KR101608598B1

KR101608598B1 - 정지 액체상 랩온어칩

Info

Publication number: KR101608598B1
Application number: KR1020140162362A
Authority: KR
Inventors: 최석정
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2016-04-04
Also published as: WO2016080617A1

Abstract

본 발명은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber); 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber); 상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며, 상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩에 관한 것이다.

Description

정지 액체상 랩온어칩{Stationary liquid phase lab-on-a-chip}

본 발명은 입자를 이동수단을 이용하여 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출할 수 있는 정지 액체상 랩온어칩에 관한 것이다.

ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 와 같은 면역분석(immunoassay)은 항체를 이용하는 검출 방법으로 질병이나 연구에 널리 사용되고 있다. 예를 들어 샌드위치 ELISA 방법에서는 분석물질의 서로 다른 부위에 결합하는 두 종류의 항체를 사용하는데 그 가운데 한 항체는 면역플레이트(immunoplate) 와 같은 고체상(solid phase)에 고정시켜 포획항체(capture antibody)로 사용하고 다른 항체는 효소와 연결하여 표지화 항체(labelled antibody) 로 사용한다. 포획항체가 있는 고체상에 분석물질을 포함하는 시료를 더하여 반응시키면 분석물질이 항체에 결합한다. 이 상태에서 고체상 표면을 세척 완충용액(washing buffer) 으로 세척하면 분석물질을 제외한 나머지 모든 물질을 제거할 수 있다. 여기에 다시 표지화 항체를 넣어 반응시키고 결합하지 않은 표지화 항체를 세척 완충용액으로 세척하면 고체상에는 분석물질의 양에 비례하여 효소가 결합하게 된다. 따라서, 효소 활성을 측정함으로써 분석물질의 양을 측정할 수 있다.

여기서, 고체상에 항체를 고정시키는 이유는 고체상에 결합하지 않고 액체상(liquid phase) 에 남아있는 물질들을 쉽게 제거할 수 있기 때문이다. 다른 면역 분석법에서는 고체상(solid phase)에 항체와 결합할 수 있는 이차항체나 단백질 G(protein G) 를 고정시켜 사용하기도 하고 항원을 고정시키기도 한다.

고체상으로는 면역플레이트(immunoplate)와 같은 플라스틱 표면이 많이 사용되지만 표면적이 넓은 장점으로 인하여 입자를 사용할 수도 있다. 특히 자성입자(magnetic particle)는 자석을 이용하여 포집하거나 이동시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 불순물이 많이 포함되어 있는 시료에서 분석물질을 분리하는 전처리(pretreatment) 에 많이 이용되고 있다. 예를 들면 분석물질에 대한 항체를 고정시킨 자성입자를 시료에 넣고 반응시키면 분석물질이 자성입자에 고정된 항체에 결합하게 된다. 자력을 튜브 벽에 가하면 자성입자는 모두 튜브 벽에 달라붙게 되고 나머지 용액을 제거함으로써 불순물을 모두 제거할 수 있다.

그러나 종래의 면역분석법을 자동화하기 위해서는 액체를 이동시켜야하기 때문에 펌프가 필요하고, 장치 내에 세척 완충용액이 담긴 통과 액체의 이동을 위한 튜브들이 필요하며, 또한 면역플레이트나 액체 주입장치를 이동시키는 이송장치가 필요하기 때문에 장치가 크고 복잡해지는 문제점이 발생되었다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 정지 액체상에서 고체상인 입자를 이동시킴으로써 면역분석법을 시행하는 기술(등록특허 제10-1398764호)이 제안된 바 있다. 상기 기술은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample) 의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber), 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber) 그리고 시료공간과 검출공간 사이에 위치하여 상기 혼합용액과 검출용액이 섞이는 것을 방지하는 채널(channel) 을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(stationary liquid phase lab-on-a-chip, SLP LOC)에서 입자를 시료공간에서 검출공간으로 이동시킴으로써 분석물질을 검출할 수 있는 기술이 개시되어 있다.

특히, 도 1에 도시된 바와 같이, 종래기술의 랩온어칩은 고정 커버를 이용하여 세척 완충용액 공간 마개(132)를 이동시킴으로써, 세척 완충용액을 채널로 주입하여, 채널에서 세척과정이 이루어지는 방법을 이용해왔다. 그러나, 상기와 같은 기술은 입자의 세척과정이 채널(130)을 통과하는 동안에만 일어나기 때문에 충분히 세척되지 않을 수 있으며, 입자가 충분히 세척되지 않는 상태에서는 분석물질이 없는 시료를 측정하였을 때의 기준값이 높아져 낮은 농도의 분석물질이 포함된 시료와 차이를 구별하기 어렵게 되는 문제점이 있다. 즉, 최저검출한계(lower limit of detection)가 높아지는 문제점이 발생하는 것이다.

KR 등록 제10-1398764호

본 발명은 분석물질의 검출시 세척효율을 높일 수 있는 정지액체상 랩온어칩을 제공하고자 한다.

본 발명은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber); 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber); 상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며, 상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 정지액체상 랩온어칩은 세척공간을 추가로 포함함으로써, 분석물질의 검출시 세척효율을 높일 수 있다.

도 1은 종래기술의 완충용액 공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브를 제거하는 것을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 본 발명의 정지액체상 랩온어칩의 도면이다.
도 6은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 커버의 구조와 크기를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 중간 몸체의 구조와 크기를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 회전에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬라이딩에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 11은 실시예 1의 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 12는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 채널에 의해 각 공간의 용액이 분리되는 것과 자석의 이동에 의해 자성입자가 시료공간에서 세척공간을 거쳐 검출공간으로 이동하는 것을 보여주는 사진이다.
도 13은 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 세척공간에 플러그가 설치된 것과 채널에 공기밸브가 설치된 것을 보여주는 사진이다.
도 14는 실시예 2에서 세척공간의 설치에 의해 입자의 세척 효율이 증가하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 15는 실시예 3에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브가 각 공간의 용액이 혼합되지 않도록 하는 효과가 있음을 보여주는 그래프이다.
도 16은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타내는 모식도이다.
도 17은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 흡광도의 평균값을 STX 농도의 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 19는 MBA 방법으로 평가한 패류독 농도와 본 발명의 정지액체상 랩온어칩으로 측정한 패류독의 농도가 비례함을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 정지액체상 랩온어칩에 관한 것으로, 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber); 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber); 상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며, 상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 랩온어칩이라 함은 실험실에서 행해지는 혼합, 반응, 분리, 분석 등의 여러 가지 조작이 구현되도록 제작된 칩으로, 정지 액체상 랩온어칩은 랩온어칩 내에서 액체가 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라, 액체상을 이동시키는 종래의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미하는 것이다. 이와 관련하여 보다 상세한 설명은 후술하도록 한다.

이에 더하여, 상기 채널은 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간보다 직경이 작을 수 있으며, 상기 정지액체상 랩온어칩은 상기 채널을 개폐하며, 상기 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하는 밸브수단을 포함할 수 있다.

이때, 상기 밸브수단은 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브일 수 있으며, 상기 세척공간의 상면은 플렉서블한 재질로 형성되며, 상기 세척공간의 상면에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거할 수 있다. 또는 상기 세척공간의 상면에 피스톤이 설치되며, 상기 피스톤에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거할 수 있다.

하나에 양태로서, 상기 밸브수단은 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 설치되는 게이트 밸브 또는 글로브 밸브일 수 있으며, 특정 양태로서, 상기 밸브수단은 회전축을 중심으로 회전가능한 원판형으로 형성되며, 상기 세척공간과 채널이 상기 시료공간 및 검출공간과 격리되도록 상기 밸브수단내에 설치되어, 상기 밸브수단의 회전에 의해서, 상기 채널을 개폐할 수 있다.

이 외에도, 상기 밸브수단은 상기 시료공간과 검출공간의 사이에서 수직방향으로 슬라이딩 이동가능하게 판상으로 형성되며, 상기 세척공간과 채널이 상기 시료공간 및 검출공간과 격리되도록 상기 밸브수단에 설치되어, 상기 밸브수단의 슬라이딩 이동에 의해서, 상기 채널을 개폐할 수 있다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브를 제거하는 것을 나타내는 도면, 도 5는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 본 발명의 정지액체상 랩온어칩의 도면, 도 6은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 커버의 구조와 크기를 나타낸 도면, 도 7은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 중간 몸체의 구조와 크기를 나타낸 도면, 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 회전에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬라이딩에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 11은 실시예 1의 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 12는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 채널에 의해 각 공간의 용액이 분리되는 것과 자석의 이동에 의해 자성입자가 시료공간에서 세척공간을 거쳐 검출공간으로 이동하는 것을 보여주는 사진, 도 13은 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 세척공간에 플러그가 설치된 것과 채널에 공기밸브가 설치된 것을 보여주는 사진, 도 14는 실시예 2에서 세척공간의 설치에 의해 입자의 세척 효율이 증가하는 것을 보여주는 그래프, 도 15는 실시예 3에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브가 각 공간의 용액이 혼합되지 않도록 하는 효과가 있음을 보여주는 그래프, 도 16은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타내는 모식도, 도 17은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타낸 사진, 도 18은 흡광도의 평균값을 STX 농도의 표준곡선을 나타낸 그래프, 도 19는 MBA 방법으로 평가한 패류독 농도와 본 발명의 정지액체상 랩온어칩으로 측정한 패류독의 농도가 비례함을 나타내는 그래프이다. 이하, 도 2 내지 도 19와 실시예를 통해 본 발명인 정지액체상 랩온어칩을 상세히 설명한다.

도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 정지액체상 랩온어칩은 입자(200)(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(110)(sample chamber), 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(120)(detection chamber), 상기 시료공간(110) 및 검출공간(120) 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(140)(washing chamber) 및 상기 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)을 연결하는 복수의 채널(130)(channel)을 포함하며, 상기 입자(200)를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 입자(200)라 함은 분석물질 또는 분석물질에 의해 생성되는 생성물(product)과 결합되는 입자-분석물질 복합체 또는 입자-생성물 복합체를 형성하는 물질일 수 있다. 이를 위하여 입자(200)에는 분석물질에 특이적인 수용체(receptor)나 분석물질에 의해 생성되는 생성물에 특이적인 수용체가 고정되어 있을 수 있다. 특히, 상기 입자(200)는 분석물질 또는 분석물질에 의해 생성되는 생성물을 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시키는 역할을 할 수 있고, 분석물질에 표지를 붙이는 역할을 할 수도 있다.

이에 더하여, 상기 입자(200)는 실리카 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리카보네이트 입자, 유리 입자, 알루미나 입자, 금 입자, 은 입자, 팔라듐 입자, 백금 입자, 티타니아 입자, 지르코늄 입자 및 코어-쉘(core-shell) 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

특히, 본 발명은 혼합용액, 세척 완충용액 및 검출용액이 정지 상태로 담겨지는 것을 특징으로 하며, 상기 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)은 채널(130)과 연결된 부분을 제외한 다른면이 밀폐될 수 있다.

여기서, 혼합용액과 검출용액이 정지되어 있다는 것은 용액이 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라 액체상을 이동시키는 기존의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미하는 것이다. 상기 고체상이라 함은 본 발명에서 입자(200)를 의미할 수 있다.

또한, 본 발명에서 세척 완충용액(washing buffer)이라 함은 적절한 농도의 세제(detergent) 또는 염(salt)과 같이 비특이적으로 흡착된 물질들을 입자(200)로부터 제거하는데 도움이 되는 성분들을 포함하는 완충용액을 의미한다.

특정양태로서, 본 발명의 정지액체상 랩온어칩(100)은 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 세척공간(140)을 포함함으로써, 입자(200)가 세척공간(140)을 지나는 동안 세척이 이루어지도록할 수 있다.

이러한 세척공간(140)은 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 채널(130)만 형성되어 있을 때에 비해 입자(200)를 세척하는 세척 완충용액의 부피가 커지기 때문에 세척효율이 크게 높아질 수 있다. 일 예로 단면이 0.5×0.5mm 이고, 길이가 15mm 인 채널(130)에 채워져 있는 세척 완충용액의 부피는 3.75㎕에 불과할 수 있다. 그러나, 밑면적이 1cm² 이고, 높이가 0.5cm 인 세척공간(140)에 채워지는 세척 완충용액의 부피는 500㎕로 130배가 될 수 있다. 따라서, 입자(200)의 비특이적으로 흡착되어 있던 물질들이 떨어져 나올 때 희석효율이 130배가 증가될 수 있다.

이에 더하여, 본 발명의 세척공간(140)으로 인하여 입자(200)를 세척하는 세척 완충용액의 부피가 커지기 때문에 시료 공간에 있는 물질들과 검출공간(120)에 있는 물질들이 확산되어 다른 공간에 도달하는 속도가 느려질 수 있다. 상기 예에서 희석 효율이 130배 증가될 수 있어, 확산에 의한 농도 변화 속도가 감소될 수 있다.

한편, 본 발명의 정지액체상 랩온어칩(100)은 채널(130)을 개폐하며, 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하는 밸브수단을 포함할 수 있다. 이러한 밸브수단은 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120) 내에 담긴 용액들이 섞이는 것을 방지하기 위하여 설치될 수 있다. 즉, 상기 밸브수단은 정지액체상 랩온어칩에 포함된 용액이 서로 혼합되지 않아 용액이 담긴 상태로 보관을 용이하게 할 수 있다.

도 3에 도시된 바에 따르면, 상기 밸브수단은 복수의 채널(130) 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브(131)일 수 있다.

특히, 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 세척공간(140)의 상면(142)은 플렉서블한 재질로 형성되어, 상기 세척공간(140)의 상면(142)에 압력을 가하여, 상기 공기밸브(131)를 제거할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세척공간(140)의 상면(142)에 압력을 가하면, 세척공간(140) 내부의 세척 완충용액이 양쪽에 위치하는 채널(130)로 밀려나가면서, 채널(130)을 채우도록 할 수 있으며, 이때, 공기밸브(131)가 채널(130)에서부터 밀려나가 공기(111)가 시료공간(110)과 검출공간(120)의 상부로 이동할 수 있다.

다른 양태로서, 상기 세척공간(140)의 상면(142)에 피스톤이 설치될 수 있으며, 상기 피스톤에 압력을 가하여, 상술한 바와 같이, 공기밸브(131)를 제거할 수 있다.

이 외에도, 밸브수단이 공기밸브로 형성되는 경우, 도 5 내지 도 7에 나타낸 것과 같이 세척공간(140)의 일 면에 이동 가능한 플러그(141)를 설치하여, 플러그(141)를 이동시킴으로써 완충용액을 양 채널(130)로 밀어내도록할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 정지 액체상 랩온어칩(100)이 공기밸브(131)를 포함함으로써, 용액을 담은 상태에서 보관이 용이하며, 간단한 방법으로 공기밸브(131)를 제거할 수 있는 이점이 있다.

도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 밸브수단(150)은 복수의 채널(130) 중 적어도 한 곳에 설치되는 게이트 밸브 또는 글로브 밸브일 수 있다. 이와 같은 게이트 밸브 또는 글로브 밸브로 채널(130)을 개폐하여, 시료공간(110)과 세척공간(140) 또는 검출공간(120)과 세척공간(140)을 격리시키거나 연결시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 밸브수단(150)은 도 9에 도시된 바와 같이, 회전축을 중심으로 회전가능한 원판형으로 형성될 수 있다.

이때, 상기 세척공간(140)과 복수의 채널(130)이 상기 시료공간(110) 및 검출공간(120)과 격리되도록 상기 밸브수단(150)내에 설치될 수 있으며, 상기 밸브수단(150)의 회전에 의해서, 상기 채널(130)을 개폐할 수 있다. 도 9를 참조하면, 상기 밸브수단(150)을 회전하여, 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)으로 실질적으로 동일선상에 위치하도록 하면, 시료공간(110)과 세척공간(140), 검출공간(120)과 세척공간(140)이 복수의 채널(130)을 통해서 서로 연통될 수 있다.

또한, 본 발명의 밸브수단(150)은 도 10에 도시된 바와 같이, 상기 시료공간(110)과 검출공간(120)의 사이에서 수직방향으로 슬라이딩 이동가능하게 판상으로 형성될 수 있다.

이때, 상기 세척공간(140)과 채널(130)이 상기 시료공간(110) 및 검출공간(120)과 격리되도록 상기 밸브수단(150)에 설치되어, 상기 밸브수단(150)의 슬라이딩 이동에 의해서, 상기 채널(130)을 개폐할 수 있다. 도 10을 참조하면, 상기 밸브수단(150)을 전방으로 슬라이딩 이동하여, 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)이 실질적으로 동일선상에 위치하도록 하면, 시료공간(110)과 세척공간(140), 검출공간(120)과 세척공간(140)이 복수의 채널(130)을 통해서 서로 연통되며, 상기 밸브수단(150)을 후방으로 슬라이딩 이동하면, 시료공간(110)과 채널(130) 그리고 검출공간(120)과 채널(130)을 격리시킬 수 있다.

이와 같은 본 발명은 유기물질, 단백질, 핵산, 세포 등 다양한 분석물질을 검출하는데 이용될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 랩온어칩(100)으로 마비성 패류독(paralytic shellfish, PST)을 검출할 수 있다.

여기서, 마비성 패류독이라 함은 해양 식물성 유독 플랑크톤을 이매패류가 섭취하여 생기는 독성분으로, 우리나라를 비롯하여 미국과 유럽 등 대부분의 나라에서는 마비성 패류독에 의한 중독을 방지하기 위해 가식부 100g 당 마비성 패류독의 함량을 80㎍으로 규제하고 있으며, 마비성 패류독의 함량이 80㎍ 이상이 되는 해역에서는 패류의 채취를 금하고 있다. 마비성 패류독을 검출하는 공인 방법으로는 Mouse Bioassay(MBA) 방법이 있는데, 이 방법에서는 여러 마리 마우스의 복강에 조개 추출액을 주사하여 사망에 이르는 시간을 측정함으로써 마비성 패류독 가운데 주요성분인 STX(saxitoxin) 의 농도로 환산하여 STX equivalent로 나타낸다. 구체적인 마비성 패류독 검출방법은 후술하도록 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 정지 액체상 랩온어칩의 제조

본 실시예에서는 세척공간(140)을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(100)을 효율을 확인하기 위하여, 랩온어칩(100)을 제조하였다.

본 실시예에서 정지액체상 랩온어칩(100)은 도 5와 같은 구조를 갖도록 설계하였다. 이 랩온어칩(100)은 커버(300), 중간 몸체, 바닥 판으로 나누어 아크릴로 제작한 후 접착제를 이용하여 세 조각을 붙여 제작하였다. 커버(300)는 도 6에 도시된 것처럼 두께 1 mm의 아크릴 판에 구멍을 뚫어 제작하였다. 중간 몸체는 도 7에 도시된 것처럼 두께 5 mm 아크릴 판에 오각형, 마름모꼴, 직사각형 모양으로 세 개의 구멍을 뚫어 각각 시료공간(110), 세척공간(140), 검출공간(120)을 형성하도록 하고 시료공간(110)과 세척공간(140) 사이 그리고 세척공간(140)과 검출공간(120) 사이에 폭 1 mm 깊이 0.5 mm의 홈을 만들어 채널(130)을 형성하도록 하였다. 아래 판은 두께 아크릴 판을 몸체 크기에 맞춰 절단하여 사용하였다. 도 11은 세 조각을 접착시킨 후의 형태를 나타낸 것이다. 특히 랩온어칩(100)의 크기를 분광 광도계(spectrophotometer)에서 사용하는 큐벳(cuvette)과 동일하게 함으로써 검출공간(120)에서 효소반응에 의해 색깔이 나타날 경우 랩온어칩(100)을 분광 광도계(spectrophotometer)에 직접 꽂아 검출공간(120)의 흡광도를 측정할 수 있도록 하였다.

정지액체상 랩온어칩(100)은 공간의 분리(separation of chambers)와 선택적 이동(specific transport)이라는 두 가지 요소를 충족시켜야 한다. 공간의 분리라는 것은 서로 다른 공간이 채널(130)에 의해 잘 분리되어 용액이 서로 혼합되지 않아야 한다는 것이고, 선택적 이동이라는 것은 자성입자를 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시킬 때 자성입자에 결합한 물질만 선택적으로 이동하고 나머지 물질은 시료공간(110)에 그대로 남아있는 것을 의미한다. 이 두 가지 요소를 확인하기 위해 시료공간(110)에 자성입자와 파란색 염료 용액을 넣고 30분 흔들어 섞어주었다.

도 12의 맨 위에 있는 흔들기 전 사진을 보면 자성입자의 갈색과 염료의 파란색이 분리되어 있지만 흔들어준 후에는 두 번째 사진에서와 같이 혼합되어 있는 것을 볼 수 있다. 그러나 채널(130)이나 다른 공간에는 아무 색도 관찰되지 않아 채널(130)에 의해 각 공간의 내용물이 잘 분리되어 있는 것을 알 수 있다. 다음으로 랩온어칩(100)의 밑에서 자석을 시료공간(110)으로부터 검출공간(120)으로 이동시킨 결과 자성입자만 이동하고 자성입자에 결합하지 않는 염료는 시료공간(110)에 그대로 남아있는 것을 볼 수 있다.

다음으로 공기밸브(131)가 형성되는 것을 확인하기 위해 도 13에서와 같이 시료공간(110)과 검출공간(120)에는 완충용액을 채우고 세척공간(140)에는 눈으로 구별이 용이한 파란색 염료 용액을 채웠다. 그리고 세척공간(140) 양쪽 채널(130)에는 용액을 채우지 않고 비워놓음으로써 공기밸브(131)로 작용하도록 하였다. 도 10의 아래 사진을 보면 채널(130)의 공기방울이 공기밸브(131)로 작용하여 각 공간의 용액이 분리되도록 차단하고 있는 것을 확인할 수 있다. 그리고 세척공간(140)의 상부에 상하이동이 가능한 플러그(141)를 설치하여 이 플러그(141)를 아래로 밀어 세척공간(140)의 용액을 밀어내면 채널(130)의 공기(111)가 밀려나며 채널(130)이 열리도록 제작하였다.

실시예 2. 세척공간을 포함하는 랩온어칩의 세척효과

본 실시예에서는 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)의 세척효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)과 세척공간(140)을 포함하지 않는 랩온어칩(100)을 준비하였다. 여기서, 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)이라 함은 본 발명의 랩온어칩(100)을 의미하는 것으로, 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)을 의미한다.

먼저, 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)의 시료공간(110)에 스트렙트아비딘이 고정되어 있는 자성입자인 SA-MP(life technologies) 10㎍ 와 비오틴기가 없는 HRP(horseradish peroxidase) 효소 10㎍을 세척완충용액(0.01% Triton X-100, 2.5mg/ml BSA in PBS)과 함께 넣어주었다. 여기서, 비오틴기가 없는 HRP는 SA-MP 에 결합하지 않는 효소를 의미한다.

그리고, 세척공간(140)에는 상기 세척완충용액과 동일한 용액으로 채우고, 검출공간(120)은 HRP의 시료인 TMB(3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine, Sigma) 용액으로 채웠다. 또한, 본 실시예에서는 세척공간(140)의 세척효과를 확인하기 위한 것으로, 채널(130)에 형성된 공기밸브(131)는 제거하였다.

또한, 세척공간(140)을 포함하지 않는 랩온어칩(100)의 시료공간(110)에도 상기 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)과 동일하게 SA-MP 10㎍과 비오틴이 없는 HRP 효소 10㎍을 세척완충용액과 함께 넣어주고, 검출공간(120)에는 TMB 용액을 채워주었다. 그 후에, 두 개의 랩온어칩(100)을 10분간 흔들어주었고, 상기 랩온어칩(100)의 외부에서 2cm/min 의 속도로 자석을 이동시킴으로써 SA-MP 를 시료공간(110)으로부터 검출공간(120)으로 이동시켰다. 그리고, 효소반응을 위해 5분간 반응시킨 후 검출공간(120)의 TMB 용액의 650nm 흡광도를 형광분광광도계(plate reader) 로 측정하였다.

그 결과, 도 14에 나타나는 것처럼, 세척공간(140)이 있는 랩온어칩(100)의 TMB 용액(+ washing chamber)은 전혀 반응하지 않은 TMB 용액(control)의 흡광도에 비해 큰 변화가 없었지만 세척공간(140)이 없는 랩온어칩(100)의 TMB 용액(- washing chamber)은 매우 높은 흡광도를 보여주었다. 세척공간(140)이 없는 랩온어칩(100)에서는 SA-MP 에 결합하지 않은 HRP 가 확산에 의해 검출공간(120)으로 이동했을 뿐만 아니라 SA-MP에 비특이적으로 흡착된 상태로 이동해갔을 것으로 판단된다.

반면에, 세척공간(140)이 있는 랩온어칩(100)에서는 상술한 바와 같이, 세척효율의 증가와 확산에 의한 농도변화의 속도 감소로 인하여 SA-MP 에 결합하지 않은 HRP 가 검출공간(120)으로 거의 이동하지 않은것으로 판단된다.

실시예 3. 공개밸브의 유무에 따른 채널의 차단효과

본 실시예에서는 공기밸브(131)가 각 공간의 용액을 효과적으로 차단할 수 있는지 확인하였다.

먼저, 스트렙트아비딘이 고정되어 있는 자성입자인 SA-MP(life technologies)에 비오틴기가 부착된 HRP(horseradish peroxidase)효소를 더하여 결합시킴으로써 HRP-SA-MP 를 만들었다. 두 개의 랩온어칩(100)을 준비하여 HRP-SA-MP 10㎍을 세척완충용액(0.01% Triton X-100, 2.5mg/ml BSA in PBS)과 함께 시료공간(110)에 넣어주었다.

세척공간(140)은 상기 세척완충용액과 동일한 용액으로 채우고, 검출공간(120)은 HRP 의 시료인 TMB(3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine, Sigma) 용액으로 채웠다. 두개의 랩온어칩(100) 중 하나는 각 채널(130)에 공기밸브(131)를 설치하고, 다른 하나는 채널(130)을 세척완충용액으로 채워 공기밸브(131)를 설치하지 않았다.

공기밸브(131)를 설치한 랩온어칩(100)과 설치하지 않은 랩온어칩(100)을 30분간 심하게 진동을 가하고 30분간 더 놓아둔 후 검출공간(120) TMB 용액의 650nm 흡광도를 흡광광도계로 측정하였다. 그 결과 도 15에 나타난 바와 같이 공기밸브(131)를 설치한 랩온어칩(100)의 TMB 용액(+air valve) 은 전혀 반응하지 않은 TMB 용액(control) 의 흡광도와 유사하게 나왔지만 공기밸브(131)가 없는 랩온어칩(100)의 TMB 용액(-air valve) 은 흡광도가 높아져 반응이 많이 일어났음을 알 수 있었다. 이는 공기밸브(131)가 없는 랩온어칩(100)에서는 진동에 의해 HRP-SA-MP 입자가 검출공간(120)으로 이동하였지만, 공기밸브(131)가 있는 랩온어칩(100)에서는 이동하지 않았음을 보여준다. 따라서, 랩온어칩(100)을 보관하는 동안 각 공간의 용액이 혼합되는 것을 방지하는데 공기밸브(131)가 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용한 마비성 패류독 검출

본 실시예에서는 세척공간(140)을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(100)을 이용하여 경쟁적인 면역분석법에 의해 마비성 패류독(paralytic shellfish toxin, PST) 을 검출하였다.

마비성 패류독(PST)은 여러가지 독소로 구성되어 있는데, 본 실시예에서는 마비성 패류독에서 가장 중요한 독소인 STX(saxitoxin)에 대한 STX Ab(항체)를 일차 수용체로 사용하였다. 또한, 고체상으로는 protein G 를 고정시킨 G-MB(자성입자, 미국 Pierce) 를 사용하였으며, 상기 protein G 는 항체와 결합할 수 있는 이차 수용체로 작용하였다.

또한, 시료에 포함된 독소와 경쟁반응을 하게되는 표지화 표준물질로는 HRP(horseradish peroxidase) 효소를 연결시킨 STX-HRP 를 이용하였으며, 10×STX Ab 용액과 10×STX-HRP 용액은 미국 Beacon Analytical Systems 에서 구입하여 사용하였다. 그리고, 검출공간(120)에는 HRP의 기질인 TMB 용액을 채워 검출용액으로 사용하였다.

STX Ab 는 G-MB 에 결합하여 고정되고 STX Ab 에는 시료에 포함된 STX와 표지화 표준물질인 STX-HRP 가 경쟁적으로 결합한다. 이 상태에서 자석을 이용하여 G-MB 를 시료공간(110)으로부터 검출공간(120)으로 이동시키면 G-MB 에 결합한 STX-Ab, 그리고 STX Ab 에 결합한 STX 및 STX-HRP 만 이동하게 된다. 시료의 STX의 농도가 높을수록 더 작은 양의 STX-HRP 가 G-MB 에 결합하기 때문에 검출공간(120)으로 이동하는 HRP의 효소 활성은 낮아진다.

본 실시예에서 세척공간(140)과 채널(130)에는 세척완충용액(0.01% Triton X-100, 2.5 mg/ml BSA in PBS) 140㎕로 채워주었으며, 시료 공간에는 G-MB 10㎍, 10×STX Ab 5㎕, 10×STX-HRP 5㎕, STX 시료 20㎕, 세척완충용액 160㎕를 더하고, 검출공간(120)에는 TMB 용액 100㎕ 를 더해주었다.

그 후에 셰이커(shaker)에서 350rpm 으로 30분간 결합 반응을 해주고 자석 이동장치를 사용하여 자성입자를 시료 공간에서 검출공간(120)으로 진동을 가하며 이동시켰다. 이때의 이동속도는 1.5cm/min 이었으며, 효율적인 이동을 위해 시료공간(110)의 처음 1/3 지점에서 30초, 시료공간(110)이 끝나는 지점에서 1.5cm/min 이었으며, 세척공간(140)이 시작하는 지점에서 10초, 세척공간(140)이 끝나는 지점에서 10초, 검출공간(120)의 처음 1/3 지점에서 10초간 멈추고 마지막으로 자석을 랩온어칩(100) 밖으로 이동시켰다. 그리고 효소 반응을 위해 다시 350rpm 으로 20분간 혼합(shaking) 하고 랩온어칩(100)을 분광광도계(spectrophotometer) 에 직접 꽂아 검출공간(120)의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 시료의 STX 농도가 높아질수록 G-MB 에 결합하는 STX-HRP 의 양이 감소하여 검출공간(120)의 흡광도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이 실험을 반복하여 흡광도의 평균값을 STX 농도에 대해 그래프로 나타낸 결과 도 18과 같은 표준곡선을 얻을 수 있었다. 그리고 여러 개의 조개 시료를 추출한 후 MBA 방법으로 패류독 농도를 평가하고 동시에 정지액체상 랩온어칩(100)으로도 측정하였다. 그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 서로 비례하는 결과로 나타나 정지액체상 랩온어칩(100)이 면역분석에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

100: 랩온어칩 110: 시료공간
111: 공기 120: 검출공간
130: 채널 131: 공기밸브
132: 마개 140: 세척공간
141: 플러그 142: 세척공간의 상면
150: 밸브수단
200: 입자 300: 커버

Claims

입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber);
검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber);
상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber);
상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 및
상기 채널을 개폐하며, 상기 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하기 위하여, 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브인 밸브수단; 을 포함하며,
상기 세척공간의 상면은 플렉서블한 재질로 형성되며, 상기 세척공간의 상면에 압력을 가하여 상기 공기밸브를 제거하며,
상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
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입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber);
검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber);
상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber);
상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 및
상기 채널을 개폐하며, 상기 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하기 위하여, 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브인 밸브수단; 을 포함하며,
상기 세척공간의 상면에 피스톤이 설치되며, 상기 피스톤에 압력을 가하여 상기 공기밸브를 제거하며,
상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
제1항 또는 제10항에 있어서,
상기 채널은 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간보다 직경이 작은 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.