WO2016080617A1 - 정지 액체상 랩온어칩 - Google Patents

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WO2016080617A1
WO2016080617A1 PCT/KR2015/006390 KR2015006390W WO2016080617A1 WO 2016080617 A1 WO2016080617 A1 WO 2016080617A1 KR 2015006390 W KR2015006390 W KR 2015006390W WO 2016080617 A1 WO2016080617 A1 WO 2016080617A1
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WO
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space
washing
chip
detection
sample
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Application number
PCT/KR2015/006390
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English (en)
French (fr)
Inventor
최석정
Original Assignee
강릉원주대학교산학협력단
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/24—Apparatus for enzymology or microbiology tube or bottle type
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis

Definitions

  • the present invention relates to a stationary liquid lab-on-a-chip capable of detecting analytes by moving particles from a sample space to a detection space using a moving means.
  • Immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are widely used in diseases and research as detection methods using antibodies.
  • the sandwich ELISA method uses two types of antibodies that bind to different regions of the analyte, one of which is immobilized in a solid phase, such as an immunoplate, to capture antibody.
  • the other antibody is used as a labeled antibody in connection with the enzyme.
  • a sample containing an analyte is added and reacted on a solid with a capture antibody, the analyte binds to the antibody. In this state, washing the solid surface with a washing buffer can remove all materials except the analyte.
  • the enzyme binds to the solid phase in proportion to the amount of the analyte.
  • the amount of analyte can be determined by measuring enzyme activity.
  • the reason for immobilizing the antibody on the solid phase is that it is easy to remove substances remaining in the liquid phase without binding to the solid phase.
  • secondary antibodies or protein G which can bind to antibodies in the solid phase, are used or immobilized.
  • magnet particles have the advantage that they can be collected or moved by using a magnet has been widely used in the pretreatment (separation) to separate the analyte from the sample containing a lot of impurities.
  • a magnetic particle immobilized with an antibody to an analyte is added to a sample and reacted, the analyte binds to an antibody immobilized on the magnetic particle.
  • magnetic force is applied to the tube wall, the magnetic particles all stick to the tube wall and all impurities can be removed by removing the remaining solution.
  • a technique (registered patent No. 10-1398764) has been proposed to perform an immunoassay by moving particles that are solid in a stationary liquid phase.
  • the technique detects a sample chamber in which a mixed solution of a reactant including particles and a sample containing an analyte is contained, and a detection solution containing a detection solution.
  • Stationary liquid phase lab-on-a-chip comprising a detection chamber and a channel located between the sample space and the detection space to prevent mixing of the mixed solution and the detection solution;
  • a technique for detecting analyte by moving particles from a sample space to a detection space is disclosed.
  • the lab-on-a-chip of the prior art by moving the wash buffer space stopper 132 using a fixed cover, by injecting the wash buffer solution into the channel, the washing process is performed in the channel Has been used.
  • such a technique may not be sufficiently washed because the washing of the particles occurs only while passing through the channel 130, and when the particles are not sufficiently washed, the reference value when measuring the sample without the analyte is There is a problem in that it becomes difficult to distinguish the difference from the sample containing a high concentration of the analyte. That is, a problem arises in that the lower limit of detection becomes high.
  • the present invention is to provide a stationary liquid phase wrap-on chip that can increase the cleaning efficiency when detecting analyte.
  • the present invention includes a sample chamber in which a mixed solution of a sample including a reactant including particles and an analyte is contained; A detection chamber in which a detection solution is contained; A washing chamber located between the sample space and the detection space, the washing chamber containing a washing buffer; And a plurality of channels connecting the sample space, the washing space, and the detection space.
  • the stationary liquid lab-on-a-chip according to the present invention further includes a washing space, thereby increasing the washing efficiency upon detection of the analyte.
  • FIG. 1 is a view showing the structure of a stationary liquid lab-on-a-chip comprising a buffer solution space of the prior art.
  • FIG. 2 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip including an air valve according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing the removal of the air valve in the stationary liquid wrap-on-a-chip including the air valve according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a view of a stationary liquid lab-on-a-chip of the present invention including a washing space prepared in Example 1.
  • FIG. 5 is a view of a stationary liquid lab-on-a-chip of the present invention including a washing space prepared in Example 1.
  • FIG. 6 is a view showing the structure and size of a cover for manufacturing a stationary liquid lab-on-a-chip including a washing space in Example 1.
  • FIG. 6 is a view showing the structure and size of a cover for manufacturing a stationary liquid lab-on-a-chip including a washing space in Example 1.
  • FIG. 7 is a view showing the structure and size of an intermediate body for manufacturing a stationary liquid lab-on-a-chip including a washing space in Example 1.
  • FIG. 7 is a view showing the structure and size of an intermediate body for manufacturing a stationary liquid lab-on-a-chip including a washing space in Example 1.
  • FIG. 8 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip including a valve means according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip including a valve means for opening and closing a channel by rotation according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip including a valve means for opening and closing a channel by sliding according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip of Example 1.
  • FIG. 12 shows that the magnetic particles move from the sample space to the detection space through the cleaning space by separating the solution of each space by the channel and moving the magnet in the stationary liquid lab-on-a-chip including the cleaning space prepared in Example 1 This is a picture that shows how to do it.
  • FIG. 13 is a photograph showing that a plug is installed in a washing space of a stationary liquid lab-on-a-chip including a washing space prepared in Example 1, and an air valve is installed in a channel.
  • Example 14 is a graph showing that the washing efficiency of the particles is increased by the installation of the washing space in Example 2.
  • Example 15 is a graph showing that the air valve in the stationary liquid lab-on-a-chip including the washing space manufactured in Example 3 has an effect of preventing the solution of each space from being mixed.
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the results of measuring shellfish poison by using a stationary liquid lab-on-a-chip containing the washing space prepared in Example 4.
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the results of measuring shellfish poison by using a stationary liquid lab-on-a-chip containing the washing space prepared in Example 4.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of measuring shellfish poison using a stationary liquid lab-on-a-chip containing the washing space prepared in Example 4.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of measuring shellfish poison using a stationary liquid lab-on-a-chip containing the washing space prepared in Example 4.
  • 18 is a graph showing a standard curve of STX concentration as a mean value of absorbance.
  • 19 is a graph showing the concentration of shellfish poison measured by the MBA method and the concentration of shellfish poison measured by the stationary liquid lab-on-a-chip of the present invention.
  • the present invention relates to a stationary liquid lab-on-a-chip, comprising: a sample chamber in which a mixed solution of a reactant including particles and a sample including analyte is contained; A detection chamber in which a detection solution is contained; A washing chamber located between the sample space and the detection space, the washing chamber containing a washing buffer; And a plurality of channels connecting the sample space, the washing space, and the detection space. It includes, characterized in that for detecting the analyte by moving the particles from the sample space to the detection space by using a moving means.
  • the lab-on-a-chip is a chip manufactured to implement various operations such as mixing, reaction, separation, and analysis performed in a laboratory, and the stationary liquid lab-on-a-chip does not move any liquid in the lab-on-a-chip. It does not mean that, unlike the conventional method of moving the liquid phase, it means that the analysis can be performed by moving the solid phase instead of moving the liquid phase in the main analysis step. More detailed description thereof will be provided later.
  • the channel may have a smaller diameter than the sample space, the washing space, and the detection space, and the stationary liquid lab-on-a-chip opens and closes the channel, and prevents mixing of the sample, the detection solution, and the wash buffer solution. Means may be included.
  • the valve means may be an air valve located in at least one of the plurality of channels, the upper surface of the washing space is formed of a flexible material, by applying pressure to the upper surface of the washing space, to remove the air valve can do.
  • a piston is installed on the upper surface of the washing space, by applying pressure to the piston, it is possible to remove the air valve.
  • the valve means may be a gate valve or a globe valve installed in at least one of the plurality of channels, in a particular aspect, the valve means is formed in a disc shape rotatable about a rotation axis, the cleaning A space and a channel are provided in the valve means so as to be isolated from the sample space and the detection space, and the channel can be opened and closed by the rotation of the valve means.
  • valve means is formed in a plate shape to be slidably movable in the vertical direction between the sample space and the detection space, is installed in the valve means so that the washing space and the channel is isolated from the sample space and the detection space, The channel can be opened and closed by sliding movement of the valve means.
  • FIG. 2 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip including an air valve according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a view illustrating the removal of an air valve from a stationary liquid lab-on-a-chip including an air valve according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 7 is a stationary liquid lab-on-a-chip including the washing space in Example 1
  • Figure 8 is a view showing the structure and size of the intermediate body for manufacturing the Figure showing a stationary liquid wrap-on chip including a valve means according to another embodiment of the present invention
  • Figure 9 is another embodiment of the present invention
  • Fig. 10 shows a stationary liquid lab-on-a-chip comprising a valve means for opening and closing a channel by rotation according to the present invention.
  • FIG. 10 is a stationary liquid lab-on-a-rup including a valve means for opening and closing a channel by sliding according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing a chip
  • FIG. 11 is a view showing a stationary liquid lab-on-a-chip of Example 1, and FIG.
  • FIG. 12 is a solution of each space by a channel in a stationary liquid lab-on-a-chip including a washing space prepared in Example 1
  • FIG. 13 is a washing space of the stationary liquid lab-on-a-chip including the washing space prepared in Example 1 Photo showing that the plug is installed in the air valve is installed in the channel
  • Figure 14 is to increase the cleaning efficiency of the particles by the installation of the cleaning space in Example 2
  • 15 is a graph showing that the air valve in the stationary liquid lab-on-a-chip containing the washing space manufactured in Example 3 has an effect of preventing the mixing of the solutions in each space
  • FIGS. 2 to 19 Schematic diagram showing the results of measuring shellfish poison using a stationary liquid lab-on-a-chip containing the prepared washing space
  • Figure 17 is a shellfish poison using a stationary liquid lab-on-a-chip containing the washing space produced in Example 4
  • the photograph showing the measurement result
  • Figure 18 is a graph showing the standard curve of the STX concentration of the average value of the absorbance
  • Figure 19 is the shellfish poison concentration measured by the MBA method
  • the concentration of shellfish poison measured by the stationary liquid lab-on-a-chip of the present invention Is a graph indicating that is proportional to.
  • the static liquid lab-on-a-chip of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 2 to 19.
  • the stationary liquid lab-on-a-chip contains a mixed solution of a reactant including particles 200 and a sample including analytes. It is located between the sample chamber 110 (sample chamber), the detection chamber 120 (detection chamber) containing the detection solution (detection solution), the sample space 110 and the detection chamber 120, washing buffer solution (washing buffer) includes a washing chamber 140 (washing chamber) and a plurality of channels (130) connecting the sample space 110, the washing space 140 and the detection space 120, The analyte is detected by moving the particles 200 from the sample space 110 to the detection space 120 using a moving means.
  • the particle 200 may be a material forming a particle-analyte complex or particle-product complex that is combined with an analyte or a product produced by the analyte.
  • the particle 200 may have a receptor specific for the analyte or a receptor specific for a product generated by the analyte.
  • the particle 200 may serve to move the analyte or a product generated by the analyte from the sample space 110 to the detection space 120, and may serve to attach a label to the analyte. .
  • the particles 200 include silica particles, polystyrene particles, polycarbonate particles, glass particles, alumina particles, gold particles, silver particles, palladium particles, platinum particles, titania particles, zirconium particles, and core-shells. ) At least one selected from the group consisting of particles.
  • the present invention is characterized in that the mixed solution, the washing buffer and the detection solution is contained in a stationary state, the sample space 110, the washing space 140 and the detection space 120 is connected to the channel 130 The other side except the part may be sealed.
  • the suspension of the mixed solution and the detection solution does not mean that the solution does not move at all, but unlike the conventional method of moving the liquid phase, the analysis may be performed by moving the solid phase instead of moving the liquid phase. It means that you can.
  • the solid phase may refer to the particle 200 in the present invention.
  • the washing buffer is a buffer containing components that help remove non-specifically adsorbed substances from the particle 200, such as a detergent or salt at an appropriate concentration.
  • a detergent or salt at an appropriate concentration.
  • the stationary liquid lab-on-a-chip 100 of the present invention includes a washing space 140 between the sample space 110 and the detection space 120, so that the particles 200 pass through the washing space 140. During the wash may be performed.
  • the washing space 140 has a larger volume of the washing buffer for washing the particles 200 compared to the case where only the channel 130 is formed between the sample space 110 and the detection space 120, the washing efficiency may be greatly increased.
  • the volume of the washing buffer filled in the channel 130 having a cross section of 0.5 ⁇ 0.5 mm and a length of 15 mm may be only 3.75 ⁇ l.
  • the volume of the wash buffer solution filled in the washing space 140 having a bottom area of 1 cm 2 and a height of 0.5 cm may be 130 times as 500 ⁇ l. Therefore, the dilution efficiency may be increased by 130 times when the non-specifically adsorbed materials of the particle 200 come off.
  • the washing buffer 140 of the present invention increases the volume of the washing buffer for washing the particles 200, the substances in the sample space and the substances in the detection space 120 are diffused to reach other spaces. Can be slow. In this example, the dilution efficiency can be increased by 130 times, so that the rate of change of concentration due to diffusion can be reduced.
  • the stationary liquid lab-on-a-chip 100 of the present invention may open and close the channel 130, may include a valve means for preventing the mixing of the sample, the detection solution and the wash buffer solution.
  • the valve means may be installed to prevent the solutions contained in the sample space 110, the washing space 140 and the detection space 120 is mixed. That is, the valve means may not be mixed with each other contained in the stationary liquid lab-on-a-chip to facilitate storage in the state containing the solution.
  • the valve means may be an air valve 131 positioned at at least one of the plurality of channels 130.
  • the upper surface 142 of the washing space 140 is formed of a flexible material, by applying pressure to the upper surface 142 of the washing space 140, the air valve 131 ) Can be removed. More specifically, when pressure is applied to the upper surface 142 of the washing space 140, the washing buffer solution in the washing space 140 is pushed to the channel 130 located on both sides, so as to fill the channel 130 In this case, the air valve 131 is pushed out of the channel 130, the air 111 may move to the upper portion of the sample space 110 and the detection space 120.
  • a piston may be installed on the upper surface 142 of the washing space 140, and the air valve 131 may be removed by applying pressure to the piston.
  • valve means is formed of an air valve, as shown in Figures 5 to 7 to install a movable plug 141 on one surface of the washing space 140, the buffer 141 by moving the plug 141 May be pushed out to both channels 130.
  • the stationary liquid wrap-on-a-chip 100 of the present invention includes an air valve 131, it is easy to store the solution in a state, and the air valve 131 can be removed in a simple manner. There is this.
  • the valve means 150 of the present invention may be a gate valve or a globe valve installed at at least one of the plurality of channels 130.
  • the channel 130 may be opened or closed by the gate valve or the globe valve to isolate or connect the sample space 110 and the cleaning space 140 or the detection space 120 and the cleaning space 140.
  • valve means 150 of the present invention may be formed in a disc shape rotatable about a rotation axis.
  • the washing space 140 and the plurality of channels 130 may be installed in the valve means 150 to be isolated from the sample space 110 and the detection space 120, the valve means 150 of By rotating, the channel 130 may be opened and closed.
  • the valve means 150 when the valve means 150 is rotated to be positioned substantially in the same line as the sample space 110, the cleaning space 140, and the detection space 120, the sample space 110 and the washing are performed.
  • the space 140, the detection space 120, and the cleaning space 140 may communicate with each other through the plurality of channels 130.
  • valve means 150 of the present invention may be formed in a plate shape to be slidably movable in the vertical direction between the sample space 110 and the detection space 120.
  • the washing space 140 and the channel 130 are installed in the valve means 150 to be isolated from the sample space 110 and the detection space 120, by the sliding movement of the valve means 150
  • the channel 130 may be opened or closed. Referring to FIG. 10, when the valve means 150 is slidably moved forward, the sample space 110, the washing space 140, and the detection space 120 are positioned substantially in the same line. ) And the washing space 140, the detection space 120 and the washing space 140 are in communication with each other through a plurality of channels 130, and sliding the valve means 150 to the rear, the sample space 110 And the channel 130 and the detection space 120 and the channel 130 may be isolated.
  • the present invention can be used to detect various analytes such as organic substances, proteins, nucleic acids, cells, and the like.
  • the paralytic shellfish (PST) may be detected by the lab-on-a-chip 100 of the present invention.
  • the paralytic shellfish poison is a toxic component caused by the ingestion of marine phytotoxic plankton by bivalve shells, and in most countries such as Korea, the United States, and Europe, paralyzed per 100g of edible part to prevent poisoning by paralytic shellfish poison.
  • the content of adult shellfish poison is regulated to 80 ⁇ g, and the collection of shellfish is prohibited in sea areas where the content of paralytic shellfish poison exceeds 80 ⁇ g.
  • the official method for detecting paralytic shellfish poison is the Mouse Bioassay (MBA) method, in which shellfish extract is injected into the abdominal cavity of several mice and the time to death is measured. Converted to the concentration of (saxitoxin) and expressed as STX equivalent. Specific paralytic shellfish poison detection method will be described later.
  • the lab-on-a-chip 100 was manufactured.
  • the stationary liquid lab-on-a-chip 100 is designed to have a structure as shown in FIG. 5.
  • the wrap-on-a-chip 100 was made of acrylic by dividing the cover 300, the middle body, and the bottom plate, and then attaching three pieces using an adhesive.
  • the cover 300 was fabricated by punching an acrylic plate 1 mm thick as shown in FIG. 6.
  • the intermediate body drills three holes in a pentagonal, rhombic, and rectangular shape on a 5 mm thick acrylic plate to form a sample space 110, a cleaning space 140, and a detection space 120, respectively.
  • a channel 130 was formed by making a groove having a width of 1 mm and a depth of 0.5 mm between the space 110 and the cleaning space 140 and between the cleaning space 140 and the detection space 120.
  • the lower plate was used by cutting a thick acrylic plate to fit the body size.
  • Figure 11 shows the shape after bonding three pieces.
  • the size of the lab-on-a-chip 100 is the same as the cuvette used in the spectrophotometer, so when the color appears by the enzymatic reaction in the detection space 120, the lab-on-a-chip 100 is replaced by a spectrophotometer ( The absorbance of the detection space 120 was measured by directly plugging into a spectrophotometer.
  • the stationary liquid lab-on-a-chip 100 must satisfy two factors: separation of chambers and specific transport. Separation of space means that the different spaces are separated well by the channel 130 so that the solutions should not be mixed with each other, and selective movement means that the magnetic particles are moved when moving the magnetic particles from the sample space 110 to the detection space 120. This means that only the material bound to the particles is selectively moved and the remaining material remains in the sample space 110. To confirm these two elements, magnetic particles and blue dye solution were added to the sample space 110 and shaken for 30 minutes.
  • the buffer solution is filled in the sample space 110 and the detection space 120 as shown in FIG. 13, and the blue dye solution is easily distinguished by eyes in the washing space 140. Filled up.
  • both channels 130 of the washing space 140 were emptied without filling the solution to act as the air valve 131.
  • the air bubble of the channel 130 acts as an air valve 131 is blocked to separate the solution in each space.
  • a plug 141 which can be moved to the upper portion of the washing space 140 by pushing the plug 141 down to push the solution of the washing space 140, the air 111 of the channel 130 is pushed out The channel 130 was made to open.
  • Example 2 cleaning effect of a lab-on-a-chip including a washing space
  • the washing effect of the lab-on-a-chip 100 including the washing space 140 was confirmed. More specifically, the lab-on-a-chip 100 including the washing space 140 and the lab-on-a-chip 100 not including the washing space 140 were prepared.
  • the lab-on-a-chip 100 including the washing space 140 means the lab-on-a-chip 100 of the present invention, and the washing space 140 between the sample space 110 and the detection space 120. It means a lab-on-a-chip 100 comprising a).
  • SA-MP life technologies
  • HRP horseradish peroxidase
  • the washing space 140 was filled with the same solution as the washing buffer solution, and the detection space 120 was filled with TMB (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine, Sigma) solution which is a sample of HRP.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine, Sigma
  • the same as the lab-on-a-chip 100 including the washing space 140 10 ⁇ g of SA-MP and biotin may be used. 10 ⁇ g of HRP enzyme was added together with the washing buffer solution, and the detection space 120 was filled with a TMB solution. Thereafter, the two lab-on-a-chips 100 were shaken for 10 minutes, and the SA-MP was moved from the sample space 110 to the detection space by moving the magnet at a speed of 2 cm / min from the outside of the lab-on-a-chip 100. 120). After reacting for 5 minutes for the enzyme reaction, the 650 nm absorbance of the TMB solution in the detection chamber 120 was measured by a fluorescence spectrophotometer (plate reader).
  • the TMB solution (+ washing chamber) of the lab-on-a-chip 100 having the washing space 140 did not change much compared to the absorbance of the TMB solution (control) which did not react at all, but the washing space
  • the TMB solution (-washing chamber) of the lab-on-a-chip 100 without (140) showed very high absorbance.
  • the HRP not bound to SA-MP not only moved to the detection space 120 by diffusion but also moved to a state in which it was adsorbed nonspecifically to SA-MP. do.
  • HRP-SA-MP was prepared by adding a biotin group-attached horseradish peroxidase (HRP) enzyme to SA-MP (life technologies), which is a streptavidin-fixed magnetic particle.
  • HRP-SA-MP life technologies
  • Two wrap-on-a-chips (100) were prepared and 10 ⁇ g of HRP-SA-MP was added to the sample space 110 together with the wash buffer solution (0.01% Triton X-100, 2.5 mg / ml BSA in PBS).
  • the washing space 140 was filled with the same solution as the washing buffer solution, and the detecting space 120 was filled with TMB (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine, Sigma) solution which is a sample of HRP.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine, Sigma
  • the absorbance photometer was used to measure the 650 nm absorbance of the TMB solution in the detection space 120.
  • the TMB solution (+ air valve) of the lab-on-a-chip 100 in which the air valve 131 is installed is similar to the absorbance of the TMB solution (control) that does not react at all, but the air valve 131
  • the TMB solution (-air valve) of the lab-on-a-chip (100) without the absorbance was found to be a lot of reaction was increased.
  • paralytic shellfish toxin was detected by a competitive immunoassay using the stationary liquid lab-on-a-chip 100 including the washing space 140.
  • Paralytic shellfish poison is composed of various toxins.
  • STX Ab antibody
  • STX saxitoxin
  • G-MB magnetic particle, Pierce, USA
  • protein G was immobilized was used as the solid phase, and the protein G served as a secondary receptor capable of binding to antibodies.
  • STX-HRP using a horseradish peroxidase (HRP) enzyme was used as a labeling standard to compete with toxins contained in the sample.
  • 10 ⁇ STX Ab solution and 10 ⁇ STX-HRP solution were US Beacon Analytical It was purchased from Systems.
  • the detection space 120 was filled with a TMB solution, which is a substrate of HRP, and used as a detection solution.
  • STX Ab is fixed by binding to G-MB, and STX Ab competitively binds STX included in the sample and STX-HRP, a labeling standard.
  • STX-HRP a labeling standard
  • the washing space 140 and the channel 130 were filled with 140 ⁇ l of a washing buffer solution (0.01% Triton X-100, 2.5 mg / ml BSA in PBS), and 10 ⁇ g of G-MB and 10 ⁇ g in the sample space.
  • a washing buffer solution 0.01% Triton X-100, 2.5 mg / ml BSA in PBS
  • 10 ⁇ g of G-MB and 10 ⁇ g in the sample space 5 ⁇ l of ⁇ STX Ab, 5 ⁇ l of 10 ⁇ STX-HRP, 20 ⁇ l of STX sample, 160 ⁇ l of washing buffer solution were added, and 100 ⁇ l of TMB solution was added to the detection chamber 120.
  • the reaction was performed for 30 minutes at 350 rpm in a shaker, and the magnetic particles were moved with vibration from the sample space to the detection space 120 using a magnet moving device.
  • the moving speed was 1.5cm / min, 30 seconds at the first third point of the sample space 110, 1.5cm / min at the end of the sample space 110 for efficient movement, and the washing space 140 10 seconds at the start point, 10 seconds at the end of the cleaning space 140, 10 seconds at the first 1/3 point of the detection space 120 and finally moved the magnet out of the wrap-on-a-chip (100).
  • the mixture was shaken at 350 rpm for 20 minutes and the lab-on-a-chip 100 was directly inserted into a spectrophotometer to measure the absorbance of the detection chamber 120.
  • valve means

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Abstract

본 발명은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber); 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber); 상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며, 상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩에 관한 것이다.

Description

정지 액체상 랩온어칩
본 발명은 입자를 이동수단을 이용하여 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출할 수 있는 정지 액체상 랩온어칩에 관한 것이다.
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 와 같은 면역분석(immunoassay)은 항체를 이용하는 검출 방법으로 질병이나 연구에 널리 사용되고 있다. 예를 들어 샌드위치 ELISA 방법에서는 분석물질의 서로 다른 부위에 결합하는 두 종류의 항체를 사용하는데 그 가운데 한 항체는 면역플레이트(immunoplate) 와 같은 고체상(solid phase)에 고정시켜 포획항체(capture antibody)로 사용하고 다른 항체는 효소와 연결하여 표지화 항체(labelled antibody) 로 사용한다. 포획항체가 있는 고체상에 분석물질을 포함하는 시료를 더하여 반응시키면 분석물질이 항체에 결합한다. 이 상태에서 고체상 표면을 세척 완충용액(washing buffer) 으로 세척하면 분석물질을 제외한 나머지 모든 물질을 제거할 수 있다. 여기에 다시 표지화 항체를 넣어 반응시키고 결합하지 않은 표지화 항체를 세척 완충용액으로 세척하면 고체상에는 분석물질의 양에 비례하여 효소가 결합하게 된다. 따라서, 효소 활성을 측정함으로써 분석물질의 양을 측정할 수 있다.
여기서, 고체상에 항체를 고정시키는 이유는 고체상에 결합하지 않고 액체상(liquid phase) 에 남아있는 물질들을 쉽게 제거할 수 있기 때문이다. 다른 면역 분석법에서는 고체상(solid phase)에 항체와 결합할 수 있는 이차항체나 단백질 G(protein G) 를 고정시켜 사용하기도 하고 항원을 고정시키기도 한다.
고체상으로는 면역플레이트(immunoplate)와 같은 플라스틱 표면이 많이 사용되지만 표면적이 넓은 장점으로 인하여 입자를 사용할 수도 있다. 특히 자성입자(magnetic particle)는 자석을 이용하여 포집하거나 이동시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 불순물이 많이 포함되어 있는 시료에서 분석물질을 분리하는 전처리(pretreatment) 에 많이 이용되고 있다. 예를 들면 분석물질에 대한 항체를 고정시킨 자성입자를 시료에 넣고 반응시키면 분석물질이 자성입자에 고정된 항체에 결합하게 된다. 자력을 튜브 벽에 가하면 자성입자는 모두 튜브 벽에 달라붙게 되고 나머지 용액을 제거함으로써 불순물을 모두 제거할 수 있다.
그러나 종래의 면역분석법을 자동화하기 위해서는 액체를 이동시켜야하기 때문에 펌프가 필요하고, 장치 내에 세척 완충용액이 담긴 통과 액체의 이동을 위한 튜브들이 필요하며, 또한 면역플레이트나 액체 주입장치를 이동시키는 이송장치가 필요하기 때문에 장치가 크고 복잡해지는 문제점이 발생되었다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해 정지 액체상에서 고체상인 입자를 이동시킴으로써 면역분석법을 시행하는 기술(등록특허 제10-1398764호)이 제안된 바 있다. 상기 기술은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample) 의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber), 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber) 그리고 시료공간과 검출공간 사이에 위치하여 상기 혼합용액과 검출용액이 섞이는 것을 방지하는 채널(channel) 을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(stationary liquid phase lab-on-a-chip, SLP LOC)에서 입자를 시료공간에서 검출공간으로 이동시킴으로써 분석물질을 검출할 수 있는 기술이 개시되어 있다.
특히, 도 1에 도시된 바와 같이, 종래기술의 랩온어칩은 고정 커버를 이용하여 세척 완충용액 공간 마개(132)를 이동시킴으로써, 세척 완충용액을 채널로 주입하여, 채널에서 세척과정이 이루어지는 방법을 이용해왔다. 그러나, 상기와 같은 기술은 입자의 세척과정이 채널(130)을 통과하는 동안에만 일어나기 때문에 충분히 세척되지 않을 수 있으며, 입자가 충분히 세척되지 않는 상태에서는 분석물질이 없는 시료를 측정하였을 때의 기준값이 높아져 낮은 농도의 분석물질이 포함된 시료와 차이를 구별하기 어렵게 되는 문제점이 있다. 즉, 최저검출한계(lower limit of detection)가 높아지는 문제점이 발생하는 것이다.
본 발명은 분석물질의 검출시 세척효율을 높일 수 있는 정지액체상 랩온어칩을 제공하고자 한다.
본 발명은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber); 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber); 상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며, 상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 정지액체상 랩온어칩은 세척공간을 추가로 포함함으로써, 분석물질의 검출시 세척효율을 높일 수 있다.
도 1은 종래기술의 완충용액 공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브를 제거하는 것을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 본 발명의 정지액체상 랩온어칩의 도면이다.
도 6은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 커버의 구조와 크기를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 중간 몸체의 구조와 크기를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 회전에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬라이딩에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 11은 실시예 1의 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 12는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 채널에 의해 각 공간의 용액이 분리되는 것과 자석의 이동에 의해 자성입자가 시료공간에서 세척공간을 거쳐 검출공간으로 이동하는 것을 보여주는 사진이다.
도 13은 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 세척공간에 플러그가 설치된 것과 채널에 공기밸브가 설치된 것을 보여주는 사진이다.
도 14는 실시예 2에서 세척공간의 설치에 의해 입자의 세척 효율이 증가하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 15는 실시예 3에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브가 각 공간의 용액이 혼합되지 않도록 하는 효과가 있음을 보여주는 그래프이다.
도 16은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타내는 모식도이다.
도 17은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 흡광도의 평균값을 STX 농도의 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 19는 MBA 방법으로 평가한 패류독 농도와 본 발명의 정지액체상 랩온어칩으로 측정한 패류독의 농도가 비례함을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 정지액체상 랩온어칩에 관한 것으로, 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber); 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber); 상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며, 상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 랩온어칩이라 함은 실험실에서 행해지는 혼합, 반응, 분리, 분석 등의 여러 가지 조작이 구현되도록 제작된 칩으로, 정지 액체상 랩온어칩은 랩온어칩 내에서 액체가 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라, 액체상을 이동시키는 종래의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미하는 것이다. 이와 관련하여 보다 상세한 설명은 후술하도록 한다.
이에 더하여, 상기 채널은 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간보다 직경이 작을 수 있으며, 상기 정지액체상 랩온어칩은 상기 채널을 개폐하며, 상기 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하는 밸브수단을 포함할 수 있다.
이때, 상기 밸브수단은 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브일 수 있으며, 상기 세척공간의 상면은 플렉서블한 재질로 형성되며, 상기 세척공간의 상면에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거할 수 있다. 또는 상기 세척공간의 상면에 피스톤이 설치되며, 상기 피스톤에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거할 수 있다.
하나에 양태로서, 상기 밸브수단은 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 설치되는 게이트 밸브 또는 글로브 밸브일 수 있으며, 특정 양태로서, 상기 밸브수단은 회전축을 중심으로 회전가능한 원판형으로 형성되며, 상기 세척공간과 채널이 상기 시료공간 및 검출공간과 격리되도록 상기 밸브수단내에 설치되어, 상기 밸브수단의 회전에 의해서, 상기 채널을 개폐할 수 있다.
이 외에도, 상기 밸브수단은 상기 시료공간과 검출공간의 사이에서 수직방향으로 슬라이딩 이동가능하게 판상으로 형성되며, 상기 세척공간과 채널이 상기 시료공간 및 검출공간과 격리되도록 상기 밸브수단에 설치되어, 상기 밸브수단의 슬라이딩 이동에 의해서, 상기 채널을 개폐할 수 있다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 공기밸브를 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브를 제거하는 것을 나타내는 도면, 도 5는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 본 발명의 정지액체상 랩온어칩의 도면, 도 6은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 커버의 구조와 크기를 나타낸 도면, 도 7은 실시예 1에서 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 제작하기 위한 중간 몸체의 구조와 크기를 나타낸 도면, 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 회전에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 슬라이딩에 의해 채널을 개폐하는 밸브수단을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 11은 실시예 1의 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 12는 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 채널에 의해 각 공간의 용액이 분리되는 것과 자석의 이동에 의해 자성입자가 시료공간에서 세척공간을 거쳐 검출공간으로 이동하는 것을 보여주는 사진, 도 13은 실시예 1에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩의 세척공간에 플러그가 설치된 것과 채널에 공기밸브가 설치된 것을 보여주는 사진, 도 14는 실시예 2에서 세척공간의 설치에 의해 입자의 세척 효율이 증가하는 것을 보여주는 그래프, 도 15는 실시예 3에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩에서 공기밸브가 각 공간의 용액이 혼합되지 않도록 하는 효과가 있음을 보여주는 그래프, 도 16은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타내는 모식도, 도 17은 실시예 4에서 제작한 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 패류독을 측정한 결과를 나타낸 사진, 도 18은 흡광도의 평균값을 STX 농도의 표준곡선을 나타낸 그래프, 도 19는 MBA 방법으로 평가한 패류독 농도와 본 발명의 정지액체상 랩온어칩으로 측정한 패류독의 농도가 비례함을 나타내는 그래프이다. 이하, 도 2 내지 도 19와 실시예를 통해 본 발명인 정지액체상 랩온어칩을 상세히 설명한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 정지액체상 랩온어칩은 입자(200)(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(110)(sample chamber), 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(120)(detection chamber), 상기 시료공간(110) 및 검출공간(120) 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(140)(washing chamber) 및 상기 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)을 연결하는 복수의 채널(130)(channel)을 포함하며, 상기 입자(200)를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 입자(200)라 함은 분석물질 또는 분석물질에 의해 생성되는 생성물(product)과 결합되는 입자-분석물질 복합체 또는 입자-생성물 복합체를 형성하는 물질일 수 있다. 이를 위하여 입자(200)에는 분석물질에 특이적인 수용체(receptor)나 분석물질에 의해 생성되는 생성물에 특이적인 수용체가 고정되어 있을 수 있다. 특히, 상기 입자(200)는 분석물질 또는 분석물질에 의해 생성되는 생성물을 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시키는 역할을 할 수 있고, 분석물질에 표지를 붙이는 역할을 할 수도 있다.
이에 더하여, 상기 입자(200)는 실리카 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리카보네이트 입자, 유리 입자, 알루미나 입자, 금 입자, 은 입자, 팔라듐 입자, 백금 입자, 티타니아 입자, 지르코늄 입자 및 코어-쉘(core-shell) 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
특히, 본 발명은 혼합용액, 세척 완충용액 및 검출용액이 정지 상태로 담겨지는 것을 특징으로 하며, 상기 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)은 채널(130)과 연결된 부분을 제외한 다른면이 밀폐될 수 있다.
여기서, 혼합용액과 검출용액이 정지되어 있다는 것은 용액이 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라 액체상을 이동시키는 기존의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미하는 것이다. 상기 고체상이라 함은 본 발명에서 입자(200)를 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 세척 완충용액(washing buffer)이라 함은 적절한 농도의 세제(detergent) 또는 염(salt)과 같이 비특이적으로 흡착된 물질들을 입자(200)로부터 제거하는데 도움이 되는 성분들을 포함하는 완충용액을 의미한다.
특정양태로서, 본 발명의 정지액체상 랩온어칩(100)은 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 세척공간(140)을 포함함으로써, 입자(200)가 세척공간(140)을 지나는 동안 세척이 이루어지도록할 수 있다.
이러한 세척공간(140)은 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 채널(130)만 형성되어 있을 때에 비해 입자(200)를 세척하는 세척 완충용액의 부피가 커지기 때문에 세척효율이 크게 높아질 수 있다. 일 예로 단면이 0.5×0.5mm 이고, 길이가 15mm 인 채널(130)에 채워져 있는 세척 완충용액의 부피는 3.75㎕에 불과할 수 있다. 그러나, 밑면적이 1cm2 이고, 높이가 0.5cm 인 세척공간(140)에 채워지는 세척 완충용액의 부피는 500㎕로 130배가 될 수 있다. 따라서, 입자(200)의 비특이적으로 흡착되어 있던 물질들이 떨어져 나올 때 희석효율이 130배가 증가될 수 있다.
이에 더하여, 본 발명의 세척공간(140)으로 인하여 입자(200)를 세척하는 세척 완충용액의 부피가 커지기 때문에 시료 공간에 있는 물질들과 검출공간(120)에 있는 물질들이 확산되어 다른 공간에 도달하는 속도가 느려질 수 있다. 상기 예에서 희석 효율이 130배 증가될 수 있어, 확산에 의한 농도 변화 속도가 감소될 수 있다.
한편, 본 발명의 정지액체상 랩온어칩(100)은 채널(130)을 개폐하며, 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하는 밸브수단을 포함할 수 있다. 이러한 밸브수단은 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120) 내에 담긴 용액들이 섞이는 것을 방지하기 위하여 설치될 수 있다. 즉, 상기 밸브수단은 정지액체상 랩온어칩에 포함된 용액이 서로 혼합되지 않아 용액이 담긴 상태로 보관을 용이하게 할 수 있다.
도 3에 도시된 바에 따르면, 상기 밸브수단은 복수의 채널(130) 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브(131)일 수 있다.
특히, 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 세척공간(140)의 상면(142)은 플렉서블한 재질로 형성되어, 상기 세척공간(140)의 상면(142)에 압력을 가하여, 상기 공기밸브(131)를 제거할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세척공간(140)의 상면(142)에 압력을 가하면, 세척공간(140) 내부의 세척 완충용액이 양쪽에 위치하는 채널(130)로 밀려나가면서, 채널(130)을 채우도록 할 수 있으며, 이때, 공기밸브(131)가 채널(130)에서부터 밀려나가 공기(111)가 시료공간(110)과 검출공간(120)의 상부로 이동할 수 있다.
다른 양태로서, 상기 세척공간(140)의 상면(142)에 피스톤이 설치될 수 있으며, 상기 피스톤에 압력을 가하여, 상술한 바와 같이, 공기밸브(131)를 제거할 수 있다.
이 외에도, 밸브수단이 공기밸브로 형성되는 경우, 도 5 내지 도 7에 나타낸 것과 같이 세척공간(140)의 일 면에 이동 가능한 플러그(141)를 설치하여, 플러그(141)를 이동시킴으로써 완충용액을 양 채널(130)로 밀어내도록할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 정지 액체상 랩온어칩(100)이 공기밸브(131)를 포함함으로써, 용액을 담은 상태에서 보관이 용이하며, 간단한 방법으로 공기밸브(131)를 제거할 수 있는 이점이 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 밸브수단(150)은 복수의 채널(130) 중 적어도 한 곳에 설치되는 게이트 밸브 또는 글로브 밸브일 수 있다. 이와 같은 게이트 밸브 또는 글로브 밸브로 채널(130)을 개폐하여, 시료공간(110)과 세척공간(140) 또는 검출공간(120)과 세척공간(140)을 격리시키거나 연결시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 밸브수단(150)은 도 9에 도시된 바와 같이, 회전축을 중심으로 회전가능한 원판형으로 형성될 수 있다.
이때, 상기 세척공간(140)과 복수의 채널(130)이 상기 시료공간(110) 및 검출공간(120)과 격리되도록 상기 밸브수단(150)내에 설치될 수 있으며, 상기 밸브수단(150)의 회전에 의해서, 상기 채널(130)을 개폐할 수 있다. 도 9를 참조하면, 상기 밸브수단(150)을 회전하여, 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)으로 실질적으로 동일선상에 위치하도록 하면, 시료공간(110)과 세척공간(140), 검출공간(120)과 세척공간(140)이 복수의 채널(130)을 통해서 서로 연통될 수 있다.
또한, 본 발명의 밸브수단(150)은 도 10에 도시된 바와 같이, 상기 시료공간(110)과 검출공간(120)의 사이에서 수직방향으로 슬라이딩 이동가능하게 판상으로 형성될 수 있다.
이때, 상기 세척공간(140)과 채널(130)이 상기 시료공간(110) 및 검출공간(120)과 격리되도록 상기 밸브수단(150)에 설치되어, 상기 밸브수단(150)의 슬라이딩 이동에 의해서, 상기 채널(130)을 개폐할 수 있다. 도 10을 참조하면, 상기 밸브수단(150)을 전방으로 슬라이딩 이동하여, 시료공간(110), 세척공간(140) 및 검출공간(120)이 실질적으로 동일선상에 위치하도록 하면, 시료공간(110)과 세척공간(140), 검출공간(120)과 세척공간(140)이 복수의 채널(130)을 통해서 서로 연통되며, 상기 밸브수단(150)을 후방으로 슬라이딩 이동하면, 시료공간(110)과 채널(130) 그리고 검출공간(120)과 채널(130)을 격리시킬 수 있다.
이와 같은 본 발명은 유기물질, 단백질, 핵산, 세포 등 다양한 분석물질을 검출하는데 이용될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 랩온어칩(100)으로 마비성 패류독(paralytic shellfish, PST)을 검출할 수 있다.
여기서, 마비성 패류독이라 함은 해양 식물성 유독 플랑크톤을 이매패류가 섭취하여 생기는 독성분으로, 우리나라를 비롯하여 미국과 유럽 등 대부분의 나라에서는 마비성 패류독에 의한 중독을 방지하기 위해 가식부 100g 당 마비성 패류독의 함량을 80㎍으로 규제하고 있으며, 마비성 패류독의 함량이 80㎍ 이상이 되는 해역에서는 패류의 채취를 금하고 있다. 마비성 패류독을 검출하는 공인 방법으로는 Mouse Bioassay(MBA) 방법이 있는데, 이 방법에서는 여러 마리 마우스의 복강에 조개 추출액을 주사하여 사망에 이르는 시간을 측정함으로써 마비성 패류독 가운데 주요성분인 STX(saxitoxin) 의 농도로 환산하여 STX equivalent로 나타낸다. 구체적인 마비성 패류독 검출방법은 후술하도록 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
실시예 1. 정지 액체상 랩온어칩의 제조
본 실시예에서는 세척공간(140)을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(100)을 효율을 확인하기 위하여, 랩온어칩(100)을 제조하였다.
본 실시예에서 정지액체상 랩온어칩(100)은 도 5와 같은 구조를 갖도록 설계하였다. 이 랩온어칩(100)은 커버(300), 중간 몸체, 바닥 판으로 나누어 아크릴로 제작한 후 접착제를 이용하여 세 조각을 붙여 제작하였다. 커버(300)는 도 6에 도시된 것처럼 두께 1 mm의 아크릴 판에 구멍을 뚫어 제작하였다. 중간 몸체는 도 7에 도시된 것처럼 두께 5 mm 아크릴 판에 오각형, 마름모꼴, 직사각형 모양으로 세 개의 구멍을 뚫어 각각 시료공간(110), 세척공간(140), 검출공간(120)을 형성하도록 하고 시료공간(110)과 세척공간(140) 사이 그리고 세척공간(140)과 검출공간(120) 사이에 폭 1 mm 깊이 0.5 mm의 홈을 만들어 채널(130)을 형성하도록 하였다. 아래 판은 두께 아크릴 판을 몸체 크기에 맞춰 절단하여 사용하였다. 도 11은 세 조각을 접착시킨 후의 형태를 나타낸 것이다. 특히 랩온어칩(100)의 크기를 분광 광도계(spectrophotometer)에서 사용하는 큐벳(cuvette)과 동일하게 함으로써 검출공간(120)에서 효소반응에 의해 색깔이 나타날 경우 랩온어칩(100)을 분광 광도계(spectrophotometer)에 직접 꽂아 검출공간(120)의 흡광도를 측정할 수 있도록 하였다.
정지액체상 랩온어칩(100)은 공간의 분리(separation of chambers)와 선택적 이동(specific transport)이라는 두 가지 요소를 충족시켜야 한다. 공간의 분리라는 것은 서로 다른 공간이 채널(130)에 의해 잘 분리되어 용액이 서로 혼합되지 않아야 한다는 것이고, 선택적 이동이라는 것은 자성입자를 시료공간(110)에서 검출공간(120)으로 이동시킬 때 자성입자에 결합한 물질만 선택적으로 이동하고 나머지 물질은 시료공간(110)에 그대로 남아있는 것을 의미한다. 이 두 가지 요소를 확인하기 위해 시료공간(110)에 자성입자와 파란색 염료 용액을 넣고 30분 흔들어 섞어주었다.
도 12의 맨 위에 있는 흔들기 전 사진을 보면 자성입자의 갈색과 염료의 파란색이 분리되어 있지만 흔들어준 후에는 두 번째 사진에서와 같이 혼합되어 있는 것을 볼 수 있다. 그러나 채널(130)이나 다른 공간에는 아무 색도 관찰되지 않아 채널(130)에 의해 각 공간의 내용물이 잘 분리되어 있는 것을 알 수 있다. 다음으로 랩온어칩(100)의 밑에서 자석을 시료공간(110)으로부터 검출공간(120)으로 이동시킨 결과 자성입자만 이동하고 자성입자에 결합하지 않는 염료는 시료공간(110)에 그대로 남아있는 것을 볼 수 있다.
다음으로 공기밸브(131)가 형성되는 것을 확인하기 위해 도 13에서와 같이 시료공간(110)과 검출공간(120)에는 완충용액을 채우고 세척공간(140)에는 눈으로 구별이 용이한 파란색 염료 용액을 채웠다. 그리고 세척공간(140) 양쪽 채널(130)에는 용액을 채우지 않고 비워놓음으로써 공기밸브(131)로 작용하도록 하였다. 도 10의 아래 사진을 보면 채널(130)의 공기방울이 공기밸브(131)로 작용하여 각 공간의 용액이 분리되도록 차단하고 있는 것을 확인할 수 있다. 그리고 세척공간(140)의 상부에 상하이동이 가능한 플러그(141)를 설치하여 이 플러그(141)를 아래로 밀어 세척공간(140)의 용액을 밀어내면 채널(130)의 공기(111)가 밀려나며 채널(130)이 열리도록 제작하였다.
실시예 2. 세척공간을 포함하는 랩온어칩의 세척효과
본 실시예에서는 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)의 세척효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)과 세척공간(140)을 포함하지 않는 랩온어칩(100)을 준비하였다. 여기서, 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)이라 함은 본 발명의 랩온어칩(100)을 의미하는 것으로, 시료공간(110)과 검출공간(120) 사이에 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)을 의미한다.
먼저, 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)의 시료공간(110)에 스트렙트아비딘이 고정되어 있는 자성입자인 SA-MP(life technologies) 10㎍ 와 비오틴기가 없는 HRP(horseradish peroxidase) 효소 10㎍을 세척완충용액(0.01% Triton X-100, 2.5mg/ml BSA in PBS)과 함께 넣어주었다. 여기서, 비오틴기가 없는 HRP는 SA-MP 에 결합하지 않는 효소를 의미한다.
그리고, 세척공간(140)에는 상기 세척완충용액과 동일한 용액으로 채우고, 검출공간(120)은 HRP의 시료인 TMB(3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine, Sigma) 용액으로 채웠다. 또한, 본 실시예에서는 세척공간(140)의 세척효과를 확인하기 위한 것으로, 채널(130)에 형성된 공기밸브(131)는 제거하였다.
또한, 세척공간(140)을 포함하지 않는 랩온어칩(100)의 시료공간(110)에도 상기 세척공간(140)을 포함하는 랩온어칩(100)과 동일하게 SA-MP 10㎍과 비오틴이 없는 HRP 효소 10㎍을 세척완충용액과 함께 넣어주고, 검출공간(120)에는 TMB 용액을 채워주었다. 그 후에, 두 개의 랩온어칩(100)을 10분간 흔들어주었고, 상기 랩온어칩(100)의 외부에서 2cm/min 의 속도로 자석을 이동시킴으로써 SA-MP 를 시료공간(110)으로부터 검출공간(120)으로 이동시켰다. 그리고, 효소반응을 위해 5분간 반응시킨 후 검출공간(120)의 TMB 용액의 650nm 흡광도를 형광분광광도계(plate reader) 로 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타나는 것처럼, 세척공간(140)이 있는 랩온어칩(100)의 TMB 용액(+ washing chamber)은 전혀 반응하지 않은 TMB 용액(control)의 흡광도에 비해 큰 변화가 없었지만 세척공간(140)이 없는 랩온어칩(100)의 TMB 용액(- washing chamber)은 매우 높은 흡광도를 보여주었다. 세척공간(140)이 없는 랩온어칩(100)에서는 SA-MP 에 결합하지 않은 HRP 가 확산에 의해 검출공간(120)으로 이동했을 뿐만 아니라 SA-MP에 비특이적으로 흡착된 상태로 이동해갔을 것으로 판단된다.
반면에, 세척공간(140)이 있는 랩온어칩(100)에서는 상술한 바와 같이, 세척효율의 증가와 확산에 의한 농도변화의 속도 감소로 인하여 SA-MP 에 결합하지 않은 HRP 가 검출공간(120)으로 거의 이동하지 않은것으로 판단된다.
실시예 3. 공개밸브의 유무에 따른 채널의 차단효과
본 실시예에서는 공기밸브(131)가 각 공간의 용액을 효과적으로 차단할 수 있는지 확인하였다.
먼저, 스트렙트아비딘이 고정되어 있는 자성입자인 SA-MP(life technologies)에 비오틴기가 부착된 HRP(horseradish peroxidase)효소를 더하여 결합시킴으로써 HRP-SA-MP 를 만들었다. 두 개의 랩온어칩(100)을 준비하여 HRP-SA-MP 10㎍을 세척완충용액(0.01% Triton X-100, 2.5mg/ml BSA in PBS)과 함께 시료공간(110)에 넣어주었다.
세척공간(140)은 상기 세척완충용액과 동일한 용액으로 채우고, 검출공간(120)은 HRP 의 시료인 TMB(3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine, Sigma) 용액으로 채웠다. 두개의 랩온어칩(100) 중 하나는 각 채널(130)에 공기밸브(131)를 설치하고, 다른 하나는 채널(130)을 세척완충용액으로 채워 공기밸브(131)를 설치하지 않았다.
공기밸브(131)를 설치한 랩온어칩(100)과 설치하지 않은 랩온어칩(100)을 30분간 심하게 진동을 가하고 30분간 더 놓아둔 후 검출공간(120) TMB 용액의 650nm 흡광도를 흡광광도계로 측정하였다. 그 결과 도 15에 나타난 바와 같이 공기밸브(131)를 설치한 랩온어칩(100)의 TMB 용액(+air valve) 은 전혀 반응하지 않은 TMB 용액(control) 의 흡광도와 유사하게 나왔지만 공기밸브(131)가 없는 랩온어칩(100)의 TMB 용액(-air valve) 은 흡광도가 높아져 반응이 많이 일어났음을 알 수 있었다. 이는 공기밸브(131)가 없는 랩온어칩(100)에서는 진동에 의해 HRP-SA-MP 입자가 검출공간(120)으로 이동하였지만, 공기밸브(131)가 있는 랩온어칩(100)에서는 이동하지 않았음을 보여준다. 따라서, 랩온어칩(100)을 보관하는 동안 각 공간의 용액이 혼합되는 것을 방지하는데 공기밸브(131)가 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 세척공간을 포함하는 정지액체상 랩온어칩을 이용한 마비성 패류독 검출
본 실시예에서는 세척공간(140)을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(100)을 이용하여 경쟁적인 면역분석법에 의해 마비성 패류독(paralytic shellfish toxin, PST) 을 검출하였다.
마비성 패류독(PST)은 여러가지 독소로 구성되어 있는데, 본 실시예에서는 마비성 패류독에서 가장 중요한 독소인 STX(saxitoxin)에 대한 STX Ab(항체)를 일차 수용체로 사용하였다. 또한, 고체상으로는 protein G 를 고정시킨 G-MB(자성입자, 미국 Pierce) 를 사용하였으며, 상기 protein G 는 항체와 결합할 수 있는 이차 수용체로 작용하였다.
또한, 시료에 포함된 독소와 경쟁반응을 하게되는 표지화 표준물질로는 HRP(horseradish peroxidase) 효소를 연결시킨 STX-HRP 를 이용하였으며, 10×STX Ab 용액과 10×STX-HRP 용액은 미국 Beacon Analytical Systems 에서 구입하여 사용하였다. 그리고, 검출공간(120)에는 HRP의 기질인 TMB 용액을 채워 검출용액으로 사용하였다.
STX Ab 는 G-MB 에 결합하여 고정되고 STX Ab 에는 시료에 포함된 STX와 표지화 표준물질인 STX-HRP 가 경쟁적으로 결합한다. 이 상태에서 자석을 이용하여 G-MB 를 시료공간(110)으로부터 검출공간(120)으로 이동시키면 G-MB 에 결합한 STX-Ab, 그리고 STX Ab 에 결합한 STX 및 STX-HRP 만 이동하게 된다. 시료의 STX의 농도가 높을수록 더 작은 양의 STX-HRP 가 G-MB 에 결합하기 때문에 검출공간(120)으로 이동하는 HRP의 효소 활성은 낮아진다.
본 실시예에서 세척공간(140)과 채널(130)에는 세척완충용액(0.01% Triton X-100, 2.5 mg/ml BSA in PBS) 140㎕로 채워주었으며, 시료 공간에는 G-MB 10㎍, 10×STX Ab 5㎕, 10×STX-HRP 5㎕, STX 시료 20㎕, 세척완충용액 160㎕를 더하고, 검출공간(120)에는 TMB 용액 100㎕ 를 더해주었다.
그 후에 셰이커(shaker)에서 350rpm 으로 30분간 결합 반응을 해주고 자석 이동장치를 사용하여 자성입자를 시료 공간에서 검출공간(120)으로 진동을 가하며 이동시켰다. 이때의 이동속도는 1.5cm/min 이었으며, 효율적인 이동을 위해 시료공간(110)의 처음 1/3 지점에서 30초, 시료공간(110)이 끝나는 지점에서 1.5cm/min 이었으며, 세척공간(140)이 시작하는 지점에서 10초, 세척공간(140)이 끝나는 지점에서 10초, 검출공간(120)의 처음 1/3 지점에서 10초간 멈추고 마지막으로 자석을 랩온어칩(100) 밖으로 이동시켰다. 그리고 효소 반응을 위해 다시 350rpm 으로 20분간 혼합(shaking) 하고 랩온어칩(100)을 분광광도계(spectrophotometer) 에 직접 꽂아 검출공간(120)의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 시료의 STX 농도가 높아질수록 G-MB 에 결합하는 STX-HRP 의 양이 감소하여 검출공간(120)의 흡광도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이 실험을 반복하여 흡광도의 평균값을 STX 농도에 대해 그래프로 나타낸 결과 도 18과 같은 표준곡선을 얻을 수 있었다. 그리고 여러 개의 조개 시료를 추출한 후 MBA 방법으로 패류독 농도를 평가하고 동시에 정지액체상 랩온어칩(100)으로도 측정하였다. 그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 서로 비례하는 결과로 나타나 정지액체상 랩온어칩(100)이 면역분석에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
[부호의 설명]
100: 랩온어칩 110: 시료공간
111: 공기 120: 검출공간
130: 채널 131: 공기밸브
132: 마개 140: 세척공간
141: 플러그 142: 세척공간의 상면
150: 밸브수단
200: 입자 300: 커버

Claims (9)

  1. 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(sample chamber);
    검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(detection chamber);
    상기 시료공간 및 검출공간 사이에 위치하며, 세척 완충용액(washing buffer) 이 담겨지는 세척공간(washing chamber); 및
    상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간을 연결하는 복수의 채널(channel); 을 포함하며,
    상기 입자를 이동수단을 이용하여 상기 시료공간에서 검출공간으로 이동시켜 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 채널은 상기 시료공간, 세척공간 및 검출공간보다 직경이 작은 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 정지액체상 랩온어칩은
    상기 채널을 개폐하며, 상기 시료, 검출용액 및 세척 완충용액의 혼합을 방지하는 밸브수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 밸브수단은 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 위치하는 공기밸브인 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 세척공간의 상면은 플렉서블한 재질로 형성되며,
    상기 세척공간의 상면에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 세척공간의 상면에 피스톤이 설치되며,
    상기 피스톤에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 밸브수단은 상기 복수의 채널 중 적어도 한 곳에 설치되는 게이트 밸브 또는 글로브 밸브인 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 밸브수단은 회전축을 중심으로 회전가능한 원판형으로 형성되며,
    상기 세척공간과 채널이 상기 시료공간 및 검출공간과 격리되도록 상기 밸브수단내에 설치되어,
    상기 밸브수단의 회전에 의해서, 상기 채널을 개폐하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 밸브수단은 상기 시료공간과 검출공간의 사이에서 수직방향으로 슬라이딩 이동가능하게 판상으로 형성되며,
    상기 세척공간과 채널이 상기 시료공간 및 검출공간과 격리되도록 상기 밸브수단에 설치되어,
    상기 밸브수단의 슬라이딩 이동에 의해서, 상기 채널을 개폐하는 것을 특징으로 하는 정지액체상 랩온어칩.
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