ES2753400T3

ES2753400T3 - Nuevo anticuerpo anti-presepsina

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Publication number: ES2753400T3
Application number: ES15755779T
Authority: ES
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2015-02-25
Publication date: 2020-04-08
Anticipated expiration: 2035-02-25
Also published as: CA2938956C; PL3628731T3; CA2938956A1; EP3112463A4; BR112016019739B1; CN106255751B; US10676532B2; KR102360851B1; JP6759429B2; RS62033B1; RU2016137807A3; US20180201688A1; BR112016019739A2; WO2015129774A1; PH12016501579A1; RU2016137807A; EP3628731B1; AU2015223840A2; EP3112463A1; AU2015223840A1

Abstract

Un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno comprende: (a) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 24; (b) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 24; (c) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 21; (d) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 24; o (e) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 27.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo anticuerpo anti-presepsina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-presepsina o a fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos, que son útiles para la medición de presepsina en una muestra.

Antecedentes de la invención

CD14 es una glucoproteína conocida que se expresa en la superficie de la membrana de las células monocíticas y funciona como un receptor de LPS (lipopolisacárido). Hay 2 formas de moléculas CD14. Una es la forma unida a membrana de CD14 (mCD14) expresada en la superficie celular. Otra forma es el CD14 soluble (sCD14). Los sCD14 que tienen un peso molecular de aproximadamente 55 kDa y aproximadamente 49 kDa (en lo sucesivo, el "sCD14 de alto peso molecular") son conocidos en la técnica y se ha indicado que estos sCD14 muestran un alto nivel en la sangre de un paciente con muchas enfermedades, tales como sepsis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y lupus eritematoso sistémico (LES). Por esta razón, estos sCD14 de alto peso molecular no se consideran marcadores específicos de la enfermedad. Véanse los documentos no patentados 1 y 2.

Por otro lado, se ha informado que hay una nueva especie molecular de sCD14, sCD14-ST (subtipo de antígeno CD14 soluble, también denominado presepsina), cuya concentración sanguínea se incrementa característicamente en pacientes con sepsis.

El sCD14-ST (presepsina) se caracteriza por migrar a 13 ± 2 kDa del peso molecular en SDS-PAGE en condiciones no reductoras de todos los sCD14 y comprende la región N-terminal de CD14. sCD14-ST (presepsina) tiene una secuencia de aminoácidos en la que la región C-terminal está en gran medida delecionada en comparación con las secuencias de aminoácidos de sCD14 de alto peso molecular, y a diferencia del sCD14 de alto peso molecular, sCD14-ST (presepsina) no tiene capacidad de unión a LPS. Además, la presepsina muestra una inmunogenicidad diferente de la del sCD14 de alto peso molecular y, por lo tanto, las moléculas se pueden distinguir usando el anticuerpo. La concentración en sangre de presepsina aumenta específicamente en pacientes con sepsis (véase el documento de patente 1). Por otro lado, se informa que la concentración en sangre de presepsina muestra un nivel más alto en la sangre de los pacientes con sepsis en comparación con los pacientes con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), que es difícil de discriminar de la sepsis. Por tanto, la presepsina se considera un marcador de diagnóstico específico de sepsis (véase el documento 3 no patentado).

Se han desvelado un anticuerpo policlonal derivado de conejo (anticuerpo S68) y un anticuerpo monoclonal derivado de rata (F1146-17-2) que reconocieron específicamente la presepsina,(véanse los Documentos de Patentes 1 y 2). Actualmente, un sistema de medición que utiliza un anticuerpo policlonal derivado de conejo como un anticuerpo específico contra la presepsina se usa prácticamente en la medición de la presepsina y los kits de medición para llevar a cabo el sistema de medición están comercializados en Europa y Japón (PATHFAST™ Presepsin, Mitsubishi Chemical Medience Corporation).

Se ha intentado la adquisición de un anticuerpo monoclonal de presepsina antihumano que puede usarse de forma práctica, pero no se ha obtenido un anticuerpo que tenga un rendimiento satisfactorio.

Documentos de los antecedentes de la técnica

Documento de patente

Documento de patente 1: WO 2005/108429.

Documento de patente 2: WO 2004/044005.

Documento no de patente 1: Hayashi y col., Infection and Immunity, 67: 417-420, 1999.

Documento no de patente 2: Lawn, y col., Clinical & Experimental Immunology, 120: 483-487, 2000.

Documento no de patente 3: Yaegashi, y col., Journal of Infection and Chemotherapy, 11: 234-238, 2005.

Sumario de la invención

Problema que ha de resolver la invención

El objeto de la invención es proporcionar un nuevo anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, que sea excelente en cuanto a la reactividad con presepsina y adecuado para medir la presepsina en una muestra.

Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, que proporcione un valor de medición de presepsina que se correlaciona favorablemente con el valor de medición por el anticuerpo S68 (anticuerpo policlonal obtenido mediante la inmunización de un conejo usando el péptido S68 descrito en el Ejemplo 1 del documento WO 2004/044005).

Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, que proporciona un valor de medición de presepsina y que no se ve afectado por la influencia de una sustancia que interfiere (por ejemplo, triglicéridos) en una muestra, y puede permitir medir la presepsina con alta precisión incluso en el caso de una muestra que tenga diversos factores de fondo.

Medios para resolver el problema

Como se proporciona en el presente documento, se obtuvo una pluralidad de anticuerpos monoclonales a partir de una pluralidad de hibridomas obtenidos inmunizando un conejo con el péptido S68 mediante una pluralidad de etapas de selección, tales como la actividad de unión con el péptido S68 y la actividad de unión con presepsina. Se construyó un sistema ELISA para medir la presepsina. Como resultado de investigar la reactividad con presepsina, se obtuvieron anticuerpos, en los que la reactividad del anticuerpo con presepsina se mejoró aproximadamente 10.000 veces en comparación con un sistema ELISA que usa F1146-17-2 (anticuerpo monoclonal obtenido mediante inmunización de una rata con el péptido S68 descrito en el Ejemplo 2 del documento WO 2004/044005 A1). La secuencia de aminoácidos de la parte CDR de la región variable F1146-17-2 se describe en SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO: 47.

Los niveles de presepsina en la sangre de pacientes con sepsis plural se midieron en el sistema ELISA usando cada uno de estos anticuerpos monoclonales de conejo y se realizó un análisis de correlación con los valores de medición mediante el sistema ELISA usando el anticuerpo S68. Como resultado, se determinó que había algunos anticuerpos que mostraban una alta correlación y algunos anticuerpos que mostraban baja correlación. Se determinó además que la interferencia de triglicéridos (TG) en una muestra puede estar implicada en la diferencia en los valores de correlación. Para obtener un anticuerpo que se correlaciona favorablemente con el valor de medición de presepsina del anticuerpo S68, que resiste la interferencia de TG en una muestra y que es adecuado para la medición de presepsina en una muestra, se continuó la investigación y se determinó que se genera una diferencia en el rendimiento de un anticuerpo dependiendo del epítopo que el anticuerpo reconoce. En otras palabras, se determinó que la diferencia se produce por la interferencia del triglicérido (también denominado TG) en una muestra y/o el epítopo.

Se determinó que una anticuerpo que mostraba un rendimiento preferente en la medición de presepsina reconoce una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 (krvdadadpr; o la región correspondiente a la Posición 52 a la Posición 61 en la Secuencia No. 3 (CD14 soluble de longitud completa humana). Este es un nuevo epítopo que fue descubierto por primera vez por la presente invención.

Un anticuerpo que reconoce esta secuencia P03 como un epítopo se inhibió competitivamente en una reacción entre el anticuerpo y la presepsina en un 50 % o más por una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la secuencia P03. Por otro lado, la inhibición por competición para una reacción entre el anticuerpo y la presepsina por cada secuencia de restos de aminoácido que consiste en la SEQ ID NO: 35 a SEQ ID NO: 41 fue inferior al 20 %, lo que significa la inhibición por competición por una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 36 (correspondiente a la posición 49 a la posición 58 de CD14 soluble de longitud completa humana: también conocida como secuencia P02), una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 37 (correspondiente a la posición 55 a la posición 64 de CD14 soluble de longitud completa humana: también conocida como secuencia P04), o una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 38 (correspondiente a la posición 58 a la posición 67 de CD14 soluble de longitud completa humana: también conocida como secuencia P05) fue inferior al 20 %. Por tanto, se determinó que un anticuerpo que reconoce la secuencia P03 como un epítopo tiene una alta especificidad para la secuencia P03.

Al mismo tiempo, también se vio que, entre los anticuerpos obtenidos de hibridomas, los anticuerpos que reconocen la secuencia P04 y la secuencia P05 en la presepsina no son adecuados para la medición de presepsina, ya que estos anticuerpos son susceptibles a la interferencia de TG en una muestra en el momento de la medición de presepsina, y así sucesivamente. De esta manera, inesperadamente, una ligera diferencia en la posición del epítopo reconocido por un anticuerpo influye sobre el rendimiento del anticuerpo.

Además, en la secuencia de un resto de aminoácidos en la que la posición 8 ácido aspártico de la secuencia P03(SEQ ID NO: 1) está sustituido con alanina, la inhibición por competición por una reacción entre el anticuerpo y la presepsina fue inferior al 20 %. Por otro lado, se descubrió que una secuencia de restos de aminoácidos en la que cualquiera de los aminoácidos de la posición 2 a la posición 7, la posición 9 y la posición 10 de la secuencia P03 (SEQ ID NO: 1) se sustituyen con alanina (o glicina), inhiben de forma competitiva una reacción entre el anticuerpo y la presepsina en un 50 % o más.

Adicionalmente, para hacer un anticuerpo que tenga un rendimiento preferente para la medición de presepsina, las alteraciones de las secuencias de CDR se realizaron según las secuencias de anticuerpos que reconocen la secuencia P03 como un epítopo. Además, los anticuerpos se hicieron usando un procedimiento de presentación en fagos. Los anticuerpos resultantes se seleccionaron según un patrón para obtener anticuerpos que son iguales o tienen un mejor rendimiento que el de los anticuerpos obtenidos de hibridomas.

Se obtuvieron anticuerpos que reconocen la secuencia P03 como un epítopo, que se obtuvieron de hibridomas y anticuerpos alterados seleccionados y se confirmó que tenían una afinidad extremadamente alta por la presepsina, y resisten la influencia de una sustancia interferente (particularmente, triglicéridos) en una muestra. Estos anticuerpos están correlacionados favorablemente con un sistema de medición que usa el anticuerpo S68. Estos anticuerpos son adecuados para la medición de presepsina en una muestra, en, por ejemplo, un ensayo ELISA de tipo sándwich para la medición de presepsina.

La presente invención se describe a continuación.

(1) Un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno comprende:

(a) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 97 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 24;

(b) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 24;

(c) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 21;

(d) VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 24; o

(e) Vh que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de Secuencia NO: 27.

(2) El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o el fragmento se une a la presepsina con una afinidad menor de 10-8 M (KD).

(3) El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la unión entre el anticuerpo y la presepsina se inhibe de forma competitiva en un 50 % o más en un sistema de reacción en el que una secuencia de resto de aminoácidos que consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 1 se somete a reacción competitiva (absorbancia) de modo que se inhiba la unión entre el anticuerpo o el fragmento y la presepsina.

(4) El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la inhibición competitiva para la unión entre el anticuerpo y la presepsina por una secuencia de resto de aminoácido es inferior al 20 % en un sistema de reacción en el que la secuencia de resto de aminoácido se somete a reacción competitiva (absorbancia) de modo que la unión entre el anticuerpo o el fragmento y la presepsina se inhibe, y en el que la secuencia del resto de aminoácido consiste en una secuencia en la que el ácido aspártico en la posición 8 en la SEQ ID NO: 1 está sustituida con alanina.

(5) El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que

(i) el anticuerpo no se une específicamente a CD14 soluble de alto peso molecular; y/o

(ii) la relación de la muestra que exhibe el grado de separación del valor de medición de presepsina de ± 20 % o menos, cuando la concentración de triglicéridos (TG) es de 20 mg/ml en una muestra, indica el 50 % o más en la prueba de interferencia de TG en múltiples muestras realizadas usando el anticuerpo anterior; y/o (iii) el valor de medición de presepsina obtenido usando el anticuerpo anterior en una muestra exhibe un coeficiente de correlación de 0,9 o más con el valor de medición obtenido usando el anticuerpo S68 en una muestra; y/o

(iv) el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo monocatenario (scFv), región V dimerizada (diacuerpo), región V estabilizada con disulfuro (dsFv), sc (Fv)2, un polipéptido que comprende CDR, un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada y un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera.

(6) Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores.

(7) Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de acuerdo con el punto (6) anterior.

(8) Una cepa transformada obtenida mediante la introducción del vector recombinante de acuerdo con el punto (7) anterior a una célula huésped.

(9) La cepa transformada de acuerdo con el punto (8) anterior, en la que la célula hospedadora es una célula CHO.

(10) Un procedimiento para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, en el que el procedimiento comprende cultivar la cepa transformada de acuerdo con los puntos (8) o (9) anteriores.

(11) Un kit para medir presepsina, en el que el kit comprende al menos el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores.

(12) Un kit para detectar sepsis o ayudar a la detección/diagnóstico de sepsis en el que el kit comprende al menos el anticuerpo o el fragmento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores.

(13) El kit para medir presepsina de acuerdo con el punto (11) anterior, en el que el kit para medir la presepsina se usa para la detección o evaluación de al menos una enfermedad seleccionada de la discriminación entre sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), evaluación de riesgo de gravedad de la sepsis, predicción pronóstica de sepsis (predicción de mortalidad), valuación del grado de gravedad séptica, detección de infecciones del sitio quirúrgico, detección de coagulación intravascular diseminada (CID), detección de CID infecciosa, detección de cardiopatías, detección de infecciones respiratorias asociadas con infección bacteriana, detección de enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), detección de neutropenia febril (FN), detección del síndrome hemofagocítico (SHF) y evaluación de la función del fagocito.

(14) Un procedimiento para medir la presepsina, en el que el procedimiento comprende la etapa de ponerse en contacto con al menos el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores y una muestra que contiene presepsina.

(15) Un procedimiento para detectar sepsis o ayudar a la detección/diagnóstico de sepsis, que comprende al menos las etapas que se describen a continuación:

1) una etapa para medir la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto usando el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5) anteriores, y

2) una etapa para determinar si la concentración de presepsina obtenida en el punto 1) anterior es un valor alto en comparación con un valor de corte o no.

(16) Un procedimiento para seleccionar un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, en el que el procedimiento comprende al menos las etapas que se describen a continuación:

1) una etapa de obtención de un anticuerpo anti-presepsina candidato o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno candidato, y

2) una etapa de selección del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno, en la que la unión entre el anticuerpo y la presepsina se inhibe de manera competitiva en un 50 % o más en un sistema de reacción en el que una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 se somete a una reacción competitiva para que la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina está inhibido.

Efecto de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo que es excelente en la reactividad con presepsina y adecuado para medir la presepsina en una muestra, por lo que se puede mejorar la calidad y la precisión de la medición de presepsina. La presente invención proporciona la capacidad de proporcionar anticuerpos que tienen alta afinidad por la presepsina que también son adaptables para la cuantificación de una cantidad menor de presepsina al nivel de una persona normal y permite la mejora de la sensibilidad. Además, la presente invención proporciona la capacidad de proporcionar un anticuerpo que resiste la influencia de una sustancia interferente en una muestra, que permite la medición en un sistema ELISA de tipo sándwich para evitar la influencia de la diferencia individual (factor de fondo del sujeto) de una muestra de suero y producir mediciones con alta precisión. Tales medidas, que tienen una especificidad alta, es posible solo con un anticuerpo que se une específicamente a solo presepsina y no se une específicamente a sCD14 de alto peso molecular, en el sistema ELISA de tipo sándwich.

Los problemas relacionados con la medición de presepsina utilizando anticuerpos policlonales (incluido el seguro de la homogeneidad entre lotes, dificultad de producción y costes) pueden resolverse, por lo que se puede proporcionar un anticuerpo que es excelente en la práctica. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal tiene la ventaja de que puede producirse a bajo coste, estable y eficazmente, y se puede mantener una calidad uniforme de dicho anticuerpo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de una serie de pruebas de interferencia de TG en suero sanguíneo de un ser humano normal, usando el anticuerpo de F1466-26 (A), F1466-5 (B) y F1466-19 (C).

La figura 2 es la lista de variantes obtenidas en el ejemplo 8 y el ejemplo 12.

La figura 2-1 es la lista de variantes obtenidas en el ejemplo 8 y el ejemplo 12 y continúa desde la figura 2.

La figura 2-2 es la lista de variantes obtenidas en el ejemplo 8 y el ejemplo 12 y continúa desde la figura 2-1.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

A continuación, en el presente documento, la presente invención se describe con más detalle.

1. Un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento reconoce específicamente un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismos, en el que el anticuerpo o el fragmento reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 como un nuevo epítopo de presepsina.

La expresión "reconoce específicamente un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1" indica que el anticuerpo reconoce específicamente, como epítopo, una secuencia correspondiente a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 entre las secuencias de presepsina.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" indica, entre los fragmentos parciales de un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, un fragmento que tiene la misma propiedad de unión al antígeno que el anticuerpo original.

Tal como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" u "homología de secuencia" se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polinucleótidos o secuencias de aminoácidos, a saber, una secuencia de referencia y una secuencia dada para comparar con la secuencia de referencia. La identidad u homología de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias se hayan alineado de manera óptima para producir el mayor grado de similitud de secuencia, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. Tras dicho alineamiento, la identidad de secuencia se determina posición a posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición particular si, en esa posición, los nucleótidos o los restos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide después por el número total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para proporcionar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, GrifEn A. M. y GrifEn H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. y Devereux J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo H. y Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad de secuencia están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los procedimientos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente, que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de dichos programas incluyen, aunque no de forma limitativa, el paquete del programa GCG (Devereux y col., Nuc. Ac. Res., 12(1 ):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al, J. Molec. Biol, 215:403-410 (1990)). El programa BLAs Tx está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes.

El procedimiento para determinar un epítopo no está particularmente limitado en la presente invención, por ejemplo, la determinación puede hacerse por el procedimiento descrito en el Ejemplo 6.

El anticuerpo de la presente invención puede caracterizarse por una inhibición competitiva del 50 % o más para la unión entre el anticuerpo y la presepsina de acuerdo con un sistema de reacción (preferentemente usando absorbancia) en el que el péptido P03 (una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1) se utiliza para la reacción competitiva para inhibir la unión entre el anticuerpo y la presepsina. Preferentemente, El sistema de reacción es un ELISA de tipo sándwich. Más preferentemente, el sistema de reacción es ELISA de tipo sándwich usando (a) el anticuerpo o el fragmento de la presente invención y (b) el anticuerpo F1106-13-3 o el anticuerpo F1031 8-3. La secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 corresponde a la posición 52 a la posición 61 de

la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) del CD14 soluble de longitud completa. Preferentemente, la inhibición competitiva para la unión entre el anticuerpo de la presente invención y la presepsina es inferior al 20 % por el péptido

P01 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 46 a la posición 55 de la SEQ ID NO: 3), el péptido

P02 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 49 a la posición 58 de la misma secuencia), el péptido

P05 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 58 a la posición 67 de la misma secuencia), el pépti P06 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 61 a la posición 70 de la misma secuencia), el péptido

P07 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 64 a la posición 73 de la misma secuencia) o el péptido

P08 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 67 a la posición 76 de la misma secuencia).

Preferentemente, la inhibición competitiva para la unión entre el anticuerpo de la presente invención y la presepsina

es inferior al 20 % por el péptido P04 (la secuencia de aminoácidos representada por la posición 55 a la posición 64

de la SEQ ID NO: 3).

Como alternativa, como uno de los otros procedimientos para determinar un epítopo, también es posible ver la actividad de unión entre una secuencia parcial (por ejemplo, el péptido P03) de un antígeno objetivo y un anticuerpo, tal como se describe en, por ejemplo, Ejemplo 9-(4).

Una realización de la presente invención proporciona un anticuerpo anti-presepsina que se une a una secuencia en la que uno o más aminoácidos distintos del ácido aspártico de posición 8 en la secuencia P03 (SEQ ID NO: 1) está/están sustituido/s. El número de aminoácidos sustituidos es, preferentemente dos o menos de los aminoácidos, y, más preferentemente, un aminoácido.

Por ejemplo, en un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-presepsina que se unirá a P03 o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia del 90 % o mayor. El epítopo objetivo puede compartir 90,

91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de secuencia con P03. En algunas realizaciones, el anticuerpo

anti-presepsina específico para una secuencia que comparte una identidad de secuencia del 90 % o mayor con P03

puede ser un anticuerpo monoclonal.

Un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que reconoce específicamente la presepsina. La presepsina

(sCD14-ST) es un fragmento soluble de CD14 e indica una sustancia que tiene las siguientes propiedades 1) a 3).

- Peso molecular de 13 ± 2 kDa según SDS-PAGE en condiciones no reductoras,

- Tiene una secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 11 de la SEQ ID NO: 3 en el extremo N-terminal, y

- Se une específicamente a un anticuerpo preparado mediante el uso de un péptido que consiste en 16 restos de aminoácidos descritos en la SEQ ID NO: 2 para el antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, presepsina significa presepsina humana, a menos que se ilustre particularmente lo contrario.

Además, en la presente invención, la presepsina puede ser una sustancia que tiene la actividad de presepsina, tal como no solo un patrón de presepsina (rsCD14-ST descrito en el Ejemplo 16 del documento WO 2005/108429) sino también rsCD14ST-Fc (como se describe en el Ejemplo 9-(2) a continuación).

Como se describe en el presente documento, el "anticuerpo que reconoce específicamente" significa un anticuerpo

que reconoce inmunológicamente a un sujeto para reconocimiento específico y/o un anticuerpo que muestra una reacción antígeno-anticuerpo típica con un sujeto para reconocimiento específico. Cuando la unión entre el anticuerpo

y el sujeto para el reconocimiento específico se expresa por afinidad, la constante de disociación de equilibrio (KD) es, generalmente, menor de 10'7 M. Un anticuerpo de la presente invención reconoce específicamente la presepsina solamente. El CD14 soluble principal presente en la sangre humana es el CD14 soluble de aproximadamente 55 kDa

y aproximadamente 49 kDa (sCD14 de alto peso molecular). Un anticuerpo de la presente invención no se une específicamente al sCD14 de alto peso molecular. En cuanto a sCD14 de alto peso molecular, se puede usar el CD14

de longitud completa humana que consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 3 o se puede preparar por adsorción en columna de afinidad usando el anticuerpo 3C10 del fluido corporal de un ser humano normal, por ejemplo (véase el Ejemplo 23 del documento WO 2005/108429).

En un aspecto, un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención tiene una excelente reactividad para la presepsina y, por lo tanto, es útil para medir la presepsina en una muestra. Por ejemplo, la presepsina en una muestra puede medirse estableciendo un sistema ELISA de tipo sándwich usando un anticuerpo

o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención.

En comparación con F1146-17-2 (un anticuerpo monoclonal derivado de una rata, descrito en el Ejemplo 2 del documento WO 2004/044005), un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención es más adecuado para la detección de presepsina presente en una cantidad traza en una muestra, en vista

del hecho de que la reactividad con presepsina se mejora aproximadamente 10.000 veces en un sistema ELISA de

tipo sándwich (Ejemplo 4). En otras palabras, en comparación con F1146-17-2, un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención se puede caracterizar por tener reactividad con presepsina que se incrementa en 10.000 veces o más en términos de proporción de concentración de presepsina.

En un paciente con sepsis, se ha informado de que la concentración en sangre de la presepsina aumenta de forma característica. Un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención se usa deseablemente para la detección de sepsis. Un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo es, preferentemente, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo para el cual se observa una diferencia en el valor de medición de presepsina cuando se construye un ELISA de tipo sándwich usando el presente anticuerpo, y se miden una muestra de un paciente con sepsis y una muestra de una persona normal, como se muestra en el Ejemplo 1.

Un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención es, adecuadamente, un anticuerpo que no tiene un problema con la influencia de una sustancia interferente en una muestra cuando se realiza la medición de presepsina en una muestra mediante el establecimiento de un sistema de medición.

En la presente invención, una sustancia interferente significa una sustancia cuya presencia influye potencialmente en el valor de medición de la presepsina (en lo sucesivo, también denominado "interferencia"). Ejemplos de los mismos incluyen triglicéridos (también conocidos como TG), bilirrubina, hemoglobina, factor reumatoide y colesterol. En la presente invención, la sustancia interferente preferida para la evaluación de un anticuerpo es triglicérido (TG).

Como un indicador de evaluación de la prueba de interferencia, la desviación del valor de medición de presepsina en el momento de añadir una cierta cantidad de una sustancia interferente a una muestra del valor de medición de presepsina de la misma muestra sin añadir ninguna sustancia interferente puede expresarse como un grado de separación ( %). Además, el grado de separación ( %) puede usarse para un indicador de evaluación de la prueba de interferencia. El grado de separación de un valor de medición según la adición de una sustancia interferente se expresa de la siguiente manera:

Grado de separación ( %) = {(Valor de medición de la presepsina después de añadir una sustancia interferente) -(Valor de medición de la presepsina sin añadir una sustancia interferente) {/ (Valor de medición de la presepsina sin añadir una sustancia interferente) X 100.

Tal como se usa en el presente documento, La expresión "no tiene un problema con la influencia de una sustancia interferente" puede describirse como sigue: en una prueba de interferencia usando múltiples muestras, por ejemplo, una relación de la muestra que muestra el grado de separación de ± 20 % o menos y, más preferentemente, ± 10 % o menos es alta, en la que el grado de separación indica el valor obtenido de la medición de presepsina de acuerdo con la adición de una cierta cantidad de una sustancia interferente. La expresión "una relación de la muestra es alta" en múltiples muestras generalmente indica 50 % o más, preferentemente, del 60 % o mayor, más preferentemente del 70 % o mayor, incluso más preferentemente 80 % o más y particularmente preferentemente 90 % o más de múltiples muestras.

Con respecto a la prueba de interferencia TG, por ejemplo, es posible que la prueba de interferencia se realice para muestras múltiples y aquellas que tienen una alta relación de la muestra que exhibe un grado de separación del valor de medición de presepsina de ± 20 % o menos, y más preferentemente ± 10 % o menos, cuando la concentración de TG es 20 mg/ml en una muestra mediante la adición de TG, se usan como un indicador. Una realización preferida de la presente invención es cuando la prueba de interferencia de TG se realiza usando un sistema de medición que usa un anticuerpo de la presente invención, en el que el anticuerpo exhibe una alta proporción de una muestra en la cual el grado de separación del valor de medición de presepsina es ± 20 % o menos, y más preferentemente ± 10 % o menos, cuando la concentración de TG es 20 mg/ml.

Como alternativa, por ejemplo, se puede obtener un grado de separación del valor de medición de presepsina cuando la concentración de t G en una muestra es de 20 mg/ml en una pluralidad de muestras, y se puede usar como un índice de que un promedio del grado de separación es ± 20 % o menos, y más preferentemente ± 10 % o menos. Una de las realizaciones preferentes de un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo en el que un promedio de un grado de separación del valor de medición de presepsina a la concentración de TG en una muestra de 20 mg/ml exhibe ± 20 % o menos, y más preferentemente ± 10 % o menos, cuando se realiza una prueba de interferencia de TG con respecto a una pluralidad de muestras mediante un sistema de medición que usa el anticuerpo.

En NCEP-ATPIII, que es una guía para la dislipidemia en EE.UU., se describe que menos de 150 mg/dl de TG es normal, TG de 150 a 200 mg/dl está en el límite, TG de 200 a 499 mg/dl es un valor alto (alto), y 500 mg/dl o más es un valor alto notable (muy alto). Se puede decir que la concentración de TG de 20 mg/ml (= 2000 mg/dl) en una muestra está en el estado donde la concentración de TG es extremadamente alta, a la luz del patrón mencionado anteriormente.

En una prueba de interferencia de TG del presente ejemplo, se mide un grado de separación del valor de medición de presepsina en tres puntos de la concentración de TG de una muestra de 6,7 mg/ml, 13,3 mg/ml y 20 mg/ml. Se observó una tendencia a que el grado de separación también sea pequeño a la concentración de TG de una muestra de 6,7 mg/ml y 13,3 mg/ml en un anticuerpo en el que el grado de separación es pequeño a la concentración de TG de una muestra de 20 mg/ml (sistema de medición) en comparación con un anticuerpo en el que el grado de separación es grande.

La prueba de interferencia de TG puede realizarse utilizando suero humano de persona normal. Dado que una muestra de una persona normal (es decir, una persona no séptica) tiene una baja concentración de presepsina, cuando sufre interferencia de TG, un grado de separación del valor de medición se vuelve fácilmente grande. Mediante la presente prueba, si se puede medir una cantidad menor de presepsina en una muestra, es indicativo de que la prueba tiene buena precisión. Por ejemplo, un grado de separación del valor de medición de presepsina a la concentración de TG en una muestra es preferentemente ± 100 % o menos, más preferentemente ± 70 % o menos, más preferentemente ± 50 % o menos, y particularmente preferentemente ± 20 % o menos. Es deseable realizar la prueba usando una pluralidad de muestras, como en la prueba mencionada anteriormente.

Adicionalmente, un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención también se puede evaluar según la comparación entre el grado de separación del valor de medición de presepsina obtenido al añadir una sustancia de interferencia para el anticuerpo y el grado de separación del anticuerpo S68 en las mismas condiciones. De acuerdo con una realización preferida, un anticuerpo de la presente invención y un anticuerpo S68 exhiben grados de separación similares.

Con respecto a la prueba de interferencia de TG, la evaluación también se puede hacer teniendo una alta proporción de la muestra que exhibe un 20 % o menos y, más preferentemente, un 10 % o menos de una diferencia entre el grado de separación del valor de medición de presepsina cuando la concentración de TG es 20 mg/ml en un muestra de acuerdo con la adición de TG en un sistema de medición usando el anticuerpo de la presente invención y el grado de separación del anticuerpo S68 en las mismas condiciones. Con respecto a la diferencia en el grado de separación, cuando el grado de separación del valor de medición obtenido del anticuerpo de la presente invención es 5 % y el grado de separación del valor de medición obtenido del anticuerpo S68 es -10 %, por ejemplo, la diferencia en el grado de separación se calculó como 15 %.

Como la muestra utilizada en la prueba de interferencia, se pueden usar las muestras descritas en la segunda realización de la presente invención. En el caso de una prueba de interferencia de TG, la muestra es, preferentemente, suero o plasma.

En cuanto a un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención, un anticuerpo que exhibe una buena correlación con el valor de medición obtenido mediante el uso del anticuerpo S68 es preferente cuando la presepsina en una muestra se mide estableciendo un sistema de medición. "Buena correlación" significa que el coeficiente de correlación es, preferentemente, 0,9 o más, y más preferentemente 0,95 o más.

Un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención puede unirse específicamente a presepsina, y la afinidad por la presepsina (constante de disociación de equilibrio, valor KD) es preferentemente menor de 10-7 M, más preferentemente menos de 10-8 M, incluso más preferentemente menos de 10 9 M, particularmente preferentemente menos de 10-10 M, y lo más preferentemente menos de 10-11 M. La constante de disociación de equilibrio de un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención para presepsina está preferentemente en el intervalo de 10-7 M a 10 -14 M, más preferentemente en el intervalo de 10-8M A 10-13M. rsCD14ST-Fc se puede usar como presepsina.

La afinidad (constante de disociación de equilibrio, valor KD) se puede medir usando, por ejemplo, BIACORE (GE Healthcare).

En una de las realizaciones preferentes de la presente invención, la afinidad (valor KD) por la presepsina del anticuerpo de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo es excelente en comparación con la afinidad por la presepsina del anticuerpo s 68. Es deseable que la afinidad (valor KD) para rsCD14ST-Fc (descrita en Presepsina: Ejemplo 9-(2) de un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo exhibe un valor numérico al mismo nivel o menor que 1,08E-08 de afinidad (valor KD) para rsCD14ST-Fc para el anticuerpo S68, y es deseable que la afinidad muestre preferentemente 1/2 de un valor KD del anticuerpo S68 (5,40E-09) o menos, y más preferentemente 1/10 de un valor Kd del anticuerpo S68 (1,08E -09) o menos.

Una de las realizaciones preferentes de la presente invención es una excelente actividad de unión de un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo con presepsina en comparación con el anticuerpo S68.

Por ejemplo, el rsCD14ST-Fc (presepsina) se fija a una fase sólida y se hace reaccionar con un anticuerpo, y la actividad de unión de un anticuerpo con presepsina se puede evaluar por absorbancia como se describe en el Ejemplo 10-(2).

Cuando se realiza una prueba de acuerdo con el Ejemplo 10 y se determina que la absorbancia en una reacción del anticuerpo S68 y rsCD14ST-Fc es 1, una relación de absorbancia cuando el anticuerpo de la presente invención y el rsCD14ST-Fc reaccionan es, preferentemente, 1 o más, más preferentemente 2 o más, más preferentemente 4 o más y particularmente preferentemente 5,5 o más.

La presente invención proporciona un anticuerpo descrito en cualquiera de las siguientes formas. Estos anticuerpos son anticuerpos anti-presepsina. Debido a que el siguiente anticuerpo de (a), (b) o (c) y el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo reconocen específicamente un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 presente en presepsina, son ejemplos preferidos de una primera realización. Más preferente es un anticuerpo de (a) o (b), o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.

(a) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo que comprende VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

(b) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo que comprende VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o

(c) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo que comprende VH que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, VH CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y VL que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, VL CDR2 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y VL CDR3 que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos de la región CDR descrita en la Figura 2 a Figura 2-2. Estos anticuerpos reconocen específicamente un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 presente en la presepsina. Es más preferente un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR de 5793, 5810, 5864, 5979, 5983, 5988 o 6028, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.

Se desvelan polipéptidos que comprenden CDR descritos en cualquiera de los siguientes (i), (ii), (iv) y (v).

(i) un polipéptido que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4, VH CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 5, y VH CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 6

(ii) un polipéptido que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8, y VH CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 9

(iii) un polipéptido que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 10, VH CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 11, y VH CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 12

(iv) un polipéptido que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 19, VL CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 20 y VL CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 21

(v) un polipéptido que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 22, VL CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 23 y VL CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 24

(vi) un polipéptido que comprende VL CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 25, VL CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 26 y VL CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 27

Se desvelan polipéptidos que comprenden VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 que consiste en cada secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2 a la Figura 2-2. En la realización, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que consiste en cada secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2 a la Figura 2 -2. Más preferente es un polipéptido que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de s Eq ID NO: 8 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 94 (5793) o un polipéptido que comprende VH CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7, VH CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 97 y VH CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 9 (5810).

La presente invención proporciona un polipéptido que comprende la región variable descrita en cualquiera de los siguientes. Más preferente es un polipéptido de (i), (ii), (iv) o (v).

(i) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4, CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 5, CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID (ii) una VH que comprende CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7, CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 8, CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 9

(iii) una VH que comprende CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 10, CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ iD NO: 11, CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 12

(iv) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 19, CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 20, CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 21

(v) una VL que comprende CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 22, CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 23, CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 24

(vi) una VL que comprende CDR1 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 25, CDR2 que consiste en una secuencia de SEQ iD NO: 26, CDR3 que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 27

Se desvela un polipéptido que comprende una VH que comprende VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 que consiste en cada secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2 a la Figura 2-2.

Se desvela un polipéptido que comprende una VL que comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que consiste en cada secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2 a la Figura 2 -2.

El polipéptido es, preferentemente, una sustancia de unión a antígeno que tiene una actividad de unión para presepsina.

El anticuerpo o polipéptido anterior puede tener una sustitución, una deleción, una adición y/o una inserción (denominada sustitución) de uno o más aminoácidos en la secuencia CDR. El anticuerpo o polipéptido después de la sustitución de uno o más aminoácidos tiene, preferentemente, la misma actividad o rendimiento que antes de realizar la sustitución, en términos de actividad de unión para un antígeno, característicos a la hora de medir la presepsina. Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o polipéptido después de la sustitución, que tiene la misma actividad o rendimiento o mejor que antes de realizar la sustitución, incluye tanto una variante obtenida por modificación artificial basada en un procedimiento de ingeniería genética conocido como una variante de origen natural (llamada variante de alelo). Un número múltiple de sustituciones de aminoácidos no está particularmente limitado y la sustitución puede incluir 1 o más. Sin embargo, preferentemente tiene tres o menos aminoácidos, más preferentemente, dos o menos aminoácidos e incluso más preferentemente un aminoácido en una CDR. El anticuerpo o polipéptido anterior puede tener una secuencia de aminoácidos de CDR con una identidad del 90 % o superior a la secuencia de aminoácidos de CDR designada por la SEQ ID NO. como se ha descrito anteriormente. La identidad de secuencia puede ser del 92 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor o 99 % o mayor. Tal anticuerpo o polipéptido tiene, preferentemente, el mismo nivel de actividad o rendimiento que el anticuerpo o polipéptido designado por la SEQ ID NO.

La región marco (FR) del anticuerpo que se conjugará con la CDR se selecciona de modo que las CDR formen un buen sitio de unión a antígeno. La FR usada para la región variable de la presente invención no está particularmente limitada y se puede usar cualquier FR. En caso necesario, uno o más aminoácidos de la FR pueden estar sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados de forma que la CDR pueda formar un sitio de unión a antígeno adecuado. Por ejemplo, de acuerdo con la medición y evaluación de la actividad de unión de un anticuerpo usando FR con un aminoácido sustituido para un antígeno, también se puede seleccionar una secuencia de FR variante que tenga una propiedad deseada. En una realización, FR puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 80 % o mayor a la secuencia designada por la s Eq ID NO. La identidad de secuencia puede ser del 85 % o mayor, 90 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor o 99 % o mayor. Por ejemplo, de acuerdo con la medición y evaluación de la actividad de unión de un anticuerpo usando FR con un aminoácido sustituido para un antígeno, también se puede seleccionar una secuencia de FR variante que tenga una propiedad deseada.

Por ejemplo, la FR bien conocida que se puede obtener de una base de datos (por ejemplo, GenBank), FR de un anticuerpo obtenido en la presente invención puede usarse como la región marco. (por ejemplo, AAO06511.1, AAT02391.1, AAG13973.1 y AGT29816.1 se ilustran como ejemplo como secuencia de aminoácidos. AY596429.1, AY171772.1, KC020056.1 y AF294966.1 se ilustran como ejemplo como secuencia de polinucleótidos). Las SEQ ID NO: 48 a 84 son adecuadas para su uso en ciertas realizaciones de la presente invención. Estas son FR que se pueden obtener de una base de datos, o FR de un anticuerpo obtenido en la presente invención. Las regiones marco pueden derivarse de varios animales, aunque el conejo se usa preferentemente en algunas realizaciones de la presente invención. Las regiones FR preferidas de los anticuerpos de la presente invención incluyen las mostradas en las SEQ ID NO: 64-84 o, más preferentemente, las SEQ. ID. NO: 65, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 83, o 84.

En una realización, los ejemplos preferentes de las regiones variables del anticuerpo de la presente invención son los siguientes.

( 1)

(i) una VH que comprende CDR de VH de la variante descrita en la figura 2 a la figura 2-2 (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 del anticuerpo 5810) y la FR de la secuencia de SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73; y

(ii) una VL que comprende CDR de VL de la variante descrita en la figura 2 a la figura 2-2 (por ejemplo, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 del anticuerpo 5810) y FR de la secuencia de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 84.

(2)

(i) una VH que comprende las CDR de VH de F1466-5, F1466-26 o F1466-16 (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 de F1466-26) y la FR de la secuencia de SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 73; y

(ii) una VL que comprende las CDR de VL de F1466-5, F1466-26 o F1466-16 (por ejemplo, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 de F1466-26) y la FR de la secuencia de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 84.

(3)

(i) una VH que comprende CDR de VH de la variante descrita en la figura 2 a la figura 2-2 (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 del anticuerpo 5810) y la FR de la secuencia de SEQ ID NO: 65 (o 66), SEQ ID NO: 68(o 69), SEQ ID NO: 71(o 72) y SEQ ID NO: 73; y

(ii) una VL que comprende CDR de VL de la variante descrita en la figura 2 a la figura 2-2 (por ejemplo, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 del anticuerpo 5810) y FR de la secuencia de SEQ ID NO: 75 (o 76), SEQ ID NO: 78(o 79), SEQ ID NO: 81 (u 82 u 83), y SEQ ID NO: 84.

(4)

(i) una VH que comprende las CDR de VH de F1466-5, F1466-26 o F1466-16 (por ejemplo VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 de F1466-26) y la FR de la secuencia de SEQ ID NO: 65 (o 66), SEQ ID NO: 68(o 69), SEQ ID NO: 71(o 72) y SEQ ID NO: 73; y

(ii) una VL que comprende las CDR de VL de F1466-5, F1466-26 o F1466-16 (por ejemplo VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 del anticuerpo 5810) y la FR de la secuencia de SEQ ID NO: 75 (o 76), SEQ ID NO: 78(o 79), SEQ ID NO: 81 (u 82 u 83), y SEQ ID NO: 84.

En la región variable, uno o más aminoácidos (por ejemplo, cinco o menos aminoácidos y, preferentemente, tres o menos aminoácidos) pueden estar sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados. El anticuerpo o polipéptido después de la sustitución de uno o más aminoácidos tiene, preferentemente, la misma actividad o rendimiento que antes de realizar la sustitución, en términos de actividad de unión para un antígeno, característicos a la hora de medir la presepsina. En una realización, cuando una región variable está especificada por la secuencia como se ha descrito anteriormente, la región variable puede tener una secuencia de aminoácidos con una identidad del 80 % o superior a la secuencia designada por la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO. La identidad de secuencia puede ser del 85 % o mayor, 90 % o mayor, 95 % o mayor, 97 % o mayor o 99 % o mayor. Dicha región variable tiene, preferentemente, el mismo nivel de actividad o rendimiento que la región variable designada por la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO.

La región constante usada para un anticuerpo de la presente invención no está particularmente limitada, y se puede usar cualquier región constante. Los ejemplos preferidos de la región constante que se usa para el anticuerpo de la presente invención incluyen una región constante de IgG derivada de un ratón, una rata, un conejo o un ser humano. La región constante puede tener uno o más aminoácidos que están sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados dentro de un intervalo en el que la actividad de unión para un antígeno, las características al momento de medir la presepsina no se ven afectadas por ellas.

El anticuerpo de la presente invención es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal, es decir, un anticuerpo monoclonal anti-presepsina. El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo secretado por una célula productora de anticuerpos de un monoclón. En comparación con un anticuerpo policlonal, el anticuerpo monoclonal tiene una característica en que se puede obtener un anticuerpo con un título alto y una especificidad de antígeno homogénea. Teóricamente, el anticuerpo monoclonal tiene la ventaja de que tiene un menor peso de anticuerpo requerido para una medición de antígeno en comparación con un anticuerpo policlonal. Como se describe en el presente documento, el término "anticuerpo" puede usarse con un significado de "anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo".

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede producir preferentemente usando el péptido S68, descrito por la SEQ ID NO: 2, como antígeno para la administración. Se puede obtener un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante, por ejemplo, inmunización de un animal con péptido S68, produciendo un hibridoma usando células productoras de anticuerpos de un animal inmunizado y células de mieloma, seleccionando y cultivando el hibridoma preparado como una célula individual y purificando un sobrenadante de cultivo.

La especie animal de la que deriva el anticuerpo no está particularmente limitada y sus ejemplos incluyen un ratón, una rata, un hámster y un conejo. Es, preferentemente, un conejo. En otras palabras, un anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal anti-presepsina derivado de un conejo (también denominado anticuerpo monoclonal anti-presepsina de conejo).

Como células de mieloma, se pueden usar varias células conocidas. Ejemplos de las mismas incluyen SKO-007 derivado de un ser humano, SHM-D33 de heteromieloma humano-ratón, P3, NS-1, P3U1 y SP2/0 derivan de un ratón, y YB2/0 e Y3-Ag1,2, 3 derivados de una rata. También es posible usar linfocitos B inmortalizados derivados de conejo.

De acuerdo con la presente invención, También es preferente que se produzca un hibridoma de conejo-conejo por fusión entre células de bazo de conejo y linfocitos B inmortalizados derivados de un conejo o que se produzca un hibridoma de conejo-ratón por fusión con células derivadas de la línea celular de ratón inmortalizada.

La fusión entre las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se puede realizar mediante un procedimiento conocido, y los ejemplos de un agente para promover la fusión que se puede usar incluyen polietilenglicol (PEG) y el virus Sendai. Con respecto a una solución de cultivo utilizada para la fusión celular, se puede usar la solución de cultivo RPMI1640 o la solución de cultivo MEM.

El hibridoma formado por fusión se cultiva durante de varios días a tres semanas más o menos. Adicionalmente, mediante el uso de un medio de selección como un medio que contiene hipoxantina, timidina y aminopterina (medio HAT), por ejemplo, los hibridomas fusionados pueden separarse de las células no fusionadas. El hibridoma obtenido se selecciona adicionalmente según un anticuerpo producido por él. De acuerdo con la preparación del hibridoma seleccionado como un solo clon de acuerdo con una dilución límite conocida, se establece como un hibridoma productor de anticuerpos.

La purificación de un anticuerpo se puede realizar mediante un procedimiento conocido como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad (columna de proteína A, columna de proteína G), un procedimiento de precipitación, precipitación con alcohol, isoelectroenfoque, electroforesis, centrifugación o filtración en gel.

Un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención también se puede producir mediante una técnica de recombinación genética que puede ser utilizada por un experto en la materia. Por ejemplo, basado en una secuencia del anticuerpo anti-presepsina obtenido, se prepara un polinucleótido que codifica el anticuerpo o una parte del anticuerpo y se expresa en un huésped adecuado después de la introducción en un vector de expresión.

La preparación del polinucleótido que codifica el anticuerpo o una parte del anticuerpo puede realizarse mediante, por ejemplo, extracción del ARNm de un hibridoma que produce el anticuerpo de la presente invención y sintetizar un ADNc. Se puede realizar utilizando un kit comercialmente disponible.

Como alternativa, un anticuerpo en el que se altera una parte de una secuencia del mismo también se puede hacer según una secuencia de un anticuerpo anti-presepsina usando la técnica de recombinación de genes que puede usar un experto en la técnica. Se puede preparar un vector que comprende una secuencia objetivo y se puede expresar en un huésped adecuado.

El vector utilizado para la presente invención no está particularmente limitado. Sin embargo, es, preferentemente, un vector y/o vector de expresión adecuado para la expresión del gen del anticuerpo. Ejemplos del mismo incluyen, aunque no de forma limitativa, un vector que contiene el promotor EF-1a y/o el potenciador de CMV.

Los ejemplos del vector que se pueden usar también incluyen el plásmido derivado de E. coli (por ejemplo, pBR322, pBR325, pUC12 y pUC13), el plásmido derivado de Bacillus subtilis (por ejemplo, pUB110, pTP5 y pC194), el plásmido derivado de levadura (por ejemplo, pSH19 y pSH15), bacteriófago, tal como el fago A y virus, tal como el retrovirus, el virus vaccinia y baculovirus.

El promotor usado en la presente invención puede ser cualquier promotor que sea adecuado para el huésped usado para la expresión génica. Por ejemplo, cuando el huésped es una célula animal, un promotor derivado de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de choque térmico, un promotor de citomegalovirus, Se puede usar el promotor EF1a.

Si se requirió, el vector puede contener un potenciador, una señal de corte y empalme, una señal para la adición de poli A, un marcador de selección y un origen para la replicación de SV40.

Los ejemplos del marcador de selección que se pueden usar incluyen la deshidrofolato reductasa (dhfr), gen resistente al metotrexato (MTX) y gen resistente a la ampicilina.

La célula huésped utilizada para la presente invención no está particularmente limitada. Por ejemplo, se usan células bacterianas (E. coli), levadura, células de anfibios (células de ovocitos de Xenopus laevis), un insecto o célula de insecto (sf9) y una célula animal. Los ejemplos de la célula animal que se pueden usar incluyen células COS-1, células COS-7, células CHO, células CHO con depleción del gen DHFR (célula c Ho dhfr-), célula 3T3 de ratón, célula HEK293 humana y célula de mieloma.

Un procedimiento para introducir un vector de expresión en una célula huésped puede realizarse mediante un procedimiento conocido, y sus ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, un procedimiento de lipofección, un procedimiento de fosfato de calcio, un procedimiento de electroporación y un procedimiento de microinyección.

Después de la introducción de un vector de expresión a una célula huésped, las células se cultivan en un medio de cultivo adecuado para cada célula huésped. Por ejemplo, en el caso de células animales, puede usarse un medio para cultivar células animales tales como medio RPMM640 y medio GIT o aquellos medios añadidos con diversos aditivos tales como FCS. Mediante el cultivo de células transformadas obtenidas en un medio, el anticuerpo puede expresarse y acumularse en un sobrenadante de cultivo. Para la purificación de un anticuerpo en sobrenadante de cultivo, se puede utilizar el procedimiento descrito anteriormente. Adicionalmente, la cantidad de expresión de un anticuerpo y la actividad del anticuerpo antígeno se puede medir mediante ELISA.

Un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo puede prepararse mediante un procedimiento de presentación en fagos. La obtención de un anticuerpo mediante el procedimiento de presentación en fagos puede llevarse a cabo mediante la técnica que puede usar un experto en la técnica (véase CARLOS F. BARBAS y col., Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). Por ejemplo, se obtiene un gen a partir de linfocitos esplénicos obtenidos inmunizando un animal con el péptido S68, y se liga con un vector fagemido y así sucesivamente, y posteriormente, el procedimiento convencional se realiza para obtener un anticuerpo.

Además, para producir un anticuerpo alterado en el que solo se cambia una secuencia particular de CDR (por ejemplo, VH CDR3), También es posible utilizar el procedimiento de presentación en fagos. Esto también puede llevarse a cabo utilizando la técnica que puede usar un experto en la técnica, empleando un plásmido que comprende una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo como molde, y cebadores particulares.

Los ejemplos del fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención incluyen Fab, Fab', F(ab')2, un anticuerpo monocatenario (scFv), región V dimerizada (diacuerpo), región V estabilizada con disulfuro (dsFv), sc(Fv)2, y un polipéptido que contiene CDR, un polipéptido que contiene una región variable de la cadena pesada, y un polipéptido que contiene una región variable de la cadena ligera. Cualquiera de esos fragmentos de anticuerpos tiene una propiedad de unión a antígeno que es la misma que el anticuerpo de la presente invención para reconocer un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Esos fragmentos de anticuerpos pueden prepararse usando técnicas de recombinación genética conocidas por un experto en la materia.

Fab indica, entre los fragmentos obtenidos al tratar IgG con la proteasa papaína, un fragmento de anticuerpo que tiene una propiedad de unión a antígeno en la que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa están unidas mediante un enlace disulfuro.

F (ab')2 indica, entre los fragmentos obtenidos al tratar IgG con la proteasa pepsina, los obtenidos al unir Fab con un enlace disulfuro de una región bisagra.

Fab' indica un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno, que se obtiene al digerir el enlace disulfuro de una región bisagra de F(ab')2. Se puede obtener Fab' mediante un tratamiento de F(ab')2 con un reactivo reductor, ditiotreitol.

scFv es un polipéptido en el que una VH y una VL están unidas entre sí a través de un enlazador peptídico adecuado y es un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno.

El diacuerpo indica un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno divalente obtenida por dimerización de scFv.

dsFv indica un polipéptido que tiene una sustitución de un resto de aminoácido de cada una de VH y VL con un resto de cisteína, que está unido a través de un enlace disulfuro.

sc(Fv)2 indica un fragmento de antígeno obtenido como una cadena sencilla basada en la unión de dos VH y dos VL a través de un enlazador. sc(Fv)2 puede producirse uniendo scFv a través de un enlazador.

En realizaciones preferidas, un polipéptido que comprende una CDR es el mismo que los descritos anteriormente, y es un fragmento que tiene una actividad de unión a antígeno. Un péptido que comprende múltiples CDR puede unirse directamente o mediante un enlazador adecuado.

El polipéptido que comprende una región variable de la cadena pesada y el polipéptido que comprende una región variable de la cadena ligera son como se ha descrito anteriormente.

En la presente invención, cualquier enlazador peptídico introducible por ingeniería genética puede usarse como enlazador. El enlazador preferido en la presente invención es un enlazador peptídico. La longitud del enlazador peptídico no está particularmente limitada, y puede seleccionarse adecuadamente dependiendo del fin. Sin embargo, generalmente es de 1 a 100 aminoácidos, preferentemente de 3 a 50 aminoácidos, y más preferentemente de 5 a 20 aminoácidos. Cuando cuatro regiones variables de anticuerpos están unidas, generalmente se necesitan tres enlazadores. Los enlazadores múltiples pueden ser los mismos o pueden usarse enlazadores diferentes.

Un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo quimérico es una molécula de anticuerpo producida mediante la combinación de una parte de moléculas de anticuerpos de dos o más especies diferentes. El anticuerpo quimérico preferido en la presente invención es un anticuerpo que tiene una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de conejo y una región constante de otra especie (por ejemplo, ser humano); sin embargo, en el presente documento se contemplan otras combinaciones quiméricas conocidas en la técnica. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo obtenido trasplantando CDR de especies no humanas a un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos humanizados pueden producirse mediante procedimientos generales que se conocen en la técnica.

La presente invención comprende un anticuerpo en el que se añaden uno o más restos de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de la presente invención. Un anticuerpo de la presente invención también puede comprender una proteína de fusión en la que el anticuerpo está fusionado con otro péptido o polipéptido. La producción de una proteína de fusión se puede realizar utilizando un procedimiento conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, después de unir un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la presente invención a un polinucleótido que codifica otro péptido o polipéptido de manera que tengan un marco superpuesto e introducirlo en un vector de expresión, se puede realizar la expresión en una célula huésped. Otros péptidos o polipéptidos utilizados para la unión con el anticuerpo de la presente invención no están particularmente limitados. Ejemplos de los mismos incluyen FLAG, 6 x His que consiste en seis restos de His (histidina), segmento de polihistidina, hemaglutinina de influenza (HA), marcador-T7, marcador de HSV, GST (glutatión-S-transferasa), región constante de inmunoglobulina (región Fc), p-galactosidasa y proteína de unión a maltosa.

2. procedimiento para medir presepsina

En una segunda realización de la presente invención, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la medición inmunológica de presepsina utilizando al menos un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención, e incluye una etapa de poner en contacto el anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención con una muestra que contiene presepsina. En la presente invención, el término "medida" se puede usar indistintamente con términos como "detectar", "cuantificar" o "ensayo" y se usa como un significado que incluye la determinación cuantitativa y cualitativa. La medición de presepsina se realiza preferentemente in vitro.

Dado que la presepsina se conoce como un marcador utilizado para la detección de sepsis, se puede decir que el procedimiento anterior es un procedimiento para detectar sepsis que incluye una etapa de contacto del anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención con una muestra que contiene presepsina.

En otro aspecto, también se puede decir que la presente invención es un procedimiento para detectar sepsis, o un procedimiento para ayudar a la detección de sepsis, que comprende al menos 1) una etapa para medir la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto que usa un anticuerpo de la presente invención, y 2) una etapa para determinar si la concentración de presepsina es un valor alto en comparación con un valor de corte o no. El valor de corte puede ser de 314 a 600 pg/ml, preferentemente de 400 a 580 pg/ml, más preferentemente de 450 a 550 pg/ml, y más preferentemente de 500 pg/ml.

Tal como se usa en el presente documento, "detección de enfermedad", puede usarse indistintamente con "asistencia para la detección de enfermedades" o "asistencia para el diagnóstico de enfermedades".

Además, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno puede usarse para la detección o evaluación de al menos una enfermedad, incluida la discriminación entre sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), evaluación de riesgo de gravedad de la sepsis, predicción pronóstica de sepsis (predicción de mortalidad), valuación del grado de gravedad séptica, detección de infecciones del sitio quirúrgico, detección de coagulación intravascular diseminada (CID), detección de CID infecciosa, detección de cardiopatías, detección de infecciones respiratorias asociadas con infección bacteriana, detección de enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), detección de neutropenia febril (FN), detección del síndrome hemofagocítico (SHF) y evaluación de la función del fagocito.

La expresión "infecciones del sitio quirúrgico", como se usa en el presente documento, significa enfermedades infecciosas que son causadas después de la cirugía e incluye todas las infecciones debidas a cirugía y terapia complementaria necesaria para ello. Las infecciones del sitio quirúrgico incluyen todas las enfermedades diagnosticadas como infecciones del sitio quirúrgico según las Directrices para la prevención de la infección del sitio quirúrgico, 1999 (CDC).

La enfermedad cardíaca incluye el síndrome coronario agudo (SCA), insuficiencia cardíaca aguda, insuficiencia cardíaca aguda descompensada (ADHF), insuficiencia cardíaca crónica, arteriopatía coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico, accidente cerebrovascular hemorrágico y ataque de isquemia cerebral transitoria.

Una infección respiratoria asociada con una infección bacteriana puede incluir infecciones del tracto respiratorio inferior o neumonía. Las infecciones del tracto respiratorio inferior incluyen infecciones agudas del tracto respiratorio inferior e infecciones crónicas del tracto respiratorio inferior. Las infecciones agudas del tracto respiratorio inferior incluyen traqueítis aguda, bronquitis aguda y bronquiolitis aguda. La mayoría de ellos se desarrollan por infecciones virales del tracto respiratorio superior que se propagan al tracto respiratorio inferior y, en algunas de estas enfermedades, se produce una infección secundaria por bacterias. La administración de antibióticos puede adaptarse si se observan signos de infección bacteriana secundaria. La infección crónica del tracto respiratorio inferior es una afección patológica en la que se ha encontrado una infección bacteriana persistente en el tracto respiratorio inferior que tiene trastornos orgánicos causados por bronquiectasias o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, e incluye infección persistente y exacerbación aguda. Las enfermedades que causan trastornos orgánicos en el tracto respiratorio inferior incluyen bronquiectasias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, panbronquiolitis difusa, tuberculosis pulmonar obsoleta, neumoconiosis, infección por micobacterias no tuberculosas, aspergilosis broncopulmonar alérgica, fibrosis pulmonar y asma bronquial crónica. En ambos casos de infección persistente y exacerbación aguda, se aplica la administración de antibióticos. La neumonía incluye neumonía adquirida en la comunidad y neumonía adquirida en el hospital. Preferentemente, la neumonía es una neumonía adquirida en la comunidad.

La evaluación de la función de las células fagocíticas significa (a) la medición de la actividad fagocítica de los neutrófilos, granulocitos y/o glóbulos blancos, (b) evaluación de la función inmune midiendo la actividad fagocítica de los neutrófilos, granulocitos y/o glóbulos blancos, (c) evaluación de la calidad de las células implantables tras el trasplante de células autólogas o trasplante de células alogénicas, y (d) detección de fagocitosis relacionadas con enfermedades por las células fagocíticas. Las enfermedades relacionadas con la fagocitosis por las células fagocíticas incluyen enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, mastitis, gota, glomerulonefritis, colitis ulcerosa, fiebre mediterránea, otitis media, rinitis, neumonía, tuberculosis, cistitis, enfermedad por infección por líquido amniótico y piosemia. La muestra utilizada para detectar las enfermedades relacionadas con la fagocitosis por las células fagocíticas es el fluido tisular, linfa, líquido sinovial, leche, líquido cefalorraquídeo, pus, saliva, lágrimas, moco, secreción nasal, esputo, orina, ascitis, líquido amniótico, fluidos corporales, tal como semen, t también el líquido de lavado obtenido después de lavar la cavidad nasal, los bronquios, los pulmones, la piel, la cavidad peritoneal, varios órganos, articulaciones y huesos.

Los ejemplos del procedimiento para la medición inmunológica de presepsina mediante el uso de un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención incluyen inmunoensayo enzimático (a continuación, también descrito como ELISA o EIA), inmunoensayo enzimático de quimioluminiscencia (CLEIA), inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA), prueba de anticuerpos de fluorescencia (FAT), inmunoensayo enzimático de fluorescencia (FEIA), inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunocromatografía, un procedimiento de aglutinación y un procedimiento de competición. En la presente invención, se puede usar cualquiera de los procedimientos directos e indirectos. También se puede utilizar un procedimiento de sensibilización que implique la formación y detección de un complejo biotina-avidina (estreptavidina).

El EIA es un ejemplo de un inmunoensayo que usa un anticuerpo marcado con enzima y los ejemplos del mismo incluyen un procedimiento directo y un procedimiento indirecto. Los ejemplos preferidos de los mismos incluyen ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas).

El ELISA de tipo sándwich es un procedimiento en el que la medición se realiza mediante el uso de dos o más anticuerpos con un sitio de reconocimiento de antígeno diferente. Un anticuerpo se inmoviliza por adelantado en una fase sólida y formando un complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo con un antígeno, la detección de dicho antígeno, que se coloca entre dos tipos de anticuerpos, es posible.

El inmunoensayo enzimático de quimioluminiscencia (CLEIA) es un procedimiento en el que un anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas o perlas se hace reaccionar con un antígeno en una muestra seguido de una reacción con un anticuerpo marcado con enzima y lavado (separación B/F), se realiza una reacción enzimática mediante la adición de un sustrato quimioluminiscente, y se mide la intensidad de la luminiscencia.

Por ejemplo, es posible que un anticuerpo conjugado con biotina reaccione con un antígeno en una muestra en fase líquida, el anticuerpo queda atrapado por partículas magnéticas unidas a estreptavidina, el anticuerpo marcado con enzima se hace reaccionar después del lavado (separación B/F), y se realiza el mismo tratamiento que el anterior.

Cuando se utiliza una fosfatasa alcalina (ALP) como enzima marcadora, es preferente usar CDP-Star™, AMPPD® o CSPD® como sustrato quimioluminiscente. Cuando la enzima marcadora es HRP, el luminol se usa preferentemente como sustrato quimioluminiscente.

Generalmente se cree que la sensibilidad de detección es alta en el orden de quimioluminiscencia> fluorescencia> absorción (generación de color), y el procedimiento de medición puede seleccionarse dependiendo de la sensibilidad deseada.

El inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA) es un procedimiento en el que un anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas o similares reacciona con un antígeno en una muestra, el anticuerpo marcado con un sustrato quimioluminiscente se hace reaccionar con él seguido de lavado (separación B/F) y se mide la intensidad de la luminiscencia. Como sustancia de marcaje, se usa acridinio o similar.

El inmunoensayo enzimático fluorescente (FEIA) es un procedimiento en el que un anticuerpo inmovilizado reacciona con un antígeno en una muestra seguido de reacción con un anticuerpo marcado con enzima y lavado (separación B/F), se realiza una reacción enzimática añadiendo un sustrato fluorescente y se mide la intensidad de la fluorescencia. Como enzima de marcaje, se usa HRP o ALP o similar. Cuando la enzima marcadora es HRP, Amplex®Red se utiliza como sustrato fluorescente. Cuando la enzima marcadora es ALP, se usan, preferentemente, 4-MUP (fosfato de 4-metilumbelifenilo), AttoPhos®.

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un procedimiento en el que un anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas, un antígeno en una muestra y un anticuerpo marcado con una sustancia electroquimioluminiscente se hacen reaccionar entre sí seguido de lavado (separación B/F), y se mide la intensidad de la luminiscencia que se origina de la energía eléctrica. Como sustancia de marcaje, se usa rutenio. Como sustancia de marcaje, se usa Ru(bpy)3. Según la oxidación basada en la carga en un electrodo y la reducción de la reacción por tripropilamina (TPA), se repite la luminiscencia de excitación.

El radioinmunoensayo (RIA) es un procedimiento de medición en el que se usa un cuerpo de marcaje de un isótopo radiactivo. Por ejemplo, haciendo reaccionar un antígeno en una muestra y un anticuerpo inmovilizado en perlas y haciéndolo reaccionar con un anticuerpo marcado con un radioisótopo (1251) seguido de lavado (separación B/F), se puede medir la radiactividad de 1251.

La inmunocromatografía es un procedimiento de medición inmunológica en el que se aplica un fenómeno capilar resultante de la migración de un material de prueba junto con la disolución de un reactivo en una tira de prueba. Específicamente, Se forma un inmunocomplejo entre tres sustancias, es decir, el antígeno en una muestra, se determina un anticuerpo marcado en una tira de prueba y un anticuerpo de captura, y el color del producto marcado. Para el marcaje de un anticuerpo, se usa oro coloidal, una enzima o una sustancia fluorescente. Cuando se usa un anticuerpo marcado con enzima, la generación de color se produce al aplicar un sustrato enzimático en una tira reactiva.

El procedimiento de flujo continuo es un procedimiento en el que se forma un antígeno como sustancia de prueba, con una solución en una muestra, un complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo en una membrana como una membrana insoluble. En ese momento, una sustancia no inmovilizada en la membrana generalmente atraviesa en dirección perpendicular desde la superficie hasta la superficie posterior de la membrana, y se elimina.

El procedimiento de aglutinación es un procedimiento en el que un antígeno en una muestra reacciona con un anticuerpo en un reactivo y se observa aglutinación. Ejemplos de los mismos incluyen un procedimiento en el que no se usa fase sólida, un procedimiento de aglutinación de partículas (PA) en el que las partículas preparadas artificialmente se usan como una fase sólida, y un procedimiento de aglutinación de látex (LA) en el que las partículas de látex se usan entre PA.

Según el procedimiento de competición, por ejemplo, un anticuerpo se une a una fase sólida y una muestra para la prueba y una cierta cantidad de un antígeno marcado se hacen reaccionar simultáneamente y, por lo tanto, se puede medir una cantidad de antígeno en la muestra a partir de la cantidad de producto marcado unido.

En un aspecto, un anticuerpo de la presente invención puede usarse en cualquiera de los procedimientos de detección descritos anteriormente para su uso en un procedimiento para detectar presepsina en una muestra o diagnosticar a un individuo sospechoso de tener sepsis.

La muestra utilizada para la medición de presepsina no está particularmente limitada. Sin embargo, es, preferentemente, una muestra acuosa. Ejemplos de los mismos incluyen fluidos corporales, tales como sangre (sangre completa, plasma, suero), orina, fluidos de tejidos, líquido linfático, fluido articular, leche, líquido cefalorraquídeo, pus, saliva, fluido lagrimal, fluido mucoso, secreción nasal, esputo, líquido abdominal, fluido usado, o semen, líquido de lavado después de lavar la cavidad nasal, tubos bronquiales, los pulmones, la piel, cavidad abdominal, varios órganos, sobrenadante de cultivo de células articulares o óseas, y eluyente de columna. Esas muestras se pueden usar para la medición directamente o después de la dilución o extracción con varios tampones seguidos de concentración.

Asimismo, en caso de usar sangre completa como muestra, la muestra de sangre completa puede analizarse dentro de las 72 horas, dentro de las 48 horas, dentro de las 24 horas, dentro de las 12 horas, dentro de las 6 horas o dentro de las 4 horas posteriores a la recolección de la muestra de sangre completa. La recolección de muestras de sangre completa se puede realizar utilizando un tubo de recolección de sangre EDTA o tubos de recolección de sangre con heparina. Preferentemente, la muestra de sangre completa se analiza dentro de las 6 h posteriores a su recolección en los tubos de recolección de sangre con EDTA, o dentro de las 4 h posteriores a su recolección en el tubo de recolección de sangre con heparina.

3. Kit para la medición de sCD14-ST

En una tercera realización de la presente invención, Esta divulgación proporciona un kit para medir la presepsina que tiene un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la primera realización como un elemento constitucional esencial.

El kit de medición de la presente invención incluye preferentemente un reactivo auxiliar para la medición de presepsina. Los ejemplos del reactivo auxiliar incluyen un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario, un anticuerpo marcado, una enzima marcadora, una sustancia de marcaje, tal como oro coloidal, un sustrato cromogénico, un sustrato fluorescente (Amplex® Red, AttoPhos®, 4-MUP), un sustrato quimioluminiscente (Luminol, CDP-Star™, AMPPD®, CSPD®), una sustancia ligante específica como biotina-estreptavidina, un vehículo insoluble, un agente bloqueante, una solución diluyente, un líquido de lavado y un material de referencia.

El reactivo auxiliar puede usarse en una combinación adecuada dependiendo del procedimiento para medir la presepsina de la segunda realización. El anticuerpo primario es, preferentemente, un anticuerpo que se une a presepsina. Más preferentemente, es un anticuerpo que reconoce un epítopo que es diferente del anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de los mismos incluyen el anticuerpo F1106-13-3 y el anticuerpo F1031-8-3 que se describen en el Ejemplo 3 del documento WO 2004/044005.

Cualquiera de los anticuerpos de la presente invención y el anticuerpo primario pueden usarse como un anticuerpo marcado. Cuando ninguno de los anticuerpos de la presente invención y el anticuerpo primario está marcado, también se puede usar un anticuerpo secundario marcado.

Los ejemplos de los vehículos insolubles incluyen partículas magnéticas, perlas, vidrio, celulosa, nitrocelulosa, un polímero sintético poroso, fibra de vidrio, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, placa de plástico, partículas de látex, tela no tejida y papel de filtro.

Para el marcaje de un anticuerpo, preferentemente se usan una enzima, tal como peroxidasa (HRP), fosfatasa alcalina (ALP) y p-galactosidasa, oro coloidal.

Cuando se usa HRP, por ejemplo, se puede mencionar 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) u o-fenilendiamina (OPD) como sustrato cromogénico. Cuando se usa ALP, se puede mencionar fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) como un sustrato cromogénico. Cuando se usa p-galactosidasa, se ilustra o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPD) como un sustrato cromogénico.

Un kit de medición para el ELISA de tipo sándwich, que pueden incluir, por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención y un anticuerpo primario (cualquier anticuerpo puede estar marcado con una enzima), un sustrato cromogénico, una solución diluyente o un material de referencia. Cuando ninguno de los anticuerpos de la presente invención y el anticuerpo primario está marcado, También se puede incluir un anticuerpo secundario marcado.

Un kit de medición para el inmunoensayo enzimático de quimioluminiscencia (CLEIA) puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas, un anticuerpo marcado con enzima, un sustrato quimioluminiscente, una solución diluyente o un líquido de lavado.

Un kit de medición para inmunoensayo enzimático de fluorescencia (FEIA) puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas, un anticuerpo marcado con enzima, un sustrato fluorescente, una solución diluyente, un líquido de lavado.

Un kit de medición para el inmunoensayo enzimático de electroquimioluminiscencia (ECLIA) puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo biotinilato, un anticuerpo marcado con Ru(bpy)3, partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina, tripropilamina.

Un kit de medición basado en inmunocromatografía es una tira reactiva en la que una parte de adición de muestra, una parte reactiva, una parte de detección y una parte de absorción están dispuestas de manera que una muestra líquida añadida a la parte de adición para la prueba sufre una migración en el orden anterior. Por ejemplo, es posible proporcionar una unión de portador insoluble con el anticuerpo primario en la parte de detección impregnando el anticuerpo secundario marcado en la parte de reactivo.

En cuanto a la tira reactiva, se ilustra el uso de un soporte poroso. Los ejemplos del vehículo poroso incluyen nitrocelulosa, celulosa, derivados de celulosa, nailon, fibras de nailon, fibra de vidrio y un polímero sintético poroso. Los ejemplos de la parte de absorción incluyen un polímero absorbente tal como una esponja compuesta de un material absorbente de agua, papel de filtro de celulosa y papel de filtro.

Como se ha informado que la concentración sanguínea de presepsina aumenta de manera característica en un paciente con sepsis, un kit para medir la presepsina de la tercera realización de la presente invención puede usarse como un kit para detectar sepsis, o un kit para ayudar a la detección o diagnóstico de sepsis.

También se puede usar un kit para medir la presepsina de la tercera realización de la presente invención como un agente de diagnóstico para sepsis o un agente complementario para el diagnóstico de sepsis. Cuando se utiliza con el fin de detectar sepsis o ayudar al diagnóstico, se determina que un sujeto tiene una posibilidad de sepsis cuando la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto medida usando el anticuerpo de la presente invención es un valor más alto que un valor de corte, y esto puede ayudar a la detección o diagnóstico. En un aspecto, el valor de corte puede ser de 314 a 600 pg/ml, preferentemente de 400 a 580 pg/ml, más preferentemente de 450 a 550 pg/ml, y más preferentemente de 500 pg/ml.

Además, se puede utilizar un kit para medir la presepsina para la detección o evaluación de al menos una enfermedad seleccionada, tales como, discriminación entre sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), evaluación de riesgo de gravedad de la sepsis, predicción pronóstica de sepsis (predicción de mortalidad), valuación del grado de gravedad séptica, detección de infecciones del sitio quirúrgico, detección de coagulación intravascular diseminada (CID), detección de CID infecciosa, detección de cardiopatías, detección de infecciones respiratorias asociadas con infección bacteriana, detección de enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), detección de neutropenia febril (FN), detección del síndrome hemofagocítico (SPH) y evaluación de la función del fagocito. El kit para medir la presepsina puede ser un kit para la detección o evaluación de al menos una enfermedad descrita anteriormente.

4. Polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno del mismo descrito en la primera realización

En una cuarta realización de la presente invención, la divulgación proporciona un polinucleótido o un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la primera realización de la presente invención. El polinucleótido incluye ADN (ADN genómico, ADNc, ADN sintético) y ARN (ARNm). El polinucleótido puede ser cualquiera de una cadena sencilla (codificante o antisentido) y una cadena doble. Por ejemplo, es posible que el ARNm se extraiga de un hibridoma que produce el anticuerpo de la presente invención usando un kit comercialmente disponible y se sintetiza ADNc. Un gen diana puede amplificarse por el procedimiento de PCR.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención puede tener una identidad de al menos 80 % o más con la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o la cadena ligera de la región variable. Con respecto a la secuencia CDR, puede tener una identidad de al menos 80 % o más con la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR completa de un anticuerpo (VH CDR1 con 3 y VL CDR1 con 3). Desde el punto de vista de la sensibilidad de detección, puede exhibir la identidad del 85 % o más, la identidad del 90 % o más, la identidad del 95 % o más, la identidad del 96 % o más, la identidad del 97 % o más, la identidad del 98 % o más o la identidad del 99 % o más.

Adicionalmente, de acuerdo con cierta realización, un anticuerpo codificado por una secuencia de nucleótidos que hibrida, en condiciones estrictas, con una secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada o la cadena ligera también se incluye en el anticuerpo de la presente invención.

La hibridación puede realizarse mediante un procedimiento conocido o un procedimiento basado en él, por ejemplo, un procedimiento descrito en Molecular Cloning 3a (J. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).

Las condiciones estrictas indican condiciones en las que se forma un híbrido específico mientras que no se forma un híbrido no específico. Las condiciones estrictas típicas incluyen, por ejemplo, realizar hibridación a una concentración de potasio de 25 mM a 50 mM y una concentración de magnesio de 1,0 mM a 5,0 mM. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente las condiciones modificando la reacción de hibridación o la concentración de sal de una solución de reacción para la hibridación.

5. Vector recombinante que contiene el polinucleótido descrito en la cuarta realización

En una quinta realización, la presente invención proporciona un vector introducido con un polinucleótido que codifica el aminoácido de un anticuerpo o el fragmento de antígeno de unión a anticuerpo de la presente invención. El vector es, preferentemente, un vector y/o un vector de expresión adecuado para la expresión del gen del anticuerpo que se describe en la primera realización. Puede producirse mediante una técnica que pueda emplear un experto en la técnica.

6. Células que producen el anticuerpo o el fragmento de antígeno de unión del anticuerpo descrito en la primera realización

En una sexta realización de la presente invención, la divulgación proporciona células que producen el anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la presente invención. Los ejemplos de las células incluyen un hibridoma, un transformante y células recombinantes genéticas introducidas con el gen del anticuerpo de la presente invención.

Los ejemplos específicos del hibridoma para producir un anticuerpo incluyen un clon descrito en el Ejemplo 1.

Se puede obtener un transformante mediante la introducción de un vector introducido con el polinucleótido que codifica el aminoácido del anticuerpo anterior o su fragmento de antígeno de unión al anticuerpo de la presente invención a la célula huésped descrita en la primera realización (por ejemplo, células COS-1 y células CHO).

El procedimiento para producir un hibridoma o un transformante puede ser el mismo que los descritos para la primera realización.

7. Procedimiento para producir el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno usando un transformante

En una séptima realización de la presente invención, la divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, que incluye una etapa de cultivo de un transformante que contiene un vector introducido con un nucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de la primera realización.

Un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno de la primera realización se produce en un cultivo del transformante y un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo de unión al antígeno de la primera realización se recoge del cultivo. Los procedimientos utilizados pueden ser los mismos que los descritos en la primera realización.

8. Procedimiento para la detección selectiva del anticuerpo anti-presepsina

En una octava realización de la presente invención, la divulgación proporciona un procedimiento para la detección selectiva un anticuerpo para obtener un anticuerpo anti-presepsina útil para medir la presepsina en una muestra, en el que el procedimiento incluye al menos las siguientes etapas;

- etapa de construir un sistema de medición de presepsina utilizando un anticuerpo de un candidato,

- etapa de determinar una influencia de la concentración de TG en una muestra en un valor de medición de presepsina utilizando el sistema de medición

En otras palabras, el procedimiento se caracteriza porque una prueba de interferencia de TG se realiza con un sistema de medición que utiliza un anticuerpo. El procedimiento para obtener un anticuerpo candidato (preferentemente, anticuerpo anti-presepsina) puede ser el mismo que el descrito en la primera realización o la séptima realización. En algunas realizaciones, el sistema para medir presepsina es un sistema de medición que permite la medición del valor de presepsina en una muestra, y no está particularmente limitado. Ejemplos de los mismos incluyen el sistema de medición descrito en la segunda realización y, por ejemplo, se puede utilizar un ELISA de tipo sándwich.

Con respecto a la etapa de determinar la influencia de la concentración de TG en una muestra sobre un valor de medición de presepsina, la influencia puede determinarse en vista de la separación entre los dos valores de medición, es decir, según la comparación entre el valor de medición de presepsina en una muestra sin TG y el valor de medición de presepsina en la misma muestra con una cierta cantidad de TG añadida. Por ejemplo, cuando la prueba de interferencia de TG se realiza utilizando múltiples muestras y la relación de una muestra que exhibe el grado de separación del valor de medición de presepsina en el momento de tener una concentración de TG de 20 mg/ml en una muestra en comparación con el valor de medición de la presepsina en el momento de no añadir ningún TG es ± 20 % o menos y, más preferentemente, ± 10 % o menos es alta, se puede determinar que la influencia de TG en una muestra sobre el valor de medición de presepsina es pequeña y también se puede determinar, como improbable de que influya la interferencia de TG, el anticuerpo es útil para la medición de presepsina.

Como alternativa, como otro procedimiento de evaluación, la evaluación se puede realizar comparando el grado de separación después de realizar la prueba de interferencia de TG usando un anticuerpo candidato y un anticuerpo S68. Como una realización preferente, cuando la separación del valor de la medición de presepsina en el momento de realizar una prueba de interferencia de TG usando un anticuerpo candidato es similar al grado de separación del anticuerpo s 68 en las mismas condiciones, el anticuerpo se puede descubrir que es un anticuerpo útil para medir la presepsina en una muestra. Como ejemplo, para un sistema de medición en el que la prueba de interferencia de TG se realiza utilizando múltiples muestras y se usa un anticuerpo candidato, se determina una diferencia entre el grado de separación al tener una concentración de TG de 20 mg/ml en una muestra después de añadir TG y el grado de separación del sistema de medición que usa el anticuerpo S68 en las mismas condiciones y si se determina que la proporción de una muestra que exhibe la diferencia en el grado de separación de 20 % o menos y, preferentemente, de 10 % o menos es alta, se puede determinar que el anticuerpo es un anticuerpo útil para medir la presepsina en una muestra.

El procedimiento de detección selectiva de la presente invención puede incluir, opcionalmente, una etapa de determinación de la actividad de unión entre un anticuerpo candidato y el péptido S68 o presepsina. Adicionalmente, el procedimiento de detección de la presente invención puede incluir, opcionalmente, una etapa de medición de una muestra de una persona normal (es decir, una persona que no presenta sepsis) y un paciente con sepsis utilizando el sistema de medición de presepsina utilizando un anticuerpo candidato y comparando una diferencia en los valores de medición. En una realización, la detección selectiva se puede realizar de acuerdo con las descripciones del Ejemplo 1.

Una realización preferente del procedimiento de detección selectiva es un procedimiento que comprende al menos las siguientes etapas:

1) una etapa para obtener un anticuerpo candidato anti-presepsina usando el procedimiento de producción descrito en la primera realización de la presente invención y

2) una etapa de construir un sistema de medición de presepsina usando el anticuerpo candidato y seleccionar el anticuerpo que tiene una proporción de detección del 50 % o más, que muestra un grado de separación del valor de medición de presepsina de ± 20 % o menos, cuando la concentración de TG se ajusta a 20 mg/ml mediante la adición de TG

En este procedimiento, la concentración de TG (en el presente documento, 20 mg/ml) en una muestra, un grado de separación del valor de medición de presepsina (en lo sucesivo, ± 20 %) y una proporción de muestra se pueden cambiar apropiadamente. Como alternativa, la etapa (2) también se puede realizar reemplazándolo con otras pruebas de interferencia de TG y/o procedimientos de evaluación, descritos en la primera realización de la presente invención.

Otra realización preferente en la octava realización de la presente invención es un procedimiento de detección selectiva del anticuerpo de la presente invención que comprende al menos las siguientes etapas:

1) una etapa de obtención de un anticuerpo anti-presepsina candidato, y

2) una etapa de determinación de si el anticuerpo reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 como un epítopo o no

En este procedimiento, la etapa (2) puede ser un procedimiento para determinar un epítopo descrito en la primera realización de la presente invención, puede usarse, sin ninguna limitación.

Por ejemplo, la etapa (2) puede comprender además la etapa siguiente:

2) una etapa de selección del anticuerpo, en la que la unión entre el anticuerpo y la presepsina se inhibe de manera competitiva en un 50 % o más en un sistema de reacción en el que una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 se somete a una reacción competitiva (absorbancia) de modo que se inhibe la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina.

La siguiente etapa (3) se puede añadir opcionalmente al procedimiento para determinar un epítopo:

3) una etapa de selección del anticuerpo en el que la inhibición de la finalización de la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina debido a, al menos, una de las secuencias de restos de aminoácidos que consiste en las SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41 es inferior al 20 %, en un sistema de reacción que una secuencia de restos de aminoácidos se somete a una reacción competitiva (absorbancia) de modo que se inhibe la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina.

Además, otra realización preferente en la octava realización de la presente invención es un procedimiento de detección selectiva del anticuerpo de la presente invención que comprende al menos las siguientes etapas:

2) una etapa de selección de dicho anticuerpo en la que un coeficiente de correlación con el valor de medición de presepsina en una muestra que usa el anticuerpo S68 muestra 0,9 o más

Este procedimiento puede llevarse a cabo de acuerdo con las descripciones de la primera realización de la presente invención y el Ejemplo 5. Un coeficiente de correlación también se puede cambiar adecuadamente.

Además, otra realización preferente es un procedimiento de detección selectiva del anticuerpo de la presente invención que comprende al menos las siguientes etapas:

1) una etapa de obtención de un anticuerpo anti-presepsina candidato, y

2) una etapa de selección de una unión del anticuerpo a la presepsina con una afinidad (constante de disociación en el equilibrio, valor KD) de menos de 10'8 M

Como alternativa, la etapa (2) puede reemplazarse con la etapa siguiente:

2) una etapa de selección de un anticuerpo en la que la actividad de unión del anticuerpo a la presepsina es excelente en comparación con la actividad de unión del anticuerpo S68 a la presepsina

Es posible llevar a cabo la medición de afinidad (constante de disociación en el equilibrio, valor KD) y actividad de unión de acuerdo con la descripción de la primera realización de la presente invención. La actividad de unión puede evaluarse mediante una proporción de absorbancia. Preferentemente, una proporción de absorbancia cuando el anticuerpo de la presente invención y la presepsina reaccionan es de 2 o más, cuando se observa que la absorbancia del anticuerpo s 68 y la presepsina es 1.

El procedimiento de detección selectiva del anticuerpo de la presente invención como se ha descrito anteriormente se puede llevar a cabo combinando las etapas respectivas. Una combinación preferente es, por ejemplo, de la siguiente manera:

Un procedimiento de detección de un anticuerpo anti-presepsina que comprende al menos las etapas siguientes:

1) una etapa de obtención de un anticuerpo anti-presepsina candidato,

2) una etapa de selección del anticuerpo en la que la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina se inhibe de manera competitiva en un 50 % o más en un sistema de reacción (preferentemente, absorbancia) que una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 se somete a una reacción competitiva para que se inhiba la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina, y

3) una etapa de selección de un anticuerpo en el que la actividad de unión del anticuerpo con presepsina es excelente en comparación con la actividad de unión del anticuerpo S68 a presepsina.

9. Procedimiento de tratamiento del paciente con sepsis

También se desvela un procedimiento para tratar a un paciente con sepsis que comprende realizar un tratamiento de sepsis en un sujeto que ha sido sometido a un procedimiento para ayudar a la detección de sepsis usando un anticuerpo de la primera realización de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.

El procedimiento para ayudar a la detección de sepsis puede ser el mismo que se describe en la segunda realización de la presente invención. El tratamiento de la sepsis incluye la administración de un agente antibacteriano o un esteroide, un vasopresor, una solución de reposición, administración de oxígeno, manejo de la respiración artificial, diálisis de filtración sanguínea sostenida e intercambio de plasma.

10. Procedimiento de detección selectiva del fármaco (o terapéutica) de ensayo

También se desvela un procedimiento de detección selectiva de un fármaco (o terapéutica) de ensayo, que comprende una etapa para determinar la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto al que se le ha administrado un fármaco (o terapéutica) de ensayo, usando un anticuerpo de la primera realización de la presente invención o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, o un kit de la tercera realización. Una enfermedad a la que está dirigida un fármaco de ensayo no está particularmente limitada siempre que sea una enfermedad en la que la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto está incrementada. Preferentemente, la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto se compara antes y después de la administración del fármaco de ensayo para determinar si la concentración de presepsina después de la administración del fármaco de ensayo se reduce en comparación con antes de la administración o no. Como alternativa, puede determinarse si la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto después de la administración del fármaco de ensayo se reduce en comparación con una persona normal que no ha recibido el fármaco de ensayo.

También se desvela un procedimiento de detección selectiva de un fármaco de ensayo que comprende la etapa siguiente:

1) una etapa para determinar la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto al que se le ha administrado un fármaco de ensayo.

11. rsCD14ST-Fc

También se desvela rsCD14ST-Fc que tiene una estructura que comprende una secuencia de la posición 1 a la posición 64 de la SEQ ID NO: 3 (CD14 soluble de longitud completa humana) y una región Fc de una cadena pesada de anticuerpo.

rsCD14ST-Fc se puede obtener, por ejemplo, mediante transfección de un plásmido para expresión transitoria que expresa rsCD14ST-Fc, que tiene una secuencia que tiene una secuencia de reconocimiento de trombina corriente abajo de una secuencia de la posición 1 a la posición 64 de sCD14 humano, y una secuencia de una región Fc de una cadena pesada de anticuerpo IgG1 derivada de ser humano, en una célula huésped, tal como una célula COS-1, cultivando la célula huésped y recuperando y purificando el sobrenadante de cultivo resultante.

Es deseable insertar una secuencia que facilite el corte entre una secuencia de la Posición 1 a la Posición 64 de sCD14 y Fc humanos, y, además de una secuencia de reconocimiento de trombina, por ejemplo, se puede usar una secuencia de reconocimiento de Factor Xa y una secuencia de reconocimiento de PreScission Protease sin limitaciones concretas. No es esencial que rsCDl4ST-Fc tenga una secuencia que facilite el corte.

La región Fc de una cadena pesada de anticuerpo en rsCD14ST-Fc no está limitada. Además de una región Fc derivada de un anticuerpo IgGI derivado de ser humano, se pueden usar regiones Fc de todos los demás anticuerpos conocidos. La célula huésped tampoco está particularmente limitada.

Dado que rsCD14ST-Fc se obtiene cultivando una célula huésped, tal como una célula COS-1, la expresión es fácil y dado que Fc se une específicamente a la proteína A y se puede usar una columna de proteína A para la purificación, tiene la ventaja en la producción de que la purificación también es fácil. La purificación después del corte de una región Fc es posible usando el procedimiento convencional además de la columna de Proteína A, y se puede realizar la purificación, por ejemplo, utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 13 del documento WO 2005/108429.

rsCD14ST-Fc también se puede usar como rsCD14-ST cortando una región Fc o se puede usar como rsCD14ST-Fc sin cortar la región Fc, y ambos se unen específicamente a un anticuerpo anti-presepsina.

El rsCD14ST-Fc hecho en el Ejemplo 9-(2) tiene la misma secuencia de trombina que la de un patrón rsCD14-ST, que se inserta entre rsCD14ST y Fc. El rsCD14ST obtenido cortando una región Fc con trombina tiene la misma secuencia que la de un patrón de rsCD14ST y tiene las propiedades equivalentes (véase el documento WO 2005/108429).

En la preparación de rsCD14 a partir de rsCD14ST-Fc, después del corte de Fc, solo Fc puede eliminarse fácilmente pasándolo a través de una columna de proteína A, y la preparación también es fácil. Se puede seleccionar adecuadamente un medio para cortar una región Fc de rsCD14ST-Fc de conformidad con una secuencia insertada que facilite el corte.

Dado que rsCD14ST-Fc tiene la actividad de rsCD14-ST sin cortar la región Fc, se puede utilizar como antígeno.

El patrón de rsCD14-ST anterior se obtiene expresando rsCD14 en el que se inserta un sitio de reconocimiento de trombina entre la posición 64 y la posición 65 del sCD14 humano, en una célula huésped, y cortando el rsCD14 en un sitio de reconocimiento de trombina. Una estructura de rsCD14 comprende rsCD14-ST, pero muestra poca reactividad como rsCD14-ST. Solo después del corte y la purificación, rsCD14-ST obtiene una actividad que se puede usar. Por otro lado, dado que rsCD14ST-Fc se puede usar como rsCD14-ST o un patrón, independientemente de si se corta la región Fc. Por tanto, se puede omitir el trabajo de corte y se puede utilizar de forma sencilla.

Ejemplos

Los ejemplos mencionados a continuación que no entran dentro del ámbito de las reivindicaciones son para fines ilustrativos.

Ejemplo 1: Producción de anticuerpo monoclonal contra péptido sintético como antígeno

1-(1) Inmunización de conejo

La producción de un antígeno de administración y la inmunización de un conejo se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 del documento WO 2004/044005 A1. Específicamente, el péptido se produjo mediante el péptido en el que se insertó cisteína en el extremo N-terminal de un péptido (en lo sucesivo, descrito como péptido S68) que consiste en la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2 (correspondiente a la secuencia de la posición 53 a la posición 68 descrito en la SEQ ID NO: 3). Este péptido se unió a KLH (PIERCE) y se usó como antígeno de administración (en lo sucesivo, descrito como péptido S68-KLH).

Se mezclaron 100 |jg de péptido S68-KLH con el mismo volumen de adyuvante completo de Freund (DIFCO) y se administraron por vía intradérmica al dorso de un conejo blanco New Zealand (tres meses de edad). Dos semanas después y también una semana después, se mezclaron 100 jg de péptido S68-KLH con el mismo volumen de adyuvante incompleto de Freund (DIFCO) y se administraron por vía intradérmica en el dorso. Adicionalmente, se administraron 20 jg de péptido S68-KLH dos veces en la vena del oído.

Una semana después de la finalización de la administración, se tomaron muestras de sangre de la vena del oído y el antisuero se separó de acuerdo con un procedimiento estándar y el título de anticuerpos y la reactividad para presepsina se determinaron usando un ELISA de tipo sándwich. Específicamente, F1106-13-3 se inmovilizó en una inmunoplaca (MAXISORP, C96, 430341, fabricada por Nunc) y se bloqueó. Cada antisuero de conejo se diluyó con D-PBS (pH 7,4) y se sometió a una dilución en serie al cuadrado de x1/1.000 a x1/32.000 veces (8 puntos). El patrón de referencia de presepsina (rsCD14-ST descrito en el Ejemplo 16 del documento WO 2005/108429) se diluyó con una solución diluyente (BSA al 0,1 %/D-PBS) para preparar una solución patrón de 3 ng/ml. Después de añadir la serie de dilución de antisuero a una placa, posteriormente se añadió una solución patrón de 3 ng/ml. La placa se incubó durante una hora y, posteriormente, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween20 al 0,05 %. A continuación, se añadieron 100 j l de una solución obtenida diluyendo Igs-HRP anti-conejo (DAKO, P448) y la placa se incubó durante una hora a 25 °C. Después de lavar de manera similar la placa cinco veces, se añadió una solución de tetrametilbencidina (TMB, fabricado por BioFix) y se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la reacción se terminó con una solución de ácido sulfúrico 1 M. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando Multiskan JX (fabricado por Thermolab Systems). Según el resultado de la medición de absorbancia, se seleccionó una pieza con un título alto de anticuerpos.

Cuatro días antes de extraer el bazo, se administraron 400 jg de péptido S68-KLH en la vena del oído. Después de la extracción aséptica del bazo, se recuperaron los linfocitos.

1-(2) Fusión celular y clonación

De acuerdo con el procedimiento descrito en la patente de Estados Unidos N.° 7429487, se mezclaron 2x108 células de los linfocitos y 1 x 108 células de linfocitos B inmortalizados derivados de conejo para el compañero de fusión y la fusión celular se realizó dos veces divididas. Las células fusionadas se sembraron en una placa de 96 pocillos y se cultivaron según un procedimiento general.

Con respecto al sobrenadante de cultivo de los 286 clones obtenidos, se determinó la actividad de unión para el antígeno administrado usando el péptido S68-BSA y se seleccionaron 72 clones con actividad de unión confirmada.

Con respecto a los 72 clones que tienen actividad de unión confirmada para el antígeno administrado, la actividad de unión para un patrón de referencia de presepsina se determinó mediante el sistema ELISA de tipo sándwich, que es la misma que 1-(1) y se seleccionaron los clones con actividad de unión confirmada.

Con respecto a los clones con actividad de unión confirmada para un patrón de referencia de presepsina, se determinó la especificidad para la presepsina en sangre de un paciente. Específicamente, tres sueros de una persona normal (adquiridos en ProMed-Dx) y tres sueros de un paciente con sepsis (adquiridos en Bioreclamation) se diluyeron cinco veces con una solución diluyente y se determinaron mediante el sistema de ELISA de tipo sándwich, que es lo mismo que 1-(1). Como resultado, se seleccionaron cinco clones en los que la reactividad con un patrón de referencia de presepsina es buena, la absorbancia no aumenta en una muestra de la persona normal y la absorbancia aumenta en una muestra del paciente con sepsis. Cada clon se clonó por dilución limitante y se preparó cada ampolla congelada.

1-(3) Análisis para el modo de unión mediante BIACORE

Para determinar el modo de unión entre cada anticuerpo que se ha obtenido del clon seleccionado y presepsina, se realizó el análisis utilizando BIACORE3000 (fabricado por GE Health Care). En un chip CM5 (fabricado por GE Health Care), el anticuerpo F1106-13-3 se inmovilizó mediante un procedimiento estándar y se añadió adicionalmente un patrón de referencia de presepsina (1 pg/ml). Adicionalmente se añadió el sobrenadante de cultivo diluido (0,5 pg/ml) y se trazó un sensorgrama. Todos los clones exhibieron un buen modo de unión desde el cual no se observa disociación en la fase de disociación.

1- (4) Preparación del anticuerpo monoclonal de conejo

Usando el hibridoma obtenido que produce un anticuerpo monoclonal anti-presepsina de conejo, se produjo un anticuerpo monoclonal de conejo. Específicamente, de acuerdo con un procedimiento estándar, se descongeló la ampolla congelada y las células se recogieron después de cultivarlas en medio RPMI1640 (fabricado por Sigma) que contenía 10 % de suero bovino fetal y 8 % de suplemento A (fabricado por Abcam) y las células se cultivaron usando medio IS-MAB-CD ( fabricado por Irvine) según el protocolo de CELLine (fabricado por Integra Bioscience) y se recogió el sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo. A continuación, del sobrenadante de cultivo obtenido, se purificó el anticuerpo usando rmp-Proteína A Sepharose Ff (fabricado por GE Health Care). La solución eluida que contenía el anticuerpo purificado se concentró y posteriormente se dializó contra D-PBS (pH 7,4). La concentración de proteína del anticuerpo se midió mediante el procedimiento de Bradford usando IgG bovina (fabricado por BioRad) como patrón. El anticuerpo obtenido se analizó por SDS-PAGE y, como resultado, se identificó una sola banda con un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. Adicionalmente, como resultado de la reducción, se identificaron una cadena pesada de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera de aproximadamente 25 kDa.

Ejemplo 2: Producción de anticuerpo recombinante

2- (1) Construcción del plásmido para la expresión y determinación de la secuencia de aminoácidos en la región variable del anticuerpo monoclonal de conejo

De cada hibridoma obtenido del Ejemplo 1, se extrajo ARN total usando el Mini Kit RNeasy (fabricado por Quiagen) y se sintetizó un ADNc monocatenario usando el kit SuperScript VILO cDNA Synthesis (fabricado por Invitrogen). Usando el conjunto de Ig-cebadores de conejo (Rader C, y col. JBC 2000; 275: 13668-76 y Lang I, y col. Gene 1996; 172: 295-8) que utiliza el ADNcmonocatenario obtenido como molde, la región variable se amplificó por PCR y la secuencia de nucleótidos de cada región variable de la cadena pesada y la cadena ligera se determinó mediante un procedimiento estándar.

Se realizó una búsqueda en la base de datos con respecto a la información de la secuencia que no sea la región variable y se diseñaron el cebador lateral 5' y el cebador lateral 3'. Usando dichos cebadores, La PCR se realizó para amplificar cada una de la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa, que luego se clonaron en pTK-2433 que tiene el promotor EF-1a y el potenciador de CMV, es decir, un vector para la expresión transitoria en células de mamífero. De acuerdo con un procedimiento estándar, se determinaron las secuencias de nucleótidos de cada una de la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa y la secuencia de aminoácidos codificados por ellas.

Las secuencias de aminoácidos de la parte CDR de la región variable del anticuerpo se ilustran en la Tabla 1 (cadena pesada) y la Tabla 2 (cadena ligera).

Tabla 1

Tabla 2

2-(2) Preparación de anticuerpo recombinante para expresión transitoria

Los plásmidos para la expresión transitoria que se han producido en el punto 2-(1) anterior (el plásmido de expresión que contiene la secuencia de la cadena pesada y el plásmido de expresión que contiene la secuencia de la cadena ligera) se mezclaron entre sí en la misma cantidad y las células COS-1 ( ATCC: CRL-1650) se transfectaron con la mezcla. Específicamente, después de mezclar el reactivo de transfección a 2 pl/ml y el plásmido a 4 pg/ml y añadirlos al medio, se añadieron células COS-1 a las mismas y se cultivaron a 37 °C. Setenta y dos horas después, se recogió el sobrenadante del cultivo y se añadió nuevamente a un medio recién preparado. Noventa y seis horas después, se recogió el sobrenadante del cultivo y las fracciones obtenidas por dos colecciones se mezclaron y filtraron a través de un filtro de 0,22 pm (Sterivac, fabricado por Millipore). El sobrenadante del cultivo obtenido se purificó por el procedimiento descrito en el punto 1-(4) anterior, y como resultado del análisis por SDS-PAGE, se identificó un anticuerpo recombinante que muestra una única banda a aproximadamente 150 kDa.

2-(3) Construcción de plásmido para la expresión estable de anticuerpo recombinante

Usando una enzima de restricción, el fragmento de gen que codifica la cadena pesada y el fragmento de gen que codifica la cadena ligera se digirieron de los plásmidos para la expresión transitoria que se han producido en el punto 2- (2) anterior y se unieron al plásmido (pTK-2577; descrito en el documento JP 2007-215546 A) que contiene el promotor EF-1a y la unidad de expresión DHFR de ratón [promotor SV40 como promotor (que no contiene una región potenciadora), la señal de poliA derivada de SV40] para producir un plásmido para la expresión estable en células animales de mamífero.

Ejemplo 3: Fabricación de anticuerpos por células CHO

3- (1) Preparación de células CHO de producción de anticuerpos recombinantes de anticuerpos monoclonales de conejo

Las células CHO deficientes en el gen DHFR (CHO DXB11) se transfectaron con el plásmido para una expresión estable que se ha construido en el punto 2-(3) anterior y se establecieron células CHO transformadas productoras de un anticuerpo de conejo. Específicamente, CHO DXB11 que se ha aclimatado y cultivado con EX-CELL 302 PF CHO (fabricado por JRH Bioscience) que contiene el suplemento de medio HT (50x) Hybri-Max (fabricado por Sigma; utilizado a una concentración final de 1x) y L-glutamina 200 mM (fabricada por Sigma; utilizada a una concentración final de 4 mM) se centrifugó el día de la transfección y se inoculó en un matraz a la concentración de 8 x 106 células/150 cm2 Roux. Usando 125 pl de FuGENE6 (fabricado por Promega), se prepararon 12,5 pg del plásmido de expresión de acuerdo con el protocolo adjunto a FuGENE6 y, a continuación, se introdujeron en CHO DXB11. Después de cultivar durante dos días a 37 ° C, 5 % de CO², las células se recogieron y se lavaron dos veces con medio EX-CELL 302 PF CHO sin HT que contenía L-glutamina 4 mM (en lo sucesivo, descrita como EX-CELL (HT-), y se resuspendieron en EX-CELL (HT-). A continuación, las células se sembraron nuevamente en una placa de 96 pocillos a 12.500-50.000 células/pocillo y se cultivaron continuamente a 37 °C, 5 % de CO². El semivolumen del medio se reemplazó con EX-CELL (HT-) recién preparado cada tres o cuatro días. Después de continuar el cultivo durante aproximadamente dos semanas, las células dentro de un pocillo con una colonia se transfirieron a una nueva placa.

El anticuerpo en el sobrenadante del cultivo de las células CHO se sometió a detección selectiva mediante el procedimiento ELISA que usa el antígeno peptídico S68 como una fase sólida y, a continuación, se seleccionaron cinco tipos de células CHO que producen un anticuerpo que se une al péptido S68.

3-(2) Amplificación génica usando metotrexato

Realizando un procedimiento de amplificación génica, las células CHO transformadas para expresar el anticuerpo recombinante obtenido en el punto 3-(1) se seleccionaron y cultivaron en medio EX-CELL (HT-) que contenía metotrexato (en lo sucesivo, descrito como MTX), se seleccionaron los clones en los que se incrementa la cantidad de producción de un anticuerpo recombinante diana. Específicamente, las células transformadas obtenidas del Ejemplo 3-(1) se suspendieron en medio EX-CELL (HT-) que contenía MTX 30 nM y, a continuación, se extendieron sobre una placa de 96 pocillos. El semivolumen del medio se reemplazó cada tres o cuatro días con EX-CELL (HT-) recién preparado que contenía MTX 30 nM y el cultivo se continuó a 37 °C, 5 % CO², hasta generar una colonia. La concentración de IgG en el sobrenadante del cultivo de la colonia obtenida se determinó por el procedimiento ELISA y se seleccionaron los clones que exhibían una mayor cantidad de producción. Como resultado, se obtuvo el transformante que exhibía la cantidad de producción aumentada de dos a diez veces. Mientras tanto, sometiendo el transformante con el gen amplificado a una selección y cultivo repetidos en un medio en el que la concentración de MTX aumenta de tres a diez veces, fue posible obtener los clones con una mayor cantidad de producción.

3-(3) Producción de anticuerpo recombinante por células CHO

Los clones obtenidos del punto 3-(2) se inocularon en medio CHO-SFM (HT-) (fabricado por GIBCO) que contenía MTX 30 nM para que tuviera 1 x 105 células/ml y se cultivaron durante siete días a 37 °C. El sobrenadante del cultivo obtenido se usó para purificar el anticuerpo. El anticuerpo se purificó del sobrenadante del cultivo usando una columna de proteína A (Prosep-A, fabricado por Millipore). Como resultado del análisis del anticuerpo recombinante purificado por SDS-PAGE, se identificó un anticuerpo que muestra el mismo peso molecular que el anticuerpo derivado del hibridoma.

Ejemplo 4: Evaluación de la reactividad de cada anticuerpo en el sistema ELISA de tipo sándwich

La reactividad con presepsina se evaluó para 5 tipos de anticuerpos monoclonales de conejo preparados en el Ejemplo 2, el anticuerpo s 68 descrito en el Ejemplo 1 del documento WO 2004/044005 A1 (anticuerpo policlonal obtenido mediante la inmunización de un conejo con péptido S68) y F1146-17-2 descrito en el Ejemplo 2 del documento WO 2004/044005 A1 (anticuerpo monoclonal obtenido mediante la inmunización de una rata con péptido S68). Específicamente, cada anticuerpo se diluyó a 5 jg/m l con PBS (pH 7,4) y se añadieron 50 |jg del mismo a cada pocillo de una inmunoplaca (Maxisorb, fabricada por NUNC). Después de la reacción durante la noche a 4 °C, el lavado con agua de intercambio iónico se realizó cinco veces y el bloqueo se realizó añadiendo a cada pocillo 200 j l de PBS que contenía 0,1 % de StabilGuard (fabricado por SurModics, Inc) y 0,1 % de Tween20 (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A continuación, el patrón de referencia de presepsina se diluyó a 1.000 ng/ml utilizando una solución diluyente y posteriormente se diluyó en una proporción de tres veces para preparar una dilución en serie del material de referencia. La dilución en serie del patrón de referencia se añadió en una cantidad de 50 j l por pocillo y se hizo reaccionar durante una hora a 25 °C. Una vez completada la reacción, se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween20 al 0,05 % y se añadieron a cada pocillo 50 j l de anticuerpo F1106-13-3 marcado con peroxidasa que se había diluido a 0,25 jg/ml. Después de la reacción durante dos horas a 25 °C, el lavado se realizó cinco veces de la misma manera que antes y se añadió una solución TMB a cada pocillo. Después de la reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se terminó usando una solución de ácido sulfúrico 0,5 M y se midió la absorbancia a 450 nm (sublongitud de onda de 650 nm) usando un espectrofotómetro de placa (fabricado por Molecular Devices).

Los resultados de medición se muestran en la Tabla 3. Cualquier sistema de medición usando cada anticuerpo monoclonal de conejo preparado en el Ejemplo 2 fue excelente en la reactividad con el patrón de referencia de presepsina y mostró una reactividad casi equivalente con la del sistema de medición que usa el anticuerpo S68.

Por otro lado, el sistema de medición con F1146-17-2 mostró baja reactividad y 0,368 de la absorbancia cuando la concentración de presepsina fue de 1.000 ng/ml. Esta absorbancia fue casi equivalente a la absorbancia mostrada cuando la concentración de presepsina fue de 0,03 a 0,1 ng/ml en el sistema de medición usando el anticuerpo monoclonal de conejo. Como se ha indicado anteriormente, se reveló que el sistema de medición que usa el anticuerpo monoclonal de conejo mejoró la reactividad en aproximadamente 10.000 veces en comparación con el sistema de medición que usa F1146-17-2. Dado que la concentración de presepsina de una muestra de persona normal suele ser de aproximadamente 50 a 300 pg/ml, se demostró que la medición es imposible en un sistema de medición usando F1146-17-2.

Tabla 3

Ejemplo 5: Medición de la muestra del paciente y prueba de interferencia

Los valores de presepsina en muestras de sangre de 30 pacientes con sepsis se midieron mediante el sistema de ELISA de tipo sándwich descrito en el Ejemplo 4 utilizando cada anticuerpo fabricado en el Ejemplo 2 y se analizó la correlación con los valores de medición mediante el sistema ELISA de tipo sándwich utilizando el anticuerpo S68.

Como resultado, en cada sistema de ELISA usando el anticuerpo monoclonal de conejo, había dos tipos de sistemas, un sistema que muestra una buena correlación con el valor de medición mediante el sistema de ELISA que usa el anticuerpo S68 y otro sistema que muestra una correlación escasa. Los resultados mostraron que los coeficientes de correlación de los anticuerpos monoclonales de conejo F1466-12 y F1466-19 eran peores en comparación con los otros. Los coeficientes de correlación de los anticuerpos respectivos fueron F1466-12 = 0,89, F1466-19 = 0,93 y F1466-26 = 0,98.

A continuación, las influencias de las sustancias de interferencia en la sangre (bilirrubina F, bilirrubina C, hemoglobina, factor de reumatismo y triglicéridos) en el valor de medición de presepsina se investigaron en sistemas de ELISA de tipo sándwich fabricados utilizando cada uno de los anticuerpos monoclonales de conejo y el anticuerpo S68, respectivamente. Cada una de las sustancias de interferencia en concentraciones escalonadas se añadió al suero de voluntarios sanos contenidos con una cantidad fija de presepsina y se midió la concentración de presepsina, y se evaluó la influencia de cada una de las sustancias de interferencia en el valor de medición sobre la base del valor de medición cuando no se añadió la sustancia de interferencia.

Como resultado, la interferencia de la bilirrubina F, bilirrubina C, hemoglobina y el factor de reumatismo no era un nivel problemático en los sistemas de medición que utilizan cualquier anticuerpo.

Por otro lado, los triglicéridos (TG) influyeron en el sistema de medición utilizando algunos anticuerpos. La prueba de interferencia de TG se realizó como se describe a continuación. Como muestra se usó suero humano de voluntarios sanos al que se añadió una determinada cantidad de presepsina. Las muestras diluidas en serie a 20 mg/ml de la concentración de TG en las muestras se produjeron usando una transfusión de Intralipid al 20 % (Fresenius SE & Co.KGaA). Los TG contenidos originalmente en el suero de la muestra no se consideran en esta concentración de TG. Las muestras diluidas se diluyeron más de 20 veces con una solución de dilución de muestra y el valor de presepsina se midió mediante ELISA. Esta prueba de interferencia de TG se realizó para varias muestras.

Como resultado, la adición de TG tuvo una influencia en el valor de medición de presepsina en el sistema de medición usando anticuerpos F1466-12 y F1466-19 y la proporción de la muestra que mostró más de ± 20 % del grado de separación del valor de medición de presepsina fue alta cuando la concentración de TG en la muestra fue de 20 mg/ml.

Además, se obtuvo un grado de separación del valor de medición de presepsina a la concentración de TG en una muestra de 20 mg/ml en una pluralidad de muestras y se calculó un promedio del grado de separación para cada anticuerpo. Como resultado, un promedio del grado de separación exhibe ± 20 % o menos en un sistema de medición que usa el anticuerpo S68, F1466-5 y F1466-26.

Por otro lado, en un sistema de medición con anticuerpos de F1466-12, F1466-19 y F1466-16, el resultado fue que un promedio del grado de separación supera ± 20 %.

Además, los grados de disociación de los valores de medición de presepsina mediante la adición de TG se compararon entre un sistema de ensayo usando cada anticuerpo monoclonal de conejo y un sistema de ensayo usando el anticuerpo S68. Por tanto, cuando la concentración de TG en la muestra fue de 20 mg/ml mediante la adición de TG, las muestras que muestran más del 20 % representan en exceso tanto la diferencia entre el grado de disociación del sistema de medición de F1466-12 como el grado de disociación del sistema de medición del anticuerpo S68 y la diferencia entre el grado de disociación del sistema de medición de F1466-19 y el grado de disociación del sistema de medición del anticuerpo S68, alta.

Esto sugiere la posibilidad de que la diferencia en el rendimiento de los anticuerpos en la prueba de interferencia de TG influya en el análisis de correlación como se ha descrito anteriormente.

Se intentó la prueba de sustancia de interferencia para F1146-17-2, pero los datos no se obtuvieron debido a la baja reactividad.

Ejemplo 6: Especificidad del anticuerpo; Análisis para el epítopo

Se analizaron los epítopos de cada uno de los anticuerpos monoclonales de conejo y F1146-17-2 fabricados en el Ejemplo 2 (anticuerpo monoclonal obtenido mediante inmunización de una rata con el péptido S68).

Se sintetizaron 8 tipos de péptidos que consisten en 10 aminoácidos que contienen el fragmento parcial de la secuencia de péptidos de SEQ ID NO: 2, que se usó como antígeno de administración en el Ejemplo 1 (véase la Tabla 4). La secuencia del epítopo se investigó observando la reacción de inhibición por competición con un patrón de referencia de presepsina mediante el sistema de ELISA de tipo sándwich descrito en el Ejemplo 4. Específicamente, las placas de inmovilización de cada anticuerpo se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4. A continuación, se añadieron 400 pg/ml del patrón de referencia de presepsina y 20 |jg/ml de los péptidos sintéticos mostrados en la Tabla 4 (P01 a P08) en 25 jl, respectivamente, a las placas, y se hicieron reaccionar. Sin adición del péptido (descrito como PBS) y un péptido para un control negativo (descrito como NC: La secuencia CGD-KTTATDIKGKE (SEQ ID NO: 34) se usaron como control negativo. Además, se utilizó como control negativo el péptido S68. El sistema de reacción se desarrolló en color con TMB después de completada la reacción. Si el péptido sintético reaccionó con el anticuerpo, la absorbancia disminuyó porque se inhibió la unión del patrón de referencia de presepsina al anticuerpo. La tasa de inhibición de cada péptido se calculó cuando se asumió que la absorbancia de PBS era del 100 %.

Como resultado de ello, un anticuerpo que reconoce solo P03, un anticuerpo que reconoce de P03 a P04 y un anticuerpo que reconoce de P04 a P05 se confirmaron como se muestra en la Tabla 5. Además, se reveló que F1146-17-2 reconoció de P04 a P05. Como resultado de ello, se reveló que se obtuvo un anticuerpo monoclonal que reconoce la ubicación de P03 como epítopo. Se descubrió que F1466-12 y F1466-19, que mostró peores resultados en la prueba de interferencia de TG y la correlación con el sistema de medición que usa el anticuerpo S68 en el Ejemplo 5, reconoció de P04 a P05 y no reconoció P03 como el epítopo de manera similar al anticuerpo monoclonal de rata (F1146-17-2). Los otros anticuerpos reconocieron a P03 como el epítopo. Esto sugiere que existe una relación entre la capacidad adecuada para la medición de presepsina del anticuerpo y el epítopo que el anticuerpo reconoce. Además, la presepsina tiene una secuencia de aminoácidos que es muy deficiente en una porción C-terminal de sCD14 de alto peso molecular y se supone que la longitud de un aminoácido de la misma tiene variación. Es posible que una diferencia en la especificidad de un anticuerpo influya en la correlación con el valor de medición usando el anticuerpo S68 en el Ejemplo 5.

Tabla 4

Tabla 5

continuación

Ejemplo 7: Análisis detallado del epítopo

Con respecto al anticuerpo monoclonal de conejo que reconoce el péptido P03, se investigó la reactividad con péptidos obtenidos modificando el péptido P03 para un aminoácido. Se sintetizaron los péptidos (péptidos P031 a P039) obtenidos mediante la sustitución de los aminoácidos en la posición 53 a la posición 61 con alanina (glicina cuando el aminoácido original es alanina) por un aminoácido en el péptido P03 (correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de la posición 52 a la posición 61 de la SEQ ID NO: 3) y las reactividades entre los péptidos P031 a P039 y el anticuerpo se confirmaron mediante el sistema de ELISA de tipo sándwich de acuerdo con la descripción del ejemplo 4.

Como resultado, la actividad de unión con el anticuerpo se perdió cuando el ácido aspártico en la posición 59 de SEQ ID NO: 3 en el péptido P03 (correspondiente a la posición 8 de la SEQ ID NO: 1) se sustituyó con alanina.

La actividad de unión con el anticuerpo se mantuvo cuando los aminoácidos en la posición 53 a la posición 58 de la SEQ ID NO.: 3 (correspondiente a los aminoácidos de la posición 2 a la posición 7 de la SEQ ID NO: 1), la posición 60 y la posición 61 de la SEQ ID NO: 3 en el péptido P03 (correspondiente a la posición 9 y la posición 10 de la SEQ ID NO: 1) se sustituyeron con alanina (o glicina).

Tal como se ha descrito anteriormente, se confirma que el anticuerpo que reconoce el péptido P03 como un epítopo reconoce los péptidos como epítopo que los péptidos se obtuvieron sustituyendo los aminoácidos en la posición 53 a la posición 58, la posición 60 y la posición 61 descritas en la SEQ ID NO: 3 en el péptido P03 con alanina (o glicina) para un aminoácido.

Ejemplo 8: Preparación de variante de anticuerpo monoclonal anti-presepsina derivado de conejo

En función de la secuencia de anticuerpos monoclonales anti-presepsina derivados de conejo descritos en el Ejemplo 1, se prepararon variantes.

8-(1) Análisis de la secuencia de CDR

Como resultado del análisis de la secuencia CDR de cinco tipos de anticuerpos anti-presepsina que se han obtenido del Ejemplo 1, se presumió que la secuencia de cada anticuerpo tiene una secuencia que afecta a la actividad del anticuerpo y una secuencia que no afecta a la actividad del anticuerpo. Por tanto, utilizando como base la secuencia CDR del anticuerpo F1466-26, que es uno de los anticuerpos que se muestra claramente que reconoce la secuencia de P03 (SEQ ID NO: 1) como un epítopo en el Ejemplo 6, se realizó una modificación de aminoácidos de cada secuencia de CDR para preparar una variante y se evaluó la actividad de la variante. Se prepararon aproximadamente 100 variantes. La modificación de aminoácidos se realizó mediante sustitución, inserción o deleción de un aminoácido, o sustitución de una secuencia con varios aminoácidos.

Una variante que contiene la longitud completa de la cadena pesada del anticuerpo F1466-26 y toda la longitud de la cadena ligera del anticuerpo F1466-5 también se preparó y se evaluó de la misma manera que anteriormente.

8-(2) Preparación de plásmido para preparar producto con modificación de la cadena pesada

Se preparó un plásmido para un producto con modificación de la cadena pesada como sigue. Aunque se dan descripciones para el plásmido pTK-5793, también se construyeron otros plásmidos de acuerdo con el mismo procedimiento. Usando como molde el plásmido para la expresión transitoria de una cadena pesada (pTK-5605) que contiene toda la longitud de la cadena pesada de F1466-26 obtenida del Ejemplo 2 y un par de cebadores (IgG de conejo (14-12)-e: cebador lateral de 3' y cebador lateral IgV2: 5' Aor13HI-r de conejo), se realizó una PCR. También usando el fragmento amplificado obtenido como molde y un par de cebadores (IgG de conejo (14-12)-e y IgV2 de conejo Aor13HI), se realizó una PCR. El fragmento amplificado obtenido a partir del mismo se clonó en el plásmido pT7-Blue y luego se preparó un fragmento que incluía una secuencia deseada usando la enzima de restricción Aor13HI. Asimismo, el pTK-4273 (fabricado por nuestra empresa) que tiene un promotor EF-1a y un potenciador de CMV y otra secuencia génica que comprende otras partes distintas de la región variable de la cadena pesada de IgG de conejo, que es un vector para la expresión transitoria en células de mamíferos, se digirió con la enzima de restricción Aor13HI para preparar un fragmento de vector. El fragmento preparado que contiene la secuencia deseada se clonó en el fragmento del vector para preparar pTK-5793.

8-(3) Preparación de plásmido para preparar producto con modificación de la cadena ligera

Se preparó un plásmido para un producto con modificación de la cadena ligera como sigue. Aunque se dan descripciones para el plásmido pTK-5844, también se construyeron otros plásmidos de acuerdo con el mismo procedimiento. Usando como molde el plásmido para la expresión transitoria de una cadena ligera (pTK-5608) que contiene la longitud completa de la cadena ligera de F1466-26 obtenida del Ejemplo 2 y un par de cebadores (cebador lateral pEF2ce-28: 3' y cebador lateral and pEF2ce-49: 5'), se realizó una PCR. Usando también el fragmento amplificado obtenido como molde y un par de cebadores (pEF2ce-28 y pEF2ce-49), se realizó una PCR. El fragmento amplificado obtenido a partir del mismo se clonó en el plásmido pT7-Blue y luego se preparó un fragmento que incluye una secuencia deseada usando las enzimas de restricción BamHI y Xbal. Asimismo, el pTK-2433 (fabricado por nuestra empresa), que es un vector para la expresión transitoria en células de mamíferos, se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Xbal para preparar un fragmento de vector. El fragmento preparado que contiene la secuencia deseada se clonó en el fragmento del vector para preparar pTK-5844.

Secuencia de cebadores

IgG de conejo (14-12)-e: 5'GGG GGT CCG GAG GTC GCC TGG TCA CGC CTG G 3'(SEQ ID NO: 85)

IgV2 Aor13HI-conejo: 5'GGG TCC GGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3'(SEQ ID NO: 86)

pEF2ce-28: 5' TTC ATT CTC AAG CCT CAG AC 3'(SEQ ID NO: 87)

pEF2ce-49: 5' TTT TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT 3'(SEQ ID NO: 88)

8- (4) Preparación de anticuerpo recombinante en el sistema de expresión transitoria

A continuación, en el presente documento, el procedimiento para la expresión transitoria de un anticuerpo usando el plásmido pTK-5793 para preparar un producto con modificación de la cadena pesada se muestra como un ejemplo representativo. El plásmido (pTK-5793) para preparar el producto con modificación de la cadena pesada que se ha preparado en el Ejemplo 8-(2) y el plásmido (pTK-5608) para la expresión transitoria de una cadena ligera que se ha descrito en el Ejemplo 8-(3) se mezclaron en la misma cantidad y las células COS-1 (ATCC: CRL-1650) se transfectaron con ellos utilizando un reactivo de transfección (FuGENE (marca registrada) 6, Promega KK). Específicamente, utilizando el medio de suero reducido Opti-MEM (marca registrada) (fabricado por Life Technologies) como líquido para dilución, se prepararon un reactivo de transfección y el plásmido a 0,96 pl/25 pl y 0,48 pg/25 pl, respectivamente. Después de mezclar y añadir a un medio, se añadieron a las células COS-1, que luego se cultivaron a 37 °C. Después de cultivar durante 72 horas, se recogió el sobrenadante del cultivo.

Similar a lo anterior, el plásmido para preparar cada producto con modificación de la cadena pesada se usó después de mezclarlo con el plásmido (pTK-5608) para la expresión transitoria de una cadena ligera. El plásmido para preparar cada producto con modificación de la cadena ligera se usó después de mezclarlo con el plásmido (pTK-5605) para la expresión transitoria de una cadena pesada. El producto modificado que incluye la longitud completa de la cadena pesada del anticuerpo F1466-26 y la longitud completa de la cadena ligera del anticuerpo F1466-5 se preparó mezclando con el pTK-5605 y un plásmido para la expresión transitoria de una cadena ligera que incluye toda la longitud de la cadena ligera de F1466-5.

Ejemplo 9: Evaluación de la variante (1)

Dieciséis tipos de variantes (anticuerpos IgG) que se obtuvieron por expresión en células COS-1 en el Ejemplo 8 se purificaron y se evaluaron la reactividad con presepsina, la especificidad y la afinidad (valor KD) de cada anticuerpo.

9-(1) Purificación de anticuerpos

El sobrenadante del cultivo de las células COS-1 obtenido del punto 8-(4) se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (Sterivac, Merck Millipore). El sobrenadante del cultivo obtenido se purificó usando Prosep vA (Merck Millipore). Un eluato que contenía el producto purificado se concentró y posteriormente se dializó contra D-PBS (pH 7,4). La concentración de proteína se obtuvo por el procedimiento de Lowry usando IgG (BioRad Laboratories, Inc.) como patrón. El anticuerpo obtenido se analizó mediante SDS-PAGE. Como resultado, se determinó un anticuerpo recombinante que muestra una banda única de aproximadamente 150 kDa.

9- (2) Preparación de rsCD14ST-Fc en sistema de expresión transitoria

Primero, utilizando como molde pTK356H (TB64) (un plásmido que tiene una secuencia que codifica rsCD14 que se describe en el Ejemplo 13 del documento WO 2005/108429), un par de cebadores (hCD14-a, hCD14-d) y una polimerasa Taq (TAKARA BIO INC.), se realizó una reacción de PCR. El fragmento amplificado obtenido a partir del mismo (que contiene una secuencia de reconocimiento de trombina corriente abajo de la secuencia de la posición 1 a la posición 64 de sCD14 humano que incluye una secuencia señal y un sitio de enzima de restricción en ambos extremos) se usó para la clonación de TA en el vector pT7Blue ( Merck Millipore). Después de confirmar la secuencia, se usó como pTK-3047. A continuación, el fragmento obtenido al digerir el pTK-3047 con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI se insertó en un fragmento de vector que se preparó previamente mediante restricción de pTK-2233 (un plásmido para la expresión de células de mamífero que contiene una secuencia que codifica la región Fc de la cadena pesada del anticuerpo IgG1 (cadena pesada derivada de ser humano) con EcoRI y BamHI, y el clon obtenido se usó como pTK-3053.

Secuencia de hCD14-a 5'-GGGAATTCGCCGCCACCATGGAGCGCGCGTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 89)

Secuencia de hCD14-d 5'-GGGATCCACGCGGAACCAGAGCATACTGCCGCGGG-3' (SEQ ID NO: 90)

Las células COS-1 (ATCC: CRL-1650) se transfectaron con el plásmido pTK-3053 para la expresión transitoria para expresar rsCD14ST-Fc. Específicamente, un reactivo de transfección y el plásmido se mezclaron entre sí a 2 pl/ml y 4 pg/ml, respectivamente. Después de mezclar y añadir a un medio, se añadieron a las células COS-1, que luego se cultivaron a 37 °C. Después de cultivar durante 72 horas, se recogió el sobrenadante del cultivo y se añadió además un medio recién preparado. Después de cultivar durante 96 horas, se recogió el sobrenadante del cultivo y las fracciones obtenidas de dos colecciones se mezclaron y filtraron a través de un filtro de 0,22 pm (Sterivac, Merck Millipore). El sobrenadante del cultivo obtenido se purificó usando Prosep vA (Merck Millipore). Un eluato que contenía el producto purificado se concentró y posteriormente se dializó contra D-PBS (pH 7,4). La concentración de proteína se obtuvo mediante el procedimiento de Lowry utilizando BSA (BioRad Laboratories, Inc.) como patrón. El rsCD14ST-Fc obtenido se analizó mediante SDS-PAGE. Como resultado, se determinó una única banda con un peso molecular de aproximadamente 75 kDa. La actividad de unión del rsCD14ST-Fc preparado a un anticuerpo anti--presepsina se determinó mediante ELISA en el que se inmoviliza un antígeno en una fase sólida.

9-(3) Establecimiento de ELISA de tipo sándwich

Mediante el uso de la variante que se ha purificado en 9-(1), se estableció un ELISA de tipo sándwich. Específicamente, cada variante se inmovilizó en la INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) fabricado por Nunc, seguido de bloqueo. A continuación, añadiendo un producto patrón de presepsina (0 a 300 pg/ml), la placa se hizo reaccionar durante una hora a 25 °C. Después, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05 %. A continuación, se añadió una solución que contenía F1106-13-3 F(ab')2-HRP diluido a cada pocillo y se dejó que la reacción se produjera durante 2 horas a 25 °C. De forma similar, después de lavar la placa cinco veces, se añadió una solución TMB y se dejó que la reacción se produjera durante 20 minutos a temperatura ambiente. Cuando se completó la reacción, la reacción se terminó usando una solución 1 M de ácido sulfúrico. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando un lector de placas.

9-(4) Evaluación de la especificidad (1)

Para evaluar la especificidad de la variante que se ha purificado en el punto 9-(1), el ELISA se realizó mediante el uso de una placa a la que el péptido P03 (SEQ ID NO: 1, preparado en el Ejemplo 6) se inmoviliza. Para la comparación, también se realizó una evaluación de F1466-26.

Específicamente, el péptido BSA o P03-BSA se inmovilizó en una INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) por Nunc seguido de bloqueo.

Según el resultado de la concentración de proteína que se obtuvo en el punto 9-(1), se realizó una dilución con D-PBS y se preparó para tener 500 ng/ml. Cada solución diluida se añadió en una cantidad de 50 pl por pocillo y se permitió que la reacción se produjera en la placa durante una hora. Posteriormente, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05 %. A continuación, se añadió a cada pocillo una solución en la que se diluyó Igs-HRP anti-conejo (DAKO, P448) y se dejó que la reacción tuviera lugar durante una hora a temperatura ambiente. De forma similar, después de lavar la placa, se añadió una solución de TMB y se dejó que la reacción tuviera lugar durante de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la reacción se terminó usando una solución 1 M de ácido sulfúrico. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando un lector de placas (Molecular Devices). Junto con la secuencia CDR modificada de la variante, los resultados se muestran en la Tabla 7 a la Tabla 13.

Como resultado, se descubrió que el 87 % de las variantes se unen al péptido P03 y, por lo tanto, se demostró que el sitio P03 se reconoce como un epítopo. Específicamente, se demostró que 5795, 5803, 5811,5810, 5784, 5793, 5858, 5878, 5875, 5876, 5844, 5874 y 5684 reconocían el sitio P03 como un epítopo entre los productos modificados obtenidos.

9-(5) Evaluación de la afinidad

La afinidad (KD) de la variante por presepsina (se usó rsCD14ST-FC preparado en el punto 9-(2), se evaluó el péptido P03 y el péptido S68. La evaluación también se realizó de manera similar para el anticuerpo S68, un anticuerpo monoclonal derivado de rata (F1146-17-2) y el F1466-26.

La medición de la afinidad se realizó utilizando BIACORE3000 (GE Healthcare). En un chip CM5 (GE Healthcare), cada uno de rsCD14ST-Fc, P03-BSA y S68-BSA se inmovilizó de acuerdo con un procedimiento común y se añadieron series de dilución de cada anticuerpo (1,6 a 1000 nM) y se determinó el modo de unión para cada antígeno. Se trazó un sensorgrama y obteniendo la constante de la velocidad de asociación (Ka) y la constante de la velocidad de disociación (Kd), se calculó la constante de disociación en el equilibrio (KD), se calculó la constante de disociación en el equilibrio (KD).

El resultado de la medición de la afinidad (KD) del anticuerpo S68, el anticuerpo monoclonal derivado de rata (F1146-17-2) y F1466-26 para el rsCD14ST-FC se muestra en la Tabla 15.

Como resultado, se descubrió que, el F1466-26 (valor KD de 1,48E-09) tiene una afinidad por la presepsina que es aproximadamente diez veces mayor que la del anticuerpo S68 (valor KD de 1,08E-08) en términos del valor KD. También se descubrió que el F1466-26 tiene una afinidad por la presepsina (valor KD) que es aproximadamente diez mil veces mayor que la de un anticuerpo monoclonal derivado de rata (F1146-17-2: valor KD de 1,08E-05).

El resultado de medir la afinidad (KD) de cada variante para el rsCD14ST-FC se muestra en la Tabla 7 a la Tabla 13, junto con la secuencia de CDR modificada. Como resultado, se descubrió que el 80 % de la variante tiene una afinidad que es mayor o igual que la del anticuerpo S68. De acuerdo con la modificación de la secuencia de CDR del F1466-26, se obtuvo una variante (5810) que tiene una afinidad por la presepsina (valor KD) que es aproximadamente mil veces mayor que la del F1466-26.

Una realización preferida de la presente invención es un anticuerpo que tiene una mayor afinidad por la presepsina en comparación con la afinidad del anticuerpo S68 por la presepsina. Cuando se hace una comparación en términos del valor de KD, los ejemplos del anticuerpo preferido incluyen F1466-26 y 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844 y 5684 como una variante. Asimismo, un anticuerpo que exhibe un valor KD de anticuerpo de menos de 10-8 también es favorable y también se observaron F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844 y 5684. Asimismo, también es preferente un anticuerpo que tenga una excelente afinidad por la presepsina por presepsina que muestre un valor de KD que sea 1/2 o menor que el valor de KD del anticuerpo S68 y también se observaron F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784 y 5793. Los que exhibieron un valor de KD particularmente excelente fueron 5793 (7,3E-10) y 5810 (6,52E-12).

Se descubrió que la variante 5684 en la que se combinan toda la longitud de la cadena pesada de F1466-26 y toda la longitud de la cadena ligera de F1466-5 mantiene la especificidad de P03 y la actividad de unión para presepsina. Debido a que F1466-26 y F1466-5 son los anticuerpos que reconocen el mismo sitio P03 que un sitio de epítopo, se demostró que la actividad del anticuerpo puede mantenerse posiblemente incluso cuando se realiza la sustitución de secuencia entre anticuerpos que tienen la misma especificidad.

Como se muestra en el Ejemplo 2, cualquiera de la secuencia CDR3 de la cadena pesada de F1466-5 y F1466-26 que reconoce P03 como epítopo es GDF y está compuesta por una secuencia relativamente corta, es decir, tres aminoácidos. Como tales, se cree que es una característica del presente anticuerpo.

Asimismo, debido a que se observó un aumento en la afinidad en la variante 5793 de acuerdo con la modificación de la 3ade la CDR3 de la cadena pesada, se demostró que la tercera secuencia de CDR3 de la cadena pesada posiblemente puede tener un efecto sobre la actividad del anticuerpo.

Tabla 6

Tabla 7- CDR1 de la cadena pesada de región modificada

Tabla 8- CDR2 de la cadena pesada de región modificada

Tabla 9- CDR3 de la cadena pesada de región modificada

Tabla 10- CDR1 de la cadena ligera de región modificada

Tabla 11- CDR2 de la cadena ligera de región modificada

Tabla 12- CDR3 de la cadena ligera de región modificada

Tabla 13- Longitud completa de la cadena ligera en la región modificada

9-(6) Evaluación de la especificidad (2) - Reacción de inhibición competitiva de péptidos

De acuerdo con el Ejemplo 6, se realizó una prueba para la reacción de inhibición competitiva por péptidos P01 a P08 para la reacción entre cada variante y presepsina.

La prueba se realizó mediante ELISA en el que la variante se inmoviliza en estado sólido. Específicamente, la variante se inmovilizó sobre INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) por Nunc seguido de bloqueo. A continuación, Se añadió la presepsina patrón (300 pg/ml) a cada pocillo en una cantidad de 25 pl por pocillo. Posteriormente, se añadió cada péptido que se había diluido (0,01 a 10 pg/ml) en una cantidad de 25 pl. Se permitió que se produjera la reacción en la placa durante una hora a 25 °C. Después, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05%. A continuación, se añadió a cada pocillo una solución en la que se diluyó F1106-13-3 F(ab')2-HRP en una cantidad de 50 pl por pocillo y se permitió que la reacción se produjera durante 2 horas a 25 °C. De forma similar, después de lavar la placa cinco veces, se añadió una solución de TMB y la reacción se dejó que se produjera durante de 30 a 40 minutos a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la reacción se terminó usando una solución 1 M de ácido sulfúrico. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando un lector de placas. Como control negativo, se usó una muestra sin añadir el péptido (descrito como PBS). Como control positivo, se usó el péptido S68. Al tener la absorbancia de PBS como 100 %, se calculó la relación de inhibición de cada péptido. Como resultado, se confirmó que todas las variantes que se han probado reconocen específicamente la secuencia P03 como se muestra en la Tabla 14.

Tabla 14

continuación

Ejemplo 10: Evaluación de la variante (2)

Entre las variantes preparadas en el Ejemplo 8, se evaluó la actividad de unión para la presepsina y la especificidad para la variante que no se ha evaluado en el Ejemplo 9.

10-(1) Medición de la concentración de anticuerpos por ELISA

Para determinar la concentración de IgG en el sobrenadante del cultivo obtenido del Ejemplo 8-(4), la concentración de IgG se midió utilizando ELISA de tipo sándwich. Específicamente, el anticuerpo anti-conejo (DAKO, Z196) se inmovilizó sobre la INMUNOPLACA (Ma X iSORP, C96, 430341) por Nunc seguido de bloqueo. Al utilizar el anticuerpo monoclonal de conejo purificado como patrón, se preparó una solución estándar de 100 a 1,56 ng/ml de acuerdo con la dilución con un tampón de dilución (BSA al 0,1 %/D-PBS). A continuación, el sobrenadante del cultivo recogido se diluyó con el tampón de dilución (BSA al 0,1 %/D-PBS). La solución diluida del sobrenadante de cultivo o la serie de dilución del patrón se añadieron a los pocillos, y se permitió que la reacción se produjera durante una hora en una placa. Posteriormente, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05 %. A continuación, se añadió a cada pocillo una solución en la que se diluyó Igs-HRP anti-conejo (DAKO, P399) y se dejó que la reacción tuviera lugar durante una hora a temperatura ambiente. De forma similar, después de lavar la placa cinco veces, se añadió una solución de tetrametilbencidina (TMB, BioFix) y se permitió que la reacción tuviera lugar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la reacción se terminó usando una solución 1 M de ácido sulfúrico. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando un lector de placas (Molecular Devices). La concentración de anticuerpos en cada sobrenadante de cultivo se midió usando una curva patrón que se obtuvo a partir de la dilución de concentración en serie del estándar.

10-(2) Evaluación de la actividad de unión y la especificidad para presepsina

Para evaluar la actividad de unión y la especificidad para la presepsina de la variante, se realizó un ELISA mediante el uso de una placa en la que se inmoviliza un antígeno en estado sólido.

Específicamente, BSA, rsCD14ST-Fc, o el péptido P03-BSA se inmovilizó en la INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) por Nunc seguido de bloqueo.

Según el resultado de la concentración de IgG en el sobrenadante de cultivo, se hizo que la dilución del sobrenadante del cultivo con D-PBS tuviera 500 ng/ml (para una muestra con una concentración baja de anticuerpos, se usó la reserva original del sobrenadante del cultivo). Se añadió cada solución diluida de un sobrenadante en una cantidad de 50 |jl por pocillo y se permitió que la reacción se produjera en la placa durante una hora. Posteriormente, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween20 al 0,05 %. A continuación, se añadió a cada pocillo una solución en la que se diluyó Igs-HRP anti-conejo (DAKO, P448) y se dejó que la reacción tuviera lugar durante una hora a temperatura ambiente. De forma similar, después de lavar la placa, se añadió una solución de TMB y se dejó que la reacción tuviera lugar durante de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la reacción se terminó usando una solución 1 M de ácido sulfúrico. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando un lector de placas (Molecular Devices).

Para la comparación, la evaluación del anticuerpo S68 también se realizó con la evaluación de la actividad de unión para presepsina. La actividad de unión para presepsina se mostró como la proporción de la absorbancia en el momento de la reacción entre cada anticuerpo y rsCD14ST-Fc, cuando la absorbancia en el momento de la reacción entre el anticuerpo S68 y sCD14ST-Fc se establece en 1. Junto con la secuencia modificada de cada variante, los resultados se muestran en la Tabla 15 a la Tabla 20.

Como resultado, se descubrió que la mayoría de los anticuerpos se unen a los péptidos P03 y, por lo tanto, se demostró que el 76 % de los anticuerpos reconoce el sitio P03 como un epítopo.

Asimismo, se descubrió que F1466-26 y la mayoría de las variantes exhibían una proporción de absorbancia que es mayor en aproximadamente 4 a 5 veces en comparación con el anticuerpo S68 y, por lo tanto, tienen una excelente actividad de unión para presepsina. En comparación con el valor KD y la proporción de absorbancia de F1466-26 para presepsina, se supone que el valor KD de estos anticuerpos será el mismo nivel que el valor KD favorable de los anticuerpos medidos en el ejemplo 9.

Una realización preferente de la presente invención es un anticuerpo que tiene una actividad de unión para la presepsina mayor que la del anticuerpo S68. Por ejemplo, en términos de la absorbancia como se describe en los ejemplos, se cree que es preferente un anticuerpo que muestra una absorbancia más alta que la del anticuerpo S68, preferentemente un anticuerpo que muestra una absorbancia mayor en al menos 2 veces que la del anticuerpo S68. Un anticuerpo que exhibe, como actividad de unión para presepsina, la absorbancia 5 veces o más que la del anticuerpo S68 y tiene una propiedad de unión particularmente excelente fue 5934, 5935, 5939, 5944, 5808, 5809, 5824, 5979, 5980, 5983, 5984, 5987, 5988, 5860, 5864 y 5863 entre los anticuerpos obtenidos, 5979, 5983, 5988 y 5864 exhibieron una absorbancia 5,5 veces o más mayor que la del anticuerpo S68 y tuvieron una actividad de unión particularmente excelente para la presepsina entre ellos.

Tabla 15- CDR1 de la cadena pesada de región modificada

Tabla 16- CDR2 de la cadena pesada de región modificada

Tabla 17- CDR3 de la cadena pesada de región modificada

continuación

Tabla 18- CDR1 de la cadena ligera de región modificada

Tabla 19- CDR2 de la cadena ligera de región modificada

Tabla 20- CDR3 de la cadena ligera de región modificada

Ejemplo 11: Preparación de anticuerpo monoclonal usando el procedimiento de presentación en fagos que usa péptido sintético como antígeno

Con respecto al Ejemplo 1-(1), usando linfocitos que se recogen de un conejo inmunizado con el péptido S68-KLH como antígeno para la administración, se prepara un anticuerpo monoclonal de acuerdo con un procedimiento de presentación en fagos.

11-(1) Establecimiento de la biblioteca de fagos inmuno F (ab)

De acuerdo con el procedimiento descrito por CARLOS F. BARBAS III, y col., Phage Display A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press), el ARN total se extrae de los linfocitos derivados del bazo que se han recogido del Ejemplo 1-(1) usando el reactivo TRIZOL (Life Technologies). A continuación, mediante el uso del sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III para RT-PCR (Life Technologies), se sintetiza un ADNc monocatenario. A partir de este ADNc, mediante el uso de un cebador específico para el gen de anticuerpos de conejo notificado por BARBAS III, y col., se preparan un fragmento que contiene la región variable de la cadena pesada y un fragmento que contiene la región variable de la cadena ligera. Mediante el uso de fragmentos amplificados de la región variable de la cadena pesada de conejo obtenida y CHI de cadena pesada humana como molde, el fragmento de cadena pesada quimérica de conejo/ser humano se amplifica mediante PCR. Adicionalmente, mediante el uso de fragmentos amplificados de la región variable de la cadena ligera de conejo (tipo kappa o tipo lambda) y la región constante de la cadena ligera humana como molde, se amplifica el fragmento de cadena ligera quimérica de conejo/ser humano. Usando estos fragmentos, se obtuvo la cadena pesada quimérica de conejo/ser humano y la cadena ligera quimérica de conejo/ser humano como molde, finalmente se prepara el fragmento Fab quimérico de conejo/ser humano. A continuación, conforme a la digestión de pCDisplay- 4 (Creative Biogene), que es un fagemido para la expresión de anticuerpos, con las enzimas de restricción SacI y SpeI, se prepara un fagemido. De forma similar, de acuerdo con la digestión del fragmento Fab quimérico de conejo/ser humano con SacI y SpeI y la inserción del fragmento de ADNc en el fragmento de fagemido preparado de este modo, se prepara un plásmido para expresar la biblioteca de fagos.

11-(2) Preparación de la solución de fagos para la presentación en fagos

Siguiendo un procedimiento común, la cepa de E. Coli TG1 (Alient Technologies) se transforma con el plásmido que se ha preparado en 11-(1) y la solución que contiene la E. Coli se inocula en una placa de medio LB a la que se ha añadido ampicilina. Después del cultivo a 37 °C, las colonias formadas se recogen para preparar la biblioteca de E. Coli. Parte de la biblioteca se cultiva y,, después de añadir ampicilina y glucosa a una suspensión de E. Coli, se cultiva con agitación durante una hora a 37 °C. Después de ello, se transfecta con el fago auxiliar M13KO7 (Life Technologies) y el cultivo en agitación se continúa nuevamente durante una hora. Las células se recogen mediante centrifugación y después de eliminar la solución de cultivo, se suspenden en 10 ml de solución de cultivo 2 x YT seguido de cultivo en agitación a 37 °C. Al día siguiente, el sobrenadante de cultivo se separa mediante centrifugación y se transfieren 8 ml del sobrenadante a otro tubo. Después de añadir 2 ml de solución de PEG/NaCl seguido de mezcla, se mantiene en hielo durante una hora. A continuación, el fago precipitado se recoge por centrifugación y se usa como una solución de fago para la presentación en fagos.

11-(3) Selección del anticuerpo objetivo por procedimiento de barrido

A partir de una solución de fago preparada a partir de 11-(2), se selecciona un anticuerpo mediante un procedimiento de barrido. El barrido se realiza de acuerdo con dos tipos de procedimientos. El primer procedimiento se realiza según el procedimiento de BARBAS y col. Específicamente, S68-BSA se inmoviliza en estado sólido en la INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) fabricada por Nunc, seguido de bloqueo. Después de añadir, en una cantidad de 50 pl por pocillo, se añade D-PBS que contiene 4 % de leche desgrasada y 0,2 % de TritonX-100, 50 pl de la solución de fago obtenida del punto 11-(2). Se deja que la reacción se produzca en la placa durante una hora. Posteriormente, se lava con D-PBS que contiene TritonX-100 al 0,1 %. A continuación, la elución se realiza durante 10 minutos usando Glicina-HCl 100 mM (pH 2,2) y la solución recuperada se neutraliza con Tris-HCl 1 M (pH 7,4). El eluato y la cepa TG1 de E. Coli se mezclan entre sí y reaccionan a 37 °C. La cepa TG1 se transfecta nuevamente con el fago unido al antígeno peptídico S68. A la solución de cultivo, se añaden ampicilina y fago auxiliar M13KO7. Después de hacerlos reaccionar a 37 °C, se recoge E. Coli para añadir un medio y kanamicina al mismo, y se cultiva durante la noche. A partir de la solución de cultivo, el sobrenadante se recoge mediante centrifugación y la solución de fago se prepara mediante tratamiento con PEG. Repitiendo tres veces el mismo procedimiento, se concentra un fago que se une específicamente al péptido S68.

Como segundo procedimiento, el barrido también se realiza tres veces utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 12-(2) para concentrar el fago específico de presepsina.

11-(4) Medición de la actividad de unión del anticuerpo e interpretación de la secuencia CDR

La solución de cultivo de TG1 del punto 11-(3), que se transfecta con el fago, se inocula en una placa LB que contiene ampicilina para formar una colonia. A partir de cada colonia, se prepara nuevamente una solución de fago y la reactividad se determina mediante ELISA. Específicamente, cada uno de BSA, S68-BSA, P03-BSA y sCD14ST-Fc están inmovilizados en la INMUNOPLACA (Ma XISORP, C96, 430341) fabricada por Nunc, seguido de bloqueo. Después de añadir D-PBS que contiene 4 % de leche desgrasada y 0,2 % de TritonX-100, la solución de fago recogida se añade a la misma. Se deja que la reacción se produzca en la placa durante una hora. Posteriormente, la placa se lava cinco veces con solución salina fisiológica que contiene Tween20 al 0,05 %. A continuación, una solución en la que se diluye el conjugado monoclonal HRP/Anti-M13 (GE Healthcare), se añade a cada pocillo y se deja que la reacción se produzca durante una hora a temperatura ambiente. De forma similar, después de lavar la placa cinco veces, se añade una solución de TMB y se deja que la reacción se produzca durante de 10 a 20 minutos a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la reacción se termina usando una solución de ácido sulfúrico 1 M. La absorbancia a 450/650 nm se mide utilizando un lector de placas (ThermoMax, Molecular Devices). Como resultado, la unión se confirma a partir de varios tipos de fago. De esas colonias, se aísla el fagemido y se determina la secuencia.

Según el procedimiento de presentación en fagos, se obtiene un anticuerpo anti presepsina que se une específicamente a P03 y presepsina y es una secuencia diferente de la secuencia CDR obtenida por un procedimiento de hibridoma.

Ejemplo 12: Preparación de la variante de la secuencia de CDR3 de la cadena pesada utilizando el procedimiento de presentación en fagos

Debido a que se espera que la secuencia CDR3 de la cadena pesada tenga un efecto sobre una actividad enzimática, se preparó una variante de la secuencia CDR3 de la cadena pesada utilizando un procedimiento de presentación en fagos y se evaluó.

12-(1) Preparación de la variante modificada de la secuencia CDR3 de la cadena VH usando el procedimiento de presentación en fagos

Para preparar la biblioteca de mutaciones aleatorias VH CDR3, la PCR se realizó usando el plásmido pTK-5956 que contiene la cadena pesada y la cadena ligera de F1466-26 como molde, un par de cebadores (p-nnk3-2s; 5 'fosforilado-GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC T-3' (SEQ ID: 91), p-nnk3-2a; 5 'fosforilado-GCC ACA AAA ATA AGT GGC CGT GTC CTC GGT TGT CGG ACT G-3 '(SEQ ID:92) (N representa uno cualquiera de G, A, T y C, y K representa G o T), y una ADN polimerasa resistente al calor (TAKARA BIO INC.). El fragmento amplificado obtenido a partir del mismo se autoligó usando ADN ligasa. El resultante se transformó en E. Coli XL1-Blue (Agilent Technologies) y se cultivó en una placa de agar que contenía LB/Ampicilina/Tetraciclina. Al día siguiente, las colonias generadas se recogieron utilizando 2 x solución de cultivo YT. A la suspensión de E. Coli, se añadieron ampicilina, tetraciclina y glucosa y el cultivo se realizó durante una hora a 37 °C con agitación. Tras ello, se transfectó con el fago auxiliar M13KO7 (Life Technologies) y el cultivo con agitación se continuó nuevamente durante una hora. Las células se recogieron mediante centrifugación y después de eliminar la solución de cultivo, se suspendieron en 10 ml de solución de cultivo 2 x YT, seguido de cultivo con agitación a 32 °C. Al día siguiente, el sobrenadante de cultivo se separó mediante centrifugación y se transfirieron 8 ml del sobrenadante a otro tubo. Después de añadir 2 ml de solución de PEG/NaCl seguido de mezcla, se mantuvo en hielo durante una hora. A continuación, el fago precipitado se recogió mediante centrifugación y se usó como una solución de fago de la biblioteca de mutaciones aleatorias VH CDR3.

12-(2) Selección del anticuerpo objetivo por procedimiento de barrido

Con la biblioteca preparada en el punto 12-(1), se realizó un barrido para seleccionar un anticuerpo. Específicamente, la solución de fago (2 ml) obtenida del punto 12-(1) y 6 |jg de sCD14ST-Fc se hicieron reaccionar a 37 °C. Dos horas después, se añadieron 200 j l de resina de proteína A (Prosep-vA, Merck Millipore) a esto seguido de reacción durante 20 minutos. Después de lavar cinco veces con PBS que contiene Tween20 al 0,05 %, la resina se añadió con un eluyente (Tris-HCl, glicina (pH 2,2) y se mantuvo durante 8 minutos. A continuación, se recogió la solución de fago eluida y se neutralizó la solución. La solución recogida y la solución de cultivo de E. ColiXL-1 Blue se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 37 °C. Una hora después, se añadieron L-glutamina, ampicilina y el fago auxiliar M13KO7 (Invitrogen) y se permitió que la reacción tuviera lugar a 37 °C. De nuevo, una hora después, el medio se reemplazó con un medio 2 x YT seguido de cultivo durante la noche. Por tanto, se recogieron fagos específicamente unidos a rsCD14ST-Fc. Repitiendo tres veces el mismo procedimiento, se concentró un anticuerpo diana.

12-(3) Preparación de fagos que contienen la secuencia específica de presepsina y determinación de la secuencia de CDR

XL-1 Blue se transfectó nuevamente con la solución de fago finalmente obtenida en el punto 12-(2) y el sobrenadante del cultivo se inoculó en un medio 2 x YT para preparar una colonia. La colonia resultante se cultivó nuevamente con XL-1 Blue y, añadiendo un fago auxiliar, se preparó una solución de fago que contenía fago único. A continuación, utilizando la solución de fago obtenida, la reactividad se confirmó según el ELISA. Específicamente, sCD14ST-Fc se inmovilizó en una placa, es decir, INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) fabricada por Nunc, seguido de bloqueo. La solución de fago se diluyó (x 2) usando D-PBS que contenía leche desgrasada al 4 % y TritonX-100 al 0,2 % y se permitió que la reacción se produjera en la placa durante una hora. Posteriormente, la placa se lavó cinco veces con solución salina fisiológica que contenía Tween 20 al 0,05 %. A continuación, se añadió una solución en la que se diluyó el conjugado monoclonal HRP/Anti-M13 (GE Healthcare) en una cantidad de 50 j l por pocillo y se permitió que la reacción se produjera durante una hora a temperatura ambiente. De forma similar, después de lavar la placa cinco veces, se añadió una solución de TMB y se permitió que la reacción tuviera lugar a temperatura ambiente.

Una vez completada la reacción, la reacción se terminó usando una solución 1 M de ácido sulfúrico. La absorbancia a 450/650 nm se midió utilizando un lector de placas (ThermoMax, Molecular Devices). A continuación, E. Coli se transfectó con la solución de fago con actividad de unión confirmada y después de recoger el plásmido de acuerdo con un procedimiento común, se determinó la secuencia del gen.

12-(4) Preparación del anticuerpo IgG

El fagemido se recogió de los fagos candidatos obtenidos y se preparó un fragmento que codifica la región variable de la cadena pesada. De acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, se preparó un plásmido para preparar una variante de cadena pesada. A continuación se usó para la transfección de células COS-1, junto con el plásmido (pTK-5608) para la expresión transitoria de la cadena ligera que contiene toda la longitud de la cadena ligera del F1466-26. Las células COS-1 se cultivaron a 37 °C. Setenta y dos horas después, se recogió el sobrenadante del cultivo.

12-(5) Evaluación de la variante de la secuencia de CDR3 de la cadena pesada

La variante obtenida se sometió a la misma prueba que en el Ejemplo 10-(2) para evaluar la actividad de unión para la presepsina (rsCD14ST-Fc) y la especificidad de P03. Los resultados se muestran en la Tabla 21, junto con la secuencia de CDR de la CDR3 de la cadena pesada modificada.

Como resultado, la variante 6027 en la que se han sustituido 3 aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada mostró una reactividad ligeramente menor para la presepsina en comparación con otras variantes. Sin embargo, en comparación con el anticuerpo S68, exhibió casi la misma reactividad. Las variantes 6026, 6028 y 6029 exhibieron una excelente reactividad para la presepsina a pesar de que se han sustituido dos aminoácidos. Según estos resultados, se demostró que la actividad del anticuerpo puede mantenerse posiblemente incluso cuando la CDR3 de la cadena pesada está compuesta de tres aminoácidos y sus dos aminoácidos están sustituidos. La variante 6028 mostró una actividad de unión particularmente excelente para la presepsina.

Tabla 21- CDR3 de la cadena pesada de región modificada

Ejemplo 13: Prueba de interferencia de triglicéridos (TG)

De acuerdo con el ejemplo 5 y el ejemplo 6, se ha demostrado que la medición de presepsina usando un anticuerpo que reconoce P04-05 como epítopo es fácilmente interferido por TG en una muestra, pero la medición de presepsina usando un anticuerpo que reconoce P03 como epítopo apenas es interferida por TG.

13-(1) Prueba de interferencia de TG (1) usando suero sanguíneo de ser humano normal

Para mayor confirmación, se determinó una influencia de TG en una muestra de prueba normal. La prueba de interferencia TG se realizó para F1466-26 (especificidad:P03), F1466-5 (P03) y F1466-19 (P04-05) utilizando suero sanguíneo de un ser humano normal.

A la muestra de prueba de ser humano normal (8 muestras) (plasma sanguíneo EDTA, ENECEE BLOOD SERVICIES), se añadió TG a una concentración final de 10 mg/ml y el valor de medición de presepsina se comparó antes y después de la adición. Con respecto a la concentración de t G en ese momento, el TG incluido originalmente en la muestra de prueba no se tuvo en cuenta. La evaluación se realizó usando una placa en la que cada anticuerpo se inmoviliza en estado sólido y el sistema ELISA de tipo sándwich descrito en el Ejemplo 9-(3). Los resultados se muestran en la figura 1.

Como resultado, los anticuerpos F1466-26 y F1466-5 que reconocen a P03 como un epítopo casi no mostraron cambios en el valor de medición antes y después de la adición de TG. Sin embargo, el valor de medición del anticuerpo F1466-19 que reconoce P04-05 como un epítopo se vio significativamente afectado por la adición de TG. Cabe esperar que, como F1466-19, la medición usando un anticuerpo en el que el valor de medición de presepsina se ve significativamente afectado por TG presente en una muestra de prueba exhibe un valor de medición alto para una persona sana que normalmente muestra un valor bajo. En ese caso, es difícil tener una diferencia entre un valor normal y un valor anormal. Por tanto, se puede decir que dicho anticuerpo no es adecuado para la medición de presepsina en una muestra de prueba. Mientras tanto, se confirmó que el anticuerpo que reconoce P03 como un epítopo apenas se ve afectado por Tg presente en una muestra de prueba, y por lo tanto es un anticuerpo adecuado para la medición de presepsina presente en una muestra de prueba.

Además, una prueba que usa este suero humano de persona normal respalda que una reacción cruzada con sCD14 de alto peso molecular es insignificante en un sistema de ensayo que usa un anticuerpo que reconoce P03 como epítopo.

En suero humano de persona normal, la presepsina es unos pocos cientos de pg/ml, mientras que sCD14 de alto peso molecular está presente en alrededor de 5,6 a 11,2 pg/ml (documento WO 2005/108429, Ejemplo 12), y si el anticuerpo reacciona con sCD14 de alto peso molecular, es imposible medir una cantidad menor de presepsina.

De acuerdo con el presente ejemplo, se confirmó que, en un sistema de ensayo que usa un anticuerpo que reconoce P03 como epítopo, no se produce una reacción cruzada con sCD14 de alto peso molecular y es posible medir la presepsina en una cantidad menor de unos pocos cientos de pg/ml.

13-(2) Prueba de interferencia de TG (2) usando la variante

La prueba de interferencia TG se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 5 para las variantes recién obtenidas y se determinó la influencia de TG presente en la muestra de prueba. La variante se usó después de la purificación.

Específicamente, la variante se inmoviliza en INMUNOPLACA (MAXISORP, C96, 430341) fabricado por Nunc, seguido de bloqueo. La dilución de un patrón de presepsina se realizó usando un tampón de dilución para preparar series de concentración de presepsina (15,6 a 500 pg/ml). A tres tipos de muestra de prueba humana, se añadió triglicérido (Intralipid, fabricado por Fresenius Kabi Japan) para tener una concentración final de 6,7, 13,3 o 20 mg/ml. En cuanto a la muestra de prueba humana, se usaron una muestra de suero de sangre obtenida de un paciente con sepsis y dos muestras de suero obtenidas de una persona normal, que se han añadido demás con una cierta cantidad de presepsina. Adicionalmente, el TG contenido originalmente en una muestra de prueba no se consideró para la concentración de TG. La muestra de prueba se diluyó (x 20) usando un tampón de dilución y se añadió a cada pocillo una muestra sin TG añadido o con TG añadido en cada concentración o una serie de dilución de un patrón. La medición se llevó a cabo utilizando ELISA de tipo sándwich como el Ejemplo 9-(3). La relación (%) de la muestra de prueba que exhibe una tasa de disociación de ± 20 % o menos para la medición de presepsina cuando la concentración de TG es 20 mg/ml en una muestra de prueba se mostró en la Tabla 22.

Como resultado, se confirmó que el anticuerpo que reconoce a P03 como epítopo apenas se ve afectado por los triglicéridos.

Tabla 22

Ejemplo 14: Lista de productos modificados con propiedades deseables

La secuencia de CDR de anticuerpos con propiedades deseables, que se han obtenido de los Ejemplos 8 y 12 de la presente invención, se muestra en la Figura 2 a la Figura 2-2 (SEQ ID NO: 93 a SEQ ID NO: 156). El número total de anticuerpos preparados en los Ejemplos 8 y 12 fue 109 y el número de anticuerpos preferidos fue 65.

Los anticuerpos que tienen afinidad por presepsina (valor KD) de menos de 10'8 M se evaluaron como O y los anticuerpos que tienen la afinidad de menos de 10'9 M se evaluaron como ©. Los anticuerpos que tienen un valor KD de menos de 10-7 M pero que exhiben una afinidad casi equivalente a la afinidad por la presepsina del anticuerpo S68 se evaluaron como A. De acuerdo con la evaluación del valor KD, los anticuerpos con actividad de unión particularmente excelente para la presepsina fueron las variantes 5793 y 5810.

La actividad de unión para presepsina se evaluó mediante la proporción de absorbancia obtenida en la reacción entre cada anticuerpo y rsCD14ST-Fc frente a la absorbancia obtenida en la reacción entre el anticuerpo S68 y rsCD14ST-Fc, cuando la absorbancia obtenida en la reacción entre el anticuerpo S68 y rsCD14ST-Fc se establece en 1. El anticuerpo con la proporción de absorbancia de 4 o más se evaluó como o y el anticuerpo con la proporción de absorbancia de 5,5 o más se evaluó como ®. Según la evaluación basada en la comparación de absorbancias, el anticuerpo que se encontró que tenía una actividad de unión particularmente excelente para la presepsina fue la variante 5864, 5979, 5983, 5988 y 6028.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno comprende:

2. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o el fragmento se une a la presepsina con una afinidad menor de 10-8 M (KD).

3. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la unión entre el anticuerpo y la presepsina se inhibe de forma competitiva en un 50 % o más en un sistema de reacción en el que una secuencia de resto de aminoácidos que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 se somete a reacción competitiva (absorbancia) de modo que se inhiba la unión entre el anticuerpo o el fragmento y la presepsina.

4. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la inhibición competitiva para la unión entre el anticuerpo y la presepsina por una secuencia de resto de aminoácido es inferior al 20 % en un sistema de reacción en el que la secuencia de resto de aminoácido se somete a reacción competitiva (absorbancia) de modo que la unión entre el anticuerpo o el fragmento y la presepsina se inhibe, y en el que la secuencia del resto de aminoácido consiste en una secuencia en la que el ácido aspártico en la posición 8 en la SEQ ID NO: 1 está sustituida con alanina.

5. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que

(i) el anticuerpo no se une específicamente a CD14 soluble de alto peso molecular; y/o

(ii) la relación de la muestra que exhibe el grado de separación del valor de medición de presepsina de ± 20 % o menos, cuando la concentración de triglicéridos (TG) es de 20 mg/ml en una muestra, indica el 50 % o más en la prueba de interferencia de TG en múltiples muestras realizadas usando el anticuerpo anterior; y/o

(iii) el valor de medición de presepsina obtenido usando el anticuerpo anterior en una muestra exhibe un coeficiente de correlación de 0,9 o más con el valor de medición obtenido usando el anticuerpo S68 en una muestra; y/o (iv) el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo monocatenario (scFv), región V dimerizada (diacuerpo), región V estabilizada con disulfuro (dsFv), sc (Fv)2, un polipéptido que comprende CDR, un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada y un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera.

6. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido deacuerdo con la reivindicación 6.

8. Una cepa transformada obtenida introduciendo el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 a una célula huésped.

9. La cepa transformada de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la célula hospedadora es una célula CHO.

10. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo, en el que el procedimiento comprende la etapa de cultivar la cepa transformada de acuerdo con la reivindicación 8 o 9.

11. Un kit para medir la presepsina, en el que el kit comprende al menos el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Un kit para detectar sepsis o ayudar a la detección/diagnóstico de sepsis, en el que el kit comprende al menos el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. Un procedimiento de medición de la presepsina, en el que el procedimiento comprende la etapa de poner en contacto con al menos el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una muestra que contiene presepsina.

14. Un procedimiento para detectar sepsis o ayudar a la detección/diagnóstico de sepsis, que comprende al menos las etapas que se describen a continuación:

1) una etapa de medición de la concentración de presepsina en una muestra de un sujeto usando el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 2) una etapa para determinar si la concentración de presepsina obtenida en el punto 1) anterior es un valor alto en comparación con un valor de corte o no.

15. Un procedimiento para la detección selectiva de un anticuerpo anti-presepsina o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, en el que el procedimiento comprende al menos las etapas que se describen a continuación:

1) una etapa de obtención de un anticuerpo anti-presepsina candidato o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno candidato, y

2) una etapa de selección del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de unión al antígeno, en la que la unión entre el anticuerpo y la presepsina se inhibe de manera competitiva en un 50 % o más en un sistema de reacción en el que una secuencia de restos de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 se somete a una reacción competitiva para que se inhiba la unión entre dicho anticuerpo y la presepsina.