KR101895597B1

KR101895597B1 - 정지 액체상 랩온어튜빙

Info

Publication number: KR101895597B1
Application number: KR1020170022302A
Authority: KR
Inventors: 최석정
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2018-09-07
Also published as: KR20180096084A

Abstract

본 발명은 서로 다른 종류의 용액을 수용하여, 일련의 실험을 수행할 수 있는 랩온어 튜빙(lab-on-a-tubing)에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙은 서로 다른 종류의 용액 사이에 액체밸브를 포함함으로써, 서로 다른 종류의 용액이 혼합되는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다. 아울러, 서로 다른 종류의 용액은 각각 검출용액과 분석물질을 포함하는 시료를 포함하고, 분석물질을 이동수단에 의해 검출용액으로 이동시켜 분석물질을 검출할 수 있으며, 상기 분석물질의 이동에 따라 액체밸브를 용이하게 개폐할 수 있는 효과가 있다.

Description

정지 액체상 랩온어튜빙{Stationary liquid phase lab-on-a-tubing}

본 발명은 서로 다른 종류의 용액을 수용하여, 일련의 실험을 수행할 수 있는 랩온어튜빙(lab-on-a-tubing)에 관한 것이다.

ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)와 같은 면역분석(immunoassay)은 항체를 이용하는 검출 방법으로 질병이나 연구에 널리 사용되고 있다. 예를 들어 샌드위치 ELISA 방법에는 분석물질의 서로 다른 부위에 결합하는 두 종류의 항체를 사용하는데 그 가운데 한 항체는 면역플레이트(immunoplate) 와 같은 고체상(solid phase)에 고정시켜 포획항체(capture antibody)로 사용한다. 포획항체가 있는 고체상에 분석물질을 포함하는 시료를 더하여 반응시키면 분석물질이 항체에 결합한다. 이 상태에서 고체상 표면을 세척 완충용액(washing buffer)으로 세척하면 분석물질을 제외한 세척 완충용액으로 세척하면 고체상에는 분석물질의 양에 비례하여 효소가 결합하게 된다. 따라서, 효소 활성을 측정함으로써 분석물질의 양을 측정할 수 있다.

여기서, 고체상에 항체를 고정시키는 이유는 고체상에 결합하지 않고 액체상(liquid phase) 에 남아있는 물질들을 쉽게 제거할 수 있기 때문이다. 다른 면역 분석법에서는 고체상(solid phase)에 항체와 결합할 수 있는 이차항체나 단백질 G(protein G)를 고정시켜 사용하기도 하고 항원을 고정시키기도 한다.

고체상으로는 면역플레이트(immunoplate)와 같은 플라스틱 표면이 많이 사용되지만 표면적이 넓은 장점으로 인하여 입자를 사용할 수 있다. 특히 자성입자(magnetic particle)는 자석을 이용하여 포집하거나 이동시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 불순물이 많이 포함되어 있는 시료에서 분석물질을 분리하는 전처리(pretreatment)에 많이 이용되고 있다. 예를 들어 분석물질에 대한 항체를 고정시킨 자성입자를 시료에 넣고 반응시키면 분석물질이 자성입자에 고정된 항체에 결합하게 된다. 그리고 반응공간 외부에서 자석을 벽에 가하면 자성입자는 모두 반응공간의 벽에 달라붙게 되고 나머지 용액을 제거함으로써 불순물을 모두 제거할 수 있다.

그러나, 종래의 면역분석법을 자동화하기 위해서는 액체를 이동시켜야 하기 때문에 펌프가 필요하고, 장치 내에 세척 완충용액이 담긴 통과 액체의 이동을 위한 튜빙들이 필요하며, 또한 면역플레이트나 액체 주입장치를 이동시키는 이송장치가 필요하기 때문에 장치가 크고 복잡해지는 문제점이 발생되었다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 정지 액체상에서 고체상인 입자를 이동시킴으로써 면역분석법을 시행하는 기술(등록특허 제10-1398764호)이 제안된 바 있다.

상기 기술은 도 1에 도시된 바와 같이, 입자(particle, 200)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber, 110), 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber, 120) 그리고 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 위치하는 채널(channel, 130)을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(stationary liquid phase lab-on-a-chip, SLP LOC, 100)에서 입자를 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시킴으로써 분석물질을 검출할 수 있는 기술이 개시되어 있다.

특히, 도 2를 참조하면, 종래기술의 랩온어칩(100)은 고정 커버를 이용하여 세척 완충용액 공간 마개(132)를 이동시킴으로써, 세척 완충용액을 채널로 주입하여, 채널에서 세척과정이 이루어지는 방법을 이용해왔다. 그러나, 상술한 기술은 입자의 세척과정이 채널(130)을 통과하는 동안에만 일어나기 때문에 충분히 세척되지 않을 수 있으며, 입자가 충분히 세척되지 않는 상태에서는 분석물질이 없는 시료를 측정하였을 때의 기준값이 높아져 낮은 농도의 분석물질이 포함된 시료와 차이를 구별하기 어렵게 되는 문제점이 있었다. 즉, 최저검출한계(lower limit of detection)가 높아지는 문제점이 발생하였다.

아울러, 상술한 랩온어칩에서 검출용액, 완충용액 및 시료용액 등의 서로 다른 종류의 용액들을 사용하는 경우, 그 용액들이 서로 혼합되는 문제점이 발생하였으며, 이들의 혼합을 방지하기 위하여, 랩온어칩에 밸브를 추가로 설치하였다.

그러나, 밸브가 설치된 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 분석물질을 검출하는 경우, 입자의 이동에 따라 밸브를 개폐해야하는 번거로움이 있으며, 특히, 밸브가 개방되었을 때, 서로 다른 종류의 용액들이 혼합되는 경우가 발생하였다.

한국 등록특허 제10-1398764호

본 발명은 서로 다른 종류의 용액이 서로 혼합되지 않도록 수용하여, 일련의 실험을 수행할 수 있는 랩온어튜빙(lab-on-a-tubing)을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시예에서,

n종류(n은 2이상의 정수)의 용액이 각각 구분되어 순차적으로 수용되는 튜빙;

각각의 용액 사이에 위치하며, 인접하는 두 용액이 섞이는 것을 방지하는 액체밸브; 및

튜빙 내에 위치하여 이동수단에 의해 액체밸브를 통과 가능한 입자; 를 포함하는 랩온어튜빙을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙은 서로 다른 종류의 용액 사이에 액체밸브를 포함함으로써, 서로 다른 종류의 용액이 혼합되는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다.

아울러, 여러 가지 종류의 용액이 필요한 일련의 실험을 용이하게 수행할 수 있는 효과가 있다.

특히, 서로 다른 종류의 용액은 각각 검출용액 및 분석대상시료와 입자가 포함된 혼합물이 로딩되는 로딩 완충용액을 포함하고, 로딩 완충용액에 포함되는 분석대상시료와 입자를 이동수단에 의해 검출용액으로 이동시켜 분석대상시료에 포함되는 분석물질을 검출할 수 있다.

도 1은 종래의 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 2는 종래의 완충용액을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙의 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 코티솔을 검출하기 위한 랩온어튜빙을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 코티솔을 검출하기 위한 랩온어튜빙을 이용하여 코티솔을 검출한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 박테리아로부터 DNA 를 추출하기 위한 랩온어튜빙을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 박테리아로부터 DNA 를 추출하기 위한 랩온어튜빙에서 DNA 를 추출한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 서로 다른 종류의 용액이 서로 혼합되지 않도록 수용하여, 일련의 실험을 수행할 수 있는 랩온어튜빙(lab-on-a-tubing)에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 일 실시예에서,

본 발명에서 "랩온어튜빙(lab-on-a-tubing)"이라 함은 실험실에서 행해지는 혼합, 반응, 분리, 분석 등의 여러 가지 조작이 구현되도록 제작된 칩인 랩온어칩과 유사한 것으로, 단지 칩의 형태가 아닌 관의 형태로 이루어진 것을 의미한다.

보다 구체적으로, "랩온어튜빙"은 그 내부를 통해 액체가 흘러갈 수 있는 구조를 가지고 있으며, 플라스틱, 유리, 고무, 금속 등의 관으로 이루어질 수 있다.

한편, 정지 액체상 랩온어튜빙(Stationary liquid phase lab-on-a-tubing) 은 랩온어튜빙 내에서 액체가 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라, 액체상을 이동시키는 종래의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙의 구조를 나타낸 도면, 도 4는 본 발명의 실시예에서 코티솔을 검출하기 위한 랩온어튜빙을 나타낸 도면, 도 5는 본 발명의 실시예에서 코티솔을 검출하기 위한 랩온어튜빙을 이용하여 코티솔을 검출한 결과를 나타낸 도면, 도 6은 본 발명의 실시예에서 박테리아로부터 DNA 를 추출하기 위한 랩온어튜빙을 나타낸 도면, 도 7은 본 발명의 실시예에서 박테리아로부터 DNA 를 추출하기 위한 랩온어튜빙에서 DNA 를 추출한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 도 3 내지 도 7을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙을 상세히 설명한다.

한편, 정지 액체상 랩온어튜빙(Stationary liquid phase lab-on-a-tubing) 은 랩온어튜빙 내에서 액체가 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라, 액체상을 이동시키는 종래의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미한다. 여기서, "고체상"이라 함은 입자를 의미한다.

보다 구체적인 설명은 후술하도록 한다.

본 발명은 일 실시예에서,

먼저, 본 발명의 일 실시예에 따른 튜빙은 그 내부에 중공이 형성된 관의 형태로 그 내부를 통해 액체가 흘러갈 수 있는 구조를 갖고 있으며, 플라스틱, 유리, 고무, 금속 등으로 만들어질 수 있다.

한편, 튜빙은 0.1 내지 2mm의 내부직경을 가질 수 있다.

보다 구체적으로, 튜빙의 내부 직경이 0.1mm 미만일 경우 내부에 용액을 수용할 수 있는 공간이 부족할 수 있으며, 직경이 2mm를 초과하는 경우, 액체밸브가 서로 다른 종류의 용액이 분리된 상태로 유지하기 어렵기 때문에 0.1 내지 2mm 의 직경의 튜빙을 이용하는 것이 바람직하다.

아울러, 튜빙내에서 용액 및 액체밸브 등을 안정적으로 유지하기 위하여 일측은 밀폐시킬 수 있으며, 다른 한쪽은 시료가 주입될 때만 개방할 수 있도록 사용할 수 있다.

특히, 튜빙은 필요에 따라서 적절한 길이로 절단하여 용이하게 사용할 수 있다.

이에 더하여, 튜빙은 내부에 n종류의 용액이 각각 구분되어 순차적으로 수용될 수 있다. 여기서, n은 2 이상의 정수를 의미한다.

한편, "n종류의 용액"이라 함은 실험에 필요한 서로 다른 복수의 수용액을 의미할 수 있으며, 검출용액, 입자를 포함하는 반응물과 분석물질을 포함하는 분석대상시료를 포함하는 혼합용액, 세척 완충용액, 용해 완충용액, 표지화 수용체를 포함하는 표지용액 등을 의미할 수 있다. 분석하고자 하는 물질에 따라서 튜빙 내에 수용되는 용액은 변경될 수 있다.

한편, 검출용액은 분석물질을 검출하기 위한 용액을 의미할 수 있으며, 분석물질에 따라 그 용액의 종류는 상이하다. 세척 완충용액은 적절한 농도의 세제 또는 염과 같이 비특이적으로 흡착된 물질들을 입자로부터 제거하는데 도움이 되는 성분을 포함하는 완충용액을 의미한다.

아울러, 용해 완충용액은 일 예로 세포로부터 DNA 를 분리하기 위하여 세포를 용해하는 완충용액을 의미한다.

표지용액은 표지화 수용체를 포함하는 용액으로, 표지화 수용체는 분석물질과 결합가능한 수용체에 표지가 부착될 수 있으며, 표지는 발색, 발광, 형광, 촉매활성, 자력 및 방사성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시에에 따르면, 튜빙내에 수용되는 용액의 종류에 따라서, 그 용액을 포함하는 공간을 임의로 지칭할 수 있으며, 검출용액을 포함하는 공간은 검출공간, 세척 완충용액을 포함하는 공간은 세척 완충공간 등으로 지칭될 수 있다. 아울러, 시료 등 분석물질을 포함하는 분석대상시료를 주입하는 공간은 로딩 완충공간으로 지칭될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙은 검출용액과 분석대상시료와 입자가 포함된 혼합물이 로딩되는 로딩 완충용액을 순차적으로 수용할 수 있다. 그리고, 검출용액과 로딩 완충용액 사이에 액체밸브를 포함함으로써, 상기 두 용액이 섞이는 것을 방지할 수 있다.

특정 양태로서, 상기 검출용액과 로딩 완충용액 사이에는 세척 완충용액을 더 포함할 수 있으며, 이는 로딩 완충용액에서 반응이 일어나지 않은 입자 등을 세척하기 위한 공간을 마련할 수 있다.

다른 양태로서, 상기 검출용액과 로딩 완충용액 사이에는 용해 완충용액을 더 포함할 수 있다. 이는 세포 등을 검출할 때, 세포로부터 DNA 를 분리하기 위한 수용액일 수 있으며, 하나의 예로 용해 완충용액은 구아니딘 티오시안산염(guanidine thiocyanate) 수용액일 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어튜빙은 내부에 액체밸브를 포함하여 서로 다른 종류의 용액이 서로 혼합되는 것을 방지하는 것을 특징으로 한다.

특히, 튜빙에 수용되는 용액은 수용성일 수 있으며, 액체밸브는 지용성일 수 있다.

보다 구체적으로, 액체밸브는 서로 다른 종류의 용액 사이에 위치할 수 있으며, 후술하게 되는 입자가 통과될 수 있다.

본 발명에서, "액체밸브"는 액체로 이루어진 밸브를 의미하는 것으로, 물과 섞이지 않는 액체로 이루어질 수 있다.

보다 구체적으로, 액체밸브는 왁스(wax), 오일(oil) 또는 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 등으로 이루어질 수 있으며, 물과 섞이지 않는 액체와 수용액층을 보다 안정적으로 유지하기 위해서는 소정의 점성을 갖는 지용성 물질로 이루어질 수 있다.

참고로, "왁스"는 물에 녹지 않은 1가 또는 2가 알코올 지방산 에스터를 의미할 수 있다. 아울러, "오일"은 미네랄 오일일 수 있으며, 석유에서 얻은 액체상태의 탄화수소류 혼합물을 의미할 수 있다. 아울러, "트리아실글리세롤"은 지방산에서 유래하는 아실기를 세 산소에 지니는 글리세롤을 의미할 수 있다.

아울러, 액체밸브는 1기압의 조건에서 10 내지 20℃ 의 녹는점을 갖는 것을 특징으로 한다.

액체왁스의 녹는점이 10℃ 미만인 경우에 장시간 냉장 보관할 때 액체상태로 유지될 수 있어, 튜빙내에 서로 다른 용액이 혼합될 수 있으며, 20℃를 초과하는 경우 상온에서도 고체상태를 유지할 수 있어, 분석하고자 하는 입자의 이동이 방해될 수 있다.

따라서, 액체밸브는 10 내지 20℃ 의 녹는점을 갖는 것이 바람직하다.

이에 더하여, 본 발명에서 "입자"라 함은 분석물질 또는 분석물질에 의해 생성되는 생성물과 결합되는 입자-분석물질 복합체 또는 입자-생성물질 복합체를 형성하는 물질을 의미한다. 이를 위하여 입자에는 분석물질에 특이적인 수용체나 분석물질에 의해 생성되는 생성물에 특이적인 수용체가 고정되어 있을 수 있다.

특히, "입자"는 분석물질 또는 분석물질에 의해 생성되는 생성물을 시료공간에서 검출공간으로 이동시키는 역할을 할 수 있으며, 분석물질에 표지를 붙이는 역할을 할 수 있다.

이에 더하여, 입자는 실리카 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리카보네이트 입자, 유리입자, 알루미나 입자, 금 입자, 은 입자, 팔라듐 입자, 백금 입자, 티타니아 입자, 지르코늄 입자 및 코어-쉘(core-shell) 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 입자는 자성입자일 수 있으며, 상기 자성입자는 고체상으로 작용하며 튜빙의 외부에서 자석으로 용이하게 이동시킬수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에서 랩온어튜빙에 수용되는 용액은 정지 상태로 담겨지는 것을 특징으로 한다.

여기서, 수용액이 정지되어 있다는 것은 용액이 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라 액체상을 이동시키는 종래의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미한다. 이때, "고체상은" 본 발명에서 입자를 의미할 수 있다.

즉, 랩온어튜빙에는 서로 다른 종류의 용액이 수용되며, 상기 서로 다른 종류의 용액 사이에 액체밸브를 포함한다. 이때, 튜빙의 외부에서 자석의 이동에 따라 액체밸브를 통과하여 실험을 수행할 수 있다.

특히, 액체밸브는 자력에 의해서 입자만을 이동시킬 수 있기 때문에 서로 다른 종류의 용액들이 혼합되는 것을 방지할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 랩온어튜빙을 이용한 분석물질 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면,

랩온어튜빙의 일측에 분석대상시료 및 입자를 로딩하여, 튜빙내에서 분석대상시료가 부착된 입자를 형성하는 단계; 및

로딩된 입자와 랩온어튜빙 내에 수용된 검출용액의 반응에 의해 분석대상시료에 대한 분석을 수행하는 단계;를 포함하는 랩온어튜빙을 이용한 분석물질 검출방법을 제공한다.

하나의 양태로서, 분석대상시료가 부착된 입자는

분석물질;

분석물질에 대한 수용체가 고정된 포획입자; 및

표지를 포함하는 표지화 입자를 포함할 수 있으며, 포획입자-분석물질-표지화 입자 복합체를 형성하여, 상기 표지화 입자에 포함된 표지가 검출용액과 반응하여 분석물질을 검출할 수 있다.

이때, 분석물질은 다가결합이 가능한 바이러스, 박테리아 또는 진핵세포일 수 있으며, 포획입자는 분석물질에 특이적인 수용체가 고정된 자성입자일 수 있다.

아울러, 포획입자는 상기 분석물질에 특이적인 수용체가 고정된 자성입자이며, 상기 표지화 입자는 상기 분석물질에 특이적인 상기 수용체가 고정되며, 표지를 포함하는 비자성 입자일 수 있다.

상기 포획입자와 상기 표지화 입자에 고정되는 수용체는 동일한 수용체를 사용할 수도 있고, 서로 다른 자리에 결합하는 두 종류의 수용체일 수 있다. 즉, 제1수용체와 제2수용체를 사용할 수도 있다.

다른 양태로서, 분석대상시료가 부착된 입자는

분석물질;

분석물질에 대한 수용체가 고정된 포획입자; 및

표준물질에 표지가 연결된 표지화 표준물질; 을 포함하며,

상기 분석물질과 표지화 표준물질은 경쟁적으로 수용체에 결합하여, 상기 표지화 표준물질과 연결된 표지가 검출용액과 반응하여 분석물질을 검출할 수 있다.

이때, 분석물질은 유기독소, 항생제 또는 마약일 수 있다.

여기서, "포획입자"라 함은 분석물질을 포획하여 이동시키는 역할을 하는 입자를 의미하며, 자성입자일 수 있다.

아울러, "표지화 표준물질"이라 함은 입자에 대한 수용체를 고정시켜 포획입자를 만들고 분석물질의 표준물질에 표지기능을 부여하여 표지화 표준물질을 만들 수 있다.

분석물질의 표준물질이란 이미 정제되어 농도를 알고 있는 분석물질 또는 분석물질과 동등하게 수용체에 결합할 수 있는 물질로서 시료에 포함된 분석물질의 양을 평가하기 위한 기준으로 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 분석물질을 포함하는 시료에 포획 입자와 표지화 표준물질을 넣고 반응시키면 시료에 있는 분석물질의 양에 반비례하는 양의 표지화 표준물질이 포획 입자에 결합하게 된다. 따라서 포획 입자를 검출 공간으로 이동시키고 포획 입자에 결합한 표지의 신호를 측정함으로써 분석물질의 양을 평가할 수 있다.

특히, 경쟁적 면역 분석법에서 입자에 수용체를 고정시키는 대신 분석물질의 표준물질을 고정시켜 포획 입자를 만들 수도 있다. 이 경우에는 수용체에 표지 기능을 부여하여 표지화 수용체를 만들어야 한다. 시료에 표준물질이 고정된 포획 입자와 표지화 수용체를 넣고 반응시키면 시료에 있는 분석물질의 양에 반비례하는 양의 표지화 수용체가 포획 입자에 결합하게 된다. 따라서 입자를 검출 공간으로 이동시키고 입자에 결합한 표지의 신호를 측정함으로써 분석물질의 양을 평가할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 랩온어튜빙을 이용하여 코티솔을 검출할 수 있다.

보다 구체적으로, 랩온어튜빙에서는 서로 다른 수용액을 필요로 하는 다양한 실험들을 수행할 수 있다. 예를 들어 horseradish peroxidase(HRP)가 코티솔과 연결된 HRP-코티솔을 이용하여 경쟁적 면역분석을 하기 위해서는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 기질 수용액과 세척 완충용액이 필요할 수 있다.

튜빙에 TMB 용액, 액체 왁스, 세척 완충용액, 액체 왁스, 로딩 완충용액을 차례로 채우면 TMB 용액, 세척 완충용액, 로딩 완충용액은 모두 수용액이기 때문에 액체 왁스에 의해 분리되어 서로 섞이지 않게 된다.

또한 녹는 온도가 섭씨 10~20도 사이에 있는 액체 왁스를 사용하면 냉장고에 보관할 때 왁스가 고체상태가 되어 층을 매우 안정한 상태로 유지시킬 수 있다. 여기에서 세척 완충용액으로는 세제가 포함된 PBS(phosphate-buffered saline)를 사용할 수 있다.

로딩 완충용액은 시료를 포함하여 실험을 시작할 때 필요한 용액을 더하게 되는 완충용액을 의미하며 PBS를 포함하여 필요에 따라 다양한 완충용액을 사용할 수 있다.

여기에서 면역분석을 할 때는 코티솔이 포함된 시료, 코티솔에 대한 항체를 고정시킨 자성입자, 효소가 연결된 코티솔을 함께 로딩 완충용액에 더하고, 자성입자를 TMB 용액으로 이동시킨 후, TMB 용액의 색깔이 변한 정도를 측정할 수 있다.

또 다른 양태로서, 상기 분석대상시료가 부착된 입자는

분석물질에 의해 생성되는 물질; 및

분석물질에 의해 생성되는 물질과 결합할 수 있는 수용체가 고정된 포획입자;를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 상술한 분석대상시료가 부착된 입자를 이용하여 분석물질을 검출하는 방법은,

일측이 폐쇄된 튜빙에 증류수, 액체밸브, 표지화 입자를 포함하는 용해 완충용액, 액체밸브, 로딩 완충용액을 주입하는 단계;

로딩 완충용액에 특정세포를 포함하는 시료, 특정세포에 대한 수용체가 고정된 포획입자를 혼합하여, 세포-포획입자 복합체를 형성하는 단계;

세포-포획입자 복합체를 이동수단에 의해서 용해 완충용액으로 이동시켜 세포를 용해하여, 세포로부터 DNA 를 분리하여, DNA-표지화 입자 복합체를 형성하는 단계; 및

용해 완충용액에 위치하는 세포-포획입자 복합체 및 DNA-표지화 입자 복합체를 이동수단에 의해 증류수로 이동시켜 DNA를 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.

이때, 세포-포획입자 복합체 및 DNA-표지화 입자 복합체는 증류수에서 각각 해리되는 단계를 더 포함할 수 있으며, 포획입자는 세포에 특이적인 수용체가 고정된 자성입자이며, 표지화 입자는 DNA에 특이적인 수용체가 고정되며, 표지를 포함하는 자성 입자일 수 있다.

이는 분석물질의 양에 비례하여 생성되는 물질을 검출함으로써 분석물질의 양을 평가할 수 있다.

이 경우에는 분석물질의 양에 비례하여 생성되는 물질에 대한 수용체를 입자에 고정시켜야 하며, 분석물질이 효소인 경우 생성물에 대한 수용체가 여기에 해당될 수 있다.

또는 분석물질과 반응하여 해리되거나 구조가 변하는 분자에 대한 수용체도 입자에 고정될 수 있다. 생성물에 대한 수용체를 입자에 고정시킬 경우에는 생성물 자체에 표지 기능이 있는 것이 바람직하다.

분석물질과 반응하여 해리되거나 구조가 변하는 분자에 대한 수용체를 입자에 고정시켜 사용할 경우에는 그 분자에 표지 기능을 부여하여 사용할 수 있다.

특정 양태로서, 박테리아의 DNA를 추출하는 실험은 다음과 같이할 수 있다.

튜빙에 증류수, 액체 왁스, 실리카로 코팅된 자성입자가 포함된 guanidine thiocyanate 수용액, 액체 왁스, 로딩 완충용액을 차례로 채운다. 특정 박테리아가 포함된 시료와 그 박테리아에 대한 항체가 고정된 자성입자를 함께 로딩 완충용액에 더하여 자성입자를 이동시키면 자성입자가 박테리아를 포획하여 함께 이동할 수 있다.

그리고, 자성입자를 guanidine thiocyanate 수용액으로 이동시키면 guanidine thiocyanate에 의해 박테리아가 용해되어 DNA가 흘러나오고 역시 guanidine thiocyanate의 작용에 의해 그 DNA가 실리카로 코팅된 자성입자에 결합한다.

마지막으로 자성입자를 증류수로 이동시키면 DNA가 실리카로 코팅된 자성입자로부터 해리되기 때문에 DNA가 녹아있는 증류수를 취함으로써 박테리아의 DNA를 추출할 수 있다.

이 방법은 박테리아뿐만 아니라 진핵세포나 바이러스로부터 DNA를 추출하는 데에도 사용할 수 있으며, DNA 추출 과정이 튜빙 내에서 이루어지기 때문에 생물학적 위험 요소에 노출될 가능성을 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

이에 더하여, 랩온어튜빙에서는 위와 같은 검출방법에서 신호를 증폭하는 것도 가능하다.

하나의 예로, 튜빙에 측정 완충용액, 액체 왁스, 세척 완충용액, 액체 왁스, 아비딘이 고정된 형광입자A를 포함하는 완충용액A, 액체 왁스, 비오틴이 고정된 형광입자B를 포함하는 완충용액B, 액체 왁스, 로딩 완충용액을 차례로 채울 수 있다.

그리고, 박테리아가 포함된 시료, 박테리아에 대한 항체가 고정된 자성입자, 박테리아에 대한 항체와 비오틴이 고정된 형광입자C를 함께 로딩 완충용액에 더하면 자성입자-박테리아-형광입자C 복합체가 형성된다. 자성입자를 완충용액A로 이동시키면 형광입자C위에 형광입자A가 다시 결합한다. 여기에서 다시 자성입자를 완충용액B로 이동시키면 형광입자A 위에 형광입자B가 또 결합한다. 이와 같은 과정을 반복하면 형광입자A와 형광입자B가 교대로 결합하여 형광신호를 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계의 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 코티솔(cortisol)의 검출

1-1. 시료 및 기구

내경이 1.55mm 인 테플론 튜빙을 Upchurch Scientific에서 구입하였으며, 코티솔(cortisol)을 포함하는 시료는 Sigma에서 구입하였다. 그리고, 코티솔과 경쟁반응을 하는 표지화 표준물질로는 HRP(horseradish peroxidase) 효소를 연결시킨 HRP-코티솔을 이용하였으며, 이는 CalBioreagent에서 구입하였다.

한편, 검출 완충용액은 HRP 효소에 의해 발색정도를 측정하기 위해 TMB(3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine) 용액을 Sigma에서 구입하여 사용하였으며, 세척 완충용액으로는 0.1% Tween-20가 들어있는 PBS 용액을 사용하였다.

아울러, 자성입자는 아모라이프사이언스에서 공급 받았고, 자성입자에 고정시킨 코티솔에 대한 항체는 CalBioreagent에서 구입하였으며, 튜빙 내에서 액체 밸브로 사용되는 액체왁스는 Bio-Rad에서 구입하였다.

특히, 자성입자에 코티솔에 대한 항체를 고정시키는 것은 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide를 사용하는 화학적 방법을 사용하였다.

1-2. 실험 준비

도 4는 본 발명의 실시예에서 코티솔을 검출하기 위한 랩온어튜빙을 나타낸 도면이다.

먼저, 내경이 1.55mm 인 테플론 튜빙을 길이 4cm가 되도록 자르고 PDMS(polydimethylsiloxane) 10㎕ 로 튜빙의 한 쪽 끝을 막았다.

그리고, 막힌 끝으로부터 시작하여, TMB 20㎕, 액체왁스 10㎕, 세척 완충용액 20㎕, 액체왁스 10㎕를 차례대로 넣었다. 이때, 수용액 층과 액체 왁스 층이 완전히 접촉하도록 하여 두 층 사이에 기포를 남겨놓았다가 나중에 기포를 이동시킴으로써 TMB 용액을 고르게 섞어주었다.

다음으로, 세척 완충용액 25㎕에 코티솔이 포함된 시료 10㎕, 코티솔에 대한 항체를 고정시킨 자성입자 5㎍(㎕), HRP-코티솔 ㎍(㎕)을 더하여 혼합한 후 그 혼합물을 튜빙의 가장 밖에 있는 액체 왁스층 다음으로 넣어주었다(도 4 참조).

1-3. 자석 이동에 의한 입자 이동방법을 이용한 코티솔(cortisol)의 검출

본 실시예에서 자석 이동에 의한 입자 이동방법을 이용하여 코티솔을 검출하였다.

보다 구체적으로, 튜빙 밖에 위치하는 자석을 혼합물이 있는 위치에서 출발하여 세척 완충용액 층에서 자석을 잠시 튜빙으로부터 멀리 했다가 다시 튜빙의 세척 완충용액 층에 대고 TMB 층까지 천천히 옮겨준다.

이때, 자석의 이동에 걸리는 전체 시간은 약 20초 정도였다. 자성입자를 TMB 층까지 이동시킨 후에 튜빙의 입구를 막아주고 TMB 층 부분을 손가락으로 톡톡쳐서 자성입자를 분산시킨다.

그리고, 마지막으로 5분간 효소 반응을 시킨 후 TMB 층의 색깔을 관찰한다.

참고로, 시료공간에서는 시료에 포함된 코티솔과 HRP-코티솔이 경쟁적으로 반응하였다. 반응이 완료된 후 자성입자를 검출 완충용액으로 이동시켰더니 자성입자에 결합한 HRP-코티솔의 효소 활성에 의해 색깔이 나타났다.

이때, 코티솔의 농도가 높으면 자성입자에 결합하는 HRP-코티솔의 양이 감소하기 때문에 검출용액의 흡광도는 낮아진다.

한편, 코티솔과 HRP-코티솔의 경쟁적 면역분석이 제대로 이루어지는지 확인하기 위하여 HRP-코티솔을 양을 변화시켜 실험을 진행하였으며, 구체적으로 0.1ng/㎖, 1ng/㎖, 3ng/㎖, 10ng/㎖ 및 100ng/㎖ 로 각각 진행하였다.

도 5는 본 발명의 실시예에서 코티솔을 검출하기 위한 랩온어튜빙을 이용하여 코티솔을 검출한 결과를 나타낸 도면이다.

결과적으로, HRP-코티솔의 농도가 높아지는 것은 시료 내에 포함되어 있는 코티솔의 농도는 낮아지는 것을 의미하는 것으로, 도 5를 참조하면, HRP-코티솔의 농도가 높아질수록 흡광도가 높아진 것을 확인할 수 있었다.

즉, 이에 따라 경쟁적 면역분석이 제대로 이루어졌다는 것을 알 수 있었으며, 이 결과는 자성입자에 결합한 HRP-코티솔이 자성입자에 의해 검출공간으로 이동했음을 보여주며, 자성입자에 결합하지 않은 HRP-코티솔은 검출 공간으로 이동하지 않아, 액체 왁스에 의해서 용액 또는 자성입자에 결합하지 않은 HRP-코티솔의 이동이 없었음을 알 수 있었다.

실시예 2. 박테리아 DNA 추출

2-1. 시료 및 기구

본 실시예에서는 내경이 2mm 인 테플론 튜빙을 Upchurch Scientific에서 구입하였으며, 용해 완충용액(5.5M guanidine thiocyanate, 20mM Tris-Cl, 20mM EDTA, pH6.6) 제조에 필요한 시약은 Sigma에서 구입하였다. 아울러, 실리카로 코팅된 자성입자(이하, 자성입자 A)와 항체를 고정시키는 자성입자는 아모라이프사이언스에서 공급 받았으며, 장염비브리오균에 대한 항체는 앱클론에서 제조하였다.

또한, 튜빙 내의 용액의 혼합을 방지하기 위한 액체왁스는 Bio-Rad에서 구입하였다.

마지막으로, 장염비브리오균 검출하기 위하여 실시간 PCR 키트를 사용하였으며, 이는 코젠바이오텍에서 구입하였다.

자성입자에 장염비브리오균에 대한 항체를 고정시키는 것은 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide를 사용하는 화학적 방법을 사용하였다.

2-2. 실험준비

도 6은 본 발명의 실시예에서 박테리아로부터 DNA 를 추출하기 위한 랩온어튜빙을 나타낸 도면이다.

먼저, 내경이 2mm 인 테플론 튜빙을 길이 7cm가 되도록 자르고 PDMS(polydimethylsiloxane) 10㎕ 로 튜빙의 한 쪽 끝을 막았다.

그리고, 막힌 끝으로부터 시작하여, 증류수 20㎕, 액체왁스 35㎕, 실리카로 코팅된 자성입자 A 10㎍ 이 포함된 용해 완충용액 50㎕, 액체왁스 35㎕을 차례대로 넣었다. 아울러, 액체 왁스 다음으로 10⁴ cfu/㎖로 묽힌 장염비브리오균 (KCTC 2471) 50㎕에 장염비브리오균에 대한 항체가 고정된 자성입자 B 10㎕(10㎍)을 더한 혼합물을 넣어주었다(도 6 참조).

2-3. 자석이동에 의한 입자 이동 방법으로 박테리아 검출

실시예 2-2의 혼합물에서 장염비브리오균과 자성입자 B 사이의 결합을 촉진하기 위하여 30분간 튜빙에 진동을 가하였다.

그리고, 튜빙의 외부에서 자석을 혼합물이 있는 곳에 위치시키고 자성입자 B를 모아주고, 자석을 용해 완충용액이 있는 곳으로 이동시킨 후 30분간 진동을 가하였다.

이 때, 자성입자 B 에 결합된 상태로 이동한 장염비브리오균에서 용해되어 흘러나온 DNA 가 자성입자 A와 결합하게 되며, 자석을 증류수가 있는 곳으로 이동시키면 자성입자 A와 자성입자 B가 모두 이동하여 자성입자 A에 결합한 DNA 가 해리된다.

다음으로, DNA 가 제대로 추출되었는지 확인하기 위하여 DNA 가 녹아있는 증류수 20㎕ 가운데 6㎕를 취하여 장염비브리오균 검출용 실시간 PCR 키트를 이용하여 PCR 을 시행하였다.

한편, 비교를 하기 위하여 전 과정을 튜빙에서 시행하여 추출한 DNA(A)와 균을 포획하는 과정만 튜빙에서 진행하였으며, 나머지는 튜빙에서 추출한 DNA(B)도 함께 PCR 을 시행하였다. 전 과정을 튜빙에서 시행하는 실험에서 마지막 세척에는 80% 알코올을 이용하였다.

도 7은 본 발명의 실시예에서 박테리아로부터 DNA 를 추출하기 위한 랩온어튜빙에서 DNA 를 추출한 결과를 나타낸 도면이다.

도 7에서 나타난 바와 같이 세 가지 방법으로 추출한 DNA 가 모두 비슷한 속도로 증폭된 것을 확인할 수 있다.

이상의 결과를 통해 랩온어튜빙에서 자석을 움직이는 매우 간단한 방법으로 박테리아 DNA 를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

100: 랩온어칩
110: 시료공간 120: 검출공간
130: 채널 132: 공간마개
200: 입자

Claims

검출용액, 세척 완충용액 및 분석대상시료와 입자가 포함된 혼합물이 로딩되는 로딩 완충용액이 각각 구분되어 순차적으로 수용되는 튜빙;
각각의 용액 사이에 위치하며, 인접하는 두 용액이 섞이는 것을 방지하는 액체밸브; 및
튜빙 내에 위치하여 이동수단에 의해 액체밸브를 통과 가능한 입자; 를 포함하며,
상기 입자는 분석대상시료 내의 분석물질에 대한 수용체가 고정된 자성입자이며,
상기 검출용액, 세척 완충용액 및 로딩 완충용액은 수용성이며, 액체밸브는 왁스(wax), 오일(oil) 및 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 중 1종 이상을 포함하는 지용성인 것을 특징으로 하는 랩온어튜빙.
증류수, 실리카 코팅 자성입자가 포함된 구아니딘 티오시안산염 (guanidine thiocyanate) 수용액 및 분석대상시료와 입자가 포함된 혼합물이 로딩되는 로딩 완충용액이 각각 구분되어 순차적으로 수용되는 튜빙;
각각의 용액 사이에 위치하며, 인접하는 두 용액이 섞이는 것을 방지하는 액체밸브; 및
튜빙 내에 위치하여 이동수단에 의해 액체밸브를 통과 가능한 입자; 를 포함하며,
상기 입자는 분석대상시료 내의 분석물질에 대한 수용체가 고정된 포획입자인 자성입자이며,
상기 증류수, 구아니딘 티오시안산염 수용액 및 로딩 완충용액은 수용성이며, 액체밸브는 왁스(wax), 오일(oil) 및 트리아실글리세롤(triacylglycerol) 중 1종 이상을 포함하는 지용성인 것을 특징으로 하는 랩온어튜빙.
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제1항 또는 제2항에 있어서,
튜빙은
평균 직경이 0.1 내지 2mm 인 관형태인 것을 특징으로 하는 랩온어튜빙.
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제1항 또는 제2항에 있어서,
액체밸브는
10 내지 20℃ 의 녹는점을 갖는 랩온어튜빙.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 자성입자는 자력에 의해서 이동되는 것을 특징으로 하는 랩온어튜빙.
제1항에 따른 랩온어튜빙을 이용하여,
로딩 완충용액에 분석대상시료와 입자가 포함된 혼합물을 로딩하여 분석대상시료가 부착된 입자를 형성하는 단계;
자력에 의해서 상기 분석대상시료가 부착된 입자를 검출용액으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 단계; 를 포함하는 분석물질 검출방법.
제2항에 따른 랩온어튜빙을 이용하여,
분석대상시료는 세포이며, 상기 세포를 포함하는 분석대상시료와 포획입자가 포함된 혼합물을 로딩하여 세포-포획입자 복합체를 형성하는 단계;
세포-포획입자 복합체를 이동수단에 의해서 용해 완충용액으로 이동시켜 세포를 용해하여, 세포로부터 DNA를 분리하고, DNA-실리카 코팅 자성입자 복합체를 형성하는 단계; 및
용해 완충용액에 위치하는 세포-포획입자 복합체 및 DNA-실리카 코팅 자성입자 복합체를 이동수단에 의해 증류수로 이동시켜 DNA 를 추출하는 단계; 를 포함하는 DNA 추출방법.