCGGG‐3´(配列番号90)
9−(1)で精製した改変体を用いてサンドイッチELISAを構築した。すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)に各改変体を固定化し、ブロッキングした。次に、プレセプシン標準品(0〜300pg/mL)を添加し、プレートを25℃で1時間反応させ、続けてプレートを0.05%Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。次にF1106−13−3 F(ab´)2−HRPを希釈した溶液を各ウェルに添加し、25℃で2時間反応させた。同様に5回プレートを洗浄後、TMB溶液を添加し、室温20分間反応させた。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止した。450/650nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。
9−(1)で精製した改変体の特異性を評価するため、P03ペプチド(実施例6で作製、配列番号1)を固定したプレートを用いてELISAを実施した。比較のため、F1466−26の評価も行った。
すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)にBSA、又は、P03ペプチド−BSAをそれぞれプレートに固定化後、ブロッキングした。
改変体の、プレセプシン(9−(2)で調製したrsCD14ST−FCを用いた)、P03ペプチドおよびS68ペプチドとの親和性(KD)を評価した。また、S68抗体、ラット由来モノクローナル抗体(F1146−17−2)、及び、F1146−26についても同様に評価を行った。
実施例6に準じて、各改変体とプレセプシンとの反応に対する、P01からP08ペプチドによる競合阻止反応試験を行った。
試験は、改変体を固相に固定化したELISAを用いて実施した。すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)に改変体を固定化後、ブロッキングした。プレセプシン標準品(300pg/mL)を1ウェル当たり25μL添加した。続いて希釈した各ペプチドを(0.01−10μg/mL)を25μL添加した。プレートを25℃で1時間反応させ、続けてプレートを0.05%Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。次にF1106−13−3 F(ab´)2−HRPを希釈した溶液を各ウェル50μL添加し、25℃で2時間反応させた。同様に5回プレートを洗浄後、TMB溶液を添加し、室温30−40分間反応させた。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止した。450/650nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。陰性コントロールとしてペプチド無添加(PBSと記載)、陽性コントロールとしてS68ペプチドを用いた。PBSの吸光度を100%として各ペプチドの阻止率を計算した。その結果、表23に示すように、試験を実施した改変体は全てP03配列を特異的に認識していることが確認された。
実施例8で調製した改変体のうち、実施例9で評価を行っていない改変体について、プレセプシンに対する結合活性及び特異性の評価を行った。
実施例8−(4)で得られた培養上清中のIgG濃度を確認するため、サンドイッチELISAを用いてIgG濃度を測定した。すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)に抗ウサギ抗体(DAKO、Z196)をプレートに固定化後、ブロッキングした。精製ウサギモノクローナル抗体を標準品として希釈液(0.1%BSA/D-PBS)で希釈し100−1.56 ng/mLの標準液を調製した。次に、回収した培養上清を希釈液(0.1%BSA/D-PBS)で希釈した。培養上清希釈液又は標準品希釈列をウェルに添加し、プレートを1時間反応させ、続けてプレートを0.05%Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。次に抗ウサギIgs−HRP(DAKO、P399)を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温1時間反応させた。同様に5回プレートを洗浄後、テトラメチルベンジジン溶液(TMB、BioFix)を添加し、室温10分間反応させた。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止し、450/650nmの吸光度をプレートリーダー(モレキュラーデバイス)で測定した。各培養上清中の抗体濃度は標準品濃度希釈列の検量線を用いて算出した。
改変体のプレセプシンに体する結合活性及び特異性を評価するため、抗原を固相に固定したプレートを用いてELISAを実施した。
すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)にBSA、rsCD14ST−Fc、又はP03ペプチド−BSAをそれぞれプレートに固定化後、ブロッキングした。
得られた抗体のうち、プレセプシンに対する結合活性が、S68抗体の5倍以上の吸光度を示す、特に結合活性に優れた抗体は、5934、5935、5939、5944、5808、5809、5824、5979,5980、5983、5984、5987、5988、5860、5864、5863であった。中でも、5979、5983、5988、5864は、S68抗体の5.5倍以上の吸光度を示し、特に優れたプレセプシンに対する結合活性を有していた。
合成ペプチドを抗原としたファージディスプレイ法を用いたモノクローナル抗体の作製
実施例1−(1)において、S68ペプチド−KLHを投与抗原としてウサギに免疫して回収した脾臓からのリンパ球を用いて、ファージディスプレイ法によりモノクローナル抗体を作製しうる。
CARLOS F. BARBASIII等 Phage Display A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載の方法に従って実施しうる。実施例1−(1)で回収したリンパ球よりTRIZOL Reagent(Life Technologies)を用いてtotal RNAを抽出し、SuperScript III First−Strand Synthesis System for RT−PCR(Life Technologies)にて一本鎖cDNAを合成する。このcDNAからBARBARSIII等より報告されているウサギ抗体遺伝子特異的プライマーを用いて重鎖可変領域を含む断片と軽鎖可変領域を含む断片を調製する。得られたウサギ重鎖可変領域およびヒト重鎖CH1の増幅断片を鋳型にしてPCRによりウサギ/ヒトキメラ重鎖断片を増幅し、ウサギ軽鎖可変領域(カッパ型又はラムダ型)およびヒト軽鎖定常領域の増幅断片を鋳型にしてウサギ/ヒトキメラ軽鎖断片を増幅する。得られたこれらウサギ/ヒトキメラ重鎖およびウサギ/ヒトキメラ軽鎖の断片を鋳型にして最終的にウサギ/ヒトキメラFab断片を調製する。次に、抗体発現用ファージミドであるpCDisplay−4(Creative Biogene)を制限酵素SacIおよびSpeIで切断し、ファージミド断片を調製する。同様にウサギ/ヒトキメラFab断片をSacIおよびSpeIで切断し、調製したファージミド断片にcDNA断片を挿入し、ファージライブラリー発現用プラスミドを調製する。
11−(1)で調製したプラスミドを大腸菌TG1株(Alient Technologies)に常法により形質転換させ、大腸菌を含む溶液をアンピシリンを添加したLB培地のプレートに播種する。37℃で培養後、形成されたコロニーを回収し大腸菌のライブラリーを調製する。ライブラリーの一部を培養し、この大腸菌懸濁液に、AmpicillinおよびGlucoseを添加し、37℃で1時間、振とう培養する。その後、ヘルパーファージM13KO7(ライフテクノロジーズ)を感染させ、さらに1時間、振とう培養を続ける。遠心分離により集菌し、培養液を捨てた後、10mLの2×YT培養液に懸濁し、37℃で振とう培養する。翌日、培養上清を遠心分離後、上清8mLを別のチューブへ移し、2mLのPEG/NaCl溶液を加えて混合し、氷上に1時間静置した後に、沈殿したファージを遠心分離により回収し、これをファージディスプレイ用のファージ溶液とする。
11−(2)で調製したファージ溶液からパンニング法により抗体を選択する。パンニングは2種類の方法で実施する。第一の方法としてBARBAS等の記載の方法に準じて実施する。すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)にS68−BSAをプレートに固相化後、ブロッキングする。4%スキムミルク0.2%TritonX−100を含むD−PBSを1ウエル当たり50μL添加後、11−(2)で得たファージ液を50μL添加する。プレートを1時間反応させ、続けてプレートを0.1%TritonX−100を含むD−PBSで洗浄する。次に100mM Glycine−HCl(pH2.2)で10分間溶出し、回収した溶液を1M Tris−HCl(pH7.4)で中和する。この溶出液と大腸菌TG1株を混合し、37℃で反応させ、S68ペプチド抗原に結合したファージをTG1株に再感染させる。培養液にアンピシリン、M13K07ヘルパーファージを添加し、37℃で反応させた後、大腸菌を回収し、培地及びカナマイシンを添加し、一晩培養する。培養液から遠心分離により上清を回収し、PEG処理によりファージ液を調製する。同様な操作を3回繰り返し、S68ペプチドに結合する特異的なファージを濃縮する。
11−(3)の、ファージを感染させたTG1培養液を、Ampicillinを含むLBプレートに播種しコロニーを形成させる。それぞれのコロニーから再度ファージ溶液を調製し、EIAで反応性の確認を行う。すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)にBSA、S68−BSA、P03−BSA及びsCD14ST−Fcをプレートにそれぞれ固定化後、ブロッキングする。4%スキムミルク、0.2%TritonX−100を含むD−PBSを添加後、回収したファージ液を添加する。プレートを1時間反応させ、続けてプレートを0.05%Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄する。次にHRP/Anti−M13 Monoclonal Conjugate(GE Healthcare)を希釈した溶液を各ウエルに添加し、室温1時間反応させる。同様に5回プレートを洗浄後、TMB溶液を添加し、室温10−20分間反応させる。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止する。450/650nmの吸光度をプレートリーダー(ThermoMax、Molecular Devices)で測定する。その結果、複数のファージで結合が確認される。それらコロニーからファージミドを単離し、配列を確認する。
重鎖CDR3配列は、抗体の活性に影響することが予測されたため、ファージディスプレイ法を用いて、重鎖CDR3配列の改変体を作製し、評価した。
VH CDR3ランダムミューテーションライブラリーを調製するため、F1466−26の重鎖と軽鎖を含むプラスミドpTK‐5956を鋳型とし、プライマー対(p‐nnk3‐2s;5’リン酸化‐GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC T‐3’:配列番号91,p‐nnk3‐2a;5’リン酸化‐GCC ACA AAA ATA AGT GGC CGT GTC CTC GGT TGT CGG ACT G‐3’配列番号92(NはG,A,T,Cのいずれかを、KはGあるいはTを表す))と耐熱性DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を用いてPCR反応を行い、得られた増幅断片をDNAリガーゼによって自己結合させた。これを大腸菌XL1‐Blue(アジレントテクノロジー)に形質転換し、LB/Ampicillin/Tetracycline寒天プレート上で培養し、翌日生じたコロニーを、2×YT培養液で回収した。この大腸菌懸濁液に、Ampicillin、Tetracycline、およびGlucoseを添加し、37℃で1時間、振とう培養を行った。その後、ヘルパーファージM13KO7(ライフテクノロジーズ)を感染させ、さらに1時間、振とう培養を続けた。遠心分離により集菌し、培養液を捨てた後、10mLの2×YT培養液に懸濁し、32℃で振とう培養を行った。翌日、培養上清を遠心分離後、上清8mLを別のチューブへ移し、2mLのPEG/NaCl溶液を加えて混合し、氷上に1時間静置した後に、沈殿したファージを遠心分離により回収し、これをVH CDR3ランダムミューテーションライブラリーのファージ溶液とした。
12−(1)で調製したライブラリーよりパンニングを実施し、抗体を選択した。すなわち、12−(1)で得られたファージ液(2mL)とsCD14ST−Fc 6μgと37℃で反応させ、2時間後プロテインA樹脂(Prosep−vA、ミリポア)200μLを添加し、20分間反応させた。0,05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、樹脂に溶出液(Tris−HCl,Glycine(pH2.2))を添加し8分間静置後、溶出したファージ液を回収し、溶液を中和した。この回収液と大腸菌XL−1 Blue培養液を混合し、37℃で反応させた。1時間後、L−Glutamine、アンピシリンおよびヘルパーファージM13K07(インビトロジェン)を添加し、37℃で反応させた。さらに1時間後、培地を2xYT培地に交換し、一晩培養しrsCD14ST−Fcに特異的に結合したファージを回収した。この操作を3回くり返し、目的の抗体を濃縮した。
12−(2)で最終的に得られたファージ液を再度XL−1 Blueに感染させ、その培養上清を2×YTのプレートに播種し、コロニーを作製した。このコロニーを再度XL−1 Blueと培養し、ヘルパーファージを添加し単一ファージを含むファージ溶液を調製した。次に得られたファージ液を用いて、ELISAで反応性の確認をおこなった。すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)にsCD14ST−Fcをプレートに固定化後、ブロッキングした。4%スキムミルク、0.2%TritonX−100を含むD−PBSでファージ液を2倍希釈し、プレートで1時間反応させた。続けてプレートを0.05%Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄し、希釈したHRP/Anti−M13 Monoclonal Conjugate(GEヘルスケア)を各ウェル50μL添加し、室温1時間反応させた。同様に5回プレートを洗浄後、TMB溶液を添加し、室温で反応させた。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止し、450/650nmの吸光度をプレートリーダー(ThermoMax、Molecular Devices)で測定した。結合活性の確認できたファージ液を大腸菌に感染させ、プラスミドを常法により回収し、遺伝子配列を確認した。
得られた候補ファージからファージミドを回収し、重鎖の可変領域をコードする断片を調製した。実施例8に記載の方法に従って、重鎖改変体調製用プラスミドを調製し、F1466−26の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミド(pTK−5608)とともに、COS−1細胞にトランスフェクションした。COS−1細胞を37℃で培養し、72時間後、培養上清を回収した。
得られた改変体について、実施例10−(2)と同様の試験を実施し、プレセプシン(rsCD14ST−Fc)に対する結合活性及びP03特異性を評価した。改変した重鎖CDR3のCDR配列とともに、結果を表30に示す。
実施例5及び実施例6では、P04−05をエピトープとして認識する抗体によるプレセプシン測定は、検体中のTGによる干渉を受けやすいが、P03をエピトープとして認識する抗体によるプレセプシン測定は、TG干渉を受けにくいことが示唆された。
さらに確認を進めるため、正常人検体におけるTGの影響を確認した。F1466−26(特異性:P03)、F1466−5(P03)及び、F1466−19(P04−05)について、正常人ヒト血清を用いてTG干渉試験を実施した。
新規に得られた改変体について、実施例5と同様にTG干渉試験を実施し、検体中のTGの影響を確認した。改変体は精製して用いた。
すなわち、Nunc社イムノプレート(MAXISORP、C96、430341)に改変体を固定化後、ブロッキングした。プレセプシン標準品を希釈液で希釈しプレセプシンの濃度系列(15.6−500pg/mL)を調製した。ヒト検体3種類にトリグリセライド(イントラピッド、フレゼニウス カービ ジャパン)を添加し、最終濃度6.7、13.3、20mg/mLとなるように調製した。ヒト検体は、敗血症患者の血清1例と正常人ヒト血清に一定量のプレセプシンを添加した検体2例を用いた。また、このTG濃度は、検体に元々含まれるTGは考慮していない。検体を希釈液で20倍希釈し、TG無添加若しくは各濃度のTGを添加したサンプル、又は標準品希釈列を各ウエルに添加した。実施例9−(3)と同様にサンドイッチELISA系を用いて測定を実施した。検体中のTG濃度20mg/mLのときのプレセプシン測定値の解離度が±20%以下の検体の割合(%)を表31に示す。
その結果、P03をエピトープとして認識する抗体はトリグリセライドの影響を受けにくいことが確認された。
本発明の実施例8および12で得られた、好ましい性能を有する抗体のCDR配列を図2〜図2−2に示す(配列番号93〜156)。実施例8および12において作製した抗体の数の合計は109個であり、好ましい抗体の数は65個であった。
抗体のプレセプシンに対する親和性(KD値)が10−8M未満の抗体は○、10−9M未満の抗体は◎として評価した。KD値が10−7M未満であるが、S68抗体のプレセプシンに対する親和性とほぼ同等の親和性を有する抗体は△として評価した。KD値による評価で、特にプレセプシンとの結合活性に優れる抗体は、5793と5810であった。
プレセプシンに対する結合活性は、S68抗体とsCD14ST−Fcの反応時の吸光度を1としたときの、各抗体とrsCD14ST−Fcの反応時の吸光度の比で評価された。抗体は、吸光度比が4以上の抗体は○、5.5以上の抗体は◎として評価した。吸光度比による評価で、特にプレセプシンとの結合活性に優れる抗体は、5864、5979、5983、5988、及び、6028であった。
Claims (22)
- (i)重鎖可変領域(VH)相補性決定領域(CDR)1:X1X2X3MX4;
(ii)VH CDR2:IX5X6X7X8YAX9X10X11X12X13;及び
(iii)VH CDR3:X14X15X16;並びに
(iv)軽鎖可変領域(VL)CDR1:X17X18X19X20X21X22X23X24;
(v)VH CDR2:KX25X26X27X28X29S;及び
(vi)VH CDR3:X30X31X32YX33X34X35X36X37;を含み、
X1〜X37は、以下に選択肢として記載の1または複数個のアミノ酸配列であり、X1=任意の1個のアミノ酸、X2=Y又はF、X3=T、A又はW、X4=G又はS;
X5=I又はV、X6=NSGA、YRNIK、ANSGA、SSDGG、SDIDQ又はSDIDD、X7=T、I又はL、X8=Y、V又はF、X9=S又はT,X10=W又はA、X11=A又はG、X12=K又はA、X13=G又はA;
X14=G、A、L又はS、X15=D、F、S、P、H、I、N、R、V、G又はL、X16=F、A、S、P、H、D、I、N、R、L、E又はH;
X17=Q又はA、X18=A又はG、X19=S又はA、X20=QS、ED又はQN、X21=I又はA、X22=GSN、ISN、GSD又はSNY、X23=L又はA、X24=A又はS;
X25=A又はT、X26=S又はA、X27=K又はT、X28=L又はA、X29=A又はE;
X30=Q又はA、X31=C又はS、X32=S又はT、X33=T又はY、X34=AIGNY、ESTTF、AIGNAY又はRSTTTY、X35=G又はA、X36=H又はN、X37=V、A又はT;
配列番号1のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。 - 前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、
VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、以下に選択肢として記載の複数個のアミノ酸配列である、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
(a)VH CDR1=RYAMG、RYTMG、SFWMS、SYTMG、AYTMG、MYTMG、PYTMG、VYTMG、IYTMG、DYTMG、EYTMG、HYTMG、TYTMG、QYTMG、YYTMG、GYTMG、KYTMG、NYTMG又はWYTMG;
(b)VH CDR2=IIANSGATYYASWAKG、IINSGATYYASAAKG、IINSGATYYASWAAG、IINSGATYYASWAKA、IINSGATYYASWGKG、IIYRNIKTYYATWAKG、IINSGATYYASWAKG、IVSSDGGIYYASWAKG、IISDIDQIVYATWAKG又はIISDIDDLFYASWAKG;及び
(c)VH CDR3=GDF、GGL、ADF、GDA、LDF、SDF、GFF、GSF、GPF、GHF、GIF、GNF、GRF、GDS、GDP、GDH、GDD、GDI、GDN、GDR、GVL、GGE又はGLH;並びに
(d)VL CDR1=QASEDIISNLA、QASQSIGSNLA、QASQSAGSNLA、QASQSISNYLA、QAAQSIGSNLA、QGSQSIGSNLA、QASQSIGSNAA、AASQSIGSNLA又はQASQNIGSDLS;
(e)VL CDR2=KASTLAS、KASKLAS、KTSTLES、KASKAAS又はKAAKLAS;及び
(f)VL CDR3=QSSYTESTTFGHV、QCSYTAIGNYGHV、QSTYYRSTTTYGNT 、QCSYTAIGNAYGHV、QCSYTAIGNYGHA、QCSYTAIGNYAHV又はACSYTAIGNYGHVである、前記抗体又はその抗原結合性抗体断片。 - 前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3、並びに、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、以下の1)〜 68)のいずれかである、請求項1又は2のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
1)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号97、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
2)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号94、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
3)VH CDR1が配列番号4、VH CDR2が配列番号5、VH CDR3が配列番号6、VL CDR1が配列番号19、VL CDR2が配列番号20、VL CDR3が配列番号21の各アミノ酸配列からなる;
4)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
5)VH CDR1が配列番号10、VH CDR2が配列番号11、VH CDR3が配列番号12、VL CDR1が配列番号25、VL CDR2が配列番号26、VL CDR3が配列番号27の各アミノ酸配列からなる;
6)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号93、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
7)VH CDR1が配列番号95、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
8)VH CDR1が配列番号96、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
9)VH CDR1が配列番号98、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
10)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号99の各アミノ酸配列からなる;
11)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号100、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
12)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号101の各アミノ酸配列からなる;
13)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号102、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
14)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号103、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
15)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号122、VL CDR2が配列番号121、VL CDR3が配列番号101の各アミノ酸配列からなる;
16)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号104、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
17)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号105、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
18)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号106、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
19)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号107、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
20)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号108、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
21)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号109、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
22)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号110、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
23)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号111、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
24)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号112の各アミノ酸配列からなる;
25)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号113の各アミノ酸配列からなる;
26)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号114、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
27)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号115、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
28)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号116の各アミノ酸配列からなる;
29)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号117、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
30)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号118、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
31)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号119、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
32)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号120、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
33)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号121、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
34)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号122、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
35)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号123、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
36)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号124、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
37)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号125、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
38)VH CDR1が配列番号126、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
39)VH CDR1が配列番号127、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
40)VH CDR1が配列番号128、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
41)VH CDR1が配列番号129、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
42)VH CDR1が配列番号130、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
43)VH CDR1が配列番号131、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
44)VH CDR1が配列番号132、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
45)VH CDR1が配列番号133、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
46)VH CDR1が配列番号134、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
47)VH CDR1が配列番号135、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
48)VH CDR1が配列番号136、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
49)VH CDR1が配列番号137、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
50)VH CDR1が配列番号138、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
51)VH CDR1が配列番号139、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号9、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
52)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号140、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
53)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号141、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
54)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号142、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
55)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号143、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
56)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号144、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
57)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号145、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
58)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号146、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
59)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号147、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
60)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号148、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
61)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号149、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
62)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号150、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
63)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号151、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
64)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号152、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
65)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号153、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
66)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号154、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;
67)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号155、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる;または、
68)VH CDR1が配列番号7、VH CDR2が配列番号8、VH CDR3が配列番号156、VL CDR1が配列番号22、VL CDR2が配列番号23、VL CDR3が配列番号24の各アミノ酸配列からなる、である、前記抗体又はその抗原結合性抗体断片。 - (a)配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号97のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(b)配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号8のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号94のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び、配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(c)配列番号4のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号5のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び、配列番号6のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号19のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号20のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号21のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;
(d)配列番号7のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号8のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号9のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号22のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号23のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号24のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL;または
(e)配列番号10のアミノ酸配列からなるVH CDR1、配列番号11のアミノ酸配列からなるVH CDR2、及び配列番号12のアミノ酸配列からなるVH CDR3を含むVH、並びに、配列番号25のアミノ酸配列からなるVL CDR1、配列番号26のアミノ酸配列からなるVL CDR2、及び配列番号27のアミノ酸配列からなるVL CDR3を含むVL、
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。 - 前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して10−8M未満の親和性(KD)で結合する、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
- 前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号1の配列からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
- 前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させる反応系(吸光度)において、配列番号1の8位のアスパラギン酸をアラニンに置換した配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止が20%未満である、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の抗体又はその抗体結合性抗体断片。
- 配列番号2に記載のペプチドを投与抗原として作製される、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
- 前記抗体は、高分子量可溶型CD14とは特異的には結合しない、請求項1ないし8のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
- 前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド(TG)干渉試験を行うとき、検体中のTG濃度が20mg/mLのときのプレセプシン測定値の解離度が±20%以下を示す検体の比率が50%以上である、前記1ないし9のいずれか1に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
- 前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、S68抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、0.9以上を示す、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
- 前記抗原結合性抗体断片は、Fab、Fab´、F(ab´)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)、sc(Fv)2、CDRを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、請求項1ないし11のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
- 請求項1ないし12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項14記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 前記宿主細胞がCHO細胞である、請求項15に記載の形質転換株。
- 請求項14または請求項15に記載の形質転換株を培養することを含む、抗体またはその抗原結合性抗体断片の製造方法。
- 少なくとも前記請求項1ないし12のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を含む、プレセプシン測定用キット。
- 少なくとも前記請求項1ないし12のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を含む、敗血症を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するためのキット。
- 少なくとも前記請求項1ないし12のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプシンの測定方法。
- 少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するための方法であって、
1)前記請求項1ないし12のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
2) 1)で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判定する工程を含む、前記方法。 - 少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリーニング方法であって、
1)候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
2)当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号1からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が50%以上競合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
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