JPS5826268A - 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、反応物質の反応によって、ｍ濁液中の粒子と
、液体との間の反応物質の分布を分析する方法、とくに
反応物質の分布を測定するために粒子を液体から分離す
る必要のない分析法に関する。

以上および以下において、次の用語は次の意味を持つ。

アナライト−分析（検定）中の溶液中の、濃度が未知で
分析操作によって決定すべき物質。

反応物質−分析操作においてアナライトとだけ反応する
ように特に選ばれた物質。

標識−測定手段によって検出することができるためＩζ
反応物質に付着された反応物質の成分〇標識の分布−反
応物質の反応および未反応部分への分類。

標識の分別−通常化学手段による固相と液相との間の分
類。

懸濁液−粒子（固相）と液体との混合物。

標識の分離−物理的手段による粒子と液体との実際の分
離。

懸濁液中の粒子と液体との間の反応による反応物質の分
布は臨床化学で通常のことである。このような分布の例
は放射線免疫試験（検定）法および螢光免疫試験法で起
こる。これらの両方法においては、溶液中のアナライト
の濃度を決定しなければならない。標識を付着させた反
応物質は特にアナライトと反応するように選ぶ。反応物
質を溶液と反応させると、反応物質の一部は反応しない
で残り、反応物質の他の部分はアナライトと反応する。

それの１ら反応した反応物質を、通常反応物質の一方（
反応したまたは未反応の）を同相にし、残りの他方を液
相のままにして反応していない反応物質から分別して分
布させる。たとえば、これは反応したまたは未反応の反
応物質を抗体を被覆したビーズ、または木炭のような固
相物質に吸着させるか、ポリエチレングリコールまたは
第２抗体のような沈殿を起こさせる物質を加えて反応し
た反応物質を沈殿させることによって行なう。そうする
と反応したおよび未反応の反応物質の懸濁液ができる。

この懸濁ｒＬを固相と液相とに物理的に分離して反応し
た反応物質部分を未反応部分から分離する。ひとたび分
離すると、各分離された部分を測定することができる。

反応物質に付着した標識は典型的には放射線免疫試験の
場合には放対性アイソトープで、螢光免疫試験の場合に
は螢光材料である。他の標識も用いられる。反応物質は
、その反応とそれ以後の分布とが濃度を決定中の特定の
アナライトによってだけ行なわれるように選ぶ。反応物
質には、その分布が通常放射検知装置によって測定でき
るために、標識を付着しである。標識の測定から決定さ
れた反応物質ｉｔＢ　５）の分布は試験操作ｌこよって
決定されるアナライトの濃虻の量的指標を表わす。放射
線免疫試験法および螢光免疫試験法の両方において、反
応物質の反応および未反応部分は２相の間で物理的手段
で分離し、それからそのいずれかを測定することができ
る。懸濁液の粒子部分または液体部分を分析してそれに
含まれる標識の定量的指標を決定する。

このようにして未知の濃度、すなわち特定のアナライト
の定量的指標が計算できる。放射線免疫試験法の場合に
は、分離された粒子または液体は標識から放射された核
放射線をシンチレーション結晶によって可視光に変換す
ることによって分析される。可視光は光電子増倍管で検
出する。螢光免疫試験法の場合には、分離された粒子ま
たは液体は電磁放射線、典型的には紫外線ビームで照射
する。そうすると分離された粒子または液体の中にある
標識は螢光を発する。螢光の強さは光電子増倍管で検出
する。したがって、免疫試験法の場合には、標識を持っ
た反応物質の反応が起こり、それ力）ら反応物質の反応
部分および未反応部分の固相と液相とへの分布と分別と
が起こる。これらの相の分離と洗浄とは大巾な人手によ
る処理を必要とし、試験操作ｌζおける不槽密さと誤り
との原因となる。

必要な粒子を含む懸濁液の顕微鏡による検査には顕微鏡
像分析（ＭＩＡ）が必要である。懸濁液の顕微鏡像を撮
り、デジタル化し、作像技術によって処理して必要な像
の選択された成分に関する情報を抽出する。このような
装置は血液のような懸濁液中の粒子の分析用に提案され
ている。

本発明によれば、粒子と液体との混合物である懸濁液中
の反応および未反応の反応物質の分布を分析する方法が
得られる。反応物質には標識を付着しである。本方法は
顕微鏡中における像検出およびパターン認識装置による
懸濁液の検査を含む〇懸濁液の像をつ（す、それを電気
信号表示に変換する。電気信号表示をデジタル形で記憶
する。それから標識の位置を突きとめ、定量することに
より像を処理してデジタル形にする。したがって標識の
分布は粒子と液体の間における反応物質の分布を表わす
。

本発明の方法は次のように実施する。＃、縄を付着させ
た反応物質を免疫試験法番ご用いる。反応物質は特定の
アナライトとだけ反応するように選びアナライトの定量
的指標を決定する。反応物質の反応および未反応部分を
粒子と液体との間で分別する。粒子および液体、すなわ
ち免役試験法から反応した反応物質および反応しなかっ
た反応物質を含む懸濁液をそれから顕微鏡で検査する。

像の視野を視覚的に検査することにより粒子数を計数す
る。免疫試験法に用いた反応物質量の知、１＆’Ｊこ基
づいて液体形の反応物質量を計算する。粒子と液体とは
反応物質の２つの異なる形、すなわち反応した形および
反応しない形の反応物質の物理的表示であるので、反応
物質と反応したアナライトの量が計算できる。したがっ
てアナライトの濃度か決定できる。

本発明の方法に適した１つの装置８第１図に示す。この
装置は懸濁液用の入口ｕｚと出口−とを持つ）０−チャ
ンバのある本体ｆｉｔｌｌを含む。通路（１ωが作像領
域である検査領域ａ印をよぎってこれらの入口と出口と
の間にある。通路１１６）には担体溶液に接続するよう
になった導ｆ（至）の入口かある。第２．３図に示すよ
うに、懸濁液の入口ｕ２には導管−の下流に通路Ｑｆｉ
内に針（至）かある。針Ｃ！優は分析すべき懸濁液を容
れる容器Ｃ１６１に接続されている。

顕゛微鏡（至）はストロボ光源ので下から照明された検
査領域ｆｆＦｊＩこ焦点を合イつせる。ストロボ光源は
米国科学器械社（Ｕ、　Ｓ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒ−ｐｐｒａｔｉｏｎ　）
の２ＵＰ１．５ランプを含む３０１８型がよい。顕微鏡
図の出力はＣＣＤカメラ（ロ）に焦点を結ぶ。ＣＯＤ・
カメラはａｃＡＢのＴＣ１１６０ＨＤ型がよい。ＣＣＤ
カメラの出力は一連の静止（スチル）こま像に変換し、
適当な電子プロセッサを・用いてこれらの像を評価する
。プロセッサは米国マサツセツツ州つオルサムのハママ
ッシステム社（Ｈａｍａｔｓｕ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎ
ｃ、　）の像分析装置（ＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓ　
Ｓｙｓｔｅｍｓ　）Ｃ−１２８５１でよい。ＣＣＤカメ
ラ図の出力は第４図に拝承する電子プロセッサに接続す
る９がよい。これは白黒ＴＶモニタ関とＣＣＤカメラで
見た像のスチルこま像を貯或するフレームグラバ（こま
保持−）とを含む。フレームグラバはモントリオールに
あるマトロツクス社（Ｍａｔｒｏｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ　）のＦＧＯ８型がよい。

２５６型のビデオリフレッシメモ１月４りに供給する。

フレームグラバとビデオリフレッシメモリとは中央処理
装置（ＣＰＵ）１４６１めマルチパスに結合スる。

ＣＰＵはインチ／ｌ／　（Ｉｎｔｅｌ　）社の８０／２
０計算機がよい。マルチパス（４引マまたエレクトロ二
ックソリューションズ社（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　５ｏ
ｌｕｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、）の４８　Ｋ　ＲＡＭ＋４し
データ社（Ｄａｔａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）のＲ
Ｍ　ｌ五７型の１６にデ、１アルポートＲＡＭとに結合
する。ビデオリフレッシメモリの出方はまたカラーモニ
タ（５２１）に結合する。モニタ（５２）は人間の検査
のために個々のスチルこまのデジタル的に増巾されたビ
デオ像を得るのに用いることができる。

デュアルポート几ＡＭ５１の第？出カはマルチパス（２
）ニ接続する。マルチパス（５４）はアドバンストマイ
クロデバイス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍｉｃｒｏ　Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ　）社のＣＰ　Ｕ　（５６）　、エレクトロニ
ックソルーションス社の４８Ｋ　ＲＡＭ（５８）、アド
バンストマイクロデバイス社の８／８型のようなフロッ
ピディスク制御装置（６０）の形のとりはずし可能な配
憶装置、および２ユニツトのシュガー１−　（８ｈｕｇ
ａｒｔ　）社製フロッピディスク記憶装−（６ツ憾接続
されている。

第１図に示した装置を用いて、免疫試験法の粒子と液体
との懸濁液を容器（ホ）から入口ａ＝経てフローチャン
バに入れる。懸濁液が検査領域１８１８通るとき懸濁液
の像を撮る。第２．３図かられ力）るように、フローチ
ャンバは検査領域−において厚さと実質的に平行な方向
につくら′れた像と同じ巾と厚さとを持つ。この像はＣ
ＣＤカメラ１３４１で電気信号に変えられる。ＣＣＤカ
メラ（至）は電気信号を複数のピクセルに分割する。各
ピクセルの振幅はギジタル化・され４８ＫｆｔＡＭ（４
８１に記載される。ＣＰＵは１象円に見られる反応物質
の標識を位置を突きとめて定量することにより像を処理
して゛デジタル形にする。標識の分布の分析は反応した
、および未反応の反応物質の分布を表わす。分析はデジ
タル作像、パターン認１技術によって行なう。そのよう
な技術は当業界では周知である（たとえば米国特許第４
，０９７，８４５号〕。

担体溶液−は懸濁液（至）を検査領域−の２つのシース
の間に運ぶ。担体溶液＠の流量を調節することにより、
検査領域ａ〜における懸濁液の厚さを調節することがで
きる。これはＣＣＤカメラ（２）で見た懸濁液（至）の
量を調節し、これは粒子対液体の比に影響する。後者は
信号対雑音比を調節する。

兎のグロブリンが放射性チロキシンと反応した、山羊の
対兎グロブリン抗体である第２抗体沈殿物中のチロキシ
ンエ　の量の、決定に本発明の方法を用いる実施例は以
下のとおりである。反応物質はガンマｊｌ！Ｉ出す放射
性アイソトープである標識を′持っている。固相および
液相の反応および未反応の反応物質を持つ溶液もガンマ
＃８申す。反応物質の標識力）らのガンマ線はｌ−のタ
リウムで活性化されたヨウ化ナトリウムのようなシンチ
レーション結晶に入射してそれから光パルスを発生する
。

ＣＣＤカメラがこれらの光パルスの像を撮り、それは傷
内の標識位置と量とを表わす。標識の位置と量とは反応
物質の位置と量とを表わす。同時に、顕微鏡とＣｇＤカ
メラとは懸濁液内の粒子の作像をする。同じ傷内の粒子
の位置と数、および反応物質の位置と数は粒子とともに
分別された反応物質の部分を決定する。反応物質の分布
はそれから計算されてアナライトの濃度の決定に用いら
れる。

本発明の方法の他の実施例においては、イソチオシアン
酸フルオロセインの標識を持つ山羊の対人免疫グロブリ
ンＧ抗体の螢光免疫試験反応物質はプラスチックのマイ
クロビーズ上に蓄積されて血清中の免疫グロブリンＧの
濃度を決定する。固体（粒子）および液体形ｌこ分離さ
れた反応および未反応の反応物質を含む懸濁液は入口１
１ｚカ）らフローチャンバの検査領域ａυに入れられる
。粒子の数と位置との表示を持つ懸濁液の像を懸微鏡圓
が撮ってＣＣＤカメラ（ロ）に記録する。これは螢光免
疫試験なので、懸濁液を放射線で照射して標識を発光さ
せる、すなわち放射線、典型的には紫外線に応答して可
視光を発生する。標識の発光も顕微鏡（至）でとり上げ
られてＣＣ１）カメラで作像される。

螢光顕微鏡におけるよ″うに適当なフィルタを用いる。

螢光によって決定された、反応物質の数と位置とを示す
標識の数と位置とは必要ｐ粒子の数と位置との像ととも
に反応物質のアナライトとの作用の分布の決定を助ける
。

従来技術においては、未反応の反応物質の反応した反応
物質からの分離は、固相または敵相内の反応物質の定量
の前に２つの相の間の分布をさせ、それから固相（粒子
）を液相から分離することによって行なう。本発明の方
法においては、必要な反応物質を含む懸濁液の液体から
粒子を分離する必要、かないことがわかる。懸濁液中の
液体内の反応物質すなわち未反応の反応物質、および粒
子と結合した反応物質との両方の定着はｒｆａ４　敗鏡
像分析法によって行なわれ、反応および未反応の反応物
質の分布の決定は液体から粒子を分離し４ｆいで行なう
ことができる。したがって、本発明の方法には、人手Ｃ
ζよる処理と、それＩＪ）ら起こる不１ｆｔ’ｆＨさと
誤りとを軽減するという利点がある。さらに、もちろん
、本発明の方法によって分析の時間が軽減され、汚染と
放射性粒子から起こる７１）も刈れないトラブルを最少
にする。

懸濁液の像は第五図に示すように靭＃説のスライド上ま
たはノロ−チャンバ内につく−ることノＪｓ’ｃ：きる
ことを強調しておく。フローチャンバの使用はもちろん
信号対雑音比を増大させる。さらに、標識は、たとえば
視覚的または光学的手段で容易に検出できる任意の団成
のものでよい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施する装置の斜視図である。 第２図は第１　［Ｎのフローチャンバの平面図である？
。 第３図は第２図の線３−３に沿った断面図である。 亀４図は第１図の装置にＪいる電子プロセッサの概略図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１１　　懸濁液中の粒子と液体との間の、標識を持っ
   た反応物質の分析法であって、 前記懸濁液の像をつくることと、 前記像を電気信号表示に変換することと、前記電気信号
   表示をデジタル形で記・１恵″ｉＪ−ることと、 ゛前記デジタル形の像を前記標識の位置の突きとめと定
   量とによって処理することと を含み、 前記標識の分布は前記粒子と液体との間の反応物質の分
   布を表わす 方法０ （２）溶液とともに粒子である固相と液体である液相と
   の２つの相の混合物である懸濁ｉ＋つくるアナライトと
   特に反応するように選ばれ、この反応は１つの相で行な
   われ、未反応のものは他の相にある、標識を持つ反応物
   質を前記溶液と反応させることによって溶液中のアナラ
   イトの量を決定する方法であって、 前記懸濁液の像をつくることと、 前記像を電気信号表示に変換することと、前記電気信号
   表示をデジタル形で記憶することと、 前記粒子または前記液体と関係した標ａ８定量すること
   によって前記像を処理することと、前記定量に基づいて
   アナライトの量を計算することと を含む方法。 （３）　　前記懸１ｌＩｊｉｌａをフローチャンバを通
   して流すことを含み、前記像はこのチャンバにおいてつ
   くら、れる、特許請求の範囲第１項または第２項に記載
   の方法。 ＋４１　　前記標識は視覚的に検出できる、特、ｆＦ請
   求の範囲第３項に記載の方法。 （５１前記フローチャンバは沖と厚さとを持ち前記像は
   前記厚さξ実質的に平行な方向にある、特許請求の範囲
   第４項に記載の方法。 （６）前記フローチャンバ内の前記懸濁液の厚さを調節
   して前記像がつくられるところの粒子と液体との比を調
   節することを含む、特許請求の範囲第５頃に記載の方法
   。 ＩＩＩ　　前記電気信号表示を複数のピクセルに分割す
   ることと、 各ピクセルの振巾をデジタル化することとを含む特許請
   求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 （８）前記標識は螢光を発する物質である、特許請求の
   範囲第７項に記載の方法。 （９）　　前記反応した液体を照射して前記標識に螢光
   を発せさせることを含む特許請求の範囲第８項に記載の
   方法。 ａａ　　前記標識は放射ｍを発する物質である、特許請
   求の範囲第７項に記載の方法。 ａｖ　　前記放射ｍを電磁放射ｆｆ！ｉＩｌζ変換する
   ことを含む特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 ａ３　　前記電磁放射線は可視光である、４！許請求の
   範囲第１１項に記載の方法。