JPS61132869A - 免疫学的分析方法 - Google Patents

免疫学的分析方法

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JPS61132869A
JPS61132869A JP25520684A JP25520684A JPS61132869A JP S61132869 A JPS61132869 A JP S61132869A JP 25520684 A JP25520684 A JP 25520684A JP 25520684 A JP25520684 A JP 25520684A JP S61132869 A JPS61132869 A JP S61132869A
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玉川 彰
Makoto Nakamura
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Toshiaki Kumazawa
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    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (技術分野) 本発明は免疫学的分析方法に関するものである。
(従来技術) 血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等の蛋白質、
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構、造が類似し
ていたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では
同定、定量が困難である。そこで、これらの物質の分析
には、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方
法が用いられている。
このような免疫学的分析方法には、例えば標識物質を用
いるものとして、RIA(ラジオイムノアッセイ) 、
BIA(エンザイムイムノアフセイ)、PI^(フルオ
ロイムノアッセイ)等がある。また、これらの標識物質
を用いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質
で標識した抗体(抗原)とサンプル中の抗原(抗体)と
が抗原抗体反応を起こした免疫複合体(Bound )
と、抗原抗体反応に関与せず、自由(Free)な状態
で残余する標識抗体(抗原)と分離する掻作いわゆるB
−F分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としな
いホモジニアス法とに分類される。
上記のへテロジニアス法による分析方法としては、特開
昭53−10495号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してB−F分離を行なうようにしたもの
が提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物質(
Free)を選択的に吸着し、免疫複合体(Bound
 )を吸着しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を
有するゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤とし
゛て用いてB−F分離を行なうというものである。
しかし、このようにB−F分離をカラムクロマトグラフ
ィーを用いて行なうものにおいては、免疫複合体の大き
さや形状にばらつきがあったり、免疫複合体と遊離物質
との大きさが近接しているとB−F分離が困難となり、
精度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブリン等の
試薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に
類似した分子の測定には使用できず、分析項目が極めて
制限 ゛される。
(発明の目的) 本発明の目的は、上述した不具合を解決し、B−F分離
を常に確実に行なうことができ、所望の分析を容易にか
つ高精度にできる免疫学的分析方法を提供しようとする
ものである。
(発明の概要) 本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、抗原または
抗体を所定の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗
原または抗体を固相化した担体とを反応さ″せた後、そ
の反応液中の前記担体に結合した標識抗原または抗体と
、結合しないそれとを分離してから、前記担体に結合し
た標識抗原または抗体をフローサイトメータにより測定
して前記サンプル中の所定の物質を分析することを特徴
とするものである。
(実施例) 第1図は本発明方法を実施するフローシステムの一例を
示すものである。
本例では、抗原を含んだサンプルをサンプル採取装置1
で採取し、試薬(担体および標識抗体)を試薬注入装置
2より注入した後、反応槽3で抗原抗体反応を起こさせ
る。その後、反応液を分離装置4に通して抗原抗体反応
に関与しなかった残余の標識抗体(Free)を排液槽
5に排出してB−F分離した後、稀釈装置6で担体を含
む免疫複合体(Bound )を緩衝液等で稀釈してフ
ローサイトメータのフローセルフに流す。ここで、レー
ザ光8の照射により生じた散乱光と蛍光を各ディテクタ
9および10により検出し、その出力をデータ処理装置
11で処理してサンプル中の所定の抗原を分析する。
第2図は、本発明の分析方法における反応模式図の一例
を示すものである。本例において、符号21は担体に用
いるラテックスで、例えば5μの均一な径のポリスチレ
ン製のものに物理的吸着により、固相抗体22が固相化
されている。符号23はサンプルである血清等に含まれ
ている分析対象となる抗原で、符号24は抗原23に特
異的に結合する抗体をFITC等の螢光物質で標識した
標識抗体である。
また、符号25は抗原抗体反応後の免疫複合体(Bou
nd)であり、符号26は残余の標識抗体(Free)
である。
以下、第1図に示すフローシステムにおける作用をヒト
■gEの分析を例にとって説明する。この場合、第2図
に示すラテックス21には抗ヒ)IgEモノクロナル抗
体22を吸着させる。モノクロナル抗体の使用は、より
特異的に抗原と結合させる目的による。また、サンプル
としての抗原は、ヒトIgE 23とし、標識抗体24
にはFITC標識抗ヒトIgB抗体を用いる。なお、標
識抗体24は非特異吸着を少な(、また反応速度を高め
る目的でFabフラグメントを用いるのが望ましい。反
応は、反応用緩衝液200μβを収容する反応槽3に、
固相抗体結合ラテックス溶液50μlと、サンプルlO
μlと、標識抗体溶液50μlとをサンプル採取装置1
及び試薬注入装置2により添加して行なわせる。なお、
これらの試薬類は、全て同時に添加しても、また抗原を
固相抗体と反応させて後、標識抗体と反応させるように
逐次添加しても良い。
ここで、例えば37℃、10分間反応させると、固相抗
体−抗原−標識抗体の免疫複合体25と残余の標識抗体
26とが生成される。
その後、反応槽3から300μlの反応液を吸引し、こ
れを分離装置4において例えば第3図に示す多孔質セラ
ミック筒31に通してB−F分離する。
多孔質セラミックは孔の径が均一に出来ており、例えば
その孔径を1μとすると、反応液中の抗ヒトIgE M
CA固相ラテックス−抗原IgB −FITC標識抗ヒ
l−1gEFabフラグメントの免疫複合体25および
抗原抗体反応に関与しなかった残余の固相抗体ラテック
スは、ラテックスの大きさだけで5μあるので多孔質セ
ラミックを通過しない。
これに対し、残余の標識抗体26はその大きさがせいぜ
い数10no+であるため、多孔質セラミックを通過し
、これにより濾過の原理でB−F分離が行なわれる。
こうして、多孔質セラミック筒31を通過できずに残っ
た免疫複合体は、稀釈装置6から緩衝液を数回流して洗
浄した後、一定量の緩衝液で稀釈して第4図に示すフロ
ーサイトメータに流して測定する。
フローサイトメータは既に知られているように、細胞の
分析専用機であり、フローセルフ中のニードル35に反
応後、B−F分離を行なった溶液36を流し、レーザ光
8をその流れに照射して細胞から発する散乱光や螢光を
測定する。通常、前方散乱光はレーザ入射光とほぼ水平
に位置するディテクタ9で検知され、主に細胞サイズの
測定に用いられている。螢光は、レーザ光8の入射角に
対して垂直方向に位置するディテクタ10で検知され、
細胞表面の螢光物質等の測定に用いられる。レーザ光8
は単一波長であるため使用できる螢光色素に制限がある
が、本例の分析方法において用いる螢光色素FITCは
波長489nm近くの光を吸収して波長515rvの螢
光を発するので、この場合は波長488 nmのArレ
ーザを用いれば良い。
このようにして、フローサイトメータに通すと、ディテ
クタ9.10の出力に基いてデータ処理装置11におい
て免疫複合体の大きさと、その上に乗った゛螢光量/l
ラテックスとが測定され、これら2つのパラメータによ
って第5図に示すサイトグラムが得られる。なお、第5
図において縦軸は螢光量を、横軸は粒子径を表わす。こ
こで、抗原抗体反応に関与しなかったラテックスは、螢
光を発しないのでサイトグラム中に表現されないが、免
疫複合体を形成したラテックスは、その径のところに螢
光量に応じて示される。このようにして、螢光量測定値
が得られれば、予じめIgB抗原標品の既知濃度系列か
ら同様にして求めた螢光強度の検量線に基いてサンプル
中のIgB濃度を求めることができる。このようにして
、上述のフローシステムにサンプルを導入するだけで、
簡便な反応系によりB−F分離、測定と一連の処理を短
時間(フローサイトメータは約5000粒子/secで
測定できる)で行なうことができ、しかも定量性の高い
分析結果を得ることができる。
本発明の他の実施例においては、数種類の粒径の異なる
ラテックス粒子に、それぞれの粒径ごとに異なる抗原を
結合させた混合担体を用い、この混合担体と、種々の抗
原を含んだサンプルと、それぞれの抗原に対する特異抗
体に螢光標識した各標識抗体とを加えて反応させた後、
上記実施例と同様の原理でB−F分離してから、フロー
サイトメータにより、免疫複合体のラテックス粒子種別
の螢光強度を求める。このようにすれば、第6図に示す
ようなサイトグラムが得られるから、その各々の螢光強
度から複数の抗原濃度を同時に分析することができる。
また、本発明の更に他の実施例においては、第7図に示
すように、フローチューブ41の一部に電磁石42を設
け、またサンプルを反応させる担体として鉄芯入りの磁
性う゛テックスを用いる。このようにして、反応後のサ
ンプルを微速でフローチューブ41内を流す際に電磁石
42に通電することにより、、磁性ラテックスを吸引し
て免疫複合体43をフローチューブ41の内側面に付着
させ、残余の標識抗体44を通過させる。その後、稀釈
用緩衝液を流して洗浄してから、電磁石42をオフにし
て一定量の緩衝後で稀釈する。このようにしても、上述
した実施例と同様、B−F分離をフローシステム中で確
実に行なうことができる。
なお、上述した実施例では、担体としてラテックスを用
いたがラテックスに限らず分子量の均一な人工細胞等、
測定対象に応じて任意の形状や大きさのものを用いるこ
とができる。また、本発明は競合法による分析にも有効
に適用することができる。更に、本発明においては、担
体を用いるものであるから、B−F分離を上述したカラ
ムクロマトゲラフイーを用いて行なうこともできる。
(発明の効果) 以上述べたように、本発明によれば、抗体固相担体を用
いるから、その免疫複合体と残余の標識抗体との大きさ
が大きく異なり、したがってフローシステム中でB−F
分離を簡単かつ確実に行なうことができる。また、B−
F分離後にフローサイトメータにより測定するものであ
るから、高精度の分析結果を得ることができる。更に、
担体は任意の大きさのものを選ぶことができ、したがっ
て分析項目が限定されないと共に、複数の粒子径を用い
ることにより同時に多項目の分析を行なうこともできる
。また、フローシステムにより煩雑なり−F分離を簡略
化しており、高速度、多検体測定を目的とした自動化が
可能である。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明方法を実施するフローシステムの一例を
示す図、 第2図は本発明方法における一例の反応模式図、第3図
はB−F分離の一例を説明するための図、第4図はフロ
ーサイトメータを説明するための図・ 第5図はサイトゲラムの一例を示す図、第6図は同じく
他の例を示す図、 ・。 第7図はB−F分離の他の例を説明するための図である
。 1・・・サンプル採取装置 2・・・試薬注入装置  3・・・反応槽4・・・分離
装置    5・・・排液槽6・・・稀釈装置    
7・・・フローセル8・・・レーザ光    9,10
・・・ディテクタ11・・・データ処理装置 21・・
・ラテックス22・・・固相抗体    23・・・抗
原24・・・標識抗体    25・・・免疫複合体2
6・・・残余の標識抗体 31・・・多孔質セラミフク筒 35・・・ニードル    41・・・フローチューブ
42・・・電磁石    ;43・・・免疫複合体44
・・・残余の標識抗体 第5図 粒子径□ 第6図 粒子径□ 株式会社ト

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1、サンプルと、抗原または抗体を所定の物質で標識し
    た標識抗原または抗体と、抗原または抗体を固相化した
    担体とを反応させた後、その反応液中の前記担体に結合
    した標識抗原または抗体と、結合しないそれとを分離し
    てから、前記担体に結合した標識抗原または抗体をフロ
    ーサイトメータにより測定して前記サンプル中の所定の
    物質を分析することを特徴とする免疫学的分析方法。
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