KR101949128B1 - 박테리아 검출 시스템 및 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자성 포획입자와 형광 표지입자를 박테리아에 결합시키고 자성 포획입자를 이동시킨 후 형광을 측정함으로써 박테리아를 검출하는 시스템에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 배양 단계를 활용하여 시료의 매트릭스 효과를 해소하고 시료에 포함된 한 개의 박테리아 세포를 신속하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

박테리아 검출 시스템 및 검출 방법{System and method for bacteria detection}

본 발명은 박테리아를 검출하는 시스템과 이 시스템을 이용하여 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것이다.

박테리아를 검출하는 기술은 식품 검사, 수질 검사, 질병 진단 등에 매우 중요하다. 특히, 식품의 안전성을 사전에 검사하여 식중독을 예방하거나 감염성 질병에 신속하게 대처할 수 있기 위해서는, 현장에서 간단한 장치와 간단한 방법을 이용하여 고감도로 검사할 수 있는 현장 신속 검사 방법이 필요하다.

식품위생법에 의하면, 식품 안전을 위해서는, 식품에서 식중독균이 하나라도 검출되면 안 되는 기준인 불검출 기준이 충족되어야 한다. 따라서, 식품의 안전성을 평가하기 위해서는, 식품 시료에 그 균이 한 개라도 있으면 검출할 수 있는 수준의 높은 감도가 필요하다.

전통적으로 박테리아를 고감도로 검출하기 위해 사용되는 방법은 시료를 고체 배지에 펼쳐 배양한 후 콜로니 수를 측정하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 최소한 하루 이상의 시간이 소요되기 때문에, 현장에서 신속하게 검사하기 어려운 단점이 있다.

신속한 검사를 위해서, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)와 같은 면역분석(immunoassay) 방법, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)과 같은 바이오센서를 이용하는 방법, 랩온어칩(lab-on-a-chip)에서 면역분석을 수행하는 방법 등이 개발되었다. 그러나, 대부분 복잡한 장비가 필요하여 실험실에서 검사가 이루어져야 하는 단점이 있었다.

최근에, 현장에서 사용할 수 있는 검출 방법으로, 정지 액체상에서 고체상인 입자를 이동시킴으로써 면역분석법을 시행하는 기술이 제안된 바 있다. 상기 기술은 정지액체상 랩온어칩(stationary liquid phase lab-on-a-chip)에서 입자(particle)를 이동시키는 간단한 방법을 사용하기 때문에, 현장 적용이 가능하다는 장점이 있다. 이 방법을 박테리아 검출에 이용할 경우에는, 자성입자(magnetic particle)에 항체가 고정된 포획입자(capture particle)와, 자성이 없고 표지기능이 있는 입자에 항체를 고정시킨 표지입자(labeling particle)를 사용하는 방법이 제안되었다.

그러나, 이 방법에서도 분석 방법이 갖는 감도의 한계와, 식품 시료에 포함된 물질이 검사에 영향을 미치는 매트릭스 효과(matrix effect)로 인하여, 식품 시료에 균이 한 개만 있어도 검출할 수 있는 수준의 감도에 도달하는 것은 어려웠다. 따라서, 어느 정도의 배양이 필요한데, 배양을 위한 별도의 배양기를 사용할 경우, 검사에 필요한 장치의 수가 늘어나 검사가 복잡해지고 비용이 많이 드는 단점이 있었다.

본 발명의 목적은 박테리아를 높은 감도로 신속하게 검출할 수 있는 간단한 시스템과, 이 시스템을 이용하여 한 개의 박테리아를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1실시형태에 따른 박테리아 검출 시스템은 검출 키트 및 검출 장치로 구성되고, 검출 키트는 목표 박테리아에 특이적인 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자; 목표 박테리아에 특이적인 수용체를 형광입자에 고정시킨 표지입자; 박테리아의 배양, 그리고 박테리아와 포획입자 및 표지입자 사이의 결합반응이 동시에 수행되는 튜브; 및 튜브가 결합되는 결합부, 형광 측정이 이루어지는 검출부, 결합부와 검출부를 연결하는 채널을 구비하는 카세트를 포함하며, 검출 장치는 베이스 플레이트; 베이스 플레이트에 설치된 제1지지대에 의해 진동 가능하게 지지되는 진동 플레이트; 진동 플레이트에 설치되어 진동 플레이트를 진동시키는 진동 모터; 진동 플레이트에 설치된 제2지지대에 의해 진동 가능하게 지지되고, 튜브를 수용하는 튜브 홀더 및 카세트를 수용하는 카세트 홀더를 구비하는 검출 플레이트; 카세트 하부에 이동 가능하게 설치되고, 박테리아와 포획입자 및 표지입자의 복합체를 카세트의 결합부로부터 검출부로 이동시키는 자석; 이동축, 이동축을 따라 이동 가능하게 설치되는 슬라이더, 슬라이더와 자석을 연결하는 연결부재를 구비하는 자석이동수단; 튜브의 온도를 일정하게 유지하거나 조절할 수 있는 온도조절수단; 및 검출부의 형광을 측정하는 형광측정수단을 포함할 수 있다.

본 발명의 제2실시형태에 따른 박테리아 검출 시스템은 검출 키트 및 검출 장치로 구성되고, 검출 키트는 목표 박테리아에 특이적인 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자; 목표 박테리아에 특이적인 수용체를 형광입자에 고정시킨 표지입자; 박테리아의 배양이 이루어지는 배양튜브; 박테리아와 포획입자 및 표지입자 사이의 결합반응이 수행되는 반응튜브; 및 반응튜브가 결합되는 결합부, 형광 측정이 이루어지는 검출부, 결합부와 검출부를 연결하는 채널을 구비하는 카세트를 포함하며, 검출 장치는 베이스 플레이트; 베이스 플레이트에 설치된 제1지지대에 의해 진동 가능하게 지지되는 진동 플레이트; 진동 플레이트에 설치되어 진동 플레이트를 진동시키는 진동 모터; 진동 플레이트에 설치된 제2지지대에 의해 진동 가능하게 지지되고, 배양튜브와 반응튜브를 수용하는 튜브 홀더 및 카세트를 수용하는 카세트 홀더를 구비하는 검출 플레이트; 카세트 하부에 이동 가능하게 설치되고, 박테리아와 포획입자 및 표지입자의 복합체를 카세트의 결합부로부터 검출부로 이동시키는 자석; 이동축, 이동축을 따라 이동 가능하게 설치되는 슬라이더, 슬라이더와 자석을 연결하는 연결부재를 구비하는 자석이동수단; 배양튜브와 반응튜브의 온도를 일정하게 유지하거나 조절할 수 있는 온도조절수단; 및 검출부의 형광을 측정하는 형광측정수단을 포함할 수 있다.

본 발명에서 카세트의 검출부가 결합부에 비해 높아지도록, 검출 플레이트는 수평면에 대해 5 내지 45도 경사진 상태로 설치될 수 있다.

본 발명에서 자석이동수단의 이동축은 검출 플레이트와 평행하게 수평면에 대해 5 내지 45도 경사진 상태로 설치될 수 있다.

본 발명에서 베이스 플레이트와 진동 플레이트를 연결하는 제1지지대는 플렉서블한 재질로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 진동 플레이트와 검출 플레이트를 연결하는 제2지지대는 플렉서블한 재질로 이루어질 수 있다.

본 발명의 제1실시형태에 따른 박테리아 검출 방법은 본 발명의 제1실시형태에 따른 박테리아 검출 시스템을 이용하며, 튜브에 목표 박테리아의 배지, 포획입자, 표지입자 및 시료를 넣고 튜브 홀더에 장착한 후, 20분 내지 3시간 동안 진동을 가하는 단계; 튜브를 카세트에 결합시킨 후, 카세트를 카세트 홀더에 장착하는 단계; 자석을 이동시켜 박테리아와 포획입자 및 표지입자의 복합체를 카세트의 결합부로부터 검출부로 이동시키는 단계; 및 형광측정수단을 이용하여 검출부의 형광을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 제2실시형태에 따른 박테리아 검출 방법은 본 발명의 제2실시형태에 따른 박테리아 검출 시스템을 이용하며, 배양튜브에 목표 박테리아의 배지와 시료를 넣고 튜브 홀더에 장착한 후 20분 내지 3시간 동안 진동을 가하는 단계; 배양튜브의 배양액 중 일부를 취한 후, 포획입자 및 표지입자와 함께 반응튜브에 넣고 튜브 홀더에 장착한 다음, 10 내지 30분 동안 진동을 가하는 단계; 반응튜브를 카세트에 결합시키고, 카세트를 카세트 홀더에 장착하는 단계; 자석을 이동시켜 박테리아와 포획입자 및 표지입자의 복합체를 카세트의 결합부로부터 검출부로 이동시키는 단계; 및 형광측정수단을 이용하여 검출부의 형광을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 정지액체상 랩온어칩을 이용한 박테리아 검출 방법은 박테리아를 배양한 후 검출하기 때문에, 시료에 박테리아가 한 개만 포함되어 있어도 검출이 가능하게 되는 효과가 있다.

또한, 본 발명에서는 배양단계와 결합단계를 분리하여 시행함으로써, 매트릭스 효과가 큰 시료에서도 균을 검출할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에서는 배양 단계와 검출 단계가 간편하게 연결됨으로써, 복잡한 실험장비나 어려운 기술을 필요로 하지 않기 때문에, 현장에서 신속하게 검사하는데 응용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용되는 포획입자와 표지입자를 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명에서 사용되는 튜브와 검출 카세트를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에서 사용되는 검출장치와 검출키트로 구성된 검출 시스템을 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 카세트와 결합시킬 수 있는 밀폐된 튜브에 들어있는 배지에 균을 접종하고 포획입자와 표지입자를 넣은 상태에서 검출장치에서 진동시키면서 배양하는 검출조건에서도, 배양에 일반적으로 사용하는 표준조건과 동일한 속도로 균이 자라는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 배양한 균의 경우, 시료에 한 개의 균만 있어도 검출이 가능하다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 균을 정량적으로 검출할 수 있는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 배양시간에 따라 형광신호가 얼마나 증폭되는지 보여주는 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 검출키트와 검출장치로 이루어진 고감도 박테리아 검출 시스템에 관한 것이다.

[검출 키트]

도 1 및 2를 참고하면, 검출키트는 시료를 넣고 검출이 이루어지는 키트로서, 포획입자, 표지입자, 튜브, 카세트로 구성될 수 있다.

도 1의 좌측 도면을 참고하면, 포획입자는 검출대상이 되는 박테리아를 포획하여 이동시키는 역할을 하며, 이러한 기능을 수행하도록 하기 위해, 박테리아에 특이적인 수용체를 자성입자에 고정시켜 제조할 수 있다. 수용체와 자성입자는 적절한 링커(EDC 등)를 통해 화학적 방법으로 고정될 수 있다. 자성입자의 크기는 자석으로 신속하게 포집할 수 있도록, 직경이 0.1 내지 5 ㎛인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 박테리아에 특이적인 수용체의 대표적인 예로는 항체를 들 수 있다.

도 1의 우측 도면을 참고하면, 표지입자는 박테리아에 결합하여 균의 존재를 나타내는 역할을 하며, 표지기능이 있는 입자에 박테리아에 특이적인 수용체를 고정시켜 제조할 수 있다. 수용체와 표지기능입자는 적절한 링커(EDC 등)를 통해 화학적 방법으로 고정될 수 있다. 입자의 표지기능이라는 것은 입자의 존재를 정량적으로 측정할 수 있게 해주는 기능을 의미한다. 표지기능을 갖는 대표적인 예로는, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)와 같은 효소를 고정시킨 입자나 형광물질을 포함하고 있는 형광입자를 들 수 있다. 특히, 유로퓸(europium)과 같은 전이금속 이온으로 만들어진 형광물질은 안정성이 높고, 여기 파장(excitation wavelength) 및 방사 파장(emission wavelength)의 차이가 커서, 적은 양도 검출이 가능하다. 따라서, 유로퓸 형광입자에 수용체로서 항체를 고정시켜 표지입자로 사용하면, 고감도 검출이 가능하다. 따라서, 여기에서는 유로퓸 형광입자를 표지입자로 사용하는 경우를 예로 들어 설명하겠다. 형광입자의 크기는 예를 들어 0.1 내지 5 ㎛일 수 있다.

박테리아는 대부분 1 ㎛ 정도의 크기를 갖고 있기 때문에, 그 표면에 포획입자와 표지입자가 동시에 결합할 수 있다. 박테리아를 포획하기 위해서, 한 개의 포획입자만 결합하면 되기 때문에, 최대의 감도를 얻기 위해서는, 포획입자는 박테리아에 최소로 결합하고, 표지입자는 박테리아에 최대로 많이 결합하도록, 두 입자의 비율을 최적화하는 것이 바람직하다. 포획입자 대 표지입자의 비율은 예를 들어 중량비율 또는 부피비율로서 1:2 내지 1:5일 수 있다.

도 2의 좌측 도면을 참고하면, 튜브에서는 박테리아가 배양되면서, 동시에 박테리아에 두 종류 입자(포획입자와 표지입자)가 결합하는 과정이 진행될 수 있다. 이를 위해, 튜브에 박테리아를 배양하는 배지(culture medium), 박테리아가 포함된 시료, 포획입자 및 표지입자를 넣은 후, 튜브에 진동을 가할 수 있다. 고감도 검출을 위해, 배지와 시료 및 포획입자와 표지입자를 포함한 전체의 부피는, 포획입자와 표지입자의 결합이 원활하게 이루어지도록, 10 mL 이하로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제1실시형태에 따르면, 하나의 튜브에서 박테리아의 배양, 그리고 박테리아와 포획입자 및 표지입자 사이의 결합반응이 동시에 수행될 수 있다. 이 경우, 하나의 튜브에 배지, 시료, 포획입자 및 표지입자가 모두 투입될 수 있다.

본 발명의 제2실시형태에 따르면, 튜브는 배양튜브 및 반응튜브와 분리되며, 배양튜브에서는 배지와 시료만 투입되어 박테리아의 배양만이 이루어지고, 반응튜브에서는 배양액의 일부와 입자들이 투입되어 박테리아와 포획입자 및 표지입자 사이의 결합반응이 수행될 수 있다.

도 2의 중앙 도면을 참고하면, 카세트는 한쪽 말단부에 배치되는 결합부; 다른 한쪽 말단부에 배치되는 검출부; 및 결합부와 검출부를 연결하는 채널을 포함하는 구조를 가질 수 있다.

도 2의 우측 도면을 참고하면, 튜브의 뚜껑을 제거하고 카세트의 결합부에 결합시킨 후, 튜브 내부에 형성된 포획입자-박테리아-표지입자 복합체를 검출부로 이동시킨 다음, 검출부의 형광을 측정함으로써, 박테리아의 검출이 이루어질 수 있다.

결합부는 뚜껑이 제거된 튜브의 입구 부분과 결합함으로써, 튜브의 공간과 카세트 내부 공간을 연결시키는 부분이다. 결합부는 판상의 카세트 본체의 한쪽 말단부에서 수직방향으로 연장되어 형성될 수 있고, 개방 또는 밀폐구조의 원통형으로 구성될 수 있으며, 튜브 직경과 동일 또는 유사한 직경을 가질 수 있다.

검출부는 형광 측정이 이루어지는 곳으로, 판상의 카세트 본체의 다른 한쪽 말단부에서 형성될 수 있고, 개방 또는 밀폐구조의 원통형으로 구성될 수 있으며, 결합부보다 작은 크기를 가질 수 있다. 형광 표지입자를 사용할 경우에는, 표지입자를 집중시켜 감도를 높일 수 있도록, 검출부 크기(직경)를 작게 하는 것이 바람직하다.

채널은 결합부와 검출부를 연결하는 유로 구조를 가질 수 있고, 개방 또는 밀폐된 긴 관형 구조로 구성될 수 있으며, 결합부와 검출부보다 작은 크기를 가질 수 있다. 포획입자-박테리아-표지입자 복합체를 제외한 다른 물질들이 튜브로부터 검출부로 이동하는 것을 방지하기 위해, 결합부와 검출부는 좁은 채널로 연결시키는 것이 바람직하다.

또한, 포획입자-박테리아-표지입자 복합체가 이동할 때, 포획입자에 비특이적으로 결합한 물질들을 효과적으로 제거하기 위해, 채널 중간에 세척 완충용액이 들어있는 세척공간을 추가할 수도 있다. 세척공간은 채널의 중앙 부위에 하나 또는 복수 개로 형성될 수 있고, 개방 또는 밀폐구조의 다면체(도 2의 평면도에 마름모 형태로 표시)로 구성될 수 있으며, 결합부보다 작고 채널과 검출부보다 큰 크기를 가질 수 있다.

시료의 매트릭스 효과가 심하여 검출이 어려울 때에는, 시료의 부피를 줄이는 대신에, 본 발명의 제2실시형태에 따라 배양단계와 결합반응단계를 분리하여 진행할 수 있다.

먼저, 배양튜브에 배지와 시료만 넣고 진동을 가함으로써 박테리아를 배양한다. 이후, 배양액의 일부를 취하여 배지, 포획입자, 표지입자와 함께 반응튜브에 넣고 진동을 가한다. 이후, 반응튜브를 카세트에 결합시켜 검출과정을 진행한다.

이러한 방법이 시료의 부피를 줄이는 것보다 나은 이유는 다음과 같다. 식품 시료에서 박테리아를 검출할 때에는 대개 시료 0.1 mL를 사용한다. 그러나, 매트릭스 효과가 심한 시료 0.1 mL를 사용하면, 입자들의 비특이적인 응집이 일어나 정확한 검사가 어렵다. 이때 매트릭스 효과를 없애기 위해, 원래 부피(0.1 mL) 대비 10분의 1인 0.01 mL를 검사에 사용하면, 시료의 대표성이 약화된다. 예를 들어, 0.1 mL에 한 개의 박테리아가 있을 경우, 0.1 mL를 사용하면 박테리아가 존재하는 것으로 판정되겠지만, 0.01 mL를 사용하면 90%의 확률로 박테리아가 없는 것으로 판정될 수 있다는 것이다. 그러나, 0.1 mL를 0.9 mL 배지에 넣어 배양함으로써 한 개의 균을 10배 이상으로 증식시킨 후, 증식된 배양액 1 mL 중 0.1 mL를 취하여 검출에 사용하면, 박테리아가 있는 것으로 판정될 것이다. 그러나, 최종 검출용 용액에 들어있는 최초 시료 부피는 0.01 mL이기 때문에, 매트릭스 효과를 10분의 1로 줄일 수 있다.

이러한 검출방법에서는 한 개의 균을 검출하기 위해 박테리아를 배양하는 단계를 포함시킬 수 있다. 박테리아의 배양을 위해서는, 배양튜브에 배지와 시료를 넣고 온도가 조절되는 진탕 배양기(shaking incubator)에서 진탕하는 방법이 사용될 수 있다. 그러나, 이와 같이 별도의 진탕 배양기를 사용할 경우, 검사에 필요한 기기의 수가 많아지고 비용이 증가하는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명에서는 박테리아의 배양, 박테리아와 입자들의 결합, 입자의 이동, 형광 측정의 전 과정을 수행할 수 있는 검출 시스템을 고안하였다.

[검출 장치/시스템]

도 3을 참고하면, 본 발명에 따른 검출시스템은 검출키트 및 검출장치로 구성될 수 있다. 검출키트는 도 2에 도시된 튜브 및 카세트로 구성될 수 있다. 검출장치는 베이스 플레이트, 검출 플레이트, 진동 플레이트, 온도조절수단, 자석, 자석이동수단(이동축 등), 진동 모터, 지지대, 형광측정수단 등을 구비할 수 있다. 검출시스템의 각 구성요소(부품)들은 개폐 가능한 밀폐 챔버나 박스에 수용될 수 있다.

베이스 플레이트는 가장 하단에 설치되어 다른 부품들을 지지하는 역할을 한다.

검출 플레이트는 튜브를 수용하는 튜브 홀더 및 카세트를 수용하는 카세트 홀더를 구비할 수 있고, 이에 따라 카세트에서 수행되는 입자 이동 과정뿐만 아니라, 튜브에서 수행되는 배양 및 결합반응까지 수행할 수 있다. 따라서, 배양을 위해 별도의 진탕 배양기를 사용하지 않고, 검출장치에서 검출에 필요한 모든 과정을 수행할 수 있다.

튜브 홀더 및 카세트 홀더의 구조는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 홈 구조, 홀 구조, 돌기 구조 및/또는 걸림 구조 등으로 구성될 수 있으며, 튜브 및 카세트를 고정시키기 위한 별도의 고정수단을 구비할 수 있다. 튜브 홀더 및 카세트 홀더는 각각 복수 개로 설치되어 복수의 튜브 및 카세트를 수용할 수 있다. 본 발명의 제2실시형태에 따르면, 튜브 홀더는 배양튜브 홀더 및 반응튜브 홀더로 분리될 수 있다.

검출 플레이트는 카세트 홀더에 수용된 검출 카세트의 검출부가 결합부에 비해 높아지도록, 수평면을 기준으로 5 내지 45도 경사진 상태로 설치될 수 있다. 이러한 경사구조에 의해, 포획입자-박테리아-표지입자 복합체를 제외한 다른 물질들이 결합부로부터 검출부로 불필요하게 이동하는 것을 방지할 수 있다.

진동 플레이트는 검출 플레이트와 베이스 플레이트 사이에 설치되어 있으며, 진동 모터가 부착되어 있어 검출 플레이트에 진동을 가하는 역할을 한다. 검출 플레이트에 여러 개의 카세트와 튜브가 수용될 경우, 모든 카세트와 튜브에 진동이 고르게 가해지도록, 진동 플레이트에 두 개 이상의 진동 모터를 부착할 수도 있다. 진동 모터의 설치 위치는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 진동 플레이트의 하면에 설치될 수 있다. 진동 모터의 진동 세기 등은 특별히 제한되지 않고 적절하게 설정할 수 있다.

진동 플레이트 및 검출 플레이트 사이에는 복수의 지지대(제2지지대)가 설치되어 두 플레이트를 연결하고 검출 플레이트를 지지할 수 있는데, 검출 플레이트가 경사진 상태로 설치되도록, 도면에 도시된 바와 같이, 한쪽 지지대의 높이는 낮고 다른 한쪽 지지대의 높이는 높을 수 있다. 적어도 하나의 제2지지대는 높이 조절 가능하게 구성될 수도 있다.

베이스 플레이트와 진동 플레이트 사이에도 복수의 지지대(제1지지대)가 설치되어 두 플레이트를 연결하고 진동 플레이트를 지지할 수 있는데, 제1지지대는 스프링, 실리콘, 스펀지와 같이 플렉서블한 재질로 구성함으로써, 진동 플레이트가 베이스 플레이트와 독립적으로 진동할 수 있게 하는 것이 바람직하다. 진동 플레이트와 검출 플레이트 사이도 플렉서블한 재질의 지지대(제2지지대)로 연결할 경우, 검출 플레이트를 더욱 유연하게 진동시킬 수 있다.

검출 플레이트의 카세트 홀더에 카세트를 장착한 후 튜브로부터 검출부로 입자를 이동시키기 위해서는, 자석을 결합부로부터 검출부로 이동시켜야 한다. 이를 위해 검출 플레이트 또는 카세트 하단부에 자석을 설치하고, 이 자석을 이동시킬 수 있는 이동수단을 설치할 수 있다. 포획입자에 충분한 자력을 가하기 위해, 자석은 카세트에 최대한 가깝게 설치하는 것이 좋다. 자석의 크기와 개수 및 자석의 세기는 특별히 제한되지 않고 적절하게 설정할 수 있다.

자석 이동수단은 리니어 액츄에이터(linear actuator)를 사용할 수 있다. 리니어 액츄에이터는 이동축, 이동축을 따라 이동하는 슬라이더, 슬라이더와 자석을 연결하는 연결부재 등을 구비할 수 있다. 슬라이더의 이동은 모터에 의해 구동될 수 있고, 이동축은 검출 플레이트의 경사각과 동일한 각도로 경사지게 배치될 수 있다. 즉, 이동 축은 수평면에 대해 5 내지 45도 경사진 상태로 설치될 수 있고, 검출 플레이트와 평행하게 설치될 수 있다. 리니어 액츄에이터는 진동 플레이트의 하부까지 연장되어 설치될 수 있는데, 이 경우 자석의 이동 가능하도록 진동 플레이트에는 이동경로를 따라 긴 구멍이 형성될 수 있다.

입자를 검출부로 이동시킨 후 검출부의 형광을 측정하기 위해서는, 별도의 형광측정장치를 사용할 수도 있지만, 검출장치 내에 형광측정수단을 포함시켜 입자 이동 후 형광을 측정하는 단계까지 자동으로 진행되게 하는 것이 더 바람직하다. 형광측정수단으로는 형광측정기(fluorimetry) 등을 사용할 수 있다.

박테리아 배양 시간을 단축시키기 위해서는, 튜브 홀더에 장착된 튜브의 온도를 박테리아 배양을 위한 최적 온도로 일정하게 유지할 수 있는 온도조절수단이 필요하다. 온도조절수단은 통상의 가열장치 및/또는 냉각장치를 포함할 수 있다.

[검출 방법]

이상의 박테리아 검출 시스템을 이용하여 한 개의 박테리아를 검출하는 방법은 다음과 같다.

시료의 매트릭스 효과가 심하지 않을 경우에는, 본 발명의 제1실시형태에 따라 배양과 결합반응이 동시에 일어나게 함으로써, 검출과정을 단순하게 하는 것이 바람직하다.

먼저, 튜브에 목표 박테리아의 배지, 포획입자, 표지입자 및 시료를 넣고, 검출 플레이트의 튜브 홀더에 튜브를 장착한 후 진동을 가한다. 이때 박테리아가 증식하는 동시에, 포획입자와 표지입자가 박테리아에 결합하여 포획입자-박테리아-표지입자 복합체가 형성된다. 이 단계에 소요되는 시간은 박테리아와 표지입자의 특성에 따라 달라질 수 있지만, 유로퓸 형광입자를 표지입자로 사용할 경우, 대부분의 박테리아가 한 개만 있어도 검출할 수 있기 때문에 20분이면 충분하다. 그러나, 일부 박테리아는 한 개만 있을 경우 검출이 어렵기 때문에 증식이 필요하며, 이때에는 증식속도에 따라 3시간까지 소요될 수 있다.

다음으로, 튜브를 카세트에 결합시켜 튜브의 공간이 카세트 내부 공간과 연결되게 한 후, 카세트를 카세트 홀더에 장착한다. 다음으로, 자석을 튜브가 연결된 결합부 아래 위치시켜 포획입자-박테리아-표지입자 복합체를 모은다. 그 다음에, 자석을 검출부 아래로 이동시켜 포획입자-박테리아-표지입자 복합체를 검출부로 이동시킨다. 이때, 검출부로 이동하는 표지입자의 양은 박테리아의 수에 비례한다. 마지막으로, 형광측정수단을 이용하여 검출부의 형광을 측정함으로써, 박테리아를 정량적으로 검출할 수 있다.

시료의 매트릭스 효과가 심한 경우에는, 튜브에 목표 박테리아의 배지, 포획입자, 표지입자, 시료를 함께 넣고 진동을 가하면, 입자들이 비특이적으로 응집되어 검출이 어려울 수 있기 때문에, 본 발명의 제2실시형태에 따라 배양과 결합반응을 분리하는 것이 좋다.

먼저, 배양튜브에 배지와 시료만 넣고, 검출 플레이트의 튜브 홀더에 장착한 후, 진동을 가함으로써 박테리아를 증식시킨다. 증식 시간은 박테리아가 10±2배로 증식되는데 필요한 시간으로 정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 한 번 분열하는데 30분이 걸리는 박테리아의 경우, 2시간 증식시키면 한 개의 박테리아가 4번 분열하여 16개가 된다. 이 단계에서는 박테리아의 증식속도에 따라 3시간까지 소요될 수 있다.

다음으로, 배양튜브 용액(배양액) 가운데 일부를 취하여 배지, 포획입자, 표지입자와 함께 반응튜브에 넣고, 검출 플레이트의 튜브 홀더에 장착한 후 진동을 가함으로써, 결합반응에 의해 포획입자-박테리아-표지입자 복합체가 형성되게 한다. 이 단계에서는 박테리아 증식이 필요 없기 때문에 20분이면 충분하다. 다음으로, 반응튜브를 카세트에 결합시킨 후, 그 다음부터는 위의 방법과 동일하게 진행한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다.

[실시예]

실시예 1: 배양에 의한 장염 비브리오균 검출조건 최적화

본 실시예에서는 포획입자와 표지입자를 이용하여 배양방법으로 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus) 균을 검출하는 조건을 최적화하였다.

포획입자는 직경 300 nm의 자성입자(아모그린텍, 한국 김포)에 장염 비브리오균 항체를 고정시켜 제조하였다. 이 자성입자는 표면에 카르복시기를 가지고 있기 때문에, EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride]를 이용하는 화학적 방법으로 항체를 고정시켰다.

표지입자는 직경 300 nm의 유로퓸 형광입자(Thermo Scientific, USA)에 장염 비브리오균 항체를 고정시켜 제조하였다. 유로퓸 형광입자 역시 표면에 카르복시기를 가지고 있기 때문에, EDC와 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)를 이용하는 화학적 방법으로 항체를 고정시켰다.

이 방법에서는 검출을 위한 카세트의 한 쪽에 포획입자, 표지입자, 그리고 균을 포함하는 시료를 넣고 결합시킨 후, 포획입자를 카세트의 다른 쪽, 즉 검출부로 이동시키고 검출부의 형광을 측정하였다. 또한, 도 3과 같이, 카세트를 장착한 후 결합반응을 촉진하고, 포획입자를 이동시키며, 용액을 균질하게 만들어주는 검출장치를 사용하였다. 검출장치에는 자석을 움직일 수 있는 리니어 액츄에이터와, 진동을 가할 수 있는 진동모터가 포함되었다. 또한, 형광측정수단을 포함시켜 전 과정을 자동화시켰다.

장염 비브리오균의 배양을 위해서, 3% NaCl이 첨가된 영양 배지(Nutrient broth, Difco)를 사용하였다. 장염 비브리오균 항체는 앱클론(한국)에 의뢰하여 제작하였다.

호기성균을 배양할 때 일반적으로 사용하는 조건은 공기가 통하는 배양튜브에 담긴 배지를 접종한 후, 진탕배양기에서 진탕하는 것이다. 진탕이 필요한 이유는 분열하는 세포를 고르게 분산시키고, 세포에 필요한 산소를 원활하게 공급하기 위한 것이다. 그러나, 이와 같이 별도의 진탕배양기를 사용할 경우, 검사에 필요한 비용이 증가하고 휴대하기 어렵게 된다. 그리고, 배양 후에 포획입자와 표지입자를 넣고 결합반응을 수행하면, 검출단계가 더 복잡해지고 시간도 더 많이 소요된다.

따라서, 본 발명의 방법에 따라 배양할 때 포획입자와 표지입자를 넣고, 도 3에 도시된 검출장치의 진동을 이용하여 배양과정을 수행할 수 있는지 확인하기 위해, 두 종류 배양조건(표준조건 및 검출조건)에서 장염 비브리오균을 배양하였다. 첫 번째 표준조건(standard condition)은 공기가 통하는 일반적인 배양튜브에 들어있는 배지에 균을 접종하고, 진탕배양기에서 진탕하면서 배양한 것이다. 두 번째 검출조건(detection condition)은 본 발명의 방법에 따라 카세트와 결합시킬 수 있는 밀폐된 튜브에 들어있는 배지에 균을 접종하고, 포획입자와 표지입자를 넣은 상태에서 검출장치에서 진동시키면서 배양한 것이다. 두 실험 모두 온도는 37도로 유지하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 것처럼, 두 조건에서 동일한 속도로 균이 증식되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 방법에 따라 밀폐된 튜브에 배지와 입자들이 모두 들어있는 상태에서 진동을 가하는 방법으로도, 일반적인 배양조건과 동일하게 배양이 가능하다는 것을 의미한다.

실시예 2: 장염 비브리오균 고감도 검출

본 실시예에서는 장염 비브리오 균을 고감도로 검출하는 실험을 수행하였다.

먼저, 배양하지 않은 상태에서 검출 가능한 최저 균수를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 장염 비브리오균을 배양한 후, 7 cfu/mL 농도로 묽혔다. 이 농도는 고체배지에서의 콜로니 측정방법으로 확인하였다. 튜브에 묽힌 균 0.1 mL, 비브리오균 배지 2 mL, 포획입자 10 ㎍(10 ㎕), 표지입자 30 ㎍(30 ㎕)을 넣고, 검출장치에서 20분 동안 진동을 가하였다. 검출 카세트에 튜브를 연결하고 검출장치에서 입자를 검출부로 이동시켰다. 마지막으로 검출부의 형광을 측정하였다.

이 실험을 12회 실시한 결과, 도 5에서 보는 것처럼, 2회는 균이 없는 대조 실험과 동일한 형광 값을 보여주었고, 나머지 10회는 뚜렷하게 구별되는 수준으로 높은 형광 값을 보여주었다. 시료의 균 농도가 7 cfu/mL이기 때문에, 0.1 mL에는 균이 하나 포함되거나, 하나도 포함되지 않을 수 있다. 따라서, 10회의 실험에서는 균이 하나 포함되어 있었고, 2회의 실험에서는 균이 하나도 포함되지 않았던 것으로 생각된다. 이 결과는 배양한 균의 경우 시료에 한 개의 균만 있어도 검출이 가능하다는 것을 보여준다.

또한, 이 방법으로 0.1 mL의 부피에 한 개의 균으로부터 최대 5,000개까지 서로 다른 개수의 균을 포함하는 시료를 만든 후, 포획입자 10 ㎍(10 ㎕), 표지입자 30 ㎍(30 ㎕)과 함께 비브리오균 배지 2 mL에 더하고, 위와 동일한 방법으로 검출실험을 하였다. 그 결과, 도 6에서 보는 것처럼, 균수에 비례하여 형광 값이 증가하여 균을 정량적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

그러나, 실제 시료는 오염물질이 포함되어 있는 경우가 많기 때문에, 균이 없는 대조 실험의 값이 높아지고 오차가 커져서 한 개의 균을 정확하게 검출하기 어려워진다. 따라서, 배양을 통해 균을 증식시킬 때, 신호를 얼마나 증폭시킬 수 있는지 실험하였다. 0.1 mL의 부피에 50개의 균을 포함하도록 시료를 만들고, 이로부터 최대 5,000개까지 서로 다른 개수의 균을 포함하는 시료를 만든 후, 포획입자 10 ㎍(10 ㎕), 표지입자 30 ㎍(30 ㎕)과 함께 비브리오균 배지 2 mL에 더하고, 진동을 가하는 시간을 30분부터 180분까지 변화시키면서 검출실험을 하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 것처럼, 30분을 기준으로 할 때, 60분, 90분, 120분, 180분에 형광신호가 각각 1.5배, 2배, 4배, 15배 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같이 시료가 다른 물질로 심하게 오염된 경우에도, 단순히 진동을 가하는 시간(배양시간)을 변화시킴으로써, 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 배양을 3시간 하는 경우에도 검출에 소요된 전체 시간은 3시간 10분 정도이기 때문에, 기존의 방법에 비해 훨씬 신속하고 간단하게 시료에 포함된 1개의 박테리아를 검출할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 목표 박테리아에 특이적인 수용체를 자성입자에 고정시킨 포획입자; 목표 박테리아에 특이적인 수용체를 형광입자에 고정시킨 표지입자; 박테리아의 배양이 이루어지는 배양튜브; 박테리아와 포획입자 및 표지입자 사이의 결합반응이 수행되는 반응튜브; 및 반응튜브가 결합되는 결합부, 형광 측정이 이루어지는 검출부, 결합부와 검출부를 연결하는 채널을 구비하는 카세트를 포함하는 검출 키트; 및
   베이스 플레이트; 베이스 플레이트에 설치된 제1지지대에 의해 진동 가능하게 지지되는 진동 플레이트; 진동 플레이트에 설치되어 진동 플레이트를 진동시키는 진동 모터; 진동 플레이트에 설치된 제2지지대에 의해 진동 가능하게 지지되고, 배양튜브와 반응튜브를 수용하는 튜브 홀더 및 카세트를 수용하는 카세트 홀더를 구비하는 검출 플레이트; 카세트 하부에 이동 가능하게 설치되고, 박테리아와 포획입자 및 표지입자의 복합체를 카세트의 결합부로부터 검출부로 이동시키는 자석; 이동축, 이동축을 따라 이동 가능하게 설치되는 슬라이더, 슬라이더와 자석을 연결하는 연결부재를 구비하는 자석이동수단; 배양튜브와 반응튜브의 온도를 일정하게 유지하거나 조절할 수 있는 온도조절수단; 및 검출부의 형광을 측정하는 형광측정수단을 포함하는 검출 장치로 구성되되,
   카세트의 검출부가 결합부에 비해 높아지도록, 검출 플레이트는 수평면에 대해 5 내지 45도 경사진 상태로 설치되고, 자석이동수단의 이동축은 검출 플레이트와 평행하게 수평면에 대해 5 내지 45도 경사진 상태로 설치되며, 베이스 플레이트와 진동 플레이트를 연결하는 제1지지대 및 진동 플레이트와 검출 플레이트를 연결하는 제2지지대는 플렉서블한 재질로 이루어진 박테리아 검출 시스템을 이용하며,
   배양튜브에 목표 박테리아의 배지와 시료를 넣고 튜브 홀더에 장착한 후 20분 내지 3시간 동안 진동을 가하면서 배양하는 단계;
   배양튜브의 배양액 중 일부를 취한 후, 포획입자 및 표지입자와 함께 반응튜브에 넣고 튜브 홀더에 장착한 다음, 10 내지 30분 동안 진동을 가하면서 반응시키는 단계;
   반응튜브를 카세트에 결합시키고, 카세트를 카세트 홀더에 장착하는 단계;
   자석을 이동시켜 박테리아와 포획입자 및 표지입자의 복합체를 카세트의 결합부로부터 검출부로 이동시키는 단계; 및
   형광측정수단을 이용하여 검출부의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 박테리아 검출 방법.

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