CN116003592A - 针对人血小板生成素的抗体 - Google Patents

Abstract

课题是提供用于高灵敏度地检测人血小板生成素的物质。解决手段是搞清楚了对人血小板生成素的包含82～84位的氨基酸序列的区域和包含127～131位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体，能够高灵敏度地检测人血小板生成素。

Description

针对人血小板生成素的抗体

技术区域

本发明涉及针对人血小板生成素的抗体。进而，本发明涉及利用该抗体的人血小板生成素免疫检测方法或特发性血小板减少性紫癜的检查方法。本发明还涉及包含所述抗体的、用于免疫检测人血小板生成素的组合物或用于检查特发性血小板减少性紫癜的组合物。

背景技术

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是与基础疾病、原因药剂等无关地血小板数减少、引起出血症状的疾病。其诊断也有病因不明的情况，基本上为排除诊断。即，在虽然发现了血小板减少(10万/μl以下)，但在血液检查项目中没有确认红细胞系统和白细胞系统的异常，并且能够排除带来血小板减少的其他疾病的情况下，诊断为ITP。

关于该血液检查项目，在ITP中，确认了作为血小板特异的造血因子的血小板生成素(TPO)的减少。因此，在日本，血浆TPO值现状下为任意的检查项目，但期待今后作为一般的临床检查的普及。进而，由于TPO的血中浓度极低，因而该检查方法需要高的灵敏度。因此，TPO的高灵敏度检测药剂的开发成为本疾病领域中的社会课题之一。

关于这一点，作为TPO检测药剂已知例如，由R&D systems社提供的ELISA试剂盒(Quantikine(注册商标)ELISA Human Thrombopoietin Immunoassay目录编号：DTP00B、非专利文献1)；1996年由麒麟酒造开发的未发售的ELISA试剂(非专利文献2)。

然而，已经搞清楚前者由于灵敏度不足而不能正确地测定健常人的约80％的血浆TPO浓度，另外关于后者，有检测需要2天等问题，尚未有能够在ITP的检查等中利用的TPO检测药剂。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：R&D systems社、“Quantikine ELISA Human ThrombopoietinImmunoassay目录编号：DTP00B”的使用说明书、2017年

非专利文献2：T Tahara等、Br J Haematol.、1996年6月、93卷、4号、783～788页

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于所述现有技术所具有的课题而做出的，目的是提供能够适应ITP的检查等的、用于高灵敏度地检测人TPO的物质。

用于解决课题的手段

本发明者们为了实现所述目的而反复进行了深入研究，结果获得了对人TPO显示高反应性的抗体2个克隆(Clone.a004,a020)。并且发现，这些抗体针对在82位的甘氨酸中导入了突变的人TPO、在84位的苏氨酸中导入了突变的人TPO、在127位的异亮氨酸中导入了突变的人TPO和在131位的苯丙氨酸中导入了突变的人TPO的反应性，与针对这些突变导入前(野生型)的人TPO的反应性相比均较低。即表明，通过以包含人TPO的82～84位的氨基酸序列的区域和包含127～131位的氨基酸序列的区域作为表位，所述抗体能够高反应性地检测人TPO。

然后，使用该抗体，构建免疫检测人TPO的体系(化学发光酶免疫测定体系)，检测各种样品中的人TPO，结果表明，能够短时间且高灵敏度地定量检测。特别发现，通过使用上述抗体，与现有的TPO检测药剂(由R&D systems社提供的ELISA试剂盒、非专利文献1)相比，能够以高达4倍的灵敏度检测人TPO，从而完成了本发明。

即，本发明涉及针对人TPO的抗体，另外，涉及利用该抗体的、人TPO的免疫检测方法或特发性血小板减少性紫癜的检查方法。进而，本发明涉及包含所述抗体的、用于免疫检测人TPO的组合物或用于检查特发性血小板减少性紫癜的组合物，更具体地涉及以下。

＜1＞针对人血小板生成素的抗体，是对人血小板生成素的包含82～84位的氨基酸序列的区域和包含127～131位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体。

＜2＞针对人血小板生成素的抗体，是对人血小板生成素的82位的甘氨酸、84位的苏氨酸、127位的异亮氨酸和131位的苯丙氨酸显示反应性的抗体。

＜3＞针对人血小板生成素的抗体，是对在82位的甘氨酸中导入了突变的人血小板生成素、在84位的苏氨酸中导入了突变的人血小板生成素、在127位的异亮氨酸中导入了突变的人血小板生成素和在131位的苯丙氨酸中导入了突变的人血小板生成素突变体的反应性，均与对野生型的人血小板生成素的反应性相比更低的抗体。

＜4＞根据＜3＞所述的抗体，被导入到所述人血小板生成素突变体中的突变均为向丙氨酸的替换。

＜5＞针对人血小板生成素的抗体，该抗体

(a)保持有序列号3～5所记载的氨基酸序列、或在序列号3～5所记载的氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列分别作为重链互补决定区1～3，并且保持有序列号7～9所记载的氨基酸序列、或在序列号7～9所记载的氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列分别作为轻链互补决定区1～3，或者

(b)保持有序列号11～13所记载的氨基酸序列、或在序列号11～13所记载的氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列分别作为重链互补决定区1～3，并且保持有序列号15～17所记载的氨基酸序列、或在序列号15～17所记载的氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列分别作为轻链互补决定区1～3。

＜6＞针对人血小板生成素的抗体，该抗体

(a)保持有包含序列号2所记载的氨基酸序列、与序列号2所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列、或在序列号2所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的重链可变区，并且保持有包含序列号6所记载的氨基酸序列、与序列号6所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列、或在序列号6所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的轻链可变区，或者，

(b)保持有包含序列号10所记载的氨基酸序列、与序列号10所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列、或在序列号10所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的重链可变区，并且保持有包含序列号14所记载的氨基酸序列、与序列号14所记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列、或在序列号14所记载的氨基酸序列中替换、缺失、添加和/或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的轻链可变区。

＜7＞针对人血小板生成素的抗体，是在对人血小板生成素的结合中与＜5＞或＜6＞所述的抗体竞争的抗体。

＜8＞使用＜1＞～＜7＞中的任一项所述的针对人血小板生成素的抗体，免疫检测人血小板生成素的方法。

＜9＞根据＜8＞所述的方法，进一步使用对人血小板生成素的包含57～61位的氨基酸序列的区域和包含102～115位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体，免疫检测人血小板生成素。

＜10＞根据＜8＞或＜9＞所述的方法，所述检测通过化学发光酶免疫测定法进行。

＜11＞特发性血小板减少性紫癜的检查方法，使用＜8＞～＜10＞中的任一项所述的方法。

＜12＞用于免疫检测人血小板生成素的组合物，包含＜1＞～＜7＞中的任一项所述的针对人血小板生成素的抗体。

＜13＞用于免疫检测人血小板生成素的组合物，进一步包含对人血小板生成素的包含57～61位的氨基酸序列的区域和包含102～115位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体。

＜14＞根据＜12＞或＜13＞所述的组合物，用于通过化学发光酶免疫测定法进行所述检测。

＜15＞根据＜12＞～＜14＞中的任一项所述的组合物，用于检查特发性血小板减少性紫癜。

＜16＞＜1＞～＜7＞中的任一项所述的针对人血小板生成素的抗体的用途，用于制造用于检查特发性血小板减少性紫癜的组合物。

此外，上述的对人TPO显示高反应性的抗体2克隆(Clone.a004,a020)的氨基酸序列如下。

[a004]

重链可变区(HV)…序列号10所记载的氨基酸序列、重链互补决定区1～3(HV CDR1～3)…序列号11～13所记载的氨基酸序列、轻链可变区(LV)…序列号14所记载的氨基酸序列、轻链互补决定区1～3(LV CDR1～3)…序列号15～17所记载的氨基酸序列

[a020]

HV…序列号2所记载的氨基酸序列、HV CDR1～3…序列号3～5所记载的氨基酸序列、LV…序列号6所记载的氨基酸序列、LV CDR1～3…序列号7～9所记载的氨基酸序列。

发明的效果

根据本发明，能够高灵敏度地检测人TPO。进而，根据本发明，能够短时间且定量地检测人TPO。因此，适合用于特发性血小板减少性紫癜的检查等。另外，现有的在TPO检测药剂(例如，非专利文献1、2中记载的ELISA试剂等)中使用的抗人TPO抗体是多克隆抗体，因而在供应稳定性方面存在困难。另一方面，本发明中，在人TPO的检测中使用的抗体能够以单克隆抗体的状态利用，因而在这方面有用性高。

另外，有这样的报告：人TPO存在C末端被切割的形态，并且具有TPO受体结合活性(TAKASHI KATO等、Stem Cells 1998；16：322～328)。本发明中，也能够检测这样的C末端切割TPO。

附图说明

图1是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a003,a004,a015,a020)对人血小板生成素(人TPO)的反应性的结果的图。

图2A是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a015,a020)对人TPO全长(TPO_Full)的反应性的结果的图。

图2B是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a015,a020)对人TPO的N末端片段(TPO_1-174)的反应性的结果的图。

图3A是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004)与人TPO的结合中的、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004)的抑制效果的结果的图。

图3B是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004)与人TPO的结合中的、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020)的抑制效果的结果的图。

图3C是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020)与人TPO的结合中的、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004)的抑制效果的结果的图。

图3D是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020)与人TPO的结合中的、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020)的抑制效果的结果的图。

图4是显示通过夹心ELISA法评价了抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)对人TPO或小鼠TPO的反应性的结果的图。

图5A是显示利用突变型人TPO的、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)的表位分析方法的概要的图。图中上部显示在人TPO(全长)的C末端侧连接了Myc标签和6×His标签的融合蛋白质的概要。在本表位分析中，如图中下部的[测定]所示，通过使用所述融合蛋白质或在该蛋白质中导入了各种氨基酸替换的突变体(参照表1)、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)和抗6×His标签单克隆抗体(mAb)的夹心ELISA法，评价了所述抗TPO兔单克隆抗体对所述融合蛋白质或其突变体的反应性。另外，该评价时，如图中下部的[对照]所示，也进行使用所述融合蛋白质或其突变体、抗6×His标签mAb和HRP标记抗Myc标签mAb的夹心ELISA法，用它们的测定值来修正所述[测定]中的各突变体之间的表达量的差异。

图5B是显示在图5A中显示了概要的、抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)的表位分析的结果的图。

图6是显示在后述的实施例中构建的化学发光自动化TPO测定系统(TPO-CLEIA)的概要的图。在该测定系统中，将经ALP标记的抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020、图中的“ALP标记抗体”)、与固相化于磁珠的抗TPO小鼠单克隆抗体(TN1抗体)、与样品混合，通过抗原-抗体反应而形成它们的免疫复合体。接着，将未结合的抗体等通过B/F分离而除去之后，与针对ALP的化学发光底物反应，以该化学发光作为指标，测定所述样品中的TPO量。

图7是显示将TPO-CLEIA的性能通过稀释线性试验进行了评价的结果的图。

图8A是显示分析了TPO-CLEIA的检出限(LoD)的结果的图。

图8B是显示分析了由R&D systems社提供的ELISA系统(R&D-ELISA)的LoD的结果的图。

图9是显示分析了TPO-CLEIA的测定限(LoQ)的结果的图。

图10是显示通过TPO-CLEIA分析了健常人的样本的结果的图。横轴显示TPO的浓度，纵轴显示对应于各浓度的健常人的样本数。

具体实施方式

＜针对人血小板生成素的抗体＞

如后述的实施例所示，本发明者们获得了对人血小板生成素显示高反应性的抗体2克隆(Clone.a004,a020)。并且发现，这些抗体都是针对导入了82位的甘氨酸的人血小板生成素、在84位的苏氨酸中导入了突变的人血小板生成素、在127位的异亮氨酸中导入了突变的人血小板生成素和在131位的苯丙氨酸中导入了突变的人血小板生成素的反应性，与针对这些突变导入前(野生型)的人血小板生成素的反应性相比，均较低。

于是，本发明是针对人血小板生成素的抗体，能够获得以下的状态。

(1)对人血小板生成素的包含82～84位的氨基酸序列的区域和包含127～131位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体。

(2)对人血小板生成素的82位的甘氨酸、84位的苏氨酸、127位的异亮氨酸和131位的苯丙氨酸显示反应性的抗体。

(3)作为针对人血小板生成素的抗体，针对在82位的甘氨酸中导入了突变的人血小板生成素、在84位的苏氨酸中导入了突变的人血小板生成素、在127位的异亮氨酸中导入了突变的人血小板生成素和在131位的苯丙氨酸中导入了突变的人血小板生成素突变体的反应性，与针对野生型的人血小板生成素的反应性相比，均较低的抗体。

本发明中，“血小板生成素(Thrombopoietin、TPO)”是指促进骨髓中的巨核细胞的增加/成熟、增加血小板数的血小板特异的造血因子，作为人来源的，典型地为包含NCBIReference Sequence:NP_000451所记载的氨基酸序列(由NCBI Reference Sequence:NM_000460中记载的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的22～253位的氨基酸(序列号1所记载的氨基酸序列)的蛋白质。

此外，在NP_000451所记载的氨基酸序列中，由1～21位的氨基酸组成的序列是信号序列，该序列被除去之后，所述蛋白质作为成熟型被分泌。在本发明中，TPO中的氨基酸的位置只要不特别说明，就将该成熟型(序列号1所记载的氨基酸序列)中的N末端(最初)的氨基酸(NP_000451所记载的氨基酸序列中的22位的丝氨酸)作为1位表示。

另外，基因的DNA序列通过其突变等而在自然界(即，非人工地)突变，由其编码的蛋白质的氨基酸序列也随之改变。进而，在TPO中，包含所述NP_000451(异形体1)在内，已知4个异形体。因此，被本发明的抗体检测等的人TPO不限于由所述典型的氨基酸序列组成的蛋白质，也包含这样的天然突变体和异形体。

本发明中的“抗体”包含免疫球蛋白的全部类和亚类。“抗体”是包含多克隆抗体、单克隆抗体、另外还包含抗体的功能性片段的形态的含义。“多克隆抗体”是包含针对不同表位的不同抗体的抗体制备物。另外，“单克隆抗体”是指由实质上均一的抗体的集团得到的抗体(包含抗体片段)。与多克隆抗体相对照地，单克隆抗体是识别抗原上的单一的决定簇的。本发明的抗体优选为单克隆抗体。本发明的抗体是从自然环境的成分中分离和/或回收(即，分离)的抗体。

本发明的抗体只要对人TPO显示例如后述那样的反应性即可，对其来源、种类、形状等不特别限定。具体地，包含非人动物来源的抗体(例如，兔抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)、人来源的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和这些抗体的功能性片段。

本发明中所谓抗体的“功能性片段”，是指作为抗体的一部分(部分片段)，与人TPO显示反应性的片段。具体可列举Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、双特异性抗体、多特异性抗体、和它们的聚合物等。

这里，“Fab”是指包含1个轻链和重链的一部分的免疫球蛋白的一价的抗原结合片段。可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化来得到，另外可以通过重组方法来得到。“Fab’”包含抗体的铰链区的1个或多于1个半胱氨酸，由于重链CH1结构域的羧基末端的几个残基的添加而与Fab不同。“F(ab’)2”是指包含两条轻链和两条重链的部分的免疫球蛋白的二价的抗原结合片段。

“可变区片段(Fv)”是具有完全的抗原识别和结合部位的最小的抗体片段。Fv是重链可变区和轻链可变区通过非共价键强地连接而成的二聚体。“单链Fv(scFv)”包含抗体的重链可变区和轻链可变区，这些区域存在于单一的多肽链。“sc(Fv)2”是将2个重链可变区和2个轻链可变区用接头(linker)等结合而制成单链而得的片段。“双特异性抗体”是具有二个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段在同一多肽链中包含与轻链可变区结合的重链可变区，各区域与其他链的互补区形成配对。“多特异性抗体”是对至少2种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，可以通过同时表达二条重链具有不同特异性的二组免疫球蛋白重链/轻链对来制备。

本发明中，所谓“反应性”是指针对作为抗原的人TPO的结合活性(亲和性)和/或特异性。该反应性如后述的实施例所示，只要是本领域技术人员，就可以通过免疫学方法来评价。例如，在使用后述的实施例所示的夹心ELISA法(捕捉用抗体为后述的TN1抗体、检测用抗体为经HRP标记的试验抗体、抗原为人TPO(全长)的检测系统)评价的情况下，如果吸光度(OD_450-620)为0.2以上，则可以评价该试验抗体对人TPO显示反应性(结合活性)。进而，在该情况下，作为对人TPO显示反应性的抗体，优选所述吸光度为0.3以上，更优选为0.4以上，进一步优选为0.5以上，更优选为0.8以上，进一步优选为1.0以上，进一步优选为2.0以上。另外，在后述的实施例所示的夹心ELISA法中，如果抗原存在下(添加浓度：1ng/ml)与不存在下的吸光度之比(S/N比)为10以上，则可以评价该试验抗体对人TPO显示反应性(特异性)。进而，在该情况下，作为对人TPO显示反应性的抗体，优选所述S/N比为20以上，更优选为30以上，进一步优选为40以上，更优选为50以上，进一步优选为60以上，更优选为70以上，进一步优选为80以上。

另外，对人TPO中包含82～84位的氨基酸序列的区域和包含127～131位的氨基酸序列的区域、尤其是82位的甘氨酸、84位的苏氨酸、127位的异亮氨酸和131位的苯丙氨酸是否显示反应性，例如，可以后述的实施例所示那样，通过检测针对人TPO突变体的反应性来评价。更具体地，如果针对在82位的甘氨酸中导入了突变的人TPO、在84位的苏氨酸中导入了突变的人TPO、在127位的异亮氨酸中导入了突变的人TPO和在131位的苯丙氨酸中导入了突变的人TPO的突变体的反应性，与针对突变导入前的人TPO(例如，野生型)的反应性相比更低，则可以评价导入了这些突变的氨基酸是抗体显示反应性的部位或包含它的区域(表位)。此外，“反应性低”是指例如，如后述的实施例所示，与野生型相比针对人TPO突变体的反应性的比率为50％以下，优选为30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为10％以下。另外，作为在人TPO突变体中导入的突变，可列举例如，向其他氨基酸(例如，与各部位的野生型的氨基酸不同的氨基酸)的替换，优选为向丙氨酸的替换。

另外，本发明中，如后述的实施例所示，提供保持有以下那样的可变区的针对人血小板生成素的抗体。

(a)保持有包含序列号2所记载的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号6所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

(b)保持有包含序列号10所记载的氨基酸序列的重链可变区、和包含序列号14所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

进而，如后述的实施例所示，对于本领域技术人员，只要抗体的氨基酸序列被确定，就能够基于其序列确定互补决定区(CDR)。因此，本发明还能够提供保持有以下那样的CDR的针对人血小板生成素的抗体。

(a)保持有由包含序列号2所记载的氨基酸序列的重链可变区确定的重链CDR1～3、和由包含序列号6所记载的氨基酸序列的轻链可变区确定的轻链CDR1～3的抗体。

(b)保持有由包含序列号10所记载的氨基酸序列的重链可变区确定的重链CDR1～3、和由包含序列号14所记载的氨基酸序列的轻链可变区确定的轻链CDR1～3的抗体。

此外，作为CDR的确定方法不特别限制，可列举例如，Kabat、Chothia、Aho、IMGT等公知的编码方案，更具体地，作为通过Kabat编码法确定的例子，可以列举保持有以下那样的CDR的针对人血小板生成素的抗体。

(a)保持有序列号3～5所记载的氨基酸序列分别作为重链CDR1～3、并且保持有序列号7～9所记载的氨基酸序列分别作为轻链CDR1～3的抗体。

(b)保持有序列号11～13所记载的氨基酸序列分别作为重链CDR1～3、并且保持有序列号15～17所记载的氨基酸序列分别作为轻链CDR1～3的抗体。

另外，本发明中，不仅包含保持有由这样的特定氨基酸序列组成的可变区和/或CDR的抗体，而且包含在不减少期望的活性(针对抗原的反应性等)的条件下其氨基酸序列被修饰了的抗体。这样的氨基酸序列突变体例如，可以通过向编码上述的可变区等的DNA的突变导入、或者肽合成来制作。这样的修饰包含例如，抗体的氨基酸序列内的残基的替换、缺失、添加和/或插入。关于抗体的氨基酸序列被改变的部位，只要与改变前的抗体具有同等的活性，则可以是抗体的重链或轻链的恒定区，还可以是可变区(框架区(FR)和CDR)。认为除了CDR以外的氨基酸的改变对于与抗原的结合亲和性的影响相对少，但现在改变CDR的氨基酸而筛选对抗原的亲和性提高了的抗体的方法是公知的(PNAS,102:8466-8471(2005)、Protein Engineering,Design&Selection,21:485-493(2008)、国际公开第2002/051870号、J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005)、Protein Engineering,Design&Selection,21：345-351(2008)、MAbs.Mar-Apr；6(2)：437-45(2014))。另外，现在，还可以通过利用综合计算化学系统等(例如，Molecular Operating Enviroment、カナダCCG社制)来模拟对抗原的亲和性提高了的抗体(例如，参照http://www.rsi.co.jp/kagaku/cs/ccg/products/application/protein.html)。进而，如Protein Eng Des Sel.2010Aug；23(8):643-51中记载的那样，在对抗原的亲和性方面已知重链可变区的CDR1和轻链可变区的CDR3不参与的例子，另外同样地，Molecular Immunology 44:1075-1084(2007))中报告了在大多数抗体中，轻链可变区的CDR2不参与对抗原的亲和性。这样，在抗体对抗原的亲和性中，并不需要重链可变区和轻链可变区各自的全部CDR1～3，就能够发挥同等的活性。实际上，在Biochem Biophys Res Commun.2003Jul 18；307(1)；198-205、J Mol Biol.2004Jul 9；340(3):525-42、J Mol Biol.2003Aug 29；331(5):1109-20中，报告了通过保持原抗体的至少1个CDR，从而维持了对抗原的亲和性的例子。

另外，关于本发明的抗体，在可变区中被改变的氨基酸数优选为10个氨基酸以内、更优选为5个氨基酸以内、进一步优选为3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内、1个氨基酸)。进而，该改变从整体上对与抗原的反应性的影响少这样的观点考虑，优选实施于CDR以外、即FR。另外，在CDR中被改变的氨基酸数优选为5个氨基酸以内、更优选为3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内、1个氨基酸)。

氨基酸的改变优选为保守的替换。本发明中，“保守的替换”是指用具有化学上同样的侧链的其他氨基酸残基替换。具有化学上同样的氨基酸侧链的氨基酸残基的组是在本发明所属的技术领域公知的。例如，可以用酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸/精氨酸/组氨酸)、在中性氨基酸中具有烃链的氨基酸(甘氨酸/丙氨酸/缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸/脯氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸/苏氨酸)、含硫氨基酸(半胱氨酸/蛋氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺/谷氨酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香族基的氨基酸(苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸)来分类。

另外，保持有包含改变后的氨基酸序列与由上述的特定氨基酸序列组成的可变区在氨基酸序列水平具有80％以上的同源性的氨基酸序列的可变区的抗体，也只要与改变之前的抗体具有同等的活性，就包含在本发明的抗体中。作为该同源性，只要为至少80％即可，但优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、99％以上)。另外，序列的同源性可以利用BLASTP(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)来确定。该程序基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)。在通过BLASTP分析氨基酸序列时，参数为例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体手法是公知的。

另外，“具有同等的活性”，是指例如，对抗原的反应性与对象抗体(代表地为本实施例所示的抗体克隆a004或a020)同等(例如，70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上)。

进而，作为本发明的抗体，也可以采取与保持有包含上述的特定氨基酸序列或其改变体的可变区或CDR的抗体，在与人TPO的结合中竞争的抗体的状态。换言之，也可以采取能与保持有包含上述的特定氨基酸序列或其改变体的可变区或CDR的抗体显示反应性的表位结合的抗体的方式。

本发明中“表位”是指抗原中存在的抗原决定簇、即抗体中的抗原结合结构域所结合的抗原上的部位。因此，本发明中的表位可以是由在氨基酸的一级序列中连续的多个氨基酸组成的多肽(线性表位)，也可以是在氨基酸的一级序列中不相邻的氨基酸通过肽或蛋白质的折叠等三级结构而来到附近而形成的多肽(不连续表位、结构性表位)。另外，作为该表位，典型地由至少3个(例如4个)、最普通为至少5个(例如，6～20个、7～15个、8～10个)氨基酸组成。

另外，在得到了抗体的情况下，只要是本领域技术人员，就能够特定该抗体显示反应性的抗原上的肽区域(表位)，制作能与该肽区域结合的各种抗体。进而，二个抗体是否能与同一或立体地重合的表位结合，如后述的实施例所示，可以通过竞争测定法来确定。

本发明的抗体可以通过杂交瘤法制作，另外可以通过重组DNA法制作。作为杂交瘤法，代表性地可列举Kohler和Milstein的方法(Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)。该方法中的细胞融合工序中使用的产生抗体的细胞是用抗原(人TPO、其部分肽、在它们之上融合有Fc蛋白质等的蛋白质、或者表达它们的细胞等)免疫后的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴、山羊)的脾细胞、淋巴细胞、外周血白细胞等。也可以使用使抗原在培养基中与从未免疫的动物预先分离的上述细胞或淋巴细胞等作用而得的产生抗体的细胞。作为骨髓瘤细胞可以使用公知的各种细胞株。产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞只要是它们能融合，则也可以是不同动物种起源的，但优选为同一动物种起源的。杂交瘤例如由用抗原免疫后的小鼠得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞之间的细胞融合而产生，然后通过筛选，可以获得产生对人TPO特异的单克隆抗体的杂交瘤。针对人TPO的单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来获得，另外，可以从施与了杂交瘤的哺乳动物的腹水获得。

重组DNA法，是从杂交瘤和/或B细胞等中克隆编码上述本发明的抗体的DNA，插入适当的载体中，将其导入宿主细胞(例如，HEK细胞等哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)，使本发明的抗体作为重组抗体而产生的方法(例如，P.J.Delves,Antibody Production:Essential Techniques,1997WILEY、P.Shepherd and C.DeanMonoclonal Antibodies,2000OXFORD UNIVERSITY PRESS、Vandamme A.M.et al.,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990))。在编码本发明的抗体的DNA的表达中，可以将编码重链或轻链的DNA分别插入表达载体中转化宿主细胞，也可以将编码重链和轻链的DNA插入单一的表达载体中转化宿主细胞(参照国际公开第94/11523号公报)。本发明的抗体可以培养上述宿主细胞，从宿主细胞内或培养液分离/纯化，以实质上纯粹且均一的形态获得。抗体的分离/纯化可以使用通常的多肽纯化中使用的方法。如果使用转基因动物制作技术制作插入了抗体基因的转基因动物(牛、山羊、绵羊、猪等)，则可以从该转基因动物的乳中大量获得来源于抗体基因的单克隆抗体。

本发明还提供编码上述本发明的抗体的DNA、包含该DNA的载体、保持该DNA的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞而回收抗体的工序的抗体的生产方法。

＜免疫检测人TPO的方法＞

本发明另外提供免疫检测试样中的人TPO的方法，该方法中使用上述的本发明的针对人TPO的抗体。

作为供于本发明的方法的“试样”，只要是人TPO可以存在的试样就不特别限制，例如，可以是从生物体分离出的体液、组织，也可以是培养细胞或其培养物(培养上清等)。

免疫检测人TPO的方法是，使试样中的人TPO与本发明的抗体接触，发生抗原抗体反应，基于所形成的免疫复合体检测该试样中的人TPO。作为免疫检测的方法，可列举例如，使用酶作为标记的EIA法(酶免疫测定法)，作为EIA法的一种状态的ELISA法或CLEIA法(化学发光酶免疫测定法)，使用被标记物质标记的抗原或抗体的标记免疫测定、例如放射性同位素作为标记的RIA法(放射免疫测定法)、使用化学发光性化合物作为标记的CLIA法(化学发光免疫测定法)，免疫层析法，以及通过凝集检测而测定的免疫凝集法(胶乳凝集法、胶体金凝集法等)，但不限于这些。

作为标记物质，只要能够结合抗体进行检测就不特别限制，可列举例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、β半乳糖苷酶(β-gal)、萤火虫萤光素酶等酶、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)等荧光色素、别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(R-PE)等荧光蛋白质、¹²⁵I等放射性同位素、胶乳粒子、胶体金粒子、抗生物素蛋白、生物素等。

在使用酶作为标记物质的情况下，通过添加显色底物(例如，在过氧化氢存在下通过利用HRP的氧化催化反应而显色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB))、化学发光底物(例如，通过利用ALP的水解而发光的AMPPD(3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷二钠盐))、荧光底物等作为底物，从而可以适应底物而进行各种检测。

除了使用结合了标记物质的本发明的抗体直接检测人TPO的方法以外，还可以利用以下方法：本发明的抗体上不结合标记物质、利用结合有标记物质的二抗等间接地检测的方法。这里所谓“二抗”，是对与抗原直接结合的抗体(一抗)显示反应性的抗体。另外。也可以代替二抗，使用结合了标记物质的蛋白G、蛋白A等。

抗体与标记物质的结合可以利用生物素-抗生物素蛋白系统。在该方法中，例如，将抗体生物素化，使抗生物素蛋白化了的标记物质与其作用，利用生物素与抗生物素蛋白的相互作用，使标记物质与抗体结合。

在本发明的方法中，从能够灵敏度更高地检测人TPO这样的观点考虑，CLEIA法等夹心法是合适的。在夹心法中，如后述的实施例所示，用固相化了的捕捉用抗体捕捉检测对象物质，使结合有标记物质的检测用抗体对其进行识别，进行B/F分离(洗涤)，然后进行适合标记物质的种类的检测。另外，也可以如免疫层析法那样，在用结合了标记物质的检测用抗体识别检测对象物质，进行B/F分离的同时，用固相化了的捕捉用抗体捕捉检测对象物质，进行适合标记物质的种类的检测。作为固相，可以使用例如，磁性粒子、胶乳粒子等粒子、塑料板等板、硝基纤维素等纤维状物质。

捕捉用抗体可以直接固定于固相，也可以间接地固定。例如，将能结合捕捉用抗体的物质固定于固相，使该物质结合捕捉用抗体，从而可以将捕捉用抗体间接地固定于固相。作为能结合捕捉用抗体的物质，可列举例如，上述的二抗、蛋白G、蛋白A等，但不限于这些。另外，在捕捉用抗体被生物素化了的情况下，可以利用抗生物素蛋白化了的固相。

在夹心法中，抗原捕捉用抗体和检测用抗体的至少一方使用本发明的单克隆抗体。另一方的抗体只要是针对人TPO的抗体即可，优选为在对本发明的抗体与人TPO的结合中不竞争的抗体(不与本发明的抗体显示反应性的表位结合的抗体)，更优选为对人TPO的包含57～61位的氨基酸序列的区域和包含102～115位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体、最优选为Clone.TN1抗体。另外，另一方的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，但从供应稳定性的观点考虑，优选为单克隆抗体。

由所得的检测值的人TPO的定量一般可以通过与利用标准样本的测定值的比较来进行。这时，例如，可以通过调查实际测定值位于基于利用标准样本的测定值制成的标准曲线上的哪个位置，从而求出试样中的人TPO量。

＜特发性血小板减少性紫癜的检查方法＞

本发明如后述的实施例所示，能够灵敏度高且定量地检测试样中的人TPO。于是，上述的本发明的免疫检测人TPO的方法也可以在检查项目中可以包含人TPO量的特发性血小板减少性紫癜的检查方法中利用。

更具体地，作为检查本发明的特发性血小板减少性紫癜的方法，可列举包含下述(a)～(b)的工序的检查方法。

(a)对于由受检体分离出的生物体试样检测人TPO的量的工序，

(b)将工序(a)中检测出的人TPO的量与基准量比较，判定所述受检体是否患有特发性血小板减少性紫癜的工序。

本发明中，“特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura、ITP)”是不伴有明确的病因的、血小板数减小到10万/μl以下的疾病，通常在血液检查项目中确认不到红细胞系统和白细胞系统的异常、并且能够排除带来血小板减少的其他疾病的情况下，判断为ITP。

于是，在ITP的检查中，期望不仅能与健常人区别，还能够与其他疾病的患者区别。作为该“其他疾病”，可列举再生障碍性贫血(AA)、骨髓增生异常综合征(MDS)、药物或放射线损伤、阵发性夜间血红蛋白尿、系统性红斑狼疮(SLE)、白血病、恶性淋巴瘤、癌向骨髓的转移、播散性血管内凝血综合征、血栓性血小板减少性紫癜、脾机能亢进症、巨幼细胞贫血、败血症、结核病、结节病、血管瘤、感染症、先天性血小板减少症(巨血小板综合征、Wiskott-Aldrich综合征、May-Hegglin异常症、Kasabach-Merritt综合征等)。

作为在本检查方法中成为对象的试样，只要是人TPO可以存在的、由生物体分离出的试样(体液、组织等)即可，不特别限制，优选为体液(血液、淋巴液、组织液、体腔液、脑脊液、关节液等)，更优选为血液，进一步优选为血浆。“血液”可以通过本领域技术人员公知的方法从受检体采集。例如，血液(全血)可以通过使用注射器等的采血来采集。血清是从全血除去了血细胞和特定的凝血因子的部分，例如，可以作为使全血凝固后的上清获得。血浆是从全血除去了血细胞的部分，例如，可以作为在不使全血凝固的条件下(例如，EDTA、柠檬酸钠、肝素等抗凝固剂存在下)进行离心分离时的上清获得。

本发明中检测的“人TPO的量”，不仅可以是绝对量，也可以是相对量。作为相对量，可列举例如，相对于总蛋白质的量的比例。另外，作为相对量，可列举基于检测中使用的测定方法或测定装置的蛋白质的量(所谓以任意单位(AU)表示数值)。作为相对量另外可以使用例如，以参照蛋白质的量作为基准计算出的值。本发明涉及的“参照蛋白质”只要是在生物体试样中稳定地存在，另外在不同的生物体试样之间其量的差小的蛋白质即可，可列举例如，内源性对照(内标)蛋白质。

在本发明的检查方法中，将这样检测到的蛋白质的量、与相同的蛋白质的基准量进行比较。该比较只要是本领域技术人员就能够适当选择适合上述检测方法的统计学分析方法来进行。作为统计学分析方法，可列举例如，曼-惠特尼(Mann-Whitney)的U检验、t检验、方差分析(ANOVA)、克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验、威尔科克森(Wilcoxon)检验、比值比(odds ratio)、风险比(hazard ratio)、费希尔(Fisher)精确检验、接受者操作特征分析(ROC分析)、分类树与决策树分析(CART分析)。另外，在比较时，也可以使用经归一化或经标准化且归一化的数据。

作为成为比较对象的“基准量”不特别限制，只要是本领域技术人员，就能够适合上述检测方法和统计学的分析方法，通过以此为基准，设定能够判别患有ITP的人与未患ITP的人(例如，健常人、患有带来血小板减少的其他疾病的人)的所谓截止值。

作为用于判别患有ITP的人与未患ITP的人的基准量，可列举例如，在未患ITP的个体群中检测出的人TPO的量的中央值或平均值。另外，也可以是通过在未患ITP的个体群与患有ITP的个体群之间比较人TPO的量而确定的值(例如，未患ITP的个体群的人TPO的量、与患有ITP的个体群的人TPO的量之间的值)。

例如，如Sakuragi M et al.,Int J Hematol.2015Apr；101(4):369-75.、Seiki Yet al.,Haematologica.2013Jun；98(6):901-7.所示，已知ITP患者的人TPO量比健常人的高，比患有带来血小板减少的其他疾病的人(例如，AA患者)的低。因此，如果样本检测量比基于健常人的人TPO量确定的基准量高、另外比基于AA患者等的人TPO量确定的基准量低，则可以判定患有ITP。另外，更具体地，如后述的实施例所示，如果血浆中的人TPO量低于基于AA患者等的人TPO量确定的基准量70pg/mL，则可以判定患有ITP。

此外，所谓比基准量“高”或“低”，只要是本领域技术人员，就能够基于上述统计学分析方法适当判断。例如，可列举检测到的人TPO量比基准量高或低，且其差被认为在统计上显著(例如，P＜0.05)。另外，可列举例如，检测到的人TPO量为对应的基准量的2倍以上(优选为、5倍以上、10倍以上)或2倍以下(优选为、5倍以下、10倍以下)。

另外，本发明的检查方法可以组合公知的ITP的检查(检查项目)而实施。作为该检查，可列举例如，血小板数的测定、外周血涂抹标本中的形态异常的观察、血液检查(红细胞系统和白细胞系统的异常的检测、外周血中的抗GPIIb/IIIa抗体产生B细胞的检测、血小板相关抗GPIIb/IIIa抗体的检测、网织血小板(或未成熟血小板)比率的检测等)、带来血小板减少的其他疾病的检测，通过将它们与本发明适当组合，能够更精确地进行ITP的诊断。

另外，ITP的检查通常由医师(包括接受医师指令的人)进行，但上述的关于人TPO量等的数据对于由医师进行的包括治疗时机等的判断在内的诊断有帮助。于是，本发明的方法也表现为为了医师的诊断而收集上述的关于人TPO量的数据的方法、将该数据呈递给医师的方法、将上述的人TPO量与基准量比较而进行分析的方法、用于辅助医师的诊断的方法。

＜包含抗人TPO抗体的组合物＞

本发明提供包含上述的本发明的针对人TPO的抗体的、用于免疫检测人TPO或用于检查ITP的组合物。

本发明的组合物中包含的抗体如上所述，但为了在各种免疫学方法中使用，也可以以固定于固相的形态提供。作为该固相，如上所述。另外，向固相的固定化，可以使用物理吸附法、化学键合法、或它们的联合使用等公知的方法，使固相与抗体等适当结合而进行。进而，根据各种免疫学方法中的检测手法，抗体也可以被上述的标记物质标记。

本发明的组合物除了上述抗体之外，还可以包含作为药剂(试剂等)容许的其他成分。作为这样的其他成分，可列举例如，药理学上容许的担载体或稀释剂(灭菌水、生理盐水、植物油、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂可以使用阿拉伯树胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠等。作为稳定剂可以使用丙二醇、二乙基亚硫酸盐(Diethylin Sulfite)、抗坏血酸等。作为保存剂可以使用苯酚、苄索氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂可以使用叠氮化钠、苄索氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

另外，本发明的组合物除了作为试剂的方式之外，还可以通过与标记的检测所需的底物、用于溶解试样的蛋白质的溶液(蛋白质溶解用试剂)、在试样的稀释或洗涤中使用的缓冲液(稀释液、洗涤液)、用于停止标记的检测反应的试剂(反应停止剂)、阳性对照(例如，重组人TPO蛋白质、标准品)、阴性对照、针对本发明所涉及的抗体的同种型对照抗体等适当组合，采取作为试剂盒的方式。作为该试剂盒，可列举例如，包含本发明的抗体、和选自标记的检测所需的底物、阳性对照和阴性对照中的至少1个物品的试剂盒。另外，在以未被标记的抗体作为抗体标准品的情况下，可以组合将与该抗体结合的物质(例如，二抗、蛋白G、蛋白A等)标记化了的物质。进而，该试剂盒可以包含该试剂盒的使用说明书。

实施例

以下基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。

＜实施例1＞抗血小板生成素(TPO)小鼠单克隆抗体(Clone.TN1)的制备

如后所述，为了获得能够高灵敏度地检测人TPO的抗体等，如下制备已有的抗TPO小鼠单克隆抗体(Clone.TN1)。此外，已知该抗体与人TPO的102～115位和57～61位的氨基酸结合(M D Feese et al.,PNAS.2004Feb 17；101(7):1816-21)。

首先，以该文献中公开的、连接了抗TPO小鼠单克隆抗体(Clone.TN1)的H链和L链的抗体可变区与一般的小鼠IgG1的恒定区的氨基酸序列为基础，通过人工合成获得编码重组TN1抗体的基因。以该合成基因作为模板，将通过PCR法扩增后的DNA的末端用HindIII和EcoRI切割，插入动物细胞用表达载体的HindIII和EcoRI位点。动物细胞用的表达载体使用被CMV启动子控制的pXC-18.4、和pXC-17.4(Lonza社)，基于GS Xceed(注册商标)GeneExpression System(Lonza社)的规定的方案，以CHOK1SV GS-KO细胞作为宿主获得产生重组TN1抗体的细胞。

接着，产生重组TN1抗体的细胞通过酶免疫测定法(ELISA)选定。将经PBS稀释的1μg/mL的TPOFull溶液添加到NUNC社酶标板(MAXSORP)中，进行固相化。用PBS洗涤之后，将1％BSA-PBS添加到板中进行封闭，以此作为测定板。作为一抗将产生重组TN1抗体的细胞的培养上清以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的一抗反应。一抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用标记抗体稀释液(20mM HEPES pH7.2，1％BSA，135mM NaCl)稀释了3,000倍的HRP标记抗小鼠IgG多克隆抗体(MBL社Code.330)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的二抗反应。二抗反应后，用PBS-T洗涤3次，添加TMB，进行显色反应，再添加0.5NH₂SO₄，使显色反应停止，测定450/620nm的吸光度(OD450-620)。

将选定的产生重组TN1抗体的细胞用CD-CHO medium(Thermo社)培养，由其培养上清通过利用了蛋白A-Sephorose的一般亲和性纯化法进行抗体纯化。这些抗体对人TPO的反应性与上述同样地通过利用了TPOFull抗原蛋白质的ELISA来确认。

＜实施例2＞抗TPO兔单克隆抗体的制备

为了获得能够高灵敏度地检测人TPO的抗体，如下制作针对人TPO的兔单克隆抗体。此外，实施例2中的各种基因操作依照Molecular cloning third.ed.(Cold SpringHarbor Lab.Press,2001)中记载的方法进行，scFv抗体噬菌体展示文库的制作依照WO2008/007648中记载的方法进行。另外，实验动物的使用获得了株式会社医学生物学研究所动物实验委员会的审查、承认而进行。

(2-1)兔的免疫

按照WO2004/044005的实施例1中记载的方法进行兔的免疫。即，将重组TPO蛋白质施与日本白兔(雌)的背部皮内。其2周后之后施与第2次，进而然后每1周施与第3，4，5，6次，进而在2周后进行第7次背部皮内施与(仅初次施与100μg和等量的氟氏完全补剂(Freundcomplete adjubant)，第2次以后施与50μg和等量的氟氏不完全补剂(Freund completeadjubant))。

施与结束1周之后从耳静脉采血，按照常规方法分离抗血清，确定抗体效价。具体地，在酶标板(F8 MAXISORP LOOSE NUNC-IMMUNO MODULE：Nunc社)上固定化用作免疫原的重组蛋白质，然后封闭。将兔的各抗血清用PBS(pH7.4)稀释，制备×1/100～×1/62500倍的5点的稀释系列。作为一抗反应将抗血清稀释系列添加到板中，使其室温反应1小时。反应后，将板用包含0.05％Tween20的PBS洗涤4次。接下来作为二抗反应添加将Anti-RabbitIgG Conj.POD(CODE458：MBL社)稀释后的溶液，使其室温反应1小时。同样地将板洗涤4次后，添加四甲基联苯胺溶液(TMB、#TMBUS-1000：Moss社)，使其室温反应5分钟。反应结束后，用1N硫酸溶液使反应停止。用吸光测定酶标仪(SUNRISE-BASIC TECAN：TECAN社)测定450/620nm的吸光度。基于吸光度测定的结果，选择抗体效价高的个体。在第7次抗原施与的1周之后无菌地采集全血和脾。

(2-2)scFv抗体噬菌体文库的制作

由回收的脾通过以下的步骤制作scFv抗体噬菌体文库。首先，由上述“2-1.”中回收的脾使用ISOGEN(315-02504：ニッポン/ジーン社)提取总RNA，用SuperScript(注册商标)III逆转录酶(ThermoFisherSCIENTIFIC社)合成单链cDNA。以该cDNA作为模板，通过兔抗体基因特异的引物扩增/制备包含重链可变区的片段和包含轻链可变区的片段。将所得的兔重链可变区和兔轻链可变区(κ型或λ型)插入抗体表达用噬粒载体中，制备scFv抗体噬菌体文库表达用质粒。

将制备的scFv抗体噬菌体文库表达用质粒转化大肠杆菌后，使辅助噬菌体重感染，从而制作在表面呈递了各种scFv的噬菌体的文库(scFv抗体噬菌体文库)。

(2-3)使用噬菌体展示法的TPO抗体的淘选/筛选

抗体的选择按照WO2007/042309和WO2006/122797等所记载的方法进行。具体地，首先，将实施例1中制备的抗TPO小鼠单克隆抗体(TN1抗体)在磁珠(Dynabeads ProteinG：Invtrogen社)上固相化，制作了抗体呈递珠。使该抗体呈递珠与重组TPO蛋白质反应，从而使作为抗原的该蛋白质介由TN1抗体呈递在珠上。然后，使该抗原呈递珠与scFv抗体噬菌体文库反应，接着通过用PBS洗涤数次来除去未结合抗体噬菌体，从而与呈递于珠的TN1抗体同时地回收能够与TPO抗原结合的抗体噬菌体。接着，由该珠用100mM三乙胺(pH11.5)使抗体噬菌体溶出。使大肠杆菌感染溶出的抗体噬菌体，在37℃培养一晚。

此外，由噬菌体感染大肠杆菌的噬菌体救援操作依照了一般的方法(Molecularcloning third.Ed.Cold Spring Harbor Lab.Press,2001)。另外，通过将上述工序重复4次，浓缩了抗TPO抗体噬菌体。

然后，制作所选择的大肠杆菌的集落板进行筛选。进而，培养各个克隆的大肠杆菌，使用纯化试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep kit：QIAGEN社)回收质粒，进行碱基序列分析。接着，基于所得的各克隆的碱基序列，由噬菌体抗体(scFv-cp3融合蛋白质)的形态进行向完全IgG的再构建。

(2-4)噬菌体抗体的IgG化

以各克隆的scFv表达载体作为模板，通过PCR在添加了信号序列和限制性酶识别序列的同时，分别扩增编码VH和VL片段的基因片段。

将这些基因片段分别用2种限制性酶处理，在预先整合有兔IgG1CH1,2,3基因的H链用载体(pXC18.4：Lonza社)和预先整合有兔κ链恒定区CKb4基因的L链用载体(pXC17.4：Lonza社)中整合各片段，制作了IgG抗体表达载体。

将该载体导入CHO细胞，通过药剂选择获得稳定表达细胞。回收其培养上清，通过利用了蛋白A(rProteinA Sepharose Fast Flow：Cytiva社)的亲和性柱进行纯化，获得了纯化抗TPO兔单克隆抗体。

此外，纯化后的蛋白质通过SDS-PAGE确定了为单一条带，使用NanoDrop(ND-1000：ThermoFisherSCIENTIFIC社)确定了蛋白浓度。

＜实施例3＞抗TPO兔单克隆抗体的活性评价

(3-1)夹心ELISA法

将用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释了的5μg/mL的抗TPO小鼠单克隆抗体(TN1抗体)溶液添加到NUNC社酶标板(MAXSORP)中，进行了固相化。用PBS洗涤之后，将1％BSA-PBS添加到板中进行封闭，以此作为测定板。将用反应用缓冲液(20mM Tris-HClpH7.4、1％BSA、400mM NaCl、0.1％Tween20)稀释成0、1ng/mL的重组全长TPO(TPO_Full)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的一抗反应。一抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用反应用缓冲液稀释成10ng/mL的纯化抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a003,a004,a015,a020)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的二抗反应。二抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用标记抗体稀释液(20mM HEPES pH7.2，1％BSA，135mM NaCl)稀释了3,000倍的HRP标记抗兔IgG多克隆抗体(MBL社Code.458)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的三抗反应。三抗反应后，用PBS-T洗涤3次，添加TMB，进行显色反应，再添加0.5NH₂SO₄，使显色反应停止，测定了OD_450-620。

其结果如图1所示，可知a004、a020的2克隆在S/N比方面优异，能够高灵敏度地检测TPO。另一方面，a003、a015与a004、a020相比S/N比差。另外，判断a003的纯化抗体的稳定性低(纯化后容易形成凝集体)，作为试剂原料不适合。

此外，虽未图示，但对于S/N比优异的a004、020与S/N比差的a015，通过SPR(表面等离子体共振)比较了各克隆的亲和性。其结果是在3克隆之间亲和性没有大的差异。由此考虑，这些3克隆的抗体活性的差异是由抗体表位的差异引起的。

(3-2)抗TPO兔单克隆抗体对TPO_Full和TPO_1-174的反应性

通过与先前同样的方法构建测定板。将用反应用缓冲液稀释成0、0.16、0.31、0.62、1.25、2.5、5ng/mL的TPO_Full和TPO-N末端片段(TPO_1-174(PEPROTECH社Code,300-18))溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的一抗反应。一抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用反应用缓冲液稀释成500ng/mL的纯化抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a015,a020)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的二抗反应。二抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用标记抗体稀释液稀释了3,000倍的HRP标记抗兔IgG多克隆抗体(MBL社Code.458)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的三抗反应。三抗反应后，用PBS-T洗涤3次，添加TMB，进行显色反应，再添加0.5N H₂SO₄，使显色反应停止，测定了OD_450-620。

其结果如图2A和2B所示，表明在先前的实验中抗体活性优异的a004、a020与TPO_Full和TPO_1-174双方反应。由此显示，两抗体在TPO的N末端结构域(信号序列以后(序列号1所记载的氨基酸序列)的第1～174位的氨基酸)内具有表位。另一方面，a015不与TPO_1-174反应，由此考虑本抗体在TPO的第175位以后的C末端具有表位，在a004和a020与a015之间显示了明确的表位不同。

＜实施例4＞表位的鉴定

接着，通过下述抑制试验(竞争测定法)，验证抗体活性优异的a004、a020是否具有共同的表位。

(4-1)使用抗TPO兔单克隆抗体(a004とa020)的抑制试验：竞争测定法

将经PBS稀释的1μg/mL的TPOFull溶液添加到NUNC社酶标板(MAXSORP)中，进行了固相化。用PBS洗涤后，将1％BSA-PBS添加到板中进行封闭，以此作为测定板。将用反应用缓冲液稀释成0、1、10μg/mL的纯化抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)溶液以100μL/孔添加到测定板，在室温进行2小时的一抗反应。一抗反应后，不洗涤，将用PeroxidaseLabeling Kit-NH2(Dojindo社Code.LK51)制作的HRP标记a004和a020抗体稀释溶液以100μL/孔添加到各个孔中，在室温进行1小时的二抗反应。二抗反应后，用PBS-T洗涤3次，添加TMB，进行显色反应，再添加0.5N H₂SO₄，使显色反应停止，测定了OD_450-620。

其结果如图3A～3D所示，显示了a004、a020彼此抑制抗原抗体反应。由此表明，两抗体具有共同的表位。

进而，虽未图示，但使用a004、a020通过转印了TPO_Full的膜实施了蛋白质印迹(WB)，结果两抗体对TPOFull不显示反应性。另外，将通过DTT的前处理而切割了SS键的TPO_Full，通过固相化于酶标板的ELISA，验证a004、a020的抗体反应性，结果两抗体对切割了SS键的TPO_Full不显示反应性。由这些结果提示，a004、a020具有TPO蛋白质的立体结构依赖性的表位。

(4-2)抗TPO兔单克隆抗体对人TPO和小鼠TPO的反应性

将用PBS稀释制备成1μg/mL的人TPO-N末端片段(TPO_1-174(PEPROTECH社Code,300-18))和小鼠TPO-N末端片段(TPO_1-174(PEPROTECH社Code,315-14))的分别添加到NUNC社酶标板(MAXSORP)中，进行了固相化。用PBS洗涤之后，将1％BSA-PBS添加到板中进行封闭，以此作为测定板。将用反应用缓冲液稀释成10μg/mL的纯化抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的一抗反应。一抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用标记抗体稀释液稀释成5,000倍的HRP标记抗兔IgG多克隆抗体(MBL社Code.458)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的二抗反应。二抗反应后，用PBS-T洗涤3次，添加TMB，进行显色反应，再添加0.5N H₂SO₄，使显色反应停止，测定了OD_450-620。

其结果如图4所示，a004、a020虽然都与人TPO_1-174显示反应性，但与小鼠TPO_1-174不显示反应性。由此显示，a004和a020在人与小鼠之间TPO的氨基酸序列不同的区域具有表位。

(4-3)TPO-Myc-His和突变型TPO-Myc-His的表达载体的构建、和表位分析

首先，如下构建TPO-Myc-His和突变型TPO-Myc-His的表达载体。通过人工合成获得了编码在人血小板生成素(NCBI Reference Sequence:NP_000451.1(除了信号序列之外))的C末端侧随机添加了Myc标签和6×His标签的TPO-Myc-His蛋白质(参照图5A的上部)的基因。以该合成基因作为模板，将用PCR法扩增后的DNA的末端用HindIII和EcoRI切割，插入了动物细胞用表达载体的HindIII和EcoRI位点。动物细胞用的表达载体使用了被CMV启动子控制的pXC-17.4(Lonza社)。将所制作的载体命名为TPO-Myc-His-pXC-17.4。另外，以TPO-Myc-His-pXC-17.4作为模板，通过定点诱变法，制作编码下述表1所示的点突变型TPO-Myc-His的基因。将所得的点突变型TPO-Myc-His基因插入动物细胞用表达载体pXC-17.4中，制备各点突变型TPO-Myc-His-pXC-17.4载体。

表1

突变型TPO-Myc-His	氨基酸点突变
		A3V	野生型TPO的自N末端起第3位的缬氨酸替换为丙氨酸
P4A	野生型TPO的自N末端起第4位的脯氨酸替换为丙氨酸
		L9A	野生型TPO的自N末端起第9位的亮氨酸替换为丙氨酸
V11A	野生型TPO的自N末端起第11位的缬氨酸替换为丙氨酸
		S13A	野生型TPO的自N末端起第13位的丝氨酸替换为丙氨酸
V21A	野生型TPO的自N末端起第21位的缬氨酸替换为丙氨酸
		E31A	野野生型TPO的自N末端起第31位的谷氨酸替换为丙氨酸
H33A	野生型TPO的自N末端起第33位的组氨酸替换为丙氨酸
		P36A	野生型TPO的自N末端起第36位的脯氨酸替换为丙氨酸
T37A	野生型TPO的自N末端起第37位的苏氨酸替换为丙氨酸
		M55A	野生型TPO的自N末端起第55位的甲硫氨酸替换为丙氨酸
T68A	野生型TPO的自N末端起第68位的苏氨酸替换为丙氨酸
		G82A	野生型TPO的自N末端起第82位的甘氨酸替换为丙氨酸
T84A	野生型TPO的自N末端起第84位的苏氨酸替换为丙氨酸
		I127A	野生型TPO的自N末端起第127位的异亮氨酸替换为丙氨酸
F131A	野生型TPO的自N末端起第131位的苯丙氨酸替换为丙氨酸
		H133A	野生型TPO的自N末端起第133位的组氨酸替换为丙氨酸
M143A	野生型TPO的自N末端起第143位的甲硫氨酸替换为丙氨酸
		G146A	野生型TPO的自N末端起第146位的甘氨酸替换为丙氨酸
S148A	野生型TPO的自N末端起第148位的丝氨酸替换为丙氨酸
		A155T	野生型TPO的自N末端起第155位的丙氨酸替换为苏氨酸
P156A	野生型TPO的自N末端起第156位的脯氨酸替换为丙氨酸
		R164A	野生型TPO的自N末端起第164位的精氨酸替换为丙氨酸
L167A	野生型TPO的自N末端起第167位的亮氨酸替换为丙氨酸
		V168A	野生型TPO的自N末端起第168位的缬氨酸替换为丙氨酸
E173A	野生型TPO的自N末端起第173位的谷氨酸替换为丙氨酸
		L174A	野生型TPO的自N末端起第174位的亮氨酸替换为丙氨酸

接着，通过以下所示的ELISA法分析抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)对TPO-Myc-His和氨基酸点突变型TPO-Myc-His的反应性，尝试了获得抗体所结合的表位的鉴定。

首先，对在经胶原涂敷的35mm盘中以1.0×10⁶个细胞/孔接种的293T细胞，使用リポフェクトアミン3000(Invitrogen社制、目录编号：L3000001)，转染如上所述构建的表达载体(TPO-Myc-His-pXC-17.4载体和各点突变型TPO-Myc-His-pXC-17.4载体)。转染后，用含10％FCS的DMEM培养基以5％CO₂、37℃实施3天培养。培养后，将细胞培养液进行离心分离(RT、10，000rpm、3min)，以回收了的上清作为分析样品。

接着，将经碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释的5μg/mL的抗His标签小鼠单克隆抗体(MBL社Code.M136-3)溶液添加到NUNC社酶标板(MAXSORP)中，进行了固相化。用PBS洗涤之后，将1％BSA-PBS添加到板中进行封闭，以此作为测定板。将先前制备的利用暂时性表达的分析样品以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的一抗反应。

在测定孔中，一抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用反应用缓冲液稀释成10μg/mL的纯化抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a015,a020)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的二抗反应。二抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用标记抗体稀释液稀释成5,000倍的HRP标记抗兔IgG多克隆抗体(MBL社Code.458)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的三抗反应(参照图5A的下部[测定])。

另一方面，在对照孔中，在利用分析样品的一抗反应后，用PBS-T洗涤3次，将用标记抗体稀释液稀释成5,000倍的HRP标记抗Myc标签抗体(MBL社Code.M192-7)溶液以100μL/孔添加到测定板中，在室温进行1小时的二抗反应(参照图5A的下部[对照])。

测定孔和对照孔中的标记抗体溶液反应后，用PBS-T洗涤3次，添加TMB，进行显色反应，再添加0.5N H₂SO₄，使显色反应停止，测定了OD_450-620。

将由测定孔和对照孔得到的TPO-Myc-His和点突变型TPO-Myc-His的吸光度通过以下的式(式＊)计算出，从而修正成各突变型的表达量的不同。在以下的式所示的相对比率为50％以下的情况下，将该抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a004,a020)判定为与该突变体中被替换之前的氨基酸结合的抗体。

式＊：(a004或a020对各突变型TPO-Myc-His的反应性/a004或a020对野生型TPO-Myc-His的反应性)/(抗Myc抗体对各突变型TPO-Myc-His的反应性/抗Myc抗体对野生型TPO-Myc-His的反应性)。

由图5B所示的结果表明，a004和a020都在G82A、T84A、I127A、F131A突变体中反应性显著降低。由此表明，a004和a020都识别第82位的甘氨酸、第84位的苏氨酸、第127位的异亮氨酸、第131位的异亮氨酸。

＜实施例5＞抗体的氨基酸序列

基于(2-3)中分析的a004和a020的碱基序列，通过Kabat编码法，如下鉴定各克隆的可变区和互补决定区的氨基酸序列。

[a004]

重链可变区(HV)的氨基酸序列…序列号10

重链互补决定区1(HV CDR1)的氨基酸序列…序列号11

重链互补决定区2(HV CDR2)的氨基酸序列…序列号12

重链互补决定区3(HV CDR3)的氨基酸序列…序列号13

轻链可变区(LV)的氨基酸序列…序列号14

轻链互补决定区1(LV CDR1)的氨基酸序列…序列号15

轻链互补决定区2(LV CDR2)的氨基酸序列…序列号16

轻链互补决定区3(LV CDR3)的氨基酸序列…序列号17

[a020]

HV的氨基酸序列…序列号2

HV CDR1的氨基酸序列…序列号3

HV CDR2的氨基酸序列…序列号4

HV CDR3的氨基酸序列…序列号5

LV的氨基酸序列…序列号6

LV CDR1的氨基酸序列…序列号7

LV CDR2的氨基酸序列…序列号8

LV CDR3的氨基酸序列…序列号9。

＜实施例6＞TPO测定试剂的制备、测定法

如图6所示，使用上述所得的抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020)和TN1抗体，构建用于免疫测定TPO量的系统(化学发光酶免疫测定系统)。首先，为了构建该系统，作为TPO测定试剂，制备抗体对不同的以下的抗体结合粒子溶液和标记化抗体溶液。

抗体结合粒子溶液(固相化抗体溶液)：使TN1抗体与羧基化磁性粒子(JSRライフサイエンス社制Magnosphere MS300/Carboxyl)化学结合。然后，制备包含这样获得的抗体结合磁性粒子、1％BSA、100mM MES、0.6M NaCl和0.02％Tween20的抗体结合粒子溶液(pH6.5)。

标记化抗体溶液：将1μg/mL的抗TPO兔单克隆抗体(Clone.a020)用碱性磷酸酶(ALP、高比活性、糖减低的重组体、ロシュ制)标记。然后，制备包含这样得到的ALP标记化抗TPO抗体、10mM MES、0.5％BSA、150mM NaCl、0.1mM ZnCl₂和10mM MgCl₂的标记化抗体溶液(pH6.5)。

接着，将这些溶液填充到自动免疫测定装置(LSIメディエンス社制STACIA)用的试剂瓶中，按照以下的步骤测定受检试样(再生障碍性贫血(AA)患者的EDTA血浆)的TPO量。

首先，向反应用池中连续地分注抗体结合粒子溶液110μ、受检试样40μL、标记化抗体溶液100μL，制备第1反应液。第1反应液在搅拌后在37℃孵育10.6分钟，形成由抗体结合磁性粒子-TPO抗原-ALP标记化抗TPO抗体构成的免疫复合体。

孵育后，将包含AMPPD(3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷二钠盐)的底物液(LSIメディエンス社制)100μL加入到所述免疫复合体中，搅拌后在37℃孵育2.7分钟。

底物液中包含的AMPPD通过所述免疫复合体中的ALP的催化作用而分解、化学发光，因而通过测定本发光量能够测定TPO抗原量。

其结果虽未图示，但本化学发光自动化TPO测定系统(以后也称为“TPO-CLEIA”)包括分注工序、反应工序等，能够在全工序约19分钟的短时间内迅速地测定受检试样的TPO量。

＜实施例7＞关于TPO-CLEIA的性能评价

(7-1)赋值

尝试了上述制备的TPO-CLEIA、与由R&D systems社提供的ELISA系统(HumanThrombopoietin Quantikine ELISA Kit DTP00B、以后也称为“R&D-ELISA”)的比较。

首先，该比较时，作为较正用基准物质使用rTPO蛋白质(从協和キリン社特别分到作为非专利文献2中记载的校准器利用的rhTPO)，尝试了利用TPO-CLEIA的赋值和利用R&D-ELISA对其的校正。

表2

其结果如表2所示，表明通过TPO-CLEIA被赋值为70pg/mL的rTPO蛋白质，在R&D-ELISA中被赋值为300pg/mL。即，理论上，认为如果对TPO-CLEIA的测定值乘以系数4.286(＝300/70)，则能够转换为R&D-ELISA测定值。

于是，实际上基于再生障碍性患者的样本用TPO-CLEIA和R&D-ELISA测定TPO的浓度，结果如表2所示，确认了如果对前者的测定值乘以所述系数，则与后者的测定值变为同等。

(7-2)利用稀释线性试验的性能评价

在特发性血小板减少性紫癜(ITP)的诊断中，能够排除伴有血小板减少的其他疾病(再生障碍性贫血(AA)等)是重要的。这里，根据过去的报告，AA样本的TPO值高，其测定上限为血中浓度3,000pg/mL(R&D-ELISA测定值，如果转换为TPO-CLEIA测定值则为700pg/mL)。另外，ITP和AA的截止值可以设定为300pg/mL(R&D-ELISA测定值，如果转换为TPO-CLEIA测定值则为70pg/mL)(Sakuragi M et al.，Int J Hematol.2015Apr；101(4)：369-75.Seiki Y et al.，Haematologica.2013Jun；98(6)：901-7.)。

于是，通过稀释线性试验，评价了根据TPO-CLEIA，所述测定上限和截止值能否具有线性地正确地测定。具体地，关于TPO高值样本(AA患者的EDTA血浆)，在低浓度域(～120pg/mL)、中浓度域(～400pg/mL)、高浓度域(～700pg/mL)中使用校准器稀释液(含有5％BSA的PBS)以各10阶段稀释，对各个稀释样品进行双重测定。以相对于由近似式计算出的理论值，所得的测定值为100±15％以内作为标准。

其结果如图7所示，由于在任意浓度域中都满足上述标准，因而评价，在测定上限、和ITP与AA的截止值(70pg/mL)下能够具有线性地正确测定生物体试样中的TPO抗原。因此表明，本TPO-CLEIA具有ITP与AA的鉴别用途、进而作为ITP的诊断药的性能。

(7-3)与R&D-ELISA的灵敏度比较

关于TPO-CLEIA与R&D-ELISA，计算出检出限(LoD)，尝试了灵敏度的比较。此时，TPO的赋值与利用TPO-CLEIA的赋值统一。

首先，将TPO低值样本(EDTA血浆)阶段稀释成40、20、10、5、2.5、1.3、0.6、0.3pg/mL，将各个稀释样品进行8重测定。计算出各稀释样品的信号值中的Mean±2SD，将在相邻的2点低浓度侧的Mean+2SD值与高浓度侧的Mean-2SD值不重合的稀释浓度作为LoD。

其结果如图8A和8B所示，TPO-CLEIA为LoD＝1.3pg/mL，R&D-ELISA为LoD＝5.0pg/mL，因而TPO-CLEIA与R&D-ELISA相比，是作为LoD约4倍的高灵敏度。

此外，如果将R&D-ELISA LoD＝5.0pg/mL以×4.286进行换算，则变成21.4pg/mL，接近位于制品规格单的灵敏度：18.5pg/mL，认为作为性能评价是妥当的。

(7-4)TPO-CLEIA的LoQ计算

对TPO-CLEIA，依据CLSI“Protocols for Determination of Limits ofDetection and Limits of Quantitation Proposed Guideline”EP-17A计算出定量限(Loimit of Quantitation、以下简称为“LoQ”)。

使用校准器稀释液，将TPO低值样本(EDTA血浆)阶段稀释成40、20、10、5、2.5、1.3、0.6、0.3pg/mL，将各个稀释样品进行8重测定。将此作为1次测定，获得2次、2天的合计4测定的测定值，求出CV值(％)为15％的浓度。其结果如图9所示，计算出TPO-CLEIA的LoQ＝3.4pg/mL。

(7-5)健常人样本中的TPO浓度测定

通过TPO-CLEIA测定100例健常人样本(EDTA血浆)的血浆TPO浓度，将各样本测定值的分布示于图10。其结果如该图所示，99例(全体的99％)的健常人样本浓度为TPO-CLEIA的LoQ＝3.4pg/mL以上，因而显示本TPO-CLEIA试剂能够通过TPO-CLEIA测定健常人血浆TPO浓度。

产业可利用性

如以上说明的那样，根据本发明，能够高灵敏度地检测人TPO。进而，根据本发明，能够短时间且定量地检测人TPO。另外，本发明中，在人TPO的检测中使用的抗体能够以单克隆抗体的状态利用，因而能够稳定性高地供应。因此，本发明在特发性血小板减少性紫癜的检查等中是有用的。

Claims (13)

1.针对人血小板生成素的抗体，该抗体

(a)保持有序列号3～5所记载的氨基酸序列分别作为重链互补决定区1～3，并且保持有序列号7～9所记载的氨基酸序列分别作为轻链互补决定区1～3，或者

(b)保持有序列号11～13所记载的氨基酸序列分别作为重链互补决定区1～3，并且保持有序列号15～17所记载的氨基酸序列分别作为轻链互补决定区1～3。

2.针对人血小板生成素的抗体，该抗体

(a)保持有重链可变区，该重链可变区包含：

序列号2所记载的氨基酸序列，或者

包含序列号3～5所记载的氨基酸序列分别作为重链互补决定区1～3、且与序列号2所记载的氨基酸序列有90％以上的同源性的氨基酸序列，

并且

保持有轻链可变区，该轻链可变区包含：

序列号6所记载的氨基酸序列，或者

包含序列号7～9所记载的氨基酸序列分别作为轻链互补决定区1～3、且与序列号6所记载的氨基酸序列有90％以上的同源性的氨基酸序列，

或者，

(b)保持有重链可变区，该重链可变区包含：

序列号10所记载的氨基酸序列，或者

包含序列号11～13所记载的氨基酸序列分别作为重链互补决定区1～3、且与序列号10所记载的氨基酸序列有90％以上的同源性的氨基酸序列，

并且

保持有轻链可变区，该轻链可变区包含：

序列号14所记载的氨基酸序列，或者

包含序列号15～17所记载的氨基酸序列分别作为轻链互补决定区1～3、且与序列号14所记载的氨基酸序列有90％以上的同源性的氨基酸序列。

3.使用权利要求1或2所述的针对人血小板生成素的抗体来免疫检测人血小板生成素的方法。

4.根据权利要求3所述的方法，进一步使用对人血小板生成素的包含57～61位的氨基酸序列的区域和包含102～115位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体，免疫检测人血小板生成素。

5.根据权利要求3所述的方法，所述检测通过化学发光酶免疫测定法进行。

6.根据权利要求4所述的方法，所述检测通过化学发光酶免疫测定法进行。

7.用于免疫检测人血小板生成素的组合物，包含权利要求1或2所述的针对人血小板生成素的抗体。

8.根据权利要求7所述的组合物，进一步包含对人血小板生成素的包含57～61位的氨基酸序列的区域和包含102～115位的氨基酸序列的区域显示反应性的抗体。

9.根据权利要求7所述的组合物，用于通过化学发光酶免疫测定法进行所述检测。

10.根据权利要求8所述的组合物，用于通过化学发光酶免疫测定法进行所述检测。

11.根据权利要求7所述的组合物，用于检查特发性血小板减少性紫癜。

12.根据权利要求8所述的组合物，用于检查特发性血小板减少性紫癜。

13.权利要求1或2所述的针对人血小板生成素的抗体的用途，用于制造用于检查特发性血小板减少性紫癜的组合物。

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