KR102360851B1 - 신규 항프레세프신 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 과제는, 프레세프신과의 반응성이 우수하고, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합한, 신규 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 제공하는 것이다. 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식하는, 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.

Description

신규 항프레세프신 항체{NOVEL ANTI-PRESEPSIN ANTIBODY}
본 발명은 검체 중의 프레세프신 측정에 유용한, 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편에 관한 것이다.
CD14 분자는 단핵구 세포의 막 표면에 발현하고 있는 당 단백질이며, LPS(리포폴리사카라이드)의 리셉터로서의 기능을 갖는 것이 알려져 있다. CD14 분자에는, 세포 표면 상에 발현하고 있는 막 결합형 CD14(mCD14)와, 가용형 CD14(sCD14)의 2종류가 존재한다. sCD14로서, 분자량 약 55kDa 및 약 49kDa의 sCD14(이하 「고분자량 sCD14」라고 한다)가 알려져 있고, 패혈증(SEPSIS), 후천성 면역결핍증(AIDS), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 전신성 에리테마토데스(SLE) 등, 많은 질환에 있어서의 환자의 혈중에서 높은 값을 나타내는 것이 보고되어 있다. 그로 인해, 이들의 고분자량 sCD14는 질환 특이적인 마커는 아니라고 여겨지고 있다(비특허문헌 1 내지 2).
한편, 패혈증 환자에 있어서 특징적으로 혈중 농도가 상승하는, 새로운 sCD14의 분자종으로서, sCD14-ST(가용성 CD14 항원 서브타입, 프레세프신이라고도 한다)가 존재하는 것이 보고되어 있다.
sCD14-ST(프레세프신)란, sCD14 중, 비환원 조건 하 SDS-PAGE에 있어서 분자량 13±2kDa에 영동되는 것을 특징으로 하고, CD14의 N 단부를 유지하고 있는 것이다. 고분자량 sCD14와 비교하면, C단측이 크게 결실된 아미노산 서열을 갖고 있으며, 고분자량 sCD14와는 달리 LPS 결합능을 갖고 있지 않다. 또한, 프레세프신은 고분자량 sCD14와는 다른 면역원성을 나타내기 때문에, 항체를 사용하여 양자를 구별할 수 있다. 프레세프신은 패혈증 환자에 있어서 특이적으로 혈중 농도가 상승한다(특허문헌 1). 또한, 패혈증과의 판별이 어려운, 전신성 염증 반응(SIRS)을 나타내는 환자와 비교해도, 패혈증 환자의 혈중에서 높은 값을 나타낸다는 보고가 있어, 프레세프신은 패혈증의 특이적인 진단 마커라고 여겨지고 있다(비특허문헌 3).
프레세프신을 특이적으로 인식하는 토끼 유래 폴리클로날 항체(S68 항체) 및 래트 유래 모노클로날 항체(F1146-17-2)가 개시되어 있다(특허문헌 1, 2).
현재, 프레세프신의 측정에는, 프레세프신에 대한 특이 항체로서 토끼 유래 폴리클로날 항체를 사용한 측정계가 실용화되어, 측정 키트가 유럽 및 일본에서 출시되어 있다(PATHFAST(R) Presepsin, 미쯔비시 가가꾸 메디엔스 가부시키가이샤)
지금까지, 실용화할 수 있는 항인간 프레세프신 모노클로날 항체의 취득이 시도되어 왔지만, 만족스러운 성능을 갖춘 항체는 얻어지지 않았다.
국제 공개 WO2005/108429 국제 공보 WO2004/044005
Hayashi 등, Infection and Immunity, 67: 417-420, 1999년 Lawn 등, Clinical&Experimental Immunology, 120: 483-487, 2000년 Yaegashi 등, Journal of Infection and Chemotherapy, 11: 234-238, 2005년
본 발명의 과제는, 프레세프신과의 반응성이 우수하고, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합한, 신규 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 제공하는 것이다.
또한, 프레세프신의 측정값이, S68 항체(WO2004/044005의 실시예 1에 기재된 S68 펩티드를 투여 항원으로 하여 토끼에게 면역하여 얻어진 폴리클로날 항체)에 의한 측정값과의 상관이 좋은, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 제공하는 것이다.
또한, 항체를 사용하여 측정한 프레세프신 측정값이, 검체 중의 간섭 물질(예를 들어, 트리글리세라이드)의 영향을 받기 어려워, 여러 가지 배경 인자를 갖는 피험자의 검체여도, 고정밀도로 프레세프신을 측정할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 제공하는 것이다.
S68 펩티드로 토끼를 면역하여 얻어진 복수의 하이브리도마로부터, S68 펩티드에의 결합 활성, 프레세프신에 대한 결합 활성 등 복수의 선별 공정을 거쳐, 복수의 모노클로날 항체를 얻었다. 프레세프신 측정을 위한 ELISA계를 구축하고, 프레세프신과의 반응성을 검토한 바, F1146-17-2(WO2004/044005의 실시예 2에 기재된 S68 펩티드를 래트에 면역하여 얻어진 모노클로날 항체: 서열 번호 42 내지 47)를 사용한 ELISA계와 비교하여, 프레세프신과의 반응성이 약 1만배 개선된 항체가 얻어진 것을 알았다.
이들 각 토끼 모노클로날 항체를 사용한 ELISA계에 있어서, 복수의 패혈증 환자의 혈중 프레세프신값을 측정하고, S68 항체를 사용한 ELISA계에 의한 측정값과의 상관 분석을 행한 바, 상관성이 우수한 항체와 떨어지는 항체가 존재하는 것이 판명되었다. 또한 검토를 진행시킨 바, 그 차이에는, 검체 중의 트리글리세라이드(TG)의 간섭이 관여하고 있음을 알아냈다. S68 항체에 의한 프레세프신 측정값과의 상관이 좋고, 검체 중의 TG 간섭을 받기 어려운, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합한 모노클로날 항체를 얻기 위해 연구를 계속한 바, 항체가 인식하는 에피토프에 의해, 그 항체의 성능에 차가 발생함을 알아냈다. 즉, 그 차이에는 검체 중의 트리글리세라이드(TG라고도 기재한다)의 간섭 및/또는 에피토프가 관여하고 있음을 알아냈다.
프레세프신 측정에 바람직한 성능을 갖는 항체는 프레세프신에 있어서의, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열(krvdadadpr: 서열 번호 3(인간 전장 가용형 CD14)의 52위치 내지 61위치에 상당하는 영역: P03 서열이라고도 한다)을 에피토프로 하는 것을 알아냈다. 이 에피토프는, 본 발명에서 처음으로 알아낸 신규 에피토프이다.
이 P03 서열을 에피토프로서 인식하는 항체와 프레세프신의 결합은, P03 서열로 이루어지는 아미노산 잔기에 의해 50％ 이상 경합 저지되었다. 한편, 서열 번호 35 내지 41의 각 아미노산 잔기에 의한 당해 항체와 프레세프신의 반응의 경합 저지는 20％ 미만이었다. 즉, 서열 번호 36(인간 전장 가용형 CD14의 49위치 내지 58위치에 상당: P02 서열이라고도 한다)으로 이루어지는 아미노산 잔기, 서열 번호 37(인간 전장 가용형 CD14의 55위치 내지 64위치에 상당: P04 서열이라고도 한다)로 이루어지는 아미노산 잔기, 또는 서열 번호 38(인간 전장 가용형 CD14의 58위치 내지 67위치에 상당: P05 서열이라고도 한다)로 이루어지는 아미노산 잔기에 의한, 당해 항체와 프레세프신의 반응의 경합 저지는 20％ 미만이었다. 이 결과로부터, 이 P03 서열을 에피토프로서 인식하는 항체는 P03 서열에 대한 특이성이 높은 것을 알았다.
동시에 하이브리도마로부터 취득한 항체 중, 프레세프신에 있어서의 P04 서열 및 P05 서열을 에피토프로서 인식하는 항체는 프레세프신 측정 시에 검체 중의 TG의 간섭을 받기 쉬운 등, 프레세프신 측정에는 적합하지 않음을 알았다. 이와 같이, 항체가 인식하는 에피토프 위치의 근소한 차이가, 항체의 프레세프신 측정을 위한 성능에 영향을 주는 것은 예상외였다.
또한, P03 서열(서열 번호 1)의 8위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 아미노산 잔기에서는, 상기 항체와 프레세프신의 반응의 경합 저지가 20％ 미만이 되었다. 한편, P03 서열(서열 번호 1)의 2위치부터 7위치, 9위치 및 10위치 중 어느 하나의 아미노산을 알라닌(또는 글리신)으로 치환한 아미노산 잔기는, 상기 항체와 프레세프신의 반응을 50％ 이상 경합 저지하는 것을 알았다.
또한, 프레세프신 측정에 바람직한 성능을 갖는 항체를 제작하기 위해, P03 서열을 에피토프로서 인식하는 항체의 서열을 바탕으로, CDR 서열의 개변을 행하였다. 또한, 파지 디스플레이법을 사용하여 항체를 제작하였다. 얻어진 항체를 일정한 기준으로 선별하고, 하이브리도마로부터 얻어진 항체와 동등 또는 보다 성능이 좋은 항체를 얻었다.
하이브리도마로부터 얻어진 P03 서열을 에피토프로서 인식하는 항체, 및 선택된 개변체는, 프레세프신에 대한 친화성이 매우 높고, 프레세프신 측정을 위한 샌드위치 ELISA계에 있어서, 검체 중의 간섭 물질(특히, 트리글리세라이드)의 영향을 받기 어려운, S68 항체에 의한 측정계와의 상관이 좋은, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합한 항체인 것이 확인되었다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
1. 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식하는, 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
2. 상기 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이,
(i) 중쇄 가변 영역(VH) 상보성 결정 영역(CDR)1: X1X2X3MX4;
(ii) VH CDR2: IX5X6X7X8YAX9X10X11X12X13; 및
(iii) VH CDR3: X14X15X16; 및
(iv) 경쇄 가변 영역(VL) CDR1: X17X18X19X20X21X22X23X24;
(v) VL CDR2: KX25X26X27X28X29S; 및
(vi) VL CDR3: X30X31X32YX33X34X35X36X37;을 포함하고,
X1 내지 X37은, 이하의 표 1 내지 표 6에 기재된 1개 또는 복수개의 아미노산 서열인, 상기 1)에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
[표 1]
Figure 112016081786898-pct00001
[표 2]
Figure 112016081786898-pct00002
[표 3]
Figure 112016081786898-pct00003
[표 4]
Figure 112016081786898-pct00004
[표 5]
Figure 112016081786898-pct00005
[표 6]
Figure 112016081786898-pct00006
3. X1=R, S, A, M, P, V, I, D, E, H, T, Q, Y, G, K, N 또는 W인, 상기 2에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
4. 상기 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3, 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 표 7에 기재된 아미노산 서열로부터 선택되고, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 표 8에 기재된 아미노산 서열로부터 선택되는, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
[표 7]
Figure 112016081786898-pct00007
[표 8]
Figure 112016081786898-pct00008
5. 상기 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3, 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3, 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은, 표 9-1, 표 9-2 및 표 9-3에 기재된 아미노산 서열로부터 선택되는, 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
[표 9-1]
Figure 112016081786898-pct00009
[표 9-2]
Figure 112016081786898-pct00010
[표 9-3]
Figure 112016081786898-pct00011
6. (a) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 97의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 94의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL;
을 포함하는 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
7. (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL;
(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
(c) 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL
을 포함하는 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
8. 상기 항체 또는 단편은 프레세프신에 대하여 10-8M 미만의 친화성(KD)으로 결합하는, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
9. 상기 항체 또는 단편과 프레세프신의 결합이 저지되도록, 서열 번호 1의 서열로 이루어지는 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는, 상기 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
10. 상기 반응계가, (a) 상기 항체 또는 단편과, (b) F1106-13-3 항체 또는 F1031-8-3 항체가 사용되는 샌드위치 ELISA인, 상기 9에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
11. 상기 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 41 중 어느 하나의 서열로 이루어지는 아미노산 잔기에 의한, 상기 항체와 프레세프신의 결합의 경합 저지는 20％ 미만인, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
12. 상기 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 서열 번호 1의 8위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 서열로 이루어지는 아미노산 잔기에 의한, 상기 항체와 프레세프신의 결합의 경합 저지가 20％ 미만인, 상기 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
13. 상기 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 서열 번호 1의 2위치부터 7위치, 9위치 및 10위치 중 어느 하나의 아미노산을 알라닌(또는 글리신)으로 치환한 서열로 이루어지는 아미노산 잔기에 의해, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는, 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
14. 상기 항체가, 고상으로 고정화된 서열 번호 1의 서열로 이루어지는 아미노산 잔기와의 결합 활성을 갖는, 상기 1 내지 13 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
15. 서열 번호 2에 기재된 펩티드를 투여 항원으로 하여 제작되는, 상기 1 내지 14 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
16. 상기 항체는 고분자량 가용형 CD14와는 특이적으로는 결합하지 않는, 상기 1 내지 15 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
17. 상기 항체를 사용하여, 복수의 검체에 대하여 트리글리세라이드(TG) 간섭 시험을 행할 때, 검체 중의 TG 농도가 20mg/mL일 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 50％ 이상인, 상기 1 내지 16 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
18. 상기 항체를 사용하여, 복수의 검체에 대하여 TG 간섭 시험을 행할 때, 검체 중의 TG 농도가 20mg/mL일 때의 프레세프신 측정값의 해리도의 평균이 ±20％ 이하인, 상기 1 내지 17 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
19. 상기 항체를 사용하여, 복수의 검체에 대하여 TG 간섭 시험을 행할 때, 검체가 정상인의 인간 혈청이며, 검체 중의 TG 농도가 10mg/mL일 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±100％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 50％ 이상인, 상기 1 내지 18 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
20. 상기 항체를 사용하여 얻어진 검체 중의 프레세프신 측정값과, S68 항체를 사용하여 얻어진 검체 중의 프레세프신 측정값과의 상관 계수가 0.9 이상을 나타내는, 상기 1 내지 19 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
21. 상기 상관 계수가 0.95 이상인, 상기 20에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
22. 상기 항체는 rsCD14ST-Fc에 대하여 1.08E-08 미만의 친화성(KD값)으로 결합하는, 상기 1 내지 21 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
23. 상기 항체와 프레세프신의 결합 활성이, 래트 유래 항프레세프신 항체(F1146-17-2)와 프레세프신의 결합 활성과 비교하여, 프레세프신 농도비로 10000배 이상의 향상을 나타내는, 상기 1 내지 22 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
24. 상기 항체와, 고상으로 고정화된 rsCD14ST-Fc의 결합 활성(흡광도)이 S68 항체와, 고상으로 고정화된 rsCD14ST-Fc의 결합 활성의 2배 이상인, 상기 1 내지 23 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
25. 상기 항체 또는 단편이 모노클로날 항체인, 상기 1 내지 24 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
26. 상기 항원 결합성 항체 단편은, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv), sc(Fv)2, CDR을 포함하는 폴리펩티드, 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 항원 결합성 항체 단편인, 상기 1 내지 25 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
27. 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
28. 상기 27에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
29. 상기 28에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주.
30. 상기 숙주 세포가 CHO 세포인, 상기 29에 기재된 형질 전환주.
31. 상기 29 또는 30에 기재된 형질 전환주를 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 제조 방법.
32. 적어도 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 포함하는, 프레세프신 측정용 키트.
33. 적어도 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 단편을 포함하는, 패혈증을 검출하기 위한 키트, 또는 패혈증의 검출 또는 진단을 보조하기 위한 키트.
34. 상기 프레세프신 측정용 키트가, 패혈증과 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)의 판별, 패혈증의 중증화의 리스크 평가, 패혈증의 예후 예측(사망률 예측), 패혈증의 중증도 평가, 수술후 감염증의 검출, 파종성 혈관내 응고 증후군(disseminated intravascular coagulation, DIC)의 검출, 감염성 DIC의 검출, 심질환의 검출, 세균 감염을 수반하는 호흡기 감염증의 검출, 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대장염)의 검출, 발열성 호중구 감소증(febrile neutropenia, FN)의 검출, 혈구 탐식 증후군(hemophagocytic syndrome, HPS)의 검출 및 식세포의 기능 평가로부터 선택되는 적어도 하나의 질환의 검출 또는 평가를 위한 키트인, 상기 32에 기재된 프레세프신 측정용 키트.
35. 프레세프신 측정용 키트에 있어서의, 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 용도.
36. 적어도 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편과, 프레세프신을 함유하는 검체를 접촉시키는 공정을 포함하는, 프레세프신의 측정 방법.
37. 적어도 이하의 공정을 포함하는, 패혈증의 검출 방법, 또는 패혈증의 검출 또는 진단을 보조하기 위한 방법이며,
1) 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 검체 중의 프레세프신 농도를 측정하는 공정, 및
2) 1)에서 얻어진 프레세프신 농도가 컷오프값과 비교하여 높은 값인지의 여부를 판정하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
38. 적어도 이하의 공정을 포함하는, 질환의 검출 또는 평가를 위한 방법이며, 당해 질환의 검출 또는 평가가, 패혈증과 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)의 판별, 패혈증의 중증화의 리스크 평가, 패혈증의 예후 예측(사망률 예측), 패혈증의 중증도 평가, 수술후 감염증의 검출, 파종성 혈관내 응고 증후군(disseminated intravascular coagulation, DIC)의 검출, 감염성 DIC의 검출, 심질환의 검출, 세균 감염을 수반하는 호흡기 감염증의 검출, 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대장염)의 검출, 발열성 호중구 감소증(febrile neutropenia, FN)의 검출, 혈구 탐식 증후군(hemophagocytic syndrome, HPS)의 검출 및 식세포의 기능 평가로부터 선택되는 적어도 하나이며,
1) 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 검체 중의 프레세프신 농도를 측정하는 공정, 및
2) 1)에서 얻어진 프레세프신 농도가 컷오프값과 비교하여 높은 값인지의 여부를 판정하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
39. 적어도 다음의 공정을 포함하는, 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 스크리닝 방법이며,
1) 후보의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여 프레세프신 측정계를 구축하는 공정
2) 당해 측정계를 사용하여, 검체 중의 TG 농도가 프레세프신 측정값에 끼치는 영향을 결정하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
40. 적어도 다음의 공정을 포함하는, 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 스크리닝 방법이며,
1) 후보의 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 얻는 공정, 및
2) 당해 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계에 있어서, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는 상기 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 선택하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
41. 적어도 다음의 공정을 포함하는, 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 스크리닝 방법이며,
1) 후보의 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 얻는 공정, 및
2) 프레세프신에 있어서의 서열 번호 1의 아미노산 서열을 에피토프로서 특이적으로 인식하는 상기 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 선택하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
42. 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도를 측정함으로써, 패혈증의 검출, 또는 검출 또는 진단의 보조가 이루어진 환자에 대하여 패혈증 치료가 실시되는, 패혈증의 치료 방법.
43. 상기 1 내지 26 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 피검약이 투여된 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도를 결정하는 공정을 포함하는, 피검약의 스크리닝 방법.
44. 서열 번호 3(인간 전장 가용형 CD14)의 1위치부터 64위치의 서열과, 항체의 중쇄 Fc 영역을 포함하는, rsCD14ST-Fc.
45. 서열 번호 3(인간 전장 가용형 CD14)의 1위치부터 64위치의 서열과, 항체의 중쇄 Fc 영역의 사이에, 절단을 용이하게 하는 서열이 삽입된, 상기 44에 기재된 rsCD14ST-Fc.
46. 상기 절단을 용이하게 하는 서열이 트롬빈 인식 서열인, 상기 45에 기재된 rsCD14ST-Fc.
47. 상기 항체의 중쇄 Fc 영역이, 인간 유래 IgG1 항체 중쇄의 Fc 영역인, 상기 44 내지 46 중 어느 하나에 기재된 rsCD14ST-Fc.
48. 서열 번호 3(인간 전장 가용형 CD14)의 1위치부터 64위치의 서열과, 항체의 중쇄 Fc 영역의 서열을 포함하는 벡터를, 숙주 세포에 도입하고, 그 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, rsCD14ST-Fc의 제조 방법.
49. 상기 48에 기재된 rsCDST-Fc의 Fc 영역을 절단하는 공정을 포함하는, rsCD14-ST의 제조 방법.
본 발명에 의해, 프레세프신과의 반응성이 우수하고, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합한 항체 및 그의 항원 결합성 항체 단편이 제공됨으로써, 프레세프신 측정의 질 및 정밀도를 높이는 것이 가능하게 된다. 프레세프신에 대한 친화성이 높은 항체를 제공할 수 있는 것에 의해, 당해 항체는 정상인 레벨의 미량의 프레세프신의 정량에도 적합하고, 고감도화가 가능하게 된다. 또한, 검체 중의 간섭 물질의 영향을 받기 어려운 항체를 제공할 수 있는 것에 의해, 샌드위치 ELISA계에서의 측정값이 혈청 샘플의 개체차(피험자의 배경 인자)의 영향을 받기 어렵고, 정밀도가 높은 측정이 가능하게 된다. 샌드위치 ELISA계에 있어서, 프레세프신과만 특이적으로 결합하고, 인간 혈중에 존재하는 고분자량 sCD14와는 특이적으로는 결합하지 않는, 특이성이 높은 측정이 가능하다.
폴리클로날 항체에 의한 프레세프신 측정의 과제(로트 간의 균일성의 확보, 생산 곤란성·비용 등)를 해결하고, 실용성이 우수한 항체의 제공이 가능하게 된다. 즉, 모노클로날 항체는 저렴하고 안정적이며 효율적으로 생산을 할 수 있고, 항체의 균일한 품질을 유지할 수 있다는 이점을 갖는다.
도 1은 F1466-26(A), F1466-5(B) 및 F1466-19(C)의 항체를 사용하여, 정상인의 인간 혈청의 TG 간섭 시험을 실시한 결과를 도시하는 도면이다.
도 2는 실시예 8 및 실시예 12에서 얻어진 각 개변체를 도시하는 도면이다.
도 2a는 실시예 8 및 실시예 12에서 얻어진 각 개변체를 도시하는 도면이다. 도 2로부터 이어지는 도면이다.
도 2b는 실시예 8 및 실시예 12에서 얻어진 각 개변체를 도시하는 도면이다. 도 2, 도 2a로부터 이어지는 도면이다.
이하에, 보다 상세하게 발명을 설명한다.
1. 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식하는, 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편
본 발명의 제1 형태는, 프레세프신 상의 신규 에피토프인, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는, 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이다.
「서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식한다」란, 항체가, 프레세프신의 서열 중, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 상당하는 서열을 에피토프로서 특이적으로 인식하는 것을 말한다.
「항원 결합성 항체 단편」은, 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체의 부분 단편 중에서, 원래의 항체와 동일한 항원 결합성을 갖는 단편을 말한다.
「서열의 동일성」 또는 「서열의 상동성(호몰로지)」은, 2개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 사이, 즉, 참조 서열과, 참조 서열과 비교되어야 할 대상이 되는 서열과의 사이의 관계에 대하여 언급된다. 서열 간의 일치에 의해 결정되는, 고도의 서열 유사성을 만들어 내도록, 서열이 최적으로 조정된 후, 서열 동일성 또는 상동성은 대상이 되는 서열과 참조 서열을 비교함으로써 결정된다. 그러한 조정에 관하여, 서열 동일성은 위치마다 결정된다. 예를 들어, 어떤 위치에서 핵산 또는 아미노산이 동일할 때, 특정한 위치에서 서열은 동일하다. 이러한 동일성을 나타내는 위치의 총 수를, 참조 서열의 핵산 또는 잔기의 총 수로 나눔으로써, 서열 동일성％가 얻어진다. 서열 동일성은 공지된 방법에 의해 간이하게 계산할 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 그것들은 Computational Molecular Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, New York(1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, New York(1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, GrifEn A. M., and GrifEn H. G., eds., Humana Press, New Jersey(1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press(1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. and Devereux J., eds., M. Stockton Press, New York(1991); and Carillo H., and Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988) 등에 기재되어 있다. 서열 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열 간에, 최대의 일치를 부여하도록 설계된다. 서열 동일성의 결정 방법은 공연히 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 있어서 체계화되어, 부여한 서열 간의 서열 동일성을 결정한다. 그러한 프로그램의 예는 특별히 한정되지 않지만, the GCG program package(Devereux et al., Nuc. Ac. Res., 12(1):387(1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA(Altschul et al, J. Molec. Biol, 215: 403-410(1990)). 등을 들 수 있다. NCBI 외의 BLASTX 프로그램은 공연히 이용 가능하다.
본 발명에 있어서 에피토프의 결정 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 실시예 6에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 항체는 당해 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, P03 펩티드(서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열)를 경합 반응시키는(바람직하게는, 흡광도를 이용하는) 반응계에 있어서, 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는 것으로 특징지어져도 된다. 당해 반응계는 바람직하게는 샌드위치 ELISA이다. 보다 바람직하게는, (a) 본 발명의 항체 또는 단편과, (b) F1106-13-3 항체 또는 F1031-8-3 항체가 사용되는 샌드위치 ELISA이다. 서열 번호 1의 아미노산 서열은, 인간 전장 가용형 CD14의 아미노산 서열(서열 번호 3)의 52위치 내지 61위치에 상당한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체와 프레세프신의 결합에 대한, P01 펩티드(서열 번호 3의 46위치 내지 55위치로 표현되는 아미노산 서열), P02 펩티드(동 서열의 49위치 내지 58위치로 표현되는 아미노산 서열), P05 펩티드(동 서열의 58위치 내지 67위치), P06 펩티드(동 서열의 61위치 내지 70위치), 또는 P07 펩티드(동 서열의 64위치 내지 73위치), P08 펩티드(동 서열의 67위치 내지 76위치)에 의한 경합 저지는 20％ 미만이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체와 프레세프신의 결합에 대한, P04 펩티드(동 서열의 55위치 내지 64위치)에 의한 경합 저지는 20％ 미만이다.
또한, 에피토프 결정을 위한 다른 방법으로서는, 예를 들어 실시예 9-(4)에 기재한 바와 같이, 목적으로 하는 항원의 부분 서열(예를 들어, P03 펩티드)과, 항체와의 결합 활성을 보는 것도 가능하다.
본 발명의 하나의 형태에서는, P03 서열(서열 번호 1)의 8위치의 아스파라긴산 이외의 아미노산 서열이 1개 또는 복수개 치환된 서열에 결합하는 항프레세프신 항체를 제공한다. 치환되는 아미노산의 수는 바람직하게는 2아미노산 이내, 더욱 바람직하게는 1아미노산이다.
예를 들어, 본 발명의 하나의 형태에서는, P03 서열 또는 그의 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 결합하는 항프레세프신 항체를 제공한다. 대상이 되는 에피토프는, P03 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 또는 100％의 동일성을 갖는 서열일 수도 있다. 어떤 형태에서는, P03 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 서열에 특이적인 항프레세프신 항체는 모노클로날 항체일 수도 있다.
본 발명의 항체는 프레세프신을 특이적으로 인식하는 항체이다.
프레세프신(sCD14-ST)은 CD14의 가용형의 단편이며, 이하의 1) 내지 3)의 성질을 갖는 물질을 말한다.
·비환원 조건 하 SDS-PAGE에서는, 분자량 13±2kDa,
·N 말단 서열에 서열 번호 3의 1위치 내지 11위치의 아미노산 서열을 갖고,
·서열 번호 2에 기재된 16아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 항원으로 하여 제작한 항체에 특이적으로 결합한다.
즉, 본 발명에 있어서, 프레세프신이란, 특별히 설명하지 않는 한, 인간 프레세프신이다.
또한, 본 발명에 있어서는, 프레세프신으로서, 프레세프신 표준품(WO2005/108429의 실시예 16에 기재된 rsCD14-ST)뿐만 아니라, rsCD14ST-Fc(실시예 9-(2)에 기재) 등, 프레세프신으로서의 활성을 갖는 물질이 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 「특이적으로 인식하는 항체」란, 특이적으로 인식하는 대상을 면역학적으로 인식하는 항체 및/또는 특이적으로 인식하는 대상과 통상의 항원 항체 반응을 나타내는 항체이다. 특이적으로 인식하는 대상과 당해 항체와의 결합을 친화성으로서 나타냈을 경우, 통상, 평형 해리 상수(KD)는 10-7M 미만이다. 본 발명의 항체는 프레세프신만을 특이적으로 인식한다. 인간 혈중에 존재하는 주요한 가용형 CD14에는, 약 55kDa 및 약 49kDa의 가용형 CD14(고분자량 sCD14)가 있다. 본 발명의 항체는 고분자량 sCD14와 특이적으로는 결합하지 않는다. 고분자량 sCD14는, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 인간 전장 가용형 CD14를 사용할 수도 있고, 또한 예를 들어 정상인의 체액의 3C10 항체 어피니티 칼럼 흡착에 의해 제작할 수도 있다(WO2005/108429 실시예 23 참조).
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 프레세프신과의 반응성이 우수하여, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 사용하여 샌드위치 ELISA계를 구축하여, 검체 중의 프레세프신을 측정할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 F1146-17-2(WO2004/044005의 실시예 2에 기재된 래트 유래 모노클로날 항체)와 비교하여, 샌드위치 ELISA계에 있어서 프레세프신과의 반응성이 약 1만배 향상된 것으로부터(실시예 4), 검체 중의 미량의 프레세프신 검출에 적합하다. 즉, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 F1146-17-2와 비교하여, 프레세프신과의 반응성이, 프레세프신의 농도비로 1만배 이상 향상되는 것으로 특징지어져도 된다.
패혈증 환자에서는, 특징적으로 프레세프신 혈중 농도가 상승하는 것이 보고되어 있어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 패혈증의 검출을 위하여 바람직하게 사용된다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 본 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 구축하고, 패혈증 환자 검체와 정상인 검체를 측정했을 때, 프레세프신 측정값에 차가 보이는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이 바람직하다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 측정계를 구축하여 검체 중의 프레세프신을 측정할 때, 검체 중의 간섭 물질의 영향이 문제가 안 될 정도인 항체가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 간섭 물질이란, 그 물질의 존재가, 프레세프신의 측정값에 영향을 줄(이하, 간섭이라고도 한다) 가능성이 있는 물질을 말하며, 예를 들어 트리글리세라이드(Triglycerides: TG라고도 한다), 빌리루빈, 헤모글로빈, 류머티즘 인자, 콜레스테롤 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 항체의 평가를 위하여 바람직한 간섭 물질은 트리글리세라이드(TG)이다.
간섭 시험의 평가 지표의 하나로서, 간섭 물질 무첨가의 검체의 프레세프신 측정값에 대한, 동 검체에 간섭 물질을 일정량 첨가했을 때의 프레세프신 측정값의 어긋남을 해리도(％)로서 나타내어, 사용할 수 있다. 간섭 물질 첨가에 의한 측정값의 해리도는 다음과 같이 나타낸다.
해리도(％)={(간섭 물질 첨가 후의 프레세프신 측정값)-(간섭 물질 무첨가의 프레세프신 측정값)}/(간섭 물질 무첨가의 프레세프신 측정값)×100
간섭 물질의 영향이 문제가 안 될 정도란, 예를 들어 복수의 검체를 사용한 간섭 시험에 있어서, 일정량의 간섭 물질 첨가에 의한 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하, 보다 바람직하게는 ±10％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 높은 것으로 나타낼 수 있다. 복수의 검체 중의 「검체의 비율이 높다」란, 통상, 복수의 검체 중의 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상이다.
TG의 간섭 시험에서는, 예를 들어 복수의 검체에 대하여 간섭 시험을 행하고, TG 첨가에 의해 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하, 보다 바람직하게는 ±10％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 높은 것을 하나의 지표로 할 수도 있다. 본 발명의 항체의 바람직한 형태의 하나는, 당해 항체를 사용한 측정계에 의해 TG 간섭 시험을 실시할 때, 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하, 보다 바람직하게는 ±10％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 높은 항체이다.
또는, 예를 들어 검체 중의 TG 농도 20mg/mL인 때의 프레세프신 측정값의 해리도를, 복수의 검체에서 구하고, 그 해리도의 평균값이 ±20％ 이하, 보다 바람직하게는 ±10％ 이하인 것을 하나의 지표로 할 수도 있다. 본 발명의 항체의 바람직한 형태의 하나는, 당해 항체를 사용한 측정계에 의해, 복수의 검체에 대하여 TG 간섭 시험을 실시할 때, 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의 프레세프신 측정값의 해리도의 평균값이 ±20％ 이하, 보다 바람직하게는 ±10％ 이하를 나타내는 항체이다.
미국의 지질 이상증의 가이드 라인인 NCEP-ATPIII에서는, TG 150mg/dL 미만은 정상, TG 150 내지 200mg/dL이 경계, TG 200 내지 499mg/dL은 높은 값(high), 500mg/dL 이상은 현저하게 높은 값(very high)으로 되어 있다. 검체 중의 TG 농도 20mg/mL(=2000mg/dL)는 상기 기준에 비추면, 극히 TG 농도가 높은 상태라고 할 수 있다.
본 실시예에 있어서의 TG 간섭 시험은 검체의 TG 농도 6.7mg/mL, 13.3mg/mL, 20mg/mL의 3점에서, 프레세프신 측정값의 해리도를 측정하고 있다. 검체의 TG 농도 20mg/mL인 때에 해리도가 작은 항체(측정계)는 해리도가 큰 항체와 비교하여, 검체의 TG 농도 6.7mg/mL 및 13.3mg/mL인 때에도 해리도가 작은 경향이 보였다.
TG 간섭 시험은, 정상인의 인간 혈청을 사용하여 실시될 수도 있다. 정상인의 검체는 프레세프신 농도가 낮기 때문에, TG 간섭을 받으면, 측정값의 해리도가 커지기 쉽다. 본 시험에 의해, 검체 중의 미량의 프레세프신을 고정밀도로 측정할 수 있을지를 시험할 수 있다. 예를 들어, 검체 중의 TG 농도 10mg/mL인 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±100％ 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 ±70％ 이하, 더욱 바람직하게는 ±50％ 이하, 특히 바람직하게는 ±20％ 이하이다. 상기 시험과 마찬가지로, 복수 검체를 사용하여 시험을 행하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편은 당해 항체의 간섭 물질 첨가에 의한 프레세프신 측정값의 해리도와 S68 항체의 동 조건 하의 해리도와의 비교에 의해 평가될 수도 있다. 바람직한 형태의 하나에서는, 본 발명의 항체와 S68 항체에 있어서, 당해 해리도는 유사하다.
TG의 간섭 시험에 대해서는, 예를 들어 본 발명의 항체를 사용한 측정계에 있어서, TG 첨가에 의해 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의 프레세프신 측정값의 해리도와, S68 항체의 동일한 조건에서의 해리도의 차가 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 높은 것으로 평가될 수도 있다. 해리도의 차는, 예를 들어 본 발명의 항체에 의한 측정값의 해리도가 +5％, S68 항체에 의한 측정값의 해리도가 -10％일 때, 해리도의 차는 15％로 계산하였다.
간섭 시험에 사용하는 검체는, 본 발명의 제2 형태에 기재된 검체를 사용할 수 있다. TG 간섭 시험의 경우에는 바람직하게는, 혈청 또는 혈장이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 측정계를 구축하고, 검체 중의 프레세프신을 측정할 때, S68 항체를 사용한 측정값과의 상관이 좋은 항체가 바람직하다. 상관이 좋다란, 바람직하게는, 상관 계수가 0.9 이상이며, 보다 바람직하게는, 0.95 이상이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 프레세프신에 대하여 특이적으로 결합하고, 프레세프신에 대한 친화성(평형 해리 상수, KD값)은 10-7M 미만인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 10-9M 미만, 특히 바람직하게는 10-10M 미만, 가장 바람직하게는 10-11M 이하이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 프레세프신에 대한 평형 해리 상수는 바람직하게는 10-7M 내지 10-14M, 보다 바람직하게는 10-8M 내지 10-13M의 범위이다. 프레세프신은 rsCD14ST-Fc가 사용될 수도 있다.
친화성(평형 해리 상수, KD값)은 예를 들어, BIACORE(GE 헬스케어)를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태의 하나는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 프레세프신에 대한 친화성(KD값)은 S68 항체의 프레세프신에 대한 친화성과 비교하여 우수하다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 rsCD14ST-Fc(프레세프신: 실시예 9-(2)에 기재)에 대한 친화성(KD값)은 S68 항체의 rsCD14ST-Fc에 대한 친화성(KD값)의 1.08E-08과 동일 정도이거나, 더 낮은 수치를 나타내는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 S68 항체의 KD값의 1/2(5.40E-09) 이하, 더욱 바람직하게는 S68 항체의 KD값의 1/10(1.08E-09) 이하를 나타내는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 형태의 하나는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 프레세프신에 대한 결합 활성은 S68 항체와 비교하여 우수하다.
예를 들어, 실시예 10-(2)에 기재한 바와 같이, rsCD14ST-Fc(프레세프신)을 고상으로 고정하여 항체와 반응시키고, 흡광도 등에 의해, 항체의 프레세프신에 대한 결합 활성을 평가할 수도 있다.
예를 들어, 실시예 10에 준하여 시험을 실시하고, S68 항체와 rsCD14ST-Fc를 반응시켰을 때의 흡광도를 1로 했을 때의, 본 발명의 항체와 rsCD14ST-Fc를 반응시켰을 때의 흡광도의 비는 바람직하게는 1 이상이며, 보다 바람직하게는 2 이상, 더욱 바람직하게는 4 이상, 특히 바람직하게는 5.5 이상이다.
본 발명은 이하의 어느 하나에 기재된 항체를 제공한다.
이들은 항프레세프신 항체이다. 이하의 (a) (b) (c)의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 프레세프신 상의, 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식하기 때문에, 제1 형태에 있어서의 바람직한 예이다. 보다 바람직하게는, (a) 또는 (b)의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
(c) 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
또한, 본 발명은 도 2 내지 도 2b에 기재된 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 제공한다. 이들 항체는 프레세프신 상의 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 보다 바람직하게는 5793, 5810, 5864, 5979, 5983, 5988, 6028의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편이다.
본 발명은 이하의 어느 하나에 기재된 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 보다 바람직하게는, (i) (ii) (iv) 또는 (v)의 폴리펩티드이다.
(i) 서열 번호 4의 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 5의 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 6의 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 폴리펩티드.
(ii) 서열 번호 7의 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 9의 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 폴리펩티드.
(iii) 서열 번호 10의 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 11의 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 12의 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 폴리펩티드.
(iv) 서열 번호 19의 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 20의 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 21의 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 폴리펩티드.
(v) 서열 번호 22의 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 폴리펩티드.
(vi) 서열 번호 25의 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 26의 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 27의 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 폴리펩티드.
또한, 본 발명은 도 2 내지 도 2b에 기재된 서열로 이루어지는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 도 2 내지 도 2b에 기재된 서열로 이루어지는 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 바람직하게는, 서열 번호 7의 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 서열로 이루어지는 VH CDR2 및 서열 번호 94의 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 폴리펩티드(5793), 또는 서열 번호 7의 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 97의 서열로 이루어지는 VH CDR2 및 서열 번호 9의 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 폴리펩티드이다(5810).
본 발명은 이하의 어느 하나에 기재된 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 보다 바람직하게는, (i) (ii) (iv) 또는 (v)를 포함하는 폴리펩티드이다.
(i) 서열 번호 4의 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 5의 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 6의 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH).
(ii) 서열 번호 7의 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 9의 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VH.
(iii) 서열 번호 10의 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 11의 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 12의 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VH.
(iv) 서열 번호 19의 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 21의 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
(v) 서열 번호 22의 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 23의 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 24의 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VL.
(vi) 서열 번호 25의 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 26의 서열로 이루어지는 CDR2, 서열 번호 27의 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 VL.
또한, 본 발명은 도 2 내지 도 2b에 기재된 서열로 이루어지는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 도 2 내지 도 2b에 기재된 서열로 이루어지는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리펩티드는, 프레세프신에의 결합 활성을 갖는 항원 결합 물질인 것이 바람직하다.
상술한 항체 또는 폴리펩티드는, CDR 서열에 있어서, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등(치환 등이라고 한다)이 되어 있을 수도 있다. 1개 또는 복수의 아미노산이 치환 등이 된 후의 항체 또는 폴리펩티드는, 항원과의 결합 활성, 프레세프신 측정 시의 특징 등에 대해서, 치환 등을 행하기 전과 동등한 활성 또는 성능을 갖고 있는 것이 바람직하다. 여기서, 치환 등을 행하기 전과 동등한 활성 또는 성능을 갖는 치환 등이 된 후의 항체 또는 폴리펩티드에는, 공지된 유전공학적 방법에 의해 인공적으로 개변한 변이체, 천연으로 발생한 변이체(소위 대립유전자 변이체)의 모두가 포함되어 있다. 치환 등이 되는 아미노산의 수가 복수인 것은, 1보다 많은 수라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개의 CDR에 대하여 3아미노산 이내, 더욱 바람직하게는 2아미노산 이내, 보다 바람직하게는 1아미노산이다. 어떤 실시 형태에서는, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는, 상기와 같이 서열 번호로 특정되는 CDR의 아미노산 서열에 대하여 90％ 이상의 동일성을 나타내는 CDR 서열을 가질 수도 있다. 그 동일성은 92％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 또는 99％ 이상일 수도 있다. 이러한 항체 또는 폴리펩티드는, 서열 번호로 특정되는 CDR산 서열을 갖는 항체 또는 폴리펩티드와 동등한 활성 또는 성능을 갖고 있는 것이 바람직하다.
CDR과 연결되는 항체의 프레임워크 영역(framework region: FR)은 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 본 발명의 가변 영역에 사용되는 FR은 특별히 한정되지 않고 어떠한 FR이 사용되어도 된다. 필요에 따라, CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록, FR의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등이 되어 있을 수도 있다. 어떤 실시 형태에서는, FR은 각 서열 번호로 나타내지는 아미노산 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수도 있다. 그 동일성은 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 또는 99％ 이상일 수도 있다. 예를 들어, 아미노산을 치환한 FR을 사용한 항체의 항원에의 결합 활성을 측정하여 평가함으로써, 원하는 성질을 갖는 변이 FR 서열을 선택할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 항체의 FR 영역은 데이터베이스(예를 들어, GenBank) 등으로부터 얻어지는 공지된 FR(아미노산 서열로서는, 예를 들어 AAO 06511.1, AAT 02391.1, AAG 13973.1, AGT 29816.1 등, 염기 서열로서는, 예를 들어 AY 596429.1, AY 171772.1, KC 020056.1, AF 294966.1 등), 본 발명에서 얻어진 항체의 FR 등을 사용할 수 있다. 당업자는 기술 상식에 기초하여 바람직한 FR을 선택할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직하게 사용되는 항체의 FR은, 예를 들어 서열 번호 48 내지 84의 FR을 들 수 있다. 이들은 데이터베이스 등에서 얻어지는 FR, 또는 본 발명에서 얻어진 항체의 FR이다. 본 발명의 항체에는, 여러 가지 동물 유래의 FR이 이용 가능한데, 특히 토끼 유래의 항체의 FR이 바람직하다. 그 중에서도, 서열 번호 64 내지 84가 바람직하고, 보다 바람직하게는 서열 번호 65 또는 66, 서열 번호 68 또는 69, 서열 번호 71 또는 72, 서열 번호 73, 서열 번호 75 또는 76, 서열 번호 78 또는 79, 서열 번호 81, 82 또는 83, 서열 번호 84의 FR이다.
어떤 실시 형태에서는, 본 발명의 항체 가변 영역의 바람직한 예는 이하와 같다.
(1) (i) 도 2 내지 도 2b에 기재된 개변체의 중쇄 CDR 서열(예를 들어, 항체 5810의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3) 및 서열 번호 64, 서열 번호 67, 서열 번호 70 및 서열 번호 73의 서열을 포함하는 FR을 갖는 중쇄 가변 영역;
(ii) 도 2 내지 도 2b에 기재된 개변체의 경쇄 CDR 서열(예를 들어, 항체 5810의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3) 및 서열 번호 74, 서열 번호 77, 서열 번호 80, 및 서열 번호 84의 서열을 포함하는 FR을 갖는 경쇄 가변 영역.
(2) (i) F1466-5, F1466-26, 또는 F1466-16의 중쇄 CDR 서열(예를 들어, F1466-26의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3), 및 서열 번호 64, 서열 번호 67, 서열 번호 70, 및 서열 번호 73의 서열을 포함하는 FR을 갖는 중쇄 가변 영역;
(ii) F1466-5, F1466-26, 또는 F1466-16의 경쇄 CDR 서열(예를 들어, F1466-26의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3), 및 서열 번호 74, 서열 번호 77, 서열 번호 80, 및 서열 번호 84의 서열을 포함하는 FR을 갖는 경쇄 가변 영역.
(3) (i) 도 2 내지 도 2b에 기재된 개변체의 중쇄 CDR 서열(예를 들어, 항체 5810의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3) 및 서열 번호 65(또는 66), 서열 번호 68(또는 69), 서열 번호 71(또는 72), 및 서열 번호 73을 포함하는 FR을 갖는 중쇄 가변 영역;
(ii) 도 2 내지 도 2b에 기재된 개변체의 경쇄 CDR 서열(예를 들어, 항체 5810의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3) 및 서열 번호 75(또는 76), 서열 번호 78(또는 79), 서열 번호 81(또는 82 또는 83), 및 서열 번호 84를 포함하는 FR을 갖는 경쇄 가변 영역.
(4) (i) F1466-5, F1466-26, 또는 F1466-16의 중쇄 CDR 서열(예를 들어, F1466-26의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3), 및 서열 번호 65(또는 66), 서열 번호 68(또는 69), 서열 번호 71(또는 72), 및 서열 번호 73을 포함하는 FR을 갖는 중쇄 가변 영역;
(ii) F1466-5, F1466-26, 또는 F1466-16의 경쇄 CDR 서열(예를 들어, F1466-26의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3), 및 서열 번호 75(또는 76), 서열 번호 78(또는 79), 서열 번호 81(또는 82 또는 83), 및 서열 번호 84를 포함하는 FR을 갖는 경쇄 가변 영역.
가변 영역은 1개 또는 복수(예를 들어 5아미노산 이내, 바람직하게는 3아미노산 이내)의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있을 수도 있다. 1개 또는 복수의 아미노산이 치환 등이 된 후의 항체 또는 폴리펩티드는, 항원과의 결합 활성, 프레세프신 측정 시의 특징 등에 대해서, 치환 등을 행하기 전과 동등한 활성 또는 성능을 갖고 있는 것이 바람직하다. 어떤 실시 형태에서는, 가변 영역이 상기와 같이 아미노산 서열로 특정되는 경우, 가변 영역은 서열 번호에 의해 특정된 서열에 대하여 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수도 있다. 그 동일성은 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 또는 99％ 이상일 수도 있다. 이러한 가변 영역은, 서열 번호에 의해 특정된 가변 영역과 동등한 활성 또는 성능을 갖고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체에서 사용되는 정상 영역은 특별히 한정되지 않고 어떠한 정상 영역이 사용되어도 된다. 본 발명의 항체에서 사용되는 정상 영역의 바람직한 예로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 인간 유래의 IgG의 정상 영역 등을 사용할 수 있다. 정상 영역은 항원과의 결합 활성, 프레세프신 측정 시의 특징 등에 영향을 주지 않는 범위에서, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입될 수도 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이며, 즉, 항프레세프신 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 단일 클론의 항체 산생 세포가 분비되는 항체이다. 모노클로날 항체는 폴리클로날 항체와 비교하여, 균일한 항원 특이성을 갖는, 고역가의 항체가 얻어지는 등의 특성을 갖는다. 이론적으로는, 모노클로날 항체는 폴리클로날 항체와 비교하여, 항원 측정에 필요한 항체 중량이 적어도 된다는 이점이 있다. 본 명세서에 있어서의 「항체」라는 말은, 「항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편」의 의미로 사용되는 경우가 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 바람직하게는, 서열 번호 2에 기재된 S68 펩티드를 투여 항원으로 하여 제작된다. 본 발명의 모노클로날 항체는 예를 들어, S68 펩티드를 동물에 면역하고, 면역된 동물의 항체 산생 세포와 미엘로마 세포로 하이브리도마를 제작하고, 계속하여 단일 세포화한 하이브리도마를 선택하고, 이것을 배양하고, 배양 상청을 정제함으로써 얻을 수 있다.
항체가 유래하는 동물종은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 토끼이다. 즉, 본 발명의 항체는 바람직하게는, 토끼 유래 항프레세프신 모노클로날 항체(토끼 항프레세프신 모노클로날 항체라고도 한다)이다.
미엘로마 세포는, 공지된 여러 가지의 세포가 사용 가능하다. 예를 들어, 인간 유래의 SKO-007, 인간 마우스 헤테로미엘로마의 SHM-D33, 마우스 유래의 P3, NS-1, P3U1, SP2/0, 래트 유래의 YB2/0, Y3-Ag1, 2, 3 등을 들 수 있다. 토끼 유래 불사화(不死化) B 임파구 등이 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서는 바람직하게는, 토끼 비(脾)세포와 토끼 유래 불사화 B 임파구와의 융합에 의해 토끼-토끼 하이브리도마, 또는 불사화한 마우스 세포주 유래의 세포와의 융합에 의해 토끼-마우스 하이브리도마를 제작할 수도 있다.
항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 융합은 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 융합 촉진제로서는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스 등을 사용할 수 있다. 세포 융합에 사용하는 배양액은, 예를 들어 RPMI1640 배양액, MEM 배양액 등을 사용할 수 있다.
융합에 의해 형성된 하이브리도마는 수일 내지 3주일 정도 배양되고, 예를 들어 히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 포함하는 배지(HAT 배지) 등의 선택 배지를 사용하여 미융합 세포와 분리한다. 얻어진 하이브리도마는, 그의 산생하는 항체에 의해 또한 선택된다. 선택한 하이브리도마를 공지된 한계 희석법에 따라서 단일 클론화하고, 항체 산생 하이브리도마로서 수립한다.
항체의 정제는, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피(단백질 A 칼럼, 단백질 G 칼럼 등), 염석법, 알코올 침전법, 등전점 침전법, 전기 영동법, 원심 분리, 겔 여과법 등의 공지된 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 당업자가 사용할 수 있는 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작할 수도 있다. 예를 들어, 얻어진 항프레세프신 항체의 서열을 기초로, 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주로 발현시킬 수 있다.
항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 구축은, 예를 들어 본 발명의 항체를 산생하는 하이브리도마로부터 mRNA를 추출하여, cDNA를 합성할 수 있다. 이들은 시판되고 있는 키트 등을 사용하여 실시 가능하다.
또한, 당업자가 사용할 수 있는 유전자 재조합 기술을 사용하여, 항프레세프신 항체의 서열을 기초로, 그 서열의 일부를 개변한 항체를 제작할 수도 있다. 목적으로 하는 서열을 포함하는 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에서 발현시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않지만, 항체 유전자의 발현에 적합한 벡터 및/또는 발현 벡터가 바람직하다. 예를 들어, EF-1α 프로모터 및/또는 CMV 인핸서를 함유하는 벡터 등을 들 수 있다.
벡터로서, 대장균 유래의 플라스미드(예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드(예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드(예, pSH19, pSH15), λ파지 등의 박테리오파지, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스 등의 바이러스 등이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 프로모터는, 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터라면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, 숙주가 동물 세포일 경우에는, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, EF1α 프로모터 등을 사용할 수 있다.
벡터는, 필요에 따라, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리A 부가 시그널, 선택 마커, SV40 복제 오리진 등을 함유할 수 있다.
선택 마커로서는, 예를 들어 디히드로 엽산 환원 효소(dhfr), 메토트렉세이트(MTX) 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 숙주 세포는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 세균 세포(대장균 등), 효모, 양서류 세포(아메리카 발톱 개구리 난모세포 등), 곤충 또는 곤충 세포(sf9 등), 동물 세포 등이 사용된다. 동물 세포로서는, 예를 들어 COS-1 세포, COS-7 세포, CHO 세포, DHFR 유전자 결손 CHO 세포(dhfr-CHO 세포), 마우스 3T3 세포, 인간 HEK293 세포, 미엘로마 세포 등이 사용된다.
발현 벡터의 숙주 세포에의 도입 방법은 공지된 방법에 의해 실시 가능하고, 예를 들어 리포펙션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 미세 주입법 등을 들 수 있다.
발현 벡터의 숙주 세포에의 도입 후, 각 숙주 세포에 적합한 배양 배지에서 세포를 배양한다. 예를 들어, 동물 세포라면, RPMI1640 배지, GIT 배지 등의 동물 세포 배양용 배지, 또는 이들에 FCS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환 세포를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 항체를 발현 축적할 수 있다. 배양 상청 중의 항체의 정제는, 상기에 기재한 방법을 사용할 수 있다. 또한, 항체의 발현량 및 항원 항체 활성은 ELISA 등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편은 파지 디스플레이법을 사용하여 제작될 수도 있다. 파지 디스플레이법에 의한 항체 취득은 당업자가 사용할 수 있는 기술에 의해 실시할 수 있다(CARLOS F.BARBAS 등 Phage Display: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 등 참조). 예를 들어, 본 발명의 실시예 11에 기재된 방법을 사용할 수 있다. S68 펩티드를 동물에 면역하여 얻어진 비장 임파구로부터 유전자를 취득하여 파지미드 벡터 등과 연결하는 등을 하고, 그 후에는 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다.
또한, 특정한 CDR(예를 들어, VH CDR3)의 서열만 변경한 개변체를 제작하기 위해서, 파지 디스플레이법을 사용하는 것도 가능하다. 이것도 주형으로 하는 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 플라스미드와 특정한 프라이머를 사용하여, 당업자가 사용할 수 있는 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 실시예 12에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 항원 결합성 항체 단편으로서는, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv), sc(Fv)2, CDR을 포함하는 폴리펩티드, 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 어느 항체 단편이든, 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 인식하는 본 발명의 항체와 동일한 항원 결합성을 갖고 있다. 이 항체 단편은 당업자가 사용할 수 있는 유전자 재조합 기술 등을 사용하여 제작할 수 있다.
Fab는, IgG를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합으로 결합한 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는, IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab가 힌지 영역의 디술피드 결합을 통하여 결합된 것이다.
Fab'은, F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단하여 얻어지는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab'은, F(ab')2를 환원제 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 적당한 펩티드 링커로 연결한 폴리펩티드이며, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
diabody는, scFv가 이량화하여, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 당해 시스테인 잔기 간의 디술피드 결합을 통하여 결합시킨 것을 말한다.
sc(Fv)2는, 2개의 VH 및 2개의 VL을 링커 등으로 결합하여 단일쇄로 한 항원 단편이다. sc(Fv)2는, 예를 들어 scFv를 링커로 결합함으로써 제작할 수 있다.
CDR을 포함하는 폴리펩티드는, 바람직한 형태는 전술한 바와 같으며, 항원 결합 활성을 갖는 단편이다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 링커를 통하여 결합시킬 수 있다.
중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명에 있어서, 링커는 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직한 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고 목적에 따라 적절히 선택하는 것이 가능한데, 통상, 1 내지 100아미노산, 바람직하게는 3 내지 50아미노산, 보다 바람직하게는 5 내지 20아미노산이다. 4개의 항체 가변 영역을 결합하는 경우에는, 통상, 3개의 링커가 필요하게 된다. 복수의 링커는 동일할 수도 있고, 서로 다른 링커를 사용할 수도 있다.
본 발명의 항체에는, 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다. 키메라 항체는 2종류 또는 그 이상의 종(種)이 상이한 항체 분자의 일부씩을 조합하여 제작된 항체 분자이다. 본 발명에 있어서 바람직한 키메라 항체는 본 발명의 토끼 모노클로날 항체 유래의 가변 영역 및 다른 종(예를 들어 인간)의 정상 영역을 갖는 항체이다. 인간화 항체는 비인간종으로부터의 CDR을 인간 항체에 이식한 항체이다. 키메라 항체 및 인간화 항체는 통상법에 따라 제작할 수 있다.
본 발명의 항체에는, 본 발명의 아미노산 서열에 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 항체도 포함된다. 또한, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드가 융합한 융합 단백질도 포함된다. 융합 단백질의 제작은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제작하는 것이 가능하고, 예를 들어 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현 벡터에 도입하고, 숙주에서 발현시킬 수 있다. 본 발명의 항체와의 결합에 사용되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 FLAG, 6개의 His(히스티딘) 잔기로 이루어지는 6×His, 폴리히스티딘 세그먼트, 인플루엔자 응집소(HA), T7-tag, HSV-tag, GST(글루타티온-S-트랜스퍼라아제), 이뮤노글로블린 정상 영역(Fc 영역), β-갈락토시다아제, 말토오스 결합성 단백질 등을 들 수 있다.
2. 프레세프신의 측정 방법
본 발명의 제2 형태는, 적어도 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 프레세프신을 면역학적으로 측정하는 방법이며, 적어도 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편과 프레세프신을 함유하는 검체를 접촉시키는 공정을 포함한다. 본 발명에 있어서 「측정」이란 말은, 「검출」 「정량」 「검정」 등의 말과 서로 변환하여 사용할 수 있고, 정량적 및 정성적인 결정을 포함하는 의미로 사용된다. 프레세프신의 측정은 바람직하게는, in vitro로 행한다.
프레세프신은 패혈증의 검출에 사용되는 마커로서 알려져 있기 때문에, 이 방법은 적어도 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편과 프레세프신을 함유하는 검체를 접촉시키는 공정을 포함하는, 패혈증을 검출하기 위한 방법이라고 할 수도 있다.
즉, 적어도, 1) 본 발명의 항체를 사용하여, 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도를 측정하는 공정, 및 2) 1)에서 얻어진 프레세프신 농도가 컷오프값과 비교하여 높은 값인지의 여부를 판정하는 공정을 포함하는, 패혈증을 검출하는 방법, 또는 패혈증의 검출 또는 진단을 보조하기 위한 방법이라고 할 수도 있다. 이때의 컷오프값은 314 내지 600pg/mL이며, 바람직하게는 400 내지 580pg/mL, 보다 바람직하게는 450 내지 550pg/mL, 더욱 바람직하게는 500pg/mL이다.
본 발명에 있어서, 「질환의 검출」은 「질환의 검출의 보조」 또는 「질환의 진단의 보조」로 표현을 바꾸어 사용될 수도 있다.
또한, 항체 또는 항원 결합성 항체 단편은 예를 들어 패혈증과 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)의 판별, 패혈증의 중증화의 리스크 평가, 패혈증의 예후 예측(사망률 예측), 패혈증의 중증도 평가, 수술후 감염증의 검출, 파종성 혈관내 응고 증후군(disseminated intravascular coagulation, DIC)의 검출, 감염성 DIC의 검출, 심질환의 검출, 세균 감염을 수반하는 호흡기 감염증의 검출, 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대장염)의 검출, 발열성 호중구 감소증(febrile neutropenia, FN)의 검출, 혈구 탐식 증후군(hemophagocytic syndrome, HPS)의 검출 및 식세포의 기능 평가로부터 선택되는 적어도 하나의 질환의 검출 또는 평가를 위하여 사용할 수 있다.
수술후 감염증은 수술후에 발병한 감염증을 총칭하고, 수술 및 그것에 필요한 보조 요법에 의한 모든 감염증을 의미한다. 또한, 수술후 감염증은 Guideline for prevention of surgical site infection, 1999(CDC)에 기초하여 수술후 감염증으로 진단되는 질환 모두를 포함하는 것이다.
심질환으로서는, 예를 들어 급성관증후군(ACS), 급성 심부전, 급성 비대상성 심부전(ADHF), 만성 심부전, 관동맥 질환, 협심증, 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중 및 일과성 뇌허혈발작을 들 수 있다.
세균 감염을 수반하는 호흡기 감염증으로서는, 하기도 감염증 또는 폐렴을 들 수 있다. 하기도 감염증에는 급성 하기도 감염증과 만성 하기도 감염증이 포함된다. 급성 하기도 감염증에는 급성 기관염, 급성 기관지염, 급성 세기관지염이 포함되고, 대부분은 상기도에의 바이러스 감염이 하기도에 파급됨으로써 발병하는데, 일부에서 세균에 의한 2차 감염이 속발한다. 세균 2차 감염의 징후가 보인 경우에는 항생제 투여의 적응이 된다. 만성 하기도 감염증은, 기관지 확장증이나 만성 폐색성 폐질환 등에서 기질적 장애를 갖는 하기도에 세균의 지속적인 감염이 성립된 병태이며, 지속 감염과 급성 증오가 존재한다. 하기도의 기질적 장애를 발생시키는 질환에는, 기관지 확장증, 만성 폐색성 폐질환, 만성 기관지염, 미만성 범세기관지염, 진구성 폐결핵, 진폐, 비결핵성 항산균증, 알레르기성 기관지 폐아스페르길루스증, 폐섬유증, 만성 기관지 천식 등이 포함된다. 지속 감염, 급성 증오 모두 항생제 투여의 적응이 된다. 폐렴에는 시중 폐렴, 원내 폐렴이 포함된다. 바람직하게는 시중 폐렴이다.
식세포의 기능 평가로서는, (a) 호중구, 과립구 및/또는 백혈구의 탐식능의 측정, (b) 호중구, 과립구 및/또는 백혈구의 탐식능을 측정하는 것에 의한, 면역 기능의 평가, (c) 자가 세포 이식 또는 타가 세포 이식 시의 이식용 세포의 품질 평가, 및 (d) 식세포에 의한 탐식이 관련하는 질환의 검출 등을 들 수 있다. 식세포에 의한 탐식이 관련하는 질환으로서는, 예를 들어 자기 면역 질환, 관절 류머티즘, 유방염, 통풍, 사구체 신장염, 궤양성 대장염, 지중해열, 중이염, 비염, 폐렴, 결핵, 방광염, 양수 감염증, 및 농정액증을 들 수 있다. 식세포에 의한 탐식이 관련하는 질환을 검출할 때에 사용하는 검체로서는, 조직액, 림프액, 관절액, 유즙, 뇌척수액, 고름, 타액, 눈물, 점액, 콧물, 담, 오줌, 복수, 양수, 정액 등의 체액, 또한 비강, 기관지, 폐, 피부, 복강, 각종 장기, 관절, 뼈 등을 세정한 후의 세정액을 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 프레세프신을 면역학적으로 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 효소 면역 측정법(이하, EIA 또는 ELISA라고도 기재한다), 화학 발광 효소 면역 측정법(CLEIA), 화학 발광 면역 측정법(CLIA), 형광 항체법(FAT), 형광 효소 면역 측정법(FEIA), 전기 화학 발광 면역 측정법(ECLIA), 방사 면역 측정법(RIA), 면역 크로마토그래피법, 응집법, 경합법 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, 직접법과 간접법 중 어느 것이 사용되어도 된다. 비오틴-아비딘(스트렙트아비딘) 복합체를 형성시켜서 검출하는 증감법이 사용될 수도 있다.
EIA는 효소 표지 항체를 사용한 면역 측정법의 하나이며, 직접법, 간접법 등을 들 수 있다. 바람직한 예로서는, 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)이다.
샌드위치 ELISA란, 항원 인식 부위가 서로 다른 2종류 이상의 항체를 사용하여, 미리 한쪽의 항체는 고상으로 고정하고, 검출하고자 하는 항원을 2종류의 항체 사이에 끼워서, 항체-항원-항체 복합체를 형성시킴으로써 측정하는 방법이다.
화학 발광 효소 면역 측정법(CLEIA: Chemiluminescent Enzyme Immunoassay)은 검체 중의 항원과, 자성 입자나 비즈 등으로 고상으로 한 항체를 반응시킨 후, 효소 표지 항체를 반응시켜, 세정(B/F 분리) 후, 화학 발광 기질을 첨가하여 효소 반응 후, 발광 강도를 측정하는 방법이다.
예를 들어, 검체 중의 항원과 비오틴을 결합시킨 항체를 액상에서 반응시키고, 스트렙트아비딘을 결합시킨 자성 입자에 항체를 트랩하고, 세정(B/F 분리) 후, 효소 표지 항체를 반응시켜, 상기와 동일한 처리를 행할 수도 있다.
표지 효소로서 알칼리포스파타아제(ALP)를 사용할 때, 화학 발광 기질은 CDP-Star™, AMPPD(R), CSPD(R)가 사용되는 것이 바람직하다. 표지 효소가 HRP인 때는, 화학 발광 기질은 루미놀이 사용되는 것이 바람직하다.
검출 감도는, 일반적으로, 화학 발광>형광>흡광(정색)의 순서로 높다고 되어 있으며, 구하는 감도에 따라서 측정법을 선택할 수 있다.
화학 발광 면역 측정법(CLIA: Chemiluminescent Immunoassay)은 검체 중의 항원과 자성 입자 등으로 고상으로 한 항체를 반응시킨 후, 화학 발광 물질로 표지한 항체를 반응시키고, 세정(B/F 분리) 후, 발광 강도를 측정하는 방법이다. 표지 물질은 아크리디늄 등이 사용된다.
형광 효소 면역 측정법(FEIA: Fluorescent Enzyme Immunoassay)은 검체 중의 항원과 고상화한 항체를 반응시킨 후, 효소 표지 항체를 반응시키고, 세정(B/F 분리) 후, 형광 기질을 첨가하여 효소 반응 후, 형광 강도를 측정하는 방법이다. 표지 효소에는, HRP나 ALP 등이 사용된다. 형광 기질은, 표지 효소가 HRP인 때는, Amplex(R) Red 등이 사용되고, 표지 효소가 ALP인 때는, 4-MUP(4-Methylumbelliphenyl phosphate), AttoPhos(R) 등이 사용되는 것이 바람직하다.
전기 화학 발광 면역 측정법(ECLIA: Electro Chemiluminescence Immunoassay)은 검체 중의 항원과 자성 입자로 고상으로 한 항체 및 전기 화학 발광 물질로 표지한 항체를 반응시킨 후, 세정(B/F 분리)하고, 전기 에너지에 의한 발광 강도를 측정하는 방법이다. 표지 물질에는 루테늄 등이 사용된다. 표지 물질에는, Ru(bpy)3 등이 사용되고, 전극에의 하전에 의한 산화와, 트리프로필아민(TPA) 등에 의한 환원 반응에 의해 여기 발광을 반복한다.
방사 면역 측정법(RIA: Radioimmunoassay)은 방사성 동위 원소에 의한 표지체를 사용한 측정 방법이다. 예를 들어, 검체 중의 항원과 비즈 등으로 고상으로 한 항체를 반응시킨 후, 방사성 동위 원소(125I 등)로 표지한 항체를 반응시키고, 세정(B/F 분리) 후, 125I의 방사선량을 측정할 수 있다.
면역 크로마토그래피법은 피검체가 시험 스트립 상을 시약을 용해하면서 이동하는 모세관 현상을 응용한 면역 측정법이다. 검체 중의 항원이, 시험 스트립상의 표지 항체 및 캡처 항체의 3자와 면역 복합체를 형성하고, 표지물의 색을 확인하는 방법이다. 항체의 표지는 금 콜로이드, 효소, 형광 물질 등이 사용된다. 효소 표지 항체를 사용하는 경우에는, 시험 스트립 상에 효소 기질을 배치하여 발색시킨다.
플로우 스루법은 불용성 담체인 멤브레인 상에서, 검체 중의 용액과 함께 피검 물질인 항원이, 항체-항원-항체 복합체를 형성시키는 방법이다. 이때, 멤브레인에 고정되지 않은 물질은 통상은 수직으로 멤브레인의 앞으로부터 뒤를 통과하여 제거된다.
응집법은 검체 중의 항원과 시약 중의 항체를 반응시켜, 응집을 관찰하는 방법이다. 고상을 사용하지 않는 방법, 고상으로서 인공적으로 제작된 입자를 사용하는 입자 응집법(particle agglutination: PA), PA 중에서도 라텍스 입자를 사용한 라텍스 응집법(latex agglutination: LA) 등을 들 수 있다.
경합법은, 예를 들어 고상으로 항체를 결합시키고, 피검 시료와 일정량의 표지 항원을 동시에 반응시키고, 결합한 표지물의 양으로부터 시료 중의 항원의 양을 측정할 수 있다.
제1 형태에 기재된 본 발명의 항체 또는 단편은 상술한 측정 방법에 바람직하게 사용된다.
프레세프신 측정에 사용되는 검체는 특별히 한정되지 않지만, 수성의 검체가 바람직하고, 예를 들어 혈액(전혈, 혈장, 혈청 등), 오줌, 조직액, 림프액, 관절액, 유즙, 뇌척수액, 고름, 타액, 눈물, 점액, 콧물, 담, 복수, 용수, 정액 등의 체액, 또한 비강, 기관지, 폐, 피부, 복강, 각종 장기, 관절, 뼈 등을 세정한 후의 세정액, 또는 세포 배양 상청, 또는 칼럼 용출액 등을 들 수 있다. 이 시료는, 그대로, 또는 각종 완충액 등으로 희석 또는 추출 후 농축되어, 측정에 사용된다.
또한, 검체로서, 전혈 검체를 사용하는 경우에는, 전혈 검체를 채취하고 나서 72시간, 48시간 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 6시간 이내, 또는 4시간 이내에 분석이 실시될 수도 있다. 또한, EDTA 채혈관 또는 헤파린 채혈관에 의해 전혈 검체가 채취될 수도 있다. 바람직하게는, EDTA 채혈관에 전혈 검체를 채취하여 6시간 이내에 분석하는 것, 또는 헤파린 채혈관에 의해 전혈 검체를 채취하여 4시간 이내에 분석하는 것을 들 수 있다.
3. sCD14 - ST 측정용 키트
본 발명의 제3 형태는, 제1 형태의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 필수적인 구성 요소로 하는 프레세프신 측정용 키트이다.
본 발명의 측정 키트는 바람직하게는, 프레세프신 측정을 위한 보조 시약을 포함한다. 보조 시약으로서는, 예를 들어 1차 항체, 2차 항체, 표지 항체, 표지 효소, 금 콜로이드 등의 표지 물질, 발색 기질, 형광 기질(Amplex(R) Red, AttoPhos(R), 4-MUP 등), 화학 발광 기질(루미놀, CDP-Star™, AMPPD(R), CSPD(R) 등), 비오틴-스트렙트아비딘 등의 특이 결합 물질, 불용성 담체, 블로킹제, 희석액, 세정액, 표준 물질 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
제2 형태의, 프레세프신 측정법에 맞추어, 적절히 조합하여 사용된다.
1차 항체는 바람직하게는, 프레세프신에 결합하는 항체이며, 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체와 다른 에피토프를 인식하는 항체가 바람직하다. 예를 들어, WO2004/044005의 실시예 3에 기재된 F1106-13-3 항체나 F1031-8-3 항체 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체와 1차 항체 중 어느 것을 표지 항체로 해도 된다. 본 발명의 항체와 1차 항체 모두 표지되어 있지 않은 경우에는, 표지된 2차 항체를 사용할 수도 있다.
불용성 담체로서는, 예를 들어 자성 입자, 비즈, 유리, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 다공성 합성 중합체, 유리 섬유, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 플라스틱 플레이트, 라텍스 입자, 부직포, 여과지 등을 들 수 있다.
항체의 표지는 퍼옥시다아제(HRP), 알칼리포스파타아제(ALP), β-갈락토시다아제 등의 효소, 금 콜로이드 등, 바람직하게 사용되지만, 이들에 한정되지 않는다.
예를 들어, HRP를 사용하는 경우에는, 발색 기질로서, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), o-페닐렌디아민(OPD) 등을 들 수 있다. ALP를 사용하는 경우에는, 발색 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트(pNPP) 등을 들 수 있다. β-갈락토시다아제를 사용하는 경우의 발색 기질로서는, o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside: ONPD) 등이 예시된다.
예를 들어, 샌드위치 ELISA법용의 측정 키트는, 본 발명의 항체 및 1차 항체(어느 하나의 항체가 효소 표지되어 있을 수도 있다), 발색 기질, 희석액, 표준 물질 등을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체 및 1차 항체가 표지되어 있지 않은 경우, 표지된 2차 항체를 함유할 수도 있다.
화학 발광 효소 면역법(CLEIA)용의 측정 키트는, 예를 들어 자성 입자 등으로 고상화한 항체, 효소 표지 항체, 화학 발광 기질, 희석액, 세정액 등을 함유할 수 있다.
형광 효소 면역 측정법(FEIA)의 측정 키트는, 예를 들어 자성 입자 등으로 고상화한 항체, 효소 표지 항체, 형광 기질, 희석액, 세정액 등을 함유할 수 있다.
전기 화학 발광 면역 측정법(ECLIA)의 측정 키트는, 예를 들어 비오틴화 항체, Ru(bpy)3 표지 항체, 스트렙트아비딘 코팅 자성 입자, 트리프로필아민 등을 함유할 수 있다.
면역 크로마토그래피법에 의한 측정 키트는 시료 첨가부, 시약부, 검출부 및 흡수부를, 시험 첨가부에 첨가되는 액성 검체가 상기 순서로 이동하도록 설치한 시험 스트립이다. 예를 들어, 시약부에 표지한 제2 항체를 함침시키고, 검출부에 제1 항체가 결합한 불용성 담체를 설치할 수 있다.
시험 스트립은 다공성 담체 등을 사용하는 것이 예시된다. 다공성 담체는, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 나일론, 나일론 섬유, 유리 섬유, 다공성 합성 중합체 등을 들 수 있다. 흡수부는 물 흡수성 재료의 스펀지 등의 흡수 중합체, 셀룰로오스 여과지, 여과지 등을 들 수 있다.
패혈증 환자에서는, 특징적으로 프레세프신 혈중 농도가 상승하는 것이 보고되어 있기 때문에, 본 발명의 제3 형태의 프레세프신 측정용 키트는 패혈증의 검출용 키트, 또는 패혈증의 검출 또는 진단을 보조하기 위한 키트일 수도 있다.
또한, 본 발명의 제3 형태의 프레세프신 측정용 키트는 패혈증의 진단약, 또는 패혈증 진단의 보조약으로서 사용할 수 있다. 프레세프신 측정용 키트는, 이러한 패혈증의 검출 등을 목적으로 할 때, 본 발명의 항체를 사용하여 측정한, 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도가 컷오프값보다 높은 값일 때에, 피험자를 패혈증의 가능성이 있다고 판정하여, 검출 또는 진단을 보조할 수 있다. 이때, 컷오프값은 314 내지 600pg/mL이며, 바람직하게는 400 내지 580pg/mL, 보다 바람직하게는 450 내지 550pg/mL, 더욱 바람직하게는 500pg/mL이다.
또한, 프레세프신 측정용 키트는, 예를 들어 패혈증과 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)의 판별, 패혈증의 중증화의 리스크 평가, 패혈증의 예후 예측(사망률 예측), 패혈증의 중증도 평가, 수술후 감염증의 검출, 파종성 혈관내 응고 증후군(disseminated intravascular coagulation, DIC)의 검출, 감염성 DIC의 검출, 심질환의 검출, 세균 감염을 수반하는 호흡기 감염증의 검출, 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대장염)의 검출, 발열성 호중구 감소증(febrile neutropenia, FN)의 검출, 혈구 탐식 증후군(hemophagocytic syndrome, HPS)의 검출 및 식세포의 기능 평가로부터 선택되는 적어도 하나의 질환의 검출 또한 평가를 위하여 사용할 수 있다. 프레세프신 측정용 키트는, 상기에 기재된 적어도 하나의 질환 검출 또는 평가를 위한 키트일 수도 있다.
4. 제1 형태에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 제4 형태로서, 본 발명의 제1 형태의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 제공된다. 당해 폴리뉴클레오티드에는, DNA(게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 등) 및 RNA(mRNA 등)가 포함된다. 폴리뉴클레오티드는, 단일쇄(코딩 또는 안티센스) 또는 이중쇄일 수도 있다. 예를 들어, 시판되고 있는 키트를 사용하여, 본 발명의 항체를 산생하는 하이브리도마로부터 mRNA를 추출하여, cDNA를 합성할 수 있다. PCR법 등에 의해 목적으로 하는 유전자를 증폭할 수도 있다.
어떤 실시 형태에서는, 본 발명의 항체는 가변 영역의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 염기 서열에 대하여 적어도 80％ 이상의 동일성을 가질 것을 요한다. 또한, CDR 서열에 대해서도, 항체의 CDR 전체(VH CDR1 내지 3 및 VL CDR1 내지 3)를 코딩하는 염기 서열에 대하여 적어도 80％ 이상의 동일성을 가질 것을 요한다. 이들은 검출 감도의 관점으로부터, 85％ 이상의 동일성, 90％ 이상의 동일성, 95％ 이상의 동일성, 96％ 이상의 동일성, 97％ 이상의 동일성, 98％ 이상의 동일성 또는 99％ 이상의 동일성을 나타내도 된다.
또한, 어떤 실시 형태에서는, 본 발명의 항체는 가변 영역의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 염기 서열의 상보쇄에 대하여 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열에 의해 코딩되는 항체도 포함된다.
하이브리다이제이션은 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법, 예를 들어 Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등에 따라서 행할 수 있다.
엄격한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 엄격한 조건이란, 예를 들어 칼륨 농도는 약 25mM 내지 약 50mM, 그리고 마그네슘 농도는 약 1.0mM 내지 약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 당업자는 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염 농도 등을 변화시킴으로써, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.
5. 제4 형태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터
제5 형태는, 본 발명의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 벡터이다. 벡터는 바람직하게는, 제1 형태에 기재한 항체 유전자의 발현에 적합한 벡터 및/또는 발현 벡터이며, 당업자가 사용할 수 있는 기술을 사용하여 제작할 수 있다.
6. 제1 형태에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 산생하는 세포
본 발명의 제6 형태로서, 본 발명의 제1 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 산생하는 세포가 제공된다. 이러한 세포의 예로서는, 하이브리도마, 형질 전환주, 또는 본 발명의 항체 유전자를 도입한 유전자 재조합 세포 등이 있다.
항체를 산생하는 하이브리도마로서는, 구체적으로는, 실시예 1에 나타난 클론을 들 수 있다.
형질 전환주는, 예를 들어 제1 형태에 기재한 숙주 세포(예를 들어, COS-1 세포, CHO 세포 등)에, 상기 기재된 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 벡터를 도입함으로써 얻을 수 있다.
하이브리도마나 형질 전환주의 제작 방법은 제1 형태에 기재된 바와 같다.
7. 형질 전환주를 사용하는 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 제조 방법
본 발명의 제7 형태는, 제1 형태의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 형질 전환주를 배양하는 공정을 포함하는, 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 제조 방법이다.
형질 전환주의 배양물 중에, 제1 형태의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 생성시키고, 배양물 중에서 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 채취한다. 상세는, 제1 형태에서 설명한 바와 같다.
8. 항프레세프신 항체의 스크리닝 방법
본 발명의 제8 형태는, 적어도 다음의 공정을 포함하는, 검체 중의 프레세프신 측정에 유용한 항프레세프신 항체를 얻기 위한, 항체의 스크리닝 방법이다.
·후보의 항체를 사용하여 프레세프신 측정계를 구축하는 공정,
·당해 측정계를 사용하여, 검체 중의 TG 농도가 프레세프신 측정값에 끼치는 영향을 결정하는 공정
즉, 이 방법은 항체를 사용한 측정계에서 TG의 간섭 시험을 행하는 것을 특징으로 하고 있다. 후보의 항체(바람직하게는, 항프레세프신 항체)를 얻는 방법은 본 발명의 제1 형태 또는 제7 형태에 기재된 바와 같다. 프레세프신 측정계는, 검체의 프레세프신값을 측정하는 측정계라면 되며 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 제2 형태에 기재한 측정계를 들 수 있고, 예를 들어 샌드위치 ELISA 등을 사용할 수 있다.
검체 중의 TG 농도가 프레세프신 측정값에 끼치는 영향을 결정하는 공정은, 예를 들어 TG 무첨가의 검체의 프레세프신 측정값과, 동검체에 TG를 일정량 첨가했을 때의 프레세프신 측정값을 비교하여, 양쪽 측정값의 해리로부터 영향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 하나의 예로서는, 복수의 검체를 사용하여 TG 간섭 시험을 행하고, TG 무첨가 시의 프레세프신 측정값에 대하여 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하, 보다 바람직하게는 ±10％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 높을 때에, 검체 중의 TG가 프레세프신 측정값에 끼치는 영향은 작다고 결정할 수도 있고, 당해 항체는 TG 간섭을 받기 어려워, 프레세프신 측정에 유용한 항체라고 결정할 수도 있다.
또는, 별도의 평가 방법으로서, 후보의 항체와 S68 항체로 TG 간섭 시험을 실시하여 해리도를 비교함으로써 평가할 수도 있다. 바람직한 형태의 하나로서, 후보의 항체를 사용하여 TG 간섭 시험을 실시했을 때의 프레세프신 측정값의 해리가, S68 항체의 동일한 조건에 있어서의 해리도와 유사할 때, 당해 항체는 검체 중의 프레세프신 측정에 유용한 항체라고 결정할 수 있다. 예를 들어, 하나의 예로서는, 복수의 검체를 사용하여 TG 간섭 시험을 행하고, 후보의 항체를 사용한 측정계에 있어서, TG 첨가에 의해 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의 해리도와, S68 항체를 사용한 측정계에 있어서의 동 조건 하의 해리도로부터 해리도의 차를 결정하고, 해리도의 차가 20％ 이하, 바람직하게는 10％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 높을 때, 당해 항체는 검체 중의 프레세프신 측정에 유용한 항체라고 결정할 수도 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 임의로, 후보의 항체와 S68 펩티드 또는 프레세프신과의 결합 활성을 결정하는 공정을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법은 임의로, 후보의 항체를 사용한 프레세프신 측정계에 의해 정상인과 패혈증 환자의 검체를 측정하고, 측정값의 차를 비교하는 공정을 포함할 수도 있다. 이들은 실시예 1의 기재에 따라 실시할 수 있다.
상기 스크리닝 방법의 바람직한 형태의 하나는, 적어도 다음의 공정을 포함하는 방법이다.
1) 후보의 항프레세프신 항체를 얻는 공정, 및
2) 당해 후보의 항체를 사용하여 프레세프신 측정계를 구축하고, TG 첨가에 의해 검체 중의 TG 농도를 20mg/mL로 했을 때, 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하를 나타내는 검체 비율이 50％ 이상인 상기 항체를 선택하는 공정.
상기 방법에 있어서, 검체 중의 TG 농도(여기서는 20mg/mL), 프레세프신 측정값의 해리도(여기서는 ±20％), 및 검체 비율은 적절히 변경 가능하다. 또한, 상기 2)의 공정은, 본 발명의 제1 형태에 기재된, 다른 TG 간섭 시험 및/또는 평가 방법으로 치환해도 실시 가능하다.
본 발명의 제8 형태에 있어서, 다른 바람직한 형태의 하나는, 적어도 다음의 공정을 포함하는 본 발명의 항체 스크리닝 방법이다.
1) 후보의 항프레세프신 항체를 얻는 공정, 및
2) 당해 항체가, 프레세프신의 서열 중, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 에피토프로서 특이적으로 인식하는 상기 항체를 선택하는 공정.
상기 방법에 있어서, 2)의 공정으로는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 제1 형태에 기재된 에피토프의 결정 방법 등을 사용할 수 있다.
예를 들어, 2)는 이하의 공정일 수도 있다.
2) 당해 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는 상기 항체를 선택하는 공정.
상기 에피토프의 결정 방법은 임의로 이하의 3)의 공정을 첨가할 수도 있다.
3) 당해 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41의 서열로 이루어지는 아미노산 잔기 중 적어도 1개에 의한, 상기 항체와 프레세프신의 결합의 경합 저지는 20％ 미만인 상기 항체를 선택하는 공정.
또한, 본 발명의 제8 형태에 있어서, 다른 바람직한 형태의 하나는, 적어도 다음의 공정을 포함하는 본 발명의 항체 스크리닝 방법이다.
1) 후보의 항프레세프신 항체를 얻는 공정, 및
2) 당해 후보의 항체를 사용하여 얻어진 검체 중의 프레세프신 측정값과, S68 항체를 사용하여 얻어진 동 검체 중의 프레세프신 측정값과의 상관 계수가 0.9 이상을 나타내는 상기 항체를 선택하는 공정.
상기 방법은 본 발명의 제1 형태, 및 실시예 5의 기재에 따라 실시 가능하다. 상관 계수도 적절히 변경 가능하다.
또한, 본 발명의 제8 형태에 있어서, 다른 바람직한 형태의 하나는, 적어도 다음의 공정을 포함하는 본 발명의 항체 스크리닝 방법이다.
1) 후보의 항프레세프신 항체를 얻는 공정, 및
2) 프레세프신에 대하여 10-8M 미만의 친화성(평형 해리 상수, KD값)으로 결합하는 항체를 선택하는 공정.
상기 2)의 공정은, 이하의 공정으로 치환될 수도 있다.
2) 당해 항체의 프레세프신에 대한 결합 활성이, S68 항체의 프레세프신에 대한 결합 활성과 비교하여 우수한 항체를 선택하는 공정.
친화성(평형 해리 상수, KD값)이나 결합 활성의 측정은 본 발명의 제1 형태의 기재에 따라 실시 가능하다. 결합 활성은 흡광도비로 평가할 수도 있다. 바람직하게는 S68 항체와 프레세프신을 반응시켰을 때의 흡광도를 1로 했을 때의, 본 발명의 항체와 프레세프신을 반응시켰을 때의 흡광도의 비는 2 이상이다.
이상의 본 발명의 항체 스크리닝 방법은 각 공정을 조합하여 실시될 수도 있다. 바람직한 조합은, 예를 들어 이하와 같다.
적어도 이하의 공정을 포함하는, 항프레세프신 항체의 스크리닝 방법이며,
1) 후보의 항프레세프신 항체를 얻는 공정
2) 당해 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는 상기 항체를 선택하는 공정, 및
3) 당해 항체의 프레세프신에 대한 결합 활성이, S68 항체의 프레세프신에 대한 결합 활성과 비교하여 우수한 항체를 선택하는 공정.
9. 패혈증 환자의 치료 방법
본 발명의 제9 형태는, 본 발명의 제1 형태의 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 패혈증의 검출을 보조하기 위한 방법이 시행된 피험자에 대하여 패혈증 치료를 행하는, 패혈증 환자의 치료 방법이다.
패혈증의 검출을 보조하기 위한 방법은 본 발명의 제2 형태에 기재된 바와 같다. 패혈증 치료는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 항균약이나 스테로이드의 투여, 승압제, 보액, 산소 투여, 인공 호흡 관리, 지속적 혈액 여과 투석, 혈장 교환 등을 들 수 있다.
10. 피검약(또는 치료약)의 스크리닝 방법
본 발명의 제10 형태는, 본 발명의 제1 형태의 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편, 또는 제3 형태의 키트를 사용하여, 피검약(또는 치료약)이 투여된 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도를 결정하는 공정을 포함하는, 피검약(또는 치료약)의 스크리닝 방법이다. 피검약이 대상으로 하는 질환은, 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도가 상승하는 질환이라면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 피검약의 투약 전과 투여 후에 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도를 비교하여, 피검약 투여 후의 프레세프신 농도가 투여 전과 비교하여 저하되는지 여부를 결정한다. 또는, 피검약 투여 후의 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도가 정상인 레벨까지 저하되는지 여부를 결정할 수도 있다.
즉, 이하의 공정을 포함하는 피검약의 스크리닝 방법이다.
1) 피검약이 투여된 피험자의 검체 중의 프레세프신 농도를 결정하는 공정
11. rsCD14ST - Fc
rsCD14ST-Fc는, 서열 번호 3(인간 전장 가용형 CD14)의 1위치부터 64위치의 서열과 항체 중쇄의 Fc 영역을 포함하는 구조를 갖는다.
rsCD14ST-Fc의 제작은, 예를 들어 실시예 9-(2)에 기재한 바와 같이, 인간 sCD14의 1위치부터 64위치의 서열의 하류에 트롬빈 인식 서열을 갖는 서열, 및 인간 유래 IgG1 항체 중쇄의 Fc 영역의 서열을 갖는 rsCD14ST-Fc를 발현하는 일과성 발현용 플라스미드를, COS-1 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염하고, 그 숙주 세포를 배양하고, 얻어진 배양 상청을 회수하여 정제함으로써 얻을 수 있다.
인간 sCD14의 1위치부터 64위치의 서열과 Fc의 사이에는, 절단을 용이하게 하는 서열이 삽입되는 것이 바람직하고, 특별히 한정되지 않지만, 트롬빈 인식 서열 이외에도, 예를 들어 Factor Xa 인식 서열, PreScission Protease 인식 서열 등이 사용될 수도 있다. rsCD14ST-Fc는, 절단을 용이하게 하는 서열을 갖는 것은 필수는 아니다.
항체 중쇄의 Fc 영역은 인간 유래 IgG1 항체 유래 이외에도, 모든 항체의 Fc 영역이 사용 가능하다. 숙주 세포도 특별히 한정되지 않는다.
rsCD14ST-Fc는, COS-1 세포 등의 숙주 세포를 배양함으로써 얻어지기 때문에 발현이 용이하고, 또한 Fc는 단백질 A와 특이적으로 결합하고, 정제에 단백질 A 칼럼을 사용할 수 있기 때문에, 정제도 용이하다는 제조상의 이점을 갖는다. Fc 영역을 절단한 후의 정제는, 단백질 A 칼럼 이외에도 통상의 방법을 사용하여 정제가 가능하고, 예를 들어 WO2005/108429의 실시예 13에 기재된 방법 등을 사용하여 정제할 수도 있다.
rsCD14ST-Fc는, Fc 영역을 절단하여 rsCD14-ST로서 사용할 수도 있고, Fc 영역을 절단하지 않고 rsCD14ST-Fc 그대로 사용할 수도 있고, 양자 모두 항프레세프신 항체와 특이적으로 결합한다.
실시예 9-(2)에서 제작한 rsCD14ST-Fc는, rsCD14ST와 Fc의 사이에, rsCD14-ST 표준품 제조시와 동일한 트롬빈 서열을 삽입하고 있다. Fc 영역을 트롬빈으로 절단하여 얻어지는 rsCD14ST는, rsCD14ST 표준품과 동일 서열을 갖고, 동등한 특성을 갖는다(WO2005/108429 참조).
rsCD14ST-Fc로부터의 rsCD14의 제조는 Fc 영역의 절단 후, 단백질 A 칼럼을 통과시킴으로써 Fc만을 용이하게 제거할 수 있고, 제조도 용이하다. rsCD14ST-Fc의 Fc 영역의 절단 수단은, 삽입한 절단을 용이하게 하는 서열에 맞춰서 적절히 선택할 수 있다.
rsCD14ST-Fc는, Fc 영역을 절단하지 않고 rsCD14ST-Fc 그대로도, rsCD14-ST의 활성을 갖기 때문에, 항원으로서 이용 가능하다.
종래의 rsCD14-ST 표준품은, 인간 sCD14의 64위치와 65위치의 사이에 트롬빈 인식 부위를 삽입한 rsCD14를 숙주 세포에서 발현시키고, 트롬빈 인식 부위에서 절단하여 얻어진다. rsCD14의 구조는 rsCD14-ST를 포함하는데, 그대로로는 rsCD14-ST로서의 반응성을 거의 나타내지 않고, 절단하여 정제한 후, rsCD14-ST의 활성이 얻어져, 사용 가능하게 된다. 한편, rsCD14ST-Fc는, Fc 영역을 절단하지 않아도 rsCD14-ST와 마찬가지로 사용할 수 있기 때문에, 절단의 수고를 삭감할 수 있고, 간이하게 사용할 수 있다.
실시예
( 실시예 1) 합성 펩티드를 항원으로 한 모노클로날 항체의 제작
1-( 1) 토끼의 면역
WO2004/044005의 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 투여 항원의 제작, 토끼의 면역을 행하였다. 즉, 서열 번호 2에 기재된 서열(서열 번호 3에 기재된 53위치부터 68위치의 서열에 해당)로 이루어지는 펩티드(이하, S68 펩티드라고 기재)의 N 말단에 시스테인을 삽입한 펩티드를 제작하였다. 이 펩티드에 KLH(PIERCE)를 결합하고, 투여 항원으로 했다(이하, S68 펩티드-KLH라고 기재).
S68 펩티드-KLH 100μg을 등량의 프로인트 완전 아주반트(DIFCO)와 혼합 후, 뉴질랜드 백색 토끼(3월령)의 배면부 표피 내에 투여하였다. 그 2주일 후와 또한 그 1주일 후에 각각, S68 펩티드-KLH 100μg을 프로인트 불완전 아주반트(DIFCO)와 등량 혼합 후, 배면부 표피 내에 투여하였다. 또한 2회 S68 펩티드-KLH 20μg을 귀정맥 내에 투여하였다.
투여 종료 1주일 후 귀정맥으로부터 채혈하고, 통상적인 방법에 따라 항혈청을 분리하고, 항체값 및 프레세프신에 대한 반응성을 샌드위치 ELISA를 사용하여 확인하였다. 즉, 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341, Nunc사)에, F1106-13-3을 고정화 후, 블로킹하였다. 토끼의 각 항혈청을 D-PBS(pH 7.4)로 희석하여, ×1/1000 내지 ×1/32000배까지의 일련의 연속 희석물(8포인트)을 제조하였다. 프레세프신 표준품(WO2005/108429의 실시예 16에 기재된 rsCD14-ST)을 희석액(0.1％ BSA/D-PBS)으로 희석하여 3ng/mL의 표준액을 제조하였다. 항혈청 희석열을 플레이트에 첨가하고, 계속하여 3ng/mL의 표준액을 첨가하였다. 플레이트를 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하였다. 다음으로 항토끼 Igs-HRP(DAKO, P448)를 희석한 용액을 100μL 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응시켰다. 마찬가지로 5회 플레이트를 세정 후, 테트라메틸벤지딘 용액(TMB, BioFix)을 첨가하고, 실온 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 450/650nm의 흡광도를 MultiskanJX(Thermolab Systems)로 측정하였다. 흡광도 측정의 결과에 기초하여, 항체값이 높은 개체를 선택하였다.
비장의 채취 4일 전에 S68 펩티드-KLH 400μg을 귀정맥 내에 투여하고, 비장을 무균적으로 채취하고, 임파구를 회수하였다.
1-(2) 세포 융합 및 클로닝
미국 특허 제7429487호에 기재된 방법에 따라, 2×108cells의 임파구와 토끼 유래 불사화 B 임파구 융합 파트너의 1×108cells를 혼합하고, 2회로 나누어서 세포 융합을 실시하였다. 융합한 세포를 96웰 플레이트에 파종하고, 통상법에 따라서 배양하였다.
얻어진 286클론의 배양 상청에 대해서, 투여 항원과의 결합 활성을 S68 펩티드-BSA를 사용하여 확인하고, 결합 활성이 확인된 72클론을 선택하였다.
투여 항원과의 결합 활성이 확인된 72클론에 대해서, 1-(1)과 동일한 샌드위치 ELISA계에 의해, 프레세프신 표준품과의 결합 활성을 확인하고, 결합 활성이 확인된 클론을 선택하였다.
프레세프신 표준품과의 결합 활성이 확인된 클론에 대해서, 환자의 혈중 프레세프신에 대한 특이성의 확인을 행하였다. 즉, 정상인 혈청 3예(ProMedDx사) 및 패혈증 환자 혈청 3예(Bioreclamation사)를 희석액으로 5배 희석하고, 1-(1)과 동일한 샌드위치 ELISA계를 사용하여 마찬가지로 측정하였다. 그 결과, 프레세프신 표준품과의 반응성이 양호하고, 또한 정상인 검체에서 흡광도가 상승하지 않고, 패혈증 환자 검체에서 흡광도가 상승하는 5클론을 선택하였다. 각 클론을 한계 희석법으로 클로닝한 뒤, 동결 앰플을 각각 제조하였다.
1-(3) BIACORE에 의한 결합 양식의 해석
선택한 클론으로부터 얻어지는 각 항체와 프레세프신의 결합 양식을 확인하기 위해서, BIACORE3000(GE 헬스케어)을 사용하여 해석을 행하였다. CM5칩(GE 헬스케어)에 F1106-13-3 항체를 통상적인 방법에 의해 고정화하고, 거기에 프레세프신 표준품(1μg/ml)을 첨가하였다. 또한 희석한 배양 상청(0.5μg/ml)을 첨가하고, 센서그램을 플롯하였다. 모든 클론이 해리상에서의 해리가 보이지 않는 양호한 결합 양식을 나타냈다.
1-(4) 토끼 모노클로날 항체의 제조
제작한 토끼 항프레세프신 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 사용하여 토끼 모노클로날 항체를 제조하였다. 즉, 통상적인 방법에 따라 동결 앰플을 해동하고, 10％ 소태아혈청, 8％ 서플리먼트 A(Abcam)를 포함하는 RPMI1640(Sigma)에서 배양 후, 세포를 회수하여 CELLine(Integra Bioscience)의 프로토콜에 따라 IS-MAB-CD 배지(Irvine)에서 배양하여 항체를 포함하는 배양 상청을 회수하였다. 다음으로 얻어진 배양 상청으로부터 rmp-Protein A Sepharose FF(GE 헬스케어)를 사용하여 항체를 정제하였다. 정제 항체를 포함하는 용출액을 농축하고, 계속하여 D-PBS(pH 7.4)에 대하여 투석하였다. 항체의 단백 농도는 소IgG(BioRad)를 표준품으로 하여 Bradford법으로 구하였다. 얻어진 항체를 SDS-PAGE로 분석한 바, 분자량 약 150kDa의 단일 밴드가 확인되고, 또한 환원함으로써 약 50kDa의 중쇄와 약 25kDa의 경쇄가 확인되었다.
(실시예 2) 재조합 항체의 제작
2-(1) 토끼 모노클로날 항체의 가변 영역 아미노산 서열의 결정과 발현용 플라스미드의 구축
실시예 1에서 얻어진, 각 하이브리도마로부터, RNeasy Mini Kit(퀴아젠)를 사용하여 토탈 RNA를 추출하고, SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)로 단일쇄 cDNA를 합성하였다. 얻어진 단일쇄 cDNA를 주형으로 한 Rabbit Ig-Primer Set(Rader C, et al. JBC 2000; 275: 13668-76, 및 Lang I, et al. Gene 1996; 172: 295-8)에 의한 PCR로 가변 영역을 증폭하고, 통상법에 따라, 중쇄 및 경쇄의 각 가변 영역의 염기 서열을 결정하였다.
가변 영역 이외의 서열 정보는 데이터베이스 상을 검색하여, 5'측 프라이머 및 3'측 프라이머를 설계하였다. 이들 프라이머를 사용하여 PCR을 행함으로써, 중쇄 전장 및 경쇄 전장을 각각 증폭하고, 포유 세포에서의 일과성 발현용 벡터이며, EF-1α 프로모터 및 CMV 인핸서를 갖는 pTK-2433으로 클로닝하였다. 통상법에 따라, 중쇄 전장 및 경쇄 전장의 염기 서열 및 그들에 코딩되는 아미노산 서열을 결정하였다. 항체의 가변 영역의 CDR 부분의 아미노산 서열을 표 10 및 표 11에 나타냈다.
[표 10]
Figure 112016081786898-pct00012
[표 11]
Figure 112016081786898-pct00013
2-(2) 일과성 발현 재조합 항체의 제조
상기 2-(1)에서 제작한 일과성 발현용 플라스미드(중쇄 서열을 포함하는 발현 플라스미드와 경쇄 서열을 포함하는 발현 플라스미드)를 등량 혼합하여 COS-1 세포(ATCC: CRL-1650)에 형질감염하였다. 즉, 형질감염 시약 2μL/mL 및 플라스미드 4μg/mL를 혼합하고, 배지에 첨가한 후, COS-1 세포에 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 72시간 후, 배양 상청을 회수하고, 추가로 새로운 배지를 첨가하였다. 96시간 후, 배양 상청을 회수하고 2회분을 혼합 후, 0.22㎛의 필터(Sterivac, 밀리 포어)로 여과하였다. 얻어진 배양 상청은, 상기 1-(4)에 기재된 방법에 따라서 정제하고, SDS-PAGE로 분석한 바, 약 150kDa의 단일 밴드의 재조합 항체가 확인되었다.
2-(3) 재조합 항체 안정 발현용 플라스미드의 구축
상기 2-(2)에서 제작한 일과성 발현용 플라스미드로부터 제한 효소를 사용하여 중쇄를 코딩하는 유전자 단편과 경쇄를 코딩하는 유전자 단편을 잘라내고, EF-1α 프로모터, 및 마우스 DHFR 발현 유닛〔프로모터로서 SV40 프로모터(인핸서 영역은 포함하지 않는다), SV40 유래 polyA 시그널〕을 갖는 플라스미드(pTK-2577; 일본 특허 공개 제2007-215546호에 기재)에 삽입하여, 포유 동물 세포에서의 안정 발현용 플라스미드를 제작하였다.
( 실시예 3) CHO 세포에 의한 항체의 제작
3-(1) 토끼 모노클로날 항체의 유전자 재조합 항체 산생 CHO 세포의 제조
DHFR 유전자 결손 CHO 세포(CHO DXB11)에, 상기 2-(3)에서 구축한 안정 발현용 플라스미드를 형질감염하여, 토끼 항체 산생 형질 전환 CHO주를 수립하였다. 즉, HT media Supplement(50×) Hybri-Max(Sigma; 최종 농도 1×로 사용) 및 200mM L-Glutamine(Sigma; 최종 농도 4mM으로 사용)을 포함하는 EX-CELL 302 PF CHO(JRH Bioscience)에서 순화 배양한 CHO DXB11을 형질감염 당일에 원심 후, 8×106cells/150㎠ Roux의 농도로 플라스크에 넣었다. FuGENE6(프로메가) 125μl를 사용하여, 발현 플라스미드 12.5μg을 FuGENE6 첨부 프로토콜에 준하여 제조하고, 전번의 CHO DXB11에 도입하였다. 5％ CO2에서 37℃, 2일간 배양한 후에, 세포를 회수하고, HT 불함유 4mM L-Glutamine 함유 EX-CELL 302 PF CHO 배지(이하 EX-CELL(HT-)라고 기재)로 두번 세정하고, EX-CELL(HT-)에 다시 현탁하였다. 다음으로 12,500 내지 50,000cells/well로 96웰 플레이트에 세포를 다시 파종하고, 5％ CO2, 37℃에서 배양을 계속하여, 3일 또는 4일마다 배지의 절반량을 새로운 EX-CELL(HT-)로 교환하였다. 약 2주일 배양을 계속한 후, 콜로니가 발생한 웰 내의 세포를 새로운 플레이트에 옮겼다.
CHO 세포의 배양 상청 중의 항체를, S68 펩티드 항원을 고상으로 사용한 ELISA법으로 스크리닝하여 S68 펩티드와 결합하는 항체를 산생하는 CHO 세포를 5종류 선택하였다.
3-(2) 메토트렉세이트(Methotrexate)를 사용한 유전자 증폭
3-(1)에서 얻어진 재조합 항체 발현 형질 전환 CHO주를, Methotrexate(이하 MTX라 표기)를 포함하는 EX-CELL(HT-) 배지에서 선택 배양함으로써, 유전자 증폭 작업을 행하여 목적으로 하는 재조합 항체의 생산량이 상승되어 있는 클론의 선택을 행하였다. 즉, 실시예 3-(1)에서 얻어진 형질 전환주를 30nM MTX 함유 EX-CELL(HT-) 배지에 현탁하고, 96웰 플레이트에 넣었다. 3일 또는 4일마다 배지의 절반량을 새로운 30nM MTX 함유 EX-CELL(HT-)로 교환하고, 콜로니가 발생할 때까지 5％ CO2, 37℃에서 배양을 계속하였다. 얻어진 콜로니의 배양 상청 중에의IgG 농도를 EIA법으로 확인하고, 생산량이 증가되어 있는 클론을 선택하였다. 그 결과, 생산량이 약 2 내지 10배 상승한 형질 전환주를 얻을 수 있었다. 또한, 이 유전자 증폭한 형질 전환주를, MTX 농도를 3 내지 10배 높인 배지에서 선택 배양을 반복함으로써, 더욱 생산량이 증가하는 클론을 얻을 수 있다.
3-(3) CHO 세포에 의한 재조합 항체의 생산
3-(2)에서 얻어진 클론을 30nM MTX 함유 CHO-SFM(HT-) 배지(GIBCO)에 1×105cells/ml로 넣고, 37℃에서 7일간 배양하였다. 얻어진 배양 상청을 이하의 정제에 사용하였다. 배양 상청을, 단백질 A 칼럼(Prosep-A, 밀리 포어)을 사용하여 항체를 정제하였다. 정제한 재조합 항체를 SDS-PAGE로 분석한 바 하이브리도마 유래의 항체와 동등한 분자량을 나타내는 항체가 확인되었다.
( 실시예 4) 샌드위치 ELISA계에서의 각 항체의 반응성 평가
실시예 2에서 제조한 토끼 모노클로날 항체 5종, WO2004/044005의 실시예 1에 기재된 S68 항체(S68 펩티드를 토끼에게 면역하여 얻어진 폴리클로날 항체) 및 WO2004/044005의 실시예 2에 기재된 F1146-17-2(S68 펩티드를 래트에 면역하여 얻어진 모노클로날 항체)에 대해서, 프레세프신과의 반응성 평가를 행하였다. 즉, 각 항체를 PBS(pH 7.4)로 5μg/mL로 희석하고, 면역 플레이트(Maxisorb, NUNC)의 각 웰에 50μL 첨가하였다. 4℃에서 하룻밤 반응 후, 이온 교환수로 5회 세정하고, 0.1％ StabilGuard(SurModics, Inc)와 0.1％ Tween20(와꼬 쥰야꾸)을 포함하는 PBS를 각 웰에 200μL 첨가하여 블로킹하였다. 이어서, 프레세프신 표준품을 희석액으로 1000ng/mL로 희석하고, 계속하여 3배 공비에 의해 희석하여, 표준품의 희석계열을 제조하였다. 표준품 희석계열을 웰당 50μL 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응하였다. 반응 종료 후, 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하고, 0.25μg/mL로 희석한 퍼옥시다아제 표지 F1106-13-3 항체를 각 웰에 50μL 첨가하였다. 25℃에서 2시간 반응 후, 마찬가지로 5회 세정하고, TMB 용액을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 20분간 반응 후, 0.5M 황산 용액으로 반응을 정지하고, 플레이트 분광 광도계(Molecular Devices)로 450nm(부파장 650nm)의 흡광도를 측정하였다.
측정 결과를 표 12에 나타내었다. 실시예 2에서 제조한 각 토끼 모노클로날 항체를 사용한 측정계는 모두 프레세프신 표준품과의 반응성이 우수하고, S68 항체를 사용한 측정계와 거의 동등한 반응성을 나타냈다.
한편, F1146-17-2를 사용한 측정계는 반응성이 낮고, 프레세프신 농도가 1000ng/mL인 때의 흡광도는 0.368이었다. 이 흡광도는, 토끼 모노클로날 항체를 사용한 측정계에서는, 프레세프신 농도가 0.03 내지 0.1ng/mL인 때의 흡광도와 거의 동등하였다. 이것으로부터, 토끼 모노클로날 항체를 사용한 측정계는, F1146-17-2를 사용한 측정계와 비교하여, 약 1만배 반응성을 개선한 것이 명확해졌다. 정상인 검체의 프레세프신 농도는 통상 약 50 내지 300pg/mL이기 때문에, F1146-17-2를 사용한 측정계에서는 측정 불가능인 것이 나타났다.
[표 12]
Figure 112016081786898-pct00014
( 실시예 5) 환자 검체의 측정과 간섭 시험
실시예 2에서 제작한 각 항체를 사용하여, 실시예 4에 기재된 샌드위치 ELISA계에 의해, 패혈증 환자 검체 30예의 혈중 프레세프신값의 측정을 행하고, S68 항체를 사용한 샌드위치 ELISA계에 의한 측정값과의 상관 분석을 하였다.
그 결과, 각 토끼 모노클로날 항체를 사용한 ELISA계에 있어서, S68 항체를 사용한 ELISA계에 의한 측정값과 상관이 좋은 계와 떨어지는 계가 존재하였다. 토끼 모노클로날 항체의 F1466-12, F1466-19의 상관 계수는, 기타와 비교하여 떨어지는 결과였다. 각각의 항체의 상관 계수는, F1466-12는 0.89, F1466-19는 0.93, F1466-26은 0.98이었다.
이어서, 각 토끼 모노클로날 항체, 및 S68 항체를 사용하여, 각각 제작한 샌드위치 ELISA계에 있어서, 혈중의 간섭 물질(빌리루빈 F, 빌리루빈 C, 헤모글로빈, 류머티즘 인자 및 트리글리세라이드)이 프레세프신 측정값에 끼치는 영향을 검토하였다. 일정량의 프레세프신을 첨가한 건강인의 혈청에, 단계적인 농도의 각 간섭 물질을 첨가하여 프레세프신 농도를 측정하고, 각 간섭 물질이 측정값에 끼치는 영향을, 간섭 물질 무첨가인 때의 측정값을 기준으로 하여 평가하였다.
그 결과, 어느 항체를 사용한 측정계에 있어서도, 빌리루빈 F, 빌리루빈 C, 헤모글로빈 및 류머티즘 인자의 간섭은 문제가 되지 않는 레벨이었다.
한편, 트리글리세라이드(TG)에 대해서는, 일부의 항체를 사용한 측정계에 영향을 주었다. TG 간섭 시험은 다음과 같이 실시하였다. 검체는 일정량의 프레세프신을 첨가한 정상인의 인간 혈청을 사용하였다. 인트라리피드 수액 20％(Fresenius사)를 사용하여 검체 중의 TG 농도 20mg/mL까지 단계적으로 희석 샘플을 제작하였다. 이 TG 농도는 검체의 혈청에 원래 포함되는 TG는 고려하고 있지 않다. 희석 샘플을 검체 희석액으로 20배 희석하고, ELISA에 의해 프레세프신값을 측정하였다. 복수의 검체에 대하여 이 TG 간섭 시험을 실시하였다.
이 결과, F1466-12, F1466-19의 항체를 사용한 측정계에 대해서는, TG 첨가가 프레세프신 측정값에 영향을 주어, 검체 중의 TG 농도 20mg/mL인 때의 프레세프신 측정값의 해리도는 ±20％보다 큰 검체의 비율이 높았다.
또한, 검체 중의 TG 농도 20mg/mL인 때의 프레세프신 측정값의 해리도를, 복수의 검체에서 구하고, 그 해리도의 평균값을 각 항체에 대하여 산출하였다. 그 결과, 해리도의 평균값이 ±20％ 이하를 나타내는 것은, S68 항체, F1466-5 및 F1466-26을 사용한 측정계였다.
한편, F1466-12, F1466-19 및 F1466-16의 항체를 사용한 측정계에 있어서는, 해리도의 평균값은 ±20％를 초과하는 결과였다.
또한, 각 토끼 모노클로날 항체를 사용한 분석계와 S68 항체를 사용한 분석계의 사이에, TG 첨가에 의한 프레세프신 측정값의 해리도를 비교하였다. 그렇게 하면, TG 첨가에 의해 검체 중의 TG 농도 20mg/mL로 했을 때의, F1466-12의 측정계의 해리도와 S68 항체의 측정계의 해리도의 차, 및 F1466-19의 측정계의 해리도와 S68 항체의 측정계의 해리도의 차는, 모두 20％보다 큰 차를 나타내는 검체의 비율이 높았다.
이것으로부터, TG 간섭 시험에 있어서의 항체의 성능의 차이가, 상기 상관 분석의 결과에 영향을 주고 있을 가능성이 시사되었다.
F1146-17-2에 대해서도 간섭 물질의 시험을 시도했으나, 반응성이 낮기 때문에, 데이터가 얻어지지 않았다.
( 실시예 6) 항체의 특이성 에피토프 해석
실시예 2에서 제작한 각 토끼 모노클로날 항체 및 F1146-17-2(S68 펩티드를 래트에 면역하여 얻어진 모노클로날 항체)의 에피토프의 해석을 행하였다.
실시예 1에서 투여 항원으로 한 서열 번호 2의 펩티드 서열의 부분 단편을 포함하는 10아미노산으로 이루어지는 펩티드를 8종류 합성하고(표 13 참조), 실시예 4에 기재된 샌드위치 ELISA계에 의해 프레세프신 표준품과의 경합 저지 반응을 봄으로써 에피토프 서열을 검토하였다. 즉, 실시예 4에 기재된 방법에 따라서, 각 항체의 고정화 플레이트를 제조하였다. 다음으로 프레세프신 표준품 400pg/mL과 표 13에 나타낸 합성 펩티드(P01 내지 P08) 20μg/mL를 각 25μL 플레이트에 첨가하고, 반응시켰다. 음성 대조군으로서 펩티드 무첨가(PBS라 기재) 및 음성 대조용 펩티드(NC라 기재: 서열 CGDKTTATDIKGKE(서열 번호 34))를 사용하였다. 또한, 양성 대조군으로서 S68 펩티드를 사용하였다. 반응 종료 후, TMB로 발색시켰다. 합성 펩티드가 항체와 반응하면, 프레세프신 표준품의 항체에의 결합이 저해되는 점에서, 흡광도가 저하되었다. PBS의 흡광도를 100％로서 각 펩티드의 저지율을 계산하였다.
그 결과, 표 14에 나타내는 바와 같이 P03만을 인식하는 항체, P03부터 P04를 인식하는 항체, P04부터 P05를 인식하는 항체가 확인되었다. 또한, F1146-17-2는 P04부터 P05를 인식하는 것이 밝혀졌다. 이 결과, P03의 위치를 에피토프로서 인식하는 모노클로날 항체가 얻어진 것이 명확해졌다. 실시예 5에 있어서, TG 간섭 시험 및 S68 항체를 사용한 측정계와의 상관이 떨어지는 결과였던 F1466-12, F1466-19는, 래트 모노클로날 항체(F1146-17-2)와 동일하게 P04부터 P05를 인식하고, P03을 에피토프로 하지 않는 것을 알았다. 기타의 항체는 P03을 에피토프로서 인식하고 있었다. 이것으로부터, 항체가 프레세프신 측정에 적합한 성능을 갖는 것과, 항체가 인식하는 에피토프와의 관련성이 시사되었다. 또한, 프레세프신은, 고분자량 sCD14의 C 단부를 크게 결손한 아미노산 서열을 갖고 있으며, 그 아미노산의 길이에는 변동이 있다고 상정된다. 항체의 특이성 차이가, 실시예 5에 있어서의 S68 항체를 사용한 측정값과의 상관에 영향을 줬을 가능성도 고찰되었다.
[표 13]
Figure 112016081786898-pct00015
[표 14]
Figure 112016081786898-pct00016
( 실시예 7) 에피토프의 상세 해석
P03 펩티드를 인식하는 토끼 모노클로날 항체에 대해서, P03 펩티드를 1아미노산씩 개변한 펩티드와의 반응성을 검토하였다.
P03 펩티드(서열 번호 1의 아미노산 서열, 또한 서열 번호 3의 서열 52위치부터 61위치로 이루어지는 아미노산 서열에 해당)에 있어서, 53위치부터 61위치의 아미노산을, 1아미노산씩, 알라닌(원래의 아미노산이 알라닌인 경우에는 글리신)으로 치환한 펩티드(P031 내지 P039 펩티드)를 제작하고, P031 내지 P039 펩티드와 항체의 반응성을, 실시예 4의 기재에 따라, 샌드위치 ELISA계에 의해 확인하였다.
그 결과, P03 펩티드에 있어서의 서열 번호 3의 59위치의 아스파라긴산(서열 번호 1의 8위치에 해당)을 알라닌으로 치환했을 때, 항체와의 결합 활성이 소실되었다.
P03 펩티드에 있어서의 서열 번호 3의 53위치 내지 58위치(서열 번호 1의 2 내지 7위치에 해당), 서열 번호 3의 60위치 및 61위치(서열 번호 1의 9위치 및 10위치)의 아미노산을 알라닌(또는 글리신)으로 치환해도, 항체와의 결합 활성은 유지되었다.
이상에서, P03 펩티드를 에피토프로서 인식하는 항체는 P03 펩티드에 있어서의 서열 번호 3에 기재된 53위치 내지 58위치, 60위치 및 61위치의 아미노산을 1아미노산씩 알라닌(또는 글리신)으로 치환한 펩티드도 또한 에피토프로서 인식하는 것이 확인되었다.
( 실시예 8) 토끼 유래 항프레세프신 모노클로날 항체의 개변체의 제작
실시예 1에 기재된 토끼로부터 얻어진 항프레세프신 모노클로날 항체의 서열을 바탕으로 개변체를 제작하였다.
8-(1) CDR 서열의 해석
실시예 1에서 얻은 항프레세프신 항체 5종류의 CDR 서열을 해석한 바, 각 항체의 서열에는, 항체의 활성에 영향을 미치는 서열과, 영향을 미치지 않는 서열이 있는 것이 추측되었다. 따라서, 실시예 6에서 P03(서열 번호 1)의 서열을 에피토프로서 인식하고 있는 것이 명확해진 항체의 하나인 F1466-26 항체의 CDR 서열을 기본으로, 각 CDR 서열의 아미노산 개변을 행하여 개변체를 제조하고, 개변체의 활성을 평가하였다. 약 100개의 개변체를 제작하였다. 아미노산의 개변은 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실, 또는 수개의 아미노산 서열 치환 등을 행하였다.
또한, F1466-26 항체의 중쇄 전장과 F1466-5 항체의 경쇄 전장을 포함하는 개변체도 제조하고, 마찬가지로 평가하였다.
8-(2) 중쇄 개변체 제조용 플라스미드의 제조
중쇄 개변체용 플라스미드를 이하와 같이 제조하였다. 플라스미드 pTK-5793에 대하여 나타내지만, 다른 플라스미드도 동일한 방법으로 구축하였다. 실시예 2에서 얻어진 F1466-26의 중쇄 전장을 포함하는 중쇄 일과성 발현용 플라스미드(pTK-5605)를 주형으로 하고, 프라이머쌍(rabbit IgG(14-12)-e: 3'측 프라이머 및 Aor13HI-rabbit IgV2: 5'측 프라이머)으로 PCR을 행하였다. 또한 얻어진 증폭 단편을 주형으로 하여 프라이머쌍(rabbit IgG(14-12)-e, Aor13HI-rabbit IgV2)으로 PCR을 행하였다. 얻어진 증폭 단편을 플라스미드 pT7-Blue로 클로닝하고, 제한 효소 Aor13HI로 목적으로 하는 서열을 포함하는 단편을 제조하였다. 또한, EF-1α 프로모터 및 CMV 인핸서를 갖고, 토끼 IgG의 H쇄 가변 영역 이외의 부위를 포함하는 유전자 서열을 갖는, 포유 세포에서의 일과성 발현용 벡터인 pTK-4273(자사)을 제한 효소 Aor13HI로 절단하여, 벡터 단편을 제조하였다. 제조한 목적으로 하는 서열을 포함하는 단편을 벡터 단편으로 클로닝하여, pTK-5793을 제조하였다.
8-(3) 경쇄 개변체 제조용 플라스미드의 제조
경쇄 개변체용 플라스미드를 이하와 같이 제조하였다. 플라스미드 pTK-5844에 대하여 나타내지만, 다른 플라스미드도 동일한 방법으로 구축하였다. 실시예 2에서 얻어진 F1466-26의 경쇄 전장을 포함하는 경쇄 일과성 발현용 플라스미드(pTK-5608)를 주형으로 하여, 프라이머쌍(pEF2ce-28: 3'측 프라이머 및 pEF2ce-49: 5'측 프라이머)으로 PCR을 행하였다. 또한 얻어진 증폭 단편을 주형으로 하여 프라이머쌍(pEF2ce-28, pEF2ce-49)으로 PCR을 행하였다. 얻어진 증폭 단편을 플라스미드 pT7-Blue로 클로닝하고, 제한 효소 BamHI 및 XbaI로 목적으로 하는 서열을 포함하는 단편을 제조하였다. 또한, 포유 세포에서의 일과성 발현용 벡터인 pTK-2433(자사)을 제한 효소 BamHI 및 XbaI로 절단하여, 벡터 단편을 제조하였다. 제조한 목적으로 하는 서열을 포함하는 단편을 벡터 단편으로 클로닝하여, pTK-5844를 제조하였다.
프라이머의 서열
rabbit IgG(14-12)-e: 5' GGG GGT CCG GAG GTC GCC TGG TCA CGC CTG G 3'(서열 번호 85)
Aor13HI-Rabbit IgV2: 5' GGG TCC GGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3'(서열 번호 86)
pEF2ce-28: 5' TTC ATT CTC AAG CCT CAG AC 3'(서열 번호 87)
pEF2ce-49: 5' TTT TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT 3'(서열 번호 88)
8-(4) 일과성 발현 재조합 항체의 제조
이하, 대표예로서 중쇄 개변체 제조용 플라스미드 pTK-5793을 사용한 항체의 일과성 발현의 방법을 나타냈다. 실시예 8-(2)에서 제조한 중쇄 개변체 제조용 플라스미드(pTK-5793)와, 실시예 8-(3)에 기재된 경쇄 일과성 발현용 플라스미드(pTK-5608)를 등량 혼합하고, COS-1 세포(ATCC: CRL-1650)에, 형질감염 시약(FuGENE(등록 상표) 6, 프로메가사)을 사용하여 형질감염하였다. 즉, Opti-MEM(등록 상표) Reduced Serum Medium(라이프 테크놀로지스 제조)을 희석액으로 하여, 형질감염 시약 0.96μL/25μL 및 플라스미드 0.48μg/25μL을 제조하여 혼합하고, 배지에 첨가한 후, COS-1 세포에 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 72시간 후, 배양 상청을 회수하였다.
마찬가지로, 각 중쇄 개변체 제조용 플라스미드는 경쇄 일과성 발현용 플라스미드(pTK-5608)와 혼합하여 사용하였다. 각 경쇄 개변체 제조용 플라스미드는 중쇄 일과성 발현용 플라스미드(pTK-5605)와 혼합하여 사용하였다. F1466-26 항체의 중쇄 전장과 F1466-5 항체의 경쇄 전장을 포함하는 개변체는 pTK-5605와, F1466-5의 경쇄 전장을 포함하는 경쇄 일과성 발현용 플라스미드를 혼합하여 제작하였다.
( 실시예 9) 개변체의 평가 (1)
실시예 8에 있어서, COS-1 세포로 발현시켜서 얻어진 개변체(IgG 항체) 16종류를 정제하고, 각 항체의 프레세프신과의 반응성, 특이성, 친화성(KD값)을 평가하였다.
9-(1) 항체의 정제
8-(4)에서 얻어진 COS-1 세포의 배양 상청을 회수하고, 0.22㎛의 필터(Sterivac, 밀리 포어)로 여과하였다. 얻어진 배양 상청으로부터 Prosep vA(밀리 포어)를 사용하여 정제하였다. 정제물을 포함하는 용출액을 농축하고, 계속하여 D-PBS(pH 7.4)에 대하여 투석하였다. 단백 농도는 IgG(BioRad)를 표준품으로 하여 로우리(Lowry)법으로 구하였다. 얻어진 항체를 SDS-PAGE로 분석한 바, 약 150kDa의 단일 밴드의 재조합 항체가 확인되었다.
9-(2) 일과성 발현 rsCD14ST - Fc의 제조
먼저, pTK356H(TB64)(WO2005/108429의 실시예 13에 기재된 rsCD14를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드)를 주형으로 하여, 프라이머쌍(hCD14-a, hCD14-d)과 Taq 효소(다카라 바이오)에 의해 PCR 반응을 행하였다. 얻어진 증폭 단편(시그널 서열을 포함하는 서열 번호 3의 인간 sCD14의 1 내지 64위치의 서열의 하류에 트롬빈 인식 서열을 갖고, 양단에 제한 효소 부위를 갖는다)을 pT7Blue 벡터(밀리 포어)로 TA 클로닝하고, 서열을 확인하여, 이것을 pTK-3047로 하였다. 이어서, pTK-3047을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 절단하여 얻어진 단편을, 미리 pTK-2233(인간 유래 IgG1 항체 중쇄의 Fc 영역을 코딩하는 서열을 갖는 포유 세포용 발현 플라스미드)을 EcoRI 및 BamHI로 절단하여 제조해 둔 벡터 단편에 삽입하고, 얻어진 클론을 pTK-3053으로 하였다.
hCD14-a의 서열 5'­GGGAATTCGCCGCCACCATGGAGCGCGCGTCCTGC-3'(서열 번호 89)
hCD14-d의 서열 5'­GGGATCCACGCGGAACCAGAGCATACTGCCGCGGG-3'(서열 번호 90)
rsCD14ST-Fc를 발현하는 일과성 발현용 플라스미드 pTK-3053을 COS-1 세포(ATCC: CRL-1650)에 형질감염하였다. 즉, 형질감염 시약 2μL/mL 및 플라스미드 4μg/mL를 혼합하고, 배지에 첨가한 후, COS-1 세포에 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 72시간 후, 배양 상청을 회수하고, 추가로 새로운 배지를 첨가하였다. 96시간 후, 배양 상청을 회수하고 2회분을 혼합 후, 0.22㎛의 필터(Sterivac, 밀리 포어)로 여과하였다. 얻어진 배양 상청을, Prosep vA(밀리 포어)를 사용하여 정제하였다. 정제물을 포함하는 용출액을 농축하고, 계속하여 D-PBS(pH 7.4)에 대하여 투석하였다. 단백 농도는, BSA(BioRad)를 표준품으로 하여 Lowry법으로 구하였다. 얻어진 rsCD14ST-Fc를 SDS-PAGE로 분석한 바, 분자량 약 75kDa의 단일 밴드가 확인되었다. 제조한 rsCD14ST-Fc의 항프레세프신 항체와의 결합 활성은 항원을 고상으로 고정화한 ELISA에 의해 확인하였다.
9-(3) 샌드위치 ELISA의 구축
9-(1)에서 정제한 개변체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 구축하였다. 즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 각 개변체를 고정화하고, 블로킹하였다. 이어서, 프레세프신 표준품(0 내지 300pg/mL)을 첨가하고, 플레이트를 25℃에서 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하였다. 다음으로 F1106-13-3 F(ab')2-HRP를 희석한 용액을 각 웰에 첨가하고, 25℃에서 2시간 반응시켰다. 마찬가지로 5회 플레이트를 세정 후, TMB 용액을 첨가하고, 실온 20분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더로 측정하였다.
9-(4) 특이성의 평가 (1)
9-(1)에서 정제한 개변체의 특이성을 평가하기 위해서, P03 펩티드(실시예 6에서 제작, 서열 번호 1)를 고정한 플레이트를 사용하여 ELISA를 실시하였다. 비교를 위하여, F1466-26의 평가도 행하였다.
즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 BSA, 또는 P03 펩티드-BSA를 각각 플레이트에 고정화 후, 블로킹하였다.
9-(1)에서 얻어진 단백 농도의 결과로부터 D-PBS로 희석하여, 500ng/mL로 제조하였다. 각 희석액을 1웰당 50μL 첨가하고, 플레이트를 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하였다. 다음으로 항토끼 Igs-HRP(DAKO, P448)를 희석한 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 마찬가지로 플레이트를 세정 후, TMB 용액을 첨가하고, 실온 3-5분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더(몰리큘러 디바이스)로 측정하였다. 개변체의 개변한 CDR 서열과 함께, 결과를 표 16 내지 표 22에 나타내었다.
그 결과, 개변체의 87％가 P03 펩티드와 결합하는 것을 알았으며, P03의 위치를 에피토프로서 인식하고 있는 것이 시사되었다. 즉, 얻어진 개변체 중, 5795, 5803, 5811, 5810, 5784, 5793, 5858, 5878, 5875, 5876, 5844, 5874 및 5684는 P03의 위치를 에피토프로서 인식하고 있는 것이 시사되었다.
9-(5) 친화성의 평가
개변체의, 프레세프신(9-(2)에서 제조한 rsCD14ST-FC를 사용했다), P03 펩티드 및 S68 펩티드와의 친화성(KD)을 평가하였다. 또한, S68 항체, 래트 유래 모노클로날 항체(F1146-17-2) 및 F1466-26에 대해서도 마찬가지로 평가를 행하였다.
친화성의 측정은 BIACORE3000(GE 헬스케어)을 사용하여 행하였다. CM5 칩(GE 헬스케어)에 rsCD14ST-Fc, P03-BSA 및 S68-BSA를 통상의 방법에 의해 각각 고정화하고, 각 항체의 연속 희석물(1.6-1000nM)을 첨가하고, 각각의 항원에 대한 결합 양식을 측정하였다. 센서그램을 플롯하고, 결합 속도 상수(Ka) 및 해리 속도 상수(Kd)를 구하고, 평형 해리 상수(KD)를 산출하였다.
S68 항체, 래트 유래 모노클로날 항체(F1146-17-2) 및 F1466-26의 rsCD14ST-FC에 대한 친화성(KD) 측정의 결과를 표 15에 나타냈다.
그 결과, F1466-26은(KD값은 1.48E-09), S68 항체(KD값은 1.08E-08)와 비교하여, 프레세프신과의 친화성이 KD값으로 약 10배 높았다. 또한, F1466-26은 래트 유래 모노클로날 항체(F1146-17-2: KD값은 1.08E-05)와 비교하면, 프레세프신과의 친화성(KD값)이 약 10000배 높은 것을 알았다.
각 개변체의 rsCD14ST-FC에 대한 친화성(KD) 측정의 결과를, 개변한 CDR 서열과 함께 표 16 내지 표 22에 나타냈다. 그 결과, 개변체의 80％가 S68 항체와 비교하여 동등 이상의 친화성을 갖는 것을 알았다. F1466-26의 CDR 서열의 개변에 의해, 프레세프신과의 친화성(KD값)이 F1466-26에 비하여, 약 1000배 상승한 개변체(5810)가 얻어졌다.
본 발명의 바람직한 형태의 하나는, 항체의 프레세프신에 대한 친화성이, S68 항체의 프레세프신에 대한 친화성과 비교하여 우수한 항체이며, KD값으로 비교하면, 바람직한 항체로서는, 예를 들어 F1466-26, 개변체의 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844, 5684를 들 수 있었다. 또한, 항체의 KD값이 10-8 미만을 나타내는 항체도 바람직하고, F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844, 5684를 들 수 있었다. 또한, 항체의 KD값이, S68 항체의 KD값의 1/2 이하를 나타내는 프레세프신과의 친화성이 우수한 항체도 바람직하고, F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, 5793을 들 수 있다. 특히 우수한 KD값을 나타낸 것은 5793(7.3E-10)과 5810(6.52E-12)이었다.
F1466-26의 중쇄 전장과 F1466-5의 경쇄 전장을 조합한 개변체 5684는 P03 특이성 및 프레세프신과의 결합 활성이 유지되는 것을 알았다. F1466-26과 F1466-5는, 동일한 P03의 위치를 에피토프로서 인식하는 항체인 것으로부터, 동일한 특이성을 갖는 항체 간에 서열을 치환해도, 항체의 활성은 유지될 가능성이 시사되었다.
실시예 2에서 나타낸 바와 같이, P03을 에피토프로서 인식하는 F1466-5 및 F1466-26의 중쇄 CDR3 서열은 모두 GDF이며, 3아미노산이라고 하는 비교적 짧은 서열에 의해 구성되어 있어, 본 항체의 특징적인 점으로 생각되었다.
또한, 개변체의 5793에서는, 중쇄 CDR3의 3번째의 개변에 의해 친화성의 상승이 보여진 것으로부터, 중쇄 CDR3의 3번째의 아미노산은 항체의 활성에 영향을 미칠 가능성이 시사되었다.
[표 15]
Figure 112020013464947-pct00038
[표 16]
Figure 112016081786898-pct00018
[표 17]
Figure 112016081786898-pct00019
[표 18]
Figure 112016081786898-pct00020
[표 19]
Figure 112016081786898-pct00021
[표 20]
Figure 112016081786898-pct00022
[표 21]
Figure 112016081786898-pct00023
[표 22]
Figure 112020013464947-pct00039
9-(6) 특이성의 평가 ( 2) 펩티드 경합 저지 반응
실시예 6에 준하여, 각 개변체와 프레세프신의 반응에 대한, P01부터 P08 펩티드에 의한 경합 저지 반응 시험을 행하였다.
시험은, 개변체를 고상으로 고정화한 ELISA를 사용하여 실시하였다. 즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 개변체를 고정화 후, 블로킹하였다. 프레세프신 표준품(300pg/mL)을 1웰당 25μL 첨가하였다. 계속하여 희석한 각 펩티드(0.01-10μg/mL)를 25μL 첨가하였다. 플레이트를 25℃에서 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하였다. 다음으로 F1106-13-3 F(ab')2-HRP를 희석한 용액을 각 웰에 50μL 첨가하고, 25℃에서 2시간 반응시켰다. 마찬가지로 5회 플레이트를 세정 후, TMB 용액을 첨가하고, 실온 30-40분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더로 측정하였다. 음성 대조군으로서 펩티드 무첨가(PBS라 기재), 양성 대조군으로서 S68 펩티드를 사용하였다. PBS의 흡광도를 100％로 하여 각 펩티드의 저지율을 계산하였다. 그 결과, 표 23에 나타낸 바와 같이, 시험을 실시한 개변체는 모두 P03 서열을 특이적으로 인식하고 있는 것이 확인되었다.
[표 23]
Figure 112016081786898-pct00025
( 실시예 10) 개변체의 평가 (2)
실시예 8에서 제조한 개변체 중, 실시예 9에서 평가를 행하고 있지 않은 개변체에 대해서, 프레세프신에 대한 결합 활성 및 특이성의 평가를 행하였다.
10-(1) ELISA에 의한 항체 농도의 측정
실시예 8-(4)에서 얻어진 배양 상청 중의 IgG 농도를 확인하기 위해서, 샌드위치 ELISA를 사용하여 IgG 농도를 측정하였다. 즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 항토끼 항체(DAKO, Z196)를 플레이트에 고정화 후, 블로킹하였다. 정제 토끼 모노클로날 항체를 표준품으로 하여 희석액(0.1％ BSA/D-PBS)으로 희석하여 100-1.56 ng/mL의 표준액을 제조하였다. 이어서, 회수한 배양 상청을 희석액(0.1％ BSA/D-PBS)으로 희석하였다. 배양 상청 희석액 또는 표준품 희석열을 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하였다. 다음으로 항토끼 Igs-HRP(DAKO, P399)를 희석한 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온 1시간 반응시켰다. 마찬가지로 5회 플레이트를 세정 후, 테트라메틸벤지딘 용액(TMB, BioFix)을 첨가하고, 실온 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지하고, 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더(몰리큘러 디바이스)로 측정하였다. 각 배양 상청 중의 항체 농도는 표준품 농도 희석열의 검량선을 사용하여 산출하였다.
10-(2) 프레세프신에 대한 결합 활성 및 특이성의 평가
개변체의 프레세프신에 대한 결합 활성 및 특이성을 평가하기 위해서, 항원을 고상으로 고정한 플레이트를 사용하여 ELISA를 실시하였다.
즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 BSA, rsCD14ST-Fc 또는 P03 펩티드-BSA를 각각 플레이트에 고정화 후, 블로킹하였다.
배양 상청의 IgG 농도의 결과로부터 배양 상청을 D-PBS로 희석하여, 500ng/mL로 제조했다(항체 농도가 옅은 것은 배양 상청의 원배(原倍)를 사용했다). 각 상청 희석액을 1웰당 50μL 첨가하고, 플레이트를 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하였다. 다음으로 항토끼 Igs-HRP(DAKO, P448)를 희석한 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 마찬가지로 플레이트를 세정 후, TMB 용액을 첨가하고, 실온 3-5분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더(몰리큘러 디바이스)로 측정하였다.
프레세프신에 대한 결합 활성의 평가에서는, 비교를 위하여, S68 항체의 평가도 행하였다. 프레세프신에 대한 결합 활성은 S68 항체와 sCD14ST-Fc의 반응 시의 흡광도를 1로 했을 때의, 각 항체와 rsCD14ST-Fc의 반응 시의 흡광도의 비로 나타냈다. 결과를, 각 개변체의 개변된 서열과 함께 표 24 내지 표 29에 나타내었다.
그 결과, 항체의 대부분이 P03과 결합하는 것이 확인되어, 76％의 항체가 P03을 에피토프로서 인식되고 있는 것이 시사되었다.
또한, F1466-26 및 개변체의 대부분은, S68 항체와 비교하여, 흡광도비로 약 4 내지 5배 높은, 프레세프신에 대한 우수한 결합 활성을 갖고 있었다. F1466-26의 프레세프신에 대한 KD값 및 흡광도비와 비교하면, 이 항체의 프레세프신에 대한 KD값은, 실시예 9에서 측정된, 항체의 프레세프신에 대한 바람직한 KD값과 동일 정도라고 생각되었다.
본 발명의 바람직한 형태의 하나는, 항체의 프레세프신에 대한 결합 활성이, S68 항체의 동 활성과 비교하여 우수한 항체이다. 예를 들어, 본 실시예에 준하여 흡광도를 사용하는 경우, S68 항체 이상의 흡광도를 나타내는 항체, 바람직하게는 S68 항체의 2배 이상의 흡광도를 나타내는 항체가 바람직하다고 생각되었다.
얻어진 항체 중, 프레세프신에 대한 결합 활성이, S68 항체의 5배 이상의 흡광도를 나타내는, 특히 결합 활성이 우수한 항체는 5934, 5935, 5939, 5944, 5808, 5809, 5824, 5979, 5980, 5983, 5984, 5987, 5988, 5860, 5864, 5863이었다. 그 중에서도, 5979, 5983, 5988, 5864는 S68 항체의 5.5배 이상의 흡광도를 나타내고, 특히 우수한 프레세프신에 대한 결합 활성을 갖고 있었다.
[표 24]
Figure 112016081786898-pct00026
[표 25]
Figure 112016081786898-pct00027
[표 26]
Figure 112016081786898-pct00028
[표 27]
Figure 112016081786898-pct00029
[표 28]
Figure 112016081786898-pct00030
[표 29]
Figure 112016081786898-pct00031
(실시예 11)
합성 펩티드를 항원으로 한 파지 디스플레이법을 사용한 모노클로날 항체의 제작
실시예 1-(1)에 있어서, S68 펩티드-KLH를 투여 항원으로 하여 토끼에게 면역하여 회수한 비장으로부터의 임파구를 사용하여, 파지 디스플레이법에 의해 모노클로날 항체를 제작할 수 있다.
11-(1) 면역 F( ab ) 파지 라이브러리의 구축
CARLOS F. BARBASIII 등 Phage Display A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 실시예 1-(1)에서 회수한 임파구로부터 TRIZOL Reagent(Life Technologies)를 사용하여 토탈(total) RNA를 추출하고, SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies)로 단일쇄 cDNA를 합성한다. 이 cDNA로부터 BARBARSIII 등으로부터 보고되어 있는 토끼 항체 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 중쇄 가변 영역을 포함하는 단편과 경쇄 가변 영역을 포함하는 단편을 제조한다. 얻어진 토끼 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 CH1의 증폭 단편을 주형으로 하여 PCR에 의해 토끼/인간 키메라 중쇄 단편을 증폭하고, 토끼 경쇄 가변 영역(카파형 또는 람다형) 및 인간 경쇄 정상 영역의 증폭 단편을 주형으로 하여 토끼/인간 키메라 경쇄 단편을 증폭한다. 얻어진 이들 토끼/인간 키메라 중쇄 및 토끼/인간 키메라 경쇄의 단편을 주형으로 하여 최종적으로 토끼/인간 키메라 Fab 단편을 제조한다. 이어서, 항체 발현용 파지미드인 pCDisplay-4(Creative Biogene)를 제한 효소 SacI 및 SpeI로 절단하여, 파지미드 단편을 제조한다. 마찬가지로 토끼/인간 키메라 Fab 단편을 SacI 및 SpeI로 절단하고, 제조한 파지미드 단편에 cDNA 단편을 삽입하여, 파지 라이브러리 발현용 플라스미드를 제조한다.
11-(2) 파지 디스플레이용 파지 용액의 제조
11-(1)에서 제조한 플라스미드를 대장균 TG 1주(Alient Technologies)에 통상의 방법에 의해 형질 전환시켜, 대장균을 포함하는 용액을 암피실린을 첨가한 LB 배지의 플레이트에 파종한다. 37℃에서 배양 후, 형성된 콜로니를 회수하여 대장균의 라이브러리를 제조한다. 라이브러리의 일부를 배양하고, 이 대장균 현탁액에, 암피실린(Ampicillin) 및 글루코스(Glucose)를 첨가하고, 37℃에서 1시간, 진탕배양한다. 그 후, 헬퍼 파지 M13KO7(라이프 테크놀로지스)을 감염시키고, 또한 1시간, 진탕배양을 계속한다. 원심 분리에 의해 집균하고, 배양액을 버린 후, 10mL의 2×YT 배양액에 현탁하고, 37℃에서 진탕배양한다. 다음날, 배양 상청을 원심 분리 후, 상청 8mL를 다른 튜브에 옮기고, 2mL의 PEG/NaCl 용액을 첨가하여 혼합하고, 얼음 위에 1시간 정치한 후에, 침전한 파지를 원심 분리에 의해 회수하고, 이것을 파지 디스플레이용의 파지 용액으로 한다.
11-(3) 패닝법에 의한 목적 항체의 선택
11-(2)에서 제조한 파지 용액으로부터 패닝법에 의해 항체를 선택한다. 패닝은 2 종류의 방법으로 실시한다. 제1 방법으로서 BARBAS 등의 기재된 방법에 준하여 실시한다. 즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 S68-BSA를 플레이트로 고상화 후, 블로킹한다. 4％ 탈지유 0.2％ TritonX-100을 포함하는 D-PBS를 1웰당 50μL 첨가 후, 11-(2)에서 얻은 파지액을 50μL 첨가한다. 플레이트를 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.1％ TritonX-100을 포함하는 D-PBS로 세정한다. 다음으로 100mM 글리세린(Glycine)-HCl(pH 2.2)로 10분간 용출하고, 회수한 용액을 1M Tris-HCl(pH 7.4)로 중화한다. 이 용출액과 대장균 TG 1주를 혼합하고, 37℃에서 반응시켜, S68 펩티드 항원에 결합한 파지를 TG 1주에 재감염시킨다. 배양액에 암피실린, M13K 07 헬퍼 파지를 첨가하고, 37℃에서 반응시킨 후, 대장균을 회수하고, 배지 및 카나마이신을 첨가하고, 밤새 배양한다. 배양액부터 원심 분리에 의해 상청을 회수하고, PEG 처리에 의해 파지액을 제조한다. 동일한 조작을 3회 반복하고, S68 펩티드에 결합하는 특이적인 파지를 농축한다.
제2 방법으로서 실시예 12-(2)에 기재된 방법을 사용하여 마찬가지로 패닝을 3회 행하고, 프레세프신에 특이적인 파지를 농축한다.
11-(4) 항체의 결합 활성의 측정과 CDR 서열의 해석
11-(3)의, 파지를 감염시킨 TG 1 배양액을, Ampicillin을 포함하는 LB 플레이트에 파종하여 콜로니를 형성시킨다. 각각의 콜로니로부터 다시 파지 용액을 제조하고, EIA로 반응성의 확인을 행한다. 즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 BSA, S68-BSA, P03-BSA 및 sCD14ST-Fc를 플레이트에 각각 고정화 후, 블로킹한다. 4％ 탈지유, 0.2％ TritonX-100을 포함하는 D-PBS를 첨가 후, 회수한 파지액을 첨가한다. 플레이트를 1시간 반응시키고, 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정한다. 다음으로 HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(GE Healthcare)를 희석한 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온 1시간 반응시킨다. 마찬가지로 5회 플레이트를 세정 후, TMB 용액을 첨가하고, 실온 10-20분간 반응시킨다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지한다. 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더(ThermoMax, Molecular Devices)로 측정한다. 그 결과, 복수의 파지에서 결합이 확인된다. 그들 콜로니로부터 파지미드를 단리하고, 서열을 확인한다.
파지 디스플레이법에 의해, 하이브리도마법으로 얻어진 CDR 서열과는 다른 서열을 갖는, P03 및 프레세프신과 특이적으로 결합하는 항프레세프신 항체가 얻어진다.
( 실시예 12) 파지 디스플레이법을 사용한 중쇄 CDR3 서열의 개변체의 제작
중쇄 CDR3 서열은, 항체의 활성에 영향을 미치는 것이 예측되었기 때문에, 파지 디스플레이법을 사용하여, 중쇄 CDR3 서열의 개변체를 제작하고, 평가하였다.
12-(1) 파지 디스플레이법을 사용한 VH쇄 CDR3 서열의 개변체의 제조
VH CDR3 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하기 위해서, F1466-26의 중쇄와 경쇄를 포함하는 플라스미드 pTK-5956을 주형으로 하여, 프라이머쌍(p-nnk3-2s; 5' 인산화-GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC T-3': 서열 번호 91, p-nnk3-2a; 5' 인산화-GCC ACA AAA ATA AGT GGC CGT GTC CTC GGT TGT CGG ACT G-3' 서열 번호 92(N은 G, A, T, C 중 어느 하나를, K는 G 또는 T를 나타낸다))과 내열성 DNA 폴리메라아제(다카라 바이오)를 사용하여 PCR 반응을 행하고, 얻어진 증폭 단편을 DNA 리가아제에 의해 자기 결합시켰다. 이것을 대장균 XL1-Blue(아질렌트 테크놀로지)로 형질 전환하고, LB/Ampicillin/Tetracycline 한천 플레이트 상에서 배양하고, 다음날 발생한 콜로니를, 2×YT 배양액으로 회수하였다. 이 대장균 현탁액에, Ampicillin, Tetracycline 및 Glucose를 첨가하고, 37℃에서 1시간, 진탕배양을 행하였다. 그 후, 헬퍼 파지 M13KO7(라이프 테크놀로지스)을 감염시키고, 또한 1시간, 진탕배양을 계속하였다. 원심 분리에 의해 집균하고, 배양액을 버린 후, 10mL의 2×YT 배양액에 현탁하고, 32℃에서 진탕배양을 행하였다. 다음날, 배양 상청을 원심 분리 후, 상청 8mL를 다른 튜브에 옮기고, 2mL의 PEG/NaCl 용액을 첨가하여 혼합하고, 얼음 위에 1시간 정치한 후에, 침전한 파지를 원심 분리에 의해 회수하고, 이것을 VH CDR3 무작위 돌연변이 라이브러리의 파지 용액으로 하였다.
12-(2) 패닝법에 의한 목적 항체의 선택
12-(1)에서 제조한 라이브러리로부터 패닝을 실시하고, 항체를 선택하였다. 즉, 12-(1)에서 얻어진 파지액(2mL)과 sCD14ST-Fc 6μg과 37℃에서 반응시키고, 2시간 후 단백질 A 수지(Prosep-vA, 밀리 포어) 200μL을 첨가하고, 20분간 반응시켰다. 0.05％ Tween20을 포함하는 PBS로 5회 세정한 후, 수지에 용출액(Tris-HCl, Glycine(pH 2.2))을 첨가하여 8분간 정치 후, 용출한 파지액을 회수하고, 용액을 중화하였다. 이 회수액과 대장균 XL-1 Blue 배양액을 혼합하고, 37℃에서 반응시켰다. 1시간 후, L-Glutamine, 암피실린 및 헬퍼 파지 M13K 07(인비트로젠)을 첨가하고, 37℃에서 반응시켰다. 또한 1시간 후, 배지를 2xYT 배지로 교환하고, 밤새 배양하고 rsCD14ST-Fc에 특이적으로 결합한 파지를 회수하였다. 이 조작을 3회 반복하여 목적으로 하는 항체를 농축하였다.
12-(3) 프레세프신 특이적 서열을 포함하는 파지의 제조 및 CDR 서열의 결정
12-(2)에서 최종적으로 얻어진 파지액을 다시 XL-1 Blue에 감염시키고, 그 배양 상청을 2×YT의 플레이트에 파종하고, 콜로니를 제작하였다. 이 콜로니를 다시 XL-1 Blue와 배양하고, 헬퍼 파지를 첨가하여 단일 파지를 포함하는 파지 용액을 제조하였다. 다음으로 얻어진 파지액을 사용하여, ELISA로 반응성의 확인을 행하였다. 즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 sCD14ST-Fc를 플레이트에 고정화 후, 블로킹하였다. 4％ 탈지유, 0.2％ TritonX-100을 포함하는 D-PBS로 파지액을 2배 희석하고, 플레이트에서 1시간 반응시켰다. 계속하여 플레이트를 0.05％ Tween20을 포함하는 생리 식염수로 5회 세정하고, 희석한 HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(GE 헬스케어)를 각 웰 50μL 첨가하고, 실온 1시간 반응시켰다. 마찬가지로 5회 플레이트를 세정 후, TMB 용액을 첨가하고, 실온에서 반응시켰다. 반응 종료 후, 1M 황산 용액으로 반응을 정지하고, 450/650nm의 흡광도를 플레이트 리더(ThermoMax, Molecular Devices)로 측정하였다. 결합 활성을 확인할 수 있었던 파지액을 대장균에 감염시키고, 플라스미드를 통상의 방법에 의해 회수하고, 유전자 서열을 확인하였다.
12-(4) IgG 항체의 제조
얻어진 후보 파지로부터 파지미드를 회수하고, 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 단편을 제조하였다. 실시예 8에 기재된 방법에 따라, 중쇄 개변체 제조용 플라스미드를 제조하고, F1466-26의 경쇄 전장을 포함하는 경쇄 일과성 발현용 플라스미드(pTK-5608)와 함께, COS-1 세포에 형질감염하였다. COS-1 세포를 37℃에서 배양하고, 72시간 후, 배양 상청을 회수하였다.
12-(5) 중쇄 CDR3 서열의 개변체의 평가
얻어진 개변체에 대해서, 실시예 10-(2)와 동일한 시험을 실시하고, 프레세프신(rsCD14ST-Fc)에 대한 결합 활성 및 P03 특이성을 평가하였다. 개변한 중쇄 CDR3의 CDR 서열과 함께, 결과를 표 30에 나타내었다.
그 결과, 중쇄 CDR3에 3아미노산 모두 치환된 개변체 6027은, 다른 개변체와 비교하여, 프레세프신에 대한 반응성이 약간 낮았지만, S68 항체와의 비교에서는 거의 동등한 반응성을 갖고 있었다. 개변체의 6026, 6028 및 6029는 2아미노산이 치환되었지만, 프레세프신에 대한 반응성이 우수하였다. 이것으로부터, 중쇄 CDR3이 3아미노산으로 구성될 때, 2아미노산이 치환된 경우에도 항체의 활성이 유지될 가능성이 시사되었다. 개변체의 6028은 프레세프신과의 결합 활성이 특히 우수하였다.
[표 30]
Figure 112016081786898-pct00032
( 실시예 13) 트리글리세라이드 (TG) 간섭 시험
실시예 5 및 실시예 6에서는, P04-05를 에피토프로서 인식하는 항체에 의한 프레세프신 측정은 검체 중의 TG에 의한 간섭을 받기 쉽지만, P03을 에피토프로서 인식하는 항체에 의한 프레세프신 측정은 TG 간섭을 받기 어려운 것이 시사되었다.
13-(1) 정상인의 인간 혈청을 사용한 TG 간섭 시험(1)
또한 확인을 진행시키기 위해서, 정상인 검체에 있어서의 TG의 영향을 확인하였다. F1466-26(특이성: P03), F1466-5(P03) 및 F1466-19(P04-05)에 대해서, 정상인의 인간 혈청을 사용하여 TG 간섭 시험을 실시하였다.
정상인 검체(8검체)(EDTA 혈장, TENECEE BLOOD SERVICIES)에, TG를 최종 농도 10mg/mL가 되도록 첨가하고, 첨가 전후의 프레세프신 측정값을 비교하였다. 이때의 TG 농도는, 검체 중의 원래 포함되는 TG는 고려하고 있지 않다. 각 항체를 각각 고상으로 고정화한 플레이트를 사용하여, 실시예 9-(3)에 기재된 샌드위치 ELISA계를 사용하여 평가하였다. 결과를 도 1에 도시한다.
그 결과, P03을 에피토프로서 인식하는 항체인 F1466-26 및 F1466-5는, TG 첨가 전후에, 측정값의 변동이 거의 보이지 않았던 것에 비하여, P04-05를 에피토프로서 인식하는 항체인 F1466-19에서는, 측정값이 TG 첨가의 영향을 강하게 받았다. 프레세프신 측정값이 검체 중의 TG의 영향을 강하게 받는 항체에 의한 측정은 F1466-19와 같이, 원래 낮은 값을 나타내는 정상인의 측정값이 높게 나올 것으로 예상된다. 이 경우, 정상값과 이상값의 차가 나기 어려워진다. 이러한 항체는 검체 중의 프레세프신 측정에는 적합하지 않다고 할 수 있다. 한편, P03을 에피토프로서 인식하는 항체는 검체 중의 TG의 영향을 받기 어려워, 검체 중의 프레세프신 측정에 적합한 항체인 것이 확인되었다.
또한, 이 정상인의 인간 혈청을 사용한 시험은, P03을 에피토프로서 인식하는 항체를 사용한 분석계에서는, 고분자량 sCD14와의 교차 반응은 문제가 되지 않을 정도인 것을 뒷받침하는 것이다.
정상인의 인간 혈청 중, 프레세프신은 수백pg/mL인 것에 비해서, 고분자량 sCD14는 5.6 내지 11.2μg/mL 정도 존재하고 있어(WO2005/108429, 실시예 12), 만약 당해 항체가 고분자량 sCD14와 반응하는 것이라면 미량인 프레세프신은 측정 불가능하다.
본 실시예에 의해, P03을 에피토프로서 인식하는 항체를 사용한 분석계에서는, 고분자량 sCD14와의 교차 반응을 일으키지 않고, 수백pg/mL 정도의 미량의 프레세프신 측정이 가능한 것이 확인되었다(도 1).
13-(2) 개변체의 TG 간섭 시험 (2)
신규로 얻어진 개변체에 대해서, 실시예 5와 마찬가지로 TG 간섭 시험을 실시하고, 검체 중의 TG의 영향을 확인하였다. 개변체는 정제하여 사용하였다.
즉, Nunc사 면역 플레이트(MAXISORP, C96, 430341)에 개변체를 고정화 후, 블로킹하였다. 프레세프신 표준품을 희석액으로 희석하여 프레세프신의 농도 계열(15.6-500pg/mL)을 제조하였다. 인간 검체 3종류에 트리글리세라이드(인트라리피드, 프레세니우스 카비 재팬)를 첨가하고, 최종 농도 6.7, 13.3, 20mg/mL가 되도록 제조하였다. 인간 검체는, 패혈증 환자의 혈청 1예와 정상인의 인간 혈청에 일정량의 프레세프신을 첨가한 검체 2예를 사용하였다. 또한, 이 TG 농도는, 검체에 원래 포함되는 TG는 고려하고 있지 않다. 검체를 희석액으로 20배 희석하고, TG 무첨가 또는 각 농도의 TG를 첨가한 샘플, 또는 표준품 희석열을 각 웰에 첨가하였다. 실시예 9-(3)과 마찬가지로 샌드위치 ELISA계를 사용하여 측정을 실시하였다. 검체 중의 TG 농도 20mg/mL인 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하인 검체의 비율(％)을 표 31에 나타내었다.
그 결과, P03을 에피토프로서 인식하는 항체는 트리글리세라이드의 영향을 받기 어려운 것이 확인되었다.
[표 31]
Figure 112016081786898-pct00033
( 실시예 14) 바람직한 성능을 갖는 개변체의 리스트
본 발명의 실시예 8 및 12에서 얻어진, 바람직한 성능을 갖는 항체의 CDR 서열을 도 2 내지 도 2b에 나타내었다(서열 번호 93 내지 156). 실시예 8 및 12에 있어서 제작한 항체의 수의 합계는 109개이며, 바람직한 항체의 수는 65개였다.
항체의 프레세프신에 대한 친화성(KD값)이 10-8M 미만인 항체는 ○, 10-9M 미만의 항체는 ◎로서 평가하였다. KD값이 10-7M 미만이지만, S68 항체의 프레세프신에 대한 친화성과 거의 동등한 친화성을 갖는 항체는 △로서 평가하였다. KD값에 의한 평가에서, 특히 프레세프신과의 결합 활성이 우수한 항체는 5793과 5810이었다.
프레세프신에 대한 결합 활성은 S68 항체와 sCD14ST-Fc의 반응 시의 흡광도를 1로 했을 때의, 각 항체와 rsCD14ST-Fc의 반응 시의 흡광도의 비로 평가되었다. 항체는 흡광도비가 4 이상인 항체는 ○, 5.5 이상인 항체는 ◎로서 평가하였다. 흡광도비에 의한 평가에서, 특히 프레세프신과의 결합 활성이 우수한 항체는 5864, 5979, 5983, 5988 및 6028이었다.
SEQUENCE LISTING <110> Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Novel anti-presepsin antibody <130> MD1040WO,G1025WO <150> 61/944,674 <151> 2014-02-26 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Synthesis <400> 1 Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Synthesis <400> 2 Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 356 <212> PRT <213> Synthesis <400> 3 Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val 1 5 10 15 Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys 20 25 30 Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu 35 40 45 Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala 50 55 60 Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala Ala 65 70 75 80 Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala Tyr 85 90 95 Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly Thr 100 105 110 Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala Glu 130 135 140 Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln 145 150 155 160 Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro Ala 165 170 175 Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg Gly 180 185 190 Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn Leu 195 200 205 Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ile Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala Ala 210 215 220 Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp Ser 245 250 255 Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln Val 260 265 270 Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys Asn 275 280 285 Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp Asn 290 295 300 Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320 His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser 325 330 335 Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala 340 345 350 Arg Gly Phe Ala 355 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 4 Arg Tyr Ala Met Gly 1 5 tag gta tgc aat ggg <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 5 Ile Ile Tyr Arg Asn Ile Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 atc att tat aga aat att aag aca tac tac gcg acc tgg gcc aaa ggc <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 6 Gly Asp Phe 1 ggg gac ttt <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 7 Arg Tyr Thr Met Gly 1 5 tag gta tac aat ggg <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 8 Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 atc att aat agt ggt gcc aca tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 9 Gly Asp Phe 1 ggg gac ttt <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 10 Ser Phe Trp Met Ser 1 5 tag ctt ctg gat gag <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 11 Ile Ile Ser Asp Ile Asp Asp Leu Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 att att agt gat att gat gac cta ttc tac gcg agc tgg gcg aaa ggc <210> 12 <211> 3 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 12 Gly Gly Leu 1 ggt ggt ttg <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 13 Ser Tyr Asp Met Ile 1 5 agc tac gac atg atc <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 14 Tyr Ile Gly Ser Pro Gly Thr Thr Tyr Tyr Gly Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 tac att ggg agt ccc ggg acc aca tac tac ggg agc tgg gcg aaa ggc <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 15 Ser Gly Asp Ile Thr Asn Arg Phe Asn Leu 1 5 10 tct ggt gat att act aat aga ttt aac ttg <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 16 Asn Tyr Asp Met Ile 1 5 aac tac gac atg atc <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 17 Tyr Ile Gly Ser Pro Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 tac att ggg agt ccc ggg acc act tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 18 Ser Gly Asp Ile Thr Asn Arg Phe Asn Leu 1 5 10 tct ggt gat atc aca aat aga ttt aat ttg <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 19 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ile Ser Asn Leu Ala 1 5 10 cag gcc agt gag gat att att agt aat tta gcc <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 20 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 aag gca tcc act ctg gca tct <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 21 Gln Ser Ser Tyr Thr Glu Ser Thr Thr Phe Gly His Val 1 5 10 cag agc agt tat act gag agt act act ttt gga cat gtt <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 22 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 cag gcc agt cag agt att ggt agt aat tta gcc <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 23 Lys Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 aag gca tct aaa ctg gca tct <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 24 Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Gly His Val 1 5 10 caa tgc agt tat act gca att ggt aat tat gga cat gtt <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 25 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 cag gcc agt cag agc att agt aac tac tta gcc <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 26 Lys Thr Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 aag aca tcc act ctg gaa tct <210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 27 Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Thr Thr Tyr Gly Asn Thr 1 5 10 caa agt act tat tat agg agt act aca act tat ggt aat act <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 28 Gln Ala Ser Glu Arg Ile Arg Asn Trp Leu Ser 1 5 10 cag gcc agt gag agg att agg aat tgg tta tcc <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 29 Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 agg gcc tcc act cta gaa tct <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 30 Gln Cys Ser Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn Ala 1 5 10 caa tgt agt gct ggt ggc aat gct ggt aat gct <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 31 Gln Ala Ser Glu Arg Ile Arg Asn Trp Leu Ser 1 5 10 cag gcc agt gag agg att agg aat tgg tta tcc <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 32 Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 agg gcc tcc act cta gaa tct <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus (Rabbit) <400> 33 Gln Cys Ser Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn Gly 1 5 10 caa tgt agt gct ggt ggc aat gct ggt aat ggt <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Synthesis <400> 34 Cys Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens (Human) <400> 35 Asn Leu 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norvegicus(Rat) <400> 44 Thr Phe Asp Cys 1 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus(Rat) <400> 45 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus(Rat) <400> 46 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus(Rat) <400> 47 Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 48 <211> 29 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 48 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser 20 25 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 49 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 1 5 10 <210> 50 <211> 30 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 50 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 1 5 10 15 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val 20 25 30 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 51 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 29 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 52 Gln Ser Val Glu Gly Ser Arg Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn 20 25 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 53 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 31 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 54 Arg Tyr Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Leu 1 5 10 15 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 55 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 43 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 56 Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu 20 25 30 Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys 35 40 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 57 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 58 <211> 32 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 58 Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 59 <211> 44 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 59 Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro 1 5 10 15 Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr 20 25 30 Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro 35 40 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Synthesis <400> 60 Asp Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys 20 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Synthesis <400> 61 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 62 <211> 32 <212> PRT <213> Synthesis <400> 62 Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 63 Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Lys Gly Lys 1 5 10 <210> 64 <211> 48 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 64 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Xaa Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Xaa Ser Gly Xaa Xaa Leu Ser 35 40 45 <210> 65 <211> 48 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 65 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Xaa Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 <210> 66 <211> 48 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 66 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser 35 40 45 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 67 Trp Val Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Xaa Ile Gly 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 68 Trp Val Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 1 5 10 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 69 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 70 <211> 31 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (6)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 70 Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ser Thr Thr Xaa Asp Leu Lys Xaa 1 5 10 15 Thr Ser Xaa Thr Thr Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Xaa Xaa 20 25 30 <210> 71 <211> 31 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 71 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Xaa 1 5 10 15 Thr Ser Xaa Thr Thr Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Xaa 20 25 30 <210> 72 <211> 31 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 72 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Xaa Xaa Ser Thr Thr Xaa Asp Leu Lys Met 1 5 10 15 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Gly 20 25 30 <210> 73 <211> 37 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 73 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser 20 25 30 Thr Val Thr Leu Gly 35 <210> 74 <211> 46 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (23)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 74 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Xaa Xaa Xaa Val Met Thr Gln Thr Pro Ala 20 25 30 Ser Val Xaa Xaa Xaa Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys 35 40 45 <210> 75 <211> 46 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 75 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Xaa Val Met Thr Gln Thr Pro Ala 20 25 30 Ser Val Xaa Xaa Xaa Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys 35 40 45 <210> 76 <211> 45 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 76 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys 35 40 45 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 77 Trp Xaa Gln Gln Lys Xaa Gly Gln Pro Pro Lys Xaa Leu Ile Xaa 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 78 Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 79 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Xaa Leu Ile Xaa 1 5 10 15 <210> 80 <211> 32 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 80 Xaa Xaa Xaa Ser Arg Xaa Xaa Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Leu Thr Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Ala Asp Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Cys 20 25 30 <210> 81 <211> 32 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 81 Gly Val Xaa Ser Arg Xaa Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Xaa 1 5 10 15 Leu Thr Xaa Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Xaa Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 82 <211> 32 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 82 Val Phe Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Ser Cys 20 25 30 <210> 83 <211> 32 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 83 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Xaa Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 84 <211> 36 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus(rabbit) <400> 84 Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro 1 5 10 15 Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr 20 25 30 Val Thr Ile Val 35 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Synthesis <400> 85 gggggtccgg aggtcgcctg gtcacgcctg g 31 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Synthesis <400> 86 gggtccggag gagacggtga ccagggtgcc 30 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Synthesis <400> 87 ttcattctca agcctcagac 20 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Synthesis <400> 88 ttttcactgc attctagttg tggt 24 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Synthesis <400> 89 gggaattcgc cgccaccatg gagcgcgcgt cctgc 35 <210> 90 <211> 35 <212> DNA <213> Synthesis <400> 90 gggatccacg cggaaccaga gcatactgcc gcggg 35 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Synthesis <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 91 ggtnnknnkn nktggggcca aggcaccctg gtcaccgtct 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Synthesis <400> 92 gccacaaaaa taagtggccg tgtcctcggt tgtcggactg 40 <210> 93 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 93 Ala Asp Phe 1 <210> 94 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 94 Gly Asp Ala 1 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 95 Arg Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 96 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 96 Ser Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Synthesis <400> 97 Ile Ile Ala Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 98 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 98 Ala Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Synthesis <400> 99 Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Ala Tyr Gly His Val 1 5 10 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 100 Gln Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Synthesis <400> 101 Gln Ser Ser Tyr Thr Glu Ser Thr Thr Phe Gly His Val 1 5 10 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Synthesis <400> 102 Lys Thr Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 103 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Synthesis <400> 104 Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Ala Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Synthesis <400> 105 Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Ala Gly 1 5 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Synthesis <400> 106 Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ala 1 5 10 15 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Synthesis <400> 107 Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Gly Lys Gly 1 5 10 15 <210> 108 <211> 16 <212> PRT <213> Synthesis <400> 108 Ile Val Ser Ser Asp Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Synthesis <400> 109 Ile Ile Tyr Arg Asn Ile Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Synthesis <400> 110 Ile Ile Ser Asp Ile Asp Gln Ile Val Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 111 <211> 16 <212> PRT <213> Synthesis <400> 111 Ile Ile Ser Asp Ile Asp Asp Leu Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Synthesis <400> 112 Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Gly His Ala 1 5 10 <210> 113 <211> 13 <212> PRT <213> Synthesis <400> 113 Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Ala His Val 1 5 10 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 114 Gln Ala Ala Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 115 Gln Gly Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Synthesis <400> 116 Ala Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Gly His Val 1 5 10 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Synthesis <400> 117 Lys Ala Ser Lys Ala Ala Ser 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Synthesis <400> 118 Lys Ala Ala Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 119 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Ala Ala 1 5 10 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 120 Ala Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Synthesis <400> 121 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 122 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ile Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Synthesis <400> 123 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Asp Leu Ser 1 5 10 <210> 124 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 124 Leu Asp Phe 1 <210> 125 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 125 Ser Asp Phe 1 <210> 126 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 126 Met Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 127 Pro Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 128 Val Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 129 Ile Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 130 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 130 Asp Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 131 Glu Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 132 His Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 133 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 133 Thr Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 134 Gln Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 135 Tyr Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 136 Gly Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 137 Lys Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 138 Asn Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Synthesis <400> 139 Trp Tyr Thr Met Gly 1 5 <210> 140 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 140 Gly Phe Phe 1 <210> 141 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 141 Gly Ser Phe 1 <210> 142 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 142 Gly Pro Phe 1 <210> 143 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 143 Gly His Phe 1 <210> 144 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 144 Gly Ile Phe 1 <210> 145 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 145 Gly Asn Phe 1 <210> 146 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 146 Gly Arg Phe 1 <210> 147 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 147 Gly Asp Ser 1 <210> 148 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 148 Gly Asp Pro 1 <210> 149 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 149 Gly Asp His 1 <210> 150 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 150 Gly Asp Asp 1 <210> 151 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 151 Gly Asp Ile 1 <210> 152 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 152 Gly Asp Asn 1 <210> 153 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 153 Gly Asp Arg 1 <210> 154 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 154 Gly Val Leu 1 <210> 155 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 155 Gly Gly Glu 1 <210> 156 <211> 3 <212> PRT <213> Synthesis <400> 156 Gly Leu His 1

Claims (22)

  1. (a) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 97의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL;
    (b) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 94의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL;
    (c) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL;
    (d) 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (e) 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR1, 서열 번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및 서열 번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 VL CDR3을 포함하는 VL,
    을 포함하는 항프레세프신 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 프레세프신에 대하여 10-8M 미만의 친화성(KD)으로 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편과 프레세프신의 결합이 저지되도록, 서열 번호 1의 서열로 이루어지는 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편과 프레세프신의 결합이 저지되도록, 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계(흡광도)에 있어서, 서열 번호 1의 8위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 서열로 이루어지는 아미노산 잔기에 의한, 상기 항체와 프레세프신의 결합의 경합 저지가 20％ 미만인, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아래 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상의 특성을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
    (i) 상기 항체는 고분자량 가용형 CD14와는 특이적으로는 결합하지 않음;
    (ii) 상기 항체를 사용하여, 복수의 검체에 대하여 트리글리세라이드(TG) 간섭 시험을 행할 때, 검체 중의 TG 농도가 20mg/mL일 때의 프레세프신 측정값의 해리도가 ±20％ 이하를 나타내는 검체의 비율이 50％ 이상임; 및
    (iii) 상기 항체를 사용하여 얻어진 검체 중의 프레세프신 측정값과, S68 항체를 사용하여 얻어진 검체 중의 프레세프신 측정값과의 상관 계수가 0.9 이상을 나타냄.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합성 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv), 및 sc(Fv)2로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 항원 결합성 항체 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
  9. 제8항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포인, 형질 전환주.
  11. 제9항에 기재된 형질 전환주를 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편의 제조 방법.
  12. 상기 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 포함하는, 프레세프신 측정용 키트.
  13. 상기 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 포함하는, 패혈증을 검출하기 위한 키트, 또는 패혈증의 검출 또는 진단을 보조하기 위한 키트.
  14. 상기 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편과, 프레세프신을 함유하는 검체를 접촉시키는 공정을 포함하는, 프레세프신의 측정 방법.
  15. 이하의 공정을 포함하는, 패혈증의 검출 방법, 또는 패혈증의 검출 또는 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법이며,
    1) 상기 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 사용하여, 검체 중의 프레세프신 농도를 측정하는 공정, 및
    2) 1)에서 얻어진 프레세프신 농도가 컷오프값보다 높은 값인지의 여부를 비교하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
  16. 다음의 공정을 포함하는, 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편의 스크리닝 방법이며,
    1) 후보의 항프레세프신 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 얻는 공정, 및
    2) 당해 항체와 프레세프신의 결합이 저지되도록, 서열 번호 1로 이루어지는 아미노산 잔기를 경합 반응시키는 반응계에 있어서, 상기 항체와 프레세프신의 결합이 50％ 이상 경합 저지되는 상기 항체 또는 항원 결합성 항체 단편을 선택하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
  17. 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프를 특이적으로 인식하는, 항프레세프신 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 프레세프신에 대하여 10-8M 미만의 친화성(KD)으로 결합하는, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 서열 번호 2에 기재된 펩티드를 투여 항원으로 하여 제작되는, 항체 또는 그의 항원 결합성 항체 단편.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 항원 결합성 항체 단편은, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv), sc(Fv)2로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 항원 결합성 항체 단편.
  21. 삭제
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