CN102680621A - 一种化学发光检测技术及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学发光检测技术及其用途，所述的化学发光检测技术是由层析柱、捕获相、待检物样品、检测相和检测器组成，可用于多种分析检测技术产品的开发，具有良好的适用价值和市场前景。

Description

一种化学发光检测技术及其用途

技术领域

本发明涉及一种化学发光检测技术及其用途。

背景技术

柱层析技术是利用层析柱对生物分子进行分离和检测的技术，其中层析柱是其常用的主体结构。层析技术按层析的机理分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、疏水层析等。吸附层析是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析是利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析是利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，使之分离。凝胶层析是利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同，使之分离。亲和层析是在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质，常见的亲和对有酶和抑制剂、抗原和抗体、配体和受体等。柱层析技术是一中分离效率很高的分析分离手段与方法，它能够将各种性质极极其类似的物质分离开，它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。目前这种技术已广泛应用于科学研究与工业生产的多个领域，在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。化学发光分析技术是一种高灵敏的微量及痕量分析技术，具有操作方便、灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，广泛地应用于环境、临床、药物分析、食品和工业分析中。近年来，随着新发光试剂的合成、新体系的开发、与其它技术的联用，尤其是流动注射技术、传感器技术、高效液相色谱技术、毛细管电泳技术、免疫分析技术及各种固定化试剂技术的联用，更显示出化学发光分析快速、灵敏、简便等优点，也进一步拓宽了化学发光的应用范围。化学发光分析根据发光体系应用方式的不同可分为：直接标记发光物质分析法、酶催化化学发光分析法和电化学发光分析法。直接标记发光物质分析法是用化学发光剂直接标记待检物特异性结合物，如抗原、抗体、配体等，使之与待检物特异结合，进行待检物的定量分析。酶催化化学发光分析法是以酶标记待检物特异性结合物，形成待检物和酶的复合物，然后以酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前所用的化学发光检测反应体系均是将待检物与标记复合物在反应室内进行混合反应，形成待检物-标记复合物，单一步骤的反应时间要在7-8分钟或更长。如是多步骤反应，则所需时间会更长。同时对反复使用的反应室的清洗、混合、震荡、分离也明显提高了检测反应的复杂性。柱层析技术的吸附效率明显高于混合反应的吸附效率，吸附反应时间短、且操作简单、使用成本低廉，因此，开发一种采用柱层析分析技术进行的化学发光检测技术，使得吸附分离反应在层析柱内进行，不仅使用方便、减少浪费，同时也可显著提高工作效率，在检测和分析、分离的诸多领域具有重要的实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种化学发光检测技术及其用途，特别是以柱层析结构作为化学发光检测吸附分离反应载体的化学发光检测技术。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案。

一种化学发光检测技术，以柱层析结构作为化学发光检测中的吸附分离反应的载体，由层析柱、捕获相、待检物样品、检测相和检测器组成。所述的化学发光检测技术，具有如下特征：1）用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相，该步反应所述的待检物特异性结合物也称为能与待检物特异性结合的第一物质，如第一抗体；2）捕获相装载于层析柱内使用；3）检测相是由直接或间接化学发光指示剂标记待检物特异性结合物而制成，该步反应所述的待检物特异性结合物也称为能与待检物特异性结合的第二物质，如第二抗体，与第一物质具有相互配对反应的特性；4）用检测器检测被捕获的检测相的发光量进而计算待检物的含量和/或用检测器检测未被捕获而流出层析柱的检测相的发光量进而计算待检物的含量。待检物特异性结合物常用的有酶和抑制剂、抗原和抗体、配体和受体等。常用的捕获载体有凝胶颗粒和磁微粒，凝胶颗粒有葡聚糖凝胶系列的凝胶过滤填料和琼脂糖凝胶系列的凝胶过滤填料、葡聚糖凝胶系列的离子交换填料和琼脂糖凝胶系列的离子交换填料、疏水层析填料、亲和层析填料、纤维素类填料等，其中亲和层析填料在本发明技术中最为常用，有溴化氰活化琼脂糖凝胶介质（CNBr Sepharose FF）、NHS活化琼脂糖凝胶介质等。

所述的层析柱的结构包括下列一种或一种以上的特性：1）刚性管道结构；2）非刚性管道结构；3）芯片结构包括微流控芯片结构和普通芯片结构；4）为预装柱；5）为使用前装载的柱状结构；6）为加有开关控制装置的管道结构；7）为出样端过滤截留出口易于被去除而使柱内固相填料易于移离柱层析结构进行下一级分析的柱状结构。刚性管道结构常见为实验室常用的两端接有接口或不接有接口的玻璃、有机玻璃、不锈钢等材质的层析柱，也包括为某些分析特制的硬质材料的柱状结构。非刚性管道结构多指塑料、橡胶、硅胶等材料制成的可以随意圈曲的管道结构，两端接有接口或不接有接口。微流控芯片是微流控技术实现的主要平台，其装置特征主要是其容纳流体的有效结构（通道、反应室和其它某些功能部件）至少在一个纬度上为微米级尺度，由于微米级的结构，流体在其中显示和产生了与宏观尺度不同的特殊性能，因此发展出独特的分析产生的性能。本发明技术所采用的芯片结构也包括毫米级的液体流动芯片装置。本发明技术所采用的层析柱包括预装柱和使用前进行装载的层析柱，考虑使用的方便程度预装柱将作为优选，同时在预装柱上加建出样端过滤截留出口易于被去除而使柱内固相填料易于移离柱层析结构。本发明技术所采用的层析柱其管道结构也是优选对象，在检测时层析填料被固定在管道的特定部位进行，分析完成后被排出管道，再进行新的分析检测。

所述的捕获相中的捕获载体包括包括但不限于：1）凝胶颗粒；2）磁微粒。其中凝胶颗粒为多种柱层析填料，常用亲和层析填料，磁微粒为能用待检物特异性结合物，如抗体、抗原等，进行标记的磁性微粒。

所述的待检物样品包括来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。

所述的化学发光指示剂为常用的直接化学发光指示剂和间接的能以化学发光剂作为底物进行化学发光反应的物质。化学发光指示剂可分为直接发光和间接发光两类。直接发光类有鲁米诺类、光泽精类、钌(Ⅱ)一联吡啶配合物、吖啶酯类化合物等。间接发光类目前常用的标记酶为碱性磷酸酶(ALP)和过氧化物酶类，如辣根过氧化物酶(HRP)。辣根过氧化物酶常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光。碱性磷酸酶标记时所用的发光底物是环1，2一二氧乙烷衍生物AMPPD为发光底物。另外量子点(quantumdots，QDs)又称半导体纳米微晶体，是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-V族元素组成的能够接受激光产生荧光的半导体纳米颗粒。

所述的检测器所用的检测方法包括下列一种或一种以上的特性：1）捕获相在柱层析结构原位进行化学发光反应，即吸附分离和检测均在装有捕获相的层析柱上进行，吸附分离和检测的全过程中捕获相处于原位，不进行移位处理；2）捕获相在柱层析管道结构内移位，然后进行化学发光反应，即吸附分离过程在管道内装有捕获相的柱层析吸附分离区段，检测时将捕获相移位，使其离开柱层析吸附分离区段，进入检测区段进行检测；3）捕获相被移离柱层析结构，在检测反应室内进行化学发光反应，即吸附分离过程在装有捕获相的柱层析结构内进行，检测时打开柱层析结构的出口端，将捕获相转移至检测反应室内进行检测。

所述的化学发光检测技术包括以下步骤：1）用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相；2）将捕获相装载于柱层析结构内；3）用直接或间接化学发光指示剂标记待检物特异性结合物，制成检测相；4）将含有待检物的待检样品加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，待检物被捕获；5）用清洗液清洗去除层析柱内的捕获相上未被结合而残留的待检物及其待检样品；6）将检测相加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，检测相与被捕获的待检物特异性结合，形成捕获相-待检物-检测相复合物，进而被间接捕获；7）直接检测未被捕获而流出的检测相的发光量进而计算待检物的含量；8）直接检测被捕获的检测相和/或检测相复合物，用所得检测相的发光量计算待检物的含量。

所述的化学发光检测技术在多种化学发光检测技术产品开发中的应用。有环境、临床、药物分析、食品和工业分析等多领域的检测产品。

有益效果]

1）本发明创造性地将柱层析分析技术与化学发光技术进行了有机结合，设计了柱层析化学发光检测技术，明显提高了化学发光的检测速度，使整个样品的检测时间从现有的15-20分钟/样品，加速至5-10分钟/样品。

2）本发明将待检样品的吸附分离过程全部控制在层析柱上，简化了操作程序，方便了使用，降低了检测成本。

3）本发明采用柱层析吸附分离技术，大大简化了在仪器配制设计制作中的复杂程度，降低仪器的设计和生产成本。

因此，本发明技术对改善现有化学发光检测技术具有重要的意义和良好的应用前景。

具体实施方式] 

   通过以下具体实施实例，可以进一步了解本发明，但以下实例不是对本发明的限定。

实施例1、本发明技术与现行化学发光检测技术对凝胶介质吸附性能的影响：

实验材料：装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的小型预装层析柱、抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质、辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、化学发光检测仪、人血红蛋白溶液。

   实验方法：取已知浓度的人血红蛋白溶液，用PBS溶液稀释配置100ng/ml人血红蛋白溶液。实验将采用本发明技术与现行化学发光检测技术观测不同吸附反应时间对发光量的影响。观察时间点1、2、4、10、20、30、45、60分钟。

现行化学发光检测技术组，每管加入抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul，再分别加入人血红蛋白溶液各50ul, 37℃震摇温育，3000转/分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul清洗, 3000转/分离心3分钟，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，37℃震摇以对应的时间进行温育，3000转/分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul清洗，3000转/分离心3分钟，弃上清，转移凝胶介质至发光杯，置化学发光检测仪，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。

本发明技术组，取装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的预装层析柱，室温分别加入人血红蛋白溶液各50ul, 收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，弃流出液，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，以对应的时间进行室温静置，收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，转移凝胶介质至发光杯，置化学发光检测仪，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。

实验结果：见表1，现行化学发光检测技术实验在30分钟基本达到平衡，本发明技术在2分钟就基本达到平衡。

表1、本发明技术与现行化学发光检测技术对凝胶介质吸附性能的影响

 

       

现行技术      5325  7562   7866  10230  13579  19889  19764  19521

本发明技术   16352 19463  20121 19852  19635  19375  20023  19652

实施例2、本发明技术与现行化学发光检测技术检测结果的比较：

实验材料：装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的预装层析柱、抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质、辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、化学发光检测仪、人血红蛋白溶液。

   实验方法：取已知浓度的人血红蛋白溶液，用PBS溶液稀释配置10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng人血红蛋白溶液。另取健康人全血，加入等量的去离子水溶血释放血红蛋白，再用PBS进行10000倍稀释。实验将采用本发明技术与现行化学发光检测技术测定10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng人血红蛋白溶液并绘制标准曲线，然后测定健康人血红蛋白，并计算血红蛋白浓度。取42个试管，分为本发明技术组和现行化学发光检测技术组。每个样品做3个平行管。

现行化学发光检测技术组，每管加入抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul，再分别加入已知浓度的人血红蛋白溶液和待测健康人血红蛋白溶液各50ul,37℃震摇温育30分钟，3000转/分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul, 混匀，3000转/分离心3分钟，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，37℃震摇温育30分钟，3000转/分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul, 混匀，3000转/分离心3分钟，弃上清，转移凝胶介质至发光杯，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。

本发明技术组，取装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的预装层析柱，分别加入已知浓度的人血红蛋白溶液和待测健康人血红蛋白溶液各50ul, 收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，弃流出液，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，收集流出液，加入PBS缓冲液100ul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，转移凝胶介质至发光杯，加入100ul鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。

实验结果：现行技术完成实验时间82分钟,测定结果2.91ug/50ul，本发明技术完成实验时间16分钟，测定结果3.17ug/50ul，两种实验方法所得结果基本一致,但本发明所用时间明显短于现行技术。

Claims (9)

1.一种化学发光检测技术，其特征在于：所述的化学发光检测技术是以柱层析结构作为化学发光检测吸附分离反应的载体，由层析柱、捕获相、待检物样品、检测相和检测器组成。

2.根据权利要求 1 所述的化学发光检测技术，具有如下特征：

1）用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相；

2）捕获相装载于层析柱内使用；

3）检测相是由直接或间接化学发光指示剂标记待检物特异性结合物而制成；

4）用检测器检测被捕获的检测相的发光量进而计算待检物的含量和/或用检测器检测未被捕获而流出层析柱的检测相的发光量进而计算待检物的含量。

3.根据权利要求 1或2 所述的化学发光检测技术，其特征在于：所述的层析柱的结构包括下列一种或一种以上的特性：

1）刚性管道结构；

2）非刚性管道结构；

3）芯片结构包括微流控芯片结构和普通芯片结构；

4）为预装柱；

5）为使用前装载的柱状结构；

6）为加有开关控制装置的管道结构；

7）为出样端过滤截留出口易于被去除而使柱内固相填料易于移离柱层析结构进行下一级分析的柱状结构。

4.根据权利要求 1－3任一 所述的化学发光检测技术，其特征在于：所述的捕获相中的捕获载体包括包括但不限于：

1）凝胶颗粒；

2）磁微粒。

5.根据权利要求 1－4任一所述的化学发光检测技术，其特征在于：所述的待检物样品包括来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。

6.根据权利要求 1－5任一所述的化学发光检测技术，其特征在于：所述的化学发光指示剂为常用的直接化学发光指示剂和间接的能以化学发光剂作为底物进行化学发光反应的物质。

7.根据权利要求 1－6任一所述的化学发光检测技术，其特征在于：所述的检测器所用的检测方法包括下列一种或一种以上的特性：

1）捕获相在柱层析结构原位进行化学发光反应；

2）捕获相在柱层析管道结构内移位，然后进行化学发光反应；

3）捕获相被移离柱层析结构，在检测反应室内进行化学发光反应。

8.根据权利要求1－7任一所述的化学发光检测技术，其特征在于：所述的化学发光检测技术包括以下步骤：

1）用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相；

2）将捕获相装载于柱层析结构内；

3）用直接或间接化学发光指示剂标记待检物特异性结合物，制成检测相；

4）将含有待检物的待检样品加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，待检物被捕获；

5）用清洗液清洗去除层析柱内的捕获相上未被结合而残留的待检物及其待检样品；

6）将检测相加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，检测相与被捕获的待检物特异性结合，形成捕获相-待检物-检测相复合物，进而被间接捕获；

7）直接检测未被捕获而流出的检测相的发光量进而计算待检物的含量；

8）直接检测被捕获的检测相和/或检测相复合物，用所得检测相的发光量计算待检物的含量。

9.权利要求 1－8任一所述的化学发光检测技术在多种化学发光检测技术产品开发中的应用。