KR0171392B1 - 유동 면역센서법 및 그 장치 - Google Patents

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윌리암 씨 가버트
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Abstract

표적물 성분의 검출방법은 (a) 표적물에 특이적인 항체를 제공하고, (b) 표지된 항체-항원 복합체를 형성하도록 표적물의 표지된 동족체에 항체의 결합부위를 노출시키며, (c) 표지된 항원-항체 복합체를 지난 표적물을 함유하는 액체배지를 유동시키고, (d) 표적물을 표지된 동족체와 대체시키며, (e) 대체된 표지 동족체를 검출하는 것을 포함하는 표적물성분의 검출방법의 단계를 포함한다.
본 발명은 유동면역센서에 의해 수행된다; 유동액체는 면역센서를 통하여 샘플로 이동한다; 수용수단은 액체에 샘플을 도입한다; 유동조절 수단은 면역센서를 통하여 액체의 이동을 조절한다; 유동조절 수단은 면역센서를 통하여 액체의 이동을 조절한다; 교환기는 존재하는 어떤 표적물의 표지된 항원을 대체시키도록 표적물의 표지된 항원에 접촉하여 샘플을 운반한다; 검출장치는 방출된 어떤 표지된 항원을 검출한다; 처리수단은 검출장치로부터 오는 폐기물을 처리하거나 수집한다.

Description

[발명의 명칭]
유동 면역센서법 및 그 장치
[기술분야]
본 발명은 연속적이고도 상대적으로 신속한, 항체를 기초로 한 표적물 성분(target moiety)의 검출방법 및 이 방법을 수행할 수 있는 유동 면역센서 장치에 관한 것이다.
[배경기술]
오늘날, 건강과 안전에 대한 이유로, 위험물질과 결합하거나 또는 그 자체가 위험한, 환경 또는 샘플 내의 성분을 신속히 검출할 필요가 있다. 이러한 성분들은 약품, 음식 또는 체액 샘플 내에 존재할 수 있다. 또는 대기 중이나 수중에 존재할 수도 있다. 본 명세서에서는 이러한 성분들을 표적물 또는 표적물 성분이라 칭한다.
이 표적물은 음식 내에 존재하는 독성물질이나 또는 대기 혹은 수중에 존재하는 독성물과 같이 건강에 위협을 주는 것일 수 있다. 또한, 폭발물 및 금지약물에 의해 발산되는 증발물질같이 인간의 후생에 위험한 물질의 존재를 지시하여 주는 화학물질일 수도 있다. 나아가, 이러한 표적물은 동물들의 체액에서 발견되는 특별한 성분이거나 신진대사물일수도 있다. 후자와 같은 표적물은 질병의 존재나 또는 단순히 신체상태를 알려줄 수도 있다.
표적물 성분을 검출하는 많은 테스트들이 실험실 조건에서 행하여지고 또 제안되었다. 음식물이나 수중의 독성물질은 배치(batch)단위로 실시되는 화학테스트로서 검출된다. 또한, 대기 중이나 수중의 독성물질은 연속공정에 의해 검출될 수 있으나 아직까지도 이러한 공정들은 목적을 달성하기 위하여 상대적으로 많은 양의 표적물 샘플을 필요로 한다. 또한 이러한 테스트들로는 표적물간의 차이를 구별할 수 없거나 많은 표적물을 검출할 수 없다. 체액성분이나 신진대사물을 검출 및 확인하는 많은 뱃치 테스트가 있다. 이러한 테스트 중 대부분은 대체로 즉각적으로 결과가 나오지 않거나 기대하는 만큼 신속한 결과가 나오지 않는다.
본 발명에서의 실시간 테스트(real-time test)는 샘플을 취해 테스트를 시작하여 2-3분내에 결과가 나오는 테스트로 정의된다. 주변환경에서 샘플을 취하고 여러 번의 조작을 거쳐 성장 또는 배양시켜 결과를 얻는 테스트는 실시간 테스트로 간주되지 않는다. 예시적으로, 유동하는 공기나 물에서 샘플을 취하고 1분 이내에 결과가 나와서, 테스트에 의해 판명된 조건이 환경에서의 조건을 나타낸다면 실시간 테스트로 간주된다.
오늘날, 가장 관심이 높은 두 분야는 약물의 검출 및 폭발물질의 검출이다. 비록 이러한 두 유형의 물질을 검출하는데 따른 화학적 문제점은 현저히 다를지라도, 물리적 문제는 종종 동일하다. 둘 모두 실시간 테스트를 필요로 한다. 마찬가지로, 샘플이 신속히 특징을 나타내고 적당한 조치가 취해질 수 있도록 샘플마다 들어있는 성분의 존재를 검출하는데 있어서도 실시간 테스트를 할 필요성이 있다. 이것은 약물 같은 샘플, 혈액 같은 샘플 또는 정액 같은 샘플을 확인해야 하는 범죄 현장에서 단순한 정성시험이 될 수도 있다.
테러행위에 폭탄은 항공기나 또는 빌딩 내에 장치되어 진다. 폭발장치는 보통 작고 밀폐되고 제한된 공간 내에 숨겨진다. 이러한 행위를 방어하려면 은폐된 장소에 있는 폭발물을 검출하여야 한다. 마찬가지로, 불법 약물 역시 작고 밀폐되고 제한된 공간 내에 숨겨져 시골, 빌딩 또는 다른 안전한 장소로 밀반입된다. 대부분의 약물 및 폭발물의 증기압은 매우 소량으로도 채취된 공기에서 검출될 수 있다. 특별한 표적물에서 이러한 소량의 표적물 압력을 검출하려면 판별 및 감응장치 및 테스트방법과 물질을 필요로 한다.
그리피스(Griffith) 등의 미국 특허 제4,818,870호에는 스니퍼(sniffer) 장치로 사용된 공기 샘플 프로브가 기술되어 있다. 이 장치로 약물 및 폭발물의 증발물을 검출한다. 그리피스의 발명에서의 검출기는 질량분석기이다. 미국 특허 제4,866,439호에는 전자 포획 검출기(electron capture detector)를 폭발물 검출 수단으로 기재하고 있다. 미국 특허 제4,849,628, 4,776,409 및 4,884,839호에는 이온화 소스나 광이온화 검출기를 이용하는 기압 검출기가 기재되어 있다. 미국 특허 제4,360,776호에서, 바우만(Bauman)은 표적물질을 검출하기 위해 전자기 공명 기술에서의 항체의 이용을 설명하고 있다. 모노클로날 항체 기술은 현대의 화학 및 의학 분석기술을 현저히 변화시켰다. 모노클로날 항체 기술은 다량의 고도의 특이성 항체를 사용하므로, 항체로 피복된 지지체를 포함하는 컬럼이 항원의 정제에 일반적으로 사용되게 되었다.
엘리사(ELISA; Enzyme Linked Immounosorbant Assay)와 같은 항체를 기초로 한 검지 시스템과 방사면역검정법(Radioimmunoassay)은 항체 특이성과 민감성의 장점을 취해 발전되어 왔다. 그러나, 감지하는 동안, 이러한 기술들은 시간이 소요되며 보통 다수의 조작과정과/또는 부가적인 시료를 필요로 한다. 항체는, 이들의 고유 민감성과 선택성 때문에, 바이오센서 중의 검출요소로의 이용이 자연스럽다.
항체와 연합한 바이오센서는 면역센서로 분류되어져 왔다. 오늘날까지 보고된 대부분의 면역센서는(Ives 등, Applied Biotechnology Labaoratoy, 1989. 3. 10; Andrade 등, 미국 특허 제4,368,047호(1983년); Place 등, Biosensors 1,321(1985); Tromberg 등, Anal. Chem., 59, 1226(1987); Thompsom, R. B.와 F. S. Ligler. NRL Memorandum Report 6182, 1988)항원과 항체의 조합을 기초로 하며, 거대분자 검출용 샌드위치 분석기나 직접결합 또는 소분자 검출용 경쟁 분석기로 구성되어 있다.
ELISA법과 친화력 크로마토그래피가 광범위하게 사용되는 것은 고체-액체간의 접촉 영역에서 일어나는 항원-항체 결합의 역학에 대한 고무된 이론적 고찰 때문이다(Lew, J. Immunol. Methods, 72,171(1984); Lundstrom 등, J. Theor. Biol., 110, 195(1984); Nygren 등., J. Immunol. Methods, 101, 63(1987); stenberg 등., J. Immunol. Methods, 113,3(1988) 항원과 항체의 조합율은 고정성분의 밀도, 항체 친화도, 기질의 기하학적 형상 및 자유성분의 농도의 기능으로 결정된다. 상기의 인용된 연구에서, 항원은 표면에 결합되고 항체는 용액 내에서 자유롭다.
상기에서 인용된 다가 시스템의 경우, 스텐버그 등(1988)은 미시적 입자표면에서의 항원, 항체 조합율은 표면 반응이 분산율보다 빠른 한 분산성 질량 전이에 의해 제한된다는 것을 보여주었다. 분산 제한 영역에서의 비율은 구의 반지름에 반비례한다.
상기에서 인용되었듯이 이베스 등은(1989년) 평형교환반응 조건하에서는 과량의 비표지된 항원(unlabelled antigen)에 의해 표지된 항원(labelled antigen)이 대체된다고 하였다. 항원이 1가이고 낮은 분자량인 한, 교환에 소요되는 시간은 15-20분일 것이라고 이베스 등은 결론지었다.
항원-항체 상호작용의 경우, 분해율은 보통 결합력을 결정한다고 간주되어진다. 고정된 항원으로부터의 IgG 및 Fab' 항체 분해의 경우, 10-4-10-5sec-1의 비율상수가 얻어졌다.(Liu 등., IEEE Trans of Biomedical Eng., Vol. BME-33, No. 2, 1986년 2월; Nygren, 1987년, 상기에서 인용; Mason 등., Biochem. Jo., 187,1(1980); Werthen 등., J. Immunol. Methods, 115, 71(1988). 면역검정법의 전형적인 시간간격의 경우, 결합이 변경될 수 없는 것으로 간주될 수 있다.
상기에서 인용되었듯이, 니그렌(1987년)의 연구에서는, 고정된 항원에 결합된 항체에서의 분해는 단지 과량의 항원 존재 하에서였다. 과량의 자유항원의 첨가에 다른 항체 친화성 컬럼으로부터의 결합된 항원의 대체는 마찬가지로 잘 알려져 있다.
아이자와 등은 (Trans ducers '87, 783(1988))마이크로 몰 량의 자유 항원을 사용하여 고정된 항원으로부터의 과산화제-표지된 IgG 항체의 현저한 대체에 대하여 보고하였다. 아이자와 등의 보고서는 자유 항원에 대한 항체의 비율이나 시간을 기재하지 않았기 때문에 불완전하였다.
히트-앤드-런(hit-and-run) 면역검정법(Warden 등., Anal. Biochem., 162, 363(1987))도 컬럼 지지체 상에서 행하여진 면역검정법이다. 이 히트-앤드-런 분석법이 갖고 있는 문제점은 연속적인 유동시스템이 아니라는 점이다. 항원이 컬럼에 도입되었을 때, 거기서 5분간 지체된다. 그러므로 5분 동안 단지 하나의 샘플 컬럼 용량만이 테스트될 수 있다. 또한 이 시간 동안, 유속보다는 분산율이 계산되는 항원-항체 인카운터(encounters)를 결정한다. 더욱이, 항원이 컬럼 상에 고정되고 IgG의 형광표지성 Fab' 단편이 여기에 결합된다. 이 Fab' 단편은 평형 결합조건에 있다고 간주되어져서, 각각의 고정된 항원에 계속적으로 결합되었다, 풀어졌다 또 결합된다. 항원을 포함하는 샘플이 도입되면, 결합이 풀어진 Fab' 단편은 5분간의 시간 경과 후에 결합하고 용해성 형광 복합체는 형광 검지계로 다운스트림(downstream)을 유동시킨다.
항체는 금지된 약물 및 폭발물의 검출에 사용되어져 왔다. 미국 특허 제4,353,886호에서 루켄스(Lukens) 등은 나르코틴 증발물에 대한 필드 테스트를 기재하고 있다. 이 테스트는 테스트판에 설치된 항체를 이용하여 그 증발물을 검출한다. 이 테스트는 상이한 판들을 노출 및 성장시켜야 하는 뱃치형 시스템이다. 이 시스템은 환경물질을 연속적으로 모니터할 수 없다.
약물을 검출하는 많은 기술들이 단독 혹은 복합적으로 발전되어져 왔다. 미국 특허 제4,235,864호에서 카울(Kaul) 등은 함께 발견된 복잡한 약물을 검출 및 식별하는 방법을 기재하고 있다. 종래의 방사면역 검정법에서는 에크고닌(ecgonine)의 방사 표지된 결합체를 사용하여 코카인을 검출한다. 많은 금지약물에 대한 항체를 제조하는 방법은 잘 알려져 있으며, 그 중 몇 가지는 시중에서 구입할 수 있다.
항체를 이용하는 기존 기술은 연속적으로 환경물질을 모니터할 수 없거나 또는 실시간 내에 반응을 나타내지 않는다. 직접 결합이나 경쟁 결합 또는 평형교환반응에 근거하는 세미-배차 과정으로 된 시스템이 존재한다.
[발명의 설명]
따라서, 본 발명의 목적은 실시간 내에 표적물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 표적물을 검지하기 위하여 실시간 내에 환경물질을 모니터하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소량의 표적물질을 민감하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
한편, 본 발명의 또 다른 목적은 실시간 내에 표적물을 검지할 수 있는 휴대용 면역센서를 제공하는 것이다.
더 나아가 본 발명은 실시간 내에 연속 유동법으로 작동하는 면역센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 실시간 내에 고 분자량 및 저 분자량(합텐)의 표적물을 모두 검출할 수 있는 면역센서를 제공하는 것이다.
이상과 같은 본 발명의 목적들은 (a) 표적물에 특이적인 항체를 제공하고, (b) 항체의 결합부위를 표지된 형태의 표적물로 포화시키며, (c) 포화된 항체를 지난 표적물을 함유하는 배지를 유동시키고, (d) 표지된 항원을 대체하도록 표적물을 허용하며, (e) 표지된 항원을 표지를 위한 검출기로 검출하는 단계로 구성된 표적물성분 검출 방법에 의해 수행된다.
또한 본 발명은 면역센서를 통하여 샘플을 이동시키기 위해 면역센서를 통하여 유동하는 액체 스트림, 액체 스트림에 샘플을 도입시키기 위한 수용수단, 면역센서를 통하여 액체 스트림을 이동시키기 위한 유동 조절수단, 샘플이 표적물의 표지된 항원과 접촉시켜서 존재하는 어떤 표적물이 표지된 항원을 대체시키도록 하는 샘플 수용 수단과 연결된 교환기, 방출된 표지항원을 검출하기 위한 교환기에 연결된 검출장치, 검출 장치에서 나오는 폐기물을 처리하거나 수집하기 위한 검출장치에 연결된 처리수단을 포함하는 유동면역센서에 의해 수행된다.
교환기는 지지배지를 함유하는 챔버를 포함한다. 항체는 이 지지배지 상에 고정된다. 항체는 특이적으로 그리고 민감하게 표적물을 인식한다. 표지된 항원은 고정된 항체에 의해 결합된다. 본 발명에서는 어떠한 표지도 사용될 수 있으나 방사표지 또는 형광표지가 바람직하다. 표지된 항원은 표적물의 존재 하에서 대체되어질 수 있다.
검출장치는 각 표지의 유형에 따라 달라질 것이다. 표지가 방사표지인 경우, 검출기는 적어도 방사선을 검출하고 검출된 방사선의 양을 표시하여 주는 방사센서를 포함한다. 만일 형광표지가 사용된다면, 검출 장치는 적어도, 형광 표지된 항원을 자극시켜 형광을 발하도록 하는 광원과, 생성된 발색의 양을 검출 및 표시하도록 하는 판독수단을 포함한다.
이 장치는 또한 액체 스트림을 형성하고 샘플을 이러한 방법과 장치로 이송시키는 액체를 저장시키는 저장기를 포함한다. 끝으로, 이 면역센서는 시스템을 통하여 흘러나오는 유체를 처리하거나 또는 재순환시키는 수단을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명의 진가는 상술된 발명의 바람직한 실시예와 동일 구조 또는 동일 요소를 나타내는 숫자가 기재되어 있는 첨부도면에 의해 설명될 것이다. 각 도면의 표시는 다이아그램화된 것이고 실제 크기나 정확한 비율은 나타내지 않았다.
제1도는 발명을 구성하는 장치의 개략도이고,
제2도는 본 발명 교환기의 상세 개략도이고,
제3도는 자유 항원으로 표지된 항원을 대체하는 것을 입증하는 차트이며,
제4도는 시그날 발생에 대한 항체밀도의 효과를 나타내는 그래프이며,
제5도는 모델 항원의 검출을 위한 감도를 나타내는 스트립 차트 기록지이다.
[발명의 상세한 설명]
[발명을 수행하기 위한 방법]
항체는, 그들의 고유한 특이성 때문에, 바이오센서에서 검출요소로서 사용하기 위한 자연적인 것이다. 항체를 이용하는 바이오 센서는 면역센서로 분류된다.
본 발명의 방법 및 면역센서는 기존의 방법 및 면역센서와는 상이한 메카니즘으로 작동된다고 믿어진다. 여기서 면역센서라는 용어는 장치에서 구체화되는 것과 같은 본 발명의 일부분을 지칭하는데 사용된다.
고정된 항체에 대한 항원의 결합은 처음 몇 시간 동안은 본질적으로 불변인 것으로 간주된다(Stenberg 등., J. Immunel. Methods, 113, 93(1988)). 그러므로 낮은 농도의 항원(항체의 몰농도와 비교하여)이 액체의 연속적인 유동스트림에서 검출될 수 있다는 것을 알아낸 것은 놀라운 일이었다.
본 발명의 방법에서, 표지된 항원의 대체는 비평형 조건하에서 수초 내에 일어난다. 이 반응의 역학은 정지 시스템 내의 고정된 항원/항체 복합체에서 설명되었던 것과는 다른 것이라 추측된다. 이 검출 방법은 유사하거나 혹은 동등한 항원 부위를 갖는 선결합 표지 복합체(pre-bound labelled complex)의 대체를 기초로 하나 컬럼에 대한 항원의 결합만으로 되는 것은 아니다. 이 대체 반응은 평형이 일어날 수 있는 항체/표지된 항원 복합체 부근에서 표적물 분자가 충분한 시간 동안 머물 수 없으므로 종래의 기술에 따른 단순한 평형 결합을 반영하지 않는다. 본 발명의 방법 및 면역센서는 항체와 항원의 조합 대신에 항체 결합 부위로부터의 항원의 해리와 관계 있다.
상기에서 인용된, 이베스 등(1989년)은 평형교환 반응이라는 가정하에서 비표지된 항원에 의한 표지된 항원의 대체에 대하여 연구하였다. 항원이 1가이고 낮은 분자량을 갖고 있는 조건하에서, 이베스 등은 15-20분 내에 대체가 완결될 것이라 결론짓는다.
본 발명의 시스템 내에서는 수초 내에 대체가 이루어진다.
본 발명의 방법 및 유동 면역센서라고 칭한 면역센서의 목적은 특수한 화학물질이나 생물학적 종(항원)의 존재를 위하여 환경물질을 연속적으로 모니터함으로써 표적물의 존재를 거의 즉석에서 알려주는 것이다. 이 방법 및 면역센서는 동시에 한가지 이상의 화학물질이나 종을 모니터하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 주의 물질(suspect material)의 유동이 연속적인 근거로 기대된다는 상황에 제한되지 않는다. 본 발명의 개념은 연속적인 스트림에서 샘플을 제거하고 독립적으로 이것을 분석하기보다는 실시간 내에 활성도를 모니터 할 수 있도록 하는데 있다. 물론, 본 발명의 방법과 장치는 샘플을 액체 유동 스트림에 주사하여 각각의 샘플에 있어서, 특수한 샘플이나 복합적인 불연속 샘플을 분석하거나 체크하는데 사용될 수도 있다. 즉, 단일 또는 복합 샘플을 신속히 분석하기 위해 본 발명에 따른 면역센서 내에서 본 발명의 방법에 의해 처리될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 표적물에 대하여 특이적인 고정된 항체에 결합된 표지된 항원을 포함하는 교환영역을 통하여 샘플 수용수단으로부터 액체 스트림을 유동시키는 것을 포함한다. 이 항원과 항체는 유동 액체와 반응하지 않는다. 이 교환영역을 통과한 후, 이 액체는 만일 표지된 항원이 존재하기만 한다면 항원 상의 표지를 검출할 수 있는 검출 장치를 통과한다.
본 발명방법을 수행함에 있어서 샘플을 액체 유동스트림에 주입시키고 교환영역에 통과시킨다. 다른 방도로서, 샘플을 일정 용량의 액체 중에 분산시키고 이 용량의 액체를 샘플로서 유동스트림 내로 유입시킬 수 있다. 또 다른 양태로서, 샘플을 일정 용량의 액체 중에 분산시키고 이 용량의 액체를 액체 유동스트림으로서 사용한다. 만일 샘플에 표적물이 함유되어 있다면, 그 표적물이 검출장치를 통해 액체 스트림으로 유동하는 표지된 항원을 대치시키게 되며 이에 따라 검출장치에서 그 표적물이 검출되는 것이다. 액체는 샘플과 함께 또는 샘플 없이 검출장치로부터 액체가 적절히 처리되는 처리 영역 또는 회수영역으로 유동한다.
본 발명에서 사용된 액체는 물, 완충액 및 수성 샘플 희석제이다. 바람직한 액체는 인산염-완충된 염수, 붕산염-완충된 염수, TRIS-염수, 알세이버액 및 링거액과 같은 완충액이다. 생물학적 용도용 완충액은 미합중국 캘리포니아 라 졸라 소재의 아메리칸 훽스트 코포레이션(American Hoechst Corporation)에 의하여 출판된 소책자 buffers[편집자; Donald Guoffrey, (1983)]에 일반적으로 기술되어 있다. 정확한 액체는 공정에 사용된 시약 및 표적물을 위한 용매가 그 액체로서 사용되고 그 액체가 표적물, 시약 또는 면역 센서장치의 구성요소와 화학적으로 반응하지 않는 한 본 발명에서 중요한 것으로 다루어지지는 않는다.
본 발명의 방법에서 액체 스트림의 유속은 0.1 내지 2.0ml/분이어야 하며 0.3 내지 0.8ml/분이 바람직하다. 최적의 유속은 교환기 상에서의 표적물의 체류시간이 가능한 최단시간 내에 측정 가능량의 표지된 항원을 대체시키기에 충분한 정도이다.
본 발명에서 사용 가능한 광범위한 항체는 시판 중에 있거나 문헌에 기술된 많은 제법을 이용하여 수득할 수 있다. 시판 중의 항체를 가장 완벽하게 단일 목록으로서 수록하고 있는 것은 린스코트 목록집(Linscott's Directory; 미합중국 캘리포니아 94941 밀 밸리 글렌 드라이브 40)이다. 그 문헌에 기술된 어떠한 항체도 다양한 범위의 표적물을 동정하기 위한 본 발명의 방법 및 면역센서에 사용 또는 적용할 수 있다.
본 발명의 방법은 체액의 특정성분(예, 티록신, 고밀도 지방단백질, 저밀도 지방단백질, 콜레스테롤, 알부민, α-1 항트립신, β-2 마이크로글로블린, 셀룰로플라스민, C1 억제자, C1q 및 기타 보체성분, C-반응성 단백질, α-2-간 단백질, 크리오피브리노겐, 페리틴, 미엘린 기본 단백질, 트랜스페린, 인슐린, 사람의 융모막 고나도트로핀, 에스트로겐, 프로게스테론 또는 세균성 수막염, H. 인플루엔자, N. 수막염, 슈도모나스 뉴모니아, 보르디텔라 페르투시스, 보렐리아 부르그도르페리(라임질환), 스타필로코커스 및 스트렙토코커스와 같은 병원체로부터 유도된 항원)을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 면역센서의 중요한 작용은 짧은 시간에 측정할 수 있다는데 있다. 이에 따라 샘플 중의 체액, 치료약물 및 남용약물(예, 테오필린, 디곡신, L-도파, 인슐린, 코카인 및 이의 신진대사물, 마리화나 신진대사물, 헤로인 또는 몰핀 신진대사물)을 신속하게 평가할 수 있다. 적절한 항체와 표지된 항원을 함유한 교환기를 통해 유동하는 스트림 내로 샘플을 주입하거나 용해시킴으로써 상기와 같은 치료약물 및 남용약물을 샘플간 비교치를 기준으로 하여 모니터할 수 있다.
가장 중요한 것은 주변 대기 또는 수질과 같은 환경에 존재하는 금지 약물과 같은 위험물질, TNT, RDX, PETN 등과 같은 여러 폭발성 물질, 생물학적 또는 화학적 살상물질, 독소, 니트로 벤젠, 이소티오시아네이트 및 기타 수질 및 대기오염물질의 양을 계속적으로 모니터할 수 있다는 점이다.
본 발명의 방법 및 면역센서는, 또한, 발효공정상태 또는 기질의 효소적 전환상태를 모니터하는데 사용할 수 있다.
본 발명 방법의 중요한 이점은 유동유체 이외의 다른 시약들이, 양성결과(이하 hit라 한다)가 검출되지 않는다면, 결코 소모되지 않는다는 것이다. 본 발명 방법을 자동화하기 위한 장치를 적절히 고안함에 있어서, 완충액을 hit를 얻을 때까지 재순환시킬 수 있다. hit를 얻은 후 교환영역을 대체하거나 재생할 수 있다.
교환 영역을 재생할 때 과량의 표지된 항원을 함유하는 유체를 교환영역에 유입시킨다. 표지된 항원은 비표지된 표적물을 대체하고 항원 결합부위에 결합한다. 재생은 평형교환반응이기 때문에, 완충액 중의 표지된 항원의 농도는 가능한 높아야 하며 교환영역에서의 표지된 항원의 체류시간은 완전한 대체를 이룰 수 있을 정도로 길어야 한다.
유동면역센서 및 방법은 항원-항체 결합의 가역성에 의존한다. 표지된 항원 복합체는 수용성이 유지되는 한 다양한 화학적 조성을 가질 수 있다. 표지된 분자 상의 항원성 부위는 검출대상 항원과 동일해서는 안 된다. 항체 결합을 억제하지만 결합 친화도를 약화시키는 표지된 항원의 변형은 대체반응을 실질적으로 증진시킬 수 있으며 결국 그 시스템의 감도를 높여준다.
전개시간 없이도 급속히 검출될 수 있는 표지는 어떠한 것이라도 사용할 수 없다. 그러한 표지로서는 방사성표지, 형광단, 발색단, 전자활성 그룹 및 전자스핀 표지를 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 것은 방사성표지 및 형광라벨이다. 방사성 폐기물을 처리하는데 따른 곤란성 때문에, 형광라벨이 가장 바람직하다.
형광물질-표지된 항원 복합체의 두 가지 특징은 감도를 극대화 하는데 중요하다. 첫째, 형광 항원 복합체는 컬럼 매트릭스 또는 요동통로 상의 어떠한 구성요소에도 직접적으로 부착되어서는 안된다. 둘째, 최고의 감도를 위해 형광단-표지된 분자당 단지 하나의 항원성 부위가 바람직하다. 다수의 항원성 부위를 함유하는 복합체가 사용될 수 있겠으나 감도가 높지 않을 수 있다.
유동 면역센서의 주요부는 (1) 대상 항원을 특이하게 생화학적으로 인식하는 항체가 고정되어 있는 지지매체와 컬럼 (2) 표지된 항원 복합체 및 (3) 유동시스템 모니터 또는 검출기이다. 물론, 연결튜브, 텀프 및 밸브와 같은 보조부품이 완전히 작동 가능한 면역센서 장치를 만드는데 필요하지만 이러한 보조부품을 연결하는 수단은 일단 본 발명의 기본 원리가 주어진 상태에서 통상적인 방법으로 진행되는 것에 불과하다. 특정 구성 요소들은 본 발명 방법의 시약과 상호 작용하지 않거나 그 시약을 오염시키지 않는 물질을 이용하여 제조하여야 한다. 필요하다면, 본 분야에 공지된 방법으로 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어를 장착하여 시스템을 자동화 할 수 있다.
제1도는 시스템의 상이한 구성을 나타내기 위해 사용될 수 있는 개략도이다. 유체는 저장기(11)에 함유된다. 유체는 저장기(11)로부터 튜브(22)를 거쳐 적절한 조절밸브(21)를 지나 적합한 펌프(19)로 유동한다. 펌프(19)는 시스템을 오염시키지 않고 시스템 내로 비교적 소량의 액체를 항속으로 유동시킬 수 있는 형태이다.
샘플수용수단(13)이, 또한, 튜브(15)를 통해 밸브(21)에 연결된다. 수용수단은 면역센서의 용도에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 한가지 양태로서, 수용수단(13)은 샘플이, 시스템의 액체로서 장치 내로 주입되기 전에 용해되어 있거나 주사기 또는 주입루프에 의한 것과 같이 저장기(11)로부터 내려온 액체 스트림에 첨가되는 샘플로서 소량의 액체 중에 용해되어 있는, 액체용기일 수 있다. 또 다른 양태로서, 샘플 수용수단은 환경을 계속 모니터하고 환경의 샘플을 튜브(22)를 통해 유동하는 액체 스트림 내로 유인하는 액체 흡인기(sipper) 또는 대기 채취기(예, Midwest Research Institute 제품 SpinconR)의 형태일 수 있다.
펌프(19)로부터 유체는 밸브(23)를 경유하여 튜브(25a),(25b) 및/또는 (25c)로 유동한다. 밸브(23)는 컬럼(35)과 컬럼(31) 사이에서 또는 덤프(45)로 유동을 전환시키는 전환형 밸브이거나 다른 양태로서 밸브(23)는 액체 유동을 (35)와 (31)로 분산시키는 분산형 밸브일 수 있다. 컬럼(31)은 반드시 필요한 것은 아니지만 가양성 시그널을 통제하는 목적으로 바람직하다. 배출기(45)는 튜브(25c)와 튜브(43)를 경유하여 밸브(23)에 연결되어 컬럼(35)과 (31)로부터의 유동을 전환시키거나 시스템을 배출하는 수단으로서 유동을 전환시킬 수 있다. 면역센서의 바람직한 형태로서, 밸브(23)가 샘플을 교환컬럼(35)과 대조컬럼(31) 사이로 양분하는 것이다. 교환컬럼(35) 및 대조컬럼(31)은 반드시 한가지 형상을 띌 필요는 없지만, 지지매체(33)를 함유하고 이 지지체와 지지체상에 고정된 항체에 액체 스트림이 접촉하도록 액체스트림에 대한 유동진로를 제공하는 형태의 튜브, 컬럼 또는 용기일 수 있다.
이들 컬럼(35)과 (31)의 용적 또는 형태는 샘플과 표지된 항원 사이에 양호한 접촉시간을 허용하고 면역센서 또는 방법에서 라벨, 표적물 또는 기타 물질과 상호 작용하지 않는한 중요하지 않다. 컬럼은 화학적으로 불활성이고 강성인 재료(예, 유리, 테플론 또는 스테인레스강)로 만든 것을 사용하는 것이 바람직하다. 컬럼내에 보유되는 액체용량은 중요하지 않지만 0.1 내지 0.5ml의 용적을 갖는 대체 가능한 마이크로 컬럼을 이용하는 것이 바람직하다. 유동면역센서는 작게 휴대용으로 만들 수 있다. 약 200μl 베트용적의 컬럼이면 대부분의 용도에 충분하다.
지지매체(33)는 그 지지매체가 가양성 시그널 또는 가음성 시그널을 나타내지 않도록 분석 대상물질에 대해 중성인 물질이어야 한다. 바람직한 물질은 Sigma 제품 SepharoseR비드와 같은 활성화된 폴리사카라이드 비드이다. 기타 적합한 재질로서 실리카 또는 유리비드, 중공섬유 또는 활성화된 폴리머를 들 수 있다. 지지매체는 교환컬럼(35)과 대조컬럼(31) 모두에 존재한다. 또 다른 양태에서, 중공섬유 또는 모세튜브 다발이 튜브와 지지매체로서 동시에 작용할 수 있다. 튜브의 표면은 지지체로서 작용하는 한편 다발 내 또는 다발 주변의 통로들은 유체를 유동시키는 작용을 한다.
항체(37)는 지지매체(33)에 고정된 상태에서 표지된 항원(39)과 결합한다. 교환컬럼(35)은 표적물에 대한 항원과 항체를 함유한다. 대조컬럼(31)은 샘플에 존재하지 않을 것으로 기대되는 표적물에 대한 항원과 항체를 함유한다. 라벨, 지지체 및 컬럼 재료는 달리 언급되지 않는한 교환컬럼(35)과 대조컬럼(31) 모두 동일하다.
제1도 및 제2도에 도시된 바와 같이 작동시 표적항원이 교환컬럼(35)에 유입되어 항체(37)로부터 표지된 항원(39)을 대체한다. 대체된 표지항원(39)은 컬럼(35)을 빠져나가 튜브(40)를 거쳐 검출기(41)로 유동하게 되며 이곳에서 그 항원의 존재가 검색된다. 폐기물(45)은 튜브(43)를 경유하여 빠져나가고 경우에 따라 처분하거나 재순환시킨다. 동시에 대조샘플은 대조컬럼(31)으로 유동하여 비-반응성 항체와 접촉한 다음 튜브(40a)를 경유하여 제2검출기(41a)로 유동하고 이곳에서 시그널이 없음을 확인한다. 유동대조액체는 처분하거나 컬럼(35)으로 유동한 액체와 같은 방식으로 (43)과 (45)를 통해 재순환시킬 수 있다.
검출기(41) 및 제2검출기(41a)는 형광측정기, 분광측정기, 방사능탐지기 또는 전극 일 수 있으며 바람직한 것은 유동조절, 데이터 프로쎄싱 및 시그널발생에 대한 마이크로 프로세서와 유동셀이 장착된 형광측정기이다.
컬럼 내의 대체반응은 다음과 같은 단계로 이루어진다. 고체지지체(33) 상에 고정된 항체를 표지된 과량의 항원에 저촉시켰을 때 표지된 분자가 항체의 결합부위를 점유한다. 항체-피복된 지지체와 표지된 항체를 200μl 컬럼에 부하시키고 기준선이 자리잡을 때까지 완충제로 세척한다. 시스템에 사용된 전형적인 유속은 0.3 내지 0.8ml/분이다. 항원(비표지된)이 함유된 시험 샘플이 컬럼을 지날 때 표지된 항원이 고정된 항체 상의 결합부위로부터 방출되며 샘플 중의 항원농도에 비례하는 시그널을 발생한다. 표지된 복합체가 유동셀이 장착된 검출기를 통해 빠져 나가면서 시그널이 검색된다.
컬럼은 작고 값이 저렴하며 교환 가능하도록 고안한다. 그럼으로써 컬럼을 버리거나 과량의 표지된 항원을 쏟아부어 재생시킨다. 이러한 재생능력은 용해된 항원의 표준물을 도입시켜 시스템의 정기적인 테스트를 수행하여 양성 시그널의 발생을 확신시켜 준다. 관련이 없는 항체와 상응하는 표지된 분자를 함유하는 컬럼을 사용하여 가양성 시그널을 통제할 수 있다(제1도의 컬럼31). 샘플 스트림을 양분하여(제1도의 밸브23) 대조컬럼에 통과시키는 한편 교환컬럼에 통과시킨다. 항체로부터 항원의 비특이적 방출을 일으킬 수 있는 어떠한 요인도(즉, 역, 유기용매) 대조컬럼뿐만 아니라 교환컬럼으로부터 시그널을 발생시킨다.
현 장치는 스펙트로비젼(Spectrovision)으로부터 얻은 손가방 크기의 형광계를 갖고 있으나 이러한 부품은 훨씬 더 작게 만들 수 있다. 또한, 작은 레이저를 형광계에 장착시켜 감도를 높일 수 있다. 임의로, 밸브 및 펌프를 조절하고 데이터를 프로쎄씽하며 데이터 통계를 얻기 위하여 마이크로프로세서를 부착시켰다.
항원의 존재에 대한 연속 스트림을 모니터하는 것 외에도 교환컬럼은 많은 개개의 샘플을 자동적으로 검정하면서 사용될 수 있다. 예컨대, 자동화 채집기(흡입기)가 있는데 이에 의해 96-웰 미소역가 평판 또는 일련의 튜브로부터 유체를 추출하고 이들을 액체 스트림으로 유입시킬 수 있다. 상술된 면역쎈서와 연결하여 사용할 때 많은 개개의 샘플을 대단히 신속하게 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 면역센서는 작은 분자를 검출하기 위한 경쟁적 면역검정의 유용한 대안물로서 이용 가능하게 하는 몇 가지 특징을 수반하고 있다. 첫째, 0.8ml/분 정도의 연속 유속하에서 피코몰의 항원을 검출할 수 있다. 항원 대체반응이 일어날 수 있도록 유동을 멈추어야 할 필요성이 전혀 없다. 둘째, 대체반응은 시그널이 없어지는 것을 측정하는 많은 경쟁적 면역검정법과는 대조적으로 시그널을 생성한다. 시그널이 출현하는 것을 검색하는 것이 시그널이 소량 감소하는 검색하는 것보다 쉽다. 셋째, 센서 자체는 많은 샘플을 연속적으로 모니터하거나 스크리닝하기 위해 비교적 작고 편리하게 만들 수 있다. 따라서, 시약을 추가하거나, 많은 단계를 수행하거나 검정과정 동안에 조작할 필요가 없다. 마지막으로, 본 발명의 방법 및 면역센서는 작고 큰 분자 모두를 포함한 다양한 범위의 표적물을 검출하는데 적용할 수 있다.
본 발명을 기술하는 하기 실시예는 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있는 특정 기술을 포함한 본 발명의 특정 적용 가능성을 보여준다. 이에, 이들 특정 실시예가 본원에 기술된 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
[실시예 1]
디니트로페놀(DNP)의 검출
표준절차를 이용하여 트레실 클로라이드-활성화된 SepharoseR4B(미합중국 미조리 세인트루이스 소재의 Sigma Chemocla Co. 제품)에 항체를 연결한다. 고체 지지체 상의 단백질 농도의 측정에 대해 Ahmad와 Saleemuddin에 의해 개괄된 변형법(Anal. Biochem, 148, pp. 533-541(1985))을 기초로 하여 쿠마시 블루 검정법을 이용하여 지지체에 결합된 단백질의 양을 측정한다. 방사성 표지된 DNP 결합체 또는 형광물질 표지된 DNT 결합체를 세파로즈R과 록킹 플랫폼 상에서 4℃ 하에 적어도 밤새 배양시켜 고정된 항체의 항원 결합부위와 반응시킨다. 이들 실시예에서, 결합체는 DNP가 테트라-설폰화된 인슐린A-쇄에 연결되어 구성된 것이다(참조; 발명의 명칭 Novel Sulfonated Oligomeric Carriers for Fluorescent of Chemiluminescent Labelling of Ligands 하에 Bredehorst, Ligler, Kusterbeck Vogal에 의해 출원된 관련특허원). DNP 결합체를 DNP 대 항체의 몰 비가 3:1인 양으로 가한다. 사용 직전에 슬러리 분취량을 제거하고 미소원심분리기에서 30초 동안 스피닝한 다음 상등물을 제거하고 세파로즈R을 0.1%V/V 트리톤 X-100이 함유된 인산염 완충염수(10mM 인산염, 0.14M 염수, 이것은 검정 동안 내내 사용된 시스템 완충액이다) 중에 현탁시킨다. 저장 동안에 이 매질에 0.1%V/V의 나트륨 아지드를 가하여 세균성장을 억제시킨다.
500μl의 베드용량을 갖는 컬럼을 이용하여 방사성 면역검정법을 수행한다. 형광면역검정법은 제조된 세파로즈R200μl의 베드용량을 갖는 컬럼을 이용하여 수행한다. 컬럼의 내부직경은 7mm이며 컬럼은 배출구에 유리원료 혼합물을 갖는다. 컬럼 아래로 연결되고 필요한 경우 형광계 아래로 연결된 연동펌프를 이용하여 완충액 유동을 설정한다. 컬럼 용출물의 개개 분취량을 모으고 이들을 섬광계수계 또는 200μl 큐벳이 장착된 SLM 8000 형광계 상에서 검정한다. 연속적 모니터를 위해서는 용출물을 8μl 유동셀과 900볼트의 PMT 고전압세트가 장착된 스펙트로비젼 형광계에 적용시킨다. SLM 8000 및 스펙트로비젼 형광계 모두는 방출광을 위해 515mml 대역필터를 장착한다.
연속 유동조건 하에서 자유 항원 DNP에 의해 컬럼으로부터 표지된 디니트로페놀(DNP)이 대체될 수 있었음을 보여주는 초기 연구는 대체량을 가장 정확하게 정량하기 위하여 요오드화된 DNP-결합체를 사용하였다. 제3도의 데이터는 저수준의 자유항원에 의해 표지된 항원이 대체되었음을 보여준다. 항원의 2차 및 3차 첨가 후 대체된 표지항원의 양은 감소하였으나 계속해서 측정 가능하였다.
검출의 감도를 증가시키기 위하여 시스템을 실행하기 위해서 뿐만 아니라 표지된 항원을 제조하기 위한 조건으로 실시되었다. 시험된 시스템 파라메터는 고상 지지체 상의 항체밀도 및 유속을 포함한다. 증가된 시그널이 보다 높은 항체밀도 및 결과적인 보다 높은 밀도의 고정된 항원과 함께 나타났다(제4도).
이것은 아마도 항체/표지된 항원 복합체를 대항하는 자유항원의 증가를 반영한다. 이 특수한 항원/항체 조합물의 최적 유속은 약 0.3ml/분(표 Ⅰ)이었다. 0.5ml/분에서 표지된 항원이 컬럼의 유체 다운스트림드에서 더 적게 검출되었다. 유속을 감소시키는 것은 검출된 다수의 형광성 항원을 증가시키지만 유속이 0.1ml/분에 접근할 때 표지된 항원은 보다 큰 양으로 분배되고 형광피크는 덜 정확한 시그널 대 잡은 분해를 야기하면서 넓어졌다.
시스템이 유용하도록 하기 위하여 표시된 항원이 대체가 특정한 표적물 항원의 존재 하에서만 발생하는 것이 기본이다. 그 반응의 특이성을 확인하기 위하여 인슐린, 글리신, 라이신, 슈크로오스, 0.1% 트리톤 X-100, 및 소혈청 알부민을 포함하는 화합물을 교환기에 도입했다. 이들 중 어느 것도 표지된 항원을 대체하지 않았다.
전형적인 실험으로 먼저 세파로오스 에 결합된 항-DNP 항체를 방사 표지된 DNP 결합체와 혼합했다. 세척 후에 50μl 베드용적 컬럼을 준비하고 다양한 양의 항원, 라이신에 결합된 DNP(DNP-라이신)를 완충제 스트림 및 방사활성을 측정하기 위해 용출액으로부터 수집된 분취량에 도입했다. 샘플 크기는 컬럼에 채워진 DNP-라이신 모두 4ng부터 12ng까지 이었다(표 Ⅱ). 4ng DNP-라이신에서 그 시그널은 2X 백그라운드보다 적었으며 이것은 이 검정을 위한 검출의 한계가 더 낮게 측정되었다.
400μl 분별물이 수집되었고 그 활성은 섬광 계수기에서 측정되었다. 피크활성도가 보고된다. 방사 표지된 시그널분자를 이용하여 표적물 항원을 검출하는 것과 유사하게 형광-표지된 시그널분자 역시 이 검정 시스템을 사용할 수 있다는 것이 나타났다. 세파로스 에 결합된 항-DNP 항체의 컬럼을 준비했다. 방사표지 대신에 형광 DNP-결합체를 시그널분자로 사용했다. 다시 다양한 양의 DNP-라이신을 그 시스템(0.3ml/분으로)에 채웠을 뿐만 아니라 특이성 대조군으로 공급하기 위해 DNP없이 라이신을 그 시스템에 채웠다. 그 결과는 표 Ⅲ에 나타냈다. 이들 실험에서 반복적으로 얻어진 가장 작은 검출 가능 샘플크기는 200μl에서 20ng DNP-라이신이었다.
형광단위는 3실험의 평균 피크영역을 나타낸다.
끝으로, 형광/DNP 항원/항체쌍(항체 친화도; 10 )을 갖는 유동형상에서 시스템의 감도 수준은 0.35ml/분의 최적 유속을 이용하여 측정되었다. 제5도는 전형적인 실험을 도시한 것이다. 항원은 0.2ml에 5ng의 농도로 검출될 수 있다(14×10 분자). 항원의 더 높은 농도는 전의 이동으로부터 표지된 항원의 소모가 명백하게 되는 점까지 비례하여 더 큰 응답성을 발생시킨다. 그러나, 별개의 양성시그널은 250ng 샘플이 25, 50, 100 및 250ng 항원의 첨가 후에 첨가되었을 때까지 발생되었다.
[실시예 2]
트리니트로톨루엔(TNT)의 검출
TNT에 대하여 특이적인 마우스 모노클로날 IgG 항체를 세파로오스 4B 위에 고정시켰다. 이용 가능한 항원 결합부위를 형광 TNT-결합체로 채웠다. 그 지지체를 200μl 베드용적 컬럼을 만드는데 사용했다. 인산 완충염(PBS, 10mM 인산), pH 7.6, 0.1% V/V 트리톤 X-100의 완충액 유동을 설정했다. 용출이 스펙트론비젼 포터블 형광계에 검출되었으며 형광계의 출력이 스트립차트 기록지에 기록되었다. 안정한 기준선이 얻어진 후에 8μg/ml에서 라이신의 200μl 샘플을 시스템의 특이성을 체크하기 위해 장치의 윗부분에 채웠다.
시그널은 얻어지지 않았다. 다음에 PBS-트리톤 200ng TNT를 함유하는 새롭게 제조된 용액의 200μl 샘플을 컬럼에 도입했다. 기준선보다 두배 더 큰 신호가 일치되게 발생되었다. 그 결과는 표 Ⅳ에 요약되었다.
이 실시예는 본 발명의 접근이 수용액 샘플에서 TNT를 특수하게 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
표적물 형광성을 이용한 연속적인 유동에서의 표적물검출 유속은 0.32ml/분이었고 베드용적은 200μl이었다.
[실시예 3]
코카인의 검출
코카인의 검출을 위해 200μl 베드용적 컬럼을 항 코카인 항체(바이오 디자인) 및 형광 벤조일에크고닌을 이용하여 상기에서와 같이 설정하였다. 검정은 스펙트로비젼 및 8μl 유동셀을 이용하여 연속적인 유동 조건하에서 실행했다. 다양한 코카인 농도 및 샘플량을 컬럼에 부착시켰다. 그 결과는 표 Ⅴ에 요약되었는데 40ng의 코카인보다 적은 양이 유동 스트림에 샘플도입 후에 20초 이하에서 5:1보다 더 큰 시그널 대 잡음율과 함께 면역센서에 의해 검출될 수 있다.
컬럼베드 용적은 200μl의 항체-피복 세파로스 이었으며 완충액 유속은 0.72ml/분이었다.
본 발명의 유동 면역센서에서는 형광단 또는 프로테오라이시스의 첨가에 의해 항체를 변성시키는 것이 필요하지 않다. 그러한 변성은 항체 활성의 손실을 가져올 수 있고 항체 친화성에 영향을 미칠 수 있다. 또한 힛 앤드 런 시스템이 의존하는 약한 항체-항원 상호작용(기이즈 등, ibid)은 컬럼 외부에서 세척되는 만큼 표지된 성분이 반복적으로 방출되지 않으므로 연속적인 유동시스템에서는 생산적이지 않을 것이다.
상기 기술을 고려할 때 본 발명의 많은 변형이 가능함이 명백하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위 안에서 상세하게 설명된 것 이외에도 실시될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다.

Claims (39)

  1. (a) 표적물에 특이적인 항체를 제공하고, (b) 표지된 항체-항원 복합체를 형성하도록 표적물의 표지된 동족체에 항체의 결합부위를 노출시키며, (c) 표지된 항원-항체 복합체를 통과한 표적물을 함유하는 액체배지를 유동시키고, (d) 표적물은 표지된 동족체와 대체시키며, (e) 대체된 표지 동족체를 검출하는 것을 포함하는 표적물 성분의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적물이 티록신, 고밀도 지방단백질, 저밀도 지방단백질, 콜레스테롤, 알부민, α-1 항트립신, β-2 마이크로글로블린, 셀룰로플라스민, C1 억제자, C1q, C-반응성 단백질, α-2-간 단백질, 크리오피브리노겐, 페리틴, 미엘린 기본 단백질, 트랜스페린, 인슐린, 인간 융모막 고나도트로핀, 에스트로겐, 프로게스테론 또는 세균성 수막염, H. 인플루엔자, N. 수막염, S. 뉴모니아, 보르디텔라 페르투시스, 보렐리아 부르그도르페리, 스타필로코커스, 스트렙토코커스와 같은 병원체로부터 유도된 항원, 테오필린, 디곡신, L-도파, 인슐린, 코카인 및 그 신진대사물, 마리화나 신진대사물, 헤로인, 몰핀 신진대사물, TNT, RDX, PETN 또는 다른 폭발성 물질, 생물학적 살상제, 화학적 살상제, 독소, 니트로 벤젠, 이소티오시아네이트, 수질 및 대기오염물, 발효공정요소 및 기질의 효소적 전환물질로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 방사 표지된 항원-항체 복합체가 수용성으로서 분자당 하나의 항원성 부위를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지, 형광단, 발색단, 전기활성그룹 및 전자스핀표지로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지 및 형광단으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 액체배지가 물, 완충액 및 수성 샘플 희석액제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 액체배지가 물, 완충액 및 수성 샘플 희석액제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 액체배지가 물, 완충액 및 수성 샘플 희석액제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 액체배지가 물, 완충액 및 수성 샘플 희석액제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 완충액이 인산염-완충염수, 붕산염-완충염수, TRIS염수, 알세이버액 및 링거액으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 액체배지가 분당 약 0.1-2.0ml의 속도로 유동함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제3항에 있어서, 액체배지가 분당 약 0.1-2.0ml의 속도로 유동함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제6항에 있어서, 액체배지가 분당 약 0.1-2.0ml의 속도로 유동함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 액체배지가 분당 약 0.1-2.0ml의 속도로 유동함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 액체배지가 분당 약 0.3-0.8ml의 속도로 유동함을 특징으로 하는 방법.
  16. 샘플을 수집하기 위한 샘플수집수단; 챔버, 챔버에 있는 지지배지, 표적물을 특이적으로 그리고 민감하게 인식하는 배지 위에 고정된 항체 및 항체와 함께 항원-항체 복합체를 형성하고 표적물에 의해 쉽게 대체되는 표지된 항원을 포함하는 샘플 수집수단에 연결된 교환기; 연결부로부터 수집기까지의 최대 유동 통로 거리에서 교환기에 연결된 검출장치; 액체를 함유하는 저장기; 수집수단, 수집기 및 검출장치를 통하여 개별적으로 액체를 계속적으로 유동시키기 위한 유동수단; 검출장치로부터 오는 폐기물을 처리하거나 수집하기 위해 검출장치에 연결된 처리수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 유동면역센서.
  17. 제16항에 있어서, 액체배지가 물, 완충액 및 수성 샘플 희석액제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  18. 제17항에 있어서, 완충액이 인산염-완충염수, 붕산염-완충염수, TRIS염수, 알세이버액 및 링거액으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  19. 제16항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지, 형광단, 발색단, 전기활성그룹 및 전자스핀표지로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  20. 제17항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지, 형광단, 발색단, 전기활성그룹 및 전자스핀표지로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  21. 제18항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지, 형광단, 발색단, 전기활성그룹 및 전자스핀표지로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  22. 제19항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지 및 형광단으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  23. 제21항에 있어서, 표지된 복합체의 표지가 방사성표지 및 형광단으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  24. 제16항에 있어서, 검출기가 방사활성 측정장치와 검출된 방사활성의 양을 표시하기 위한 수단을 포함함을 특징으로 하는 센서.
  25. 제22항에 있어서, 검출기가 방사활성 측정장치와 검출된 방사활성의 양을 표시하기 위한 수단을 포함함을 특징으로 하는 센서.
  26. 제16항에 있어서, 검출기가 최소한 빛을 발생시키도록 형광단을 여기시키기 위한 발광원 및 발생된 빛의 양을 검출하고 판독된 빛의 양을 표시하기 위한 판독수단을 함유함을 특징으로 하는 센서.
  27. 제23항에 있어서, 검출기가 최소한 빛을 발생시키도록 형광단을 여기시키기 위한 발광원 및 발생된 빛의 양을 검출하고 판독된 빛의 양을 표시하기 위한 판독수단을 함유함을 특징으로 하는 센서.
  28. 제16항에 있어서, 표적물 교환기와 그 표적물 교환기에 평행하게 있는 대조 교환기를 갖는 것을 특징으로 하는 센서.
  29. 제17항에 있어서, 표적물 교환기와 그 표적물 교환기에 평행하게 있는 대조 교환기를 갖는 것을 특징으로 하는 센서.
  30. 제23항에 있어서, 표적물 교환기와 그 표적물 교환기에 평행하게 있는 대조 교환기를 갖는 것을 특징으로 하는 센서.
  31. 제25항에 있어서, 표적물 교환기와 그 표적물 교환기에 평행하게 있는 대조 교환기를 갖는 것을 특징으로 하는 센서.
  32. 제27항에 있어서, 표적물 교환기와 그 표적물 교환기에 평행하게 있는 대조 교환기를 갖는 것을 특징으로 하는 센서.
  33. 제16항에 있어서, 각 교환기가 약 0.1-05ml의 용량을 가짐을 특징으로 하는 센서.
  34. 제28항에 있어서, 각 교환기가 약 0.1-05ml의 용량을 가짐을 특징으로 하는 센서.
  35. 제32항에 있어서, 각 교환기가 약 0.1-05ml의 용량을 가짐을 특징으로 하는 센서.
  36. 제16항에 있어서, 지지매체가 활성 폴리사카라이드 비드, 실리카 비드, 유리 비드, 중공섬유 및 활성 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  37. 제19항에 있어서, 지지매체가 활성 폴리사카라이드 비드, 실리카 비드, 유리 비드, 중공섬유 및 활성 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  38. 제26항에 있어서, 지지매체가 활성 폴리사카라이드 비드, 실리카 비드, 유리 비드, 중공섬유 및 활성 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
  39. 제33항에 있어서, 지지매체가 활성 폴리사카라이드 비드, 실리카 비드, 유리 비드, 중공섬유 및 활성 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 센서.
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