JPH0588423B2 - - Google Patents
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- JPH0588423B2 JPH0588423B2 JP59255208A JP25520884A JPH0588423B2 JP H0588423 B2 JPH0588423 B2 JP H0588423B2 JP 59255208 A JP59255208 A JP 59255208A JP 25520884 A JP25520884 A JP 25520884A JP H0588423 B2 JPH0588423 B2 JP H0588423B2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は免疫学的分析方法に関するものであ
る。
る。
（従来技術）
血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等の
蛋白質、ホルモン、細菌、ウイルス等はその分子
構造が類似していたり、ごく微量であるために、
通常の分析方法では同定、定量が困難である。そ
こで、これらの物質の分析には、一般に抗原抗体
反応を利用した免疫学的な分析方法が用いられて
いる。
蛋白質、ホルモン、細菌、ウイルス等はその分子
構造が類似していたり、ごく微量であるために、
通常の分析方法では同定、定量が困難である。そ
こで、これらの物質の分析には、一般に抗原抗体
反応を利用した免疫学的な分析方法が用いられて
いる。
このような免疫学的分析方法には、例えば、標
識物質を用いるものとして、RIA（ラジオイムノ
アツセイ）、EIA（エンザイムイムノアツセイ）、
FIA（フルオロイムノアツセイ）等がある。また、
これらの標識物質を用いる分析方法は、測定系に
おいて、例えば標識物質で標識した抗体（抗原）
とサンプル中の抗原（抗体）とが抗原抗体反応を
起こした免疫複合体（Bound）と、抗原抗体反応
に関与せず、自由（Free）な状態で残余する標
識抗体（抗原）とを分離する操作、いわゆるＢ−
Ｆ分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要と
しないホモジニアス法とに分類される。
識物質を用いるものとして、RIA（ラジオイムノ
アツセイ）、EIA（エンザイムイムノアツセイ）、
FIA（フルオロイムノアツセイ）等がある。また、
これらの標識物質を用いる分析方法は、測定系に
おいて、例えば標識物質で標識した抗体（抗原）
とサンプル中の抗原（抗体）とが抗原抗体反応を
起こした免疫複合体（Bound）と、抗原抗体反応
に関与せず、自由（Free）な状態で残余する標
識抗体（抗原）とを分離する操作、いわゆるＢ−
Ｆ分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要と
しないホモジニアス法とに分類される。
上記のヘテロジニアス法による分析方法として
は、特開昭53−10495号公報において、カラムク
ロマトグラフイーを利用してＢ−Ｆ分離を行なう
ようにしたものが提案されている。これは、例え
ば溶液中の遊離物質（Free）を選択的に吸着し、
免疫複合体（Bound）を吸着しないイオン交換樹
脂や、分子ふるい効果を有するゲルクロマトグラ
フイー用の充填剤を吸着剤として用いてＢ−Ｆ分
離を行なうというものである。
は、特開昭53−10495号公報において、カラムク
ロマトグラフイーを利用してＢ−Ｆ分離を行なう
ようにしたものが提案されている。これは、例え
ば溶液中の遊離物質（Free）を選択的に吸着し、
免疫複合体（Bound）を吸着しないイオン交換樹
脂や、分子ふるい効果を有するゲルクロマトグラ
フイー用の充填剤を吸着剤として用いてＢ−Ｆ分
離を行なうというものである。
しかし、このようにＢ−Ｆ分離をカラムクロマ
トグラフイーを用いて行なうものにおいて、多項
目の分析を行なうとすると、項目毎にカラムを作
成しなければならないと共に、反応液を項目毎に
異なるカラムに吸着させる操作が必要となる。し
たがつて、費用がかかると共に、分析操作が煩雑
になり、また、各カラムにおいて免疫複合体の大
きさや形状にばらつきがあつたり、免疫複合体と
遊離物質との大きさが近接しているとＢ−Ｆ分離
が困難となり、精度が悪くなる。このため、例え
ば免疫グロブリン等の試薬として用いる抗体と同
じ分子や、化学的、物理的に類似した分子の測定
には使用できず、分析項目が極めて制限される。
トグラフイーを用いて行なうものにおいて、多項
目の分析を行なうとすると、項目毎にカラムを作
成しなければならないと共に、反応液を項目毎に
異なるカラムに吸着させる操作が必要となる。し
たがつて、費用がかかると共に、分析操作が煩雑
になり、また、各カラムにおいて免疫複合体の大
きさや形状にばらつきがあつたり、免疫複合体と
遊離物質との大きさが近接しているとＢ−Ｆ分離
が困難となり、精度が悪くなる。このため、例え
ば免疫グロブリン等の試薬として用いる抗体と同
じ分子や、化学的、物理的に類似した分子の測定
には使用できず、分析項目が極めて制限される。
（発明の目的）
本発明の目的は、上述した不具合を解決し、多
項目の分析を短時間でかつ簡便な構成で、しかも
高精度にできる免疫学的分析方法を提供しようと
するものである。
項目の分析を短時間でかつ簡便な構成で、しかも
高精度にできる免疫学的分析方法を提供しようと
するものである。
（発明の概要）
本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、複
数種類の分析項目に対応する抗原または抗体のそ
れぞれを所定の標識物質で標識した標識抗原また
は標識抗体と、複数の異なる粒径を有し、粒径毎
に異なる分折項目に対応する抗原または抗体を固
相化した複数の担体とを反応させる工程と、 反応後の担体を含む溶液を流しながら、該溶液
中の物質の粒径情報および標識物質の有無の情報
を順次検出する工程と、 この検出した２つの検出情報を粒径毎に分別し
て対応させる工程とを含み、 この粒径毎に分別して対応させた情報に基づい
て前記数種類の分析項目を分析することを特徴と
するものである。
数種類の分析項目に対応する抗原または抗体のそ
れぞれを所定の標識物質で標識した標識抗原また
は標識抗体と、複数の異なる粒径を有し、粒径毎
に異なる分折項目に対応する抗原または抗体を固
相化した複数の担体とを反応させる工程と、 反応後の担体を含む溶液を流しながら、該溶液
中の物質の粒径情報および標識物質の有無の情報
を順次検出する工程と、 この検出した２つの検出情報を粒径毎に分別し
て対応させる工程とを含み、 この粒径毎に分別して対応させた情報に基づい
て前記数種類の分析項目を分析することを特徴と
するものである。
（実施例）
第１図は本発明の分析方法における反応模式図
の一例を示すものである。本例において、符号
１，２および３はそれぞれ担体に用いるポリスチ
レン製のラテツクスで、粒径は例えばラテツクス
１が0.5μ、ラテツクス２が1.0μ、ラテツクス３が
1.5μというように、各径で均一なものを用いる。
符号４，５および６は各径のラテツクス１，２お
よび３にそれぞれ物理的吸着により固相化した固
相抗体である。また、符号７，８および９はサン
プルである血清等に含まれている抗原で、符号１
０，１１および１２はそれぞれの抗原７，８およ
び９に特異的に結合する抗体をFITC等の螢光物
質で標識した標識抗体である。
の一例を示すものである。本例において、符号
１，２および３はそれぞれ担体に用いるポリスチ
レン製のラテツクスで、粒径は例えばラテツクス
１が0.5μ、ラテツクス２が1.0μ、ラテツクス３が
1.5μというように、各径で均一なものを用いる。
符号４，５および６は各径のラテツクス１，２お
よび３にそれぞれ物理的吸着により固相化した固
相抗体である。また、符号７，８および９はサン
プルである血清等に含まれている抗原で、符号１
０，１１および１２はそれぞれの抗原７，８およ
び９に特異的に結合する抗体をFITC等の螢光物
質で標識した標識抗体である。
以下、ヒト免疫グロブリンクラスの特異性分析
を例にとつて説明する。
を例にとつて説明する。
粒径0.5μのラテツクス１には抗ヒトIgG抗体４
を、粒径1.0μのラテツクス２には抗ヒトIgA抗体
５を、粒径1.5μのラテツクス３には抗ヒトIgM抗
体６をそれぞれ固相化する。なお、これらの固相
抗体には、ラテツクス同志の非特異吸着をなくす
意味と、抗原との特異性を増強する意味で、モノ
クロナル抗体の使用が望ましい。反応は、反応用
緩衝液200μにこれらの抗体結合ラテツクス溶
液50μと、ヒトIgG７、IgA８、IgM９等の抗原
が含まれたサンプル10μと、それぞれFITCで
標識した抗ヒトIgG抗体１０、抗ヒトIgA抗体１
１、抗ヒトIgM抗体１２の混合溶液50μとを添
加して行なわせる。ここで、標識抗体１０，１
１，１２は非特異吸着を少なく、また反応速度を
高める目的でFabフラグメントを用いることが望
ましい。また、これらの試薬類は全て同時に添加
しても、また抗原を固相抗体と反応させて後、標
識抗体と反応させるように逐次添加しても良い。
を、粒径1.0μのラテツクス２には抗ヒトIgA抗体
５を、粒径1.5μのラテツクス３には抗ヒトIgM抗
体６をそれぞれ固相化する。なお、これらの固相
抗体には、ラテツクス同志の非特異吸着をなくす
意味と、抗原との特異性を増強する意味で、モノ
クロナル抗体の使用が望ましい。反応は、反応用
緩衝液200μにこれらの抗体結合ラテツクス溶
液50μと、ヒトIgG７、IgA８、IgM９等の抗原
が含まれたサンプル10μと、それぞれFITCで
標識した抗ヒトIgG抗体１０、抗ヒトIgA抗体１
１、抗ヒトIgM抗体１２の混合溶液50μとを添
加して行なわせる。ここで、標識抗体１０，１
１，１２は非特異吸着を少なく、また反応速度を
高める目的でFabフラグメントを用いることが望
ましい。また、これらの試薬類は全て同時に添加
しても、また抗原を固相抗体と反応させて後、標
識抗体と反応させるように逐次添加しても良い。
ここで、例えば37℃、10分間反応させると、各
固相抗体ラテツクス−抗原−標識抗体の免疫複合
体（Bound）１３，１４，１５と残余の標識抗体
（Free）１６とが生成される。本例では、これを
第２図に示すフローサイトメータに流して測定す
る。
固相抗体ラテツクス−抗原−標識抗体の免疫複合
体（Bound）１３，１４，１５と残余の標識抗体
（Free）１６とが生成される。本例では、これを
第２図に示すフローサイトメータに流して測定す
る。
フローサイトメータは既に知られているよう
に、細胞の分析専用機であり、フローセル２１中
のニードル２２に反応液２３を流し、レーザ光２
４をその流れに照射して細胞から発する散乱光や
螢光を測定する。通常、前方散乱光はレーザ入射
光とほぼ水平に位置するデイテクタ２５で検知さ
れ、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢光
は、レーザ光２４の入射角に対して垂直方向に位
置するデイテクタ２６で検知され、細胞表面の螢
光物質等の測定に用いられる。レーザ光２４は単
一波長であるため、使用できる螢光色素に制限が
あるが、本例の分析方法において用いる螢光色素
FITCは波長489nm近くの光を吸収して波長
515nmの螢光を発するので、この場合は波長
488nmのArレーザを用いれば良い。
に、細胞の分析専用機であり、フローセル２１中
のニードル２２に反応液２３を流し、レーザ光２
４をその流れに照射して細胞から発する散乱光や
螢光を測定する。通常、前方散乱光はレーザ入射
光とほぼ水平に位置するデイテクタ２５で検知さ
れ、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢光
は、レーザ光２４の入射角に対して垂直方向に位
置するデイテクタ２６で検知され、細胞表面の螢
光物質等の測定に用いられる。レーザ光２４は単
一波長であるため、使用できる螢光色素に制限が
あるが、本例の分析方法において用いる螢光色素
FITCは波長489nm近くの光を吸収して波長
515nmの螢光を発するので、この場合は波長
488nmのArレーザを用いれば良い。
このようにして、反応後の第１図に示す免疫複
合体１３，１４，１５と残余の標識抗体１６とが
混ざり合つた反応液２３をニードル２２からフロ
ーセル２１中に導入し、ニードル２２中を流れる
各免疫複合体と残余の標識抗体等の各成分のレー
ザ光２４による散乱光および螢光をデイテクタ２
５および２６でそれぞれ検知すれば、デイテクタ
２５によつて各免疫複合体の大きさが測定され、
しかもその大きさは各ラテツクスの径が1μ前後
であれば、せいぜい数nmの固体抗体−抗原−標
識抗体結合部は誤差範囲となるから、殆んどラテ
ツクスの粒径に依存する。また、同時にデイテク
タ２６により、各ラテツクス上に乗つた螢光量／
１ラテツクスが測定され、これら２つのパラメー
タによつて第３図に示すサイトグラムが得られ
る。なお、第３図において縦軸は螢光量を、横軸
は粒子径を表わす。
合体１３，１４，１５と残余の標識抗体１６とが
混ざり合つた反応液２３をニードル２２からフロ
ーセル２１中に導入し、ニードル２２中を流れる
各免疫複合体と残余の標識抗体等の各成分のレー
ザ光２４による散乱光および螢光をデイテクタ２
５および２６でそれぞれ検知すれば、デイテクタ
２５によつて各免疫複合体の大きさが測定され、
しかもその大きさは各ラテツクスの径が1μ前後
であれば、せいぜい数nmの固体抗体−抗原−標
識抗体結合部は誤差範囲となるから、殆んどラテ
ツクスの粒径に依存する。また、同時にデイテク
タ２６により、各ラテツクス上に乗つた螢光量／
１ラテツクスが測定され、これら２つのパラメー
タによつて第３図に示すサイトグラムが得られ
る。なお、第３図において縦軸は螢光量を、横軸
は粒子径を表わす。
ここで、抗原抗体反応に関与しなかつた残余の
標識抗体は微径であるから１標識抗体あたりの螢
光量の位置３１に集中する。また、径が１番小さ
いラテツクスにより結合した第１図の免疫複合体
１３は位置３２に、２番目に小さいラテツクスに
より結合した第１図の免疫複合体１４は、抗原濃
度が高かつたのでラテツクス１個あたりの螢光量
としてもかなり高い位置３３に示される。また、
一番ラテツクス径が大きかつた第１図の免疫複合
体１５は、抗原濃度が薄かつたので位置３４に示
されることになる。
標識抗体は微径であるから１標識抗体あたりの螢
光量の位置３１に集中する。また、径が１番小さ
いラテツクスにより結合した第１図の免疫複合体
１３は位置３２に、２番目に小さいラテツクスに
より結合した第１図の免疫複合体１４は、抗原濃
度が高かつたのでラテツクス１個あたりの螢光量
としてもかなり高い位置３３に示される。また、
一番ラテツクス径が大きかつた第１図の免疫複合
体１５は、抗原濃度が薄かつたので位置３４に示
されることになる。
このようにして螢光量測定値が得られれば、予
めIgG，IgA，IgM等各抗原の既知濃度系列から
同様にして求めた螢光強度と抗原濃度との関係を
表わす検量線に基いてサンプル中の各抗原濃度を
求めることができる。
めIgG，IgA，IgM等各抗原の既知濃度系列から
同様にして求めた螢光強度と抗原濃度との関係を
表わす検量線に基いてサンプル中の各抗原濃度を
求めることができる。
このようにして、フローサイトメータと、各抗
原に応じて異なる粒径のラテツクスに抗体を固相
化したラテツクスイムノアツセイとを用いれば、
免疫複合体の大きさを、抗原別に識別することが
可能となり、これによりＢ−Ｆ分離なしに同時に
多項目の抗原濃度を測定することができる。これ
は、高速で多検体測定につながるばかりでなく、
抗原、抗体の大きさに比べラテツクス粒子の大き
さがかなり大きいところから、免疫複合体の大き
さや形状のバラツキがかなり小さくなり、したが
つて測定精度も高くなる。
原に応じて異なる粒径のラテツクスに抗体を固相
化したラテツクスイムノアツセイとを用いれば、
免疫複合体の大きさを、抗原別に識別することが
可能となり、これによりＢ−Ｆ分離なしに同時に
多項目の抗原濃度を測定することができる。これ
は、高速で多検体測定につながるばかりでなく、
抗原、抗体の大きさに比べラテツクス粒子の大き
さがかなり大きいところから、免疫複合体の大き
さや形状のバラツキがかなり小さくなり、したが
つて測定精度も高くなる。
なお、本発明は上述した例にのみ限定されるも
のではなく、幾多の変更または変形が可能であ
る。例えば、担体はラテツクスに限らず、分子量
の均一な人工細胞等、測定対象に応じて任意の形
状や大きさのものを用いることができる。また、
フローサイトメータにソーテイング機能を付加し
て、測定後に免疫複合体、残余の標識抗体をそれ
ぞれ分離することもできる。このようにすれば、
残余の標識抗体を分離して取出すことができるか
ら、これを再使用することができる。更に、フロ
ーサイトメータに反応装置やオートサンプラ等を
付加することによつて自動測定も容易に行なうこ
とができる。この場合、フローサイトメータにお
ける測定速度は約500粒子／secであるから、１つ
のサンプルについて１×106粒子を測定したとし
ても、３分前後で高速に分析することができる。
また、本発明は競合法による分析にも有効に適用
することができる。
のではなく、幾多の変更または変形が可能であ
る。例えば、担体はラテツクスに限らず、分子量
の均一な人工細胞等、測定対象に応じて任意の形
状や大きさのものを用いることができる。また、
フローサイトメータにソーテイング機能を付加し
て、測定後に免疫複合体、残余の標識抗体をそれ
ぞれ分離することもできる。このようにすれば、
残余の標識抗体を分離して取出すことができるか
ら、これを再使用することができる。更に、フロ
ーサイトメータに反応装置やオートサンプラ等を
付加することによつて自動測定も容易に行なうこ
とができる。この場合、フローサイトメータにお
ける測定速度は約500粒子／secであるから、１つ
のサンプルについて１×106粒子を測定したとし
ても、３分前後で高速に分析することができる。
また、本発明は競合法による分析にも有効に適用
することができる。
（発明の効果）
以上述べたように本発明によれば、サンプル中
の数種類の抗原について各別に分折できるから、
数種類のカラムを作らなくて良く、分析時間、手
間が大幅に短縮できる。また、ラテツクス等の粒
子径で多項目を分離して測定するものであるか
ら、類似の抗原に対しても精度良く分折すること
ができる。更に、Ｂ−Ｆ分離を必要とせず、反応
液をそのままフローサイトメータに流すことによ
り、多項目の分析を行なうことができるから、高
速度、多検体測定を目的とした自動化が可能であ
る。
の数種類の抗原について各別に分折できるから、
数種類のカラムを作らなくて良く、分析時間、手
間が大幅に短縮できる。また、ラテツクス等の粒
子径で多項目を分離して測定するものであるか
ら、類似の抗原に対しても精度良く分折すること
ができる。更に、Ｂ−Ｆ分離を必要とせず、反応
液をそのままフローサイトメータに流すことによ
り、多項目の分析を行なうことができるから、高
速度、多検体測定を目的とした自動化が可能であ
る。
第１図は本発明における一例の反応模式図、第
２図はフローサイトメータを説明するための図、
第３図は測定データのサイトグラムを示す図であ
る。 １，２，３……ラテツクス、４，５，６……固
相抗体、７，８，９……抗原、１０，１１，１２
……標識抗体、１３，１４，１５……免疫複合
体、１６……残余の標識抗体、２１……フローセ
ル、２２……ニードル、２３……反応液、２４…
…レーザ光、２５，２６……デイテクタ。
２図はフローサイトメータを説明するための図、
第３図は測定データのサイトグラムを示す図であ
る。 １，２，３……ラテツクス、４，５，６……固
相抗体、７，８，９……抗原、１０，１１，１２
……標識抗体、１３，１４，１５……免疫複合
体、１６……残余の標識抗体、２１……フローセ
ル、２２……ニードル、２３……反応液、２４…
…レーザ光、２５，２６……デイテクタ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サンプルと、複数種類の分析項目に対応する
抗原または抗体のそれぞれを所定の標識物質で標
識した標識抗原または標識抗体と、複数の異なる
粒径を有し、粒径毎に異なる分折項目に対応する
抗原または抗体を固相化した複数の担体とを反応
させる工程と、 反応後の担体を含む溶液を流しながら、該溶液
中の物質の粒径情報および標識物質の有無の情報
を順次検出する工程と、 この検出した２つの検出情報を粒径毎に分別し
て対応させる工程とを含み、 この粒径毎に分別して対応させた情報に基づい
て前記複数種類の分析項目を分析することを特徴
とする免疫学的分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25520884A JPS61132870A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25520884A JPS61132870A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8131602A Division JP2709296B2 (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 免疫学的分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61132870A JPS61132870A (ja) | 1986-06-20 |
| JPH0588423B2 true JPH0588423B2 (ja) | 1993-12-22 |
Family
ID=17275519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25520884A Granted JPS61132870A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61132870A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
| JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
-
1984
- 1984-12-03 JP JP25520884A patent/JPS61132870A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
| JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61132870A (ja) | 1986-06-20 |
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