JP3908272B2 - リガンドの検出のための固相アッセイ - Google Patents
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Description
この発明は、化学的、生化学的及び生物学的アッセイに関係し、特に、リガンドの検出のための固相アッセイに関するものである。
発明の背景
試料と一種以上の試薬とを様々に反応させてリガンド/結合体複合体例えば抗体/抗原又は類似の複合体を形成し、次いで、それを観察する、試料中の予め決めた部分の存在又はレベルを測定するためのアッセイは周知である。典型的には、抗体を用いて、その抗体が特異性を有する抗原の存在をアッセイする。これらのアッセイは、ハプテン例えばホルモン、アルカロイド、ステロイド、抗原、抗体、核酸及びこれらの断片、酵素並びに細胞表面レセプターを定量するように拡張された。用語「リガンド/結合体」は、ここで用いる場合、この広い意味に理解されるべきである。
敏感な免疫アッセイは、典型的には、複合体の標識成分を例えば試薬に組み込み、次いで、非複合体化標識試薬を複合体化試薬から分離するトレーサー技術を利用する。その後、この複合体を、標識からのシグナルを観察することにより定量することができる。複合体の成分又は部分を標識するために、放射性同位体、蛍光性及び化学発光性分子、比色用標識及び他のマーカーが用いられており、適当な装置を用いて標識からの放射を検出し及び測定する。
複合体の少なくとも一成分が、最初に、その複合体の形成の前に固体支持体に結合されるアッセイにおいては、その成分を固体支持体例えばウェルミクロ滴定プレート又はビーズに結合させるのに要する典型的に長い時間の故に、又ときには、加熱、撹拌等の処置にもかかわらずに固相への成分の結合を生じるために時間のオーダーでインキュベーション時間が必要となるために、基本的な問題が生じる。従って、ミクロビーズ、ディップスティック、マクロビーズ等の利用を含む、このインキュベーション時間を減じる試みに関する相当数の従来技術があるが、それにもかかわらず、10〜20分のオーダーでのインキュベーション時間が典型的である。
固相アッセイのための多くの形式があるが、それでもなお、それらは、サンドイッチと競争の2つの型に分類され得る:これらの両者は、当業者には周知である。サンドイッチアッセイは、典型的には、抗原が1つ以上の結合体と同時に結合し得ることを要求する。これらの結合体の一方は、固相に結合され、同時に、他の結合体は標識により標識される。固相に結合された標識結合体の量は、次いで、試料中の抗原濃度と関係付けられる。サンドイッチアッセイにおける一般的問題は、非特異的結合、即ち、固相上にあるが抗原と結合してない標識結合体の量である。サンドイッチアッセイをデザインするときには、普通、シグナルレベルと非特異的結合との間の取捨考量がある。標識結合体の濃度又は標識結合体のインキュベーション時間を増加させることは、シグナルレベルを増大させるが、非特異的結合の量をも増大させる。
洗浄緩衝液、洗浄剤、ブロッキング工程、照合等を含む、非特異的結合の影響を減じることを試みる種々のアプローチがなされたが、これらも当業者には周知である。
競争アッセイにおいては、標識部分(抗原への結合体又は抗原のアナログの何れか)を固相に結合することができる。抗原の存在は、標識部分の固相への結合を減じ又は阻止する。シグナルにおける阻止の量は、抗原濃度の尺度である。競争アッセイが十分機能するためには、抗原、標識部位及び固相結合部位の量が、ほぼ等しくなければならない。従って、競争アッセイは、通常、サンドイッチアッセイより感度が遙かに低く、直線状範囲が小さいという欠点も有する。それにもかかわらず、それらは、一度に一つの結合体と結合することしかできない小さい抗原に対して有用である。
化学的、生化学的及び生物学的アッセイの結果は、重要な決定をするために用いられ、それ故、結果の正確さ及び信頼性は極めて重要である。これまでは、既知濃度の対照用試料を定期的にアッセイし、又は測定すべき試料と同時にさえアッセイして、未知試料におけるアッセイの操作を較正し及び確認する。この工程は、関心あるアッセイにおける誤りの可能性を減少させる(但し、排除はしない)。
本発明の目的は、上記の問題の多くを解決する固相アッセイ法を提供することである。この発明の他の目的は、他のもののうちで、当業者に公知の標準的競争アッセイと比較して増大された測定の直線状範囲、改善された感度、劣化させる試薬又は環境条件における変動により引き起こされる誤りに対する減少した発生度、泡又は機械的問題により生じる誤りに対する減少した発生度、自動化の容易さ、及びアッセイの最終結果を得るための減少した時間を有する「競争的(competition-like)」アッセイを提供することである。この発明の「競争的」アッセイは、標準的競争アッセイに類似しているが、この発明の競争的アッセイの少なくとも一工程が、ここに記載の様式で、時間的に制限されて、標準的競争アッセイに典型的な競争的平衡が成立しない点が異なる。
この発明の他の目的は、少なくとも一工程が時間制限されて、それにより、非特異的結合反応と関係する問題及び標準的サンドイッチアッセイに典型的な問題が回避される改良されたサンドイッチアッセイを提供することである。
この発明の更に他の目的は、固相アッセイ法において時間のかかるインキュベーション工程を排除すること、及びこのアッセイを行なうのに要する時間を有意に減じることである。
発明の要約
上記の目的は、固相を利用して結合アッセイを実施する方法を含む本発明により達成され、そこでは、分析物及び/又はリガンド成分の少なくとも1つ以上は、固相成分との限られた接触時間しか与えられない。本方法において、固相物質は、好ましくは、実質的に過剰の結合性リガンドで被覆される。好適具体例において、我々の同時係属中の一般に譲渡された米国特許出願第07/924,720号に記載されたように、固相成分と試薬含有試料の分析物含有試料との接触時間は、試料を比較的速く固相物質を通り過ぎて流すことにより制限される。本発明は、以下に詳述する幾つかの変法及び改良を含み、その各々は、制限された固相接触時間を含む。
本発明は、試料中の分析物の存在及びレベルを、固相上の結合している複合体の形成を検出することにより検出する方法を含む。この発明の好適な「競争的」方法は、下記の工程を含む:
(a)試料を、分析物/第2リガンド複合体が形成されるように前記の分析物と結合することのできる第2リガンドと混合し、
(b)工程(a)で生成した混合物を、第2リガンドと結合し得る第1リガンドを結合して有する固相と接触させて第1リガンド/第2リガンド複合体を形成し、この結合は、工程(a)で形成された分析物/第2リガンド複合体の解離が実質的に阻止される条件下で十分に制限された時間行ない、
(c)検出可能な標識を、標識部分が第1リガンド/第2リガンド複合体の形成により固相上に保持されるように、工程(a)又は工程(b)の前又は後の何れかにおいて第2リガンドに結合させ、
(d)試料中の分析物の存在又はレベルを測定することができるように、この標識部分を検出して、固相上の第1リガンド/第2リガンド複合体の形成を検出する。
当業者により容易に認められるように、かかる競争的アッセイは又、特定の結合リガンド例えば抗体についての結合定数を定量するためにも用いることができるであろう。
この発明の好適な「サンドイッチ型」方法は、下記の工程を含む:
(a)試料を
(i)分析物に結合することのできる第1リガンドを結合して有する固相;及び
(ii)この第1リガンドに、又は第1リガンド/分析物複合体に、第1リガンド/分析物/第2リガンド複合体が固相上に形成されるように結合することのできる第2リガンドと接触させ、この接触は、第2リガンドと固相との間の如何なる非特異的結合も実質的に阻止される条件下で十分限られた時間行ない、
(b)検出可能な標識を、第1リガンド/分析物/第2リガンド複合体の形成の前又は後の何れかに、第1リガンド/分析物/第2リガンド複合体の形成のときに標識部分が固相上に保持されるように第2リガンドに結合させ、
(c)この標識を検出して試料中の分析物の存在又はレベルを測定する。
この発明は又、上記の競争的及び/又はサンドイッチ型アッセイと共に用いることのできる一点較正及び品質保証の方法をも提供する。
本発明は、標準的な競争型及びサンドイッチ型免疫アッセイの感度を、分析物及び/又はリガンド成分の少なくとも1つ以上を固相デバイス(例えば、ビーズ、毛細管内表面、ミクロ滴定プレートその他のデバイス)の表面上を流して接触させる工程によって実質的に増大させることを含み、この固体表面は、予め、分析物及び/又はリガンドの結合パートナーで適当に被覆し又は含浸しておく。
下記のように、幾つかの場合には、分析物含有液体を分析物に対する標識又は標識した結合パートナーと予備反応させる。他の場合には、分析物含有試料を固体表面上を流して接触させた後に、標識した第2結合パートナー、標識剤又は標識成分を含む少なくとも一の追加溶液をもこの固体表面上を流して接触させる。次いで、この固体表面を適当な洗浄溶液で洗い、標識のシグナル強度を直接測定する。
或は、下記の段落に記載の好適具体例におけるように、固相物質上の標識の蓄積は、実時間で連続的に監視することができる。この場合、少なくとも幾つかのアッセイにおいては、シグナルの蓄積速度を上首尾に利用して分析物を正確に定量することができるので、洗浄工程は不必要である。
好適具体例において、この発明のアッセイは、同時係属中の米国特許出願第07/924,720号中に記載されたフローセルシステムを含むシステムにおいて実施することができる。このシステムの好適具体例においては、結合パートナーで被覆された別々のビーズの少なくとも一の分離塊を、円筒状のキャピラリー導管内で処理し、該導管は、好ましくは透明であり且つ収束レンズ手段の焦点範囲内に配置し且つ該範囲を通過する。この円筒状導管をレンズ手段の光軸を横切るように且つそのレンズ手段の曲率中心の後ろに位置させる。既に述べたように、この発明のアッセイは、種々の他のシステムにおいても行なうこともでき、典型的には、下記のように一層感度は低い(免疫学的に被覆されたキャピラリー、ミクロ滴定プレート等を含む)。
このシステムにおいては、ビーズ等の被覆塊が半透明であり且つキャピラリーが半透明又は透明であるときには、蛍光の発達を、米国特許出願第07/924,720号に提出した光学的測定装置及び電気的検出手段を用いて、アッセイの進行につれて監視し且つ測定することができる。標識の性質によって、他の固体表面に結合した標識されたリガンド/結合体複合体の測定を、これまでかかる測定において用いられた測定手段を用いることによって行なうことができる。
この発明のアッセイは、一般に、固体表面を、実質的に過剰の分析物の結合パートナー(サンドイッチアッセイ)又はアナログ(競争的アッセイ)で被覆し、分析物含有液体及び/又は任意の他の液体を、高速で、その固体の表面積を分析物又は他の反応物含有液体に可能な最大限度まで露出する条件下で、その固体表面上を接触して流すことを企図する。
この発明の鍵となる要素は、分析物と試薬を含有する溶液と固相物質との接触時間が比較的短いことであると考えられる。例えば、好適具体例において、比較的少容量の分析物(約2μl)のみが、任意所定の時間、固相物質と接触する。
本発明の競争的アッセイについて、「接触時間」とは個々の分析物/第2リガンド複合体が固相と接触する時間の平均量をいう。典型的流量において、予備混合した試料の各「増分」(ここに、「増分」とは、単一分析物/第2リガンド複合体を含む平均容積をいう)は、固相と、約1分未満、好ましくは、約10秒未満、最も好ましくは約1秒未満接触する。例えば、1000μ1/分の流量では、予備混合した試料の各増分は、典型的に、1分間の約1/500のみの固相との接触する。
本発明の改良されたサンドイッチアッセイについて、「接触時間」とは、第2リガンドが固相と接触する時間の総量をいう。
最適接触時間は、研究される特定の分析物の結合動力学を含む他のアッセイパラメーターと共に変化し得るが、すべての場合において、最適接触時間は、比較的短いことが予想される。
この発明のアッセイは、一価及び多価の存在物を含む広い範囲の分析物に適用することができる。これらのアッセイは、これまで直接アッセイすることは困難と考えられてきた液体の適当に希釈した試料例えば全血液、乳等について、直接、上首尾に行なうことができる。
この発明のアッセイ方法は、当分野で従来用いられてきた方法を超える多大な利点を有する。これらの利点は、一層早い実施時間、特に低い分析物濃度における一層高い感度、多くの場合におけるインキュベーション時間の排除及びすべての場合におけるその短縮、自動化の容易さ、及び高い再現性、並びに特定の競争アッセイにおける拡大された直線状範囲を含むが、決してこれらに限定されない。
下記のように、本アッセイ方法を用いて、各分析物に対する特異的動作曲線を確立することができ、それによって、異常に高レベルの結合による偽陰性及び偽陽性並びに動作エラーにより引き起こされる間違った結果を容易に排除することができる。
本発明の方法を用いて、既知の抗原濃度の液体を用いる一点較正を、競争的アッセイに並びにサンドイッチ型アッセイに用いることができる。これは、特に、異常に低い結合レベルによる偽陰性及び偽陽性(例えば、不活性な抗体の存在により引き起こされるもの)を排除するのに有用である。本発明の他の及び更なる利点並びに利益は、以下に論じ或は下記の詳細な議論から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明と標準的ELISAアッセイとの比較を示している;
図2は、特異的(B)及び非特異的結合(B0)についての代表的結合曲線を示している;
図3は、不備の有無における代表的出力を示している;
図4は、全乳中のゲンタマイシンについての代表的曲線族を示している;
図5は、試料及び較正シグナルのグラフを示している;
図6は、変化させた流量に対する標準曲線を示している;
図7は、幾つかの流量についての、濃度に対する阻止パーセントを示すグラフを示している;
図8は、変化させた抗体希釈についての標準曲線を示している;
図9は、変化させた分析物希釈についての標準曲線を示している;
図10A及び10Bは、フェリチン濃度に対するシグナルを示している;そして
図11A及び11Bは、ゲンタマイシン濃度に対するシグナルを示している。
図12は、典型的な競争的アッセイ(「解離あり」)についての時間に対する複合体形成のプロットを、予備形成した分析物−第2結合リガンド複合体の解離がない理想化した競争的アッセイ(「解離なし」)と比較して示している。
発明の詳細な説明
本発明は、分析物を含む試料を、例えば、その分析物に対する過剰の免疫学的結合パートナーに含浸し又は被覆した固体表面上を接触させて急速に流す工程を含む工程により、短時間で、再現可能に或は満足な結果にて、競争及びサンドイッチ免疫アッセイを行なうことができるという発見に基づいている。
標識の存在は、必須であるが、種々の方法にて達成することができる。例えば、希釈した分析物試料を標識した抗体と予備反応させ或は標識した抗体の溶液を、分析物を固体表面上を流した直後に、その固体表面上を接触させて流すことができる。この標識は、分析物に対する第1次抗体に直接結合し、或はそれは、第2次抗体に結合することができ、それは、次いで、(a)第1次抗体及び分析物と予備反応するか、(b)第1次抗体と予備反応し、その後、生成物は次いで固体支持体(その活性部位の少なくとも幾つかに分析物は既に結合している)上を接触して急速に流されるか、(c)固体支持体(その少なくとも幾つかの活性部位に分析物−第1次抗体系吉合体は既に結合している)上を接触して急速に流される。
既知濃度の分析物の試料を用いた研究において、分析物を含む溶液を、その免疫学的結合パートナーが結合している固体表面上を流す前に、免疫反応物の幾つか又はすべてが予備反応されるかに依存して、種々の結合曲線が得られることが見出された。しかしながら、結合曲線を、既知濃度の分析物試料を用いて行なった実施(各実施では、同じ試薬及び方法を用いる)に基づいて注意して確立すれば、それを、未知濃度の分析物試料と共に上首尾に用いて、高度に再現可能で且つ正確な結果を与えることができる。
言い換えると、標準した第1次及び第2次抗体を含む免疫反応物は、希釈した分析物試料と、同じ順序で同じ時間混合し、そして免疫学的に処理した固体表面と、同じ順序で同じ流量で且つ同じ接触の条件並びに影響を持ち得る他の条件例えば攪拌(又はその欠如)及び温度の下で接触させなければならない。同じ方法の維持は、固体結合した免疫学的結合パートナーへの分析物の曝露の時間が減少するにつれてますます重要になる。
この発明によって競争的免疫アッセイを行なう際に、任意所定の分析物分子又は任意所定の分析物/第2リガンド複合体と免疫学的結合パートナーが結合した固体表面との接触時間は非常に小さい。今まで、この発明のアッセイ方法の実験的評価においては、分析物を含む溶液を、円筒状カラム(直径約1.7mm)中で、その分析物の免疫学的結合パートナーが結合した固体支持体上を接触させて、250〜2000μl/分で変化する流量で流した。一層遅い及び一層早い流量は、ある環境下ではよく機能するが、現在は、この範囲は、分析物と固体表面上に固定されたその結合パートナーとの間の必要な接触時間を保証するのに最適であり、上記のように、比較的短い接触時間を確実にすると考えられている。
分析物含有溶液の述べた範囲の流量を用いて、この発明による競争的免疫アッセイは、これまで、固体支持体が分析物の順次的増加量と約1〜2分間連続的に接触する環境下で行なわれてきた。この時間は、任意の単一容積増分の分析物と固相物質との間の接触時間よりも(ここで論じるように、この発明のサンドイッチアッセイについては状況が異なるにもかかわらず)、この発明の競争的アッセイに対して一層重要でないと考えられる。これまで研究されたすべての競争的アッセイにおいて、任意の単一容積増分の分析物と固相物質との間の接触時間は、約1分未満、好ましくは約10秒未満、最も好ましくは約1秒未満であった。
分析物及びその固定された結合パートナーの性質、固体支持体の構成及び配置、反応温度及びなおその上恐らく他の変量に依存して、分析物溶液とその固定された結合パートナーとの約25秒〜5分間(即ち、300秒)に及ぶ接触時間が幾つかの場合に望ましいことが予期されるが、これまで用いられた時間範囲60〜120秒(即ち、1〜2分間)は、固体支持体が高い表面積を示す場合例えばビーズ塊(各々約100ミクロンの平均直径)を含む場合に特に有効であると考えられる。
この発明の方法は、広範な多様な固体支持体に用いることができ且つ決してビーズを用いる利用に限定されないことを企図する。ビーズに代わる好適な固体支持体例えば免疫原に対する支持体として適当な合成ポリマー塊を、泡及び糸状構造において(緩く編んだマット状構造として)及びビーズに加えて他の様々な形態で用いることができる。更に、当業者に周知のように、免疫学的反応物で被覆したガラス又はプラスチックチューブその他のデバイスが、固体支持体として適している。本発明の方法においては、例えば、適当な内部免疫学的被覆を有する毛細管及び被覆したミクロ滴定プレートが、分析物含有試料との必要な接触を高速流中で容易に与えることができるであろうことが予期される。
更に、他のデバイス例えばカセット、ミクロフィルター等を、溶液中の分析物と固体結合した固定された結合パートナーとの間の急速流、接触反応を有利に行なうチャンバーとして働くように容易に適合させることができると考えられる。
本発明において効率的に機能することが見出された反応チャンバーは、同時係属中の米国特許出願第07/924,720号に記載されたレンズ手段を通るキャピラリー導管である。
上記の同時係属中の出願に記載されたシステムは、特に、蛍光標識の利用及びアッセイ中に生じる蛍光の光学的検出に適合するように開示されている。本発明は、用いる標識が、蛍光、発光又は比色型であってよいことを企図する;実際、環境及び健康の理由から好ましくない周知の放射性標識も又有用である。実際、検出可能なシグナルを生成する任意の標識を、電気的又は電子工学的手段により、好適に利用することができる。
このことについて、上記の同時係属中の米国特許出願第07/924,720号がシグナルを電気的検出器に運ぶ光学的検出システムを用いていることを注意する。この同時係属中の出願により、免疫アッセイ反応が進行するにつれて、全蛍光が、光学的に、連続的に検出される。
免疫アッセイ中の全蛍光の監視は、分析物の固定された結合パートナーとの免疫学的結合を監視することと必ずしも同じではないということを注意すべきである。このアッセイのある段階で、発生した全蛍光は、未結合の標識された第1次及び第2次抗体の存在、非特異的結合の発生等を含む様々な理由により、免疫学的結合に特有の蛍光を大きく超える。更に、光学的に検出された全蛍光からのものを含む電気的シグナルは、その光学的に検出された全蛍光からのシグナルを、分析物が存在しないときに検出され得るシステム自身のノイズ又は蛍光のベースライン散乱から分離しない。これらの警告にもかかわらず、アッセイ中に発生した全蛍光シグナルを監視すること、特に、アッセイ中のシグナルの蓄積速度を監視することが、分析物濃度の大いに満足すべき測定(感度、再現性等に関して)を与えることが見出された(例えば、実施例5及び6を参照されたい)。このリアルタイムでシグナルを監視する能力も又、下記の品質保証発明の実施には重要である。
一点較正型のアッセイを上首尾に用いて、本発明のサンドイッチ及び競争型アッセイの両方を実施することができる。一点較正アッセイの利用は、例えば参考研究室において、特に魅力を有する。一点較正アッセイの公知の利点のうちの一つであるが、それらは、未知濃度の分析物の試料のアッセイと本質的に同時の参照標準試料についての別個のアッセイを行なう必要を回避する;それらは、同じ固体支持体を用いて、アッセイにおける比較参照標準/未知試料結合の直接的表示を与える。やはり公知のように、固体支持体上に固定した結合パートナーが、例えば、ある理由により部分的に不活性であるならば、一点較正結果は、それにもかかわらず、同じ固体支持体上で同じ試薬を用いて、濃度既知及び未知の試料の両方を用いて行なわれるので有効である。
示したように、この発明のアッセイは、容易に、全体又は一部を自動化することができる。それらは、規定した装置にて、アッセイ反応物(所望の分析物の免疫学的結合パートナーで含浸した固体支持体、標識又は標識された抗体、緩衝液及び分析物参照標準を含む)がキット形態にパッケージされている環境下で実施するようにデザインすることができる。かかるキットは、例えば、使い捨ての反応チャンバーデバイス例えばカセット、ビーズ容器、被覆したキャピラリー等を含んでよい。
リアルタイムでシグナルを監視する能力は、特定の試薬及び順次的プロセスを用いる所定の分析物のアッセイのための「品質保証」曲線の確立を与えるという更なる利点を有する。品質保証曲線の構築は、下記により達成される:
(1)生の出力データを数学的関数に当てはめること。これは、部分的に、利用すべく選択したデータパラメーターに依存し、部分的に、プロセスシーケンスに依存する(何故なら、所定のアッセイに対する数学的関数は、幾つかの関数からなっていてよく、各々がアッセイの特定の時間間隔をカバーするので)。一度この関数が確立されれば、標準適合アルゴリズム(最小二乗回帰用アルゴリズム等)を用いて関数パラメーターを変化させて統計学的な「最適適合」曲線に達する。このアルゴリズムは、「有意の誤差」を最小にするように用いる(ここに、後者は、適合した関数と存在するデータとの間の差として定義される)。
(2)各有意の誤差を予めプログラムした域値と比較すること。コンピューターは、この仕事を実行することができる。
(3)その後、コンピューターを用いて、有意の誤差が域値を超える実施を信号で知らせ、アッセイの自動化の程度に応じて、そのアッセイを自動的に再実施するか又は不備として捨てること。
これらの域値は、良いデータ及び悪いデータの両者のセットを蓄積するための関数を適合させることにより決定し、更なるデータが得られたときに再評価にかけられる。
可能な限り結合動力学に基づく方程式に適合させることにより、品質保証の利用は、異常に高い非特異的結合による偽陽性及び偽陰性の拒絶を可能にし得る。とにかく、それは、アッセイ工程の不調例えば後述の実施例のいくつかで議論される空気の泡により引き起こされるものによる値を拒絶する。
既知の一次及び二次の現象に基づく種々の動力学的説明が、この発明のアッセイに対して提出され、種々の実験結果の説明にかなり成功した。それにもかかわらず、これらの説明は、仮説と見なされており、ここには、純粋に理解の助けとして含まれ、後述の請求の範囲に示したこの発明の範囲を制限すると解釈することはできない。
本発明の一具体例において、我々は、競争的アッセイを実施するが、該アッセイで我々は、分析物を含む試料を分析物特異的な抗体と予備反応させ、次いで、その予備反応させた混合物を、やはり分析物特異的抗体と結合することのできる固相を通過して流す。
我々の得たこれらの優れた結果に対する仮の説明は、比較的短い予備反応させた混合物の容積の各増分と固相との接触時間(1秒よりずっと短い)が、実質的に、古典的な三方競争的平衡の成立を阻止することである(それは、もし予備形成した分析物/抗体複合体が解離し、同時に、抗体/固相複合体が形成されるならば生じるような平衡である)。それよりも、我々は、観察されたシグナルは、殆ど完全に、予備反応した混合物中に残った残留の遊離の(即ち、試料抗原と複合体化してない)抗体の結合によるものであるという仮説を立てている。この効果は、分析物/抗体複合体の比較的遅い解離速度のために起きると考えられる。本質において、この短い接触時間中には、非常に僅かの複合体化した抗体/抗原対しか解離しない。
この理論の試験として、我々は、それを2つのデータのセットに適合させる。同時係属中の出願第07/924,270号に記載のように、プロトタイプ免疫アッセイシステムを用いて、一つのデータのセットを得た。他のデータのセットを、標準的ELISA技術を用いて得た。
下記の実施例を、この発明の制限ではなく、説明として提供する。
実施例で与えたアッセイにおいて、蛍光標識からの放出は、上記の同時係属出願の開示に従って、次の各々を計算するようにプログラムされたコンピューターを含む電気的検出器に光学的に向けられた。(1)検出されたベースラインと検出された終点との間の差として定義される「デルタ」、(2)リアルタイムで監視した際の、シグナル蓄積の勾配、(3)複数の同一試料での実施の間の標準偏差である「シグマ」、及び(4)これらの同一の実施の変動の係数である「C.V.」。
この発明は、更に、このアッセイの実施中又は一層遅い時間の何れかに、このアッセイの「品質保証」分析を実施するための手段を含む。この分析は、アッセイ結果の幾つかを誤り又は不十分のために拒絶すべきであるかの決定を与える。
この発明は、更に、このアッセイ固相物質及び他の関連分析リガンドの性能を、未知試料をアッセイするのにこれらの物質を用いる数秒間の時間の内にチェックするのに用いることのできる較正液を含む。この種の較正液はサンドイッチ免疫アッセイ技術においては周知であるが、競争アッセイ型でのその利用は、未だ達成されていないし或は開示されていない。
好適具体例において、この固相は、実質的に過剰の第1結合リガンドを表面に固定して有する液体透過性の多孔質塊からなる。この多孔性塊は、フローセルに含まれ支持手段例えば液体透過性スクリーンにより適所に保持される多数の粒子からなってよい。このスクリーンは、フローセル中に永久に固定してもよく、或は米国特許出願第08/026,507号(参考として、本明細書中に援用する)に記載のように一時的に形成してもよい。
本発明により、分析物含有試料は、比較的短時間、固相物質と密接に接触させられる。本発明の競争的アッセイの好適具体例において、試料は、固相物質の多孔質塊を通して流される。この場合において、接触時間は、容積の各増分が固相と接触する時間をいうものと理解される。
固相上に固定された第2結合リガンドの量を検出するために標識が必要であることは認められよう。任意の放射性標識を本発明に使用することができ、それは、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性同位体標識、比色標識等を含むが、これらに限られない。更に、標識がこのアッセイで利用される第1結合リガンドの一つに直接結合し得ること、或は、適当な第1結合リガンドと複合体を形成し得る中間の第3の結合リガンドを介して第1結合リガンドに結合し得るということも認められよう。中間の第3結合リガンドを利用する技術は、抗体に基づくアッセイの特殊な場合において、典型的には、当業者により「第2抗体技術」と呼ばれる。
好ましくは、本発明の競争的アッセイは、次の工程にて実施する:実質的に過剰の第1結合リガンド(典型的には、試料分析物又は試料分析物のアナログ)を多孔質固相物質に結合する。この未知量の分析物を含む試料を典型的に制限量の標識した第2結合リガンドと混合する。第2結合リガンドと試料の混合物を、次いで、固相物質を通して流す。
当分野で公知のように、標準的競争アッセイは、典型的に、試料中の分析物の存在又は量を測定するために用いられる。この測定は、典型的に、分析物の不在にて達成した第1結合リガンド/第2結合リガンド複合体形成のレベル(典型的には、第2結合リガンドに結合した検出可能標識の存在及び/又は量を検出することによりアッセイする)と、未知量の分析物を含む試料の存在下で達成した第1結合リガンド/第2結合リガンド複合体形成(例えば、試料と第2結合リガンドを予備反応させたとき;又は試料、第1結合リガンド及び第2結合リガンドをすべて同時に反応させる場合)のレベルとの比較を含む。
本発明の競争的アッセイを、同様にして用いることができる。かかるアッセイのためには、分析物/第2結合リガンド複合体の形成が第1結合リガンド/第2結合リガンド複合体の形成を阻止することが重要である。
第2結合リガンドと試料分析物との混合を行なってから、その混合物をフローシステムに導入することができ、或はそれを、例えば第2結合リガンドを含む流れを分析物含有試料のフロー流れに注入することにより自動的に達成することができる。
固相上の実質的に過剰の第1結合リガンドを用いて、予備混合した試料及び標識した第2結合リガンドの固相上の第1結合リガンドとの接触時間を制限することにより、試料分析物の定量を可能にすることは、本発明の目的である。これは、当業者により、前に理解された固相結合リガンドの濃度が検出すべき分析物の濃度にほぼ等しくなければならない実施からの新発展を意味するものと理解されよう。
好ましくは、次の工程を取り入れることにより、一点較正を競争的形式の場合に行なうことができる:上記のように競争的アッセイを行なう直前又は直後に、既知の参照液、典型的には、既知濃度の分析物化合物又はそのアナログを、試料分析物について用いるのと同じ起源から引き出した標識した第2結合リガンドの他のアリコートと混合する。合わせた(それは、上記のように自動的に達成され得る)後に、参照液及び標識した第2結合リガンドの混合物を、再び固相と密接にしかし一時的に接触させる。2つのシグナルを測定するが、その一つは参照液から生じ、一つは試料から生じる。この参照液は、特性が知られているので、標識した第2結合リガンド活性、第1結合リガンド活性等の変動を補正する基準として用いることができる。この一点較正が過剰の固相結合能力により可能となることは認められよう(この能力の効果的な利用が本発明の第1の目的である)。
好ましくは、本発明のサンドイッチアッセイは、次の工程にて行なわれる: 関心ある分析物に結合し得る実質的に過剰の第1結合リガンドを固相物質上に固定する。試料を、流すことにより、この固相物質と密接にしかし一時的に接触させる。次いで、試料分析物/第1結合リガンド複合体との複合体を形成し得る第2の標識した結合リガンドを、流すことにより、固相物質と再び密接にしかし一時的に接触させる。次いで、分析物の量を、固相物質上に保持された標識した結合リガンドの量を測定することにより定量する。当業者は、分析物の定量というのは、サンドイッチアッセイ中に存在することが常に見出される非特異的結合(即ち、分析物の不在における標識した第2リガンドの結合)を差し引く必要があることを認めるであろう。標識した第2結合リガンドと固相物質との間の接触時間を制限することにより特異的結合の比を非特異的結合を超えて増大させることは、本発明の目的である。
好ましくは、品質保証方法を、典型的にはコンピューターにより、アッセイ中のシグナル生成の過程を監視し且つ記録することにより、本発明の競争的アッセイ又はサンドイッチアッセイの何れかにより実行することができる。時間に対する生成シグナル曲線の形状を予め測定した標準曲線と比較することにより、空気の泡、その他の機械的問題等による誤りを容易に検出することができる。
この発明の重要な要素は、分析物及び/又は試薬含有溶液と固相物質との接触時間が比較的短いということである。例えば、同時係属中の米国特許出願第07/924,720号に十分に記載されているように、キャピラリーフローセル及び多孔質固相を用いる好適具体例において、比較的小さい容積の分析物(約2μl)しか任意所定時間で固相物質と接触しない。
本発明の典型的な競争的アッセイを、約1000μl/分の流量で行なった。かかるアッセイのためには、分析物の各増分を固相と、平均して1分間の約1/500だけ又は僅か1秒の1/10にわたって接触させる。最適接触時間は未だ決定されていないし、最適時間は、研究される特定の分析物の結合動力学を含む他のアッセイパラメーターと共に変化すると考えられるが、すべての場合に最適接触時間が比較的短いであろうことは、確かに予想される。
「比較的短い」とは、ここで用いる場合、試料及び試薬含有溶液と固相との接触時間が、分析物の結合動力学に依存して、約1分より短く、好ましくは約10秒より短く、最も好ましくは約1秒より短いことを意味する。
種々のアッセイにおいて、約250〜2000μl/分の範囲の流量が研究された。この範囲の流量は、広範囲の分析及び試料マトリックスに適当であることが見出されているが、この発明は決してこの範囲の流量に限定されるものではない。
一次の結合動力学に基づく比較的単純なモデルが提出され、種々の実験結果を説明するのにかなり成功している。これらのモデル及びそれらに基づく説明は、仮のものと見なされ、ここでは純粋に理解を助けるためのものであって、決して、後述の請求の範囲に示したこの発明の範囲を制限するものと解してはならない。
本発明の一具体例において、我々は、競争的アッセイを行なうが、該アッセイにおいては、未知量の分析物を含む試料を特異的抗体と予備反応させ、次いで、その予備反応させた混合物を、実質的に過剰の分析物物質を上に固定して有しそれ故やはり特異的抗体に結合することのできる固相を通して流す。競争的アッセイにおいて、重要なパラメーターは、試料の任意の部分の固相との平均接触時間であり、固相と全試料との接触時間ではない。
如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、我々の得た優れた結果(例えば、高い感度、高い再現性広い直線状範囲)の仮の説明は、予備反応させた混合物の容積の各増分の固相との比較的短い接触時間(1秒未満)が本質的に古典的な三方競争平衡の成立を阻止するというものであると考えられる。その代わりとして、我々は、観察されたシグナルは、殆どすべて、予備反応した混合物中に残った残留の遊離の(即ち、試料抗原と複合体化してない)抗体の結合によるものであるという仮説を立てている。この効果は、抗体/抗原複合体の比較的遅い解離速度のために起きると考えられる。本質において、この短い接触時間中には、非常に僅かの複合体化した抗体抗原対しか解離しない。換言すれば、固相と予備反応した混合物の増分との間の接触時間を制限することにより、我々は、競争反応に関連した問題を回避することができる。
この理論の試験として、我々は、2つのアッセイ方法を用いた。その1つは同時係属中の米国特許出願第07/924,720号に記載されたものであり、1つは、標準的ELISA技術及びプレートリーダーを用いるものである。両方の場合において、固相物質の被覆は、比較を容易にすることができるように殆ど同じであった。方程式は、上記の両モデル及び標準的三方競争平衡に近づくように導いた。「競争的」モデルに近づくのに用いた方程式は、標識した抗体が試料中で抗原と平衡に達すること及び残りの遊離の抗体が、次いで、固相と平衡に達することを仮定した。このモデルは、現実の過程の粗い単純化と考えられ、決してこの発明の範囲を制限することを意図するものではない。このアッセイにおける未知のパラメーターは、抗体アフィニティー及び固相抗原の有効濃度であった。図1に示すように、2セットのデータに同時に適合するモデルを与えるこれらのパラメーターについての妥当な値(抗体アフィニティー=4×10-9及び有効固相抗原濃度=1×10-8モル)が見出された。
この理論を与える別の方法を、図12に示したグラフ中に具体的に示してある。図12は、(i)予備成形した分析物−第2結合リガンド複合体の解離がない「理想化した」競争的アッセイ(「解離なし」);及び(ii)典型的な競争的アッセイ(「解離あり」)についての接触時間(ここに「接触時間」とは、予備反応した混合物の単一の増分が固相と接触する時間をいう)に対する複合体形成のプロットを示している。これらの図12に示した曲線は、標準的な数学的モデル化技術を用いて計算した(Chemical Kinetics and Dynamics. J.I. Steinfeld等、Prentiss Hall Press, 1989を参照されたい)。当業者は、関心ある任意の結合反応について類似の曲線を容易に生成することができる。
図12を参照して、もし予備反応した混合物と固相との接触時間が5秒未満であるならば(示した特定の会合速度定数について)、観察された現実のシグナルは、解離のない仮説の場合と事実上同じであることは明白である。従って、この発明の好適な競争的アッセイにおいては、予備反応した混合物(試料及び第2結合リガンドを含む)と固相との接触工程は、固相上の第1結合リガンドと第2結合リガンドとの間の結合反応が、時間に対する複合体形成のプロット(例えば、図12の「解離あり」の曲線)が、予備成形された分析物/第2結合リガンド複合体の解離がないと仮定して生成された同じパラメーターの理想化されたプロットから実質的に分かれる点まで進まない条件下で十分制限された時間で行なう。
比較的低濃度の遊離の抗体の実質的に過剰の固相抗原への結合は、明瞭に大きい遊離抗体濃度の範囲にわたって、本来的に、直線的過程である(それは、我々の実施例において観察された比較的大きい直線的範囲の原因であると考えられる)。
上記の競争的アッセイと共に働くように構成された一点較正液の好適具体例において、我々は、既知濃度の抗原(較正液)を、試料と混合した標識抗体と同じ位置から引き出した標識抗体のアリコートと混合する。次いで、この混合物を固相を通して、典型的には未知試料と同じ速度で同じ時間流す。透明のキャピラリー中に配備した半透明の固相の好適具体例(第07/924,720号参照)を用いて、シグナル生成をリアルタイムで観察することが可能である。この場合に、シグナル生成応答の勾配が分析物濃度の信頼できる指示であることが見出される。この一点較正液の場合、我々は、この勾配を2つの領域で計算し、1つは較正液に対応し、他は未知試料に対応する。(既知の)較正液からの応答の勾配は、他方の可能なアッセイ変量例えば抗体活性、温度等に対する基準を与える。
或は、一点較正を、純粋な標識抗体を用いて実行することができる。ゼロ抗原にて較正液を用いるのに似ているが、試料又は較正液中への抗体の稀釈がないので、異なる。それにもかかわらず、この方法も有効な参照を提供することができる。
リアルタイムでシグナル生成を測定する能力のない場合には、この較正を、別々の時間例えば較正液の通過の前後及び試料抗体混合物の通過の前後にシグナルレベルの変化を測定することによって実行することができる。
漠然と上記したように、サンドイッチ免疫アッセイの好適具体例は、やはり、出願第07/924,720号に記載の装置を利用する。サンドイッチアッセイの好適具体例は、やはり、標識した試薬と固相との制限された接触時間の基本概念を含む。ここのモデルは、やはり仮のものと考えなければならず、制限するものではなく、説明目的でのみ含まれるものであるが、幾らか異なっている。
上記の背景の節に記載したように、高感度のサンドイッチ免疫アッセイを実行する際の一般的困難は、標識抗体の固相への非特異的結合の存在である。すべてのシステムに適用できるとは保証されていないが、非特異的結合シグナルは平衡に達するのが特異的結合シグナルより遅いことがしばしば認められる。漠然と、我々は、標識抗体と固相との接触時間を制限すること(即ち、標識抗体が固相と接触する全時間を制限すること)により、我々は非特異的結合を超える特異的結合の比の増大をもたらすことができると考える。この効果は、図2を参照して仮に理解され得る。
図2は、特異的(B)及び非特異的(B0)結合反応を表す単純化した結合曲線を示している。これらの単純化した結合曲線は、当業者により、標準的数学モデル化技術を用いて容易にプロットされ得る現実の結合曲線の代表である。現実の結合反応の観察と一致して、図2に示されたこれらの曲線は、非特異的結合B0の速度が特異的結合Bの速度より遅いという状況を描いている。
当分野で公知であり、図2に示したように、結合曲線は、3つの基本領域からなる:ゼロから増加するほぼ直線的な領域(曲線Bの領域1;曲線B0の領域1〜3);結合反応が安定に達することを表している曲がった領域(曲線Bの領域2;曲線B0の領域4);及び長時間の後に、結合反応が平衡に達したときに到達する実質的に一定の領域(曲線Bの領域の3〜5;曲線B0の領域5)。
任意の特定の結合曲線について、ほぼ直線的な領域の勾配は、下記式により与えられる:
ka*[Ab]*[S]
(式中、kaは会合速度定数であり、[Ab]及び[S]はこれらの2つの反応物の濃度である)。この領域の勾配は、[Ab]及び[S]が一定である範囲に対してのみ直線的である。
t=0において、この結合曲線の勾配は、下記式により与えられる:
d[AbS]/dt=ka*[Ab0]*[S0] (1)
tが無限大に近づくときには、この結合曲線の定常領域が接近する値は、下記式により与えられる:
[AbS]=K*[AB]*[S] (2)
(式中、Kは平衡結合定数である)。
従って、図2に示したこれらの2つの曲線を比較した場合、B/B0比は、t=0及びtが無限大に近づくときには、正確に決定することができる:
t=0の場合、 B/B0=kas*[S0]/kas*[Son] (3)
t≒∞の場合、 B/B0=Ks*[S]/Kn*[Sn] (4)
(式中、sは特異的結合を表し、nは非特異的結合を表す)。
図2を参照して、領域1で示した期間中に、両曲線は直線状であり、B/B0比は一定且つ最大値である。領域2において特異的結合Bは安定に達するので、領域3の期間中、比B/B0は、B0が増加し続けているので減少する。領域4の期間中、B0が安定に達し、比B/B0は、一層低い、一定の、平衡レベルを呈する。
図2を参照すれば、この発明のサンドイッチアッセイは、好ましくは、標識した第2結合リガンドを固相物質に接触させる工程が領域3の上界以内に時間制限されるように行なわれることは明白である。即ち、この工程は、非特異的結合レベルが安定に達する機会を有しない且つ比B/B0が一層低い、一定の、平衡値を呈しないように行なわれる。
この発明の特に好適なサンドイッチアッセイにおいて、この工程は、図2に示したグラフの領域2の上界以内に時間制限される。最も好ましくは、この発明のサンドイッチアッセイは、この工程で、図2のグラフの領域1の上界以内に時間制限される。
換言すれば、本発明のサンドイッチアッセイは、特異的(即ち、第2結合パートナー/分析物/第1結合パートナー複合体)及び非特異的(即ち、第2結合パートナー/固相)結合反応の両者がそれらの各々の結合曲線の直線状領域内にあって且つ平衡に達しない条件下で十分制限された時間行なうのが最も望ましい。かかる環境下で、特異的結合の非特異的結合に対する比B/B0は、一定である。
本発明のサンドイッチアッセイのこの工程を、図2のグラフの領域1の上界以内に時間的に制限したならば、この反応工程の時間を更に制限する利益のないことも又、明白である。事実、更なる反応時間の減少は、それらが生成されるシグナルの全量を減じるので望ましくない。
標準的サンドイッチアッセイにおいて、特異的及び非特異的結合反応の両者は、平衡にまで進行することができる(図2の領域4以降)。非特異的結合は、かかるアッセイにおけるバックグラウンド反応「ノイズ」に有意に寄与し得る。標識した第2結合リガンドを固相物質と接触させる工程が図2のグラフの領域1、2及び/又は3の上界以内に時間制限される、この発明の方法により行なわれるサンドイッチアッセイは、かかる非特異的結合が有意にバックグラウンド反応ノイズに寄与する標準的サンドイッチアッセイを超える改良された感度を示す。
リアルタイムでシグナル生成を監視する能力の更なる利益は、特異的アッセイにおけるある種の問題を検出するのに用いることのできる「品質保証」曲線の確立を可能にすることである。未だ完全に履行され、試験されてはいないが、品質保証曲線の構築は、下記の工程を用いて達成される:
1.生の出力データ(空気泡の有無につき、図3に表示)を、破線で示したように、数学的関数に当てはめる。用いる関数が特定のアッセイ及び用いる特定のタイミング及び流量に依存することは、予想される。この関数は、それぞれ特定の時間間隔をカバーする幾つかの関数からなっていてよいことは、予想される。データの関数への当てはめは、標準的当てはめプログラム例えば最小二乗最適当てはめアルゴリズムを用いて達成され、関数パラメーターを変え、最適当てはめを得る。この当てはめアルゴリズムは、当てはめた関数とデータセットとの間の差異を最小化する。
2.当てはめの後に、コンピューターは、当てはめたデータと関数との間の有意の差異を、予めプログラムした域値と比較する。
3.もし有意の誤差が域値を超えるならば、コンピューターは、その実施を不備として知らせ、自動化のレベルに応じて可能ならば自動的に再実施する。
示したデータにおいて、x軸上の約65における大きいスパイクは、有意の誤差を増大させて域値を超えさせることが予想される。この域値は、関数を、良い及び悪いデータの大きいセットに当てはめることにより決定される。
結合動力学から導いた方程式への当てはめは、異常に高い非特異的結合による偽陽性及び偽陰性を拒絶する品質保証方法の利用を可能にするに違いない。この予想は、データ適合において、アフィニティー定数パラメーターが許容限界を超えることである。
実施例1
この実施例においては、競争的アッセイを、この発明の方法にて実施する。
この競争的アッセイのために、用いた固相は、直径90〜125μmのPMMA粒子であった。これらの粒子は、インジアナ、Carmel在、Bangs Laboratories, Inc.から得た。それらを、粒子200mgを、1mg/mlのゲンタマイシン−BSA結合体(ニュージャージー、Toms River在、OEM Concepts、ロットNo.135−68749)を含むミズーリ、St. Louis在、Sigma Chemicalからのリン酸緩衝塩溶液(PBS)(パーツNo.1000−3)1mlと混合することにより吸着被覆した。この混合物を、1時間、連続的に揺り動かしながらインキュベートした。1時間のインキュベーションの後に、これらの粒子を沈殿させ、上清を吸い出した。次に、10%の正常ヤギ血清(ペンシルベニア、West Grove在、Jackson ImmunoResearch Laboratories、品番005−000−1210)のブロッキング溶液1mlを加えて、再び、これらの粒子を1時間揺すった。次いで、これらの粒子をPBS中で30mlに希釈し、容器中に維持した。
この反応チャンバーは、内径約1.7mmのガラスキャピラリー(Fisher Scientific,カタログNo.21−16402J)であって、ほぼ中心に付着させた48μmのナイロンメッシュを有するものであった。この反応チャンバーを、管により、コンピューター制御されたシリンジポンプ及びバルブに接続し、これらのアッセイ工程のシーケンス及びタイミングを正確に制御する。
アッセイを行なうために、最初に、次のように反応チャンバーに粒子を詰める:反応チャンバーを30秒間バックフラッシュして前のアッセイからの如何なる物質をも除去する。次に、500μlのPBSを20秒間前向きに反応チャンバーを通して流す。この時間中、機械的攪拌機が粒子の容器を攪拌してこれらの粒子を均質に懸濁させる。次の30秒間にわたって、750μlの粒子含有溶液を、ナイロンメッシュのトップにおいて約5mgの粒子をパックした反応チャンバーを通して流す。その次に、他の600μlの前向きのPBS流を24秒間にわたって流す。次は、10秒間にわたる60μlの穏やかなバックフラッシュであり、その後20秒間は何も流さない。これは、ビーズを重力により沈殿させて均一なビーズパッキングを確実にするために行なう。最後に、6秒間にわたる160μlのPBSの前向きの流れが、アッセイのための反応チャンバーを準備する。
抗体溶液を、次のように調製する:マウスの抗ゲンタマイシン抗体(カリフォルニア、San Diego在、Immuno Pharmaceutics、品番16102)を、PBSにて0.1μg/mlまで希釈する。1mg/mlのBSA及び2μg/mlのFITC標識したヤギ抗マウス抗体(ペンシルベニア、West Grove在、ImmunoResearch Laboratories, Inc、品番115−095−0710)を加え、この溶液をインキュベートしてこれらの抗体を平衡に到達させる(約30〜60分間)。
この実施例においては、これらの試料を、濃度0、1、3及び10ng/mlにてゲンタマイシンで全乳スパイクした。これらの試料を器械中に置き、その器械は試料1.5mlを流し、他方、更なる1.5mlの抗体混合物を反応チャンバーを通して120秒間にわたってフロー流れ中に注入した。その後に、3mlでの洗浄を120秒間行なった。蛍光出力を、試料/抗体流れの240秒間及び洗浄時間の間中監視した。これらの4つの試料の測定を三連で行ない、生出力を図4に示す。
この実施例中に示したように、約15秒間(注入点から反応チャンバーまでに要する時間)の予備インキュベーション時間は適当であり、優れた感度及び再現可能性を与える。
実施例2
この実施例は、未希釈標識を参照液として用いる一点較正の概念を示す。これらの粒子を、実施例1と同じ手順を用いて調製する。反応チャンバーに粒子を詰めた後に、3通りの濃度(0、1又は10ng/ml)の内の1つにて試料と混合した抗体を、1分間、1.5ml/分の速度でこれらの粒子上を及び該粒子を通して流す。その後、同じ速度で1分間洗う。次に、純粋な未希釈の抗体を同じ速度で40秒間流して第2の結合シグナルを起こし、これは、この場合、基準である。その後、更に1分間緩衝液で洗う。
図5は、同じ固相を用いて、2つの順次的結合シグナルを生成することが可能であることを示している。約140〜170秒に生じて基準を表している第2の結合勾配は、再現可能であり且つ約25〜70秒に生じている試料結合を変えることにより有意に影響を受けないので、それらは、全システム性能の直接的測定を与える。
実施例3
一連の競争的アッセイの実施を、この発明のアッセイ方法を用いて、感度及び正確さに影響を与え得る因子の基本的理解を得る目的で、濃度既知のジゴキシンを分析物として用いて行なった。
これらの実施例においては、濃度1mg/mlの被覆用溶液を用いて、上記のゲンタマイシンの実施例と同じ手順によって、固相粒子をジゴキシン−BSA(マサチューセッツ、Boston在、Immunotech Corp.、品番685)で被覆した。
これまで、メイン、Portland在、Binax Corporationにより商標「Phase II」で販売された、市販のジゴキシン放射免疫アッセイキットに含まれる一連のジゴキシン血清標準を分析物として用いた(ジゴキシン濃度は、ヒト血清1ml当り、それぞれ、0.0、0.5、1.0、2.0及び4.0ngである)。各例において、それを下記に別途示さない限り、PBS中のウサギ抗ジゴキシンの1:40,000溶液で1:4の比に希釈しとた。
この一連の実験における第1次抗体は、下記に別途示さない限り、PBS中の1:40,000の希釈のウサギ抗ジゴキシンであった。
第2次抗体は、0.1%のウシ血清アルブミンを含むPBS1ml当り1マイクログラムのフルオレセインイソチオシアネートに結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンであった。
採用したアプローチは、各流量、第1次抗体濃度及び分析物希釈率を、他の2つの因子は可能な限り一定に保って変化させることであった。
標準的な条件のセットを選び、それからの変動を作成した。これらの条件は:
流量=750マイクロメートル/分
第1次抗体濃度("[AB]")=1:40,000希釈
分析物濃度("[分析物]")=1:4希釈
これらの実施のすべてにおいて、被覆したビーズを、上記のゲンタマイシンの実施例と同じ方法でシステムに導入した。各アッセイの後に、ビーズバッグを管からフラッシュして出し、新しいものを同様に挿入した。
これらの各アッセイの実施のために、分析物を第1次抗体溶液で希釈し、それにより、分析物と第1次抗体とを予備反応可能にする。この分析物希釈物を、選択した流量に等しい容積で、1分間にわたってキャピラリー導管に導入した。次いで、第2次抗体溶液の1,500μlのアリコートを120秒にわたって導入し、次いで、ビーズを3000μlのPBSで120秒間洗った。
最初の一連の実験において、試料の流量を下記の表1に示したように変えた。表1に示した実施について、ビーズにさらされた全試料容積は、各例において、1分間に導入された容積であることが理解されよう。
この表は、1500μl/分の流量においてC.V.データが最良となることを示すが、すべてのC.V.データは、当分野で一般に許容し得ると考えられる5.0%範囲内にある1。図6は、可変流量データからプロットした標準曲線を示している。予想されるように、流量の変化は、阻止%曲線(図7)に影響を与えず、殆ど用いた全試料/抗体の変化のために全体のレベルを変えるだけである。
第2の実験のシリーズにおいては、第1抗体の希釈を下記の表2に示したように変化させ、他方、流量を毎分750μlに及び現実に用いる試料の容積を750μlに維持した。やはり三連で実施し、表2に与えた値はこれらの平均である。
表2は、完全なシグナル阻止に近づくと乏しい変動係数が得られることを示している(1:100,000希釈の実施)。図8は、第1次抗体の希釈を変化させたときの標準曲線のプロットであり、予想されるように、第1次抗体の希釈率が増大するにつれて感度が増加することを示している。これは、シグナルを阻止するジゴキシンの濃度(ゼロ濃度から2標準偏差に等しい量)を計算することにより明確になる。この実施例については、1:20,000は、.494ng/mlを与え、1:40,000は、.392ng/mlを与え、そして1:100,000は、.050ng/mlを与える。
実施の第3のシリーズ(やはり三連で実施)を行なって分析物の希釈の変化の影響を試験した。分析物を第1次抗体溶液で希釈するので、各分析物希釈率の変化は、この変化が計算されなかったときでも、分析物及び第1次抗体希釈の変化を生じるということは注意すべきである。すべての場合に、分析物溶液を、1:40,000第1次抗体溶液で希釈した。表3は、この一連のアッセイ実施の各々の平均デルタ及びC.V.値を示している:
これらのデータは、一般に許容し得る限界内のC.V.を示している。図9は、各希釈率についてのジゴキシン濃度に対するシグナルのプロットである。それは、再び、第1次抗体の希釈を増すにつれて、即ち、遊離の第1次抗体濃度が減じるにつれて、感度が増加するという我々の理解に従う。
実施例4
サンドイッチ型アッセイを、前述の実施例と同じシステムを用いて行なった。実施例1で同定したのと同じビーズを、実施例1に記載した方法で、PBS中の濃度0.1mg/mlのヒツジ抗ウマフェリチンで被覆した。これらの被覆したビーズを、実施例1に示した方法で、PBS中の10%ヒツジ血清でブロックした。
各測定において、実施例1に記載したレンズ手段のキャピラリー導管中に、ビーズパックを確立した。分析物試料を、既知量のフェリチン(ウマ脾臓由来)を、PBS1ml当り0.0ng、5.0ng及び50ngの濃度レベルでPBS中に加えることにより調製した。
FITCで標識したヒツジ抗ウマフェリチンを、0.1%BSAを含むPBS中に、1μg/mlの濃度で溶解させ、「サンドイッチ」抗体として用いた。
これらのアッセイを、次のように行なった:400μlの分析物溶液を、ビーズパックを通して、20秒間流し、次いで、750μlの標識したヒツジ抗ウマフェリチンを、ビーズパックを通して、30秒間流し、その後、ビーズパックを、1500μlのPBSで、60秒間洗った。各濃度の分析物について、二連で実施した。下記の表4は、3つのフェリチン濃度のすべてについて、デルタ及び勾配値を、関連するそれぞれのシグマ及びC.V.値と共に示している。
図10A及び10Bは、それぞれ、これらのアッセイについての、フェリチン濃度(ng/ml)に対するデルタシグナルのプロット及びフェリチン濃度(ng/ml)に対する勾配のプロットである。
実施例5
競争的アッセイを、乳中ゲンタマイシンの濃度を変化させて行なった。
ビーズを、実施例に記載した方法で調製した。各アッセイ用のビーズパックを、実施例1に記載した流量及びタイミングを用いて確立した。
第1次及び第2次抗体を、室温で1時間のインキュベーションにより調製した。第1次抗体(0.1%BSAを含むPBS中の1μg/mlの濃度の抗ゲンタマイシン)を第2次抗体(同緩衝液中の4μg/mlの濃度)と合わせてインキュベーションを進行させた。
分析物溶液を、乳1ml当り28ngのゲンタマイシンを含む全乳の連続希釈法により調製して、乳中のゲンタマイシンの濃度レベルが0.0、0.11、0.22、0.44、0.88、1.75、3.5、7及び14μg/mlの試料を得た。これらの一連の希釈物の各々を、等容量の予備インキュベートした第1/第2次抗体溶液と合わせてアッセイ測定を行なった。
各アッセイにおいて、1500μlの合わせた試料/抗体溶液を、ビーズパックを通して、60秒間流し、次いで、3000μlのPBSを、洗浄として、ビーズを通して、120秒間流した。表5は、すべてのゲンタマイシン濃度レベルについて、二連のアッセイについての平均デルタ及び勾配(算出値)を、各々のシグマ及びC.V.と共に示している。
最初の0.0ng、0.11ng、0.44ng、1.75ng及び7.0ngのセットの測定を、残りのアッセイと異なる日に行なった(従って、0.0ngのアッセイは反復した)。
図11A及び11Bは、それぞれ、ゲンタマイシン(ng/ml)に対するデルタシグナル及びゲンタマイシン(ng/ml)に対する計算した勾配のプロットである。図11A及び11Bは又、本発明の「競争的」アッセイシステムの大きい直線的範囲のグラフ表示をも与える。
実施例6
ゲンタマイシン一点較正液の研究を行なった。この研究においては、ビーズを、実施例1に記載のように被覆し且つブロックした。各アッセイのために、実施例1に記載のように、キャピラリー導管中に、ビーズパックを確立した。
第1/第2次抗体試薬を、実施例1におけるように調製した。
分析物試料を、全乳中のゲンタマイシンの連続希釈により調製して、乳中の終濃度を0.0、1.25、2.5、5.0及び10.0ng/mlとした。次いで、各々を、等容積の第1/第2次抗体試薬と混合した。
基準物質又は較正液は、分析物試料と同じ方法で調製した5ng/mlのゲンタマイシン(乳中)であった。
較正液と分析物試料とを、同じ方法で実施したが、それは、1500μlの較正液をビーズを通して60秒間流し、その後、1500μlの分析物を含む試料をビーズパックを通して120秒間流し、その後、1500μlのPBSを60秒間流し、次いで、3000μlのPBSを120秒間流すことを必然的に伴った。
各試料を、較正液及び未知試料を用いて、三連で、一列の各時間にて行なった。勾配の値についての平均の結果を、関連するシグマ及びC.V.と共に、表6に示す:
この表は、再び、勾配の優れた再現可能性を示し、試料濃度に依存しない。
前述の実施例は、単に、本発明の説明であって、制限することを意図するものではない。更に、前述したものは、単に、本発明のある好適具体例の詳細な説明であることは理解されるべきである。それ故、後述の請求の範囲に記載のように、本発明の精神及び範囲から離れることなく種々の変法及び同等物を作成し得ることは、当業者には明白である。
Claims (11)
- 試料中の分析物の存在又はレベルを検出する方法であって、下記の工程:
(a)該試料を、分析物/第2リガンド複合体が形成されるように該分析物と結合することのできる第2リガンドと混合し、
(b)工程(a)で生成した混合物を、第1リガンド/第2リガンド複合体が、形成されるように第2リガンドと結合し得る第1リガンドを結合して有する固相と接触させ、該接触は、工程(a)で形成した該分析物/第2リガンド複合体の解離が実質的に阻止される条件下で且つ十分制限された時間で行ない、
(c)検出可能な標識を、該標識部分が該第1リガンド/第2リガンド複合体の形成に際して該固相上に保持されるように、工程(a)又は(b)の前又は後の何れかにおいて、該第2リガンドに結合し、
(d)該標識部分を検出して該試料中の該分析物の存在又はレベルを測定することを含み、
分析物/第2リガンド複合体の形成が第1リガンド/第2リガンド複合体の形成を阻止する、上記の方法。 - 前記接触の工程を、第1リガンド/第2リガンド複合体形成と時間とをプロットした曲線が同じパラメーターの理想化された結合曲線から実質的に分かれない条件下で十分制限した時間で行ない、該理想化された結合曲線は、工程(a)で形成された該分析物/第2リガンド複合体の解離が起きない反応を表し、前記接触の工程を、前記の混合物の任意の部分についての前記の固相との平均接触時間が約10秒より短い十分に制限された時間で行なう、請求項1に記載の方法。
- 前記接触の工程を、前記の混合物の任意の部分についての前記の固相との平均接触時間が約1秒より短い条件下で且つ十分に制限された時間で行なう、請求項2に記載の方法。
- 前記の第1リガンドと前記の分析物とが同一である、請求項1に記載の方法。
- 前記の第1リガンドと前記の分析物とが異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記の第1リガンドが前記の分析物のアナログを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記の分析物及び前記の第2リガンドが工程(a)中類似の濃度で存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記接触の工程が工程(a)で生成した前記の混合物を実質的に過剰の前記の第1リガンドを結合して有する固相と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 第1リガンド/第2リガンド複合体の固相上での形成を検出する方法であって、下記の工程:
(a)該第2リガンドと結合し得る分析物を、分析物/第2リガンド複合体が形成されるように該第2リガンドと接触させ、
(b)該分析物/第2リガンド複合体を、該第2リガンドと結合し得る第1リガンドを結合して有する固相と、第1リガンド/第2リガンド複合体が形成されるように接触させ、該接触は、工程(a)で形成された該分析物/第2リガンド複合体の解離が実質的に阻止される条件下で十分制限された時間で行ない、
(c)検出可能な標識を、該第2リガンドに、該標識部分が該第1リガンド/第2リガンド複合体の形成の際に該固相上に保持されるように、工程(a)又は(b)の前又は後に結合させ、
(d)該標識部分を検出し、それにより、該固相上の該第1リガンド/第2リガンド複合体の形成を検出することを含み、
分析物/第2リガンド複合体の形成が第1リガンド/第2リガンド複合体の形成を阻止する、上記の方法。 - 前記の固相上の前記の第1リガンド/第2リガンド複合体のレベルを定量する工程を更に含む、請求項9に記載の方法。
- 前記のレベルを、第2リガンドを固相との接触の前に前記の分析物と接触させない場合に該固相上に形成される第1リガンド/第2リガンド複合体のレベルと比較することを更に含む、請求項10に記載の方法。
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