JP2003185668A - 病原性微生物の分類学的同定及び病原性微生物の毒性タンパク質 - Google Patents

病原性微生物の分類学的同定及び病原性微生物の毒性タンパク質

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】特定の微生物種、病原菌及び非病原菌群におい
てこれらを区別する能力を有し、診断用途において微生
物タンパク質を同定するためにも用いることができる、
微生物及びタンパク質の分類学的評価方法を提供する。 【解決手段】リガンドは基材の表面から幾分離れた位置
に共有結合的にテザーされる。微生物の結合を目的とし
たリガンドの場合のテザーは少なくとも１５Å、タンパ
ク質の結合を目的としたリガンドの場合のテザーは少な
くとも６Åであることが必要である。本発明におけるリ
ガンドとしては、毒性タンパク質、外膜タンパク質及び
コンジュゲート脂質に特異的な、ヘム化合物、シデロフ
ォア、多糖類及びペプチドを含む。分析に付される溶液
中の非結合成分は結合画分から分離され、結合は、顕微
鏡法、蛍光法、エピ蛍光法、ルミネッセンス法、燐光
法、放射能法、あるいは吸光度法によって検出すること
ができる。基材表面に多くのリガンドをアレイ状にパタ
ーン化により、アレイに対する試料の結合パターンを分
析すれば、微生物を分類学的に同定ができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は病原性微生物の分類
学的同定及び病原性微生物のタンパク質トキシンを検出
するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】病原性微生物、中でも自然界に発生する
病原性細菌や毒性因子を獲得した病原性細菌は、人類を
苦しめる多くの疾病の原因である。これらの細菌の多く
は細菌戦の媒介物として提案されてきた。加えて、非病
原性微生物が遺伝子操作の後、病原菌としても使用され
得る危険や可能性が存在する（例えば、コレラトキシン
を内包する大腸菌）。
【０００３】病原性細菌の典型的なものとして、ボツリ
ヌス中毒、腺ペスト、コレラ、ジフテリア、赤痢、ラ
イ、髄膜炎、猩紅熱、梅毒及び結核の原因となっている
細菌が挙げられる。過去数十年の間、病原性細菌に対す
る一般の理解は工業化した国々では無関心に近いもので
あったが、これは主として、抗生物質による治療によっ
てこれらの疾病と闘って達成した成功の所為である。し
かしながら、細菌は驚く程抗生物質に耐性を示すように
なってきた。加えて、細菌が人間の疾病で果たしている
新しい役割、例えばヘリコバクター・ピロリ（Helicoba
cter pylori）が消化性潰瘍の原因となる媒介物である
こと、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cep
acia）が新しい肺疾患の病原菌でああること、更にクラ
ミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）が冠動
脈心疾患の引き金となっている可能性があること等の驚
くべき新事実が最近明るみに出ている。これらの病原菌
を別としても、様々な社会経済上の変化が、細菌、例え
ば大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmon
ella spp.）、ビブリオ菌（Vibrio spp.）、カンピロバ
クター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）等、によ
る食物媒介による感染が世界中で上昇するのに同様に寄
与している。
【０００４】戦場医学においては、潜在的感染もまた重
要な考慮対象である。炭疽菌（Bacillis anthracis）や
ペスト菌（Yersinia pestis）等の多くの細菌性病原
菌、更にはそれらのエキソトキシンが武器として使用さ
れてきている。また、非病原性の微生物を病原性を有す
るように改変でき、それが細菌戦の媒介物として用いら
れる可能性があるという危険が常に存在する。
【０００５】病原性微生物は、また、家畜及び家禽産業
並びに野生生物の取扱いにおいても考慮すべき対象であ
る。例えば、ウシ流産菌（Brucella abortus）はウシ類
の家畜の仔の自然流産を引き起こす。エキソトキシン産
生微生物で汚染された水源は、鳥や魚や哺乳動物個体の
死に影響を与えてきた。ごく最近、狂牛病は、フィルタ
で保持されないタンパク質粒子の経口伝染に起因するこ
とが突きとめられた。従って、動物や人間を疾病に罹ら
せる毒性タンパク質及び病原性微生物についてフィール
ド分析を実施するための迅速且つ廉価な技法の必要性は
明白である。
【０００６】一般的に言えば、細菌汚染は通常の光学顕
微鏡検査で検出できる。しかしながら、分類学的見地か
らはこの方法の価値は限られている。寸法が数ミクロン
そこそこの範囲を調べて汚染の程度を決めることは困難
且つ時間の浪費である。市販のシステムの多くは、細菌
培養による増殖を利用して充分に大きな試料（増殖物）
を得た上で、種（あるいは属）の同定のために分別的代
謝試験を行うものとなっている。しかしながら、細菌の
増殖を必要とする技法は、生存可能ではあっても培養不
能な細胞については検出できない。一方、用いた生育培
地が、特定の表現型を有する細菌を容易に増殖させてし
まう可能性もある。
【０００７】より高感度でより迅速なタイピングの方法
がＳ．ＰｉｌｌａｉとＳ．Ｃ．Ｒｉｃｋｅによる「肉及
び肉加工品における病原菌検出のための遺伝子増幅プロ
トコルの適用可能性を促進する戦略的方策（Ｓｔｒａｔ
ｅｇｉｅｓ ｔｏ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｈｅ Ａ
ｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐ
ａｔｈｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅａｔ
ａｎｄ Ｍｅａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（Ｃｒｉ
ｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１（４），２３９
〜２６１（１９９５））やＲ．Ｍ．Ａｔｌａｓ、Ｇ．Ｓ
ａｙｌｅｒ、Ｒ．Ｓ．Ｂｕｒｌａｇｅ及びＡ．Ｋ．Ｂｅ
ｊによる「微生物の環境モニタリングのための分子的ア
プローチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ
ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒ
ｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」（Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（５），７０６〜７１７
（１９９２））に記載されている。これらの技法はポリ
メラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって細菌のＤＮＡ又
はＲＮＡを増幅し、続いて核酸配列を決定して特定の細
菌種の存在を検出するものである。そのような増幅及び
配列決定技法は一般に技術的な経験を必要とし、特化さ
れた実験室条件以外では簡単には利用できない。ＰＣＲ
に基づく各種技法は微生物が存在しているという推測を
利用するものである。何故ならばこれらの技法は、完全
な標的核酸配列が検出されさえすれば（必ずしも微生物
が検出されなくても）分析したことになるからである。
また、ＰＣＲは毒性微生物タンパク質の存在を検出する
こともできない。更に、標的ＤＮＡの効果的な増幅を阻
む物質が「汚れた」試料中に存在すると、特定の微生物を
環境試料から検出することが困難になってしまう。
【０００８】細菌やウイルスの検出は、試料を細胞溶解
又は熱分解に付した後に揮発性の細胞成分（例えば、脂
肪酸）を質量スペクトル分析することで行われてきた。
この方法で微生物を検出する例として、Ｆ．Ｘｉａｎ
ｇ、Ｇ．Ａ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔ．Ｄ．Ｖｅｅｎｓｔ
ｒａ、Ｍ．Ｓ．Ｌｉｐｔｏｎ及びＲ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈに
よる「細胞溶解物のグローバルＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析
による微生物の特徴付けとバイオマーカーの開発（Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔｆｒｏｍ Ｇｌｏｂａｌ ＥＳＩ−Ｍ
Ｓ／ＭＳ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓ
ａｔｅｓ）」（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１１），２
４７５〜２４８１（２０００））に記載されている。惜
しいことに、微生物の揮発性成分の組成は環境の増殖条
件次第で変化するので分析対象物の同定は信頼できな
い。
【０００９】別の方法は、Ｍ．Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒ、
Ｂ．Ａｓｓｍｕｓ及びＡ．Ｈａｒｔｍａｎｎによる「環
境中のバクテリアを検出・同定する免疫学的方法の使用
（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｙ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．１
３，７５〜８０（１９９５））に記述されているように
免疫化学的な捕捉を利用し、続いて捕捉された細胞を光
学的に検出することである。最も一般的な免疫測定法
（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））の検出限界は数百細
胞である。この検出限界はフレクスナー赤痢菌（Shigel
la flexneri）等の非常に伝染性のある細菌のＩＤ50よ
りはるかに下である。Ｅ．Ｐｒｕｓａｋ−Ｓｏｃｈａｃ
ｚｅｗｓｋｉとＪ．Ｈ．Ｔ．Ｌｕｏｎｇによる「サルモ
ネラ・チフィムリウム検出のための圧電イムノセンサ開
発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｐｉｅｚｏｅ
ｌｅｃｔｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）」（ＥｎｚｙｍｅＭｉ
ｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１７３〜１７７（１
９９０））に記載されている圧電検出技法等の検出技法
は感度が低く、その検出限界は約５×１０5細胞であ
る。Ｄ．Ｒ．Ｂａｓｅｌｔ、Ｇ．Ｕ．Ｌｅｅ及びＲ．
Ｊ．Ｃｏｌｔｏｎによる「フォース顕微鏡技術に基づい
たバイオセンサ（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏ
ｎ ＦｏｒｃｅＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）」（Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏ
ｎ．１３，７３１〜７３９（１９９８））という表題の
最近の報告書は免疫捕捉された細胞を検出するために原
子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いることを記述している。
この方法は、実験室環境の外で行う場合や試料容積が大
きい場合には、ほとんど役に立たない。免疫測定法もま
た、現在、ペプチドやタンパク質の微量分析に用いられ
ている。
【００１０】更に、従来の技術においてはペプチド／タ
ンパク質／微生物捕捉の際に固定化抗体を広範に利用し
てきた。用いられる抗体はｐＨ、イオン強度及び温度の
変化に非常に敏感なので、それら従来技術に係る技法も
重大な問題を同様に含んでいる。抗体は、「汚れた」試料
中の多数のタンパク質分解酵素によって分解されやす
い。更に、表面（例えば、マイクロウエルプレートや磁
気ビーズ）上に支持される抗体分子の密度が低く、必要
とされるレベルに満たないことがしばしばある。現時点
での技術水準は、Ｎ．Ｈｏｂｓｏｎ、Ｉ．Ｔｏｔｈｉｌ
ｌとＡ．Ｔｕｒｎｅｒによる「微生物の検出（Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」（Ｂｉｏｓｅｎ
ｓ．＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１１，４５５〜４７７
（１９９６））に簡潔に纏められている。
【００１１】医学面や軍事面の事情から、トキシンや病
原菌の検出のためのより優れた各種技術が要求されてい
る。リモートセンシングユニットによる戦場汚染のリア
ルタイム評価が、適切な対策を行うための迅速な診断を
可能ならしめ且つ容易ならしめるために必要である。か
かる状況で微生物／毒性タンパク質センサが有用である
ためには、広範囲に病原菌と非病原菌とを区別する能力
を必要とする。更に、かかる各種技法は、存在する細胞
が百個未満の場合には高感度を、またフイールドで十五
分未満で完了できる分析方法を必要とする。かかる各種
技法は病原菌を認識できると共に、菌株の毒性やトキシ
ン産生性に関する何らかの評価を提供できるものでなけ
ればならない。
【００１２】今日まで、病原性微生物や病原性微生物の
タンパク質トキシンの同定のために用いられている一般
的手法は、免疫学的各種方法の利用である。免疫学的方
法は、抗体がｐＨ、イオン強度、温度に対して敏感であ
るという欠点を有し、抗体自体がタンパク質分解される
と共に、貯蔵状態に関する厳しい管理を必要とする。こ
れらの問題点を克服するために、本発明は非抗体に基づ
くリガンドを使用して微生物及び微生物のタンパク質ト
キシンを捕捉しようとするものである。従って、抗体に
依存する技術の上記欠点を克服する、微生物及びタンパ
ク質の分類学的評価方法を提供することが本発明の目的
である。
【００１３】特定の微生物種、病原菌及び非病原菌群に
おいてこれらを区別する能力を有し、診断用途において
微生物タンパク質を同定するためにも用いることができ
る、微生物及びタンパク質の分類学的評価方法を提供す
ることが本発明の更に明確な目的である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヘム化合物、
シデロフォア、多糖類及びペプチドの、病原性微生物及
びそれらのタンパク質トキシンに対する結合能を明らか
にする。即ち、微生物に結合するリガンドの数と種類を
分析することによって、その微生物を分類学的に同定す
るものである。この方法は、上に述べた抗体に基づく技
術の限界を克服するために開発された。本発明の思想は
微生物の分類学的同定方法にあり、該方法では、微生物
の受容体をこれに特異的なリガンドに結合させることに
より、微生物が捕捉される。微生物含有試料をリガンド
と接触させるが、このリガンドは基材表面にテザー（te
ther; 鎖繋）されたものであるか、あるいはマーカーに
結合(conjugate)している。次いで、標的微生物（細
菌、ウイルス、真菌類、原生動物、リケッチア、その他
の細胞）やタンパク質性物質（トキシン）は洗浄や、磁
気分離、クロマトグラフィーによって結合に関与しない
試料成分や未結合リガンドと分離される。最後に、適切
な方法によって、試料から標的やマーカーの内因性信号
を検出することにより、リガンドが標的に結合している
か否かを決定する。
【００１５】電磁放射は、本発明に係る、捕捉された微
生物及び／又はトキシンの存在の検出に用いられる一方
法であって、微生物生体特有の代謝物（例えば、還元ピ
リジンヌクレオチドやその他の蛍光代謝物）、他の生体
分子（例えば、タンパク質中のトリプトファンやチロシ
ンが有名）、取込ませた色素の存在の如何について検出
するものである。例えば、リガンドが蛍光色素を含んで
いる場合には、試料を洗浄すると、リガンドは細胞に結
合したままで余分なものが洗い流されるので、蛍光発光
が見られるであろう。同様に、他のマーカー、例えば発
光性、燐光性、放射性及び／又は発色性(colorometric)
化合物もリガンドと結合でき、よって微生物及び／又は
タンパク質トキシンを同定するために用いることができ
る。
【００１６】微生物又は毒性タンパク質の捕捉を検出す
るための特異的一方法が米国特許第５，７６０，４０６
号及び第５，９６８，７６６号に記載されており、そこ
では、電磁放射は、上述のような分析対象物含有溶液で
処理されたリガンド結合基質の例えば表面に向けてなさ
れる。この検出方法は、分析対象物が実際に結合したか
どうかを決定するためには用いることができるであろ
う。リガンドに結合する特定の種類のマーカーに対して
適切に用いられる他の検出方法もまた、該リガンドが微
生物や毒性タンパク質に特異的に結合しているか否かを
決定するために用いられる。先に言及した例では、リガ
ンドに結合させた蛍光色素を微生物の検出に適用してお
り、この検出は、（１）微生物とリガンドとを接触さ
せ、（２）過剰な色素結合リガンドを洗浄除去する、と
いう工程の後に、該色素の蛍光特性を調べることによっ
て行われるものである。捕捉された微生物やタンパク質
を検出するために光学的方法が用いられる場合には、テ
ザーが光切断されないように注意することが重要であ
る。
【００１７】従って、本発明の方法は古典的な抗原抗体
認識に依存しない。対照的に、本発明の発明思想では、
試料中に含まれる微生物や微生物タンパク質の捕捉に比
較的廉価な試薬が利用される。
【００１８】本発明の一実施態様では、各種センサチッ
プ（又はビーズ）が用いられる。これらのチップは、リ
ンカーとリガンドを表面に結合させるために用いられる
化学反応と、使用検出方法との双方に適合する、適切な
支持物質、例えばガラスやプラスチックの基材（ポリ
（プロピレン）やポリ（ビニルアセテート）等）から形
成されるべきである。センサチップは、該チップの表面
に複数の区画を画定するパターン化されたアレイで形成
されており、各区画には、特定の微生物タンパク質や微
生物受容体を（従って微生物自体を）分子レベルで認識
しうる異なるリガンドが結合されている。微生物受容体
としては、例えば、微生物細胞の表層細胞膜に存在する
タンパク質、線毛、鞭毛等が挙げられ、線毛又は鞭毛は
細胞を取り囲む水性環境に曝されている。センサチップ
の表面に結合された病原菌／タンパク質捕捉のためのリ
ガンドは変化させることができ、また変化させなければ
ならない。一般に、このようなリガンドは、幅広い微生
物や毒性タンパク質を捕捉できるヘム化合物、シデロフ
ォア、多糖類、抗接着ペプチド等として特徴付けられ
る。従って、これらのリガンドは、リガンドと反応する
能力を同様に有する適切な長さのクロスリンカーを介し
て固定化、即ちセンサチップの表面に結合させることが
でき、そしてそれによってカップリング剤が、センサチ
ップの表面と種々の異なった微生物及びタンパク質と反
応できるリガンドとの間に化学的テザーを確立する。セ
ンサチップ及びアレイを、まず（１）微生物又は毒性タ
ンパク質含有溶液に曝露・接触させ、次いで（２）溶液
中の非結合成分を除去し、更に（３）リガンドがテザー
されている表面（以下、リガンド・テザー表面と称す
る）を調べて分析対象物の結合を検出する。微生物や、
完全な(intact)微生物細胞内には含まれていない微生物
タンパク質を捕捉したことが確認された、リガンドがテ
ザーされた表面のタイプやパターンを分析することによ
って、微生物やその毒性タンパク質を分類学的に同定す
ることができる。
【００１９】従って、本発明によれば、微生物を培養増
殖させたり、産生させた培養物を微視的に調べる必要な
しに、微生物を迅速に同定することができる。また、低
レベルの毒性微生物タンパク質も同様に同定できる。更
に、微生物の代謝物を捕捉する際において、従来技術で
しばしば用いられている、酵素又は抗体を用いることも
不要である。本発明のこれらのまたその他の目的、特徴
及び利点は、以下に開示する実施態様の詳細な記載及び
添付の特許請求の範囲の精査により明らかになるであろ
う。
【００２０】
【発明の実施の形態】本明細書で説明するテザーヘム(t
ethered heme)による病原性細菌（Salmonella typhimur
ium）の捕捉に関し、その結果を図１に示す。（捕捉し
た細菌の検出は米国特許第５９６８７６６号に記載の方
法及び装置を用いて行った。使用可能な細菌検出方法は
多数存在するが、米国特許第５９６８７６６号に記載の
方法を採用したのは、スライド上の細菌がかなり少数で
も検出できるためである。）図１から、テザーヘムリガ
ンドを用いて細菌を捕捉した場合の検出限界（＜１００
細胞）は、免疫学的手法を用いた場合に得られる結果
（最適条件下で約４００細胞）よりも低いことが判明し
た。微生物とヘムリガンドの間の結合は、微生物と抗体
との結合の場合に比べ、ｐＨ、イオン強度、温度に影響
されない。ヘムリガンドはまた低廉で、貯蔵にもほとん
ど注意を要さず、抗体のように容易にタンパク質加水分
解を受けない。
【００２１】図２は、非病原体（Bacillus globigii）
を含有する各種溶液で同じ濃度に希釈した病原性細菌
（Enterobactor aerogenes）を、テザーヘムによって捕
捉した結果を示す。この図は、非病原菌と病原菌の割合
が１０7：１であっても、テザーヘムでコートしたスラ
イドは、溶液から病原性細菌を効果的に捕捉できること
を示している。捕捉した細菌の検出は、Ｐｏｗｅｒｓに
付与された米国特許第５９６８７６６号に記載されてい
る装置で行った。
【００２２】本発明の一実施形態においては、まず、未
知の分析対象物である微生物やタンパク質トキシンを含
む試料を、リガンドと接触させる。リガンドはチップや
ビーズの表面に結合させておくことができる。結合効率
は、テザーの鎖長による。約４０Åの長さの微生物がリ
ガンドに最も効率良く結合することがわかっている。微
生物捕捉用のリガンドについては、少なくとも長さ１５
Åのテザーによってこれらリガンドを基材表面に共有結
合的に付着させる。なお、タンパク質トキシン捕捉用の
リガンドのテザーは少なくとも長さ６Åである。その
後、分析対象物を物理的に非結合試料から分離する。表
面にテザーされたリガンドによって捕捉された分析対象
物は、チップやビーズの表面を洗浄するだけで、試料中
の非結合成分から分離させることができる。その後、基
材の表面を調べて分析対象物がリガンドに結合したかど
うかを決定する。基材表面における微生物の結合は、顕
微鏡法、内因性蛍光発光法、コンジュゲート・ダイ (co
njugate dye) 蛍光発光法、放射能法、ルミネッセンス
法、燐光法、及び／又は吸光度法によって検出すること
ができる。微生物やタンパク質の同定は、その結合相手
のリガンドが何であるかにより決定される。テザーは、
リガンド・テザー面を洗浄するのに使用した溶液中で光
切断されないこと、あるいは化学的に不安定でないこ
と、が重要である点に注意しなければならない。
【００２３】本発明の一形態においては、まず、未知の
分析対象物微生物やタンパク質を含む試料を、センサチ
ップに接触させる。センサチップは、例えばガラス等の
基材から形成され、チップ表面に一連のセクションを有
する。各セクションには、それぞれ異なるリガンドが結
合され、特定の分析対象物に結合できるようにされてい
る。これらリガンドは、分析対象物と結合することによ
って該対象物を捕捉することができ、捕捉された分析対
象物の存在の検出は、例えば米国特許第５７６０４０６
号及び５９６８７６６号に記載され、請求されている蛍
光検出システムを用いて、タンパク質トキシンの内因性
蛍光発光を検出することによって行う。このように、セ
ンサチップのセクション群のそれぞれにおけるリガンド
は、特定の微生物細胞や微生物タンパク質を捕捉するこ
とができる。使用したチップは取っておき、捕捉微生物
を生育させるのに用いることもできる。
【００２４】本発明の他の一形態においては、未知の分
析対象物（微生物、タンパク質トキシン、あるいはその
他のタンパク質）を含む試料を、まず、マーカーと結合
(conjugate)させたリガンドに接触させる。マーカーと
しては、蛍光色素が挙げられるが、これに限定されな
い。非結合試料成分と過剰のリガンドは、リガンド結合
分析対象物から分離させる。この分離は、細胞に対して
は遠心分離で、タンパク質に対しては磁気沈降やクロマ
トグラフィーで行われる。分析対象物とリガンドの結合
の検出、即ち、分析対象物の分類学的同定は、マーカー
を検出することにより行われる（例えば、上記例示で言
及したダイ・コンジュゲート(dye-conjugate)の蛍光発
光）。
【００２５】本発明の他の一形態においては、まず、未
知の分析対象物（微生物やタンパク質）を含む試料を、
上記のように適切な長さのリンカーを用いて基材表面に
テザーさせたリガンドに接触させる。物理的分離及び洗
浄によって、溶液中の非結合成分を除去する。当業者で
あれば理解できるであろうが、捕捉した微生物やタンパ
ク質は反応性マーカーで処理することができる。但し、
この場合の条件として該マーカーは基材表面とリガンド
のどちらとも反応しないものでなければならない。分析
対象物と接触させた一種以上のリガンドに対応する表面
領域上のマーカーを検出することにより、特定の分析対
象物の存在が示唆される。
【００２６】本発明の好ましい一形態においては、本発
明で用いるリガンドは、各種ヘム化合物、シデロフォ
ア、多糖類（オリゴサッカライドを含む）及びペプチド
からなる群から選択される。
【００２７】当業者にはよく知られているように、動物
の病原体は一般に、ヘムを取り込む能力を有しており、
このため、ヘム化合物は各種病原体を捕捉するのに用い
ることができる。ヘム化合物の他に、高親和性鉄キレー
トの形態のリガンド（一般にシデロフォアと呼ばれてい
る）も、多くの病原体細菌株を捕捉するのに用いること
ができる。シデロフォアの例としては、アルカリジン、
マイコバクチン、ピオチェリン、スタフィロフェリン、
ビブリオバクチン、ヤシニアバクチンが挙げられる。
【００２８】当業者によく知られ、また、上にも述べた
ように、マーカーで標識したヘム化合物やシデロフォア
に動物の病原体を結合させることによって、病原体を分
別することもできる。そのような方法の例としては、蛍
光性、発光性、燐光性、化学発光性、あるいは放射能性
の化合物と結合させたシデロフォアやヘム化合物を含む
細菌含有溶液をインキュベートする方法が挙げられる。
細胞を洗浄後、動物の病原体の検出は、標準的な蛍光
法、比色法、あるいは放射能検出技法によって行うこと
ができる。支持体にテザーされているヘム化合物やシデ
ロフォアに、動物の病原体を結合させることによって、
例えば水等の各種環境試料から病原体微生物を分離さ
せ、濃縮及び／又は精製することもできる。
【００２９】ヘム化合物やシデロフォアの他に、微生物
細胞受容体により認識される、真核生物性の表面エピト
ープ（ペプチドや炭水化物）も同様に、本発明の実施に
おいてリガンドとして用いることができる。このリガン
ドとしては、化学的な合成によって得られる各種オリゴ
サッカライドや多糖類のみならず、天然に存在するもの
も含まれる。その他のオリゴサッカライド類、及び各種
微生物に由来する病原体に対するこれらオリゴサッカラ
イド類の親和性については、Ｋ．Ａ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ
著の「標的細胞グリココンジュゲートの細菌による認識
（Ｍｉｃｒｏｂａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ）」（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
５：６２２−６３５（１９９５））に記載されている。
【００３０】様々な病原性細菌の特性（各細菌種によっ
て引き起こされる疾病や、シデロフォア、オリゴサッカ
ライド、ヘム化合物との結合特性を含む）を表１に示
す。この特性は、各種細菌の捕捉や同定に用いることが
できる。
【００３１】ペプチドリガンドは一般に、オリゴヌクレ
オチド・ライブラリーの親和性パンニングによって同定
した上で、化学的に合成することができる。シデロフォ
アリガンドは、化学合成や微生物を培養した培地からの
単離によって得られる。オリゴサッカライドリガンド
は、化学合成や真核生物の組織からの分離によって得ら
れる。ヘム化合物は一般に、開始剤としてプロトポルフ
ィリンＩＸを用いた化学合成により得られる。
【００３２】
【表１】
【００３３】１分子中に少なくとも１個のトリプトファ
ン又はいくつかのチロシンを有するトキシンは、テザー
されたペプチドで捕捉した後、トリプトファン／チロシ
ン蛍光によって検出することができる。藻類、真菌類、
細菌類等、種々の微生物がエキソトキシンを排出するの
で、この技術によって検出できる。
【００３４】表２に、（１）本明細書に記載の技術を用
いて捕捉でき、（２）最終的にはタンパク質の内因性蛍
光によって検出できる、毒性の細菌タンパク質の例を示
す。ここで、トリプトファン１個のみ、チロシン２２個
という、表２の中で最も好ましくないケースであるＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ エンテロト
キシンＢについては、Ｔｒｐ残基１個に関する蛍光の研
究、即ち、Ｂ．Ｒ．Ｓｉｎｇｈ、Ｍ．Ｌ．Ｅｖｅｎｓｏ
ｎとＭ．Ｓ．Ｂｅｒｇｄａｈｌによる「円二色性と蛍光
分析法を用いた、スタフィロコッカス・エンテロトキシ
ンＢ及びＣ１の構造分析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｅｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ
Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ１ Ｕｓｉ
ｎｇ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ａｎｄ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐ
ｙ）」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７；８７３５〜
８７４１（１９８８））が存在する。当業者にはよく知
られているように、（スキャッタード励起信号に標準化
した）トリプトファン／チロシン蛍光が検出されさえす
れば、細胞胞子、生存不能な細胞、生存可能な栄養細菌
細胞や栄養真菌細胞、ウィルス、微生物トキシン等がセ
ンサチップのセクター表面に存在する（即ち、リガンド
に結合している）ことが示されたことになる。
【００３５】
【表２】
【００３６】上述のように、センサチップの各セクショ
ンには互いに異なるリガンドがテザーされている。この
センサチップを未知の生物やタンパク質を有する試料と
接触させると、センサチップ表面の特定の一種以上のリ
ガンドが特定の一種以上の分析対象物を選択的に捕捉し
結合する。未結合の分析対象物を適切な溶液（リン酸緩
衝液等）で洗い流した後、センサチップを適切な検出技
法に付す。センサチップの一以上のセクションに細菌が
存在することを検出する技法の例が、米国特許第５７０
６４０６号、第５９６８７６６号に開示されており、結
合した分析対象物の存在に特徴的な蛍光を励起する適切
な波長の電磁放射を用いた装置が記載されている。
【００３７】当業者にはよく知られているように、分析
対象物を捕捉するのに使用したテザーリガンドがそれ自
体蛍光を発するものである場合、この蛍光は分析対象物
と結合すると変化する可能性がある。（この蛍光の変化
は、強度の変化として、あるいは、特性蛍光エネルギー
のシフトとして見られるであろう。）テザーリガンドの
このような蛍光の変化を、分析対象物の検出を確認する
ために用いることができる。
【００３８】本発明においては、未知の微生物を含む試
料をセンサチップに接触させることができ、それにより
各種細菌の一以上の受容体がセンサチップの様々なセク
ションにテザーされている各種リガンドと反応する。そ
の後、センサチップの各セクションの内のどれとどれが
それらに対応する分析対象物と結合しているのかを検出
するために、プローブによりチップの蛍光を測定する。
例えば、ミコバクテリア・シデロフォア類はＭｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等のミコ
バクテリアを捕捉するのに使用できる。また、ｈｅｌｉ
ｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉは、テザーされたＮ−
アセチルニューロアミニル−アルファ−２，３−ガラク
トースで捕捉することができる。更に、次のペプチド、 ＧＡＤＲＳＹＬＳＦＩＨＬＹＰＥＬＡＧＡＧＧＧＣ をテザーしておけば、その末端システイン基によって、
特にフリーのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ トキシックショック・トキシン−１を捕捉でき
る。また、次のペプチド、 ＧＨＨＫＨＨＨＧＧＧＣ も、これをテザーしておくことにより、その末端システ
イン基によって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓの表面に露出しているプロテインＡを、よって
結局この生物自体を、特異的に捕捉できる。Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ トキシックショッ
ク症候群トキシン−１結合ペプチドについては、Ａ．Ｓ
ａｔｏらによる「ファージディスプレイライブラリーか
らの、トキシックショック症候群トキシン−１に結合し
その主要組織親和性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と
の結合を阻害するペプチドの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａ
ｙ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ
Ｂｉｎｄ ｔｏ Ｔｏｘｉｃ Ｓｈｏｃｋ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ Ｔｏｘｉｎ−１ ａｎｄ ｔｈａｔ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔ ＩｔｓＢｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｍａｊｏｒ
ＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ
（ＭＨＣ） Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｓ）」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、１０４４１
−１０４４７（１９９６））に記載がある。
【００３９】上で述べた通り、捕捉された単一の微生物
種の存在、あるいは分離された微生物タンパク質の存在
が確認できれば、分析を所望する対象である、各種分析
対象物のうちいくつかを確定できる。しかしながら、捕
捉された２種以上の分析対象物が、特定の分析対象物一
種を同定する場合がある。例えば、下に示す縦３列、横
３列のセクションを有するセンサチップについて考えて
みる。
【００４０】
【表３】
【００４１】この例では、次のリガンドを上記各セクシ
ョンに用意する。 セクション位置 リガンド（３×３の配列） Ａ１ アシアロＧM1 Ａ２ ヘミン Ａ３ ピオチェリン Ｂ１ Ｇａ１ＮＡｃβＧａ１ Ｂ２ アルカリジン Ｂ３ フィブロネクチン（ペプチド断片） Ｃ１ 抗S. aureus プロテイン Ａ ペプチド Ｃ２ スタフィロフェリン Ｃ３ フェロキサミン Ｂ
【００４２】分析対象物がセクションＡ１、Ａ２、Ａ
３、Ｂ１、Ｃ３において検出されるときには、問題の微
生物としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａが同定されることが判明した。同様に、セクション
Ａ２、Ｂ１、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に分析対象物が捕
捉されて存在するときには問題の微生物としてＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを同定することが
できる。この場合には、セクションＣ１において分析対
象物が捕捉されることが分類学的同定には十分である。
Ａ２、Ｂ１、Ｂ３、Ｃ２、Ｃ３の各セクションにおける
細胞の捕捉はこの結果を補強するものである。所定の分
析対象物一種を標的とする複数のリガンドをセンサチッ
プに導入することによって、単一の試料で複数の独立し
た分析を行ったと同様の結果を得ることができる。これ
は分析結果の統計学的信頼性を向上させるものである。
【００４３】前記各種リガンドは、当業者によく知られ
ている有機カップリング剤によって基材にテザーされる
ことが好ましい。センサチップとしてガラス基材、ある
いは水酸基が露出するように表面を化学的に酸化させた
プラスチックを用いる場合、本発明においては、実際に
は次の構造を有するオルガノシラン化合物：
【００４４】
【化１】
【００４５】（式中、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ、水素、炭素
数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基及
び炭素数１〜４のアルコキシ基からなる群から選択さ
れ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3のうち少なくとも一種はアルコキシ
基；Ｒ4は炭素数３以上でリガンドと反応可能な官能基
を有する長いリンカーを含む有機性基である）を用いる
ことがしばしば好ましい。リンカーを含む有機性基とし
ては、ポリアミン類、ポリエーテル類、ポリ（グリシ
ン）が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
また、カップリング剤としては、各種リガンドと反応す
る前記以外の官能基（例えば、エポキシ基、アミノ基お
よび不飽和官能基；ヒドロキシル基；チオール基等の官
能基）を有するものが本発明の実施において好ましい。
この場合、リガンドはオルガノシラン化合物の官能基
（好ましくは末端の官能基）と反応し、一方、オルガノ
シランのケイ素原子に直接結合する易加水分解性アルコ
キシ基は、センサチップのガラス基材またはプラスチッ
ク基材の表面に対して直接的反応性を有する、と信じら
れているが、本発明はこの原理に固執するものではな
い。別法としてこのようなカップリング剤（鎖延長シラ
ン）は、親シランをセンサチップ表面に反応させ、次い
で不動化されたシランにリンカーを付加するのに必要な
反応を起こさせることによって、ｉｎ ｓｉｔｕで構築
することもできる。リガンドは次いで、カップリング剤
（即ち、有機性リンカーを有するシラン）によりガラス
あるいはプラスチックの表面にテザーされる。また、リ
ガンドをチップ表面から最適距離（４０オングストロー
ム）に離しておくためにリンカーは十分長くなければな
らない。これは、距離が短いと細菌細胞の捕捉効率が低
下するためである。
【００４６】よって、ガラス表面にテザーされるリガン
ドは次のように記述することができる。
【００４７】
【化２】
【００４８】酸化したプラスチック表面にテザーされる
リガンドは上記式の「Ｇｌａｓｓ−Ｏ−Ｓｉ」部分をＣ
（プラスチックポリマーからの炭素）で置換したもので
示すことができる。センサチップ表面にリガンドをテザ
ーする反応は当業者によく知られており、文献にも記載
されている。例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによ
るＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９６６）、Ｈａｎｓｓｏｎらによる「薄層クロマ
トグラムへの炭水化物特異的な細菌の接着：宿主細胞の
糖脂質受容体の研究への合理的アプローチ（Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｄｈｅｓｉｏｎ
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅ
ｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ：Ａ Ｒａｔｉｏｎａ
ｌｉｚｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｔｕ
ｄｙ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉ
ｄＲｅｃｅｐｔｏｒｓ）」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４６：１５８〜１６３（１９
８５）、Ｎｉｌｓｓｏｎらによる「尿路病原性細菌の検
出のための炭水化物バイオセンサ表面（Ａ Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅＢｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｓｕｒｆａｃｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｕｒｏｐａ
ｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ）」（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１３７６〜１３７８（Ｄｅ
ｃｅｍｂｅｒ １９９４））にそのような反応が記載さ
れている。
【００４９】そのような反応の例としてはフェロキサミ
ンをリガンドとしてガラスセンサチップの表面にテザー
するものが挙げられる。第１の段階において、遊離ヒド
ロキシル基を有するガラス表面をまずガンマ−Ｎ−（ア
ミノプロピル）−ガンマ−アミノプロピルトリメトキシ
シランの２％溶液と反応させ、それによりシランをガラ
ス表面に結合させる。
【００５０】
【化３】
【００５１】この生成物を次いでグルタルアルデヒドと
ｐＨ約８で反応させ、次式のアルデヒドを得る。
【００５２】
【化４】
【００５３】得られたアルデヒドを更に次式のジアミン
（ＩＩＩ）と反応させ、化合物（ＩＶ）を得る。
【００５４】
【化５】
【００５５】次に、前述の反応生成物をグルタルアルデ
ヒドと反応させ、次式で表わされる（末端）アルデヒド
基を導入する。
【００５６】
【化６】
【００５７】更に、ＮａＣＮＢＨ3を用いて還元し、次
式の化合物（ＶＩ）を得る。
【００５８】
【化７】
【００５９】表面に結合した前記シランカップリング剤
をデフェロキサミンＢ（ＤＦＡ）とアルカリｐＨにおい
て反応させて変性させ、次式の化合物（ＶＩＩ）を得
る。
【００６０】
【化８】
【００６１】ＤＦＡを水性媒質中、第一鉄塩と反応させ
て鉄との錯体を生成させ、リガンドを得る。
【００６２】本発明、特に添付の請求項に規定された精
神を逸脱することなく、ここに記載した決定、手続き、
調製に対し種々の変更や改良がなされうるものと理解さ
れたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】テザーヘムでコートされたガラス製の顕微鏡ス
ライドガラス上でSalmonella typhimuriumを捕捉した結
果を示す。この病原性細菌の検出は、Ｐｏｗｅｒｓに付
与された米国特許第５９６８７６６号に記載された方法
及び装置で行った。
【図２】テザーヘムでコートされたガラス製の顕微鏡ス
ライドガラス上で、様々な濃度のBacillus globigii中
で希釈されたEnterobactor aerogenesを捕捉した結果を
示す。この病原性細菌の検出は、Ｐｏｗｅｒｓに付与さ
れた米国特許第５９６８７６６号に記載された方法及び
装置で行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ (72)発明者 ウォルサー アール． エリス ジュニア アメリカ合衆国 84321 ユタ州 ローガ ン イースト 644 ノース 600 アパー ト26 (72)発明者 クリストファー アール． ロイド アメリカ合衆国 84341 ユタ州 ローガ ン ノース 2574 イースト 200 Ｆターム(参考） 2G054 AA02 AA06 AB04 CA20 CA21 CA23 EA01 EA03 FB01 GB02 GB05 4B063 QA18 QA19 QQ02 QQ06 QQ07 QQ10 QQ79 QR43 QR45 QR48 QR82 QS22 QS24 QS28 QS36 QX02 QX07

Claims (83)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的分析対象物の分類学的同定の
    ための方法であって、 （ａ）分析対象物を含有する溶液を、光安定なリンカー
    で少なくとも１５Å離して基材表面に共有結合的にテザ
    ーした、所望の前記分析対象物に対する特異的リガンド
    に曝露して微生物を捕捉するステップと、 （ｂ）結合した分析対象物を、前記分析対象物を含有す
    る溶液中の非結合成分から物理的分離、洗浄、あるいは
    その両者によって分離するステップと、 （ｃ）リガンドがテザーしている基材表面を分析対象物
    の結合に関して調べるステップとを含む方法。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の方法であって、生物学
    的分析対象物が、 （ａ）細菌と、 （ｂ）ウイルスと、 （ｃ）リケッチアと、 （ｄ）原生動物と、 （ｅ）菌類とから成る群から選択される方法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載の方法であって、前記リ
    ガンドがヘム化合物である方法。
  4. 【請求項４】 請求項１記載の方法であって、前記リ
    ガンドがシデロフォアである方法。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の方法であって、前記リ
    ガンドが多糖類である方法。
  6. 【請求項６】 請求項１記載の方法であって、前記リ
    ガンドが外膜タンパク質に特異的なペプチドである方
    法。
  7. 【請求項７】 請求項１記載の方法であって、前記リ
    ガンドがコンジュゲート脂質に特異的なペプチドである
    方法。
  8. 【請求項８】 請求項１記載の方法であって、捕捉し
    た分析対象物の検出が顕微鏡法によって達成される方
    法。
  9. 【請求項９】 請求項１記載の方法であって、捕捉し
    た分析対象物の検出が標的の内因性蛍光によって達成さ
    れる方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された反
    応性ダイ・コンジュゲートの蛍光によって達成される方
    法。
  11. 【請求項１１】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応性
    ダイ・コンジュゲートの蛍光によって達成される方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された化
    学反応性放射性化合物の放射能によって達成される方
    法。
  13. 【請求項１３】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された化学反
    応性放射性化合物の放射能によって達成される方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された反
    応性ダイ・コンジュゲートのルミネッセンスによって達
    成される方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応性
    ダイ・コンジュゲートのルミネッセンスによって達成さ
    れる方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された反
    応性ダイ・コンジュゲートの燐光によって達成される方
    法。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応性
    ダイ・コンジュゲートの燐光によって達成される方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された反
    応性ダイ・コンジュゲートの光学吸光度によって達成さ
    れる方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表面
    による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応性
    ダイ・コンジュゲートの光学吸光度によって達成される
    方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１記載の方法であって、捕捉
    した分析対象物の検出が、分析対象物の結合の際におこ
    る、蛍光物質がテザーされたリガンド表面の蛍光消光に
    よって達成される方法。
  21. 【請求項２１】 生物学的分析対象物の分類学的同定
    のための方法であって、 （ａ）分析対象物を含有する溶液を、光安定なリンカー
    で少なくとも６Å離して基材表面に共有結合的にテザー
    した、所望の前記分析対象物に対する特異的リガンドに
    曝露してタンパク質を捕捉するステップと、 （ｂ）結合した分析対象物を、前記分析対象物を含有す
    る溶液中の非結合成分から物理的分離、洗浄、あるいは
    その両者によって分離するステップと、 （ｃ）リガンドがテザーしている基材表面を分析対象物
    の結合に関して調べるステップとを含む方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１記載の方法であって、生
    物学的分析対象物が、 （ａ）タンパク質トキシンと、 （ｂ）細胞質タンパク質とから成る群から選択される方
    法。
  23. 【請求項２３】 請求項２１記載の方法であって、前
    記リガンドがタンパク質トキシンに特異的な、通常３〜
    ２０アミノ酸長の、ペプチドである方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２１記載の方法であって、前
    記リガンドがタンパク質ホルモンに特異的な、通常３〜
    ２０アミノ酸長の、ペプチドである方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２１記載の方法であって、前
    記リガンドが細胞質タンパク質に特異的な、通常３〜２
    ０アミノ酸長の、ペプチドである方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出がタンパク質の内因性蛍光によ
    って達成される方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だってタンパク質に曝露
    された反応性ダイ・コンジュゲートの蛍光によって達成
    される方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後にタンパク質に曝露され
    た反応性ダイ・コンジュゲートの蛍光によって達成され
    る方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だってタンパク質に曝露
    された化学反応性放射性化合物の放射能によって達成さ
    れる方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後にタンパク質に曝露され
    た化学反応性放射性化合物の放射能によって達成される
    方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だってタンパク質に曝露
    された反応性ダイ・コンジュゲートのルミネッセンスに
    よって達成される方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後にタンパク質に曝露され
    た反応性ダイ・コンジュゲートのルミネッセンスによっ
    て達成される方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だってタンパク質に曝露
    された反応性ダイ・コンジュゲートの燐光によって達成
    される方法。
  34. 【請求項３４】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後にタンパク質に曝露され
    た反応性ダイ・コンジュゲートの燐光によって達成され
    る方法。
  35. 【請求項３５】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だってタンパク質に曝露
    された反応性ダイ・コンジュゲートの光学吸光度によっ
    て達成される方法。
  36. 【請求項３６】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応
    性ダイ・コンジュゲートの光学吸光度によって達成され
    る方法。
  37. 【請求項３７】 請求項２１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、タンパク質の結合の際に起
    こる、蛍光物質がテザーされたリガンド表面の蛍光消光
    によって達成される方法。
  38. 【請求項３８】 生物学的分析対象物の分類学的同定
    のための方法であって、 （ａ）分析対象物を含有する溶液を、マーカーに結合さ
    せた所望の分析対象物に対して特異的なリガンドに曝露
    するステップと、 （ｂ）結合した分析対象物を、過剰なマーカー結合リガ
    ンドから分離するステップと、 （ｃ）結合したマーカーの検出によりリガンド結合に関
    して分析対象物を調べるステップとを含む方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３８記載の方法であって、生
    物学的分析対象物が、 （ａ）細菌と、 （ｂ）ウイルスと、 （ｃ）タンパク質トキシンと、 （ｄ）リケッチアと、 （ｅ）原生動物と、 （ｆ）菌類と、 （ｇ）細胞質タンパク質とから成る群から選択される方
    法。
  40. 【請求項４０】 請求項３８記載の方法であって、結
    合した分析対象物の過剰な結合リガンドからの分離がク
    ロマトグラフィーによって達成される方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３８記載の方法であって、前
    記リガンドが磁気粒子に結合しており、結合した分析対
    象物の、分析対象物溶液中の非結合成分からの分離が、
    磁気分離によって達成され、ここにおいて前記リガンド
    は、前記磁気粒子に、少なくとも１５Å離れた位置にテ
    ザーされて微生物を捕捉する方法。
  42. 【請求項４２】 請求項３８記載の方法であって、前
    記リガンドがヘム化合物である方法。
  43. 【請求項４３】 請求項３８記載の方法であって、前
    記リガンドがシデロフォアである方法。
  44. 【請求項４４】 請求項３８記載の方法であって、前
    記リガンドが多糖類である方法。
  45. 【請求項４５】 請求項３８記載の方法であって、前
    記リガンドが外膜タンパク質に特異的なペプチドである
    方法。
  46. 【請求項４６】 請求項３８記載の方法であって、前
    記リガンドがコンジュゲート脂質に特異的なペプチドで
    ある方法。
  47. 【請求項４７】 請求項３８記載の方法であって、マ
    ーカーが蛍光性で検出が蛍光による方法。
  48. 【請求項４８】 請求項３８記載の方法であって、マ
    ーカーが発光性で検出がルミネッセンスによる方法。
  49. 【請求項４９】 請求項３８記載の方法であって、マ
    ーカーが放射性で検出が放射能による方法。
  50. 【請求項５０】 請求項３８記載の方法であって、マ
    ーカーが燐光性で検出が燐光による方法。
  51. 【請求項５１】 生物学的分析対象物の分類学的同定
    のための方法であって、 （ａ）分析対象物を含有する溶液を、基材表面に共有結
    合的にテザーされた種々のリガンドのアレイに曝露する
    ステップと、 （ｂ）リガンドアレイ上の結合した分析対象物を、溶液
    中の非結合成分から物理的分離、洗浄、あるいはその両
    者によって分離するステップと、 （ｃ）リガンドにテザーされた基材表面を分析対象物の
    結合に関して調べるステップとを含む方法。
  52. 【請求項５２】 請求項５１記載の方法であって、前
    記アレイで利用されるリガンドが微生物捕捉のための基
    材表面から少なくとも１５Åの距離で光安定なリンカー
    とテザーされる方法。
  53. 【請求項５３】 請求項５１記載の方法であって、前
    記アレイで利用されるリガンドがタンパク質トキシン捕
    捉のための基材表面から少なくとも６Åの距離で光安定
    なリンカーとテザーされる方法。
  54. 【請求項５４】 請求項５１記載の方法であって、生
    物学的分析対象物が、 （ａ）細菌と、 （ｂ）ウイルスと、 （ｃ）タンパク質トキシンと、 （ｄ）リケッチアと、 （ｅ）原生動物と、 （ｆ）菌類と、 （ｇ）細胞質タンパク質とから成る群から選択される方
    法。
  55. 【請求項５５】 請求項５１記載の方法であって、前
    記リガンドがヘム化合物である方法。
  56. 【請求項５６】 請求項５１記載の方法であって、一
    以上の前記リガンドがシデロフォアである方法。
  57. 【請求項５７】 請求項５１記載の方法であって、一
    以上の前記リガンドが多糖類である方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５１記載の方法であって、一
    以上の前記リガンドが外膜タンパク質に特異的なペプチ
    ドである方法。
  59. 【請求項５９】 請求項５１記載の方法であって、一
    以上の前記リガンドがコンジュゲート脂質に特異的なペ
    プチドである方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が顕微鏡法によって達成される
    方法。
  61. 【請求項６１】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が標的の内因性蛍光によって達
    成される方法。
  62. 【請求項６２】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された
    反応性ダイ・コンジュゲートの蛍光によって達成される
    方法。
  63. 【請求項６３】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応
    性ダイ・コンジュゲートの蛍光によって達成される方
    法。
  64. 【請求項６４】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された
    化学反応性放射性化合物の放射能によって達成される方
    法。
  65. 【請求項６５】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された化学
    反応性放射性化合物の放射能によって達成される方法。
  66. 【請求項６６】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された
    反応性ダイ・コンジュゲートのルミネッセンスによって
    達成される方法。
  67. 【請求項６７】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応
    性ダイ・コンジュゲートのルミネッセンスによって達成
    される方法。
  68. 【請求項６８】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された
    反応性ダイ・コンジュゲートの燐光によって達成される
    方法。
  69. 【請求項６９】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応
    性ダイ・コンジュゲートの燐光によって達成される方
    法。
  70. 【請求項７０】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉に先だって試料に曝露された
    反応性ダイ・コンジュゲートの光学吸光度によって達成
    される方法。
  71. 【請求項７１】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、テザーされたリガンドの表
    面による分析対象物の捕捉の後に試料に曝露された反応
    性ダイ・コンジュゲートの光学吸光度によって達成され
    る方法。
  72. 【請求項７２】 請求項５１記載の方法であって、捕
    捉した分析対象物の検出が、分析対象物の結合の際に起
    こる、蛍光物質がテザーされたリガンド表面の蛍光消光
    によって達成される方法。
  73. 【請求項７３】 タンパク質の同定のための方法であ
    って、 （ａ）微生物を含有する溶液を、微生物が破砕される状
    態に曝露し、破砕された微生物の内容物を該溶液中に導
    出するステップであって、前記破砕が、化学処理、ホー
    リン(細胞表面穿孔剤；holins)、酵素処理、凍結解凍サ
    イクル、バクテリオファージ感染、及び物理的処理から
    成る群から選択される手段によってなされるステップ
    と、 （ｂ）前記タンパク質分析対象物を含有する溶液を、光
    安定なリンカーで基材表面に共有結合的にテザーした、
    所望の前記分析対象物に対する特異的リガンドに曝露す
    るステップと、 （ｃ）結合した分析対象物を、前記分析対象物を含有す
    る溶液中の非結合成分から物理的分離によって分離する
    ステップと、 （ｄ）リガンドにテザーされた基材表面を、リガンドが
    基材表面から少なくとも６Åの距離にテザーされてタン
    パク質を捕捉する分析対象物の結合に関して調べるステ
    ップとを含む方法。
  74. 【請求項７４】 請求項７３記載の方法であって、前
    記リガンドが所望のタンパク質に特異的なペプチドであ
    る方法。
  75. 【請求項７５】 請求項７３記載の方法であって、検
    出が捕捉されたタンパク質の内因性蛍光による方法。
  76. 【請求項７６】 生物学的分析対象物を基材上に捕捉
    するための方法であって、 （ａ）使用されるリガンドが、ヘム化合物、サイドロホ
    ア、多糖類、及び外膜タンパク質、コンジュゲート脂質
    や微生物タンパク質標的に特異的なペプチドから成る群
    から選択され、 （ｂ）リガンドは基材表面から少なくとも１５Åの距離
    にテザーされて微生物を捕捉し、 （ｄ）基材はカラム充填に適しており、 （ｅ）生物学的分析対象物が細菌、ウイルス、リケッチ
    ア、原生動物、及び菌類からなる群から選択され、 （ｆ）生物学的分析対象物の基材上への捕捉が水性試料
    からの生物学的分析対象物の濃縮のために用いられ、 （ｇ）生物学的分析対象物の基材上への捕捉が医学用試
    料からの生物学的分析対象物の濃縮のために用いられる
    方法。
  77. 【請求項７７】 リガンドを基材表面にリンカーによ
    ってテザーするための方法であって、 （ａ）シラン化合物[Ｓｉ（Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4）]を酸化され
    た（ヒドロキシル化）基材表面と反応させるステップで
    あって、前記置換基中の一種がリガンドと反応可能な官
    能基を有するリンカーを含むものであるステップと、 （ｂ）リガンドを、リガンドが基材表面から少なくとも
    １５Å離れて好適にテザーされるようにリンカーが選択
    される共有結合的に付着されたシランリンカーの官能基
    と反応させるステップとを含む方法。
  78. 【請求項７８】 請求項７７記載の方法であって、Ｒ
    1〜Ｒ4が水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜
    １２のアリール基及び炭素数１〜４のアルコキシ基より
    成る群から各々選択され、Ｒ1、Ｒ2及び／又はＲ3の少
    なくとも一種がアルコキシ基である方法。
  79. 【請求項７９】 請求項７７記載の方法であって、Ｒ
    4が少なくとも３個の炭素原子を含み、またリガンドと
    反応可能な官能基を有する長いリンカーも含む有機基で
    ある方法。
  80. 【請求項８０】 請求項７７記載の方法であって、リ
    ンカーを有する有機基がポリアミン、ポリエーテル、及
    びポリ（グリシン）を含む方法。
  81. 【請求項８１】 請求項７７記載の方法であって、リ
    ンカー（Ｒ4）のカップリング剤官能基がエポキシ基、
    アミノ基、不飽和官能基、ヒドロキシル基、及びチオー
    ル基を含む方法。
  82. 【請求項８２】 請求項７７記載の方法であって、リ
    ガンドが官能基と、好適にはオルガノシラン化合物の末
    端官能基と、反応する一方で、ケイ素原子に直接結合す
    る易加水分解性アルコキシ基が基材の表面と直接反応す
    る能力を有している方法。
  83. 【請求項８３】 請求項７７記載の方法であって、最
    初に親シラン[Ｓｉ（Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4）]をリガンドと反応
    させ、続いてアルコキシシランを基材表面と反応させる
    ことによりリガンドテザーがｉｎ ｓｉｔｕで構築され
    る方法。
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