JP2004333503A - 病原性微生物の分類学的同定及び病原性微生物の毒性タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】 特定の微生物種、病原菌及び非病原菌群においてこれらを区別する能力を有し、診断用途において微生物タンパク質を同定するためにも用いることができる、微生物及びタンパク質の分類学的評価方法を提供する。
【解決手段】 生物学的分析対象物を基材上に捕捉するための方法であって、使用されるリガンドが、ヘム化合物、サイドロフォア、多糖類、及び外膜タンパク質、コンジュゲート脂質や微生物タンパク質標的に特異的なペプチドから成る群から選択され、リガンドは基材の表面から少なくとも１５Åの距離にテザーされて、微生物を捕捉する。生物対象物は細菌、ウイルス、リケッチア、原生動物、及び菌類からなる群から選択され、水性試料や医学的試料からの生物学的分析対象物の濃縮のために用いられる。
【選択図】 図１

Description

本発明は病原性微生物の分類学的同定及び病原性微生物のタンパク質トキシンを検出するための方法に関する。

病原性微生物、中でも自然界に発生する病原性細菌や毒性因子を獲得した病原性細菌は、人類を苦しめる多くの疾病の原因である。これらの細菌の多くは細菌戦の媒介物として提案されてきた。加えて、非病原性微生物が遺伝子操作の後、病原菌としても使用され得る危険や可能性が存在する（例えば、コレラトキシンを内包する大腸菌）。

病原性細菌の典型的なものとして、ボツリヌス中毒、腺ペスト、コレラ、ジフテリア、赤痢、ライ、髄膜炎、猩紅熱、梅毒及び結核の原因となっている細菌が挙げられる。過去数十年の間、病原性細菌に対する一般の理解は工業化した国々では無関心に近いものであったが、これは主として、抗生物質による治療によってこれらの疾病と闘って達成した成功の所為である。しかしながら、細菌は驚く程抗生物質に耐性を示すようになってきた。加えて、細菌が人間の疾病で果たしている新しい役割、例えばヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）が消化性潰瘍の原因となる媒介物であること、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）が新しい肺疾患の病原菌でああること、更にクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）が冠動脈心疾患の引き金となっている可能性があること等の驚くべき新事実が最近明るみに出ている。これらの病原菌を別としても、様々な社会経済上の変化が、細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella spp.）、ビブリオ菌（Vibrio spp.）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）等、による食物媒介による感染が世界中で上昇するのに同様に寄与している。

戦場医学においては、潜在的感染もまた重要な考慮対象である。炭疽菌（Bacillis anthracis）やペスト菌（Yersinia pestis）等の多くの細菌性病原菌、更にはそれらのエキソトキシンが武器として使用されてきている。また、非病原性の微生物を病原性を有するように改変でき、それが細菌戦の媒介物として用いられる可能性があるという危険が常に存在する。

病原性微生物は、また、家畜及び家禽産業並びに野生生物の取扱いにおいても考慮すべき対象である。例えば、ウシ流産菌（Brucella abortus）はウシ類の家畜の仔の自然流産を引き起こす。エキソトキシン産生微生物で汚染された水源は、鳥や魚や哺乳動物個体の死に影響を与えてきた。ごく最近、狂牛病は、フィルタで保持されないタンパク質粒子の経口伝染に起因することが突きとめられた。従って、動物や人間を疾病に罹らせる毒性タンパク質及び病原性微生物についてフィールド分析を実施するための迅速且つ廉価な技法の必要性は明白である。

一般的に言えば、細菌汚染は通常の光学顕微鏡検査で検出できる。しかしながら、分類学的見地からはこの方法の価値は限られている。寸法が数ミクロンそこそこの範囲を調べて汚染の程度を決めることは困難且つ時間の浪費である。市販のシステムの多くは、細菌培養による増殖を利用して充分に大きな試料（増殖物）を得た上で、種（あるいは属）の同定のために分別的代謝試験を行うものとなっている。しかしながら、細菌の増殖を必要とする技法は、生存可能ではあっても培養不能な細胞については検出できない。一方、用いた生育培地が、特定の表現型を有する細菌を容易に増殖させてしまう可能性もある。

より高感度でより迅速なタイピングの方法がＳ．ＰｉｌｌａｉとＳ．Ｃ．Ｒｉｃｋｅによる「肉及び肉加工品における病原菌検出のための遺伝子増幅プロトコルの適用可能性を促進する戦略的方策（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅａｔ ａｎｄ Ｍｅａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１（４），２３９〜２６１（１９９５）（非特許文献１））やＲ．Ｍ．Ａｔｌａｓ、Ｇ．Ｓａｙｌｅｒ、Ｒ．Ｓ．Ｂｕｒｌａｇｅ及びＡ．Ｋ．Ｂｅｊによる「微生物の環境モニタリングのための分子的アプローチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（５），７０６〜７１７（１９９２）（非特許文献２））に記載されている。これらの技法はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって細菌のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、続いて核酸配列を決定して特定の細菌種の存在を検出するものである。そのような増幅及び配列決定技法は一般に技術的な経験を必要とし、特化された実験室条件以外では簡単には利用できない。ＰＣＲに基づく各種技法は微生物が存在しているという推測を利用するものである。何故ならばこれらの技法は、完全な標的核酸配列が検出されさえすれば（必ずしも微生物が検出されなくても）分析したことになるからである。また、ＰＣＲは毒性微生物タンパク質の存在を検出することもできない。更に、標的ＤＮＡの効果的な増幅を阻む物質が「汚れた」試料中に存在すると、特定の微生物を環境試料から検出することが困難になってしまう。

「肉及び肉加工品における病原菌検出のための遺伝子増幅プロトコルの適用可能性を促進する戦略的方策（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅａｔ ａｎｄ Ｍｅａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１（４），２３９〜２６１（１９９５））

「微生物の環境モニタリングのための分子的アプローチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（５），７０６〜７１７（１９９２））

細菌やウイルスの検出は、試料を細胞溶解又は熱分解に付した後に揮発性の細胞成分（例えば、脂肪酸）を質量スペクトル分析することで行われてきた。この方法で微生物を検出する例として、Ｆ．Ｘｉａｎｇ、Ｇ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔ．Ｄ．Ｖｅｅｎｓｔｒａ、Ｍ．Ｓ．Ｌｉｐｔｏｎ及びＲ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈによる「細胞溶解物のグローバルＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析による微生物の特徴付けとバイオマーカーの開発（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｇｌｏｂａｌ ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅｓ）」（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１１），２４７５〜２４８１（２０００）（非特許文献３））に記載されている。惜しいことに、微生物の揮発性成分の組成は環境の増殖条件次第で変化するので分析対象物の同定は信頼できない。

「細胞溶解物のグローバルＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析による微生物の特徴付けとバイオマーカーの開発（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｇｌｏｂａｌ ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅｓ）」（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１１），２４７５〜２４８１（２０００））

別の方法は、Ｍ．Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒ、Ｂ．Ａｓｓｍｕｓ及びＡ．Ｈａｒｔｍａｎｎによる「環境中のバクテリアを検出・同定する免疫学的方法の使用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．１３，７５〜８０（１９９５）（非特許文献４））に記述されているように免疫化学的な捕捉を利用し、続いて捕捉された細胞を光学的に検出することである。最も一般的な免疫測定法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））の検出限界は数百細胞である。この検出限界はフレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）等の非常に伝染性のある細菌のＩＤ₅₀よりはるかに下である。Ｅ．Ｐｒｕｓａｋ−ＳｏｃｈａｃｚｅｗｓｋｉとＪ．Ｈ．Ｔ．Ｌｕｏｎｇによる「サルモネラ・チフィムリウム検出のための圧電イムノセンサ開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）」（ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１７３〜１７７（１９９０）（非特許文献５））に記載されている圧電検出技法等の検出技法は感度が低く、その検出限界は約５×１０⁵細胞である。Ｄ．Ｒ．Ｂａｓｅｌｔ、Ｇ．Ｕ．Ｌｅｅ及びＲ．Ｊ．Ｃｏｌｔｏｎによる「フォース顕微鏡技術に基づいたバイオセンサ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１３，７３１〜７３９（１９９８）（非特許文献６））という表題の最近の報告書は免疫捕捉された細胞を検出するために原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いることを記述している。この方法は、実験室環境の外で行う場合や試料容積が大きい場合には、ほとんど役に立たない。免疫測定法もまた、現在、ペプチドやタンパク質の微量分析に用いられている。

「環境中のバクテリアを検出・同定する免疫学的方法の使用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．１３，７５〜８０（１９９５））

「サルモネラ・チフィムリウム検出のための圧電イムノセンサ開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）」（ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１７３〜１７７（１９９０））

「フォース顕微鏡技術に基づいたバイオセンサ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１３，７３１〜７３９（１９９８））

更に、従来の技術においてはペプチド／タンパク質／微生物捕捉の際に固定化抗体を広範に利用してきた。用いられる抗体はｐＨ、イオン強度及び温度の変化に非常に敏感なので、それら従来技術に係る技法も重大な問題を同様に含んでいる。抗体は、「汚れた」試料中の多数のタンパク質分解酵素によって分解されやすい。更に、表面（例えば、マイクロウエルプレートや磁気ビーズ）上に支持される抗体分子の密度が低く、必要とされるレベルに満たないことがしばしばある。現時点での技術水準は、Ｎ．Ｈｏｂｓｏｎ、Ｉ．ＴｏｔｈｉｌｌとＡ．Ｔｕｒｎｅｒによる「微生物の検出（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」（Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１１，４５５〜４７７（１９９６）（非特許文献７））に簡潔に纏められている。

「微生物の検出（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」（Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１１，４５５〜４７７（１９９６））

医学面や軍事面の事情から、トキシンや病原菌の検出のためのより優れた各種技術が要求されている。リモートセンシングユニットによる戦場汚染のリアルタイム評価が、適切な対策を行うための迅速な診断を可能ならしめ且つ容易ならしめるために必要である。かかる状況で微生物／毒性タンパク質センサが有用であるためには、広範囲に病原菌と非病原菌とを区別する能力を必要とする。更に、かかる各種技法は、存在する細胞が百個未満の場合には高感度を、またフイールドで十五分未満で完了できる分析方法を必要とする。かかる各種技法は病原菌を認識できると共に、菌株の毒性やトキシン産生性に関する何らかの評価を提供できるものでなければならない。

今日まで、病原性微生物や病原性微生物のタンパク質トキシンの同定のために用いられている一般的手法は、免疫学的各種方法の利用である。免疫学的方法は、抗体がｐＨ、イオン強度、温度に対して敏感であるという欠点を有し、抗体自体がタンパク質分解されると共に、貯蔵状態に関する厳しい管理を必要とする。これらの問題点を克服するために、本発明は非抗体に基づくリガンドを使用して微生物及び微生物のタンパク質トキシンを捕捉しようとするものである。従って、抗体に依存する技術の上記欠点を克服する、微生物及びタンパク質の分類学的評価方法を提供することが本発明の目的である。

特定の微生物種、病原菌及び非病原菌群においてこれらを区別する能力を有し、診断用途において微生物タンパク質を同定するためにも用いることができる、微生物及びタンパク質の分類学的評価方法を提供することが本発明の更に明確な目的である。

本発明は、ヘム化合物、シデロフォア、多糖類及びペプチドの、病原性微生物及びそれらのタンパク質トキシンに対する結合能を明らかにする。即ち、微生物に結合するリガンドの数と種類を分析することによって、その微生物を分類学的に同定するものである。この方法は、上に述べた抗体に基づく技術の限界を克服するために開発された。本発明の思想は微生物の分類学的同定方法にあり、該方法では、微生物の受容体をこれに特異的なリガンドに結合させることにより、微生物が捕捉される。微生物含有試料をリガンドと接触させるが、このリガンドは基材表面にテザー（tether; 鎖繋）されたものであるか、あるいはマーカーに結合(conjugate)している。次いで、標的微生物（細菌、ウイルス、真菌類、原生動物、リケッチア、その他の細胞）やタンパク質性物質（トキシン）は洗浄や、磁気分離、クロマトグラフィーによって結合に関与しない試料成分や未結合リガンドと分離される。最後に、適切な方法によって、試料から標的やマーカーの内因性信号を検出することにより、リガンドが標的に結合しているか否かを決定する。

電磁放射は、本発明に係る、捕捉された微生物及び／又はトキシンの存在の検出に用いられる一方法であって、微生物生体特有の代謝物（例えば、還元ピリジンヌクレオチドやその他の蛍光代謝物）、他の生体分子（例えば、タンパク質中のトリプトファンやチロシンが有名）、取込ませた色素の存在の如何について検出するものである。例えば、リガンドが蛍光色素を含んでいる場合には、試料を洗浄すると、リガンドは細胞に結合したままで余分なものが洗い流されるので、蛍光発光が見られるであろう。同様に、他のマーカー、例えば発光性、燐光性、放射性及び／又は発色性(colorometric)化合物もリガンドと結合でき、よって微生物及び／又はタンパク質トキシンを同定するために用いることができる。

微生物又は毒性タンパク質の捕捉を検出するための特異的一方法が米国特許第５，７６０，４０６号及び第５，９６８，７６６号に記載されており、そこでは、電磁放射は、上述のような分析対象物含有溶液で処理されたリガンド結合基質の例えば表面に向けてなされる。この検出方法は、分析対象物が実際に結合したかどうかを決定するためには用いることができるであろう。リガンドに結合する特定の種類のマーカーに対して適切に用いられる他の検出方法もまた、該リガンドが微生物や毒性タンパク質に特異的に結合しているか否かを決定するために用いられる。先に言及した例では、リガンドに結合させた蛍光色素を微生物の検出に適用しており、この検出は、（１）微生物とリガンドとを接触させ、（２）過剰な色素結合リガンドを洗浄除去する、という工程の後に、該色素の蛍光特性を調べることによって行われるものである。捕捉された微生物やタンパク質を検出するために光学的方法が用いられる場合には、テザーが光切断されないように注意することが重要である。

従って、本発明の方法は古典的な抗原抗体認識に依存しない。対照的に、本発明の発明思想では、試料中に含まれる微生物や微生物タンパク質の捕捉に比較的廉価な試薬が利用される。

本発明の一実施態様では、各種センサチップ（又はビーズ）が用いられる。これらのチップは、リンカーとリガンドを表面に結合させるために用いられる化学反応と、使用検出方法との双方に適合する、適切な支持物質、例えばガラスやプラスチックの基材（ポリ（プロピレン）やポリ（ビニルアセテート）等）から形成されるべきである。センサチップは、該チップの表面に複数の区画を画定するパターン化されたアレイで形成されており、各区画には、特定の微生物タンパク質や微生物受容体を（従って微生物自体を）分子レベルで認識しうる異なるリガンドが結合されている。微生物受容体としては、例えば、微生物細胞の表層細胞膜に存在するタンパク質、線毛、鞭毛等が挙げられ、線毛又は鞭毛は細胞を取り囲む水性環境に曝されている。センサチップの表面に結合された病原菌／タンパク質捕捉のためのリガンドは変化させることができ、また変化させなければならない。一般に、このようなリガンドは、幅広い微生物や毒性タンパク質を捕捉できるヘム化合物、シデロフォア、多糖類、抗接着ペプチド等として特徴付けられる。従って、これらのリガンドは、リガンドと反応する能力を同様に有する適切な長さのクロスリンカーを介して固定化、即ちセンサチップの表面に結合させることができ、そしてそれによってカップリング剤が、センサチップの表面と種々の異なった微生物及びタンパク質と反応できるリガンドとの間に化学的テザーを確立する。センサチップ及びアレイを、まず（１）微生物又は毒性タンパク質含有溶液に曝露・接触させ、次いで（２）溶液中の非結合成分を除去し、更に（３）リガンドがテザーされている表面（以下、リガンド・テザー表面と称する）を調べて分析対象物の結合を検出する。微生物や、完全な(intact)微生物細胞内には含まれていない微生物タンパク質を捕捉したことが確認された、リガンドがテザーされた表面のタイプやパターンを分析することによって、微生物やその毒性タンパク質を分類学的に同定することができる。

従って、本発明によれば、微生物を培養増殖させたり、産生させた培養物を微視的に調べる必要なしに、微生物を迅速に同定することができる。また、低レベルの毒性微生物タンパク質も同様に同定できる。更に、微生物の代謝物を捕捉する際において、従来技術でしばしば用いられている、酵素又は抗体を用いることも不要である。本発明のこれらのまたその他の目的、特徴及び利点は、以下に開示する実施態様の詳細な記載及び添付の特許請求の範囲の精査により明らかになるであろう。

本明細書で説明するテザーヘム(tethered heme)による病原性細菌（Salmonella typhimurium）の捕捉に関し、その結果を図１に示す。（捕捉した細菌の検出は米国特許第５９６８７６６号に記載の方法及び装置を用いて行った。使用可能な細菌検出方法は多数存在するが、米国特許第５９６８７６６号に記載の方法を採用したのは、スライド上の細菌がかなり少数でも検出できるためである。）図１から、テザーヘムリガンドを用いて細菌を捕捉した場合の検出限界（＜１００細胞）は、免疫学的手法を用いた場合に得られる結果（最適条件下で約４００細胞）よりも低いことが判明した。微生物とヘムリガンドの間の結合は、微生物と抗体との結合の場合に比べ、ｐＨ、イオン強度、温度に影響されない。ヘムリガンドはまた低廉で、貯蔵にもほとんど注意を要さず、抗体のように容易にタンパク質加水分解を受けない。

図２は、非病原体（Bacillus globigii）を含有する各種溶液で同じ濃度に希釈した病原性細菌（Enterobactor aerogenes）を、テザーヘムによって捕捉した結果を示す。この図は、非病原菌と病原菌の割合が１０⁷：１であっても、テザーヘムでコートしたスライドは、溶液から病原性細菌を効果的に捕捉できることを示している。捕捉した細菌の検出は、Ｐｏｗｅｒｓに付与された米国特許第５９６８７６６号に記載されている装置で行った。

本発明の一実施形態においては、まず、未知の分析対象物である微生物やタンパク質トキシンを含む試料を、リガンドと接触させる。リガンドはチップやビーズの表面に結合させておくことができる。結合効率は、テザーの鎖長による。約４０Åの長さの微生物がリガンドに最も効率良く結合することがわかっている。微生物捕捉用のリガンドについては、少なくとも長さ１５Åのテザーによってこれらリガンドを基材表面に共有結合的に付着させる。なお、タンパク質トキシン捕捉用のリガンドのテザーは少なくとも長さ６Åである。その後、分析対象物を物理的に非結合試料から分離する。表面にテザーされたリガンドによって捕捉された分析対象物は、チップやビーズの表面を洗浄するだけで、試料中の非結合成分から分離させることができる。その後、基材の表面を調べて分析対象物がリガンドに結合したかどうかを決定する。基材表面における微生物の結合は、顕微鏡法、内因性蛍光発光法、コンジュゲート・ダイ (conjugate dye) 蛍光発光法、放射能法、ルミネッセンス法、燐光法、及び／又は吸光度法によって検出することができる。微生物やタンパク質の同定は、その結合相手のリガンドが何であるかにより決定される。テザーは、リガンド・テザー面を洗浄するのに使用した溶液中で光切断されないこと、あるいは化学的に不安定でないこと、が重要である点に注意しなければならない。

本発明の一形態においては、まず、未知の分析対象物微生物やタンパク質を含む試料を、センサチップに接触させる。センサチップは、例えばガラス等の基材から形成され、チップ表面に一連のセクションを有する。各セクションには、それぞれ異なるリガンドが結合され、特定の分析対象物に結合できるようにされている。これらリガンドは、分析対象物と結合することによって該対象物を捕捉することができ、捕捉された分析対象物の存在の検出は、例えば米国特許第５７６０４０６号及び５９６８７６６号に記載され、請求されている蛍光検出システムを用いて、タンパク質トキシンの内因性蛍光発光を検出することによって行う。このように、センサチップのセクション群のそれぞれにおけるリガンドは、特定の微生物細胞や微生物タンパク質を捕捉することができる。使用したチップは取っておき、捕捉微生物を生育させるのに用いることもできる。

本発明の他の一形態においては、未知の分析対象物（微生物、タンパク質トキシン、あるいはその他のタンパク質）を含む試料を、まず、マーカーと結合(conjugate)させたリガンドに接触させる。マーカーとしては、蛍光色素が挙げられるが、これに限定されない。非結合試料成分と過剰のリガンドは、リガンド結合分析対象物から分離させる。この分離は、細胞に対しては遠心分離で、タンパク質に対しては磁気沈降やクロマトグラフィーで行われる。分析対象物とリガンドの結合の検出、即ち、分析対象物の分類学的同定は、マーカーを検出することにより行われる（例えば、上記例示で言及したダイ・コンジュゲート(dye-conjugate)の蛍光発光）。

本発明の他の一形態においては、まず、未知の分析対象物（微生物やタンパク質）を含む試料を、上記のように適切な長さのリンカーを用いて基材表面にテザーさせたリガンドに接触させる。物理的分離及び洗浄によって、溶液中の非結合成分を除去する。当業者であれば理解できるであろうが、捕捉した微生物やタンパク質は反応性マーカーで処理することができる。但し、この場合の条件として該マーカーは基材表面とリガンドのどちらとも反応しないものでなければならない。分析対象物と接触させた一種以上のリガンドに対応する表面領域上のマーカーを検出することにより、特定の分析対象物の存在が示唆される。

本発明の好ましい一形態においては、本発明で用いるリガンドは、各種ヘム化合物、シデロフォア、多糖類（オリゴサッカライドを含む）及びペプチドからなる群から選択される。

当業者にはよく知られているように、動物の病原体は一般に、ヘムを取り込む能力を有しており、このため、ヘム化合物は各種病原体を捕捉するのに用いることができる。ヘム化合物の他に、高親和性鉄キレートの形態のリガンド（一般にシデロフォアと呼ばれている）も、多くの病原体細菌株を捕捉するのに用いることができる。シデロフォアの例としては、アルカリジン、マイコバクチン、ピオチェリン、スタフィロフェリン、ビブリオバクチン、ヤシニアバクチンが挙げられる。

当業者によく知られ、また、上にも述べたように、マーカーで標識したヘム化合物やシデロフォアに動物の病原体を結合させることによって、病原体を分別することもできる。そのような方法の例としては、蛍光性、発光性、燐光性、化学発光性、あるいは放射能性の化合物と結合させたシデロフォアやヘム化合物を含む細菌含有溶液をインキュベートする方法が挙げられる。細胞を洗浄後、動物の病原体の検出は、標準的な蛍光法、比色法、あるいは放射能検出技法によって行うことができる。支持体にテザーされているヘム化合物やシデロフォアに、動物の病原体を結合させることによって、例えば水等の各種環境試料から病原体微生物を分離させ、濃縮及び／又は精製することもできる。

ヘム化合物やシデロフォアの他に、微生物細胞受容体により認識される、真核生物性の表面エピトープ（ペプチドや炭水化物）も同様に、本発明の実施においてリガンドとして用いることができる。このリガンドとしては、化学的な合成によって得られる各種オリゴサッカライドや多糖類のみならず、天然に存在するものも含まれる。その他のオリゴサッカライド類、及び各種微生物に由来する病原体に対するこれらオリゴサッカライド類の親和性については、Ｋ．Ａ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ著の「標的細胞グリココンジュゲートの細菌による認識（Ｍｉｃｒｏｂａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：６２２−６３５（１９９５））に記載されている。

様々な病原性細菌の特性（各細菌種によって引き起こされる疾病や、シデロフォア、オリゴサッカライド、ヘム化合物との結合特性を含む）を表１に示す。この特性は、各種細菌の捕捉や同定に用いることができる。

ペプチドリガンドは一般に、オリゴヌクレオチド・ライブラリーの親和性パンニングによって同定した上で、化学的に合成することができる。シデロフォアリガンドは、化学合成や微生物を培養した培地からの単離によって得られる。オリゴサッカライドリガンドは、化学合成や真核生物の組織からの分離によって得られる。ヘム化合物は一般に、開始剤としてプロトポルフィリンＩＸを用いた化学合成により得られる。

１分子中に少なくとも１個のトリプトファン又はいくつかのチロシンを有するトキシンは、テザーされたペプチドで捕捉した後、トリプトファン／チロシン蛍光によって検出することができる。藻類、真菌類、細菌類等、種々の微生物がエキソトキシンを排出するので、この技術によって検出できる。

表２に、（１）本明細書に記載の技術を用いて捕捉でき、（２）最終的にはタンパク質の内因性蛍光によって検出できる、毒性の細菌タンパク質の例を示す。ここで、トリプトファン１個のみ、チロシン２２個という、表２の中で最も好ましくないケースであるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ エンテロトキシンＢについては、Ｔｒｐ残基１個に関する蛍光の研究、即ち、Ｂ．Ｒ．Ｓｉｎｇｈ、Ｍ．Ｌ．ＥｖｅｎｓｏｎとＭ．Ｓ．Ｂｅｒｇｄａｈｌによる「円二色性と蛍光分析法を用いた、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ及びＣ１の構造分析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｅｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ１ Ｕｓｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７；８７３５〜８７４１（１９８８））が存在する。当業者にはよく知られているように、（スキャッタード励起信号に標準化した）トリプトファン／チロシン蛍光が検出されさえすれば、細胞胞子、生存不能な細胞、生存可能な栄養細菌細胞や栄養真菌細胞、ウィルス、微生物トキシン等がセンサチップのセクター表面に存在する（即ち、リガンドに結合している）ことが示されたことになる。

上述のように、センサチップの各セクションには互いに異なるリガンドがテザーされている。このセンサチップを未知の生物やタンパク質を有する試料と接触させると、センサチップ表面の特定の一種以上のリガンドが特定の一種以上の分析対象物を選択的に捕捉し結合する。未結合の分析対象物を適切な溶液（リン酸緩衝液等）で洗い流した後、センサチップを適切な検出技法に付す。センサチップの一以上のセクションに細菌が存在することを検出する技法の例が、米国特許第５７０６４０６号、第５９６８７６６号に開示されており、結合した分析対象物の存在に特徴的な蛍光を励起する適切な波長の電磁放射を用いた装置が記載されている。

当業者にはよく知られているように、分析対象物を捕捉するのに使用したテザーリガンドがそれ自体蛍光を発するものである場合、この蛍光は分析対象物と結合すると変化する可能性がある。（この蛍光の変化は、強度の変化として、あるいは、特性蛍光エネルギーのシフトとして見られるであろう。）テザーリガンドのこのような蛍光の変化を、分析対象物の検出を確認するために用いることができる。

本発明においては、未知の微生物を含む試料をセンサチップに接触させることができ、それにより各種細菌の一以上の受容体がセンサチップの様々なセクションにテザーされている各種リガンドと反応する。その後、センサチップの各セクションの内のどれとどれがそれらに対応する分析対象物と結合しているのかを検出するために、プローブによりチップの蛍光を測定する。例えば、ミコバクテリア・シデロフォア類はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等のミコバクテリアを捕捉するのに使用できる。また、ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉは、テザーされたＮ−アセチルニューロアミニル−アルファ−２，３−ガラクトースで捕捉することができる。更に、次のペプチド、
ＧＡＤＲＳＹＬＳＦＩＨＬＹＰＥＬＡＧＡＧＧＧＣ
をテザーしておけば、その末端システイン基によって、特にフリーのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ トキシックショック・トキシン−１を捕捉できる。また、次のペプチド、
ＧＨＨＫＨＨＨＧＧＧＣ
も、これをテザーしておくことにより、その末端システイン基によって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの表面に露出しているプロテインＡを、よって結局この生物自体を、特異的に捕捉できる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ トキシックショック症候群トキシン−１結合ペプチドについては、Ａ．Ｓａｔｏらによる「ファージディスプレイライブラリーからの、トキシックショック症候群トキシン−１に結合しその主要組織親和性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子との結合を阻害するペプチドの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ Ｂｉｎｄ ｔｏ Ｔｏｘｉｃ Ｓｈｏｃｋ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｔｏｘｉｎ−１ ａｎｄ ｔｈａｔ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｉｔｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ （ＭＨＣ） Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、１０４４１−１０４４７（１９９６））に記載がある。

上で述べた通り、捕捉された単一の微生物種の存在、あるいは分離された微生物タンパク質の存在が確認できれば、分析を所望する対象である、各種分析対象物のうちいくつかを確定できる。しかしながら、捕捉された２種以上の分析対象物が、特定の分析対象物一種を同定する場合がある。例えば、下に示す縦３列、横３列のセクションを有するセンサチップについて考えてみる。

この例では、次のリガンドを上記各セクションに用意する。
セクション位置 リガンド（３×３の配列）
Ａ１ アシアロＧ_M1
Ａ２ ヘミン
Ａ３ ピオチェリン
Ｂ１ Ｇａ１ＮＡｃβＧａ１
Ｂ２ アルカリジン
Ｂ３ フィブロネクチン（ペプチド断片）
Ｃ１ 抗S. aureus プロテイン Ａ ペプチド
Ｃ２ スタフィロフェリン
Ｃ３ フェロキサミン Ｂ

分析対象物がセクションＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｃ３において検出されるときには、問題の微生物としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが同定されることが判明した。同様に、セクションＡ２、Ｂ１、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に分析対象物が捕捉されて存在するときには問題の微生物としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを同定することができる。この場合には、セクションＣ１において分析対象物が捕捉されることが分類学的同定には十分である。Ａ２、Ｂ１、Ｂ３、Ｃ２、Ｃ３の各セクションにおける細胞の捕捉はこの結果を補強するものである。所定の分析対象物一種を標的とする複数のリガンドをセンサチップに導入することによって、単一の試料で複数の独立した分析を行ったと同様の結果を得ることができる。これは分析結果の統計学的信頼性を向上させるものである。

前記各種リガンドは、当業者によく知られている有機カップリング剤によって基材にテザーされることが好ましい。センサチップとしてガラス基材、あるいは水酸基が露出するように表面を化学的に酸化させたプラスチックを用いる場合、本発明においては、実際には次の構造を有するオルガノシラン化合物：

（式中、Ｒ₁〜Ｒ₄はそれぞれ、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基及び炭素数１〜４のアルコキシ基からなる群から選択され、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃のうち少なくとも一種はアルコキシ基；Ｒ₄は炭素数３以上でリガンドと反応可能な官能基を有する長いリンカーを含む有機性基である）を用いることがしばしば好ましい。リンカーを含む有機性基としては、ポリアミン類、ポリエーテル類、ポリ（グリシン）が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、カップリング剤としては、各種リガンドと反応する前記以外の官能基（例えば、エポキシ基、アミノ基および不飽和官能基；ヒドロキシル基；チオール基等の官能基）を有するものが本発明の実施において好ましい。この場合、リガンドはオルガノシラン化合物の官能基（好ましくは末端の官能基）と反応し、一方、オルガノシランのケイ素原子に直接結合する易加水分解性アルコキシ基は、センサチップのガラス基材またはプラスチック基材の表面に対して直接的反応性を有する、と信じられているが、本発明はこの原理に固執するものではない。別法としてこのようなカップリング剤（鎖延長シラン）は、親シランをセンサチップ表面に反応させ、次いで不動化されたシランにリンカーを付加するのに必要な反応を起こさせることによって、ｉｎ ｓｉｔｕで構築することもできる。リガンドは次いで、カップリング剤（即ち、有機性リンカーを有するシラン）によりガラスあるいはプラスチックの表面にテザーされる。また、リガンドをチップ表面から最適距離（４０オングストローム）に離しておくためにリンカーは十分長くなければならない。これは、距離が短いと細菌細胞の捕捉効率が低下するためである。

よって、ガラス表面にテザーされるリガンドは次のように記述することができる。

酸化したプラスチック表面にテザーされるリガンドは上記式の「Ｇｌａｓｓ−Ｏ−Ｓｉ」部分をＣ（プラスチックポリマーからの炭素）で置換したもので示すことができる。センサチップ表面にリガンドをテザーする反応は当業者によく知られており、文献にも記載されている。例えば、Ｇ．Ｔ．ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９６６）、Ｈａｎｓｓｏｎらによる「薄層クロマトグラムへの炭水化物特異的な細菌の接着：宿主細胞の糖脂質受容体の研究への合理的アプローチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ：Ａ Ｒａｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４６：１５８〜１６３（１９８５）、Ｎｉｌｓｓｏｎらによる「尿路病原性細菌の検出のための炭水化物バイオセンサ表面（Ａ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ）」（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１３７６〜１３７８（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４））にそのような反応が記載されている。

そのような反応の例としてはフェロキサミンをリガンドとしてガラスセンサチップの表面にテザーするものが挙げられる。第１の段階において、遊離ヒドロキシル基を有するガラス表面をまずガンマ−Ｎ−（アミノプロピル）−ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシランの２％溶液と反応させ、それによりシランをガラス表面に結合させる。

この生成物を次いでグルタルアルデヒドとｐＨ約８で反応させ、次式のアルデヒドを得る。

得られたアルデヒドを更に次式のジアミン（ＩＩＩ）と反応させ、化合物（ＩＶ）を得る。

次に、前述の反応生成物をグルタルアルデヒドと反応させ、次式で表わされる（末端）アルデヒド基を導入する。

更に、ＮａＣＮＢＨ₃を用いて還元し、次式の化合物（ＶＩ）を得る。

表面に結合した前記シランカップリング剤をデフェロキサミンＢ（ＤＦＡ）とアルカリｐＨにおいて反応させて変性させ、次式の化合物（ＶＩＩ）を得る。

ＤＦＡを水性媒質中、第一鉄塩と反応させて鉄との錯体を生成させ、リガンドを得る。

本発明、特に添付の請求項に規定された精神を逸脱することなく、ここに記載した決定、手続き、調製に対し種々の変更や改良がなされうるものと理解されたい。

テザーヘムでコートされたガラス製の顕微鏡スライドガラス上でSalmonella typhimuriumを捕捉した結果を示す。この病原性細菌の検出は、Ｐｏｗｅｒｓに付与された米国特許第５９６８７６６号に記載された方法及び装置で行った。 テザーヘムでコートされたガラス製の顕微鏡スライドガラス上で、様々な濃度のBacillus globigii中で希釈されたEnterobactor aerogenesを捕捉した結果を示す。この病原性細菌の検出は、Ｐｏｗｅｒｓに付与された米国特許第５９６８７６６号に記載された方法及び装置で行った。

Claims (1)

1. 生物学的分析対象物を基材上に捕捉するための方法であって、
   （ａ）使用されるリガンドが、ヘム化合物、サイドロホア、多糖類、及び外膜タンパク質、コンジュゲート脂質や微生物タンパク質標的に特異的なペプチドから成る群から選択され、
   （ｂ）リガンドは基材表面から少なくとも１５Åの距離にテザーされて微生物を捕捉し、
   （ｄ）基材はカラム充填に適しており、
   （ｅ）生物学的分析対象物が細菌、ウイルス、リケッチア、原生動物、及び菌類からなる群から選択され、
   （ｆ）生物学的分析対象物の基材上への捕捉が水性試料からの生物学的分析対象物の濃縮のために用いられ、
   （ｇ）生物学的分析対象物の基材上への捕捉が医学用試料からの生物学的分析対象物の濃縮のために用いられる方法。

Images