JP4686703B2 - 細胞固定化材 - Google Patents
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Description
特許文献1には、基板表面から少なくとも所定長さ離して該基材表面にリンカーで繋ぎ止めたリガンド(ヘム、シデロフォア、多糖類等)を用いて、生物学的分析対象物を同定する方法が記載されている。シデロフォア等を利用して病原体を同定する技術に関する他の従来技術文献として特許文献2が挙げられる。
かかる構成の固定化材は、リンカーを介して基材上に配置されたシデロフォア又はアナログを備える。したがって、該シデロフォア又はアナログと標的細胞との親和性(典型的には、標的細胞がシデロフォア又はアナログの金属錯体を認識して細胞内に取り込もうとする性質)を利用して、該標的細胞を効率よく捕捉することができる。ここで、リンカーの鎖長は「標的細胞の細胞膜を貫通しない長さ」に規定されている。したがって標的細胞は、上記シデロフォア又はアナログの金属錯体を細胞膜より内側まで取り込むことはできない。このため、細胞内(細胞膜よりも内側)に取り込んだシデロフォア−金属複合体(錯体)から金属を遊離させて利用する、という本来の金属取り込み機構が完遂されない。換言すれば、該取り込み機構の途中で、複合体が細胞膜の内側までは取り込まれないことによって、その進行が妨げられる。このことを利用して、標的細胞がシデロフォア又はそのアナログに捕捉された状態(すなわち、標的細胞が基材上に固定された状態)を安定して維持することができる。
ここに開示される固定化材の一つの好ましい態様では、リンカーの長さが概ね50Å(5nm)未満である。典型的には、リンカーの長さが概ね6Å以上50Å未満である。他の好ましい態様では、リンカーの長さが概ね30Å未満(典型的には、6Å以上30Å未満)である。より好ましい態様では、リンカーの長さが概ね6Å以上15Å未満である。
シデロフォア又はアナログにキレートさせる金属は、そのキレート錯体(複合体)が標的細胞のレセプターによって認識され得るものであればよい。そのような金属の典型例は鉄(Fe)である。また、前述の条件を具備する限り、Fe以外の各種金属をシデロフォア又はアナログにキレートさせてもよい。キレートさせる金属の好適例(Fe以外)としては、Cr(クロム)、Ru(ルテニウム)、Rh(ロジウム)、Os(オスミウム)等の重金属(密度4g/cm3以上の金属をいう。)が挙げられる。
かかる構成の固定化材は、基材上に配置されたシデロフォア又はアナログの重金属錯体(すなわち、重金属をキレートしているシデロフォア又はアナログ)と標的細胞との親和性を利用して、該標的細胞を効率よく捕捉することができる。一方、上記錯体を構成する重金属は前記標的細胞内において該シデロフォア又はアナログから実質的に遊離されない。このため、細胞内に取り込んだシデロフォア−金属複合体(錯体)から金属を遊離させて利用する、という本来の金属取り込み機構を完遂することができない。換言すれば、該取り込み機構の途中で(少なくとも、該錯体を構成する金属が実質的に遊離されないことによって)その進行が妨げられる。このことを利用して、シデロフォア又はそのアナログに標的細胞が捕捉された状態を安定して維持することができる。
かかる構成によると、例えば、基材上に固定化された標的細胞の活動に伴う電流の発生(電気信号)を、リンカーを介して基材側で検出することができる。このことを利用して、基材上に固定化された標的細胞の状態をモニターし得る。また、かかる構成によると、例えば、基材からリンカーを介してシデロフォアに電流を印加することによって、シデロフォアにキレートされている金属の酸化数を制御し得る。これにより、例えば、上記金属とシデロフォア又はアナログとの相互作用の程度を調節することができる。
このような電子伝達が可能な固定化材は、少なくともシデロフォアの配置される表面が導電性材料(Au,Ag,Cu,Ni等)からなる基材を備えることが好ましい。リンカーとしては、(1).鎖長が概ね15Å未満である、及び、(2).鎖の一部又は全体が共役系を構成している、の少なくとも一方を満たすものが好ましい。
−C[R1N(OH)C(=O)R2]3 (1);
表される構造部分を備える人工シデロフォアである。ここで、上記式中のR1は二価の有機基である。該式中のR2は、炭素数1〜6(好ましくは1〜3)のアルキル基である。
上記式(1)は、ヒドロキサム酸(アミドのN−ヒドロキシアミド置換体)部分を有する置換基が一つの炭素(左端の炭素)に三つ結合しているタイプの、三脚構造の配位子である。このような三脚型配位子を構成する人工シデロフォアは、上記ヒドロキサム酸部分を利用して金属(例えば、Fe,Cr,Ru,Rh及びOsのうち一又は二以上)を適切にキレートすることができるので好ましい。
−C[R3NHC(=O)R4N(OH)C(=O)R5]3 (1’);
表される構造部分を備える。上記式中のR3及びR4は、同一の又は異なるアルキレン基であって、R3の炭素数とR4の炭素数との合計は3〜6である。また、上記式中のR5は、炭素数1〜6(さらに好ましくは1〜3)のアルキル基である。R3が炭素数2〜4のアルキレン基であり、R4が炭素数1〜3のアルキレン基であり、かつ、R3の炭素数とR4の炭素数との合計が3〜6であるシデロフォア又はアナログが好ましい。
ここに開示される製造方法は、さらに、前記シデロフォア又はアナログに所定の金属をキレートする工程を含むことができる。この金属キレート工程は、従来公知の各種の方法を適用して実施することができる。
X−C[R1N(OH)C(=O)R2]3 (2);
で表される人工シデロフォアを使用する。ここで、上記式中のR1は二価の有機基である。該式中のR2は、炭素数1〜6(好ましくは1〜3)のアルキル基である。また、Xは、リンカーの先端と結合し得る官能基である。用意した基材に配置されたリンカーが先端にイミド基(好ましくはスクシンイミド基)を有する場合、Xの好適例としては、アミノ基(NH2)又はアルキルアミノ基(NHR0,ここでR0はアルキル基であり、好ましくはメチル基又はエチル基である。)が挙げられる。
Y−C[R3NHC(=O)R4N(OH)C(=O)R5]3 (3);
で表される人工シデロフォアが提供される。ここで、上記式中のR3及びR4は、同一の又は異なるアルキレン基であって、R3の炭素数とR4の炭素数との合計は3〜6である。また、上記式中のR5は、炭素数1〜6(さらに好ましくは1〜3)のアルキル基である。また、上記式中のYは、アミノ基(NH2)、アルキルアミノ基(NHR0,ここで、R0はアルキル基であり、好ましくはメチル基又はエチル基である。)又はニトロ基(NO2)である。R3が炭素数2〜4のアルキレン基であり、R4が炭素数1〜3のアルキレン基であり、かつ、R3の炭素数とR4の炭素数との合計が3〜6である人工シデロフォアが好ましい。
(合成例1)
以下に示す合成スキームにより、人工シデロフォア合成用の中間体(三脚部分)を合成した。
上記で得られた化合物[1]の結晶5.00g(22.7mmol)をテトラヒドロフラン(THF)50mLに溶解させた。このTHF溶液を撹拌しながら、1M(mol/L)のBH3を含むTHF溶液120mLを滴下した。この反応液を4時間還流した。反応液を室温に冷却した後、pHが1〜2になるまで2Mの塩酸を加え、NaOHで中和した。この溶液を濃縮することにより、上記合成スキームに示す化合物[2]の沈殿を得た。
以下に示す合成スキームにより、人工シデロフォア合成用の中間体(ヒドロキサム酸構造を提供する部分)を合成した。なお、下記スキーム中の「Bzl」はベンジル基を表している。
これらの合成例により得られた化合物を使用して、以下に示す合成スキームによって人工シデロフォア[S1]を合成した。なお、下記スキーム中の「DMT−MM」は、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルフォリニウムクロライド(下記化学式(5)に示す化合物)を表している。また、下記スキーム中のnはいずれも2である。
反応液を濃縮した後、水100mLを加えて酢酸エチル100mLで3回抽出した。これを無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して白色油状物を得た。ESI−MASS(エレクトロスプレーイオン化質量分析)の結果から、上記合成スキームに示す化合物[5]が得られたことを確認した。分析データを以下に示す。
ESI−MASS:m/Z=912.0[M+Na]+ 。
得られた人工シデロフォア[S1]と、これと等モルのFe(ClO4)3・nH2Oとを水中で混合した。溶液の色は速やかにオレンジ色に変化した。その結果物につき、UV−Vis(紫外−可視光)スペクトル及びESI−MASS分析を行った。それらの分析データを以下に示す。
UV−Visスペクトル(水中):λmax=422nm。
ESI−MASS:m/Z=643.4[M+H]+ 。
上記UV−Visスペクトルのデータにより、三本の腕(ヒドロキサム酸型の配位子を有する三つの置換基)によるFe(III)イオンへのキレート配位が示唆された。また、上記のESI−MASSスペクトルは、目的とする化合物にH+が付加したものに相当する。これらの結果から、以下に示す錯体[S1−Fe]の形成を確認した。これは、人工シデロフォア[S1]をリガンドとするFe(III)錯体であって、該シデロフォアの三本の腕がFeイオンに6座でキレート配位した構造を有する。
合成例2により得られたN−ベンジルオキシアミン(化合物[3])を出発物質として、以下に示す合成スキームにより、人工シデロフォア合成用の中間体(ヒドロキサム酸構造を提供する部分)を合成した。
上記実施例により得られた人工シデロフォア[S1]の機能を確認するため、該シデロフォアの菌体への取込実験を行った。菌体としては、自らはシデロフォアの合成・分泌を行わず、外来のシデロフォアを利用してFeイオンを取り込むMicrobacterium flavescensを使用した。
ペプトン1g、乾燥酵母1g、K2HPO4 200mg及び鉄キレート剤(天然シデロフォア)2μgを、Milli−Q水(商標「Milli−Q」(ミリポア社製品)により精製した精製水)100mLに溶かし、pH7.4に調整した後、高温高圧で滅菌処理して液体培地を調製した。この培地に人工シデロフォア[S1]を1μM(1μmol/リットル)の濃度となるように加えて30℃で数日間インキュベーションを行った。その間、培地の濁度を濁度計にて測定することによって菌体の培養(増殖)をモニターした。また、コントロール(対照)として、人工シデロフォア[S1]に代えて同濃度(1μM)の天然シデロフォア(商品名「Deferoxamine mesylate」、SIGMA社製品)を使用した点以外は上記と同様にインキュベーションを行って菌体の培養をモニターした。
培養時間の経過に伴う濁度の変化を図1に示す。この図からわかるように、人工シデロフォアを用いた培地においても、天然シデロフォアを用いた場合(コントロール)と同様に菌体の増殖が可能であった。この結果は、Microbacterium flavescensが上記人工シデロフォアをFeイオンの取り込みに利用し得ること、換言すれば、該人工シデロフォアが菌体に取り込まれることを示唆している。また、この人工シデロフォアが、天然シデロフォアと同様に菌体のシデロフォアレセプターに認識されることが確認された。
なお、大腸菌(Escherichia Coli)を用いて同様の培養試験を行ったところ、上記と同様の生理活性が観測された。
上記人工シデロフォア[S1]を用いて、図2に示す手順で細胞固定化材を製造した。基材としては、真空蒸着法により形成された厚さ100nmの金(Au)薄膜を表面に有する雲母板(14mm×14mm角)を使用した。上記金薄膜(金電極)を水素炎でアニール処理した後、Milli−Q水及びDMSOで洗浄した。次いで、この基材をDTSP(ジチオビス(N−スクシンイミジルプロピオネート))のDMSO溶液(20mM)に室温で15分間浸漬した。これにより、金薄膜の表面をDTSP残基(N−スクシンイミジル−3−チオプロピオネート(NSTP))で修飾した。なお、実際には多数のDTSP残基が金表面に単分子膜状に配列するが、図では見易さのため一単位のDTSP残基のみを表示している。
実施例3と同様の組成及び方法で調製した液体培地に、実施例4で製造した固定化材(人工シデロフォア修飾基材)を浸漬させ、菌体(Microbacterium flavescens)を添加した後、30℃で数日間のインキュベーションを行った。また、対照として人工シデロフォアによる修飾がされていない基材(非修飾基材)を使用し、同様に菌体のインキュベーションを行った。これらの固定化材及び非修飾基材(未処理の金薄膜)の表面をリン酸バッファ溶液(50mM、pH7.4)で十分に洗浄した後、それらの表面を光学顕微鏡で観察した。その結果を、固定化材については図3に、非修飾基材については図4に示す。図示するように、人工シデロフォアで修飾された基材(固定化材)の表面には菌体がみられた。これに対して、未処理の金薄膜の表面には菌体がみられなかった。図3と同じ表面をさらに走査型電子顕微鏡(SEM)で観察したところ、図5に示すように、菌体が基材上に固定されている様子がはっきりと確認された。
また、本明細書又は図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組み合わせによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組み合わせに限定されるものではない。また、本明細書又は図面に例示した技術は複数目的を同時に達成するものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
Claims (14)
- シデロフォアを介して鉄を内部に取り込む機構を有する所定の標的細胞を基材上に固定する固定化材であって、
基材と、
該基材の表面に単分子膜状に配列した所定の鎖長のリンカーと、
該リンカーに結合し、該リンカーを介して前記基材上に配置された人工シデロフォアであって、少なくとも一種の金属をキレートし得る部分を備え、下記式(1):
−C[R 1 N(OH)C(=O)R 2 ] 3 (1)
(式中、R 1 は二価の有機基である。R 2 は炭素数1〜6のアルキル基である。);
で表される構造部分を備える人工シデロフォアと、
を備えており、ここで前記リンカーの鎖長は、前記基材上に配置された状態の前記標的細胞の細胞膜を理論上貫通しない長さに規定されていることを特徴とする細胞固定化材。 - 前記人工シデロフォアにキレートされた金属を含む、請求項1に記載の細胞固定化材。
- シデロフォアを介して鉄を内部に取り込む機構を有する所定の標的細胞を基材上に固定する固定化材であって、
基材と、
該基材の表面に単分子膜状に配列した所定の鎖長のリンカーと、
該リンカーに結合し、該リンカーを介して前記基材上に配置された人工シデロフォアであって、少なくとも一種の金属をキレートし得る部分を備え、下記式(1):
−C[R 1 N(OH)C(=O)R 2 ] 3 (1)
(式中、R 1 は二価の有機基である。R 2 は炭素数1〜6のアルキル基である。);
で表される構造部分を備える人工シデロフォアと、
前記人工シデロフォアにキレートされた重金属であって前記標的細胞内において該人工シデロフォアから実質的に遊離されない重金属と、
を備えることを特徴とする細胞固定化材。 - 前記リンカーの鎖長は、前記基材上に配置された状態の前記標的細胞の細胞膜を理論上貫通する長さに規定されている、請求項3に記載の細胞固定化材。
- 前記標的細胞が細菌細胞である、請求項1〜4のいずれかに記載の細胞固定化材。
- 前記基材、前記リンカー及び前記人工シデロフォアは、該基材と前記人工シデロフォアとの間で該リンカーを介した電子伝達が可能となる物質により構成されている、請求項1〜5のいずれかに記載の細胞固定化材。
- 前記人工シデロフォアは、下記式(3):
Y−C[R 3 NHC(=O)R 4 N(OH)C(=O)R 5 ] 3 (3)
(式中、R 3 及びR 4 は同一の又は異なるアルキレン基であってR 3 の炭素数とR 4 の炭素数との合計は3〜6である。R 5 は炭素数1〜6のアルキル基である。Yはアミノ基、アルキルアミノ基又はニトロ基である。);
または下記式(4):
で表される人工シデロフォアがリンカーに結合したものである、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞固定化材。 - シデロフォアを介して鉄を内部に取り込む機構を有する所定の標的細胞を基材上に固定する固定化材を製造する方法であって、以下の工程:
所定の鎖長のリンカーが表面に単分子膜状に配列した基材を用意する工程、ここで該リンカーの鎖長は、該基材上に配置された状態の前記標的細胞の細胞膜を理論上貫通しない長さに規定される;及び
少なくとも一種の人工シデロフォアであって少なくとも一種の金属をキレートし得る部分を備え、下記式(2):
X−C[R 1 N(OH)C(=O)R 2 ] 3 (2)
(式中、R 1 は二価の有機基である。R 2 は炭素数1〜6のアルキル基である。Xは前記リンカーの先端と結合し得る官能基である。);
で表される人工シデロフォアを、前記リンカーに結合する工程;
を包含する方法。 - 前記人工シデロフォアに所定の金属をキレートする工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- シデロフォアを介して鉄を内部に取り込む機構を有する所定の標的細胞を基材上に固定する固定化材を製造する方法であって、以下の工程:
所定の鎖長のリンカーが表面に単分子膜状に配列した基材を用意する工程;及び
少なくとも一種の人工シデロフォアであって、少なくとも一種の金属をキレートし得る部分を備え、下記式(2):
X−C[R 1 N(OH)C(=O)R 2 ] 3 (2)
(式中、R 1 は二価の有機基である。R 2 は炭素数1〜6のアルキル基である。Xは前記リンカーの先端と結合し得る官能基である。);
で表される人工シデロフォアを、前記リンカーに結合する工程;及び
前記人工シデロフォアに、少なくとも一種の重金属であって前記標的細胞内において該人工シデロフォアから実質的に遊離されない重金属をキレートする工程;
を包含する方法。 - 前記人工シデロフォアとして、下記式(3):
Y−C[R 3 NHC(=O)R 4 N(OH)C(=O)R 5 ] 3 (3)
(式中、R 3 及びR 4 は同一の又は異なるアルキレン基であってR 3 の炭素数とR 4 の炭素数との合計は3〜6である。R 5 は炭素数1〜6のアルキル基である。Yはアミノ基、アルキルアミノ基又はニトロ基である。);
で表される人工シデロフォア、もしくは、
下記式(4):
で表される人工シデロフォアを用いる、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。 - 下記式(3):
Y−C[R3NHC(=O)R4N(OH)C(=O)R5]3 (3)
(式中、R3及びR4は同一の又は異なるアルキレン基であってR3の炭素数とR4の炭素数との合計は3〜6である。R5は炭素数1〜6のアルキル基である。Yはアミノ基、アルキルアミノ基又はニトロ基である。)
で表される人工シデロフォア。 - 下記式(4):
- シデロフォアを介して鉄を内部に取り込む機構を有する所定の標的細胞を基材上に固定する方法であって、以下の工程:
請求項1〜7のいずれかに記載の固定化材を用意する工程;及び
前記固定化材に含まれる人工シデロフォアによってキレートされ得る少なくとも一種の金属の存在下において該固定化材に前記標的細胞を接触させる工程;
を包含する方法。
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