CN103718044A - 使用基于细胞的免疫荧光法使用合成校正粒子自动测定免疫荧光灶点的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过使用合成校正粒子的免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的方法，以及实施该方法的系统和试剂盒。在一个优选实施方案中，该方法特征在于免疫荧光灶点是γH2Ax灶点。

Description

使用基于细胞的免疫荧光法使用合成校正粒子自动测定免疫荧光灶点的方法和系统
描述
本发明涉及用免疫荧光法自动测定细胞免疫荧光灶点的方法，所述方法包括提供待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以细胞和粒子固定至固相，检测合成校正粒子，随后基于对合成校正粒子的检测校正并对焦荧光显微装置和自动评价系统，将所述混合物与一种或多种结合于细胞的靶底物的抗体温育，通过所述荧光显微装置检测与所述底物结合的抗体，并且使用所述自动评价系统由所述荧光显微装置产生的图像数据测定免疫荧光灶点。在一个优选实施方案中，该方法特征在于免疫荧光灶点是γH2Ax灶点。
背景技术
使用不同免疫荧光设备和方法的不同实验室之间的免疫荧光分析的标准化和自动化代表生物测定和诊断领域中的一项重大挑战。高度敏感及选择性地检测和评价荧光信号，特别在基于细胞的测定中，已经导致作为用于生物分析和诊断中的最重要检测方法的一些方法的荧光测定法的研发。荧光检测，例如使用荧光显微术的优点涉及检测的高灵敏度、使用细胞中的靶物体的荧光标记的相对简单的方法以及凭借使用具有不同标记的不同靶物体的多重标记进行多个参数的平行分析的可能性。因此这种方法替代更复杂的方法如吸收测量法和复杂且有问题的放射测量法。
然而，间接免疫荧光试验（IIF）的手工测定和评价受各种主观因素影响并且额外地受专用装置技术参数影响。除常使用的细胞底物和试剂之外，显微镜技术还包括荧光滤光片、物镜、光源和待研究的荧光图像的分析，因而这些因素的每一种均需要标准化，以便提供可靠和可比较的结果，尤其当考虑在采用不同显微设备和方法的不同实验室之间比较时。
对于健康产业而言显示强大分析前景，但是在不同实验室之间缺少足够标准化和/或自动化的免疫荧光法的一个例子是通过检测DNA双链断裂（DSB）分析DNA损伤，其中γH2Ax是检测DNA双链断裂的已知标记。
DNA代表包含单核苷酸的聚合物，所述单核苷酸自身包含碱基、脱氧核糖和磷酸基。核DNA是遗传信息的通用载体。在细胞核中，DNA与组蛋白形成复杂的结构，所述结构以核小体的形式存在，这使得控制多种核过程成为可能，原因在于染色质的结构布置。例如，在细胞分裂期间，在染色质中出现特定形态学变化，所述形态学变化允许形成固缩的染色体，所述固缩的染色体随后对于染色体可靠地分离进入子代细胞是必需的。DNA复制和转录受复杂的酶系统调节，所述酶系统也必须与染色质相互作用，以便执行它们的功能，这代表维持细胞代谢的基础。重要的是DNA分子本身和其内部所编码的信息在各种细胞过程和核过程（例如，仅列举几例，转录、复制和细胞分裂）期间自始至终保持稳定。
细胞的DNA总是受各种代谢过程的直接或间接影响，所述代谢过程可以潜在地修饰DNA的分子结构。DNA结构的某些变化对维持或执行DNA功能是必需的，例如在产生抗体的细胞发育期间或当单个碱基甲基化时在复制后立即出现短暂的链断裂。
然而，并不将压倒性数量的此类变化（例如DSB）视作重要的或预期的事件，反而将其视为对完整生物潜在危险的突变的原因。除内源过程，例如因代谢产物诸如自由基之外，DNA损伤可以因外源过程，例如因电离、紫外辐射或致突变化学品而发生。
电离辐射可能导致许多人类的损害作用，而DNA DSB是最重要之一（1-3）。活组织的电离辐射作用是基于能量转移到细胞上，因而细胞损伤的程度取决于多种因素。最重要的是放射核素的辐射物理特性、吸收剂量、暴露持续期、生物系统的辐射敏感性、局部能量沉积以及辐射的能量密度（线性能量转移，LET）（4-7）。细胞的存活取决于其DNA的完整性，因而恶性细胞的根除可以因DNA的大量损伤而发生。作为物理过程的结果，DNA发生许多化学变化，这导致DNA损伤并因此导致突变和细胞可能死亡（8，9）。在这个意义上，生物上最相关的损伤涉及DNA的DSB和单链断口（SSB）。
在真核细胞中，DNA是高度浓缩的并定位于染色质结构内，因而染色质的基础元件是核小体，其包含围绕蛋白质核芯（组蛋白八聚物）缠绕1.7圈的146个DNA碱基对。核小体的蛋白质核芯由八聚物组成，所述八聚物包含以下每种组蛋白的两个：组蛋白H2A、H2B、H3和H4。每种核小体进一步与H1组蛋白结合，所述H1组蛋白结合连接相邻的核小体的DNA。组蛋白的修饰，如乙酰化、脱乙酰化或磷酸化，调节局部染色质结构并且因此在调控各种核功能，如复制、转录或DNA修复方面发挥作用。
在DSB后组蛋白修饰的一个例子是组蛋白H2Ax的丝氨酸139的磷酸化。丝氨酸139已经磷酸化的H2Ax常称作γH2Ax。H2Ax占染色质中的H2A群体大致10%并且似乎均匀分布。如果DSB出现，则在数分钟内H2Ax蛋白被磷酸化以形成γH2Ax。这种磷酸化借助蛋白激酶（毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ATM）、DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）、毛细血管扩张性共济失调及RAD3相关蛋白（ATR）发生（10-12）。磷酸化在DSB的最近接的区域内启动并且从那里扩展开来，从而最终H2Ax分子由DSB本身多达数百万碱基被磷酸化。可以作为灶点被检测到的核复合体涉及由γH2Ax、修复蛋白和作为细胞周期的检查点控制蛋白发挥作用的蛋白质组成的蛋白复合物。
DNA双链断裂可以使用许多方法定量，如脉冲场凝胶电泳、彗星测定法或Tunnel测定法。然而全部这些方法均显示相对低的灵敏度，这允许测定仅数个DSB/细胞。就彗星测定法而言，DSB可以与背景可靠区分的阈值是大约4Gy的辐射剂量。在这种辐射剂量，存在大约160个记录到的DNA DSB。
通过免疫化学研究，已经显示可以使用免疫荧光法，通过测量γH2Ax灶点定量DNA DSB（13）。使用这种方法，用重离子辐射后和电离的光子辐射辐射后可检测灶点的数目与DNA DSB的预期数目和预期位置成正比。这种定量DNA DSB的方法足够灵敏，从而可以在微Gy范围内测量DNA DSB。使用免疫荧光法，通过丝氨酸139磷酸化的组蛋白H2Ax（γH2Ax）的染色来定量灶点，代表了相对新且灵敏的对电离辐射作用后大量DNA DSB定量的方法。
涉及使用γH2Ax检测DSB的全部实验的大多数涉及使用荧光显微术的免疫细胞化学实验和评价和/或分析。通过这种方法，除源自实验细胞系的细胞之外，来自患者的人单核细胞也已经在暴露于电离辐射后被测试。然而，该方法或使用免疫荧光显微术测定H2Ax灶点仍是相对地费时的，易受使用者偏好和技术设备的差异影响并且总体上是一种主观分析方法（14）。对于检测γH2Ax灶点，先前仅使用手工显微方法。
使用智能软件算法的γH2Ax灶点的模式识别的描述目前限于一些学术研究（14，15）。这些研究展示了自动检测和评价γH2Ax灶点的可能性。然而，目前不存在适于用商用设置自动评价γH2Ax灶点的算法的证据。必须计数细胞中的灶点（光点）（从0至40）并且通过测试细胞中的有效数字验证结果（100个细胞/载玻片）。免疫荧光筛选方面的发展现状趋向于可以单独配置的模块化、灵活和紧凑系统，这使得测量标准化。自动化判读系统，如AKLIDES，代表了可以按灵敏和有意义方式检测荧光信号的荧光光学测量系统。这类系统包括机动倒置荧光显微镜、数码照相机、机动xy-平台和具有合适的用于评价和分析的软件的计算机。可以使用数字图像处理算法以标准化方式自动地识别并描述待检测的物体，如珠或细胞结构。
直至现在，关于是否可以使用自动检测系统获得γH2Ax灶点的模式识别，仍没有令人满意的经验或报告（16）。除了通过这类分析法产生的复杂的免疫荧光模式之外，围绕γH2Ax灶点自动模式识别的复杂化还涉及基于细胞的测定法的复杂结构。另外，没有阐明对方法的标准化而言非常重要的校正。迫切需要适宜的校正试剂，所述校正试剂使得使用自动化解释系统测定和分析H2Ax灶点成为可能。
校正γH2Ax检测法的技术问题在于用于定量信号的免疫荧光图像的多样性。明显重要性是在单独的H2Ax灶点之间存在重叠和叠掩（layover）。这些效应可以在定量时产生严重问题。另外，用来分析γH2Ax灶点的系统中基于细胞试验的各种和不同特性代表针对程序标准化的严重挑战（17，18）。
自动显微解释系统可以使用分析系统的技术组件，如流通细胞测定术中常使用的校正剂（例如合成性微粒）标准化。
用于这类自动标准化的智能算法由测定提供该算法的指导原则限定（19-21）。通过排除主观影响因素，自动化客观方法充分适合这类标准化。在这个意义上，乍一看来，自学习系统似乎是技术上合适的。然而，在仔细检验后，表明自学习系统实际上不适于γH2Ax灶点分析的标准化。具有自学习软件（尤其可以修改已知模式并且还从使用者接收关于新模式的输入的软件）装置的世界范围分布将改善每个独立实验的独立分类成功率。然而，现状是每种独立自学习系统倾向于彼此独立开发，从而学习过程倾向于向越来越远离系统中提供的原始数据而推进（20，21）。这种情况的结果是自学习系统提供局部（特定实验室）改善，而不是增强共同的实验室间标准化。
因此，用统计学上定义的使用标准分析参比试剂（如微粒）的方法，γH2Ax灶点的世界范围分类标准才能校正该方法，那么这为自动化光学解释提供基础。
发明简述
通过并入标准化试剂和方法，可以建立与遍及世界的不同技术设置相容的分析平台。技术设置的差异涉及不同显微镜设置、产生荧光的不同方法或用于检测荧光灶点的不同软件设置。标准化方法克服这些差异并且最终使精确和可靠地测量生物样品中的荧光灶点成为可能。在本发明的一个方面，这随后可能增强疾病诊断的准确度，诸如由改变的免疫荧光灶点数目，例如DNA双链断裂数目增加所代表的疾病诊断。当荧光灶点的测量作为标记表示疾病并且标准化方法大规模用于研究这类标记时，分析和诊断的可靠性大幅度地增加。另外，可以随时间推移汇编数据，导致可获得巨大数据集以用于进一步诊断。仅通过标准化方法，可以在准确度方面改善自动化诊断，这需要可以在不同显微设置上可靠地用于定量，获得相同的可量化结果的新方法。在目前，现有技术中没有记载用于荧光灶点数标准化评估，适于分析如本文所述的生物样品的可靠方法。
根据现有技术，本发明基础下的技术问题是提供用免疫荧光法客观地自动测定免疫荧光灶点的方法。
这个问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。
因此，本发明的一个目的提供用免疫荧光法自动测定细胞免疫荧光灶点的方法，所述方法包括：
a.提供待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以将细胞和粒子固定至固相，
b.检测合成校正粒子，随后基于合成校正粒子的检测将荧光显微装置和自动化评价系统校正并对焦，
c.将所述混合物与一种或多种结合至细胞的靶底物的抗体温育，
d.通过所述荧光显微装置检测与所述底物结合的抗体，以及
e.使用所述自动化评价系统由所述荧光显微装置产生的图像数据中测定免疫荧光灶点。
本发明可以用于自动测定荧光显微术中出现的任何免疫荧光灶点。在一个优选实施方案中，该方法特征在于所述免疫荧光灶点是γH2Ax灶点。H2Ax灶点特别适于采用本发明方法分析和/或测定，原因在于它们在细胞核内部的尺寸和其他视觉特征和物理特征。鉴于胞核内簇集空间分布的灶点的潜在重叠，由于H2Ax灶点的尺寸，定量可能变得非常困难。本发明解决了该问题并且使得可靠自动化定量分析H2Ax灶点成为可能，这代表与那些先前已知方法相比令人惊讶和有利的进步。
在一个优选实施方案中，该方法特征在于所述合成校正粒子是微粒，优选地具有1-100μm之间的直径。直径范围1-100μm的粒子包括直径为大约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μm和落在该范围内任何值的粒子。然而，粒子可以具有任何尺寸，只要所述粒子适于对焦和校正所述显微系统。这种特定尺寸（直径1-100μm）的粒子令人惊讶地有利，因为它们为显微装置提供适宜的校正而与待分析的灶点尺寸无关。可以使用以这种尺寸的粒子校正过的系统可靠地分析H2Ax灶点，以及更大或更小的灶点。
在一个实施方案中，该方法特征在于使用荧光标记特异性标记所述合成校正粒子和/或抗体。在一个优选实施方案中，在启动该方法或系统之前，已经用荧光试剂标记粒子。粒子也可以使用荧光标记的抗体或其他这类手段进行标记，以便可以为校正而检测并且测量粒子。如果需要，结合粒子或与灶点相对应的细胞底物的独立抗体（每个均显示不同的荧光标记）可以在校正之前与固相表面上的细胞和粒子共温育。粒子的物理或其他特征也可以用于检测粒子和后续校正，如形状、颜色或反射特性，从而显微装置的校正和对焦不依赖于荧光，而依赖于使用任何合适的方法检测粒子。
在一个优选实施方案中，该方法特征在于所述抗体涉及一种或多种与细胞的靶底物结合的第一抗体，和一种或多种经荧光标记并且与第一抗体结合的第二抗体，从而促进作为免疫荧光灶点的结合底物的检测。
在一个优选实施方案中，该方法特征在于所述细胞选自单核细胞血细胞，如淋巴细胞、单核细胞和/或巨噬细胞，体外培养的细胞如成纤维细胞，或来自实验细胞系的细胞。分析从血液获得的细胞或本文所述的其他细胞提供了预料不到的优点：细胞可以容易地和可靠地迅速固定至固相用于分析，从而结合所述粒子，待分析的物体处于固定的位置，因此使得可靠定量成为可能。
在一个优选实施方案中，该方法特征在于：步骤b）中的所述校正或步骤e）中的所述测定包括通过检测染色或标记的细胞核，优选地通过检测DAPI染色的细胞核，额外地检测并定位细胞。其他染色法可以用于检测DNA并因此测定细胞核位置，如Hoechst染色法或其他结合或鉴定DNA的试剂。在一个优选实施方案中，该方法特征在于所述测定提供每个细胞的灶点数的测定。每个细胞的灶点的计算结果最终在允许与其他数据集比较的自动化分析中提供信息。这种定量可以用于诊断与灶点数量变相关的任何给定疾病。
在一个优选实施方案中，该方法特征在于：步骤e）的所述自动化评价系统包括具有将可执行指令作为软件储存的计算机可读存储器的计算装置，所述计算装置由模块组成，当由计算机执行时，所述模块执行自动对焦控制、自动化图像采集、自动化图像分析和/或自动化模式识别的功能。评价系统允许基于显微装置产生的图像数据分析和计算灶点数。为了实施灶点数的这种评价和测定，就各个灶点的形状、尺寸和强度自动地分析图像。因此鉴定灶点的规则体现在在评价系统的计算装置上运行的计算机程序中。
在一个实施方案中，该方法特征在于借助显微图像的动态自动对焦发生荧光显微装置和自动化评价系统的对焦。
本发明还涉及如本文所述的方法用于测定细胞和/或细胞群体中DNA双链断裂的数目的用途，其中γH2Ax灶点的数目与DNA双链断裂的数目成正比。如上文所述的，了解了在DNA损伤的背景下作为形成H2Ax的基础的关系和生物学机制。然而，仍不可获得用于可靠地自动定量这类灶点的方法。
本发明进一步涉及如本文所述的用途，其用于测定细胞和/或细胞群体中的DNA损伤，借以
a.将测试细胞中γH2Ax灶点的数目与对照细胞中γH2Ax灶点的数目比较，并且
b.与对照细胞相比，测试细胞中每个细胞的H2Ax灶点数目更多表示测试细胞中DNA损伤增加。
在一个优选实施方案中，如本文所述的方法适用于测定细胞和/或细胞群体对电离或任何其他类型辐射或任何其他DNA损伤性物质或治疗的辐射暴露。使用如本文所述的方法，获得关于已经在细胞或细胞群体中出现的DNA损伤的定量性信息，因而深入了解作为疾病基础的机制或鉴定疾病，例如在鉴定癌症患者或癌症风险患者的诊断性应用中使用该方法时。
使用γH2Ax检测以测定DSB诱导的程度可能有助于检测癌前期细胞、癌症分级、检测癌症疗法的有效性和开发新抗癌药物。
本发明还涉及通过根据如本文中所述方法的用免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的系统，所述系统包括
a.待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以将细胞和粒子固定至固相，
b.荧光显微装置，包含带有照相机、机动扫描台和多通道发光二极管（LED）的荧光显微镜，和
c.自动化评价系统，包括具有将可执行指令作为软件储存的计算机可读存储器的计算装置，所述计算装置由模块组成，当由计算机执行时，所述模块执行自动对焦控制、自动化图像采集、自动化图像分析和/或自动化模式识别的功能，借以分析两个以上颜色通道，每个通道对应于合成校正粒子或靶底物相关的免疫荧光灶点。
专门开发本发明的系统用于实施如本文所述的方法。该系统包含直接并且特别地与该方法相关的组件，因而构成统一的发明。该系统的内容物和在如所述方法中应用的那些试剂代表对现有技术的独特贡献，因此证明本发明的单一性。本发明也涉及试剂盒，其被明确地开发以用于实施本发明的方法。就该系统而言，试剂盒包含针对本发明所定制的内容物（例如具有固定粒子的载玻片），因此代表统一的发明的一个方面。
本发明因此还涉及用于实施根据如本文中所述方法的用免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的方法的试剂盒，所述试剂盒包含
a.一种或多种固相，包含固定至所述固相表面的合成校正粒子，待分析的细胞将固定在所述固相表面上，
b.一种或多种偶合物，包含与荧光标记物偶联，优选地用作第二抗体的免疫球蛋白特异性抗体，和任选地
c.洗涤缓冲液、盖玻片、覆盖介质和/或用于合成校正粒子、第一抗体和/或第二抗体的荧光标记物。
发明详述
合成校正粒子涉及任何物质或材料（例如本领域已知的适用于本发明方法的那些）的微粒、珠或载体，例如，由天然或人工聚合物、琼脂糖凝胶、纤维素、玻璃或金属氧化物组成的微粒、粒子或珠。校正粒子能够用荧光标记标记或优选地是已经具有荧光的，从而不需要额外的荧光标记物。荧光标记物可以指本领域共知的那些，如荧光蛋白如GFP，或罗丹明、荧光素或其衍生物如FITC、TRITC或任何种类的合适荧光团。
待检测的靶底物涉及在细胞内部和/或在细胞上空间分布的细胞结构，在抗体结合和/或检测后，所述细胞结构导致免疫荧光灶点形成。
因此，本发明的细胞免疫荧光灶点是对于作为任何直径或形状的免疫荧光点的检测而言足够清晰的任何免疫荧光图像物体，所述细胞免疫荧光灶点的特征在于它与图像的背景可区分。灶点尺寸、形状或其他视觉特征也可以测量并且并入本发明方法的分析结果中。
术语“自动化”涉及一种某种程度、优选地巨大程度或完全在没有使用者直接介入的情况下实施的过程，因而减轻系统和/或方法受使用者的主观影响。
免疫荧光法是涉及抗体与目的底物结合或相互作用或抗体样分子（如抗体片段或非抗体肽）与目的底物结合并随后基于荧光检测所述相互作用的任何测定法。
待分析的细胞和合成校正粒子的混合物涉及以任何比例的混合物。校正粒子的数目仅必须是足够的以便显微镜可以检测它们并且执行校正和对焦。粒子可以比细胞多或细胞比固相表面上的粒子多。
术语“固定”或“固定化”涉及使细胞与固相结合或连接的任何方法。原则上，固定涉及对粒子和细胞的物理约束，因而可以进行可靠的定量，即便显微镜穿过固相的多个区域拍摄各种图像。
术语“固相”优选地涉及载玻片，但是可以涉及提供表面用于分析粒子和细胞的任何固相。可以使用玻璃或合成材料（如塑料）的显微镜载玻片，也可以使用任何微量滴定平板或可以进行微粒和细胞固定的其他孔样结构。术语“固相、载玻片或分析表面”可以在本申请通篇范围内互换使用。
合成校正粒子的“检测”主要涉及测量粒子的尺寸、形状或其光强度或荧光强度。粒子的任何特性可以用于检测和后续校正和对焦，只要该特性允许使用本发明的显微装置检测。
显微装置和/或评价系统的校正涉及对装置设置的任何必要调整，如被认为对最佳图像采集必需的。这类校正测量是显微术领域技术人员已知的。
显微装置的对焦涉及如本领域技术人员所理解的对焦，以便获得清晰图像。如下文实施例中所用，一个例子是通过样品的微粒的去卷积计算点扩散函数（PSF），并且该PSF随后用于分析灶点。
荧光显微装置和自动评价系统一般如本领域和基于计算机的评价系统中常用的显微装置，其中所述评价系统能够实施用于检测和分析图像数据的基于软件的算法。下文提供实施例。
附图
本发明由附图进一步描述。这些图不意在限制本发明范围。
附图简述
图1：在具有校正微粒的载玻片上的被辐射的固定细胞中γH2Ax灶点的免疫荧光图像捕获。
图2：使用标准化微粒时自动化γH2Ax测量的示意图。
图3：考虑检测器中所测量的荧光强度的复杂的依存关系时微粒的强度测量的原理。
图4：对暴露于0和1Gy188Re后30分钟的PC Cl3细胞系中IR引起的灶点，针对磷酸化的组蛋白H2AX（γH2Ax灶点）的免疫荧光法染色。对照（小图A-C）和用1Gy辐射后（小图D-F）的代表性图像的例子。通过自动化系统AKLIDES以60x放大率拍摄照片。DAPI核染色（A，D）、对照的背景γH2Ax灶点（B）和被辐射的细胞的γH2Ax灶点（E）以及合并的荧光图像（C，F）。小图G显示捕获细胞（圆圈）的图像，伴以数字式计数灶点的结果（点）。
图5：通过数字评定数据（AKLIDES），对采用多种剂量188Re辐射的PC Cl3细胞所获得的剂量响应曲线（平均灶点数目/细胞±SD）。
实施例
本发明由以下实施例进一步描述。这些图不意在限制本发明范围。本文所述的方法用于实施如实施例中所展示的本发明中。它们意在通过实用实施例进一步描述本发明并且不代表本发明的限制说明。
实施例1：例证本文所述的使用合成校正粒子借助免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的方法：
校正微粒在载玻片上的固定
玻璃载片的每个施加点用10μl聚赖氨酸（Sigma，5μg/ml）包被并且在湿润的烘箱中温育4小时。在使用PBS从载玻片冲洗掉未结合的聚赖氨酸后，将10μl校正微粒悬液（每个施加点6000个校正微粒）吸至湿润的施加点。这种悬液随后在无菌柜下干燥并且使其停留在载玻片上过夜。
制备淋巴细胞悬液用于检测外周单核血细胞中的DSB
将试验对象的血液样品颠倒两次。将3ml未凝固的血液（比率1:1）吸到离心管的分离膜上并随后在室温以1000×g在不制动的情况下离心10分钟。使用1000μl移液器，将单核血细胞带小心地取出，并随后转移至新的离心管并放置在冰上。
全部其他步骤均在冰上进行或离心在4℃进行。将单核血细胞与相同体积的PBS混合，并将管颠倒3-4次以便混合溶液。随后将混合物以300×g（1400转/分钟）离心10分钟。使用真空泵和移液器吸头移除上清液。随后将沉淀物使用9ml蒸馏水重悬，室温温育12秒并随后与1ml冷10×PBS缓冲液混合。整个过程重复2次。
将细胞固定到具有固定的校正微粒的载玻片
在测定纯化的细胞悬液中细胞的数目后（通过计数板），将150,000个细胞接种到载玻片的每个施加点上，所述载玻片包含固定的校正微粒。将相应体积的细胞悬液吸到高压灭菌的玻璃皿上并且用培养基填充至必需体积。随后转移50μl混合的悬液至在室温下温育1小时的载玻片的施加点。
为了接种事先已经用放射性物质（例如188Re-高铼酸盐）处理的来自实验细胞系的细胞，每个施加点使用70,000个细胞。在提供相应体积的悬液后，使载玻片上的细胞在细胞离心机中以250U/分钟沉降3分钟。
在室温下在含有1%甲醛的染色托盘中进行细胞固定15分钟。在固定后，将载玻片在PBS浴中洗涤3次持续5分钟，同时温和地振摇。为透化固定的细胞，将载玻片与1%triton-X100/PBS溶液温育3次持续5分钟。随后，将载玻片在PBS浴中洗涤3次，同时温和地振摇。为封闭游离结合位点，将载玻片置于培养箱中并随后干燥。在干燥后，将25μl的1%PBS-BSA-溶液施加至每个施加点并温育30分钟。
免疫荧光染色
将细胞覆盖的载玻片置于培养箱中，并将25μl第一抗体施加至每个施加点（在PBS/BSA1%中1:1000稀释）并且在室温下温育1小时。随后，使用含有PBS溶液的淋洗瓶小心地淋洗载玻片，并此后在PBS中洗涤3次持续5分钟，伴随温和振摇。此后，将25μl荧光标记的第二抗体（在PBS/BSA1%中1:1000稀释）吸至施加点并覆盖。载玻片随后在室温下温育1小时。在温育后再次洗涤载玻片。为了在AKLIDES系统上自动解释载玻片，将覆盖介质施加至每个施加点并且小心地封装盖玻片。关于实施例图像，见图1。
使用AKLIDES系统通过校正微粒自动标准化解释细胞
AKLIDES系统的技术基础涉及倒置机动荧光显微镜IX81（Olympus，日本），其中可以通过AKLIDES软件完全控制所述荧光显微镜。通过机动xy台（IM120，
Figure BDA0000453426950000121
Wetzlar）、用于荧光图像的灵敏灰阶照相机（PS4，Kappa,Gleiche）和作为光源的可控发光二极管（LED）（PrecisExcite,CoolLed,UK）的组合，荧光检验的自动化捕获和处理成为可能。可以使用多种载玻片或平板作为样品载体，除微量滴定平板（24、48、96、384、1532孔）之外，所述载玻片由各种样式组成（1、6、12，18孔）。专门开发的软件控制各部件的相互作用并且接管试验的自动对焦和质量控制。随后在测量间，使用图像分析算法直接评价捕获的图像数据。使用不同规格的物镜（从1.25x至60x）和高透射荧光滤光片（光谱为350-700nm），可以分析和/或组合庞大数目的试验和荧光对象。
自动化γH2Ax测量的示意图，见图2。
在开始测量时，具有标准化尺寸和亮度（单位：等同可溶性荧光物质的MESF分子，来源：Schwartz2004）的微粒用于对焦。
微粒用于对焦的用途代表与所用细胞系无关的极高对焦质量。可以鉴定人为现象并从分析结果中轻易排除。另外，检测波长中的整个光路被校正。通过样品的微粒的去卷积计算点扩散函数（PSF），并且该PSF随后用于分析H2Ax灶点。通过这个校正步骤增加测量的精度，因为通过知晓PSF可以计算出焦平面外部的光。
在第二检测通道中进行灶点的测量，在所述第二检测通道中粒子用于强度和尺寸校正。图3显示检测原理和强度的计算。微粒因它们的尺寸和形状特征而被检测并且从微粒的中心测量微粒的强度。在制备时，直接通过参照测量的灶点尺寸和强度对γH2Ax灶点进行标准化分析是可能的。通过这种方案，使用如本文所述的校正微粒，可以比较多种光学检测方法和光学分解。
实施例2：例证如本文所述的方法用于测定细胞中DNA双链断裂数目、用于测定DNA损伤或用于测定细胞和/或细胞群体对电离或任何其他类型辐射的辐射暴露的用途
放射性核素
通过洗脱40GBq氧化铝基188W/188Re发生器（ITG，München，德国）获得188Re-高铼酸盐（188Re）。188Re的物理特征：物理半衰期16.9小时，最大β能量2.1MeV，γ发射155keV（15%丰度）。该发生器用5ml0.9%盐水洗脱以获得约1.0GBq/ml无载体188Re的放射性浓度。
细胞培养
甲状腺大鼠细胞系PC Cl3（核医学临床合作单位，DKFZ，Heidel-berg，德国）是在美国典型培养物保藏中心（ATCC）中可获得的FRTL5细胞系的钠碘共转运蛋白（NIS）阳性株。该细胞在Ham'sF12培养基中常规培育为贴壁单层（Gibco Invitrogen GmbH,Darmstadt，德国），所述培养基补充有5%胎牛血清、胰岛素（10μg/ml）、氢化可的松（10nM）、转铁蛋白（5μg/ml），生长抑素（10ng/ml）、甘氨酸-组氨酸-赖氨酸（10ng/mL）和TSH（10mU/ml）。使用Accutase（PAA实验室GmbH
Figure BDA0000453426950000131
德国），将指数生长的细胞每3日常规地分瓶。培养物维持在37℃、增湿的5%CO2、空气气氛下。每2-3日以及在应用放射性之前更换培养基。
辐射实验
对于实验，将0.5x106个细胞/孔的等分试样以每孔2ml无活度标准培养基的体积接种在六孔组织培养平板中并且在辐射之前预培养2天。为抑制由NIS介导的放射性核素主动转运，将细胞与充当188Re的竞争性抑制剂的0.4mM终浓度的高氯酸钠（NaClO4）预温育（23）。在与NaClO4温育10分钟后，将188Re溶液添加至细胞，每个计量点使用一个孔。使用5.7-57MBq/2ml188Re的放射性浓度，其对应于0.5-5Gy的胞外剂量（使用剂量点核函数计算）（23，24）。在37℃进行辐射1小时。在暴露于188Re后，细胞用PBS洗涤并通过添加Accutase（PAA，Coelbe，德国）收获细胞。所产生的细胞悬液在1.5ml培养基中含有约0.5×106个细胞。在辐射后立即进一步处理细胞用于γH2Ax灶点评价。
免疫组织化学和灶点分析
对于免疫染色，通过细胞离心涂片机（Hettich Universal30RF,HettichGmbH,Tuttlingen，德国），250转/分钟，3分钟，将辐射的细胞离心到玻璃载片上，每个点约70,000个细胞。随后，将细胞在室温下在4%福尔马林中固定15分钟。在固定后，用PBS洗涤细胞3次。为渗透细胞膜，添加0.1%Triton X100并温育5分钟3次，随后用PBS洗涤三次。
与PBS中的1%牛血清白蛋白（BSA/PBS）温育30分钟后，BSA/PBS中1:800稀释的抗-磷酰-组蛋白H2A.X（Ser139），克隆JBW301（小鼠，单克隆IgG1，Millipore GmbH，Schwalbach，德国）在室温下温育1小时。在三个洗涤步骤后，将1:800稀释的与Alexa Fluor488（Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国）偶联的抗小鼠IgG在黑暗下温育1小时。为了DNA染色，在另一个洗涤循环（3×PBS）后，添加4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI,Sigma-Aldrich,Taufkirchen,德国）保持10分钟。将载玻片再次洗涤两次并用荧光封固剂（Dako DeutschlandGmbH，Hamburg，德国）封装。
γH2Ax灶点的自动化解释
用于评价免疫荧光模式如H2Ax灶点的全自动化解释系统AKLIDES的概念基于新的模式识别的数学软件算法。使用具有机动扫描台（IM120，
Figure BDA0000453426950000141
德国）、400nm和490nm发光二极管（LED）（PrecisExcite,CoolLED,UK）和电荷耦合器件（CCD）灰阶照相机（DX4,Kappa,德国）的机动倒置荧光显微镜（OlympusIX81，Olympus，日本）自动评估γH2Ax灶点。
该解释系统受AKLIDES软件（Medipan，德国）控制，所述软件由用于装置和自动对焦控制的模块、具有模式识别算法的图像分析模块组成。借助灰阶转变，新的基于对象的Haralick图像表征的自动对焦过程使用DAPI作为荧光染料或使用本发明的用于对焦、质量评价和对象识别的微粒。AKLIDES系统的扫描算法依次地选择载玻片孔的位置并且以DAPI通道模式对细胞层对焦。
照相机积分时间的再调节确保细胞核正确地暴露。随后对获得的图像进行质量属性评价。在人为现象的情况下，将自动地选择新的亚孔（sub-well）位置。此后，在三个z-层中捕获检测的细胞的免疫荧光。针对每个层选择细胞特征以及组合特征使得灶点计数的计算成为可能（图2）。
自动γH2Ax灶点图像处理的技术方面
使用60×物镜，以DAPI荧光通道恰当地进行自动图像捕获过程。开始使用宽z-步骤（10μm）粗对焦，随后用窄z-步骤（0.5μm）精细对焦，可以确保检测到主焦平面。为改变荧光波长，与产生100ms的标准转换时间的双波段滤光片组合，转换激发波长。鉴于“即时（on-the-fly）”分析图像的重要性，通过分析的性能、可扩展性和质量选择算法。为了消除人为现象，通过将图像内容划分成至尺寸相等的图块随后计算图块清晰度和均匀性，进行额外的定性图像分析。通过基于直方图的阈值算法随后进行分水岭变换而进行目标分割。通过分析对象的凸度（convexity）排除细胞团块和严重受损的细胞。分段核以局部、拓扑形貌和质地/表面描述符为特征。通过计数每个细胞中离散的灶点的数目对γH2Ax灶点进行定量。离散的灶点的位置的定义是a）比8个相邻像素更亮的像素，b）1个像素与相邻灶点的最小距离（像素大小：110nm），和c）最小亮度（比细胞的平均亮度亮）。计数每个载玻片上含有100个细胞的最少10个视野。
在4图中显示暴露于0Gy和1Gy188Re后的PC Cl3细胞的免疫荧光图样的代表性图像，其通过针对γH2Ax灶点的染色和针对IR引起的灶点的核染色而获得。如果需要，可以使用DAPI作为用于另外的质量评价的荧光染料（图4A，4D）。在图4G和图5中展示自动计数的灶点的结果。
如可以在图5中见到，每个细胞核的灶点数目响应于辐射剂量增加而增加。除了手工（目视）评估荧光灶点数目之外，在用如本文所述的自动化系统测量时，观察到这种效果。这展示了本发明的自动化方法和系统用于测定细胞中DNA双链断裂数目，用于测定DNA损伤或用于测定细胞和/或细胞群体对电离或任何其他类型辐射的辐射暴露的有用性。
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Claims (15)

1.用免疫荧光法自动测定细胞免疫荧光灶点的方法，包括：
a.提供待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以将细胞和粒子固定至固相，
b.检测合成校正粒子，随后基于所述合成校正粒子的检测将荧光显微装置和自动化评价系统校正并对焦，
c.将所述混合物与一种或多种结合至细胞的靶底物上的抗体温育，
d.通过所述荧光显微装置检测与所述底物结合的抗体，以及
e.使用所述自动化评价系统由所述荧光显微装置产生的图像数据测定免疫荧光灶点。
2.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于所述免疫荧光灶点是γH2Ax灶点。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述合成校正粒子是微粒，优选地具有1-100μm之间的直径。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于使用荧光标记特异性标记所述合成校正粒子和/或抗体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述抗体涉及一种或多种与细胞的靶底物结合的第一抗体以及一种或多种经荧光标记并且与第一抗体结合的第二抗体，从而促进作为免疫荧光灶点的结合底物的检测。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述细胞选自单核细胞血细胞如淋巴细胞、单核细胞和/或巨噬细胞，体外培养的细胞如成纤维细胞或来自实验细胞系的细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤b）中的所述校正或步骤e）中的所述测定包括通过检测染色或标记的细胞核，优选地通过检测DAPI染色的细胞核，额外地检测并定位细胞。
8.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于所述测定提供每个细胞的灶点数的测定。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于步骤e）的所述自动化评价系统包括具有将可执行指令作为软件储存的计算机可读存储器的计算装置，所述计算装置由模块组成，所述模块当由计算机执行时执行自动对焦控制、自动化图像采集、自动化图像分析和/或自动化模式识别的功能。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于荧光显微镜和自动化评价系统的对焦借助显微图像的动态自动对焦而发生。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法在测定细胞和/或细胞群体中DNA双链断裂的数目中的应用，其中γH2Ax灶点的数目与DNA双链断裂的数目成正比。
12.根据前述权利要求的应用，其特征在于用于测定细胞和/或细胞群体中的DNA损伤，借以
a.将测试细胞中所述γH2Ax灶点的数目与对照细胞中所述γH2Ax灶点的数目比较，并且
b.与所述对照细胞相比，所述测试细胞中每个细胞的所述H2Ax灶点数目更多表示所述测试细胞中DNA损伤增加。
13.根据前述权利要求所述的应用，其特征在于用于测定细胞和/或细胞群体对电离或任何其他类型的辐射、任何其他DNA损伤性物质或治疗的辐射暴露。
14.根据前述权利要求中任一项所述方法的用免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的系统，所述系统包括
a.待分析的细胞和合成校正粒子的混合物，借以将细胞和粒子固定至固相，
b.荧光显微装置，包括带有照相机、机动扫描台和多通道发光二极管（LED）的荧光显微镜，和
c.自动化评价系统，包括具有将可执行指令作为软件储存的计算机可读存储器的计算装置，所述计算装置由模块组成，所述模块当由计算机执行时执行自动对焦控制、自动化图像采集、自动化图像分析和/或自动化模式识别的功能，借以分析两个以上颜色通道，每个所述通道对应于合成校正粒子或靶底物相关的免疫荧光灶点。
15.用于实施根据前述权利要求中任一项所述的用免疫荧光法自动测定免疫荧光灶点的方法的试剂盒，所述试剂盒包含
a.一种或多种固相，包含固定至所述固相表面的合成校正粒子，待分析的细胞将固定在所述固相表面上，
b.一种或多种偶合物，包含与荧光标记物偶联的、优选地用作第二抗体的免疫球蛋白特异性抗体，和任选地
c.洗涤缓冲液、盖玻片、覆盖介质和/或用于合成校正粒子、第一抗体和/或第二抗体的荧光标记。
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