CN101054554B - 用于提高微生物细胞壁透性的组合物和用于在膜上检测所述微生物的方法 - Google Patents

用于提高微生物细胞壁透性的组合物和用于在膜上检测所述微生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及透化微生物细胞壁的组合物，其包含聚乙烯亚胺(PEI)和至少一种醇的组合，并且本发明涉及使用所述组合物以靶向方式计数和检测膜上微生物的方法。本发明还涉及一种试剂盒和适于进行所述方法的探针。

Description

用于提高微生物细胞壁透性的组合物和用于在膜上检测所述微生物的方法
本发明涉及用于透化微生物细胞壁的组合物并涉及其应用，特别是其在计数和/或靶向鉴定液体或气体介质中微生物的方法中的应用。
本发明用于控制食品和药物产品生产线中涉及的液体和气体介质的微生物学质量。
在本领域，待测微生物经常以非常少数存在，因此建议区分所述微生物的性质以确定其对人类健康是否构成危害。进行的控制必须在短时间内警告所生产的产物的任何污染，如果可能，适当时，停止生产并采取净化步骤。
已开发了许多方法以最小化微生物的培养时间，同时可以搜寻某些微生物。
这特别是申请WO01/59157中所述的在用膜过滤液体之后进行的用于检测微生物的方法的主题。根据这个方法，液体样品中含有的微生物保留在液体所经过的膜的表面上。在膜的表面与琼脂培养基接触培养所述微生物一段时间，以形成肉眼不可见的小菌落。然后裂解形成所述小菌落的细胞以释放其腺苷三磷酸(ATP)和核酸内容物。ATP用作通过ATP-生物发光鉴定和定量活细胞的标记。所述检测是通用的，因为ATP是存在于所有活微生物中的标记。通过化学发光反应获得结果读数，所述化学发光反应涉及ATP通过特异于所述ATP的酶转化为光子。该光信号使用合适的视频界面(例如LCD相机)检测。获得的图像可以原位显现在膜上产生微生物的位置，与在琼脂培养基中在培养皿中进行的常规计数方式类似。
Millipore公司出售的“Milliflex rapid”系统操作原理如上。其设计为在一个相同的膜上进行过滤和检测步骤，该膜放置在塑料支持物上。这个支持物设计为适合多种用于过滤、微生物培养、用检测试剂浸渍膜和在视频室中获得图像的装置。
这个微型化的系统与在培养皿上进行的常规测试相比，可以明显节约时间。而且，可以储存数字设备获得的图像，可以监测污染(可追溯)。
然而，由于在实践中膜表面存在的微生物的计数是在细胞裂解后进行的，这使得这个系统具有某些局限。因此，很难再次使用同一个膜来准确鉴定检测的微生物。
然而，为了证明某些微生物的存在，可以使用标记的探针进行特异杂交，无论其本质上是核苷酸或者其它PNA(肽核酸)型。
PNA探针具有本质上是肽的优势，在某些应用中可以有利地替代寡核苷酸探针。
通常，原位探针杂交需要细胞核酸的完全可及性，否则这种操纵产生假阴性。
申请WO2004/050902描述了膜上检测系统，其可以检测污染血液样品的微生物的存在。
这个系统的特性在于所述微生物通过标记物质经微生物细胞壁穿透进入微生物而检测。所用标记物质是小分子，特别是插入核酸(DNA、RNA)的化合物，如花青苷衍生物、碘化丙锭、吖啶黄或溴化乙锭，其在穿透进入微生物方面比寡核苷酸探针具有更少的困难。
待测液体样品在包含标记物质和细胞透化试剂的透化溶液中稀释。细胞在这个透化溶液中保温，目的是提高细胞壁孔隙度，以促进标记物质穿透进入存在的微生物中。然后通过膜过滤可能具有微生物的所述透化溶液。然后存在的微生物保留在膜上，随后通过将标记物质与发射荧光信号的化合物和/或光源反应而检测。这个系统具有在检测前不裂解微生物或者至少尽可能限制其破坏的优势。
这产生了提供更好分辨率的检测。
然而，因为标记不是特异的，这个系统不能确定检测的微生物的性质。
而且，在这个系统中，在溶液中操作微生物需要特别的小心和更复杂的设备。应注意过滤前在溶液中保温活细胞具有在固定于膜上之前细胞可以继续生长和分裂的缺点，使得测试的最终结果产生某些不确定性。
根据WO2004/050902所述方法，还难于适当地计量透化溶液中的透化试剂，特别是当应该同时架次那革兰氏阳性细菌时，革兰氏阳性细菌通常对于透化剂更敏感，而革兰氏阴性细菌更有抗性。
组成所述透化溶液组合物的所述透化剂典型是乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、毛地黄皂苷、nonensin、六偏磷酸钠(sodium hexamethaphosphate)或者氯化苯甲烃铵。
还可以使用聚乙烯亚胺(PEI)，其是弱碱性的且是使细菌细胞壁对于溶质如抗生素(通常不穿透进入细胞质细菌中)通透的聚阳离子脂肪族聚合物(Helander，I.M.等，Polyethyleneimine is an effectivepermeabilizer of gram-negative bacteria，Microbiology(1997)，143：3139-3199)。
如WO2004/050902中所述的透化溶液中聚乙烯亚胺的浓度被限于通常低于100μg/ml的浓度。最适合于革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Esherichia coli)的浓度是大约20-30μg/ml。
本发明的目的是发现解决上述现有膜检测系统局限的方案。
令人惊奇地，本发明人注意到应用聚乙烯亚胺(PEI)组合至少一种醇特别是伯醇、更特别是乙醇产生了用于透化微生物细胞壁的更有效的组合物。这种组合物可以特别产生任选是标记的大分子，如核苷酸探针，以穿透进入微生物。
特别明显的是在包含PEI和伯醇、特别是乙醇的组合物中保温的微生物比在现有技术的组合物中耐受更高浓度的PEI。与伯醇的组合可以特别应用PEI高至100和1000μg/ml之间的浓度，而不引起任何明显的细胞裂解作用。
本发明中术语“微生物”指任何包含存在于由单层或多层细胞壁形成的包膜中的遗传物质的(真核或原核)活细胞、单细胞生物体、配子或病毒。
上述的组合物使得大分子可以穿透进入微生物，同时限制其细胞壁的破坏。
大分子限定为组合大量简单分子产生的分子，如多肽、蛋白质、糖蛋白、寡核苷酸、多糖、核酸(DNA、RNA)、抗体或其衍生物。
聚乙烯亚胺(PEI)是可以几种形式获得的可溶产物。具有大约750kDa分子量的单体聚合化形式是本发明的优选形式(CAS No.9002-98-6)。PEI用于许多领域，特别是作为在多种纯化方法溶液中用于絮凝蛋白质和核酸的物质。其也用作透化剂，由于其具有可逆破坏细胞壁中存在的磷脂的性质，因而使得这些细胞壁对于通常不能穿透进入细胞的物质是通透的。
因此，本发明的第一个方面是用于透化微生物细胞壁的组合物，其包含聚乙烯亚胺(PEI)和至少一种醇、特别是伯醇、最特别是乙醇的组合。
优选地，这种组合物不包含任何去污剂。
透化组合物中PEI的浓度可以在100和1000μg/ml之间，通常在100和900μg/ml之间，优选在150和900μg/ml之间，最优选在200和800μg/ml之间。
根据本发明，所述伯醇在所述透化组合物中通常以5％和95％之间的浓度存在，优选在5％和50％之间，最优选在10％和50％之间。
本发明另一方面涉及本发明组合物的应用，特别涉及检测膜上微生物的方法，其包括标记的大分子穿透进入微生物的步骤。
由于未知原因，PEI和伯醇特别是乙醇的混合物促进大分子、如核苷酸探针穿透进入微生物。
本发明优选的核苷酸探针特异性杂交微生物的核糖体RNA，特别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的16S RNA或23SRNA。这种探针可以特别包含相应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列。
当这些探针能够和微生物中存在的某些核酸杂交时，所述方法可以特异性检测液体或气体介质中存在的微生物类型。所述方法导致获得被检测的微生物群的更准确的图象。
可以设想所述大分子由抗原或抗体组成且其参与免疫学检测。
图1表明本发明方法处理气体样品的方式，通过将气体或气体混合物充气到液体如1％蛋白胨水中而进行。在与液体接触时，气体中含有的微生物被捕获(trap)在液体中。然后如本申请所示过滤该液体。
图2说明了实施例1中进行的本发明检测和计数微生物方法的多个步骤。通过标记的寡核苷酸探针进行的检测特异于铜绿假单胞菌。
图3示出了实施例1所述测试的结果。膜表示为在记录和数字化处理探针发射的光信号后获得的合成图像。
图4是图3中表示的图像的三维表示。
图5说明了实施例2中进行的本发明检测和计数微生物方法的多个步骤。通过标记的PNA型探针进行的检测特异于铜绿假单胞菌。
图6示出了实施例2所述测试的结果。膜表示为在记录和数字化处理探针发射的光信号后获得的合成图像。
图7是图6中表示的图像的三维表示。
图8说明了实施例3中进行的通过ATP-生物发光检测微生物的方法的多个步骤。
图9示出了实施例3b)进行的对比不同透化溶液(PEI 200μg/ml、PEI 500μg/ml和10％乙醇+PEI 500μg/ml)的测试的结果。这些是在记录和数字化处理ATP-生物发光发射的光信号后获得的合成图像。
图10示出了如图9所示对于其它透化溶液(90％乙醇和25％+PEI 500μg/ml)的相同测试。
图11是表示对于图8中所述ATP-生物发光方案中测试的每种透化溶液测量的光强度的图表。
本发明的一个主题更特别是所述透化组合物在计数和/或鉴定膜上微生物的方法中的应用，所述微生物最初存在于液体或气体介质中。
根据本发明的一个特别形式，所述方法特征在于其包含如下步骤：
(a)通过膜过滤液体或气体介质以在膜上或膜中保留该介质中存在的微生物；
(b)将膜和微生物与所述透化组合物接触，所述透化组合物包含聚乙烯亚胺和至少一种醇；
(c)通过交联剂将细胞固定在膜上；
(d)将微生物与一或多种任选标记的能穿过微生物细胞壁的大分子接触；及
(e)进行已穿透进入微生物的大分子的检测。
本发明方法靶向的微生物更特别选自假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、沙门氏菌属(Salmonella)、利斯特氏菌属(Listeria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、志贺氏菌属(Shigella)、梭菌属(Clostridium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或者气单胞菌属(Aeromonas)的革兰氏阳性或者革兰氏阴性病原菌；贾第虫属(Giardia)、内变形虫属(Entamoeba)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)或者环孢子虫属(Cyclospora)的原生动物；支原体属(Mycoplasma)或者尿素原体属(Ureaplasma)的支原体，曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)或青霉属(Penicillium)和甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，其均是环境中经常遇到的致病性微生物。
原则上该方法也用于检测单细胞藻类，如蓝细胞，单细胞形式的寄生生物体，如变形虫或线虫，吸虫或蛔虫卵，或其它植物或动物配子如花粉或精子。
本发明方法的目的是计数液体介质如水或气体介质如空气中存在的微生物，同时尽可能确定其性质(科、属、种等)。术语“液体或气体介质”是指可通过施加压力差而通过膜过滤的任何液体，所述膜具有的孔的平均直径通常在0.1和1.5微米之间，优选在0.15和0.8微米之间，更优选在0.2和0.6微米之间。这种液体可由生产无菌产物的纯溶液组成，也可以是由复杂溶液(饮用水、血清、尿、羊水等)组成或者由气体混合物如空气组成。
而且，本方法可以用于分析来自动物或患者的样品的诊断领域。
本申请中术语“膜”指具有两面的合成支持物，其孔具有已知的平均直径。
本发明中所用的膜具有高表面/体积比，恒定厚度优选在90和200微米之间。
这种膜可以是单层膜或多层膜。通常，其由一或多种如下材料组成：聚四氟乙烯、聚1，1-二氟乙烯(PVDF)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯、聚苯醚砜、乙酰纤维素和硝化纤维素。
优选选择所述材料以与所用溶剂特别是所述方法多个步骤中可能使用的醇和醛相容。
在其上检测微生物的膜优选主要由PVDF(聚1，1-二氟乙烯)或Nylon
Figure 200610168605710000210003_1
组成。更优选，其是如Millipore公司出售的商品名为Milliflex和HVWP
Figure 200610168605710000210003_2
或HVMFX
Figure 200610168605710000210003_3
类型的PVDF滤膜。
本发明方法的步骤a)由用上述膜过滤待分析的液体或气体介质以在该膜表面保留所述介质中含有的微生物组成。
一旦所述微生物被过滤并保留在膜上，所述方法步骤a)和b)之间可以包括和适当培养基接触培养微生物的任选步骤。这种培养基优选琼脂培养基，其上放置过滤后的所述膜。这个任选步骤可以获得最初过滤的每种微生物的菌落以能够更容易地检测这些微生物。
根据本发明，所述微生物随后在步骤b)中在本发明透化组合物中保温。
这个保温步骤在小体积溶液中进行，所述溶液在膜表面形成薄膜。有利地，所述透化组合物含在固体支持物中，在其上放置膜，所述固体支持物例如浸渍垫(impregnated pad)，其限制液体在膜表面上的任何可能移动，因此固定所述微生物。保温在20℃和35℃之间的温度进行5至20分钟。
本发明方法是更有效的，因为其包含通过作为交联剂的物质将细胞固定在膜上的步骤c)。
这个步骤可以将细胞固定在由膜构成的支持物上。本发明优选的交联剂选自如下：戊二醛、甲醛和多聚甲醛，多聚甲醛定义为由至少6个甲醛单元组成的分子。有利地，所述固定组合物可以含在固体支持物中，其上放置膜，所述固体支持物例如浸渍垫，其限制液体在膜表面上的任何可能移动，因此固定所述微生物。根据本发明优选所述固定步骤在20℃和35℃之间的温度进行5至20分钟。
这个固定步骤也可以通过UV照射膜上微生物而进行。所述膜优选由Nylon
Figure 200610168605710000210003_4
组成。
包括将微生物与一或多种任选标记的大分子(其可以穿透微生物细胞壁进入所述微生物)接触的步骤d)优选分别在保温和固定步骤b)和c)结束时进行，因为在这时可知微生物细胞壁对于大分子是最透化的。
根据本发明的优选形式，所述大分子被标记并用作探针。
本文所用术语“探针”是指能够识别微生物的特异生物学元件并与之缔合因而使其可以被观测到的大分子。
根据本发明另一个优选形式，所述探针可以是能够与微生物中存在的DNA或RNA序列杂交并对于所述核酸分子显示某种程度特异性的大分子。在这一方面中，其是指核酸探针。本发明示出本领域技术人员已知的任何类型的核酸探针，其与核酸杂交，所述探针例如是简单寡核苷酸、2’-O-甲基-RNA类型的寡核苷酸，或者PNA类型探针(由用嘌呤和嘧啶碱基取代的多肽链组成的探针)[Nielsen P.E.等，Science(1991)254：1497-1500]或LNA型探针(包含一或多个2’-O-4’-C-亚甲基-β-D-核糖呋喃糖基(2’-O-4’-C-methylene-β-D-ribofuranosyl)单体的寡核苷酸)，如EP0 103 661所述。
根据本发明的优选方面，用于靶向检测微生物如铜绿假单胞菌这一目的的探针包含一或多个如下序列：
5’-TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC-3’(SEQ ID NO：1)
5’-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3’(SEQ ID NO：2)
5’-CCCGAGGTGCTGGTAACT-3’(SEQ ID NO：3)
SEQ ID NO：1、2和3的序列具有特异性和选择性杂交铜绿假单胞菌的16S RNA或23S RNA的特性。本发明人实际上注意到能够杂交微生物核糖体RNA的探针对于本发明特别有用。
因此本发明的一个方面由探针组成，该探针包含相应于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的序列，即与所示序列具有至少80％相同性、优选90％、更优选95％相同性的序列。这种探针特别适于进行本发明计数和/或鉴定方法。根据本发明的另一方面，使用大分子作为引物进行由特异扩增微生物中含有的核酸组成的额外步骤，所述大分子可以穿透进入微生物并可与所述探针性质相同。如果这种大分子用于本发明方法中，则一个额外的不过是任选的步骤被导入方法中的步骤d)和e)之间。
这种扩增步骤可证明对于通过提高用于检测目的可获得的核酸量而最佳化微生物检测是有用的。如果这个扩增步骤是高度特异的，也可以以更高选择性鉴定微生物并因此降低假阳性的数目。扩增优选是NASBA类型扩增[Compton J.，Nature(1991)350：91-92]或者LAMP-PCR类型扩增[Notomi T.，Nucleic Acids Research(2000)，28(12)：e63]。
上述探针或引物可以设计为仅检测一或几种类型的微生物。在这方面，其对于微生物中存在的生物学元件可以显示不同程度的特异性。例如，如果所述引物或探针核酸选择为与在许多微生物物种中是保守序列的核酸杂交，则所述鉴定将不是非常特异的，另一方面，如果其序列选择为仅识别特异于少数物种的序列，则特异性将会更高。
根据本发明另一个特异形式及有利地，由核酸探针或引物和所述微生物核酸的特异性杂交组成的步骤可以在步骤d)之后和在随后检测步骤e)之前进行。
由核酸探针或引物杂交组成的这个步骤在本领域技术人员已知的标准杂交条件下进行。其可以包括洗涤步骤以去除导致非特异性杂交的核酸探针或引物。
为了检测目的，本发明核酸探针或引物优选是荧光标记或者与酶偶联以进行化学发光反应。
微生物检测步骤e)通过检测来自化学发光反应的光信号或通过适当界面检测相应于探针或引物标记的荧光获得的发射来进行。
根据本发明更优选的方面，所述核酸探针如寡核苷酸与过氧化物酶偶联。当过氧化物酶与鲁米诺(过氧化物酶底物)接触时，其降解后者并且降解产物发射可被Milliflex系统的视频界面(LCD相机)检测的光子。
根据另一方面，本发明由应用上述透化组合物进行体外诊断测试所组成。
实际上可以设想使用本发明透化组合物的特异性质使核苷酸探针或任何其它分子复合物穿透进入来自人或动物、或维持在培养物中的细胞以进行原位检测。
本发明透化组合物在医学领域中也可以具有许多应用，例如作为提高细胞或微生物细胞壁透性的药物佐剂，以例如使所述细胞或所述微生物对活性成分如抗体或抗病毒剂敏感。
更特别地，本发明组合物可用于使反义核酸，特别是反义RNA(RNAi)穿透进入细胞，其在细胞中倾向于抑制某些基因的表达，特别是在遗传疾病或某些癌症的治疗中。
本发明也涵盖检测和计数液体或气体介质中微生物的试剂盒，其包含至少：
-用于过滤液体或气体介质的膜；和
-本发明所述的透化组合物。
优选地，这个试剂盒中含有的所述膜主要由PVDF或Nylon
Figure 200610168605710000210003_5
组成。
有利地，这种试剂盒还包括一种组合物，该组合物包含选自如下的交联剂：戊二醛、甲醛和多聚甲醛。这第二种组合物可以将微生物固定在膜上，通过进行本发明的方法其可以获得更好的检测分辨率。
本发明的试剂盒也可以包含用于特异性检测所寻找的微生物的探针，特别是上述包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3具有至少80％相同性的序列的探针。
下述实施例的目的是阐明本发明。
实施例1
通过寡核苷酸探针特异性检测铜绿假单胞菌
进行的方法步骤于图2中阐述。
本方法的实施首先包括使用商品名为Milliflex
Figure 200610168605710000210003_6
的带有HVMP
Figure 200610168605710000210003_7
或HVMFX
Figure 200610168605710000210003_8
的装置过滤100ml溶液。这个装置包含置于环状塑料结构上的PVDF类型滤膜。
过滤后，将膜置于琼脂培养基的盒中，然后在35℃保温5小时30分钟，以便细菌小菌落可以在膜表面生长。
将膜从琼脂培养基的盒中分离出来，然后与浸渍了透化溶液(20％乙醇、PEI 200μg/ml)的纤维素垫在室温接触10分钟。
然后将膜置于浸渍了固定溶液(80％乙醇、1％甲醛、5mM NaN3、0.01％H2O2-尿素)的纤维素垫上，在室温，10分钟。
随后将其上放置膜的所述塑料结构安放在杂交盒中，该盒的底部密封。将膜在所述杂交盒中与2ml第一种预杂交溶液(10％PEG；300mM NaCl；30％甲酰胺；0.1％焦磷酸钠；0.2％PVP；0.2％Ficoll；5mM EDTA；1％Triton X-100；50mM Tris-HCl-pH7.5)接触，在45℃保温30分钟。一旦除去第一种溶液，就将膜与同体积的杂交溶液在45℃接触60分钟，该杂交溶液含有100nM与大豆过氧化物酶偶联的寡核苷酸探针。
特异于铜绿假单胞菌16S RNA的所用寡核苷酸探针具有如下序列(SEQ ID NO：2)：
5’-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3’(SEQ ID NO：2)。
然后将膜从杂交盒中分离，置于洗涤槽中与100ml洗涤溶液(10mM CAPSO、0.02％Tween20)接触。在45℃洗3次，10分钟。
干燥膜，将复水(reconstitution)后的生物发光试剂(Millipore cat#WBKLS0100)喷洒在膜表面。所述装置置于Milliflex Rapid系统中，并记录光信号。
膜表面铜绿假单胞菌的检测结果示于图3。相同分析的三维图像示于图4，其中清楚分辨了每个铜绿假单胞菌小菌落的膜定位。
实施例2
通过PNA类型探针特异性检测铜绿假单胞菌
a)应用20％乙醇、PEI 200μg/ml透化溶液
图5中阐述了所进行方法的步骤。
根据实施例1的方案进行了过滤后，将膜置于琼脂培养基盒中并在35℃保温6小时。
将膜从琼脂培养基盒中分离，然后置于浸渍了透化溶液(20％乙醇、PEI 200μg/ml)的纤维素垫上，室温10分钟。
随后将所述装置置于浸渍了固定溶液(80％甲醇、1％甲醛、5mMNaN3、0.01％H2O2-尿素)的纤维素垫上，室温10分钟。
如实施例1，将膜置于杂交盒中，与2ml杂交溶液(10％PEG；10mM NaCl；30％甲酰胺；0.1％焦磷酸钠；0.2％PVP；0.2％Ficoll；5mM EDTA；1％Triton X-100；50mM Tris-HCl-pH7.5)接触，该杂交溶液包含100nM与大豆过氧化物酶偶联的PNA探针。将装配物置于50℃60分钟。
如实施例1核苷酸探针，所用PNA探针(SEQ ID NO：3)能够与相同的铜绿假单胞菌的16S RNA序列杂交。
将支持物上的膜从杂交盒中分离，然后置于洗涤槽中，与100ml洗涤溶液(10mM CAPSO、0.02％Tween20)接触。在50℃，洗3次，各10分钟。
干燥膜，将复水后的生物发光试剂(Millipore cat#WBKLS0100)喷洒在其表面。最后，将膜置于Milliflex Rapid系统的图像分析仪中，记录光信号。获得的图像示于图6。相同分析的三维图像示于图7。
这个方法可以特异性检测滤膜表面铜绿假单胞菌的存在。
b)应用包含仅200μg/ml PEI、仅500μg/ml PEI或由10％乙醇和500μg/ml浓度的PEI(EtOH 10％-PEI500)组成的混合物的透化溶液
用仅包含PEI的透化溶液进行上述相同方案，然后用由10％乙醇和500μg/ml浓度的PEI(EtOH 10％-PEI500)组成的混合物进行。
过滤后，将膜置于琼脂培养基盒中，在35℃保温15小时。
随后在室温将膜置于浸渍了透化溶液的纤维素垫上10分钟，所述透化溶液含有仅200μg/ml PEI、仅500μg/ml PEI或由10％乙醇和500μg/ml浓度的PEI组成的混合物，未处理的膜用作对照。
随后在室温将膜置于浸渍了固定溶液(80％甲醇、1％甲醛、5mMNaN3、0.01％H2O2-尿素)的纤维素垫上10分钟，然后如上处理。
对于不同浓度PEI以及联合应用PEI和醇获得的结果示于图9。
与缺少透化剂(对照)或仅存在PEI时获得的信号相比，可见联合应用PEI和EtOH可以获得强烈、准确的信号。
实施例3
通过ATP-生物发光非特异性检测微生物
本发明透化组合物可以用于根据本领域已知的化学生物发光反应检测活微生物产生的ATP的方法中(Alexander，D.N.，G.M.Ederer，and J.M.Matsen.1976.Evaluation of an adenosine 5’-triphosphate assayas a screening method to detect significant acteriuria.J.Clin.Microbiol.3：42-46)。
应用本发明组合物可以更好地透化微生物细胞壁，以释放其ATP内容物。
a)通过化学发光检测ATP之前用90％乙醇或25％乙醇-PEI500μg/ml处理细胞
测试了通过ATP-生物发光检测水中存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的方法，其中各个步骤示于图8中。这个测试中，细胞用90％乙醇或25％乙醇-PEI 500μg/ml预处理，之后进行化学发光反应。
如前述实施例，该方案包括使用Milliflex
Figure 200610168605710000210003_9
装置过滤100ml溶液。
然后用40μl 90％乙醇或25％乙醇-PEI 500μg/ml溶液喷洒在膜表面处理膜，然后干燥。
随后用40μl生物发光溶液喷洒在膜表面处理膜，然后将其置于记录光信号的图像分析仪中。
b)在通过化学发光检测ATP之前用PEI(100-500μg/ml)单独或用乙醇-PEI混合物处理
如上述进行相同方案，其中用乙醇处理取代为用PEI(100-250-500μg/ml)单独或乙醇-PEI(本发明组合物)混合物处理：EtOH 10％-PEI 100μg/ml；EtOH 10％-PEI 250μg/ml；EtOH 10％-PEI 500μg/ml EtOH。
a)和b)不同处理的结果示于图10的表和图11的图示中。从这些对比结果可知组合EtOH和PEI可以比单独用EtOH或PEI、甚至单独使用高浓度PEI时获得明显更强烈的信号。
实施例4
通过DNA-嵌入剂(SYBRgreen)穿透非特异性检测微生物
一个实验包括在包含10％乙醇-PEI 100μg/ml混合物的本发明组合物溶液中保温大肠杆菌(E.coli)。
通过在25μg/ml或100μg/ml浓度的PEI单独溶液中或在缺少透化剂的溶液中(PBS)保温细胞进行相同实验。
实验包括在存在上述物质和DNA-嵌入剂(SYBRgreen I，1/4000)的情况下保温细菌15分钟，然后使用小平板读数仪测量荧光。
结果示于下表1。
组合EtOH和PEI可以比单独使用PEI获得明显更强烈的信号。这示出通过组合醇和PEI可以获得更好的微生物细胞壁透性。
表1：透化和标记大肠杆菌(SYBRgreen)
    透化溶液     荧光相对荧光单位(大肠杆菌)
    PBS     9375
    PEI 25μg/ml     13036
    PEI 100μg/ml     15152
    PEI 100μg/ml/EtOH 10％     20998
序列表
<110>米利波尔公司
<120>用于提高微生物细胞壁透性的组合物和用于在膜上检测所述微生物的方法
<130>BIF 116880
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<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>artificial DNA
<400>1
tctaccgcgt cacttacgtg acacc                                          25
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>artificial DNA
<400>2
cgaccagcca gagcttacgg agta                                           24
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>artificial DNA
<400>3
cccgaggtgc tggtaact                                                  18

Claims (29)

1.透化微生物细胞壁的组合物，其包含至少5重量％至95重量％之间的伯醇以及100至900μg/ml之间的聚乙烯亚胺。
2.权利要求1的组合物，特征在于组合物中聚乙烯亚胺的浓度在200至800μg/ml之间。
3.权利要求1或2的组合物，特征在于所述组合物包含5％和50％之间的伯醇。
4.权利要求3的组合物，特征在于所述组合物包含10％和50％之间的伯醇。
5.权利要求1的组合物，特征在于所述伯醇是乙醇。
6.在膜上计数和/或鉴定最初存在于液体或气体介质中的微生物的方法，特征在于其包含如下步骤：
(a)通过膜过滤所述液体或气体介质以在膜上或膜中保留存在于该介质中的微生物；
(b)在所述膜上将所述微生物与透化组合物接触，所述透化组合物包含至少5重量％至95重量％之间的伯醇以及100至900μg/ml之间的聚乙烯亚胺；
(c)通过交联剂将微生物细胞固定在膜上；
(d)将微生物与一或多种能够穿过微生物细胞壁的标记的大分子接触，所述标记的大分子选自探针或引物；及
(e)检测穿透进入微生物的大分子。
7.权利要求6的方法，特征在于其在步骤a)和b)之间包括一个培养所述微生物的额外步骤。
8.权利要求6的方法，特征在于步骤c)中作为交联剂的物质选自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
9.权利要求7的方法，特征在于步骤c)中作为交联剂的物质选自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
10.权利要求6的方法，特征在于步骤d)中所用的大分子是PNA型探针。
11.权利要求6的方法，特征在于步骤d)中所用的大分子是寡核苷酸型探针。
12.权利要求6-11任一项的方法，特征在于步骤d)中所用的探针由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列组成。
13.权利要求6-11任一项的方法，特征在于步骤d)中所述探针或引物通过与使得发射光信号的酶偶联而被标记。
14.权利要求13的方法，特征在于步骤e)中通过化学发光反应和识别所述发射的光信号来检测微生物。
15.权利要求6-11任一项的方法，特征在于步骤d)中所述探针或引物用荧光分子标记。
16.权利要求15的方法，特征在于步骤e)中通过检测相应于探针或引物标记的荧光发射信号来检测微生物。
17.权利要求6-11任一项的方法，特征在于其在步骤d)和步骤e)之间包括所述探针或引物与所述微生物的核酸特异性杂交的额外步骤。
18.权利要求6-11任一项的方法，特征在于其在步骤d)和步骤e)之间包括特异性扩增微生物中存在的核酸的额外步骤。
19.权利要求6-11任一项的方法，特征在于在其上检测微生物的膜包括PVDF或Nylon。
20.权利要求6-11任一项的方法，特征在于步骤b)的透化组合物包含聚乙烯亚胺和乙醇的组合。
21.权利要求20的方法，特征在于所述透化组合物是权利要求2-5任一项的组合物。
22.权利要求1-5任一项的组合物的应用，特征在于所述组合物用于提高微生物细胞壁透性。
23.权利要求1-5任一项的组合物的应用，特征在于所述组合物用于计数和/或鉴定微生物的方法中。
24.权利要求1-5任一项的组合物的体外应用，特征在于所述组合物用于使探针穿透进入分离的细胞中。
25.用于检测和计数微生物的试剂盒，特征在于其包含：
-过滤液体的膜；及
-权利要求1-5任一项的组合物。
26.权利要求25的试剂盒，特征在于其还包含一种包含交联剂的组合物，所述交联剂选自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
27.权利要求25或26的试剂盒，特征在于其还包含至少一种特异性检测微生物的探针。
28.权利要求27的试剂盒，特征在于用于特异性检测的探针由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列组成。
29.权利要求25的试剂盒，特征在于所述膜包括PVDF或Nylon。
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