JPH08154700A - 細菌の検出方法及び検出装置 - Google Patents
細菌の検出方法及び検出装置Info
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Abstract
する細菌に感染させ、ファージに施した標識に由来する
信号を検出することを特徴とする。RI、酵素、レポー
ター遺伝子を標識として用いることができる。この方法
は、被検体中の細菌に標識したファージを感染させる被
検体処理部と、ファージの標識に由来する信号を検出す
る検出器と、この検出器からの信号を処理するデータ処
理部とを具備する装置を用いて実施することができる。 【効果】大量の試料を短期間に、かつ簡便に処理するこ
とが可能であって、より少数の細菌をも検出することが
可能な高い感度を有し、かつ目的とする細菌を特異的に
検出することが可能な高い精度を有する。
Description
この検出方法を用いる細菌の検出装置に関する。
発酵など我々の生活に不可欠な役割を果たすものも多く
存在するが、動植物の病原や食品の腐敗の原因としてな
ど、我々の生活に悪影響を及ぼすものもまた数多く存在
する。後者の我々の生活に悪影響を及ぼす細菌について
は、その被害を最小限に止めるために、これらの原因と
なる特定の細菌を早期に検出して対処しなければならな
い。
い、免疫学的手法や分子遺伝学的手法を用いた細菌の検
出方法が報告されている。そのような検出法の例とし
て、ファージ増殖法、ELISA法、レポーター遺伝子
を用いる方法などを挙げることができる。
を、例えば水田水などの試料に添加し、試料のファージ
力価を測定することにより植物病原細菌等の対象細菌の
検出を行なう方法である。ファージは細菌に感染するウ
イルスであり、DNAもしくはRNAからなる核酸がタ
ンパク質からなる構造物で被覆された形態をとる。ファ
ージ力価とは、通常、このファージ粒子の試料中の総数
である。この方法の場合には、ファージ力価の上昇が対
象細菌の存在を示す。
酵素標識しておき、力価測定用プレートに細菌を固定し
た後、前記抗体を添加し、さらに標識に用いた酵素の基
質を加えて、発色、蛍光等を測定する方法である。固定
した細菌の中に目的の細菌が存在する場合には、発色も
しくは蛍光が生じる。
物には存在しない外来の遺伝子で、広義のマーカー遺伝
子である。ただし、形質転換体の選抜に用いられる選択
マーカー遺伝子とは異なり、ある遺伝子の発現を定量的
または組織化学的に測定する目的で用いられる遺伝子を
指す。レポーター遺伝子を用いる細菌の検出方法では、
レポーター遺伝子を細菌の染色体またはプラスミドに組
込み、その活性を測定する。
ジ増殖法は、ファージ添加後の試料のファージ力価を測
定するために、試料を予め培養した感受性細菌と混合し
て一日程度培養し、形成された溶菌斑(プラーク)数を
計測しなければならない。このため、結果を得るまでに
時間がかかる。また、測定には繁雑な操作を必要とし、
測定者は操作に熟練しなければならない。さらに、例え
ファージが細菌に吸着して細菌内への核酸の注入が行な
われたとしても感染が成立しないことがあり、その場合
には検出を行なうことができない。
後何回か洗浄工程を繰り返す必要があるが、その際、細
菌が容易に洗い流されてしまう。このため、再現性に乏
しく、誤った結果を生じやすい。また、この方法では目
的とする細菌に特異的に結合する抗体を用いるが、その
ような抗体を用意するには大変な時間と労力が必要であ
る。さらに、特異抗体は死菌にも反応するので、生菌だ
けではなく死菌をも検出してしまう。
ようにレポーター遺伝子を細菌の染色体またはプラスミ
ドに組込み、その活性を測定する。このレポーター遺伝
子の組込みには繁雑な処理を必要とする。また、レポー
ター遺伝子を組み入れた細菌のモニターには適している
ものの、自然界における同じ細菌の検出に用いることは
できない。また、レポーター遺伝子を染色体に組込んだ
場合には、コピー数が少なく、レポーター遺伝子の発現
が充分ではない。さらに、試料によっては雑菌がレポー
ター遺伝子と同一の遺伝子を有していることがあり、こ
の遺伝子に由来して活性が出現することがある。
はそれぞれ優れた特徴を有しており、その特徴を生かし
た研究等に用いるには好適なものも多い。しかしなが
ら、細菌による病気の診断、環境調査の一環としての微
生物検査、食品中に混入した微生物の検査等、大量の試
料を短期間で処理する検査方法に用いることができる方
法は限られており、それらの方法も検出限度(検出可能
な最小限の細菌数)、精度(目的の細菌に対する特異
性)共に不十分である。このため、より少数の細菌をも
検出することが可能な高い感度を有し、かつ目的とする
細菌を特異的に検出することが可能な高い精度を有する
検出法が求められている。
期間で処理することが可能であり、感度及び精度に優れ
た簡便な細菌の検出方法を提供することを目的とする。
また、この発明は、上記検出方法を利用し、大量の試料
を短期間で処理することが可能で、感度及び精度に優れ
た細菌の検出装置を提供することをも目的とする。
出方法は、検出しようとする細菌を宿主とする、標識さ
れたファージを被検体に添加し、該標識に由来する信号
について測定を行なうことを特徴とする。
ウイルスであるが、その宿主範囲は非常に狭く、特定の
細菌にしか感染することができない。したがって、この
発明による検出方法において用いられるファージは検出
しようとする細菌に依存し、細菌に合わせて適宜選択さ
れる。具体的な例として、大腸菌にはラムダファージ、
Tファージ及びM13ファージを、カンキツかいよう病菌
(Xanthomonascampestris pv. citri)にはCP1 及び
CP2 を、枯草菌にはφ105 及びφE1を、サルモネラ
菌等にはP22を、赤痢菌等にはP2 を、Clostridiumbot
ulinum にはCDβ及びDEβを、ジフテリア菌にはβ
toxtを、Staphylococcus aureusには42Dを、緑膿菌に
はD3 を、Vibrio fetus にはVFP-13 をそれぞれ用
いることができる。
同位元素(RI)や酵素標識法によって直接標識する
か、もしくはファージ自身が有する核酸(以下、ファー
ジ核酸と称することがある)にレポーター遺伝子を組込
むことにより行なうことができる。直接標識によってな
された標識は直接測定することが可能であるが、レポー
ター遺伝子を組込んだ場合にはレポーター遺伝子が発現
し、それがコ−ドする蛋白質の産生を検出することによ
り間接的に測定することができる。
同位元素としては、例えば、 3H、14C、32P及び35S
を挙げることができる。ファージを放射性同位元素で標
識するには、放射性同位元素を含むヌクレオチドをファ
ージ核酸に取込ませるか、放射性同位元素を含むアミノ
酸でファージ外被蛋白質を形成させればよい。
トビオチンで標識し、次いで酵素標識アビジン(又はス
トレプトアビジン)を加えてアビジン(又はストレプト
アビジン)−ビオチン複合体を形成させ、それによりフ
ァージ表面に酵素を固定する。酵素の固定には、アビジ
ン−ビオチン以外にも、抗原−抗体反応などを用いるこ
とができる。また、ここで用いられる酵素は、通常この
分野において用いられる酵素であればいかなるものでも
よく、例えば、アルカリホスファターゼ、パーオキシダ
ーゼを挙げることができる。
遺伝子としては、例えば、オパイン合成酵素遺伝子、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CA
T)遺伝子、NTPII遺伝子、β−グルクロニダーゼ
(GUS)遺伝子、β−ガラクトシダーゼ(LacZ)
遺伝子、並びにホタルルシフェラーゼ(Luc)及び海
洋性発光細菌 Vibrio ルシフェラーゼ(Lux)のよう
なルシフェラーゼ遺伝子を挙げることができる。これら
のレポータ−遺伝子は、トランスポゾンを用いたり、通
常のクローニングによって、ファージのプロモーターの
支配を受けるようにファージ核酸に組込まれる。
添加し、被検体中に含まれる細菌に感染させる。被検体
中に検出しようとする細菌が存在する場合には、ファ−
ジは細菌に吸着し、ファージ自身の核酸を細菌に注入す
る。細菌に注入された核酸は、自らの遺伝子が産生する
酵素によって複製され、短時間のうちに数百倍に増幅す
る。その後、複製されたそれぞれの核酸がファージ自身
の外被蛋白質を産生し、この蛋白質が各々のファージ核
酸を被覆して多数のファージ粒子を形成する。これら一
連の過程は常法により行なうことができる。
被検体中の細菌と細菌に吸着せずに残存するファージと
をフィルター等の適当な手段で分離し、分離した細菌か
ら標識に由来する信号の検出を行なう。被検体中に目的
とする細菌が含まれている場合には、分離した細菌から
ファージの標識に由来する信号が検出される。
識の種類によって異なる。例えば、放射性同位体で標識
した場合には、放射性同位体が発する特有の放射線をシ
ンチレーションカウンターなどで測定すればよい。ま
た、酵素で標識した場合には、標識した酵素の基質を添
加し、特有の発色、発光等を比色計や光度計で測定すれ
ばよい。なお、ファージを直接標識した場合には、通
常、ファージが細菌に吸着した段階で測定を行なう。
だ場合には、ファージを細菌に感染させ、レポーター遺
伝子を含むファージ核酸の複製、転写及び翻訳を活発に
行なわせた後、レポーター遺伝子の活性を測定する。フ
ァージの感染から測定までに要する時間は、検出可能な
程度までファージが増幅すればよく、特に限定されるも
のではないが、通常 1時間程度である。レポーター遺伝
子の活性は、レポーター遺伝子が発現し、その遺伝子が
コ−ドする蛋白質が産生されることをもって判定する。
産生される蛋白質が上述のように酵素である場合には、
それぞれの酵素の検出に通常用いられる方法で検出を行
なえばよい。
医療、工業など様々な分野における特定細菌の検出・同
定に広く適用することができ、例えば、下水、海水、工
場廃棄水など各環境における細菌のアセスメント、ジュ
ース、ビール等の食品中の細菌混入の検査、人間及び動
物における特定病原細菌感染の迅速な診断、植物防疫の
観点からの特定植物病原細菌の早期検出などに好適に用
いることができる。
のよる細菌の検出装置について以下に説明する。この発
明による細菌の検出装置は、図1に概略構成を示すよう
に、被検体中の細菌に標識したファージを感染させる被
検体処理部 1と、このファージの標識に由来する信号を
検出する検出器 2と、この検出器 2からの信号を処理す
るデータ処理部 3とを具備することを特徴とする。
識ファージを感染させるための処理が行なわれる。ここ
で用いられる標識ファージ及び感染処理は上記検出方法
において詳細に説明した通りである。標識ファージは、
被検体を被検体処理部 1に収容する前に予め添加しても
よく、また被検体を被検体処理部 1に収容した後に添加
することができるように被検体処理部 1に適当なファー
ジ液注入手段を設けてもよい。
た後、検出器 2で標識の検出を行なう。検出器 2は標識
に由来する信号を検出するものであり、信号の種類によ
り適宜選択され、例えば、光電子増倍管のような光電変
換素子等を用いる化学発光測定器、RI検出器などを用
いることができる。この検出器 2は、被検体処理部 1と
一体に設けられていてもよく、あるいは被検体処理部 1
とは独立に設けられ、測定時に被検体処理部 1内の所定
の位置に移動する形式でもよい。さらには、被検体処理
部 1と検出器 2とがラインを形成し、被検体処理部 1に
おいて処理された被検体を検出器 2内に搬送する形式で
もよい。
号としてデータ処理部 3に送られて電気的に処理され
る。データ処理部 3において処理されたデータは、表示
装置、記録装置等に出力される。
例として、光電子増倍管を用いる化学発光測定器を具備
する装置の概略を図2に示す。すなわち、図2に示す装
置は、上記細菌の検出方法のうち、化学発光を生じる物
質をファージの標識として用いる方法に適用することが
できる。
た形状の容器底部材12と、円筒形状の容器枠部材13とか
らなる収容容器11を有している。容器底部材12の側板の
内壁及び容器枠部材13の一方の端部近傍外壁にはそれぞ
れねじ山が設けられて互いに螺合可能となっており、螺
合することにより一体に収容容器11を形成する。容器枠
部材13の下端には、ゴム、プラスチック等からなる封止
部材14が設けられ、一体に形成された収容容器11内の液
密性を確保している。容器底部材12及び容器枠部材13は
通常金属製であるが、プラスチック等弾性を有する材料
からなるものでもよく、その場合には封止部材14は設け
なくともよい。
の液の貯留及び廃液を自在に行なうための弁15が設けら
れている。また、容器底部材12には収容容器11を加熱す
るための図示しない加熱手段が設けられており、温度制
御装置33により温度調節がなされている。さらに、容器
枠部材13の内壁にはフィルター16を係止するための突出
部17が設けられており、突出部17に係止されたフィルタ
ー16は上方から固定部材18で固定される。
管23及び24が位置している。これらの導入管23及び24
は、それぞれ被検体貯留槽20及び標識ファージ液貯留槽
24に接続し、それぞれ被検体及び標識ファージ液を収容
容器11内部に導入する。なお、図中には2つの貯留槽と
それに接続する導入管のみを示したが、例えば洗浄水な
ど、必要に応じてさらに貯留槽を設けることができる。
増倍管25が設けられており、この光電子増倍管25と収容
容器11の間には、光フィルター26と光電子増倍管25を保
護するための光シャッター27が設けられている。光電子
増倍管25は、雑音を低減するための冷却部材28で周囲を
覆われ、さらに、プリアンプ29および振幅弁別アンプ30
を介して主制御装置31に接続されている。
に、光シャッター27を制御する光シャッター制御装置32
および収容容器11の加熱手段が接続され、これらの制御
及び/またはデータ処理が行なわれる。主制御装置31に
おいて処理されたデータは、表示装置34やプリンター35
に出力され、表示や記録がなされる。
うに行なわれる。まず、測定の前段階として、被検体を
被検体貯留槽20に、また標識ファージ液を標識ファージ
液貯留槽21にそれぞれ注入する。ここで用いられるファ
ージの標識は化学発光や蛍光を生じるものであり、以
下、酵素標識法に基づいてフォトビオチンを標識したフ
ァージを例にとって説明する。これとは別に、容器枠部
材13にフィルターを固定し、容器底部材12に螺合して収
容容器11を形成し、装置内の所定の位置に装着する。
に設けられた弁15を解放し、続いて被検体貯留槽20から
導入管23を介して収容容器11内に被検体を注入する。注
入された被検体は、フィルター16によって細菌を含む固
形物と可溶成分とに分離され、可溶成分を含む濾液はフ
ィルター16を通過して弁15から収容容器外に排出され
る。次に、標識ファージ液貯留槽21から導入管24を介し
て標識ファージ液を収容容器11内に注入し、フィルター
上に残留する細菌に接触させる。これにより、フィルタ
ー上に目的の細菌が存在する場合には、細菌にファージ
が感染する。その後、図示しない導入系より洗浄水を収
容容器内に導入してフィルターを洗浄し、同様に図示し
ない導入系よりアルカリホスファターゼ標識アビジンの
溶液を導入してアルカリホスファターゼを細菌に固定す
る。さらに洗浄して未反応のアビジンを除去した後、図
示しない導入系より蛍光色素であるAMPPDを導入す
る。
ァターゼとAMPPDとの反応により生じる蛍光を、光
シャッター27を制御装置32で制御しつつ、光電子増倍管
25で測定する。
電気信号として主制御装置31に送られ、光シャッター制
御装置32及び収容容器11の加熱手段からの情報と合わせ
て処理され、表示装置34やプリンター35に出力される。
器を具備する装置について説明したが、上述の装置は、
光電子増倍管を、例えば放射線測定器に代えることによ
り、RIを標識として用いる上記細菌の検出方法に適用
することができる。その場合には、収容容器11のフィル
ター16上に細菌を濾別して洗浄した後、弁15を閉鎖し、
シンチレーションカクテルを収容容器内に注入して計測
を行なう。
収容容器11は光電子増倍管25の直下に固定されている
が、収容容器11を移動ステージ上に装着し、例えばAM
PPDの添加までを各貯留槽の直下で行ない、測定時に
は光電子増倍管25の直下に移動させて測定を行なう構成
とすることもできる。
主範囲が非常に狭く、特定の細菌にしか感染することが
できない。すなわち、細菌に対して特異性を有してい
る。このため、被検体中にファージが宿主とする細菌が
存在する場合にはファージはその細菌に感染し、宿主と
する細菌が存在しない場合には他の細菌に感染すること
なく被検体中に浮遊する。したがって、ファージの感染
を利用することにより、目的の細菌を高い精度で検出す
ることが可能となる。
ると、まず細菌に吸着し、ファージ自身の核酸を細胞に
注入する。細菌に注入された核酸は、自らの遺伝子が産
生する酵素によって複製され、短時間のうちに数百倍に
増幅する。その後、複製されたそれぞれの核酸がファー
ジ自身の外被蛋白質を産生し、この蛋白質が各々のファ
ージ核酸を被覆して多数のファージ粒子を形成する。し
たがって、たとえ被検体中の細菌数が少なくとも、測定
は数百倍に増幅したファージに対して行なうため容易で
あり、検出の感度を大幅に高めることが可能となる。
ジを用いて大腸菌の検出を行なった。
って純化した後、フォトビオチンで標識した。次いで、
この標識λファージ液を、ミリポアフィルター(ミリポ
ア社製)上に集菌した既知濃度の大腸菌に、 100ないし
1000倍の力価となるように加えてファージを吸着させ
た。ファージ液を加えた10分後にフィルターをリン酸緩
衝液などで洗浄し、アルカリホスファターゼ標識アビジ
ンを加えてファージに吸着させた後、蛍光色素(AMP
PD)を添加して生じた発光の発光量を化学発光測定機
で測定した。その結果、フィルター上の 2×103 個の大
腸菌を検出することができた。
たλファージを用いて大腸菌の検出を行なった。λファ
ージの標識は、λファージ液を調製する段階で 3H−d
CTPをファージDNAに取込ませることにより行なっ
た。この標識λファージ液を用いて、上記実施例1と同
様に既知濃度の大腸菌にλファージを吸着させて洗浄し
た後、大腸菌にシンチレーションカクテル(同仁化学社
製、Scintisol 500 )を加えてシンチレーションカウン
ターで計測した。その結果、 5×102 個の大腸菌を検出
することができた。
λファージを用いて大腸菌の検出を行なった。まず、L
uxオペロンを接続したλファージ(ファージベクター
EMBL3 )を103 個含むファージ液を調製した。次
に、ミリポアフィルター上に既知濃度の大腸菌を集菌
し、このフィルターを培地に置床した後フィルター上に
上記ファージ液を拡げ、37℃で 1時間培養した。その
後、フィルターを取出し、そのまま化学発光測定機で発
光量を測定した。
同様の処理を施し、これをコントロールとして同様に化
学発光測定機で発光量を測定した。検体の測定結果とコ
ントロールの測定結果とを比較し、コントロールよりも
有意に高い蛍光を発したものを「大腸菌有り」と判定し
た。その結果、 3×103 個の大腸菌を検出することがで
きた。
homonas campestris pv. citri)の検出を、この病原
細菌のファージであるCP1 及びCP2 を用いて、上記
実施例1と同様の方法で行なった。その結果、 1×103
個の細菌を検出することができた。
ールのそれぞれ 100mlをフィルター濾過し、濾過後の
フィルターを検体として各々上記実施例1ないし3と同
様の方法で蛍光量または放射線量の測定を行なった。得
られた結果を比較したところ、いずれの方法において
も、大腸菌を含むビールから得られた結果のほうが有意
に高く、大腸菌を検出できることが確認された。
のそれぞれ 100mlをフィルター濾過し、濾過後のフィ
ルターを検体として各々上記実施例1ないし3と同様の
方法で蛍光量または放射線量の測定を行なった。得られ
た結果を比較したところ、いずれの方法においても、大
腸菌を含む海水から得られた結果のほうが有意に高く、
大腸菌を検出できることが確認された。
びこの洗液に 1×104個のカンキツかいよう病菌を加
えたものをそれぞれフィルター濾過し、濾過後のフィル
ターを検体として各々上記実施例4と同様の方法で蛍光
量を測定した。得られた結果を比較したところ、病原細
菌を加えたものから得られた結果のほうが有意に高く、
病原細菌を検出できることが確認された。
出方法は、大量の試料を短期間で処理することが可能で
あり、感度及び精度に優れた簡便な方法である。より具
体的には、同じファージを用いるファージ増殖法と比較
しても、操作に熟練を要することなくより短時間(具体
的には 3時間以内)に結果を得ることができる。ま
た、ファージ増殖法ではファージが細菌に吸着してファ
ージ核酸の注入が行なわれたとしてもファージが増殖せ
ずに測定できないことがあるが、この発明による方法で
は、ファージを直接標識することにより、ファージが細
菌に吸着しただけであっても検出が可能である。
した細菌が洗浄の際に流れてしまい再現性に問題が生じ
るELISA法と異なり、この発明による方法では細菌
を固定化する必要はなく、そのような問題は生じない。
また、この発明による方法に用いられる標識ファージの
調製は容易であり、ELISA法に用いられる抗体の調
製のような多大な労力は必要としない。
方法では、レポーター遺伝子を組込んだ細菌及びその子
孫しか検出することはできなかったが、この発明による
方法では、レポーター遺伝子の組込みにファージを用い
ることにより試料中に存在する特定の細菌のみにレポー
ター遺伝子を組込むことができる。そのため、混入細菌
の検出など試料中の特定の細菌の検出を、それも高い精
度で、行なうことができる。
この発明による細菌の検出方法を実施するに好適に用い
られ、大量の試料を短期間で処理することができ、感度
び精度の高い測定を行なうことができる。さらには、一
連の操作を自動化し、被検体を入れるだけで測定結果が
得られるようにすることも可能である。
る図。
る、この発明による細菌の検出装置の具体例を模式的に
示す図。
…収容容器、12…容器底部材、13…容器枠部材、15…
弁、16…フィルター、18…フィルター固定部材、20…被
検体貯留槽、21…標識ファージ液貯留槽、23、24…液導
入管、25…光電子増倍管、26…光フィルター、27…光シ
ャッター、28…冷却部材、31…主制御装置、32…光シャ
ッター制御装置、33…温度制御装置、34…表示装置、35
…プリンター
Claims (2)
- 【請求項1】 検出しようとする細菌を宿主とする、標
識されたファージを被検体に添加し、該標識に由来する
信号について測定を行なうことを包含する細菌の検出方
法。 - 【請求項2】 被検体中の細菌に標識したファージを感
染させる被検体処理部と、 該ファージの標識に由来する信号を検出する検出器と、 該検出器からの信号を処理するデータ処理部と、を具備
することを特徴とする細菌の検出装置。
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