KR102395598B1 - 분석물질 검출장치 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자를 포함하는 시료 혼합물이 들어있는 주사기; 제 1 검출용액이 담겨있는 제 1 검출튜브; 한 쪽 끝은 상기 주사기와 연결되고 다른 끝은 제 1 검출튜브로 연결되며 내부에 완충용액이 담겨있는 제 1 튜빙; 및 상기 제 1 튜빙의 외부에 위치하는 자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치에 관한 것이다.

Description

분석물질 검출장치 및 이를 이용한 검출방법{APPARATUS FOR EDTECTING ANALYTE AND DETECTION METHOD USING THE SAME}
본 발명은 분석물질 검출장치 및 상기 검출장치를 이용한 분석물질 검출방법에 관한 것이다.
현장검사(point-of-care testing, POCT)는 시료를 분석 검사실로 가져가지 않고 현장에서 바로 검사하는 것이다. 현장검사를 위해서는 크고 복잡한 기기를 사용하지 않고 동물세포, 박테리아, 바이러스, 핵산, 단백질, 기타 유기물 또는 무기물과 같은 분석물질(analyte)을 검사할 수 있는 간단한 키트가 필요하며 특히 배터리와 같이 저전력을 이용하는 키트(low-powered kit)나 아예 전기를 사용하지 않는 무동력 방식의 키트(non-powered kit)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 현장검사는 숙련된 분석 기술자가 아닌 일반인이 쉽게 사용할 수 있을 정도로 작동이 쉽고 간단해야 하며 경제적이어야 한다.
현장검사를 위해 가장 널리 이용되고 있는 것은 임신진단에 사용되는 측면 흐름(lateral flow) 방식의 키트나 혈당량 검사에 사용되는 전기화학 진단 키트 등이 있다. 그러나 이와 같이 작동이 쉽고 간단한 저전력 또는 무동력 키트는 검출 감도가 매우 낮고 대부분 정성적인 검사만 가능하다는 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 형태의 랩온어칩(lab-on-a-chip)들도 개발되고 있지만 구조가 복잡하거나, 별도의 기기가 필요하거나, 감도가 낮거나, 또는 신뢰성이 낮은 문제점을 가지고 있다.
최근에는 관(tubing)에 액체 왁스(liquid wax)와 같이 물과 섞이지 않는 유기 용매로 분리되어 있는 수용액 사이에 입자를 이동시켜 분석물질을 검출하는 방법이 제시되었다(대한민국 등록특허 제10-1895597호).
대한민국등록특허 제10-1895597호
본 발명은 전력을 사용하지 않거나 극히 적은 양의 전력으로도 분석물질을 검출할 수 있고, 종래 검출장치에 비해 감도가 높고 정량적인 검사가 가능하며, 경제적이고 사용 방법이 간단하여 현장에서 신속한 검출이 가능한 무전력 또는 저전력 분석물질 검출장치 및 상기 검출장치를 이용한 검출방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 일 실시예에서, 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자를 포함하는 시료 혼합물이 들어있는 주사기; 제 1 검출용액이 담겨있는 제 1 검출튜브; 한 쪽 끝은 상기 주사기와 연결되고 다른 끝은 상기 제 1 검출튜브와 연결되며 내부에 완충용액이 담겨있는 제 1 튜빙; 및 상기 제 1 튜빙의 외부에 위치하는 자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치를 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 일 실시예에서, 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자를 포함하는 시료 혼합물이 들어있는 주사기; 제 1 검출용액이 담겨있는 제 1 검출튜브; 한 쪽 끝은 상기 주사기와 연결되고 다른 끝은 상기 제 1 검출튜브와 연결되며 내부에 완충용액이 담겨있는 제 1 튜빙; 상기 제 1 튜빙의 외부에 위치하는 자석; 제 2 검출용액이 들어있는 제 2 검출튜브; 및 상기 제 1 검출튜브와 제 2 검출튜브를 연결하는 제 2 튜빙을 포함하고, 상기 제 2 튜빙은 제 2 검출용액에 잠겨있는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치를 제공한다.
또한, 본 발명은 일 실시예에서, 상기 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 상기 주사기의 시료 혼합물을 상기 제 1 튜빙 내부로 주입하는 단계; 상기 자석을 상기 제 1 튜빙을 따라 이동시키되, 상기 제 1 튜빙의 주사기가 연결되는 끝으로부터 상기 제 1 검출튜브가 연결되는 끝으로 이동시킴으로써 상기 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 상기 완충용액에서 제 1 검출튜브와 가까운 끝 부분으로 이동시키는 단계; 상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액 가운데 5분의 1 내지 2분의 1에 해당하는 부피를 제 1 검출튜브로 주입하는 단계; 및 상기 제 1 검출튜브에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 일 실시예에서, 상기 다른 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 상기 주사기의 시료 혼합물을 상기 제 1 튜빙 내부로 주입하는 단계; 상기 자석을 상기 제 1 튜빙을 따라 이동시키되, 상기 제 1 튜빙의 주사기가 연결되는 끝으로부터 제 1 검출튜브가 연결되는 끝으로 이동시킴으로써 상기 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 상기 완충용액에서 제 1 검출튜브와 가까운 끝 부분으로 이동시키는 단계; 상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액 가운데 20% 내지 50%에 해당하는 부피를 제 1 검출튜브로 주입하는 단계; 상기 주사기의 플런저를 당겨 제 2 검출튜브에 있는 제 2 검출용액을 제 1 검출튜브로 이동시키는 단계; 및 상기 제 1 검출튜브에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분석물질 검출장치 및 검출방법은 전력을 사용하지 않거나 극히 적은 양의 전력으로도 분석물질을 검출할 수 있으며, 종래 검출장치에 비해 감도가 높고 정량적인 검사가 가능하다. 또한 본 발명에 따른 분석물질 검출장치는 경제적이고 사용 방법이 간단하여 현장에서 신속한 검출이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하는 분석방법 가운데 포획입자가 포함된 시료 혼합물을 제 1 튜빙으로 주입하는 단계를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하는 분석방법 가운데 자석을 이용하여 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 제 1 튜빙 내에서 이동시키는 단계를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하는 분석방법 가운데 주사기를 이용하여 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들이 포함된 완충용액을 제 1 검출튜브로 주입하는 단계를 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하는 분석방법 가운데 주사기를 이용하여 제 2 검출튜브에 있는 제 2 검출용액을 제 1 검출튜브로 이동시키는 단계를 도시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 카메라로 촬영한 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 박테리아를 검출하는 방법을 도시한 도면이다.
도 9 및 10은 각각 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 살모넬라 균을 검출한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 도면을 참고하여 구체적으로 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 도시한 도면이다. 도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치(1000)는 분석물질(analyte, 1111)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 포획입자(capture particle, 1112)를 포함하는 시료 혼합물(1110)이 들어있는 주사기(1100), 제 1 검출용액(1210)이 담겨있는 제 1 검출튜브(1200), 한 쪽 끝은 상기 주사기와 연결되고 다른 끝은 제 1 검출튜브와 연결되며 내부에 완충용액(1310)이 담겨있는 제 1 튜빙(tubing, 1300), 및 상기 제 1 튜빙의 외부에 위치하는 자석(1400)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 예시에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치는 상기 자석이 상기 제 1 튜빙의 외부 중 하부에 위치할 수 있다.
도 2는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 도시한 도면이다. 도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치(2000)는 분석물질(미도시)과 특이적으로 결합하는 수용체(미도시)를 자성입자(미도시)에 고정시킨 포획입자(미도시)를 포함하는 시료 혼합물(2110)이 들어있는 주사기(2100), 제 1 검출용액(2210)이 담겨있는 제 1 검출튜브(2200), 한 쪽 끝은 상기 주사기와 연결되고 다른 끝은 제 1 검출튜브와 연결되며 내부에 완충용액(2310)이 담겨있는 제 1 튜빙(2300), 상기 제 1 튜빙의 외부에 위치하는 자석(2400), 제 2 검출용액(2510)이 들어있는 제 2 검출튜브(2500), 및 상기 제 1 검출튜브와 제 2 검출튜브를 연결하는 제 2 튜빙(2600)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 예시에서, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치는 상기 자석이 상기 제 1 튜빙의 외부 중 상부에 위치할 수 있다.
본 발명에서 포획입자는, 시료에 포함된 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체를 자성입자에 고정시킨 입자로서, 분석물질을 포획한 후 자석에 의해 이동될 수 있다. 상기 자성입자의 예로는 Fe3O4 또는 Fe2O3를 포함하는 입자일 수 있다.
본 발명에서 상기 자성입자에 고정되는 수용체는 상기 분석물질과 직접 결합하는 수용체일 수 있다. 예를 들어, 상기 분석물질이 단백질, 유기 분자, 바이러스, 박테리아, 식물 세포 또는 동물 세포와 같이 항체가 형성될 수 있는 물질인 경우 각 분석물질에 대한 항체(antibody)를 수용체로 사용할 수 있다. 다른 예로, 상기 분석물질이 렉틴(lectin)인 경우 탄수화물을 수용체로 사용할 수 있으며, 반대로 탄수화물을 포함하는 물질일 경우 상기 렉틴을 수용체로 사용할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 분석물질이 DNA 또는 RNA와 같은 핵산일 경우에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 또는 PNA(peptide nucleic acid)를 수용체로 사용할 수 있다. 그 외에도 핵산으로부터 얻어지는 앱타머(aptamer), 펩티드 문고로부터 얻어지는 펩티드 리간드, affibody 문고로부터 얻어지는 단백질 리간드 등 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 모두 수용체로 사용할 수 있다.
상기 포획입자에는 분석물질의 양에 비례하여 생성되는 물질에 대한 수용체가 고정될 수 있다. 일 예로 분석물질이 단백질 인산화효소(protein kinase)인 경우 인산화된 단백질에 대한 수용체가 상기 포획입자에 고정될 수 있다.
상기 제 1 튜빙은 내경이 0.2 mm 내지 5 mm인 관을 의미할 수 있다.
상기 제 1 튜빙은 예를 들어, 유리, 금속, 플라스틱 등의 재료로 만들어질 수 있다. 특히 상기 제 1 튜빙은 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 퍼플루오로알콕시 알칸(Perfluoroalkoxy alkane, PFA), 플루오르화 에틸렌 프로필렌(Fluorinated ethylene propylene, FEP)와 같은 플라스틱으로 만들어질 수 있다. 상기 제 1 튜빙은 전술한 플라스틱으로 만들어 짐으로써, 비교적 투명하고 유연성이 있어 본 발명의 분석물질 검출장치에 사용하기에 바람직할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 분석물질 검출장치는 진동모터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분설물질 검출장치에 진동모터를 추가로 포함함으로써, 분석물질을 검출하는 과정에서 진동을 가할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 제 1 튜빙의 내부 부피는 상기 시료 혼합물과 완충용액을 합한 부피보다 클 수 있다. 이로 인해, 상기 시료를 제 1 튜빙으로 주입할 때 완충용액이 제 1 검출튜브로 밀려나가지 않게 할 수 있다.
상기 완충용액은 상기 제 1 튜빙에서 주사기가 연결된 끝 부분에 들어 있을 수 있다. 즉, 상기 완충용액은 상기 제 1 튜빙의 주사기가 연결되는 쪽에 채워 놓으면 시료를 주입할 때 시료 층이 완충용액 층에 바로 연결되어 주입될 수 있다. 상기 시료 층이 완충용액 층에 바로 연결되어 있음으로써, 포획입자의 이동이 더 쉬워질 수 있다. 한편, 상기 시료 층과 완충용액 층이 연속적으로 이어지지 않고 그 사이에 공간이 있더라도 포획입자의 이동이 가능하다. 이와 같이 두 층 사이에 공간이 있을 때는 시료 혼합물에 있는 불순물이 완충용액 층으로 이동하는 것을 방지할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 시료 혼합물은 분석물질의 검출 시 포획입자 및 분석물질을 혼합하여 반응시키는 물질로서, 분석시약을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 분석시약은 표지입자(labeling particle), 수용체-표지 복합체 또는 분석물질-표지 복합체등일 수 있다.
상기 표지입자는 상기 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 입자로서, 박테리아와 같은 세포를 검출할 때 사용할 수 있는 분석시약이다. 상기 표지입자는 박테리아를 포함하는 시료 및 포획입자와 함께 혼합되면 상기 박테리아의 크기가 크기 때문에 한 개의 박테리아에 다수의 포획입자와 표지입자가 동시에 결합하게 될 수 있다.
상기 비자성 입자는 실리카 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리카보네이트 입자, 덱스트란(dextran) 입자, 유리 입자, 알루미나 입자, 금 입자, 은 입자, 팔라듐 입자, 백금 입자, 티타니아 입자, 지르코늄 입자 및 코어-쉘(core-shell) 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.
상기 표지물질은 흡광 성질, 형광 성질, 발광 성질, 방사성, 촉매 활성 등 측정 가능한 신호를 발생할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질로는 기질에 반응을 일으켜 흡광 성질 또는 형광 성질을 갖는 생성물을 만들어 내거나, 빛을 발생시키거나, 또는 기체를 발생시킬 수 있는 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 또는 포스파타아제(phosphatase)와 같은 효소를 사용할 수 있다. 또한, 상기 표지물질로는 형광을 낼 수 있는 유기 형광 분자나 유로퓸 킬레이트(europium chelate)와 같은 형광 물질을 사용할 수 있다. 그 외에도 측정 가능한 신호를 발생할 수 있는 물질은 모두 표지 물질로 사용할 수 있다.
상기 수용체-표지 복합체는 단백질과 같은 고분자의 검출 방법인 샌드위치 면역분석법(sandwich immunoassay)에서 사용할 수 있는 분석시약으로서, 상기 수용체와 표지물질이 연결되어 있는 복합체일 수 있다. 이 방법으로 단백질을 검출하는 경우, 포획입자에는 다른 항체가 고정될 수 있고, 상기 포획입자에 고정되는 항체를 포획항체(capture antibody)라고 하고, 표지물질과 연결되는 항체를 검출항체(detection antibody)라고 부른다. 샌드위치 면역분석법에서는 포획입자에 고정된 포획항체에 분석물질이 결합되고 다시 그 분석물질에 항체-표지 복합체가 결합되어 분석물질을 중심으로 샌드위치를 형성하게 될 수 있다.
상기 분석물질-표지 복합체는 저분자 물질의 검출 방법인 경쟁적 면역분석법(competitive immunoassay)에서 사용할 수 있는 분석시약으로서, 분석물질에 표지물질(labeling material)이 연결되어 있는 복합체일 수 있다. 경쟁적 면역분석법에서는 시료에 있는 분석물질과 분석물질-표지 복합체가 포획입자에 경쟁적으로 결합하게 될 수 있다.
상기 분석물질은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자, 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상을 포함할 수 있다.
상기 제 1 검출용액은 표지물질의 신호를 측정하는데 필요한 용액으로, 예를 들어, 표지물질이 효소일 경우에는 그 효소의 기질용액이 제 1 검출용액이 될 수 있고, 표지물질이 형광물질일 경우에는 형광을 측정하기에 용이한 완충용액이 될 수 있다. 또한 DNA나 RNA와 같은 핵산을 검출할 때는 polymerase chain reaction (PCR), Recombinase Polymerase Amplification (RPA), Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)와 같은 핵산 증폭에 필요한 시약 혼합물일 수 있다.
상기 제 1 튜빙 내의 완충용액은 포획입자에 비특이적으로 결합한 물질들을 세척하여 제거하기 위한 목적으로 사용되지만 필요에 따라 검출과정의 수행에 필요한 성분을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 박테리아나 바이러스에 들어있는 유전물질을 재조합효소 중합효소 증폭(Recombinase Polymerase Amplification, RPA) 방법으로 검출하는 경우, 완충용액에 세포나 바이러스 입자를 용해시켜 핵산을 방출시킬 수 있는 성분 또는 RPA 방법에 필요한 성분을 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 완충용액은 세포나 바이러스 입자를 용해시키는 성분으로 트리톤(Triton) X-100, Tween-20 또는 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(NP-40) 등의 계면활성제를 하나 포함할 수 있다. 또한, 상기 완충용액은 RPA 방법에 필요한 성분으로 마그네슘아세테이트를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 일 실시예에서, 상기 주사기의 시료 혼합물을 상기 제 1 튜빙 내부로 주입하는 단계; 상기 자석을 상기 제 1 튜빙을 따라 이동시키되, 상기 제 1 튜빙의 주사기가 연결되는 끝으로부터 제 1 검출튜브가 연결되는 끝으로 이동시킴으로써 상기 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 상기 완충용액에서 제 1 검출튜브와 가까운 끝 부분으로 이동시키는 단계; 상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액 가운데 5분의 1 내지 2분의 1에 해당하는 부피를 제 1 검출튜브로 주입하는 단계; 및 상기 제 1 검출튜브에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 분석물질 검출장치를 이용하는 검출방법은 상기 주사기의 시료 혼합물을 상기 제 1 튜빙 내부로 주입하는 단계(도 3), 상기 자석을 상기 제 1 튜빙을 따라 이동시킴으로써 상기 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 상기 완충용액으로 이동시키는 단계(도 4), 상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액의 일부를 제 1 검출튜브로 주입하는 단계(도 5), 및 제 1 검출튜브에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 자석은 0.1 cm/min 내지 5 cm/min의 속도로 이동시킬 수 있다. 자석 이동 속도가 너무 빠르면 포획입자의 이동 효율이 낮아지고 너무 느리면 검출시간이 길어지는 단점이 있다. 자석을 제 1 튜빙의 주사기 연결 끝으로부터 제 1 검출튜브 연결 끝으로 제 1 튜빙을 따라 이동시키면 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들이 제 1 튜빙 내부 완충용액 가운데 제 1 검출튜브와 가까운 쪽 끝 부분에 모이게 된다. 그리고 포획입자가 완충용액 내에서 이동하는 동안 비특이적으로 결합한 물질들은 차츰 떨어져나가 완충용액 끝에 도달했을 때는 세척이 완료된다. 따라서 상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액 가운데 5분의 1 내지 2분의 1에 해당하는 부피만 제 1 검출튜브로 주입하면 불순물은 제거하고 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 제 1 검출튜브로 이동시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 다른 일 실시예에서, 상기 주사기의 시료 혼합물을 상기 제 1 튜빙 내부로 주입하는 단계; 상기 자석을 상기 제 1 튜빙을 따라 이동시키되, 상기 제 1 튜빙의 주사기가 연결되는 끝으로부터 제 1 검출튜브가 연결되는 끝으로 이동시킴으로써 상기 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 상기 완충용액에서 제 1 검출튜브와 가까운 끝 부분으로 이동시키는 단계; 상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액 가운데 5분의 1 내지 2분의 1에 해당하는 부피를 제 1 검출튜브로 주입하는 단계; 상기 주사기의 플런저를 당겨 제 2 검출튜브에 있는 제 2 검출용액을 제 1 검출튜브로 이동시키는 단계(도 6)를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법을 제공한다.
본 발명은 상기 분석물질 검출장치에 제 2 검출용액이 들어있는 제 2 검출튜브, 및 상기 제 1 검출튜브와 상기 제 2 검출튜브를 연결하는 제 2 튜빙을 추가 포함할 수 있다(도 2). 이 때 상기 제 2 튜빙은 제 2 검출용액에 잠겨있도록 설치하여 주사기 플런저를 당길 때 음의 압력에 의해 이동하는 것일 수 있다.
분석물질이 세포 또는 바이러스에 있는 DNA 또는 RNA인 경우 완충용액은 트리톤(Triton) X-100, Tween-20, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(NP-40)와 같은 계면 활성제를 포함시킴으로써 세포나 바이러스 입자를 용해시킬 수 있다. 또한 RPA 방법에 의한 핵산 증폭은 마그네슘아세테이트가 더해지면서 시작되기 때문에 완충용액에 마그네슘아세테이트를 포함시켜 놓고 마그네슘아세테이트를 제외한 나머지 시약을 제 1 검출튜브에 담아 놓으면 핵산을 포함하는 완충용액이 첨가되면서 증폭반응이 시작되도록 할 수 있다. 상기 검출방법에 의해 포획입자로 세포나 바이러스 입자를 포획하여 완충용액으로 이동시키면 세포나 바이러스 입자가 용해되어 핵산이 방출된다. 다음으로 주사기를 밀어 핵산과 마그네슘아세테이트가 포함된 완충용액을 제 1 검출튜브로 이동시키면 RPA 반응이 시작되어 핵산을 검출할 수 있게 된다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
카탈라아제가 고정된 표지입자를 사용한 살모넬라균의 검출
본 실시예에서는 제 2 검출튜브와 제2 튜빙이 추가된 분석물질 검출장치와 카탈라아제(catalase)가 고정된 표지입자를 사용하여 기체 부피 측정 방법으로 살모넬라균(Salmonella typhimurium)을 검출하였다.
포획입자는 직경 300 nm인 자성입자(아모그린텍, 한국 김포)에 살모넬라균 항체를 고정시켜 제조하였다. 이 자성입자는 표면에 카르복시기를 가지고 있기 때문에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC]를 이용하는 화학적 방법으로 항체를 고정시켰다.
표지입자는 직경 100 nm이고 표면에 카르복시기가 있는 실리카나노입자(Microspheres-Nanospheres, Cold Spring, NY, USA)에 카탈라아제를 먼저 고정시킨 후 그 위에 다시 살모넬라균 항체를 고정시켜 제조하였다. 실리카나노입자 역시 표면에 카르복시기를 가지고 있기 때문에 EDC를 이용하는 화학적 방법으로 효소와 항체를 고정시켰다.
본 실시예에 따른 제 2 검출튜브와 제2 튜빙이 추가된 분석물질 검출장치의 사진을 도 7에 나타내었다. 제 1 튜빙은 투명한 Perfluoroalkoxy alkane (PFA) 관(내경 2 mm, 외경 3 mm, 길이 16 cm)을 사용하였다. 제 1 튜빙의 한 쪽 끝은 실리콘 마개를 통해 제 1 검출튜브에 연결되었고 다른 끝은 루어 어댑터(luer adaptor)에 연결되었다. 제 2 튜빙은 투명한 PFA 관(내경 1 mm, 외경 1.6 mm, 길이 21 cm)을 사용하였다. 제 2 튜빙의 한 쪽 끝은 실리콘 마개를 통해 제 1 검출튜브와 연결되었고 다른 끝은 제 2 검출튜브 바닥에 닿도록 연결되었다. 제 1 튜빙에서 루어 어댑터가 연결된 쪽에 완충용액(PBS, pH 7, 0.1% Triton X-100, 1 mg/mL BSA)을 0.3 mL 넣어주었다. 제 2 검출튜브에는 제 2 검출용액으로 MB-H2O2 (1 M H2O2, 0.033 mg/mL methylene blue, 0.05 M sodium phosphate, pH7.0) 용액을 0.1 mL 넣어주었다. 도 2에는 도시하지 않았지만 검출장치에 진동모터를 부착하여 검출과정에 진동을 가하였다.
도 8을 참조하여 상기 검출장치를 이용하여 살모넬라균을 검출하는 방법을 다음과 같이 설명한다.
1 mL 주사기에 시료 0.1 mL, 포획입자 10 μg(20 μL), 표지입자 10 μg(10 μL)을 넣은 후 주사기 플런저를 더 당겨 주시가 내에 약 0.5 mL 정도의 빈 공간이 있게 하였다. 이 때, 주사기 내에서는 포획입자-살모넬라균-표지입자 복합체가 형성된다.
주사기를 루어 어댑터에 결합시키고, 주사기를 툭툭 쳐서 시료 혼합물이 주사기 끝에 위치하도록 하였다. 주사기 플런저를 밀어 시료 혼합물을 제 1 튜빙으로 주입하였다(도 8a). 이 때, 주사기 내부에는 시료 혼합물 뒤로 빈 공간이 있기 때문에 시료를 주입한 후에 플런저를 더 밀어 시료 혼합물이 제 1 튜빙 내에서 어느 지점까지 들어가게 할지 위치를 조정할 수 있다.
다음으로 자석을 제 1 튜빙의 주사기 쪽에서 제 1 검출튜브쪽으로 이동시킴으로써 포획입자-살모넬라균-표지입자 복합체를 제 1 튜빙의 제 1 검출튜브 쪽 끝으로 모아 주었다(도 8b). 이 때 자석의 이동속도는 2.5 cm/min이었다.
다시 주사기 플런저를 밀어 제 1 튜빙에 있는 완충용액 가운데 제 1 검출튜브 쪽 끝 부분의 30 μL를 튜브로 주입하였다(도 8c). 여기에는 포획입자-살모넬라균-표지입자의 복합체가 포함되어 있다.
마지막으로 주사기 플런저를 당겨 제 2 검출용액(MB-H2O2)을 제 2 검출튜브에서 제 1 검출튜브로 이동시켰다(도 8d). 이 때 75 μL는 제 1 검출튜브로 주입되고, 15 μL는 제 2 튜빙에 남아있게 하였다. 포획입자-살모넬라균-표지입자의 복합체에 있는 카탈라아제에 의해 산소 기체가 발생하면서 제 2 튜빙 끝에 있는 MB-H2O2 용액이 제 2 튜빙을 통해 제 2 검출튜브 쪽으로 밀려나게 된다(도 8e). 이렇게 밀려난 거리를 측정함으로써 살모넬라균을 검출하였다.
서로 다른 수의 살모넬라균을 포함하는 시료를 상기 검출방법에 의해 검출한 결과 제 2 튜빙 끝에 있는 MB-H2O2 용액이 밀려난 거리가 살모넬라균의 수에 비례하는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 이 실험을 3회 반복하여 균의 수에 대해 밀려난 이동거리를 그래프로 그린 결과 102-105 CFU 사이에서 이동거리가 살모넬라균 수에 비례하는 것을 확인할 수 있었으며 최저 검출한계는 102 CFU 였다(도 10).
1000, 2000: 분석물질 검출장치
1100, 2100: 주사기
1110, 2110: 시료 혼합물
1111: 분석물질
1112: 포획입자
1200, 2200: 제 1 검출튜브
1210, 2210: 제 1 검출용액
1300, 2300: 제 1 튜빙
1310, 2310: 완충용액
1400, 2400: 자석
2500: 제 2 검출튜브
2510: 제 2 검출용액
2600: 제 2 튜빙

Claims (11)

  1. 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자를 포함하는 시료 혼합물이 들어있는 주사기;
    제 1 검출용액이 담겨있는 제 1 검출튜브;
    한 쪽 끝은 상기 주사기와 연결되고 다른 끝은 상기 제 1 검출튜브와 연결되며 내부에 완충용액이 담겨있는 제 1 튜빙;
    상기 제 1 튜빙의 외부에 위치하는 자석;
    제 2 검출용액이 들어있는 제 2 검출튜브; 및
    상기 제 1 검출튜브와 제 2 검출튜브를 연결하는 제 2 튜빙을 포함하고,
    상기 제 2 튜빙은 제 2 검출용액에 잠겨있는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 분석물질 검출장치는 진동모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 튜빙의 내부 부피는 상기 시료 혼합물과 상기 완충용액을 합한 부피보다 큰 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충용액은 상기 제 1 튜빙에서 주사기가 연결된 끝 부분에 들어있는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 시료 혼합물은 분석시약을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 분석시약은 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성입자에 고정시킨 표지입자,
    상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체, 및
    상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 검출용액은 효소의 기질 용액인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 검출용액은 핵산 증폭 시약인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충용액은 트리톤(Triton) X-100, Tween-20 및 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(NP-40) 중 선택된 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충용액은 마그네슘아세테이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
  11. 제 1 항에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로,
    상기 주사기의 시료 혼합물을 상기 제 1 튜빙 내부로 주입하는 단계;
    상기 자석을 상기 제 1 튜빙을 따라 이동시키되, 상기 제 1 튜빙의 주사기가 연결되는 끝으로부터 제 1 검출튜브가 연결되는 끝으로 이동시킴으로써 상기 포획입자와 상기 포획입자에 결합된 물질들을 상기 완충용액에서 제 1 검출튜브와 가까운 끝 부분으로 이동시키는 단계;
    상기 주사기의 플런저를 밀어 상기 완충용액 가운데 5분의 1 내지 2분의 1에 해당하는 부피를 제 1 검출튜브로 주입하는 단계;
    상기 주사기의 플런저를 당겨 제 2 검출튜브에 있는 제 2 검출용액을 제 1 검출튜브로 이동시키는 단계; 및
    상기 제 1 검출튜브에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
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