BR112013030958B1

BR112013030958B1 - Anticorpo que se liga ao fator de transformação de crescimento beta, composição farmacêutica, usos dos mesmos, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, e método para produção de um anticorpo

Info

Publication number: BR112013030958B1
Application number: BR112013030958-0A
Authority: BR
Inventors: Daniel Bedinger; Shireen S. Khan; Amer Mirza; Ajay J. Narasimha; Toshihiko Takeuchi
Original assignee: Xoma Technology Ltd
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2022-02-08
Also published as: SG10201902706VA; CA2837556A1; AU2012261933A1; KR102395736B1; US20150322146A1; ZA201309050B; WO2012167143A1; US20140023644A1; KR102577578B1; EA032790B1; AU2019204781A1; CN103732623A; CN116333113A; DK2714735T3; AU2017203482A1; US20120315282A1; CN108424451A; CY1124610T1; US11098111B2; KR102051014B1

Abstract

anticorpo que se liga ao fator de transformação de crescimento beta e seu uso no tratamento de câncer, fibrose e doenças associadas com expressão do referido fator, bem como molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira e seu método de uso para produzir anticorpo e composição farmacêutica. a presente invenção refere-se, em geral, a anticorpos que se ligam ao fator de transformação de crescimento beta (tgf beta), incluindo tgf(beta)1, tgf(beta)2 e tgf(beta)3 e ao uso dos mesmos no tratamento de câncer, fibrose e doenças associadas com expressão do referido fator. a presente invenção refere-se ainda a molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira e seu método de uso para produzir anticorpo e composição farmacêutica.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere em geral aos materiais e métodos para anticorpos específicos para fator de transformação de crescimento beta (TGFβ), incluindo TGFβ1, TGFβ2 e/ou TGFβ3, e usos destes anticorpos no tratamento de sujeitos contendo câncer, uma doença ocular, condição ou distúrbio, fibrose, incluindo fibrose dos olhos ou fibroses oftálmicas, e outras condições ou distúrbios relacionadas à expressão de TGFβ.

ANTECEDENTES

[002] A família de proteínas de fator de transformação de crescimento beta (TGFβ) consiste em isoformas distintas encontradas em mamíferos (TGFβ1, TGFβ2, e TGFβ3). As proteínas TGFβ ativam e regulam respostas múltiplas de genes que influenciam os estados de doença, incluindo condições proliferativas, inflamatórias e cardiovasculares. TGFβ é uma citocina multifuncional originalmente nomeada por sua capacidade de transformar fibroblastos normais em células capazes de crescimento independente de ancoragem. As moléculas de TGFβ são produzidas principalmente por células hematopoiéticas e tumores e podem regular, ou seja, estimular ou inibir o crescimento e diferenciação de células de uma variedade de origens de tecido normal e neoplásico (Sporn et al., Science, 233: 532 (1986)), e estimulam a formação e expansão de várias células estromais.

[003] Os TGFβs são conhecidos por estarem envolvidos em vários processos celulares proliferativos e não proliferativos como proliferação e diferenciação celular, desenvolvimento embrionário, formação de matriz extracelular, desenvolvimento óssea, cicatrização de feridas, hematopoiese, e respostas imunes e inflamatórias. Ver, por exemplo, Pircher et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986); Wakefield et al., Growth Factors, 1: 203-218 (1989); Roberts and Sporn, pp 419-472 in Handbook of Experimental Pharmacology eds M. B. Sporn & A. B. Roberts (Springer, Heidelberg, 1990); Massague et al., Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990); Singer and Clark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999). Ainda, TGFβ é usado no tratamento e prevenção de doenças da mucosa intestinal (WO 2001/24813). TGFβ é ainda conhecida por ter efeitos imunossupressores fortes em vários tipos de células imunológicas, incluindo inibição de linfócito T citotóxico (CTL) (Ranges et al., J. Exp. Med., 166: 991, 1987), Espevik et al., J. Immunol., 140: 2312, 1988), expressão deprimida de linfopoi- ese de célula B e cadeia leve capa (Lee et al., J. Exp. Med., 166: 1290, 1987), regulação negativa de hematopoiese (Sing et al., Blood, 72: 1504, 1988), regulação para baixo de expressão de HLA-DR em células de tumor (Czarniecki et al., J. Immunol., 140: 4217, 1988), e inibição da proliferação de linfócitos B ativados por antígeno em resposta ao fator de crescimento de célula B (Petit-Koskas et al., Eur. J. Immunol., 18: 111, 1988). Ver ainda Patente US 7.527.791.

[004] Anticorpos para TGFβ foram descritos nas Patentes US7.527.791; 7.927.593; 7.494.651; 7.369.111; 7.151.169; 6.492.497;6.419.928; 6.090.383; 5.783.185; 5.772.998; 5.571.714; e 7.723.486. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente revelação fornece métodos e composições parao tratamento da doença ou distúrbios associados com a expressão de TGFβ. A revelação fornece anticorpos que se ligam a TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3. É fornecido que os anticorpos descritos aqui podem ter afinidade diferencial para qualquer uma das isoformas TGFβ. Ainda, foi verificado aqui que os anticorpos específicos TGFβ revelados inespe- radamente modulam células imunes em tumores (por exemplo, infiltrado em tumores) e são contemplados para tratamento de tumores associados com expressão de TGFβ, bem como outras condições ou distúrbios associados com expressão de TGFβ.

[006] Em um aspecto, a revelação fornece um anticorpo que seliga ao fator de transformação de crescimento beta (TGFβ)1, TGFβ2 e TGFβ3 compreendendo: (a) uma sequência de aminoácido de repetição determinante de complementaridade (CDR) 1 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 13, 19 e 25, ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados; (b) uma sequência de aminoácido CDR2 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 14, 20 e 26 que é da mesma região variável de cadeia pesada como (a), ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados; e (c) uma sequência de ami- noácido CDR3 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 15, 21 e 27 que é da mesma região variável de cadeia pesada como (a), ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados.

[007] Em um aspecto relacionado, a revelação fornece um anticorpo que se liga ao fator de transformação de crescimento beta (TGFβ)1, TGFβ2 e TGFβ3 compreendendo: (a) uma sequência de aminoácido CDR1 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 13, 19 e 25, ou uma variante da mesma contendo pelo menos 70% identidade para a mesma; (b) uma sequência de aminoácido CDR2 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 14, 20 e 26 que é da mesma região variável de cadeia pesada as (a), ou uma variante da mesma contendo pelo menos 70% identidade para a mesma; e (c) uma sequência de aminoácido CDR3 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 15, 21 e 27 que é da mesma região variável de cadeia pesada as (a), ou uma variante da mesma contendo pelo menos 70% identidade para a mesma.

[008] Em um aspecto relacionado, a revelação fornece um anticorpo que se liga ao fator de transformação de crescimento beta (TGFβ)1, TGFβ2 e TGFβ3 compreendendo: (a) uma sequência de aminoácido CDR1 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 13, 19 e 25, ou uma variante da mesma contendo pelo menos 70% identidade para a mesma; (b) uma sequência de aminoácido CDR2 de cadeia pesada independentemente selecionada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 14, 20 e 26, ou uma variante da mesma contendo pelo menos 70% identidade para a mesma; (c) uma sequência de aminoácido CDR3 de cadeia pesada independentemente selecionada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 15, 21 e 27, ou uma variante da mesma contendo pelo menos 70% identidade para a mesma.

[009] Em determinadas modalidades, pelo menos duas das sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 13-15, 19-21 e 25-27. Em uma modalidade relacionada, três das sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada são estabelecidas na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 13-15, 19-21 e 25-27.

[010] Em algumas modalidades, é contemplado que o anticorpocompreende uma sequência de aminoácido pelo menos 85% idêntica à região variável de cadeia pesada sequência de aminoácido estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 2, 6 e 10. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica à região variável de cadeia pesada sequência de aminoácido estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 2, 6 e 10.

[011] Ainda em outras modalidades, o anticorpo compreendeuma sequência de polipeptídeo contendo uma sequência de aminoáci- do pelo menos 70% idêntica à todas as três HCDRs em uma região variável de cadeia pesada, as sequências de aminoácidos deHCDR1, HCDR2 e HCDR3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 13-15, 19-21 e 2527.

[012] Em determinadas modalidades, um ou mais aminoácidosde estrutura de cadeia pesada foram substituídos com aminoácido(s) correspondente(s) de outra sequência de aminoácido de anticorpo humano.

[013] É contemplado que um anticorpo descrito aqui ainda compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos CDR de cadeia leve estabelecidas na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 16-18, 22-24 e 28-30. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende pelo menos duas das sequências de aminoácidos CDR de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 16-18, 22-24 e 28-30. Em outras modalidades, um anticorpo compreende pelo menos três das sequências de aminoácidos CDR de cadeia leve estabelecidas na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 16-18, 22-24 e 28-30.

[014] Em outro aspecto, um anticorpo descrito aqui compreende(a) uma sequência de aminoácido CDR1 de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 16, 22 e 28, ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados; (b) uma sequência de aminoácido CDR2 de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 17, 23 e 29 que é da mesma região variável de cadeia leve como (a), ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados; e (c) uma sequência de aminoácido CDR3 de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 18, 24 e 30 que é da mesma região variável de cadeia leve como (a), ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados.

[015] Em modalidades alternativas, um anticorpo contempladoaqui compreende: (a) uma sequência de aminoácido CDR1 de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 16, 22 e 28, ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados; (b) uma sequência de aminoácido CDR2 de cadeia leve independentemente selecionada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 17, 23 e 29, ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados; e (c) uma sequência de aminoácido CDR3 de cadeia leve independentemente selecionada estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 18, 24 e 30, ou uma variante da mesma em que um ou dois aminoácidos foram alterados.

[016] Em determinadas modalidades, pelo menos duas das sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve são estabelecidas na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 16-18, 22-24 e 28-30.

[017] É ainda contemplado que um anticorpo descrito aqui compreende uma sequência de polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido pelo menos 70% idêntica à todas as três LCDRs de uma região variável de cadeia leve, as sequências de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 16-18, 2224 e 28-30.

[018] Em uma modalidade, um anticorpo contemplado aqui compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 70% idêntica a uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 4, 8 e 12. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 4, 8 e 12. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoá- cido de região variável de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 4, 8 e 12. Ainda em outra modalidade, o anticorpo compreende a sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve estabelecida na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 4, 8 e 12.

[019] Em outra modalidade, um anticorpo descrito aqui compreende (i) uma sequência de aminoácido pelo menos 70% idêntica à todas as três LCDRs, de uma região variável de cadeia leve, as sequências de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 16-18, 22-24 e 28-30 e (ii) uma sequência de aminoáci- do pelo menos 70% idêntica à todas as três HCDRs de uma região variável de cadeia pesada, as sequências de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 estabelecidas nas SEQ ID NOs: 13-15, 19-21 e 2527.

[020] Em outro aspecto, a revelação fornece um anticorpo que seliga ao fator de transformação de crescimento beta (TGFβ)1, TGFβ2 e TGFβ3 compreendendo a região variável de cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada, em que (a) a região variável de cadeia leve compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NOs: 16, 22 e 28 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NOs: 17, 23 e 29 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas, e/ou uma CDR3 selecionada das SEQ ID NOs: 18, 24 e 30 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas; e/ou em que (b) a região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NOs: 13, 19 e 25 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NOs: 14, 20 e 26 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas, e/ou uma CDR3 selecionada das SEQ ID NOs: 15, 21 e 27 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 16 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 17 ou se-quências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, e uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 18 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas; e/ou região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 13 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 14 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, e uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 15 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas.

[021] Em uma modalidade relacionada, a região variável de cadeia leve compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 22 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 23 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, e uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 24 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas; e/ou região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 19 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 20 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, e uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 21 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas.

[022] Em determinadas modalidades, a região variável de cadeialeve compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 28 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 29 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, e uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 30 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas; e/ou região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 25 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 26 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, e uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 27 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas.

[023] É contemplado que a identidade percentual de qualqueruma das sequências de anticorpo acima pode ser pelo menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas a uma região variável de cadeia pesada ou leve ou qualquer uma das HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3 reveladas aqui.

[024] Em algumas modalidades, um anticorpo da revelação aindacompreende uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada é uma IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada ou não modificada, um fragmento da mesma, ou combinações das mesmas.

[025] Em determinadas modalidades, um anticorpo é fornecidoem que um ou mais dos aminoácidos de estrutura de cadeia leve foram substituídos por aminoácido(s) correspondente(s) de outra sequência de aminoácido de anticorpo humano.

[026] Em um aspecto, o anticorpo da revelação é selecionado dogrupo que consiste em XPA.42.089, XPA.42.068 e XPA.42.681. Sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve de XPA.42.089 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 6 e 8, respectivamente. Sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve de XPA.42.068 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, respectivamente, e sequências de ami- noácido de cadeia pesada e leve de XPA.42.681 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 10 e 12, respectivamente.

[027] Em uma modalidade, um anticorpo descrito aqui aindacompreende uma região constante de cadeia leve humana ligada a dita região variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia leve é uma região constante de cadeia leve lambda modificada ou não modificada, uma região constante de cadeia leve capa, um fragmento da mesma, ou combinações das mesmas.

[028] Em uma modalidade preferencial, a revelação fornece um anticorpo específico para TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 com uma afinidade Kd de 10-6 M ou menos. Em modalidades exemplares, um anticorpo anti-TGFβ descrito aqui se liga a pelo menos uma isoformas de TGFβ com uma afinidade de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou menos, ou opcionalmente se liga a duas isoformas TGFβ, ou todas de TGFβ1, 2, ou 3 com uma afinidade de 10-6 M. 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, ou 10-12 M ou menos para uma ou mais das isoformas. Em outras mo-dalidades, um anticorpo descrito aqui se liga a TGFβ1 e TGFβ2 com pelo menos 2-50 vezes, 10-100 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, ou 20-50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior afinidade (por exemplo, preferencialmente se liga a TGFβ1 e TGFβ2) comparado à ligação ao TGFβ3. Alternativamente, um anticorpo descrito aqui, se liga a cada uma das isoformas de TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 com uma afini-dade de 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes a cada outro. Em determinadas modalidades, o anticorpo se liga a TGFβ1 e TGFβ2 com maior afinidade que TGFβ3. Em determinadas modalidades, a afinidade é medida por ressonância de plásmon de superfície ou ensaio KINEXA.

[029] Em algumas modalidades, o anticorpo neutraliza atividadede TGFβ1 e TGFβ2 em uma maior extensão que TGFβ3. Em algumas modalidades, neutralização de anticorpo de TGFβ1 e TGFβ2 é pelo menos 2-50 vezes, 10-100 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, ou 20-50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% mais potente que a neutralização de TGFβ3. Ensaios de neutralização exemplares contemplados aqui incluem, entre outros, um ensaio de liberação de interleucina-11 e o ensaio de proliferação de célula HT-2. Além disso, um ensaio de atividade TGFβ pode ser realizado para determinar se um anticorpo revelado aqui inibe uma isoformas TGFβ preferencialmente, incluindo um ensaio de fosforilação pSMAD ou um ensaio de ligação rhLAP. Em ou- tra modalidade, o anticorpo tem uma IC50 inferior (ou seja, melhora ligação, maior potência) para TGFβ1 e TGFβ2 comparado a TGFβ3.

[030] Em outro aspecto, a revelação fornece uma molécula deácido nucleico compreendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada e/ou cadeia leve como descrito aqui.

[031] Em outro aspecto, a revelação fornece um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico contemplada aqui operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão. É ainda contemplado aqui uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão ou uma molécula de ácido nucleico da revelação. Em determinadas modalidades, a revelação fornece uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada e cadeia leve, em que os ácidos nucleicos de cadeia pesada e cadeia leve são expressos por ácidos nucleicos diferentes ou no mesmo ácido nucleico.

[032] Em um aspecto relacionado, a revelação fornece um método para usar a célula hospedeira aqui para produzir um anticorpo, o método compreendendo cultivar a célula hospedeira em condições apropriadas e recuperar dito anticorpo. É ainda fornecido um anticorpo produzido pelos métodos revelados aqui.

[033] A revelação ainda contempla uma composição farmacêutica estéril compreendendo o anticorpo como revelado aqui e um carre- ador farmaceuticamente aceitável.

[034] Em outro aspecto, a revelação fornece um método para tratar uma doença, condição ou distúrbio associado com expressão de TGFβ compreendendo a etapa de administração a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou uma composição farmacêutica contemplada aqui. Em determinadas modalidades, a doença, condição ou distúrbio é selecionada do grupo que consiste em um câncer, uma doença, condição ou distúrbio ocular (por exemplo, ocular, óptica, oftálmica ou oftalmológica), a doença, condição ou distúrbio associada com fibrose, por exemplo, doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativos, ou doenças, condições ou distúrbios contendo uma fibrose associada.

[035] Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativos ou doenças contendo uma fibrose associada incluem aquelas que afetam qualquer órgão ou tecido no corpo, incluindo, entre outros, pele, pulmão, rins, coração, cérebro e olhos. Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativas ou doenças contendo uma fibrose associada incluem, entre outros, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose peribronquiolar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença das vias aéreas pequenas (por exemplo, bronquiolite obstrutiva), enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI); fibrose pulmonar devido a agentes infecciosos ou tóxicos; fibrose renal, glomerulo- nefrite (GN) de todas as etiologias, GN proliferativa mesangial, GN imune e GN crescêntica, glomeruloesclerose, lesão tubulointersticial, fibrose intersticial renal, fibrose renal e todas as causas de fibrose intersticial renal, fibrose renal resultante de complicações de exposição ao fármaco, incluindo, tratamento com ciclosporina de receptores transplantados, nefropatia associada a HIV, necropatia de transplante, doença renal diabética, nefropatia diabética, fibrose sistêmica nefrogê- nica, diabetes, fibrose retroperitoneal idiopática, escleroderma, fibrose hepática, doenças hepáticas associadas com cicatrização excessiva e esclerose progressiva, cirrose hepática devido a todas as etiologias, distúrbios da árvore biliar, disfunção hepática atribuível a infecções, doenças fibrocísticas, doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia dilatada; miocardite; fibrose cardíaca de estenose vascular, fibrose cardíaca pós-infarto, pós infarto do miocár- dio, hipertrofia ventricular esquerda, doença veno-oclusiva, reesteno- se, reestenose pós-angioplastia, insuficiência de enxerto arterioveno- so, aterosclerose, hipertensão, doença cardíaca hipertensiva, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, insuficiência cardíaca, doença da aorta, esclerose sistêmica progressiva, polimiosite, lúpus eritemato- so sistêmico, dermatomiosite, fasciste, síndrome de Raynaud, artrite reumatoide, vitreoretinopatia proliferativa, vitreoretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, tratamento de glaucoma, deslocamento de retina, extração da catarata, ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina, (por exemplo, queimadura alcalina à córnea) fibrose de cirurgia pós catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcapsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas dos olhos do segmento anterior, fibrose do estroma da córnea, fibrose associada com opacificação da córnea, fibrose a rede trabecular, fibrose associada com glaucoma, doenças fibróticas dos olhos do segmento posteri-or, cicatrização fibrovascular, fibrose na retina ou na vasculatura da coroida do olho, fibrose de retina, fibrose epiretinal, gliose retinal, fibrose subretinal, fibrose associada com degeneração macular relacionada à idade, cirurgia pós retina e glaucoma, descolamento de retina por tração em associação com contração do tecido em retinopatia diabética, doença de Peyronie, esclerose sistêmica, lesão do cordão pós- espinhal, osteoporose, doença de Camurati-Engelmann, doença de Crohn, cicatrizes, síndrome de Marfan, insuficiência ovariana prematura, a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, fibrose devida a incisões cirúrgicas ou trauma mecânico, fibrose associada com cirurgia ocular; e cicatriz hipertrófica ou excessiva ou formação de queloide na derme que ocorre durante cura de ferimento resultante de trauma ou ferimentos cirúrgicos.

[036] Doenças oculares exemplares (por exemplo, ocular, óptica,oftálmica ou oftalmológica), condições ou distúrbios, incluem, entre outras, distúrbios fibroproliferativos, fibrose do olho, fibroses oftálmicas, disfunção da retina, fibrose associada com disfunção da retina, degeneração macular úmida ou seca, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatriza- ção na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina (por exemplo, queimadura alcalina na córnea), fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcapsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma cor- neano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatura da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

[037] Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativos exemplares dos olhos, fibrose do olho, fibrose ocular ou fibroses oftálmicas, incluem, entre outras, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com disfunção de retina, fibrose associada com degeneração macular úmida ou seca, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, fibrose associada com queimadura alcalina, fibrose de pós- cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcapsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma cor- neano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatura da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

[038] Em várias modalidades, a doença, condição ou doença, oudistúrbio fibroproliferativo do olho é selecionada do grupo que consistem em vitreorretinopatia, fibrose associada com cirurgia ocular, fibrose de cirurgia pós-catarata das lentes, fibrose do estroma corneal e queimadura alcalina.

[039] Em um aspecto relacionado, a revelação fornece um método para tratar câncer compreendendo administrar a um sujeito em ne-cessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou uma composição farmacêutica contemplada aqui. Em de-terminadas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer pulmonar, câncer de próstata, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer esofágico, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer ovariano, câncer de estômago, câncer fibrótico glioma e melanoma.

[040] Em algumas modalidades, o anticorpo ou composição au- menta o número de células natural killer (NK) em um tumor. Em várias modalidades, o anticorpo ou composição aumentam a atividade citolí- tica de células NK. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrita aqui aumenta a produção de perforina e gran- zima por células NK. Em uma modalidade, o anticorpo é XPA.42.089 ou XPA.42.681.

[041] Em várias modalidades, o anticorpo ou composição descritaaqui aumentam o número de células T regulatórias em um tumor e/ou inibe a função de célula T regulatória. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrita aqui inibem a capacidade de Tregs para regular para baixo em uma resposta imune ou para migrar a um sítio de uma resposta imune.

[042] Em várias modalidades, o anticorpo ou composição aumenta o número de células T citotóxicas em um tumor e/ou melhora a atividade CTL, por exemplo, dispara, aumenta ou promove atividade CTL. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrita aqui aumenta produção de perforina e granzima por CTL e aumenta a atividade citolítica de CTL. Em uma modalidade, o anticorpo é XPA.42.068, XPA.42.089 ou XPA.42.681.

[043] Em outra modalidade, o anticorpo ou composição reduzemo número de células-tronco derivadas de monócito (MDSC) em um e/ou inibe a função MDSC. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrita aqui inibem a capacidade de MDSCs em suprimir uma resposta imune, inibe a atividade supressiva imune de MDSCs, e/ou inibe a capacidade de MDSCs em promover a expansão e/ou função de Tregs. Em várias modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em XPA.42.089, XPA.42.068 e XPA.42.681.

[044] Em várias modalidades, o anticorpo reduz o número de células dendríticas (DC) em um tumor e/ou inibe a função tolerogênica (por exemplo, efeito tolerogênico) de células dendríticas. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrito aqui aumenta o efeito tolerogênico de células dendríticas CD8+. Em uma modalidade, o anticorpo é XPA.42.089 ou XPA.42.681.

[045] Em outro aspecto, a revelação fornece um método para tratar fibrose compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou composição farmacêutica contemplada aqui.

[046] Em várias modalidades, o anticorpo é administrado com umsegundo agente. Em uma modalidade, o segundo agente é selecionado do grupo que consiste em uma proteína de degradação de matriz extra- celular, um agente anti-fibrótico, terapia cirúrgica, quimioterapia, um agente citotóxico, ou terapia de radiação. Segundos agentes exemplares são revelados em maiores detalhes na descrição detalhada.

[047] Em várias modalidades, a terapia é administração em umperíodo base, por exemplo, por hora, por dia, por semana, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, por mês, ou em um intervalo maior. Em uma modalidade relacionada, em tratamentos exemplares os anticorpos revelados aqui podem ser administrados em uma dose de cerca de 1 mg/dia, 5 mg/dia, 10 mg/dia, 20 mg/dia, 50 mg/dia, 75 mg/dia, 100 mg/dia, 150 mg/dia, 200 mg/dia, 250 mg/dia, 500 mg/dia ou 1000 mg/dia. Estas concentrações podem ser administradas como uma forma de dosagem única ou doses múltiplas.

[048] Ainda é contemplada uma composição compreendendoqualquer um dos anticorpos anteriores ou composições da revelação que se ligam a TGFβ, ou uso do mesmo na preparação de um medicamento, par tratamento de qualquer um dos distúrbios descritos aqui associados com expressão de TGFβ. Seringas, por exemplo, de uso único ou seringas preenchidas, recipientes vedados estéreis, por exemplo, frascos, garrafas, vaso, e/ou kits ou pacotes compreendendo qualquer um dos anticorpos ou composições acima, opcionalmente com instruções apropriada para uso, são ainda contempladas.

[049] É entendido que cada característica ou modalidade, oucombinação, descrita aqui é um exemplo ilustrativo não limitante de qualquer um dos aspectos da invenção e, como tal, pretende ser com- binável com qualquer outra característica ou modalidade, ou combinação, descritas aqui. Por exemplo, onde características são descritas com linguagem tal como "uma modalidade", "algumas modalidades", "certas modalidades", "outra modalidade", "modalidades exemplares específicas", e/ou "outra modalidade", cada um destes tipos de modalidades é um exemplo não limitante de uma característica que é pretendida para ser combinada com outra característica, ou combinação de características descritas aqui sem ter que listar cada combinação possível. Ditas características ou combinações de características se aplicam a qualquer um dos aspectos da invenção. Onde os exemplos de valores que caem dentro das faixas são revelados, qualquer um destes exemplos são contemplados como pontos de avaliação possíveis de uma faixa, qualquer um e todos os valores numéricos entre ditos pontos de avaliação são contemplados, e qualquer uma e todas as combinações de pontos de avaliação superiores e inferiores são vislumbrados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[050] Figura 1 é um gráfico que mostra a competição de ligaçãode TGFβ1 para rhLAP por anticorpos TGFβ.

[051] Figura 2 mostra neutralização de sinalização pSMAD emcélulas por anticorpos TGFβ, (A) TGFβ1; (B) TGFβ2; (C) TGFβ3.

[052] Figura 3 é um gráfico que mostra inibição de células T regu-latórias (Treg) por anticorpos TGFβ.

[053] Figura 4 é um gráfico que mostra inibição de tumor em ummodelo de camundongo de xenoenxerto por anticorpos TGFβ.

[054] Figura 5 é um gráfico que mostra inibição de tumor em ummodelo de camundongo de xenoenxerto por anticorpos TGFβ.

[055] Figura 6 é um gráfico que mostra inibição de tumor em ummodelo de camundongo singeneico por anticorpos TGFβ.

[056] Figura 7 é um gráfico que mostra inibição de tumor em ummodelo de camundongo singeneico por anticorpos TGFβ.

[057] Figura 8 é um gráfico que mostra inibição de tumor em ummodelo de camundongo singeneico por anticorpos TGFβ.

[058] Figura 9 é um gráfico que mostra inibição de tumor em ummodelo de camundongo singeneico por anticorpos TGFβ.

[059] Figura 10 é um gráfico que mostra o efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células natural killer em tumores, em um modelo de tumor de camundongos singeneico.

[060] Figura 11 é um gráfico que mostra o efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células supressoras derivadas de mieloide em tumores, em um modelo de tumor de camundongos singeneico.

[061] Figura 12 é um gráfico que mostra o efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células dendríticas em tumores, em um modelo de tumor de camundongos singeneico.

[062] Figura 13 é um gráfico que mostra o efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células T regulatórias em tumores, em um modelo de tumor de camundongos singeneico.

[063] Figura 14 é um gráfico que mostra o efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células T citotóxicas em tumores, em um modelo de tumor de camundongos singeneico.

[064] Figura 15 é um gráfico que mostra os efeitos in vitro de anticorpos TGFβ em atividade citolítica de célula NK.

[065] Figura 16 é um gráfico que mostra o efeito de anticorposTGFβ em proliferação de célula T.

[066] Figura 17 é um gráfico que mostra o efeito de anticorpos TGFβ em ativação de CTL avaliada por expressão de uma granzima B (GzmB) (Figura 17A) e perforina (Figura 17B).

[067] Figura 18 é um gráfico que mostra o efeito de anticorposTGFβ em níveis de ureia nitrogênio no soro do sangue (BUN) em CsA tratados ou animais controle administrados com anticorpos TGFβ.

[068] Figura 19 é um gráfico que mostra o efeito de anticorposTGFβ em acúmulo de albumina, que é característico de glomerular dis- funcional na doença renal, na urina de animais tratados com CsA ou controle que receberam anticorpos TGFβ.

[069] Figura 20 é um gráfico que mostra o efeito de anticorposTGFβ em níveis de colágeno tipo IV na urina, que reflete a extensão de deposição de ECM e fibrose nos rins, na urina de animais tratados com CsA ou controle administrados com anticorpos TGFβ.

[070] Figura 21 é um gráfico que mostra o efeito de anticorposTGFβ em expressão de genes envolvidos na fibrose como avaliado por RT-PCR quantitativa realizada em tecido renal. Efeitos na expressão de TGF-β1 (Figura 21A) e colágeno tipo III (Figura 21B) foram avaliados em animais tratados com CsA ou animais controle administrados com anticorpos TGFβ.

[071] Figura 22 é um gráfico que mostra o efeito de anticorposTGFβ no aumento em pSMAD2 em células de epitélio de pigmento retinal (RPE) após administração de TGFβ1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[072] A presente revelação fornece medicamentos para tratarcondições ou distúrbios associados com expressão de TGFβ, por exemplo, câncer e fibrose. A presente revelação fornece moléculas ou agentes que interagem com TGFβ e inibem um ou mais de seus efeitos funcionais, como, por exemplo, sinalização através de parceiros de ligação de TGFβ. As composições reveladas aqui vantajosamente têm a capacidade de modular a atividade de célula imune em tumores, as- sim, fornecendo, em um aspecto, um método para tratar câncer afetando uma população de célula que diretamente ou indiretamente afeta o crescimento de tumores.

[073] Para que a revelação possa ser mais completamente entendida, várias definições são estabelecidas.

[074] Como usado aqui, "alvo" ou "antígeno alvo" se refere aqualquer uma ou todas as moléculas TGF-β, incluindo TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3.

[075] Como usado aqui "TGFβ" se refere a qualquer uma ou maisisoformas de TGFβ, incluindo TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 ou variantes das mesmas. Da mesma forma, o termo "receptor TGFβ," salvo se indicado de outra forma, se refere qualquer receptor que se liga pelo menos a uma isoformas TGFβ.

[076] Como usado aqui, a "atividade biológica desejada" de umanticorpo antialvo é a capacidade de ligar a TGFβ e inibe um ou mais de seus efeitos funcionais.

[077] Como usado aqui, uma "condição" ou "distúrbio associadocom expressão alvo" é a condição ou distúrbio em que a atividade alvo é detrimental e inclui doenças e outros distúrbios em que altos níveis de alvo demonstraram ser ou são suspeitos de serem responsáveis para a patofisiologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora do distúrbio, bem como doenças e outros distúrbios em que os níveis altos de expressão alvo são associados com sinais ou sintomas clínicas indesejáveis. Ditos distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento nos níveis de alvo secretado e/ou na superfície celular e/ou sinalização aumentada nas células ou tecidos afetados de um sujeito que sofre do distúrbio. Um aumento em níveis alvos pode ser detectado, por exemplo, usando um anticorpo específico alvo como descrito aqui.

[078] Doenças, condições ou distúrbios exemplares associados com expressão de TGFβ que podem ser tratadas com uma substância anticorpo que se liga a TGFβ (por exemplo, anticorpos da presente revelação) incluem cânceres, como câncer pulmonar, câncer de próstata, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer esofágico, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer ovariano, câncer de estômago, câncer fibrotico, glioma, e melanoma, doenças, condições ou distúrbios dos olhos (por exemplo, ocular, óptica, oftálmica ou oftalmológica), doenças, condições ou distúrbios as-sociados com fibrose, por exemplo, doenças fibroproliferativa, condições ou distúrbios, ou doenças, condições ou distúrbios contendo uma fibrose associada.

[079] Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativos ou doenças, condições ou distúrbios contendo uma fibrose associada incluem aquelas que afetam qualquer órgão ou tecido no corpo, incluindo, entre outros, pele, pulmão, rins, coração, cérebro e olhos. Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativas ou doenças contendo uma fibrose associada incluem, entre outros, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose peribronquiolar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença das vias aéreas pequenas (por exemplo, bronquiolite obstrutiva), enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI); fibrose pulmonar devido a agentes infecciosos ou tóxicos; fibrose renal, glomerulonefrite (GN) de todas as etiologias, por exem-plo, GN proliferativa mesangial, GN imune e GN crescêntica, glomeru- loesclerose, lesão tubulointersticial, fibrose intersticial renal, fibrose renal e todas as causas de fibrose intersticial renal, fibrose renal resultante de complicações de exposição ao fármaco, incluindo, tratamento com ciclosporina de receptores transplantados, por exemplo, tratamento com ciclosporina, nefropatia associada a HIV, necropatia de transplante, doença renal diabética, (por exemplo, nefropatia diabética), fi brose sistêmica nefrogênica, diabetes, fibrose retroperitoneal idiopáti- ca, escleroderma, fibrose hepática, doenças hepáticas associadas com cicatrização excessiva e esclerose progressiva, incluindo cirrose hepática devido a todas as etiologias, distúrbios da árvore biliar, disfunção hepática atribuível a infecções, doenças fibrocísticas, doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca congestiva, cardiomio- patia dilatada; miocardite; fibrose cardíaca de estenose vascular, (por exemplo, fibrose cardíaca pós-infarto), pós infarto do miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, doença veno-oclusiva, reestenose, (por exemplo, reestenose pós-angioplastia), insuficiência de enxerto arteri- ovenoso, aterosclerose, hipertensão, doença cardíaca hipertensiva, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, insuficiência cardíaca, doença da aorta, esclerose sistêmica progressiva, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, fasciste, síndrome de Raynaud, artrite reumatoide, vitreoretinopatia proliferativa, vitreoretino- patia de qualquer etiologia ou fibrose associada com cirurgia ocular como tratamento de glaucoma, refixação de retina, extração da catarata, ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina, (por exemplo, queimadura alcalina à córnea) fibrose de cirurgia pós catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcapsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fi- bróticas dos olhos do segmento anterior, fibrose do estroma da córnea, (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular, (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fi- bróticas dos olhos do segmento posterior, cicatrização fibrovascular, (por exemplo, na retina ou na vasculatura da coroida do olho), fibrose de retina, fibrose epiretinal, gliose retinal, fibrose subretinal, (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada à idade), fibrose associada com cirurgia pós retina e glaucoma, descolamento de retina por tração em associação com contração do tecido em reti- nopatia diabética, doença de Peyronie, esclerose sistêmica, lesão do cordão pós-espinhal, osteoporose, doença de Camurati-Engelmann, doença de Crohn, cicatrizes, síndrome de Marfan, insuficiência ovaria- na prematura, a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, fibrose devida a incisões cirúrgicas ou trauma mecânico, fibrose associada com cirurgia ocular; e cicatriz hipertrófica ou excessiva ou formação de queloide na derme que ocorre durante cura de ferimento resultante de trauma ou ferimentos cirúrgicos

[080] Doenças oculares exemplares (por exemplo, ocular, óptica,oftálmica ou oftalmológica), condições ou distúrbios, incluem, entre outras, distúrbios fibroproliferativos, fibrose do olho, fibroses oftálmicas, disfunção da retina, fibrose associada com disfunção da retina, degeneração macular úmida ou seca, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorreti- nopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina (por exemplo, queimadura alcalina na córnea), fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcap- sular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatu- ra da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

[081] Doenças fibroproliferativas exemplares, condições ou distúrbios dos olhos, fibrose do olho, fibrose ocular ou fibroses oftálmicas, incluem, entre outras, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com disfunção de retina, fibrose associada com degeneração macular úmida ou seca, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, fibrose associada com queimadura alcalina, fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcap- sular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatu- ra da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

[082] Em várias modalidades, a doença, condição ou doença, oudistúrbio fibroproliferativo do olho é selecionada do grupo que consiste em vitreorretinopatia proliferativa, fibrose associada com cirurgia ocular, fibrose de cirurgia pós-catarata das lentes, fibrose do estroma corneal e queimadura alcalina.

[083] Uma "imunoglobulina G" ou "anticorpo nativo" é uma glico-proteína tetramérica. Em uma imunoglobulina de ocorrência natural, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias poli- peptídicas, cada par contendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). A parte aminoterminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento ao antígeno. A parte carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves capa (K) e lambda (À). As cadeias pesadas são classificadas como mu (μ), delta (Δ), gama (Y), alfa (α) e epsilon (ε) e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de mais 10 aminoáci- dos. Ver, em geral, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação ao anticorpo de modo que uma imunoglobulina intacta tem dois sítios de ligação.

[084] Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domíniovariável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Resíduos de aminoácidos particulares parecem formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987).

[085] Domínios variáveis de imunoglobulina apresentam a mesma estrutural geral de regiões estruturais relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis ou CDRs. A partir de N- terminal a C-terminal, ambas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos para cada domínio é tipicamente de acordo com as definições de sequências de Kabat de Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk, (J. Fórmula Biol. 196:901-917, 1987); Chothia et al., (Nature 342:878-883, 1989).

[086] A região hipervariável de um anticorpo se refere aos resíduos de aminoácidos CDR de um anticorpo que são responsáveis para ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma CDR [por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 5065 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariá- vel (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por [Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)]. CDRs foram ainda identificadas e numeradas de acordo com a numeração ImMunoGenTics (IMGT) (Le- franc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003), que descreve os locais de CDR nos domínios variáveis de cadeia leve e pesada como a seguir: CDR1, aproximadamente resíduos 27 a 38; CDR2, aproximadamente resíduos 56 a 65; e, CDR3, aproximadamente resíduos 105 a 116 (linhagem germinativa) ou resíduos 105 a 117 (rearranjados). Em uma modalidade, é contemplado que as CDRs estão localizadas em aproximadamente resíduos 26-31 (L1), 49-51 (L2) e 88-98 (L3) no domínio variável de cadeia leve e aproximadamente resíduos 26-33 (H1), 50-58 (H2) e 97-111 (H3) no domínio variável de cadeia pesada de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo de comprimento aproximadamente semelhante aos revelados aqui. No entanto, um especialista na técnica entende que o local atual dos resíduos CDR podem variar de resíduos projetados descritos acima quando a sequência do anticorpo particular é identificado.

[087] Resíduos estruturais ou FR são os resíduos do domínio variável que não são os resíduos da região hipervariável.

[088] "Região variável de cadeia pesada" como usado aqui serefere à região da molécula de anticorpo compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de dito domínio variável de cadeia pesada. A região variável de cadeia pesada pode conter uma, duas ou três CDR de dita cadeia pesada de anticorpo.

[089] "Região variável de cadeia leve" como usado aqui se refereà região da molécula de anticorpo compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de dito domínio variável de cadeia leve. A região variável de cadeia leve pode conter uma, duas ou três CDR de dita cadeia leve de anticorpo, que pode ser uma cadeia leve capa ou lambda dependendo do anticorpo.

[090] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e incluianticorpos totalmente montados, anticorpos tetraméticos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpo que podem se ligar a um antígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia simples, diabodies), e peptídeos recombinantes compreendendo os anteriores contanto que apresentem a atividade biológica desejada. Uma "imunoglobulina" ou "anticorpo tetramérico" é uma gli- coproteína tetramérica que consiste em dias cadeia pesada e duas cadeias leves, cada uma compreendendo uma região variável e uma região constante. Porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem química ou enzimática de anticorpos intactos. Fragmentos de anticorpos ou porções de ligações ao antígeno incluem, entre outros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpo domínio (dAb), fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos CDR-enxertados, anticorpos de cadeia simples (scFv), fragmentos de anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos,, diabodies, triabodies, tetrabodies, minibody, anticorpo linear; anticorpo recombinante quelante, um tribody ou bibody, um intrabody, um nanobody, um imunofármaco modular pequeno (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de liga-ção ao antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou uma variante ou um derivado do mesmo, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma parte de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação ao antígeno específico ao polipeptídeo, como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis sequências CDR, contanto que o anticorpo retenha a atividade biológica desejada.

[091] "Anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido deuma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades pequenas.

[092] "Variante de anticorpo" como usado aqui se refere a umasequência de polipeptídeo anticorpo que contém pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido na região variável dos domínios da região variável do anticorpo de referência. As variantes podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas ao anticorpo não modificado.

[093] Um "anticorpo quimérico," como usado aqui, se refere a umanticorpo contendo sequência derivada de dois diferentes anticorpos (ver, por exemplo, patente US 4.816.567) que tipicamente se origina de diferentes espécies. Mais tipicamente, anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpo humano e de roedor, geralmente regiões variáveis constantes de humanos e camundongos.

[094] Um "anticorpo neutralizante" é uma molécula de anticorpoque é capaz de eliminar ou significativamente reduzir uma função biológica de um antígeno alvo ao qual este se liga. Assim, um anticorpo antialvo "neutralizante" é capaz de eliminar ou significativamente reduzir uma função biológica, como uma atividade de enzima, ligação ao ligante ou sinalização intracelular.

[095] Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separadoe recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em modalidades preferenciais, o anticorpo será purificado (1) mais do que 95% em peso de um anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais preferencialmente mais do que 99% em peso, (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N- terminal ou sequência interna de aminoácido pelo uso de um sequen- ciador em copo giratório, ou (3) para a homogeneidade por SDS- PAGE em condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coo- massie ou, preferencialmente, corante de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes desde que pelo me-nos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[096] Como usado aqui, um anticorpo que "especificamente seliga" é "alvo específico", é "específico para" alvo ou é "imunorreativo" com o antígeno alvo se refere a um anticorpo ou substância anticorpo que se liga ao antígeno alvo com maior afinidade que com antígenos semelhantes. Em um aspecto da revelação, os polipeptídeos de ligação ao alvo, ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos, irão se ligar com uma afinidade maior ao alvo humano em comparação à afinidade de ligação ao alvo de outro, ou seja, espécies não humanas, mas ligando a polipeptídeos que reconhecem e se ligam aos ortólogos do alvo estão dentro do escopo fornecidos.

[097] Por exemplo, um polipeptídeo que é um anticorpo ou fragmento do mesmo "específico para" seu antígeno cognato indica que as regiões variáveis dos anticorpos reconhecem e ligam o polipeptídeo de interesse com uma preferência detectável (ou seja, capaz de distinguir o polipeptídeo de interesse de outros polipeptídeos conhecidos da mesma família, em virtude de diferenças mensuráveis em afinidade de ligação, apesar da possível existência de identidade de sequência localizada, homologia ou similaridade entre membros da família). Será entendido que anticorpos específicos podem ainda interagir com outras proteínas (por exemplo, proteína A de S. aureus ou outros anticorpos na técnica de ELISA) através de interações com sequências fora da região variável dos anticorpos, e, em particular, na região constante da molécula. Ensaios de triagem para determinar a especificidade de ligação para uso nos métodos da presente revelação são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para uma discussão compreensiva de ditos ensaios, ver Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6. Anticorpos para uso nos métodos podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica.

[098] O termo "epítopo" se refere à porção de qualquer moléculacapaz de ser reconhecida por e ligada por um agente de ligação seletivo em uma ou mais regiões de ligação ao antígeno. Epítopos geralmente consistem de agrupamentos de superfície ativa quimicamente de moléculas, como, aminoácidos ou cadeias laterais de carboidratos e têm características estruturais tridimensionais bem como características de carga específicas. Epítopos como usado aqui podem ser contíguos ou não contíguos. Além disso, epítopos podem ser miméticos (mimotopes) em que compreendem uma estrutura tridimensional que é idêntica ao epítopo usado para gerar o anticorpo, já que compreende nenhum ou somente alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados no alvo que foram usados para estimular a resposta imune do anticorpo. Como usado aqui, um mimotope não é considerado um antígeno diferente do epítopo ligado por agente de ligação seletiva; o agente de ligação seletiva reconhece a mesma estrutura tridimensional do epíto- po de mimotope.

[099] O termo "derivado" quando usado em conexão com substâncias do anticorpo e polipeptídeos da presente revelação se refere aos polipeptídeos quimicamente modificados por ditas técnicas ou ubuquitinação, conjugação aos agentes terapêuticos ou diagnósticos, rotulagem (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), ligação de polímero covalente como peguilação (derivatização com polieti- lenoglicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoáci- dos como ornitina, que não ocorre normalmente em proteínas humanas. Derivados retêm as propriedades de ligação de moléculas não derivatizadas da revelação.

[0100] "Porção detectável" ou um "marcador" se refere à composição detectável por espectroscopia, fotoquímica, bioquímica, imuno- química, ou meio químico. Por exemplo, marcadores úteis incluem 32P, 35S, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usados em um ELISA), biotina- estreptavadina, dioxigenina, haptenos e proteínas para os quais antis- soro ou anticorpos monoclonais são disponíveis, ou moléculas de ácido nucleico como uma sequência complementar ao alvo. A porção de- tectável geralmente se refere a um sinal mensurável, como sinal radioativo, cromogênico ou fluorescente que podem ser usados para quantificar a quantidade de porção detectável ligada em uma amostra.

[0101] O termo "quantidade terapeuticamente efetiva" é usadoaqui para indicar a quantidade de composição específica ao alvo da revelação que é efetiva para melhorar ou reduzir sintomas ou sinais de doenças associados com expressão de proteína alvo.

[0102] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", como usadocom relação aos métodos aqui referem-se à eliminação, redução, supressão ou melhora, temporal ou permanentemente, parcial ou completamente, um sintoma clínico, manifestação ou progressão de ume vento, doença ou condição associada com expressão de TGFβ. Dito tratamento não precisar ser absoluto para ser útil.

[0103] A presente revelação fornece um anticorpo específico paraalvo, que pode compreender as sequências exemplares estabelecidas na Tabela 1, fragmentos, variantes e derivados dos mesmos, formulações farmacêuticas incluindo um anticorpo específico para alvo acima, métodos de preparação de formulações farmacêuticas, e métodos para tratar pacientes com as formulações e os compostos farmacêuticos.

[0104] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes classes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que podem ainda ser divididos em subclasses ou isotipos, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As estruturas de subunidade e a configuração tridimensional das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Diferentes isotipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, isotipos IgG1 e IgG3 têm atividade ADCC. Um anticorpo revelado aqui, se este compreende um domínio constante, pode ser de qualquer uma das subclasses ou isotipos.

[0105] Os anticorpos da presente revelação podem apresentar afi- nidade de ligação a um ou mais antígenos TGFβ de um Kd de menos do que ou igual a cerca de 10-5 M, menos do que ou igual a cerca de 10-6 M, ou menos do que ou igual a cerca de 10-7 M, ou menos do que ou igual a cerca de 10-8 M, ou menos do que ou igual a cerca de 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, ou 10-12 M ou menos. Ditas afinidades podem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, como por diálise de equilíbrio; usando tecnologia de ressonância de plásmon de superfície (SPR) (por exemplo, o instrumento BIAcore 2000, usando procedimentos gerais delineados pelo fabricante); pro radioimunoen- saio usando antígeno alvo marcado com 125I; ou por outros métodos estabelecidos abaixo ou conhecidos aos especialistas na técnica. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., (Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660, 1949).

[0106] Um ensaio de exclusão cinética KinExA é ainda útil paramedir a afinidade de um anticorpo para seu antígeno. A tecnologia Ki- nExA mede eventos de ligação na fase de solução, ao invés de eventos de ligação entre uma fase de solução e uma fase sólida. Além disso, enquanto muitos métodos para medir eventos de ligação requerem pelo menos um reativo modificado por imobilização ou marcação, o método KinExA não requer modificação de moléculas no estudo. O método KinExA parece permitir um intervalo mais amplo de constantes de ligação a ser medido do que outros métodos atualmente disponíveis. Descrição adicional sobre os dispositivos KinExA e operação para caracterização do anticorpo é disponível do fabricante (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) e pode ser encontrado na literatura publicada, por exemplo, patente US 6.664.114 e Darling et al., "Kinetic Ex-clusion Assay Technology: Characterization of Molecular Interactions." Assay and Drug Development Technologies, 2004, 2:647-657.Fator de transformação de crescimento β

[0107] TGFβ é um dímero ligado por dissulfeto que é sintetizado como uma pré-proteína de cerca de 400 aminoácidos (aa) que é clivada antes da secreção para produzir TGFβ maduro. O fragmento de clivagem N-terminal, conhecido como "peptídeo associado à latência" (LAP), pode permanecer não covalentemente ligado ao dímero, assim, inativando TGFβ. TGFβ isolado in vivo, é encontrado predominantemente na forma inativa, forma "latente", ou seja, associada com LAP. Complexo TGFβ latente pode ser ativado de várias formas, por exemplo, por ligação a um receptor de superfície de célula chamada de receptor de manose-6-fosfato independente de cátion/fator II de crescimento tipo insulina. A ligação ocorre através de resíduos de manose- 6-fosfato ligados aos sítios de glicosilação dentro de LAP. Na ligação ao receptor, TGFβ é liberado na sua forma madura. TGFβ madura ativa é então livre para ligar ao seu receptor e exerce suas funções biológicas. O domínio de ligação TGFβ principal no receptor TGFβ tipo II foi mapeado em uma sequência de 19 aminoácidos (Demetriou et al., J. Biol. Chem., 271:12755, 1996). Ver ainda Patente US 7.867.496.

[0108] Atualmente, há cinco isoformas conhecidas de TGFβ(TGFβ1 a TGFβ5; TGFβ1-3 são mamíferas, TGFβ4 é encontrada em galinha; e TGFβ5 encontrada em sapo), todas as quais são homólogas entre cada outra (60-80% identidade), formam homodímeros de cerca de 25 kDa, e atuam em receptores TGFβ comuns (TGFβ-RI, TGFβ-RII, TGFβ-RIIB, e TGFβ-RIII). Os aspectos estruturais e funcionais de TGFβ bem como receptores TGFβ são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Cytokine Reference, eds. Oppenheim et al., Academic Press, San Diego, Calif., 2001). TGFβ é bem conservado entre as espécies. Por exemplo, as sequências de aminoácidos de TGFβ1s madura de rato e humanos são praticamente idênticas. Ver ainda Patente US 7.867.496.

[0109] TGFβ1 desempenha um papel importante no processo decicatrização de feridas nos tecidos biológicos (New Engl. J. Med., Vol. 331, p. 1286, 1994 e J. Cell. Biol., Vol. 119, p. 1017,1992). No local de tecido ferido, as reações biológicas como infiltração de células inflamatórias e células de fibroblastos, produção de matriz extracelular (ECM) e vascularização, e crescimento celular para a regeneração do tecido subsequente ocorre para reparar o tecido lesionado. Ver ainda Patente US 7.579.186.

[0110] Camundongos deficientes em TGFβ2 demonstram defeitosdesenvolvimentais significativos, incluindo defeitos no coração, pulmão, craniofacial, membro, coluna, olho, ouvido e urogenitais (Dunker et al., Eur J Biol 267:6982-8, 2001). Camundongos deficientes em TGFβ3 demonstram ainda 100% letalidade por 24 hrs após o nascimento. Estes camundongos mostram comprometimento de palato significativo e desenvolvimento pulmonar retardado (Dunker et al., supra). TGFβ2 ainda foi envolvido no desenvolvimento de glaucoma (Luthen- Driscoll, Experimental Eye Res 81:1-4, 2005), fibrose associada com doença de Crohn (Van Assche et al., Inflamm Bowel Dis. 10:55-60, 2004), em cicatrização de ferida e neuropatia diabética (Pohlers et al., Biochim Biophys Acta 1792:746-56, 2009)

[0111] Foi observado que muitos tumores humanos (deMartin etal., EMBO J., 6: 3673 (1987), Kuppner et al., Int. J. Cancer, 42: 562 (1988)) e muitas linhagens celulares de tumor (Derynck et al., Cancer Res., 47: 707 (1987), Roberts et al., Br. J. Cancer, 57: 594 (1988)) produzem TGFβ e sugere um possível mecanismo para aqueles tumores para evadir sobrevivência imunológica normal.

[0112] Expressão da isoforma TGFβ em câncer é complexo e variável com diferentes combinações de isoformas TGFβ contendo papéis diferentes em cânceres particulares. Ver, por exemplo, Patente US 7.927.593. Por exemplo, TGFβ1 e TGFβ3 podem desempenhar um papel central em câncer ovariano e sua progressão do que TGFβ2; enquanto a expressão de TGFβ1 e TGFβ2 é maior em maior grau de tumores condrossarcoma do que TGFβ3. Em câncer de mama humano, TGFβ1 e TGFβ3 são altamente expressos, com expressão TGFβ3 parecendo se correlacionar com sobrevida geral - pacientes com me- tástase em nodos e expressão positiva de TGFβ3 têm resultados prognósticos fracos. No entanto, em câncer de cólon, TGFβ1 e TGFβ2 são mais altamente expressos do que TGFβ3 e estão presentes em maiores níveis circulantes do que em indivíduos sem câncer. Em gliomas, TGFβ2 é importante para migração celular.

[0113] Expressão de TGFβ foi ainda envolvido no início de váriasfibroses de tecido, como nefrosclerose, fibrose pulmonar e cirrose; bem como o início de vários estados, como hepatite crônica, artrite reumatoide, restenose vascular, e queloide da. Fibroses contempladas, incluindo fibroses associadas com a doença ou distúrbio (por exemplo, fibroproliferativo doenças ou distúrbios), ou tratamento de uma doença ou distúrbio, incluem, entre outros, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose peribronquiolar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença das vias aéreas pequenas (por exemplo, bronquiolite obstrutiva), enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI); fibrose pulmonar devido a agentes infecciosos ou tóxicos; fibrose renal, glomerulonefrite (GN) de todas as etiologias, por exemplo, GN proliferativa mesangial, GN imune e GN crescêntica, glomeruloesclerose, lesão tubulointersticial, fibrose intersticial renal, fibrose renal e todas as causas de fibrose intersticial renal, fibrose renal resultante de complicações de exposição ao fármaco, incluindo, tratamento com ciclosporina de receptores transplantados, por exemplo, nefropatia associada a HIV, necropatia de transplante, doença renal diabética, (por exemplo, nefropatia diabética), fibrose sistêmica ne- frogênica, diabetes, fibrose retroperitoneal idiopática, escleroderma, fibrose hepática, doenças hepáticas associadas com cicatrização ex- cessiva e esclerose progressiva, incluindo cirrose hepática devido a todas as etiologias, distúrbios da árvore biliar, disfunção hepática atribuível a infecções, doenças fibrocísticas, doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia dilatada; mio- cardite; fibrose cardíaca de estenose vascular, (por exemplo, fibrose cardíaca pós-infarto), pós infarto do miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, doença veno-oclusiva, reestenose, (por exemplo, reesteno- se pós-angioplastia), insuficiência de enxerto arteriovenoso, ateroscle- rose, hipertensão, doença cardíaca hipertensiva, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, insuficiência cardíaca, doença da aorta, esclerose sistêmica progressiva, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, fasciste, síndrome de Raynaud, artrite reuma- toide, vitreoretinopatia proliferativa, vitreoretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, como tratamento de glaucoma, fibrose associada com disfunção retinal, refixação de retina, extração da catarata, ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, fibrose associada com queimadura alcalina, fibrose de cirurgia pós catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata sub- capsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróti- cas dos olhos do segmento anterior, fibrose do estroma da córnea, (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose a rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas dos olhos do segmento posterior, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na retina ou na vasculatura da coroida do olho), fibrose de retina, fibrose epiretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada à idade), cirurgia pós retina e glaucoma, descolamento de retina por tração em associação com contração do tecido em retinopatia diabética, doença de Peyronie, esclerose sistêmica, lesão do cordão pós-espinhal, osteopo- rose, doença de Camurati-Engelmann, doença de Crohn, cicatrizes, síndrome de Marfan, insuficiência ovariana prematura, doença de Alzheimer e doença de Parkinson, fibrose devida a incisões cirúrgicas ou trauma mecânico, fibrose associada com cirurgia ocular; e cicatriz hi- pertrófica ou excessiva ou formação de queloide na derme que ocorre durante cura de ferimento resultante de trauma ou ferimentos cirúrgicos.

[0114] Em fibrose pulmonar e nefrosclerose, a concentração deTGFβ é alta e leva ao progresso de estados mórbidos, como fibrose (Yamamoto et al., Kidney Int. 45:916-27, 1994 e Westergren-Thorsson et al., J. Clin. Invest. 92:632-7, 1993). A lesão de tecido persistente foi presumida para continuamente transduzir sinais para expressar TGFβ, para suprimir o sinal de regulação negativo para expressão de TGFβ por ECM, ou causam ambos eventos sinergisticamente em fibrose pulmonar e nefrosclerose. Suprimir atividade de TGFβ e acúmulo de matriz extracelular em diagnóstico e tratamento de doenças fibróticas, usando um inibidor de TGFβ é revelado em WO 1991/04748, WO 1993/10808 e WO 2000/40227. Anticorpos anti-TGF-beta neutralizan- tes foram usados no tratamento de doença renal diabética experimental (Han and Ziyadeh, Peritoneal dialysis international, 19 Suppl 2: S234-237 (1999)). Ver ainda Patente US 7.527.791 que ainda descreve o uso de inibidores de TGFβ em várias indicações, assim incorporado por referência.

[0115] Doenças oculares exemplares (por exemplo, ocular, óptica,oftálmica ou oftalmológica), condições ou distúrbios, incluem, entre outras, distúrbios fibroproliferativos, fibrose do olho, fibroses oftálmicas, disfunção da retina, fibrose associada com disfunção da retina, degeneração macular úmida ou seca, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorreti- nopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina (por exemplo, queimadura alcalina na córnea), fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcap- sular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatu- ra da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

[0116] Doenças fibroproliferativas exemplares, condições ou distúrbios dos olhos, fibrose do olho, fibrose ocular ou fibroses oftálmicas, incluem, entre outras, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com disfunção de retina, fibrose associada com degeneração macular úmida ou seca, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, fibrose associada com queimadura alcalina, fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcap- sular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatu- ra da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

[0117] Em várias modalidades, a doença, condição ou doença, oudistúrbio fibroproliferativo do olho é selecionada do grupo que consiste em vitreorretinopatia proliferativa, fibrose associada com cirurgia ocular, fibrose de cirurgia pós-catarata das lentes, fibrose do estroma corneal e queimadura alcalina.Polipeptídeos de anticorpos

[0118] A presente revelação inclui moléculas de aminoácidos quecodificam anticorpos específicos alvos. Em modalidades exemplares, um anticorpo específico alvo da revelação pode compreender uma cadeia leve humana capa (K) ou humana lambda (À) ou uma sequência de aminoácido derivada das mesmas, ou uma cadeia pesada humana derivada destas ou ambas as cadeias pesada e leve juntas em uma forma de cadeia simples, dimérica ou tetramérica ou outra. Em algumas modalidades, uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imu- noglobulina específica alvo são diferentes moléculas de aminoácidos. Em outras modalidades, a mesma molécula de aminoácido contém uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo específico alvo.

[0119] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido doanticorpo antialvo humano compreende uma ou mais CDRs da sequência de aminoácido da (ou seja, sem sequência sinal) região variável de cadeia leve madura (VL) de anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 estabelecidos na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 4,8 e 12 ou variantes dos mesmos, incluindo anticorpos com CDR enxertado, modificados, humanizados, quiméricos ou humanos modificados ou qualquer variante descrita aqui. Em algumas modalidades, a VL compreende a sequência de aminoácido do início de CDR1 ao fim de CDR3 da cadeia leve de qualquer um dos anticorpos anteriores.

[0120] Em uma modalidade, o anticorpo específico alvo compreende uma cadeia leve CDR1, CDR2 ou CDR3 ((LCDR1, LCDR2, LCDR3), cada uma das quais é independentemente selecionada das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo contendo a região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da região VL estabelecida nas SEQ ID NOs: 4,8 e 12, um ácido nucleico que codifica a região VH estabelecida nas SEQ ID NOs: 4, 8, e 12, ou codificada por uma molécula de ácido nucleico que codifica a região VL estabelecida nas SEQ ID NOs: 3, 7, e 11. Em uma modalidade, a cadeia leve CDR1 é de aproximadamente resíduos 24-34, CDR2 é de aproximadamente resíduos 50-56 e CDR3 estende de aproximadamente resíduos 89-97, de acordo com a numeração de Chothia. Em uma modalidade alternativa, é contemplado que as CDRs de cadeia pesada são localizadas em aproximadamente resíduos 27 a 38 (CDR1); aproximadamente resíduos 56 a 65 (CDR2); e, aproximadamente resíduos 105 a 116 (linhagem germinativa) ou resíduos 105 a 117 (CDR3) de acordo com a numeração ImMunoGenTics (IMGT). Em uma modalidade, é contemplado que as CDRs de cadeia leve são localizadas em aproximadamente resíduos 26-31 (L1), 49-51 (L2) e 8897 (L3) no domínio variável de cadeia leve de uma cadeia leve de anticorpo de comprimento aproximadamente semelhante às reveladas aqui. Um polipeptídeo do anticorpo específico alvo pode compreender as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da região VL selecionada do grupo que consiste em XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681.

[0121] Em algumas modalidades, o anticorpo específico alvo humano compreende uma ou mais CDRs da sequência de aminoácido da região madura (ou seja, sem sequência sinal) variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 estabelecidos na Tabela 1 ou SEQ ID NOs: 2, 6 e 10 ou variantes dos mesmos. Em algumas modalidades, a VH compreende a sequência de aminoácido do início da CDR1 ao fim da CDR3 de qualquer cadeia pesada dos anticorpos anteriores.

[0122] Em uma modalidade, o anticorpo específico alvo compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2 ou CDR3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3), cada uma das quais são independentemente selecionadas das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo contendo a região variável de cadeia pesada compreendendo as sequência de aminoáci- do da região VH estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 6, e 10, um ácido nucleico que codificam a região VH estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 6, e 10, ou codificada por uma molécula de ácido nucleico que codifica a região VH estabelecida nas SEQ ID NOs: 1, 5, e 9. É ainda contemplado que um anticorpo específico alvo compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2 ou CDR3, cada uma das quais é independente-mente selecionada das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo contendo a região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da região VH estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 6, e 10. Em uma modalidade, as CDRs de cadeia pesada são localizadas de acordo com numeração de Chothia: CDR1 é de aproximadamente resíduos 26-35, CDR2 é de aproximadamente resíduos 50-58 e CDR3 estende de aproximadamente resíduos 95-102 (ou 95-111 ou 95-118). Em uma modalidade alternativa, é contemplado que as CDRs de cadeia pesada são localizadas em CDR1, aproximadamente resíduos 27 a 38 (CDR1); aproximadamente resíduos 56 a 65 (CDR2); e, CDR3, aproximadamente resíduos 105 a 116 (linhagem germinativa) ou resíduos 105 a 117 (CDR3) de acordo com numeração ImMunoGe- nTics (IMGT). Em uma modalidade, é contemplado que as CDRs de cadeia pesada são localizadas em aproximadamente resíduos 26-33 (H1), 50-58 (H2) e 97-111 (H3) no domínio variável de cadeia pesada de uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento aproximadamente semelhante às reveladas aqui. Um polipeptídeo do anticorpo específico alvo pode compreender as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da região VH selecionada do grupo que consiste em XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681.

[0123] Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma regiãovariável madura de cadeia leve como revelado acima e uma região madura variável de cadeia pesada como revelado acima, opcionalmente pareada como estabelecida na Tabela 1.

[0124] Em modalidades exemplares, a revelação contempla:um anticorpo monoclonal que retém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, ou LCDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 19 e 25; 14, 20 e 26; 15, 21 e 27 e SEQ ID NOs: 16, 22 e 28; 17, 23 e 29; e 18, 24 e 30, respectivamente, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma de ditas CDR(s), por exemplo, uma substituição conservada ou não conservada, e opcionalmente pareada como estabelecida na Tabela 1;um anticorpo monoclonal que retém todas as HCDR1, HCDR2, HCDR3, ou a região variável de cadeia pesada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 13, 19 e 25; 14, 20 e 26; e 15, 21 e 27, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma de ditas CDR(s), opcionalmente ainda compreendendo qualquer região constante de cadeia pesada apropriada, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, ou IgE, uma sequência humana da mesma, ou um híbrido do mesmo;um anticorpo monoclonal que retém todas LCDR1, LCDR2, LCDR3, ou a região variável de cadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16, 22 e 28; 17, 23 e 29; e 18, 24 e 30, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma das CDR(s), opcionalmente ainda compreendendo qualquer região constante de cadeia leve apropriada, por exemplo, uma região constante de cadeia leve capa ou lambda, uma sequência humana da mesma, ou um híbrido do mesmo.

[0125] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende todas as três cadeias leves CDRs, todas as três cadeias pesadas CDRs, ou todas as seis CDRs da cadeia leve e pesada, pareada como estabelecida na Tabela 1. Em algumas modalidades exemplares, duas cadeias leves CDRs de um anticorpo podem ser combinadas com uma terceira cadeia leve CDR de um diferente anticorpo. Alternativamente, LCDR1 de um anticorpo pode ser combinada com uma LCDR2 de um anticorpo diferente e uma LCDR3 de ainda outro anticorpo, particularmente onde as CDRs são altamente homólogas. De modo semelhante, duas cadeias pesadas CDRs de um anticorpo com uma terceira cadeia pesada CDR de um anticorpo diferente; ou uma HCDR1 de um anticorpo podem ser combinadas com uma HCDR2 de um anticorpo diferente e um HCDR3 de ainda outro anticorpo, particularmente, onde as CDRs são altamente homólogas.

[0126] Em algumas modalidades, um anticorpo é fornecido quecompreende um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à região variável de cadeia pesada estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 6, e 10 e/ou uma sequência de ami- noácido uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à região variável de cadeia leve estabelecida nas SEQ ID NOs: 4,8 e 12, o anticorpo ainda compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou todas de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3. Em algumas modalidades, a sequência de amino- ácido com identidade percentual à região variável de cadeia leve pode compreender uma, duas ou três das cadeias leves CDRs. Em outras modalidades, a sequência de aminoácido com identidade percentual à região variável de cadeia pesada pode compreender uma, duas ou três das cadeias pesadas CDRs.

[0127] Em outra modalidade, um anticorpo é fornecido que compreende um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à todas as três HCDRs na região variável de cadeia pesada de uma sequência de anticorpo na tabela 1, as CDRs estabelecida nas SEQ ID NOs: 13, 19 e 25; 14, 20 e 26; e 15, 21 e 27.

[0128] Em uma modalidade relacionada, um anticorpo é fornecidoque compreende um polipeptídeo contendo uma sequência de amino- ácido pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à todas as três LCDRs na região variável de cadeia leve de uma sequência de anticorpo na Tabela 1, as CDRs estabelecida nas SEQ ID NOs: 16, 22 e 28; 17, 23 e 29; e 18, 24 e 30.

[0129] Em outra modalidade, um anticorpo é fornecido que compreende um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticas à todas as seis CDRs nas regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de uma sequência de anticorpo na Tabela 1, as CDRs estabelecida nas SEQ ID NOs: 13, 19 e 25; 14, 20 e 26; e 15, 21 27; 16, 22 e 28; 17, 23 e 29; e 18, 24 e 30.

[0130] É contemplado que os anticorpos da revelação podem teruma, duas ou mais substituições de aminoácidos nas regiões CDR do anticorpo, por exemplo, substituições não conservativas ou conservati- vas.

[0131] Em uma modalidade relacionada, os resíduos da estruturasão alterados. As regiões estruturais de cadeia pesada que podem ser alteradas ficam nas regiões designadas H-FR1, H-FR2, H-FR3 e H- FR4, que circundam os resíduos de cadeia pesada CDR, e os resíduos das regiões estruturais de cadeia leve que podem ser alterados ficam nas regiões designadas L-FR1, L-FR2, L-FR3 e L-FR4, que circundam os resíduos CDR de cadeia leve. Um aminoácido dentro da região estrutural pode ser substituído, por exemplo, com qualquer aminoácido apropriado identificado em uma estrutura humana ou estrutura consenso humana.

[0132] Em modalidades exemplares, um anticorpo anti-TGFβ descrito aqui especificamente se liga a pelo menos uma isoforma de TGFβ selecionada do grupo que consiste em TGFβ1, TGFβ2, e TGFβ3. Em outras modalidades, o anticorpo anti-TGFβ especificamente se liga: (a) TGFβ1, TGFβ2, e TGFβ3 ("anticorpo pan-reativo" ou "anticorpo de pan-ligação"); (b) TGFβ1 e TGFβ2; (c) TGFβ1 e TGFβ3; e (d) TGFβ2 e TGFβ3. Em modalidades exemplares, um anticorpo anti-TGFβ descrito aqui se liga a pelo menos uma isoforma de TGFβ com uma afinidade de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, ou 10-12 M ou menos (menor significa menor afinidade de ligação), ou opcionalmente se liga a duas isoformas TGFβ, ou todas de TGFβ1, 2, ou 3 com uma afinidade de 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M 10-10 M 10-11 M ou 10-12 M ou me.,, , , nos de uma ou mais das isoformas. Em outras modalidades, um anticorpo descrito aqui se liga a TGFβ1 e TGFβ2 com pelo menos 2-50 vezes, 10-100 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, ou 20-50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% maior afinidade (por exemplo, preferencialmente se liga a TGFβ1 e TGFβ2) comparado à ligação a TGFβ3. Alternativamente, um anticorpo descrito aqui, se liga a cada uma das isoformas de TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 com uma afinidade de 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes de cada outro.

[0133] Em algumas modalidades, neutralização de anticorpo deTGFβ1 e TGFβ2 é e pelo menos 2-50 vezes, 10-100 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, ou 20-50%, 50100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% mais potente que a neutralização de TGFβ3.

[0134] Sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve deXPA.42.089 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 6 e 8, respectivamente. Sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve de XPA.42.068 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2 e 4, respectivamente, e sequências de aminoácido de cadeia pesada e leve de XPA.42.681 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 10 e 12, respectivamente.

Ácidos nucleicos de anticorpo

[0135] A presente revelação ainda inclui moléculas de ácido nu-cleico que codifica anticorpos específicos alvos. Em algumas modalidades, diferentes moléculas de aminoácido codificam uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo específico alvo. Em outras modalidades, a mesma molécula de ácido nucleico codifica região variável de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo específico alvo. Em uma modalidade, o ácido nucleico codifica um anticorpo específico alvo da presente revelação, bem co mo qualquer um dos polipeptídeos codificadas por ácidos nucleicos descritos aqui.

[0136] Em um aspecto, uma molécula de ácido nucleico da presente revelação compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência VL de aminoácido de anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 estabelecida nas SEQ ID NOs: 4, 8 e 12 ou uma porção das mesmas. Em um aspecto relacionado, a sequência VL de aminoácido é uma sequência consenso. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido das CDRs de cadeia leve de dito anticorpo. Em algumas modalidades, dita porção é uma porção contígua compreendendo CDR1-CDR3. Em uma modalidade, dita porção compreende pelo menos uma, duas ou três da uma região de cadeia leve CDR1, CDR2, ou CDR3, opcionalmente com uma diferente estrutura humana ou estrutura consenso humana, e opcionalmente com 1, ou até 2, ou até 3 mutações nas 3 CDRs coletivas.

[0137] Em uma modalidade a presente revelação fornece compostos de ligação ao antígeno, incluindo fragmentos funcionais, contendo uma sequência de aminoácido de região variável estabelecidas nas quaisquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, e 10 e 4, 8 e 12. Em uma modalidade relacionada, um composto de ligação ao antígeno acima mencionado é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo tetramé- rico totalmente montado, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado; um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; um anticorpo multiespecífico, um fragmento de anticorpo, Fab, F(ab')2; Fv; scFv ou fragmento de anticorpo de cadeia simples; um diabody; triabody, tetrabody, minibody, anticorpo linear; anticorpo recombinante quelante, um tribody ou bibody, um intrabody, um nanobody, um imunofármaco modular pequeno (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou uma variante ou derivado de qualquer um destes anticorpos, que compreendem uma ou mais sequências CDR da revelação e apresentam a atividade biológica desejada, ou uma mistura de dois ou mais anticorpos. Os compostos de ligação ao antígeno da presente revelação preferencialmente retêm afinidade de ligação de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M ou menos para um ou mais TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3, como medido por ressonância de plásmon de superfície.

[0138] Em um aspecto, os anticorpos da presente revelação compreendem uma região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve como estabelecido nas sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 2, 6, e 10 e SEQ ID NOs: 4, 8 e 12, respectivamente, como pareado na Tabela 1. É ainda contemplado que os anticorpos podem compreender todos ou parte dos anticorpos estabelecidos nas sequências de aminoácidos acima. Em uma modalidade, os anticorpos compreendem pelo menos uma das CDR1, CDR2, ou CDR3 da cadeia pesada das SEQ ID NOs: 2, 6, e 10, ou pelo menos uma das CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia leve das SEQ ID NOs: 4, 8 e 12, como pa- reado na Tabela 1.

[0139] Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende umasequência de aminoácido identificada como uma sequência CDR3 de cadeia pesada. Dita uma "sequência CDR3 de cadeia pesada" (HCDR3) inclui uma sequência de aminoácido identificada como uma sequência CDR3 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 1 e SEQ ID NOs: 15, 21 e 27. Alternativamente, a sequência HCDR3 compreende uma sequência de aminoácido que contém uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, substituição, inserção ou deleção) comparadas a qualquer sequência de aminoácido HCDR3 identificada na Tabela 1. Substituições preferenciais incluem a substituição a um aminoácido na posição correspondente com outra HCDR3 da Tabela 1. Alternativamente, a sequência HCDR3 pode compreender uma se- quência consenso de aminoácido da HCDR3 descrita aqui.

[0140] A cadeia pesada compreendendo uma sequência HCDR3descrita acima pode ainda compreender uma "sequência CDR1 de cadeia pesada" (HCDR1), que inclui qualquer uma das sequências de aminoácido identificada como uma HCDR1 na SEQ ID NOs: 13, 19 e 25 e Tabela 1, sequências de aminoácido que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação a qualquer HCDR1 identificada nas SEQ ID NOs: 13, 19 e 25 e Tabela 1, preferencialmente uma substituição a um aminoácido na posição correspondente com outra HCDR1 da Tabela 1, ou uma sequência consenso do HCDR1 descrito aqui.

[0141] Alternativamente, a cadeia pesada compreendendo umasequência HCDR3 descrita acima pode ainda compreender uma "sequência CDR2 de cadeia pesada" (HCDR2), que inclui qualquer uma das sequências de aminoácidos identificada como uma HCDR2 nas SEQ ID NOs: 14, 20 e 26 e Tabela 1, sequências de aminoácido que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação a qualquer HCDR2 identificada nas SEQ ID NOs: 14, 20 e 26 e Tabela 1, preferencialmente a substituição a um aminoácido na posição correspondente dentro de outra HCDR2 da Tabela 1, ou uma sequência consenso da HCDR2 descrita aqui.

[0142] A cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR3 decadeia pesada descrita acima pode ainda compreender ambas (a) uma sequência CDR2 de cadeia pesada descrita acima e (b) uma sequência CDR2 de cadeia pesada desta invenção descrita acima.

[0143] Um aspecto da presente revelação fornece um anticorpoque se liga ao antígeno alvo compreendendo uma cadeia pesada que compreende qualquer uma, duas, e/ou três das sequências de CDR de cadeia pesada descritas abaixo.

[0144] Qualquer uma das sequências CDR de cadeia pesada des- crita acima podem ainda incluir aminoácidos a qualquer extremidade das CDRs. Preparação de variantes e derivados de anticorpos e compostos de ligação ao antígeno da presente invenção, incluindo maturação de afinidade ou preparação de variantes ou derivados contendo análogos de aminoácidos, é descrita em maiores detalhes aqui. Variantes exemplares incluem aquelas contendo uma substituição conservada ou não conservada de um aminoácido correspondente dentro da sequência de aminoácido, ou uma substituição de um aminoácido com um aminoácido correspondente de uma sequência de anticorpo humano diferente.

[0145] Anticorpos compreendendo qualquer uma das cadeias pesadas descritas acima podem ainda compreender uma cadeia leve, preferencialmente uma cadeia leve que se liga ao antígeno alvo, e mais preferencialmente uma cadeia leve compreendendo sequências CDR de cadeia leve descritas abaixo.

[0146] Outro aspecto da presente revelação fornece um anticorpoque se liga ao antígeno alvo compreendendo uma cadeia leve que compreende qualquer uma, duas, e/ou três das sequências de CDR de cadeia leve descritas abaixo.

[0147] Preferencialmente a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido identificada como uma sequência CDR3 de cadeia leve. Dita uma "sequência CDR3 de cadeia leve" (LCDR3) inclui uma sequência de aminoácido identificada como uma sequência CDR3 de cadeia leve na Tabela 1 e nas SEQ ID NOs: 18, 24 e 30. Alternativamente, a sequência CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que contém uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, substituição, inserção ou deleção) em comparação a qualquer sequência CDR3 de cadeia leve de aminoácido identificada na Tabela 1. Substituições preferenciais incluem a substituição a um aminoácido na posição correspondente dentro de outra cadeia leve CDR3 da Tabela 1.

[0148] A cadeia leve compreendendo uma sequência CDR3 decadeia leve descrita acima pode ainda compreender uma "sequência CDR1 de cadeia leve", que inclui qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como uma cadeia leve CDR1 nas SEQ ID NOs: 16, 22, e 28 ou Tabela 1, sequências de aminoácido que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação a qualquer CDR1 de cadeia leve identificada nas SEQ ID NOs: 16, 22, e 28 ou Tabela 1, preferencialmente a substituição a um aminoácido na posição correspondente dentro de outra CDR1 de cadeia leve da Tabela 1.

[0149] Alternativamente, a cadeia leve compreendendo uma sequência CDR3 de cadeia leve descrita acima pode ainda compreender uma "sequência CDR2 de cadeia leve", que inclui qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como uma cadeia leve CDR2 nas SEQ ID NOs: 17, 23 e 29 ou Tabela 1, sequências de aminoácido que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação à qualquer CDR2 de cadeia leve identificada na Tabela 1, preferencialmente a substituição a um aminoácido na posição correspondente dentro de outra CDR2 de cadeia leve das SEQ ID NOs: 17, 23 e 29 ou Tabela 1.

[0150] Em um aspecto relacionado, a presente revelação contempla um polipeptídeo purificado compreendendo pelo menos uma HCDR das SEQ ID NOs: 13-15, 19-21 e 25-27 ou LCDR das SEQ ID NOs: 16-18, 22-24 e 28-30, em que as regiões estruturais da região variável de cadeia pesada e as regiões estruturais da região variável de cadeia leve compreendem regiões estruturais de um anticorpo humano. Em outra modalidade, as regiões estruturais da região variável de cadeia pesada e as regiões estruturais da região variável de cadeia leve são quimicamente alteradas por substituição de aminoácido para ser mais homóloga a uma sequência de anticorpo humano diferente. Por exemplo, dentro de cada região estrutural de cadeia pesada (H- FR1-4) é contemplado que pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis resíduos de região estrutural da região variável de cadeia pesada foram alterados por substituição de aminoácido, e em que dentro de cada região estrutural de cadeia leve (L-FR1-4), pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis resíduos estruturais da região variável de cadeia leve foram alterados por substituição de aminoácido.

[0151] A cadeia leve compreendendo uma sequência CDR3 decadeia leve descrita acima pode ainda compreender ambos (a) uma sequência CDR1 de cadeia leve descrita acima e (b) uma sequência CDR2 de cadeia leve descrita acima.

[0152] Anticorpos compreendendo qualquer uma de regiões variáveis de cadeia leve descritas acima pode ainda compreender uma região variável de cadeia pesada, opcionalmente pareado como descrito na Tabela 1, preferencialmente a região variável de cadeia pesada que se liga ao antígeno alvo, e mais preferencialmente a região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR de cadeia pesada descritas acima.

[0153] Ainda em outra modalidade, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 6, e 10 e a região variável de cadeia leve é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 8 e 12.

[0154] Em um aspecto relacionado, a molécula de ácido nucleicocompreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido de cadeia leve de uma das SEQ ID NOs: 4, 8 e 12 ou uma porção das mesmas. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo de cadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 7 e 11 ou uma porção das mesmas. Moléculas de ácido nucleico da revelação ainda incluem todas as sequências de ácido nucleico, incluindo as sequências nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 e 11 e sequências de ácido nucleico compreende códons de degeneração baseados na diversidade de código genético, que codificam uma sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo descrito aqui ou qualquer HCDRs ou LCDRs descrita aqui, e como estabelecido nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 13-30, bem como ácidos nucleicos que hibridizam em condições rigorosas, como aquelas descritas aqui, a uma sequência de um ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo descrito aqui ou qualquer HCDRs ou LCDRs descrita aqui, e como estabelecido nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 13-30.

[0155] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleicocodifica uma sequência de aminoácido VL que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 97, 98 ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido VL estabelecida nas SEQ ID NOs: 4, 8 e 12. Moléculas de ácido nucleico da revelação incluem ácidos nucleicos que hibridizam em condições altamente rigorosas, como aquelas descritas aqui, a uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido de região variável de cadeia leve das SEQ ID NOs: 4, 8 e 12, ou que tem a sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia leve das SEQ ID NOs: 3, 7 e 11.

[0156] É ainda contemplado que uma molécula de ácido nucleicoda revelação compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido VH de qualquer um dos anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681, ou uma porção das mesmas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica a sequência de aminoácido das CDRs de cadeia pesada de dito anticorpo. Em algumas modalidades, dita porção é uma porção contígua compreendendo CDR1-CDR3 de cadeia pesada. Em uma modalidade, dita porção compreende pelo menos uma, duas ou três de uma região CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia pesada, opcionalmente com uma estrutura humana diferente ou consenso humana, e opcionalmente com 1, ou até 2, ou até 3 mutações nas 3 CDRs coletivas.

[0157] Em um aspecto relacionado, a molécula de ácido nucleicocompreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido de cadeia pesada de uma das cadeias pesadas das SEQ ID NOs: 2, 6, e 10 ou uma porção das mesmas. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 1, 5 e 9 ou uma porção das mesmas.

[0158] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleicocodifica uma sequência de aminoácido VH que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido VH estabelecida nas SEQ ID NOs: 2, 6, e 10. Em um aspecto relacionado, a sequência de aminoácido VH é uma sequência consenso. Moléculas de ácido nucleico da revelação ainda incluem ácidos nucleicos que hibridizam em condições altamente rigorosas, como aquelas descritas aqui, a uma sequência de ácido nuclei- co que codifica a região variável de cadeia pesada sequência de ami- noácido das SEQ ID NOs: 2, 6, e 10, ou que tem uma sequência de ácido nucleico de região variável de cadeia pesada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 5 e 9.

[0159] É ainda contemplado que os ácidos nucleicos da revelaçãopodem codificar uma cadeia leve ou cadeia pesada completa de um anticorpo selecionado de XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 em que uma cadeia leve completa ou cadeia pesada completa compreende uma região constante de cadeia leve ou uma região constante de cadeia pesada, respectivamente, regiões constantes de cadeia leve opcionalmente incluem regiões constantes pesadas modificadas ou não modificadas capa ou lambda, e regiões constantes pesadas incluem regiões constantes modificadas ou não modificadas de qualquer uma das classes, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, ou IgE.

[0160] Em um aspecto, o anticorpo de cadeia leve completa compreende as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 4, 8 e 12. É ainda contemplado que o nucleotídeo que codifica a cadeia leve completa codifica as sequências SEQ ID NOs: 4, 8 e 12, e compreende a sequência de nucleotídeos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 3, 7 e 11.

[0161] Em um aspecto, o anticorpo de cadeia pesada completocompreende as sequências em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, e 10. É ainda contemplado que o nucleotídeo que codifica a cadeia pesada completa codifica as sequências de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 2, 6 e 10, e compreende a sequência de nucleotídeos estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 5 e 9.

[0162] Em outras modalidades, a revelação fornece um anticorpoque se liga ao fator de transformação de crescimento beta (TGFβ)1, TGFβ2 e TGFβ3 compreendendo a região variável de cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada, em que (a) a região variável de cadeia leve compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NOs: 16, 22 e 28 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NOs: 17, 23 e 29 ou sequências pelo menos 80% idênticas para as mesmas, e/ou uma CDR3 selecionada das SEQ ID NOs: 18, 24 e 30 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas; e/ou em que (b) a região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NOs: 13, 19 e 25 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NOs: 14, 20 e 26 ou sequências pelo menos 80% idênticas para as mesmas, e/ou uma CDR3 selecionada das SEQ ID NOs: 15, 21 e 27 ou sequências pelo menos 80% idêntica para as mesmas.

[0163] Em uma modalidade relacionada, a região variável de cadeia leve compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 16 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 17 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 18 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas; e/ou região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 13 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 14 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 15 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas.

[0164] Em outra modalidade, a região variável de cadeia levecompreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 22 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 23 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 24 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas; e/ou região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 19 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 20 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 21 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas.

[0165] Ainda em uma modalidade, a região variável de cadeia levecompreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 28 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 29 ou sequências pelo menos 90% idên- tica para as mesmas, uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 30 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas; e/ou região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR1 selecionada das SEQ ID NO: 25 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR2 selecionada das SEQ ID NO: 26 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas, uma CDR3 selecionada das SEQ ID NO: 27 ou sequências pelo menos 90% idêntica para as mesmas.

[0166] Em modalidades exemplares, um anticorpo da revelaçãocompreende uma cadeia leve humana capa (K) ou humana lambda (À) sequência de aminoácido derivada das mesmas, ou uma cadeia pesada humana ou sequência derivada destas ou ambas as cadeias pesada e leve juntas em uma forma de cadeia simples, dimérica ou tetra- mérica ou outra.

Anticorpos monoclonais;

[0167] Anticorpo monoclonal se refere a um anticorpo obtido deuma população de anticorpos substancialmente homogêneos. Anticorpos monoclonais são geralmente altamente específicos e podem ser direcionados contra um sítio antigênico único, em contraste às preparações de anticorpo convencional (policlonal) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra os mesmos ou diferentes determinantes (epítopos). Além de suas especificidades, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que são sintetizados pela cultura homogênea, não contaminados por outras imunoglobulinas com diferentes especificidades e características.

[0168] Anticorpos monoclonais podem ser preparados pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (Nature, 256:495-7, 1975) (Harlow & Lane; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986), ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, patente US 4.816.567). Os anticorpos monoclonais podem ainda ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clack- son et al., (Nature 352:624-628, 1991) e Marks et al., (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Métodos adicionais para produzir anticorpos mo- noclonais são bem conhecidos a um especialista na técnica.

[0169] Anticorpos monoclonais, como aqueles produzidos pelosmétodos acima, são apropriadamente separados de meio de cultura, fluido ascites, ou soro por procedimentos de purificação de imunoglo- bulina convencionais como, por exemplo, Proteína A-Sepharose, cro- matografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca iôni- ca, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise, e/ou cromatografia por afinidade.

[0170] É ainda contemplado que anticorpos da presente revelaçãopodem ser usados como fragmentos de ligação ao antígeno menores do anticorpo são bem conhecidos na técnica e descritas aqui.

Fragmentos de Anticorpos.

[0171] Fragmentos de anticorpo compreendem uma porção de anticorpo completo intacto, preferencialmente uma ligação de antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diabodies; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv); fragmentos de anticorpo multiespecíficos como anticorpos biespecíficos, triespecíficos, etc. anticorpos (por exemplo, dia- bodies, triabodies, tetrabodies); minibody; anticorpo recombinante que- lante; tribodies ou bibodies; intrabodies; nanobodies; imunofármacos modulares pequenos (SMIP), proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de; anticorpos camelizados; anticorpos contendo VHH; e outros polipeptídeos formados de fragmentos de anticorpo. Ver, por exemplo, Holliger & Hudson (Nat. Biotech. 23:1126-36 (2005)).

[0172] Digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentosde ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", fragmentos monovalentes que consistem em domínios VL, VH, CL e CH cada um com um sítio de ligação ao antígeno único, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. Tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ligação dissulfeto na região em dobradiça, que tem dois fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo única. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o Fv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno, resultando em um anticorpo de cadeia simples (scFv), em que uma região VL e VH são pareadas para formar uma molécula monovalente via um ligante sintético que permite que as mesmas sejam preparadas como uma cadeia de proteína única (Bird et al., Science 242:423-426, 1988, e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Para uma revisão de scFv ver Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l 13, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Um fragmento Fd consiste nos domínios VH e CH1.

[0173] Fragmentos de anticorpo adicionais incluem um fragmentode anticorpo (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) que consiste em um domínio VH. Diabodies são anticorpos bivalentes em que domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia de polipeptí- deo, mas usando um ligante que é muito curto para permitir o parea- mento entre os dois domínios na mesma cadeia, assim, forçando os domínios para parear com domínios de complementariedade de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, e Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Di- abodies podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[0174] Anticorpos de cadeia pesada funcionais das cadeias levessão de ocorrência natural em tubarões-lixa (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), tubarões wobbegong (Nuttall et al., Mol Immunol. 38:313-26, 2001) e Camelidae (Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998), como camelos, dromedários, alpacas e lhamas. O sítio de ligação ao antígeno é reduzido a um domínio simples, o domínio simples, o domínio VHH, nestes animais. Estes anticorpos formam regiões de ligação ao antí- geno usando somente região variável de cadeia pesada, ou seja, estes anticorpos funcionais são homodímeros de cadeias pesadas somente contendo a estrutura H2L2 (referenciada como "anticorpos de cadeia pesada" ou "HCAbs"). VHH camelídeo reportadamente recombina com regiões constantes de IgG2 e IgG3 que contêm domínios em dobradiça, CH2, e CH3 e não têm um domínio CH1 (Hamers-Casterman et al., supra). Por exemplo, IgG1 é um isotipo de anticorpo convencional (H2L2) em que VH recombina com uma região constante que contém domínios em dobradiça, CH1, CH2 e CH3, enquanto que isotipos de lhamas IgG2 e IgG3 são somente de cadeia pesada que não têm domínios CH1 e que não têm cadeias leves. Domínios VHH de camelídeos demonstraram se ligar ao antígeno com alta afinidade (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) e possuem estabilidade alta em solução (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). Fragmentos somente VH clássicos são difíceis para produzir em forma solúvel, mas melhoras na solubilidade e especificidade de ligação podem ser obtidas quando resíduos estruturais são alterados para serem mais tipo VHH. (Ver, por exemplo, Reichman, et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38.) Métodos para gerar anticorpos contendo cadeias pesadas de camelídeo são descritos em, por exemplo, publicações de patentes US 20050136049 e 20050037421.

[0175] O domínio variável de uma cadeia pesada de anticorpo é omenor fragmento de ligação antígeno funcional com uma massa molecular de somente 15 kDa, esta totalidade é referenciada como um nanobody (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Uma biblioteca de nanobody pode ser gerada de um dromedário imunizado como descrito em Conrath et al., (Antimicrob Agents Che- mother 45: 2807-12, 2001) ou usando métodos recombinantes como descrito em Revets et al, Expert Opin. Biol. Ther. 5(1):111-24 (2005).

[0176] A produção de Fab-scFv biespecíficos ("bibody") e Fab-(scFv)(2) triespecíficos ("tribody") são descritos em Schoonjans et al. (J Immunol. 165:7050-57, 2000) e Willems et al. (J Chromatogr B Ana- lyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Para bibodies ou tribodies, uma molécula scFv é fundida a uma ou ambas as cadeias VLCL (L) e VH-CH1 (Fd), por exemplo, para produzir um tribody de dois scFvs são fundidos ao C-term de Fab enquanto um bibody uma scFv é fundida ao C-term de Fab.

[0177] Um "minibody" que consiste em scFv fundido a CH3 via umligante peptídeo (sem dobradiça) ou via uma dobradiça IgG foi descrito em Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 17(4):315-23, 2004.

[0178] Intrabodies são anticorpos de cadeia simples que demonstram a expressão intracelular e podem manipular a função de proteína intracelular (Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21, 2004). Intrabodies, que compreendem sequências sinais de célula que retêm o construto anticorpo em regiões intracelulares, podem ser produzidas como descrito em Mhashilkar et al (EMBO J 14:1542-51, 1995) e Wheeler et al. (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Transbodies são anticorpos permeáveis à célula em que um domínio de transdução de proteína (PTD) é fundido com um anticorpos de fragmento variável de cadeia simples (scFv) Heng et al., (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

[0179] São ainda contemplados anticorpos que são SMIPs ou proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação específico para proteína alvo. Estes constructos são polipeptídeos de cadeia simples compreendendo domínios de ligação ao antígeno fundidos aos domínios de imunoglobulina necessários para realizar funções efetoras do anticorpo. Ver, por exemplo, WO03/041600, Publicação de patente US 20030133939 e Publicação de patente US 20030118592.

[0180] Uma ou mais CDRs podem ser incorporadas em uma molécula covalentemente ou não covalentemente para tornar esta uma imunoadesina. Uma imunoadesina pode incorporar as CDR(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo maior, pode covalentemente ligar as CDR(s) a outra cadeia de polipeptídeo ou pode incorporar as CDR(s) não covalentemente. As CDRs permitem que imunoadesinas especificamente se liguem a um antígeno particular de interesse.

[0181] Assim, uma variedade de composições compreendendouma, duas, e/ou três CDRs (por exemplo, uma CDR única isolada ou em tandem, 2, 3, ou outras repetições múltiplas das CDRs; ou combinações de 2 ou 3 CDRs isoladas ou em repetições em tandem; opcionalmente, com uma sequência espaçadora de aminoácido entre CDRs ou repetições) da região variável de cadeia pesada ou a região variável de cadeia leve de um anticorpo podem ser geradas por técnicas conhecidas na prática.

Anticorpos multiespecíficos

[0182] Em algumas modalidades, pode ser desejável gerar anticorpo antialvo multiespecífico (por exemplo, biespecífico) contendo especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes das mesmas ou diferentes moléculas. Anticorpos biespecíficos exem- plares podem se ligar aos dois epítopos diferentes da molécula alvo. Alternativamente, o braço do anticorpo específico ao alvo pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula de superfície celular, como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FCYR), como FCYRI (CD64), FCYRII (CD32) e FCYRIII (CD16) de modo a focar em mecanismos de defesa celular ao alvo. Anticorpos biespecíficos podem ainda ser usados para localizar agentes citotóxicos que expressam ou absorvem o alvo. Estes anticorpos possuem um braço de ligação ao alvo e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti- interferon-60, alcaloide da vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

[0183] De acordo com outra abordagem para preparar anticorposbiespecíficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser modificada para maximizar o percentual de heterodímeros que são recuperados de cultura de célula recombinante. A interface preferencial compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface desta primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às cadeias laterais grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais de aminoácidos com àquelas menores (por exemplo, alanina ou treo- nina). Isto fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do he- terodímero sobre subprodutos indesejados como homodímeros. Ver WO96/27011.

[0184] Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconju- gado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Anticorpos hete- roconjugados podem ser preparados usando qualquer método de reti- culação convenientes. Agentes de reticulação apropriados são bem conhecidos na técnica e são revelados na patente US 4.676.980, junto com um número de técnicas de reticulação.

[0185] As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos de fragmentos de anticorpo foram ainda descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., (Science 229:81-83, 1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença de agente de complexação ditiol de arsenito de sódio para estabilizar di- tiois vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos aos derivados tionitro- benzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido ao Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado Fab'-TNB para formar o anti-corpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. Ainda outra modalidade, fragmentos Fab'-SH diretamente recuperado de E. coli podem ser quimicamente acoplados in vitro para formar anticorpos biespecíficos. (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))

[0186] Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descreve aprodução de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E.coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar as células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra altos de tumor de mama.

[0187] Várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecíficos diretamente de cultura de célula recombinante foram ainda descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zipers de leucina. (Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992). Os peptídeos de zíper leucina de proteínas Fos e Jun foram ligados às partes Fab' de dois diferentes anticorpos por fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região em dobradiça para formar monômeros e então novamente oxidado para formar heterodímeros de anticorpo. Este método pode ainda ser utilizado para a produção dos homodímeros de anticorpo. A tecno-logia de "diabody" descrita por Hollinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993) forneceu um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpo biespecífico.

[0188] Os fragmentos compreendem a região variável de cadeiapesada (VH) conectada a uma região variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito pequeno para permitir pareamento entre os dois domínios da mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear com os domínios complementares VL e VH de outro fragmento, assim, formando dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo bi- específico pelo uso de dímeros Fv de cadeia simples (scFv) foram ainda reportados. Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

[0189] Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser um "anticorpo linear" produzido como descrito em Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995). Anticorpos lineares compreendem um par de segmentos tandem Fd (VH -CH1-VH -CH1) que formaram um par de regiões de ligação ao antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecífi- cos ou monoespecíficos.

[0190] Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo recombinante quelante (CRAb). Um anticorpo recombinante quelante reconhece epítopos adjacentes e não sobrepostos do antíge- no alvo, e é flexível suficiente para ligar a ambos epítopos simultaneamente (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).

[0191] Anticorpos com mais de duas valências também são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).

Anticorpos quiméricos e humanizados

[0192] Devido ao fato de anticorpos quiméricos ou humanizadosserem menos imunogênicos em humanos do que os anticorpos mono- clonais parentes não humanos (por exemplo, de camundongos), podem ser usados para o tratamento de humanos com muito menos risco de anafilaxia.

[0193] Anticorpos monoclonais quiméricos em que os domínios Igvariáveis de um anticorpo monoclonal não humano (por exemplo, ca-mundongo) são fundidos a domínios Ig constantes humanos, podem ser gerados usando procedimentos padrões conhecidos na técnica (Ver Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855 (1984); e, Boulianne et al, Nature 312, 643-646, (1984)).

[0194] Anticorpos humanizados podem ser obtidos por uma variedade de métodos incluindo, por exemplo: (1) enxertar regiões determinantes de complementaridade não humanas (CDRs) em uma estrutura humana e região constante (um processo referenciado na técnica como humanização por "enxerto CDR"), (2) transplantar os domínios variáveis não humanos inteiros, mas "disfarçando" os mesmos com uma superfície tipo humana por colocação de resíduos de superfície (um processo referenciado na técnica como "recobrimento"), ou, alternativamente, (3) substituir aminoácidos humanos em posições determinadas para ser improvável em adversamente efetuar ligação ao antígeno ou recobrimento da proteína, mas provável de reduzir a imunogenici- dade em um ambiente humano (por exemplo, HUMAN ENGINEERING™). Na presente revelação, anticorpos humanizados irão incluir ambos anticorpos "humanizados," "recobertos" e "HUMAN ENGINEERED™". Estes métodos são revelados em, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan,Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31:169217 (1994); Studnicka et al. Patente US 5.766.886; Studnicka et al., (Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Co et al., J. Immunol. 152, 2968-2976 (1994); Riechmann, et al., Nature 332:323-27 (1988); e Kettleborough et al., Protein Eng. 4:773-783 (1991) cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

[0195] Enxerto de CDR envolve a introdução de uma ou mais dasseis CDRs dos domínios Ig variáveis de cadeia pesada de camundongos nas quatro regiões estruturais apropriadas de domínios Ig variáveis humanas. Esta técnica (Riechmann, et al., Nature 332:323-27 (1988)), utiliza as regiões estruturais conservadas (FR1-FR4) como uma estrutura para suportar as alças CDR que são os contatos primários com o antígeno. Uma desvantagem de CDR enxertado, no entanto, é que esta pode resultar em um anticorpo humanizado que tem uma afinidade de ligação substancialmente inferior do que o anticorpo de camundongo original, porque aminoácidos das regiões estruturais podem contribuir à ligação ao antígeno, e porque aminoácidos das alças CDR podem influenciar a associação de dois domínios Ig variáveis. Para manter a afinidade de anticorpo monoclonal humanizado, a técnica de enxertar CDR pode ser melhorada por escolha de regiões estruturais humanas que mais se assemelham às regiões estruturais do anticorpo de camundongo original, e mutagênese direcionada por sítio de aminoácidos únicos dentro da estrutura ou CDRs ajudadas por modelagem de computador do sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, Co et al., J. Immunol. 152, 2968-2976 (1994)).Anticorpos humanos de animais transgênicos

[0196] Anticorpos humanos para proteína alvo podem ainda serproduzidos usando animais transgênicos que não têm produção de imunoglobulina endógena e são modificadas para conter locais de imunoglobulina humana. Por exemplo, WO 98/24893 revela animais transgênicos contendo um local Ig humano em que os animais que não produzem imunoglobulinas endógenas funcionais devido à inati- vação de locais de cadeia pesada e leve endógenas. WO 91/00906 ainda revela hospedeiros mamíferos não primatas transgênicos capazes de montar uma resposta imune a um imunógeno que os anticorpos têm regiões constantes e/ou variáveis de primatas, em que imunoglo- bulinas endógenas que codificam locais são substituídas ou inativa- das. WO 96/30498 e Patente US 6.091.001 revela o uso de sistema Cre/Lox para modificar o local da imunoglobulina em um mamífero, como para substituir todas ou uma porção da região constante ou variável para formar uma molécula de anticorpo modificada. WO 94/02602 revela hospedeiros mamíferos não humanos contendo locais de Ig endógenos inativados e locais Ig humanos funcionais. Patente US 5.939.598 revela métodos para preparar camundongos transgênicos em que os camundongos sem cadeias pesadas endógenas, e expressam um local de imunoglobulina exógena compreendendo uma ou mais regiões constantes xenogênicas. Ver ainda patentes US 6.114.598, 6.657.103 e 6.833.268.

[0197] Usando um animal transgênico descrito acima, uma resposta imune pode ser produzida a uma molécula antigênica selecionada e células que produzem anticorpos podem ser removidas do animal e usadas para produzir hibridomas que secretam anticorpos monoclo- nais. Protocolos de imunização, adjuvantes, e semelhantes são co- nhecidos na técnica e são usados na imunização de, por exemplo, um camundongo transgênico como descrito em WO 96/33735. Esta publicação revela anticorpos monoclonais contra uma variedade de moléculas antigênicas incluindo IL-6, IL-8, TNFa, CD4 humana, L selectina, gp39, e toxina tetânica. Os anticorpos monoclonais podem ser testados para a capacidade de inibir ou neutralizar a atividade biológica ou efeito fisiológico da proteína correspondente. WO 96/33735 revela que anticorpos monoclonais contra IL-8, derivados de células imunes de camundongos transgênicos imunizados com IL-8, bloquearam funções induzidas por IL-8 de neutrófilos. Anticorpos monoclonais humanos com especificidade para o antígeno usado para imunizar animais transgênicos são ainda revelados em WO 96/34096 e pedido de patente US 20030194404; e pedido de patente US 20030031667.

[0198] Animais transgênicos adicionais úteis para preparar anticorpos monoclonais incluem Medarex HuMAb-MOUSE®, descritos na patente US 5.770.429 e Fishwild, et al. (Nat. Biotechnol. 14:845-851 (1996)), que contêm sequencias de gene de genes de anticorpos humanos não rearranjados que codificam para as cadeias pesada e leve de anticorpos humanos. A imunização de um HuMAb-MOUSE® permite a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos à proteína alvo.

[0199] Ainda, Ishida et al. (Cloning Stem Cells. 4:91-102 (2002))descreve TransChromo Mouse (TCMOUSE™) que compreende segmentos de tamanho de megabase de DNA humano e que incorpora os locais de imunoglobulina humana inteira (hIg). O TCMOUSE™ tem um repertório totalmente diverso de hIgs, incluindo todas as subclasses de IgGs (IgG1-G4). A imunização de TCMOUSE™ com vários antígenos humanos produz respostas de anticorpos compreendendo anticorpos humanos.

[0200] Ver ainda Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Brug- germann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); e patente US 5.591.669, Patente US 5.589.369, Patente US 5.545.807; e Publicação de patente US 20020199213. Publicação de patente US 20030092125 descreve métodos para polarização da resposta imune de um animal ao epítopo desejado. Anticorpos humanos podem ainda ser gerados por células B ativadas in vitro (ver patentes US 5.567.610 e 5.229.275).

Anticorpos humanos da tecnologia de exibição

[0201] O desenvolvimento de tecnologias para preparar repertóriosde genes de anticorpos humanos recombinantes, e a exibição dos fragmentos de anticorpos codificados na superfície de bacteriófago filamentoso, forneceu um meio para preparar anticorpos humanos diretamente. Os anticorpos produzidos por tecnologia de fago são produzidos como fragmentos de ligação ao antígeno - geralmente fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e, assim, desprovidos de funções efeto- ras. As funções efetoras podem ser introduzidas por uma das duas estratégias: Os fragmentos podem ser projetados, por exemplo, em anticorpos completos para a expressão em células de mamíferos, ou em fragmentos de anticorpos biespecíficos com um segundo sítio de ligação capaz de disparar uma função efetora.

[0202] A presente revelação contempla um método para produziranticorpo específico de alvo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fago, triando a biblioteca com proteína alvo ou uma porção das mesmas, isolando o fago que se liga ao alvo, e obtendo o anticorpo do fago. Por meio de exemplo, um método para preparar a biblioteca de anticorpos para uso em técnicas de exibição de fago compreende as etapas de imunizar um animal não humano compreendendo locais de imunoglobulinas humanas com antígeno alvo ou uma porção antigênica da mesma para criar uma resposta imune, ex- trair células produtoras de anticorpos do animal humanizado; isolar RNA das células extraídas, realizar a transcrição reversa do RNA para produzir cDNA, amplificar o cDNA usando um iniciador, e inserir o cDNA em um vetor de exibição de fago de modo que os anticorpos são expressos no fago. Anticorpos específicos para alvo recombinan- tes da revelação podem ser obtidos desta forma.

[0203] Em outro exemplo, células que produzem anticorpos podemser extraídas de animais não imunizados, RNA isolado das células extraídas e transcrito reverso para produzir cDNA, que é amplificado usando um iniciador e inserido em um vetor de exibição de fago de modo que aqueles anticorpos são expressos no fago. Processos de exibição de fago imitam a seleção imune através da exibição de repertórios de anticorpo na mesma superfície de bacteriófago filamentoso, e subsequente seleção de fago por sua ligação ao antígeno alvo de escolha. Uma dita técnica é descrita em WO 99/10494, que descreve o isolamento de alta afinidade e anticorpos agonistas funcionais para MPL e receptores msk usando dita uma abordagem. Anticorpos da revelação podem ser isolados por triagem de uma biblioteca de anticorpo combinatorial recombinante, preferencialmente uma biblioteca de exibição de fago scFv, preparada usando cDNAs VL e VH humanos preparados de mRNA derivados de linfócitos humanos. Metodologias para preparar e triar ditas bibliotecas são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Patente US 5.969.108. Há kits disponíveis comercialmente para gerar bibliotecas de exibição de fago (por exemplo, Phar- macia Recombinant Phage Antibody System, n.° de catálogo 27-940001; e o kit Stratagene SurfZAP.TM. exibição de fago, no. de catálogo 240612). Há ainda outros métodos e reagentes que podem ser usados para gerar e triar bibliotecas de exibição de anticorpos (ver, por exemplo, Ladner et al. Patente US 5.223.409; Kang et al. Publicação PCT WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT WO 91/17271; Winter et al. Publicação PCT WO 92/20791; Markland et al. Publicação PCT WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT WO 92/01047; Garrard et al. Publicação PCT WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:7978-7982.

[0204] Em uma modalidade, para isolar anticorpos humanos específicos para o antígeno alvo com as características desejadas, uma biblioteca de VH e VL humanas é triada para fragmentos de anticorpos contendo a especificidade desejada. As bibliotecas de anticorpos usadas neste método são preferencialmente bibliotecas scFv preparadas e triadas como descrito aqui e na técnica (McCafferty et al., Publicação PCT WO 92/01047, McCafferty et al., (Nature 348:552-554 (1990)); e Griffiths et al., (EMBO J 12:725-734 (1993)). As bibliotecas de anticorpo scFv preferencialmente são triadas usando a proteína alvo como o antígeno.

[0205] Alternativamente, o fragmento Fd (VH-CH1) e cadeia leve(VL-CL) de anticorpos são separadamente clonados por PCR e re- combinados aleatoriamente em bibliotecas de exibição de fago, que podem então ser selecionados para ligação a um antígeno particular. Os fragmentos Fab são expressos na superfície do fago, ou seja, fisicamente ligados aos genes que codificam os mesmos. Assim, a seleção de Fab por ligação ao antígeno co-seleciona para as sequências de codificação Fab, que podem ser amplificadas subsequencialmente. Através de várias rodadas de ligação ao antígeno e re-amplificação, um procedimento chamado panning, Fab específico para o antígeno, são enriquecidos e finalmente isolados.

[0206] Em 1994, uma abordagem para a humanização de anticorpos, chamada "seleção guiada", foi descrita. A seleção guiada utiliza o poder de técnica de exibição de fago para a humanização de anticorpo monoclonal de camundongo (ver Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para isto, o fragmento Fd do anticorpo monoclonal de camundongo pode ser apresentado em combinação com uma biblioteca de cadeia leve humana, e a biblioteca Fab híbrida resultante pode então ser selecionada com antígeno. O fragmento Fd de camundongo, assim, fornece um padrão para guiar a seleção. Subsequentemente, as cadeias leve humanas selecionadas são combinadas com uma biblioteca de fragmento Fd. A seleção da biblioteca resultante gera Fab totalmente humano.

[0207] Uma variedade de procedimentos foi descrita para derivaranticorpos humanos a partir de bibliotecas de exibição de fago (Ver, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Patentes US 5.565.332 e 5.573.905; Clackson, T., e Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). Em particular, seleção in vitro e evolução de anticorpos derivada de bibliotecas de exibição de fago se tornou uma ferramenta poderosa (ver Burton, D. R., e Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); Publicação de patente US 20020004215 e WO 92/01047; Publicação de patente US 20030190317; e US 6.054.287 e 5.877.293.

[0208] Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Librariesby Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178:187-193 (2002), e Publicação de patente US 20030044772, publicada em 6 de março de 2003, descreve métodos para triar bibliotecas de anticorpo expressas em fago ou outras moléculas de ligação por elevação de captura, um método que envolve a imobilização das moléculas de ligação candidatas em um suporte sólido.

[0209] Fragmentos Fv são apresentados na superfície do fago, porassociação de uma cadeia expressão como uma fusão de proteína fago (por exemplo, com M13 gene III) com a cadeia complementar expressa como um fragmento solúvel. É contemplado que o fago pode ser um fago filamentoso como um da classe I de fagos: fd, M13, f1, If1, lke, ZJ/Z, Ff e um das classse II de fagos Xf, Pf1 e Pf3. O fago pode ser M13, ou fd ou um derivado do mesmo.

[0210] Uma vez segmentos VL e VH humanos iniciais são selecionados, experimentos de "mistura e combina", em que diferentes partes de segmentos VL e VH inicialmente selecionados são triados para ligação ao alvo, são realizados para selecionar combinações de pares VL/VH preferenciais. Além disso, para ainda melhorar a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH dos pares VL/VH preferenciais podem ser aleatoriamente mutados, preferencialmente dentro de qualquer uma das regiões CDR1, CDR2 ou CDR3 de VH e/ou VL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser obtida por amplificação de regiões VL e VH usando iniciadores de PCR complementares às VH CDR1, CDR2, e CDR3, ou VL CDR1, CDR2, e CDR3, respectivamente, cujos iniciadores foram "inseridos" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeos em determinadas posições de modo que os produtos PCR resultantes codifiquem os segmentos VL e VH em que as mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões VH e/ou VL CDR3. Estes segmentos VL e VH aleatoriamente mu- tados podem ser triados para ligação ao antígeno alvo.

[0211] Após triagem e isolamento de um anticorpo específico alvode uma biblioteca exibição de imunoglobulina recombinante, ácido nu- cleico que codifica o anticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de exibição (por exemplo, do genoma do fago) e subclonado em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucleico pode ser ainda manipulado para criar outras formas de anticorpo da revelação, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado por triagem de uma biblioteca combinatorial, o DNA que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em célula hospedeira de mamífero, como descrito aqui.

[0212] É contemplado que o método exibição de fago pode ser realizado em uma cepa mutadora de célula de bactéria ou de hospedeiro. Uma cepa mutadora é uma célula hospedeira que tem um defeito genético que causa DNA replicado dentro desta seja mutado com relação ao DNA parente. As cepas mutadoras exemplares são NR9046mutD5 e NR9046 mut T1.

[0213] É ainda contemplado que o método de exibição de fago pode ser realizada usando um fago helper. Isto é um fato que é usado para infectar células contendo um genoma de fago defeituoso e que funciona para complementar o defeito. O genoma de fago defeituoso pode ser um fagemídeo ou um fago com alguma função que codifica as sequências de gene removidas. Exemplos de fago helpers são M13K07, M13K07 gene III n.° 3; e exibição de fago ou codificação de uma molécula de ligação fundida a uma proteína de capsídeo.

[0214] Os anticorpos são ainda gerados via métodos de triagemde exibição de fago usando a abordagem combinatorial dupla hierárquica como revelado em WO 92/01047 em que uma colônia individual contendo um clone de cadeia H ou L é usada para infectar uma biblioteca completa de clones que codificam outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação específico de duas cadeias resultantes é selecionado de acordo com técnicas de exibição de fago como aquele descrito nesta. Esta técnica é ainda revelada em Marks et al, (Bio/Technology, 10:779-783 (1992)).

[0215] Métodos para exibição peptídeos na superfície de levedura,células microbianas e mamíferas foram ainda usados para identificar anticorpos específicos de antígeno. Ver, por exemplo, Patentes US 5.348.867; 5.723.287; 6.699.658; Wittrup, Curr Op. Biotech. 12:395-99 (2001); Lee et al, Trends in Biotech. 21(1) 45-52 (2003); Surgeeva et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 58: 1622-54 (2006). Bibliotecas de anticorpos podem ser ligadas às proteínas de leveduras, como aglutinina, efetivamente imitando a exibição de superfície celular de anticorpos por células B no sistema imune.

[0216] Além de métodos de exibição de fago, anticorpos podemser isolados usando métodos de exibição in vitro e exibição de célula microbiana, incluinda exibição de ribossomo e exibição de mRNA (Amstutz et al, Curr. Op. Biotech. 12: 400-05 (2001)). Seleção de poli- peptídeos usanda exibição de ribossomo é descrita em Hanes et al., (Proc. Natl Acad Sci USA, 94:4937-4942 (1997)) e Patentes US5.643.768 e 5.658.754 emitidas para Kawasaki. Exibição de ribossomo é ainda útil para rápida análise mutacional em grande escala de anticorpos. A abordagem de mutagênese seletiva ainda fornece um método para produzir anticorpos com atividades melhoradas que podem ser selecionadas usando técnicas de exibição ribosomal.Variantes de sequência de aminoácido

[0217] É contemplado que composições de polipeptídeos modificados compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco, e/ou seis CDRs de um anticorpo são geradas, em que uma CDR é alterada para fornecer especificidade aumentada ou afinidade à molécula alvo. Sítios dentro de CDRs de anticorpos são tipicamente modificados em séries, por exemplo, substituindo primeiro com escolhas conservativas (por exemplo, aminoácido hidrofóbico substituído por um aminoácido hidro- fóbico não idêntico) e então com escolhas mais diferentes (por exemplo, aminoácido hidrofóbico substituído por um aminoácido carregado), e então deleções ou inserções podem ser preparadas no sítio alvo. Por exemplo, usando as sequências estruturais conservadas circundando as CDRs, iniciadores PCR complementares às sequências consenso são geradas para amplificar a sequência de CDR específica ao antígeno localizada entre as regiões iniciadoras. As técnicas para clonagem e expressão de sequências de nucleotídeo e polipeptídeo são bem estabelecidas na técnica [ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. As sequências CDR amplificadas são ligadas em um plasmídeo apropriado. O plasmídeo compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis CDRs clonados opcionalmente contêm regiões de codificação de polipeptídeo adicionais ligadas à CDR.

[0218] Substâncias de anticorpo compreendendo as CDRs modificadas são triadas para afinidade de ligação para o antígeno original. Além disso, o anticorpo ou polipeptídeo é ainda testado para sua capacidade em neutralizar a atividade dos antígenos alvos. Por exemplo, anticorpos da revelação podem ser analisados como estabelecido nos Exemplos para determinar suas capacidades em interferir com a atividade biológica de antígeno alvo.

[0219] As modificações podem ser preparadas por substituiçõesde aminoácidos não conservadas descritas em detalhes abaixo. "Inserções" ou "deleções" são preferencialmente na faixa de cerca de 1 a 20 aminoácidos, mais preferencialmente 1 a 10 aminoácidos. A variação pode ser introduzida por sistematicamente preparando substituições de aminoácidos em uma molécula de peptídeo de anticorpo usando técnicas de DNA recombinante e avaliando as variantes re- combinantes resultantes para atividade. Alterações de ácido nucleico podem ser preparadas em sítios que diferente nos ácidos nucleicos de diferentes espécies (posições variáveis) ou em regiões altamente conservadas (regiões constantes). Métodos para alterar sequências de anticorpo e expressar composições de polipeptídeo de anticorpo úteis na revelação são descritos em maiores detalhes abaixo.

[0220] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões emamino- e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de um resíduo aos polipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos únicos ou múltiplos de aminoá- cidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal ou o anticorpo (incluindo fragmento de anticorpo) fundido a uma marca de epítopo ou um epítopo de receptor de salvagem. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão a um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo, por exemplo, em N-terminal ou C-terminal.

[0221] O termo "epítopo marcado" se refere a um anticorpo fundido a uma marca de epítopo. O polipeptídeo de marca de epítopo tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual o anticorpo lá contra pode ser preparado, ainda é curto suficiente de modo que este não interfira com atividade do anticorpo. A marca de epítopo preferencialmente é suficientemente único de modo que o anticorpo lá contra não substancialmente reage cruzado com outros epítopos. Poli- peptídeos de marca apropriados geralmente têm pelo menos 6 resíduos de aminoácidos e geralmente entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácidos (preferencialmente entre cerca de 9-30 resíduos). Exemplos incluem o polipeptídeo de marca de hemaglutinina (HA) e seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); a marca c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 a este (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5:3610-16 (1985)); e a marca de glicopro- teína D do vírus Herpes Simplex (gD) e seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3:547-53 (1990)). Outros marcas exemplares são uma sequência de poli-histidina, geralmente ao redor de seis resíduos de histidina, que permite o isolamento de um composto assim marcado usando quelação de níquel. Outros marcadores e marcas, como a marca FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), bem conhecidos e rotineiramente usados na técnica, são adotados pela revelação.

[0222] Como usado aqui, o termo "epítopo de ligação ao receptorde salvagem" se refere a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável para aumentar a meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG.

[0223] Outro tipo de variante é uma substituição de variante deaminoácido. Estes variantes têm pelo menos um resíduo de aminoáci- do na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seu local. Mutagênese de substituição dentro de qualquer uma das regiões hipervariáveis ou CDR ou regiões estruturais é contemplada. Substituições conservadas envolvem a substituição de um aminoácido com outro membro de sua classe. Substituições não conservadas envolvem substituir um membro de uma destas classes com um membro de outra classe.

[0224] Substituições conservadoras de aminoácido são feitas combase na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicida- de, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina (Ala, A), leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, I), valina (Val, V), prolina (Pro, P), fenilalanina (Phe, F), triptofano (Trp, W), e metionina (Met, M); aminoácidos neutros polares incluem glicina (Gly, G), serina (Ser, S), treonina (Tr, T), cisteína (Cys, C), tirosina (Tyr, Y), asparagina (Asn, N), e glutamina (Gln, Q); aminoácidos positivamente carregados (básico) incluem arginina (Arg, R), lisina (Lys, K), e histidina (His, H); e ami- noácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico (Asp, D) e ácido glutâmico (Glu, E).

[0225] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutençãoda conformação apropriada do anticorpo pode ainda ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reação cruzada anormal. De modo recíproco, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua capacidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo como fragmento Fv).

Maturação de afinidade

[0226] Maturação de afinidade geralmente envolve preparar e triaranticorpos variantes que têm substituições dentro das CDRs de um anticorpo parente e selecionar variantes que tenham uma ou mais propriedades biológicas melhoradas como afinidade de ligação em relação ao anticorpo parente. Uma forma conveniente para gerar ditas variantes de substituição é maturação de afinidade usando exibição de fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariáveis (por exemplo, 6-7 sítios) podem ser mutados para gerar todas as possíveis amino substituições em cada sítio. Os variantes de anticorpos assim gerados são exibidos de forma monovalente de partículas de fago filamentoso como fusões para o produto do gene III de M13 empacota-dos dentro de cada partícula. As variantes de exibição de fago são então triadas para suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação). Ver, por exemplo, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 e WO 93/19172.

[0227] Métodos atuais de maturação de afinidade de anticorpopertencem a duas categorias de mutagênese: estocástica e não esto- cástica. PCR Error prone, cepas de bactérias mutadoras (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359-68 (1996) Irving et al., Immunotechnology 2, 127143 (1996)), e mutagênese de saturação (Nishimiya et al.,. J. Biol. Chem. 275:12813-20 (2000); Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85 (2002)) são exemplos típicos de métodos de mutagênese estocástica (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71 (2005)). Técnicas não estocásticas geralmente usam varredura de alanina ou mutagênese direcionada a sítio para gerar coleções limitadas de variantes específicas. Alguns métodos são descritos em maiores detalhes abaixo.

[0228] Maturação de afinidade via métodos panning—Maturaçãode afinidade de anticorpos recombinantes é comumente realizada através de várias rodadas de panning de anticorpos candidatos na presença de quantidades decrescentes de antígeno. A redução da quantidade de antígeno por rodada seleciona os anticorpos com a maior afinidade ao antígeno assim gerando anticorpos de alta afinidade de um pool grande de materiais de partida. Maturação de afinidade via panning é bem conhecido na técnica e é descrito, por exemplo, em Huls et al. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71 (2001)). Métodos de maturação de afinidade usando tecnologias de exibição de fago são descritos em outro ponto aqui e conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Daugherty et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97:2029-34 (2000)).

[0229] Mutagênese de pesquisa— Mutagênse de pesquisa (LTM)(Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71 (2005)) fornece um método para rapidamente mapear o sítio de ligação ao anticorpo. Para LTM, nove aminoácidos, representativos das principais químicas de cadeia lateral fornecidas pelos 20 aminoácidos naturais, são selecionados para dissecar as contribuições de cadeia lateral funcional para ligação em cada posição em todas as seis CDRs de um anticorpo. LTM gera uma série de posição de mutações únicas dentro de uma CDR onde cada resíduo "tipo selvagem" é sistematicamente substituído por um dos nove aminoácidos selecionados. CDRs mutadas são combinadas para gerar bibliotecas de fragmentos variáveis de cadeia simples combinatorial (scFv) de crescente complexidade e tamanho sem se tornar proibitiva para a exibição quantitativo de todas as variantes. Após seleção positiva, clones com ligação melhorada são sequências, e mutações benéficas são mapeadas.

[0230] PCR Error-prone —PCR Error-prone envolve a randomiza-ção dos ácidos nucleicos entre diferentes rodadas de seleção. A ran- domização ocorre em uma taxa baixa pela taxa de erro intrínseca da polimerase usada, mas pode ser melhorada por PCR error-prone (Zaccolo et al.,. J. Mol. Biol. 285:775-783 (1999)) usando uma polime- rase contendo uma taxa de erro intrínseca alta durante a transcrição (Hawkins et al., J Mol Biol. 226:889-96 (1992)). Após os ciclos de mutação, clones com afinidade melhorada para o antígeno são selecionados usando métodos de rotina na técnica.

[0231] Embaralhamento de DNA— Embaralhamento de ácido nu-cleico para recombinação homóloga in vitro ou in vivo de grupos de polinucleotídeos mais curtos ou menores para produzir polinucleotí- deos variantes. Embaralhamento de DNA foi descrito na Patente US 6.605.449, Patente US 6.489.145, WO 02/092780 e Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-51 (1994). Geralmente, embaralhamento de DNA é compreendido de 3 etapas: fragmentação dos genes a ser embaralhados com DNase I, hibridização aleatória de fragmentos e remontagem ou preenchimento do gene fragmento por PCR na presença de DNA polimerase (PCR sexual), e amplificação de produto remontado por PCR convencional.

[0232] Embaralhamento de DNA difere de PCR error-prone emque esta é uma reação de cadeia inversa. Em PCR error-prone, o número de sítios de inicio de polimerase e o número de moléculas crescem exponencialmente. Em contraste, em ácido nucleico remontado ou embaralhamento de polinucleotídeos aleatórios o número de sítios de iniciação (mas não tamanho) dos polinucleotídeos aleatórios reduz com o tempo.

[0233] No caso de um anticorpo, embaralhamento de DNA permitea associação combinatorial livre de todas das CDR1s com todas as CDR2s com todas as CDR3s, por exemplo. É contemplado que várias famílias de sequências podem ser embaralhadas na mesma reação. Ainda, embaralhamento geralmente conserva a ordem relativa, de modo que, por exemplo, CDR1 não será encontrada na posição de CDR2. Embaralhadores raros irão conter um grande número das melhores (por exemplo, mais alta afinidade) CDRs e estes raros embaralhadores podem ser selecionados baseado em suas afinidades superiores.

[0234] O padrão de polinucleotídeo que pode ser usado em embaralhamento de DNA pode ser DNA ou RNA. Este pode ser de vários comprimentos dependendo do tamanho do gene ou polinucleotídeo mais curto ou menor a ser recombinado ou remontado. Preferencialmente, o polinucleotídeo padrão é de 50 bp a 50 kb. O padrão polinu- cleotídeo geralmente deve ser fita dupla.

[0235] É contemplado que polinucleotídeos de ácido nucleico defita simples ou fita dupla contendo regiões de identidade ao polinucleo- tídeo padrão e regiões de heterologia ao polinucleotídeo padrão podem ser adicionados ao polinucleotídeo padrão, durante a etapa inicia de seleção de gene. É ainda contemplado que dois diferentes padrões de polinucleotídeo relacionados podem ser misturados durante a etapa inicial.

[0236] Varredura de alanina - Mutagênese de varredura de alani-na pode ser realizada para resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para ligação ao antígeno. Cunningham e Wells, (Science 244:1081-1085 (1989)). Um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos com um aminoácido negativamente carregado (mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Aqueles locais de aminoácidos que demonstram a sensibilidade funcional para as substituições então são refinados introduzindo ainda ou outras variantes em, ou para os sítios de substituição.

[0237] Desenho auxiliado por computador - Alternativamente, oualém disso, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo de antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno, ou para usar software de computador para modelar ditos pontos de contato. Ditos resíduos de contato e resíduos de vizinhança são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que ditas variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a varredura como descrito aqui e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionadas para outro desenvolvimento.

[0238] Alternativamente, ou além disso, uma variedade de outrastécnicas de maturação de afinidade conhecidas podem ser usadas, incluindo por exemplo, técnicas descritas nos pedidos de patente publicados WO2009/088933; WO2009/088928; WO2009/088924; bem como Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991; Marks et al., Biotechnology 10:779-783, 1992; Virnekas et al., Nucleic Acids Res.22:5600-5607, 1994; Glaser et al., J. Immunol. 149:3903-3913, 1992; Jackson et al., J. Immunol. 154:3310-3319, 1995; Schier et al., J. Mol. Biol. 255:28-43, 1996; e Yang et al., J. Mol. Biol. 254:392-403, 1995, incorporados por referência aqui em suas totalidades.

Glicosilação alterada

[0239] Variantes de anticorpo podem ainda ser produzidas quetêm um padrão de glicosilação modificado em relação ao anticorpo parente, por exemplo, deletando uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adicionando um ou mais sítios de gli- cosilação que não estão presentes no anticorpo.

[0240] A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada O-ligada. N-ligada geralmente se refere a ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina -X treonina-, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral da asparagina. A presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Assim, sítios de glicosilação N-ligados podem ser adicionados a um anticorpo alterando a sequência de aminoácido de modo que este contenha uma ou mais destas sequências de tripeptídeo. Glicosilação O- ligada se refere à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados. Sítios de glicosilação O-ligados podem ser adicionados a um anticorpo por inserção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original.

[0241] Fc glicanos influenciam a ligação de IgG aos receptores Fce C1q, e são, portanto, importante para funções efetoras IgG. Variantes de anticorpo como Fc glicanos modificados e função efetora alterada podem ser produzidas. Por exemplo, anticorpos com açúcares terminais modificados como ácidos sialicos, fucose central, N- acetilglucosamina, bifurcante e resíduos de manose podem ter ligação alterada ao receptor FcYRIIIa e atividade ADCC alterada. Em outro exemplo, anticorpos como resíduos de terminal modificados podem ter ligação alterada a C1q e atividade de CDC alterada (Raju, Curr. Opin. Immunol. 20: 471-78 (2008).

[0242] Ainda são contempladas moléculas de anticorpo com fuco-silação ausente ou reduzida que apresentou atividade ADCC melhorada. Uma variedade de formas é conhecida na técnica para obter isto. Por exemplo, atividade efetora de ADCC é mediada por ligação à molécula de anticorpo ao receptor FCYRIII, que demonstrou ser dependente da estrutura de carboidrato da glicosilação N-ligada no Asn-297 do domínio CH2. Anticorpos não fucosilados se ligam a este receptor com afinidade aumentada e disparam funções efetoras medidas por FcyRIII mais eficientemente do que anticorpos nativos, fucosilados. Por exemplo, produção recombinante de anticorpo não fucosilado em células CHO em que a enzima alfa-1,6-fucosil transferase foi inativada resultou em anticorpo com 100 vezes de atividade de ADCC aumentada (Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 87:614-22 (2004)). Efei-tos semelhantes podem ser obtidos através da redução da atividade desta e outras enzimas na via de fucosilação, por exemplo, através do tratamento com siRNA ou RNA antissenso, linhagens de células modificadas para inativar as enzimas, ou cultivar inibidores de glicosilação seletiva (Rothman et al., Mol Immunol. 26:1113-23 (1989)). Algumas cepas de célula hospedeira, por exemplo, Lec13 ou linhagem de célula YB2/0 de hibridoma de rato produzem anticorpos com níveis menores de fucosilação. (Shields et al., J Biol Chem. 277:26733-40 (2002); Shinkawa et al., J Biol Chem. 278:3466-73 (2003)). Um aumento no nível de carboidrato dividido, por exemplo, através de produção re- combinante de anticorpo em células que sobre-expressam a enzima GnTIII, foi ainda determinado por aumentar a atividade de ADCC (Umana et al., Nat Biotechnol. 17:176-80 (1999)). Foi previsto que a ausência de somente um dos dois resíduos de fucose pode ser suficiente para aumentar a atividade de ADCC (Ferrara et al., Biotechnol Bioeng. 93:851-61 (2006)).Variantes com função efetora alterada

[0243] Outras modificações do anticorpo são contempladas. Emum aspecto, pode ser desejável modificar o anticorpo da revelação com relação à função efetora, por exemplo, para melhorar a efetivida- de do anticorpo para tratar câncer. Um método para modificar função efetora ensina que resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo a formação de ligação dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter a capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., (J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)) e Shopes, B. (J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)). Anticorpos homodí- meros com atividade antitumoral melhorada podem ainda ser preparados usando reticulantes heterobifuncionais em Wolff et al., (Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)). Alternativamente, um anticorpo pode ser modificado de modo que tenha regiões Fc duplas e pode, assim, ter lise de complemento melhorada e capacidades ADCC. Ver Steven-son et al., (Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)). Além disso, foi demonstrado que sequências dentro de CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue ao MHC Classe II e dispare uma resposta de célula T helper indesejada. Uma substituição conservada pode permitir que o anticorpo retenha atividade de ligação já que perdeu sua capacidade de disparar uma resposta de célula T indesejada. Ainda, ver Steplewski et al., (Proc Natl Acad Sci U S A. 85:4852-56 (1998)), que descreveu anticorpos quiméricos em que uma região variável de muri- no foi unida com regiões constantes humanas gama 1, gama 2, gama 3, e gama 4.

[0244] Em determinadas modalidades da presente revelação, pode ser desejável usar um fragmento de anticorpo, ao invés de um anticorpo intacto para aumentar a penetração do tumor, por exemplo. Neste caso, pode ser desejável modificar o fragmento de anticorpo para aumentar sua meia-vida sérica, por exemplo, adicionar moléculas como PEG ou outros polímeros solúveis em água, incluindo polímeros de polissacarídeos, fragmentos de anticorpos para aumentar a meia-vida. Isto pode ser obtido, por exemplo, por incorporação de um epítopo de ligação ao receptor de salvagem no fragmento do anticorpo (por exemplo, por mutação da região apropriada no fragmento do anticorpo ou por incorporação do epítopo em uma marca de peptídeo que e então fundido ao fragmento do anticorpo e qualquer extremidade ou no meio, por exemplo, por DNA ou síntese de peptídeo) (ver, por exemplo, WO96/32478).

[0245] O epítopo de ligação ao receptor de salvagem preferencialmente constitui uma região em que qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos de uma ou duas alças de um domínio Fc são transferidos a uma posição análoga ao fragmento do anticorpo. Ainda mais preferencialmente, três ou mais resíduos de uma ou duas alças do domínio Fc são transferidos. Ainda mais preferencial, o epítopo é tomado de domínio CH2 da região Fc (por exemplo, de uma IgG) e transferido em uma região CH1, CH3, ou VH, ou mais do que uma dita região, do anticorpo. Alternativamente, o epítopo é tomado do domínio CH2 da região Fc e transferido à região CL ou região VL, ou ambas, do fragmento de anticorpo. Ver ainda, pedidos internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478 que descrevem variantes Fc e suas interações com o receptor de salvagem.

[0246] Assim, anticorpos da presente revelação podem compreender uma porção de Fc humana, uma porção Fc consenso humana, ou uma variante da mesma que retém a capacidade de interagir com o receptor de salvagem Fc, incluindo variantes em que cisteínas envolvidas em ponte dissulfeto são modificadas ou removidas, e/ou em que o met é adicionado em N-terminal e/ou um ou mais dos 20 aminoáci- dos N-terminal 20 são removidos, e/ou regiões que interagem com complemento, como o sítio de ligação a C1q, são removidos, e/ou o sítio ADCC é removido [ver, por exemplo, Sarmay et al., Molec. Immunol. 29:633-9 (1992)].

[0247] Estudos anteriores mapearam o sítio de ligação em IgGhumana e murina para FcR principalmente à região dobradiça inferior composta de IgG resíduos 233-239. Outros estudos propuseram segmentos amplos adicionais, por exemplo, Gly316-Lys338 para receptor de Fc humano I, Lys274-Arg301 e Tyr407-Arg416 para receptor Fc humano III, ou encontraram novos resíduos específicos fora da dobradiça inferior, por exemplo, Asn297 e Glu318 para IgG2b murino interagindo com receptor Fc II murino. O relato de estrutura cristalina 3.2-Â do fragmento Fc IgG1 humano com receptor Fc IIIA humano delinearam resíduos IgG1 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, e Ala327-Ile332 como envolvido na ligação ao receptor Fc IIIA. Foi sugerido baseado na estrutura cristalina que além da dobradiça inferior (Leu234-Gly237), resíduos em IgG CH2 alças de domínio FG (resíduos 326-330) e BC (resíduos 265-271) podem desempenhar um papel na ligação ao receptor de Fc IIA. Ver Shields et al., (J. Biol. Chem., 276:6591-604 (2001)), incorporado por referência aqui em sua totalidade. A mutação de resíduos dentro de sítios de ligação ao receptor Fc pode resultar em função efetora alterada, como atividade ADCC ou CDC alterada, ou meia-vida alterada. Como descrito acima, mutações potenciais incluem inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos, incluindo substituição com alanina, uma substituição conservada, uma substituição não conservada, ou substituição com um resí-duo de aminoácido correspondente na mesma posição de uma subclasse diferente de IgG (por exemplo, substituindo um resíduo IgG1 com um resíduo IgG2 correspondente naquela posição).

[0248] Shields et al. reportaram que resíduos IgG1 envolvidos naligação a todos os receptores de Fc humanos estão localizados no domínio CH2 proximal à dobradiça e estão em duas categorias como a seguir: 1) posições que podem interagir diretamente com todos FcR incluem Leu234-Pro238, Ala327, e Pro329 (e possivelmente Asp265); 2) posições que influenciam carboidrato natural ou posição incluem Asp265 e Asn297. Os resíduos adicionais de IgG1 que afetaram a ligação ao receptor Fc II são como a seguir: (maior efeito) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, e (menos efeito) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295,Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, e Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A e D270A ligação reduzida. Além dos resíduos identificados acima para todas FcR, resíduos adicionais de IgG1 que reduziram a ligação ao receptor Fc IIIA por 40% ou mais são como a seguir: Ser239, Ser267 (Gly somente), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, e Asp376. Variantes que melhoraram a ligação a FcRIIIA incluem T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, e A339T. Lys414 mostrou uma redução de 40% na ligação para FcRIIA e FcRIIB, Arg416 uma redução de 30% para FcRIIA e FcRIIIA, Gln419 uma redução de 30% para FcRIIA e uma redução de 40% para FcRIIB, e Lys360 uma melhora de 23% para FcRIIIA. Ver ainda Presta et al., (Biochem. Soc. Trans. 30:487-490, 2001), incorporado aqui por referência em sua totalidade, que descreveu varias posições na região Fc de IgG1 demonstraram ligação melhorada somente para receptores Fc gama específicos (R) ou simultaneamente melhoraram a ligação a um tipo de Fc gama R e ligação reduzida a outro tipo. Variantes IgG1 selecionadas com ligação melhorada a Fc gama RIIIa foram então testadas em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo in vitro (ADCC) e demonstraram uma melhora em ADCC quando células mononucleares periféricas sanguíneas ou células natural killer foram usadas.

[0249] Por exemplo, Patente US 6.194.551, incorporada aqui porreferência em sua totalidade, descreve variantes com função efetora alterada contendo mutações na região IgG Fc humana, na posição de aminoácidos 329, 331 ou 322 (usando numeração de Kabat), alguns dos quais reduziram ligação C1q ou atividade CDC. Como outro exemplo, Patente US 6.737.056, incorporado aqui por referência em sua totalidade, descreve variantes com função efetora alterada ou ligação ao receptor Fc-gama contendo mutações na região IgG Fc humana, em aminoácidos na posição 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286,289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315,320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340,360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435,437, 438 ou 439 (usando numeração de Kabat), alguns dos quais apresenta perfis de ligação ao receptor associados com ADCC reduzida ou atividade CDC. Destes, uma mutação em aminoácidos na posição 238, 265, 269, 270, 327 ou 329 são ditos que reduzem a ligação a FcRI, uma mutação em aminoácidos na posição 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ou 439 são ditos que reduzem a ligação a FcRII, e uma mutação em aminoácidos na posição 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ou 437 são ditos que reduzem a ligação a FcRIII.

[0250] Patente US 5.624.821, incorporado por referência aqui emsua totalidade, relata que a atividade de ligação a Clq de um anticorpo murino pode ser alterada por mutação de resíduos de aminoácidos 318, 320 ou 322 da cadeia pesada e que a substituição do resíduo 297 (Asn) resulta na remoção da atividade lítica.

[0251] Publicação de patente US 20040132101, incorporado porreferência aqui em sua totalidade, descreve variantes com mutações em posições de aminoácidos 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ou 332 (usando numeração de Kabat) ou posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 (usando numeração de Kabat), das quais as mutações nas posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 podem reduzir atividade ADCC ou reduzir ligação a um receptor Fc gama.

[0252] Chappel et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 88:9036-40(1991)), incorporado aqui por referência em sua totalidade, reportam que a atividade citofílica de IgG1 é uma propriedade intrínseca de seu domínio CH2 de cadeia pesada. Mutações pontuais únicas em qualquer um dos resíduos de aminoácidos 234-237 de IgG1 significativamente reduziram ou aboliram sua atividade. Substituição de todos os resíduos IgG1 234-237 (LLGG) em IgG2 e IgG4 foram requeridos para restabelecer atividade de ligação completa. Um anticorpo IgG2 contendo a sequência ELLGGP inteira (resíduos 233-238) foi observada por ser mais ativa do que o IgG1 tipo selvagem.

[0253] Isaacs et al. (J Immunol. 161:3862-9 (1998)), incorporadoaqui por referência em sua totalidade, reporta que mutações dentro de um motivo crítico para ligação a Fc gama R (glutamato 233 para prolina, leucina/fenilalanina 234 para valina, e leucina 235 para alanina) completamente impediu a depleção de células alvo. A mutação de glu- tamato 318 a alanina eliminou a função efetora de IgG2b de camundongos e ainda reduziu a potência de IgG4 humana.

[0254] Armour et al. (Mol Immunol. 40:585-93 (2003)), incorporadopor referência aqui em sua totalidade, identificaram variantes IgG1 que reagem com o receptor de ativação, FcgamaRIIa, pelo menos 10 vezes menos eficientemente do que o IgG1 tipo selvagem mas cuja ligação ao receptor inibitório, FcgamaRIIb, é somente quatro vezes reduzida. As mutações foram feitas na região de aminoácidos 233-236 e/ou nas posições de aminoácidos 327, 330 e 331. Ver ainda WO99/58572, incorporado por referência aqui em sua totalidade.

[0255] Xu et al. (J Biol Chem. 269:3469-74 (1994)), incorporadopor referência aqui em sua totalidade, relataram que a mutação de IgG1 Pro331 para Ser marcadamente reduziu a ligação de C1q e virtualmente eliminou a atividade lítica. Em contraste, a substituição de Pro por Ser331 em IgG4 conferiu atividade lítica parcial (40%) à variante IgG4 Pro331.

[0256] Schuurman et al. (Mol Immunol. 38:1-8 (2001)), incorporadopor referência aqui em sua totalidade, relataram que a mutação de uma das cisteínas na dobradiça envolvida na formação de ligação in- ter-cadeia, Cys226, para serina resultou em uma ligação inter-cadeia pesada mais estável. Mutação de IgG4 sequência da dobradiça Cys- Pro-Ser-Cys para a IgG1 sequência da dobradiça Cys-Pro-Pro-Cys ainda marcadamente estabiliza a interação covalente entre as cadeias pesadas.

[0257] Angal et al. (Mol Immunol. 30:105-8 (1993)), incorporadopor referência aqui em sua totalidade, relataram que a mutação de serina em aminoácidos na posição 241 em IgG4 para prolina (encontrada naquela posição em IgG1 e IgG2) levou à produção de um anticorpo homogêneo, bem como extensão de meia-vida e melhora de distribuição de tecido em comparação ao IgG4 quimérico original.

Modificações covalentes

[0258] Modificações covalentes do anticorpo são ainda incluídasno escopo desta revelação. Podem ser realizadas por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula por reação de resíduos de aminoácidos alvos do anticorpo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeia laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C-terminal.

[0259] Os resíduos cisteinila mais comumente são reagidos comα-haloacetatos (e aminas correspondentes), como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar carboximetila ou carboxiamidometila derivados. Resíduos Cisteinila são ainda derivados por reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5-imidozoil)propi0nico, fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, metil 2-piridil dissulfeto, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

[0260] Resíduos histidila são derivados por reação com dietilpiro-carbonato em pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Brometo de para-bromofenacila também é útil; a reação é preferencialmente realizada em 0,1 M caco- dilato de sódio em pH 6,0.

[0261] Resíduos lisinila e amino-terminal são reagidos com ácidossuccínico ou outro anidreto de ácido carboxílico. A derivação com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos residuos lisinil. Outros reagentes apropriados para derivação de resíduos contendo .alfa.- amino incluem imidoésteres como picolinimidato metil, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitrobenzenosulfônico, O- metilisoureia, 2,4-pentanediona, e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

[0262] Resíduos de arginila são modificados por reação com umou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3- butanodiona,1,2-ciclo-hexanodiona, e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina requer que a reação possa ser realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina bem como o grupo arginina epsilon-amino.

[0263] A modificação específica de resíduos tirosila pode ser realizada, com particular interesse na introdução de marcadores espectrais em resíduos de tirosila por reação com compostos diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrome- tano são usados para formar espécies O-acetil tirosila e 3-nitro derivados, respectivamente. Resíduos tirosila são iodados usando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio.

[0264] Grupos laterais carboxila (aspartila ou glutamila) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R- N.dbd.C.dbd.N-R'), onde R e R' são diferentes grupos alquil, como 1- ciclo-hexil-3-(2-morpholinil-4-etila) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia- 4,4-dimetilpentila) carbodiimida. Além disso, resíduos aspartila e glu- tamila são convertidos em resíduos asparaginila e glutaminila por reação com íons de amônio.

[0265] Resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentementedeterminados aos resíduos correspondentes de glutamila e aspartil, respectivamente. Estes resíduos são desamidados em condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos está no escopo desta revelação.

[0266] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, meti- lação dos grupos α-amino de lisina, arginina, e cadeias laterais de his- tidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação do N-terminal amina, e amidação de qualquer grupo C-terminal carboxil.

[0267] Outro tipo de modificação covalente envolve acoplamentoquimicamente ou enzimaticamente de glicosídeos ao anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos pois não requerem produção do anticorpo em uma célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação N- ou O-ligada. Dependendo do modo de acoplamento usado, os açúcares podem ser ligados à (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres como aqueles de cis- teína, (d) grupos hidroxila livres como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO87/05330 e em Aplin e Wriston, (CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)).

[0268] A remoção de qualquer porção de carboidrato presente noanticorpo pode ser conseguida quimicamente ou enzimaticamente. A deglicosilação química requer exposição de anticorpo ao composto ácido trifluorometanosulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares exceto o açúcar ligante (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixando o anticorpo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin, et al., (Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)) e por Edge et al., (Anal. Biochem. 118: 131 (1981)). A clivagem enzi- mática de porções de carboidrato nos anticorpos pode ser obtida pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicoisdases como descrito por Thotakura et al., (Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)).

[0269] Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende ligação ao anticorpo de uma de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, poliois polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol po- lioxietilado, polioxialquilenos, ou polímeros polissacarídeos como dex- trano. Ditos métodos são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192,4.179.337, 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285, 4.609.546 ou EP 315 456.

Derivados

[0270] Como declarado acima, derivado se refere aos polipeptí-deos quimicamente modificados por ditas técnicas como ubiquitinação, marcação (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), ligação de polímero covalente como peguilação (derivação com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos como ornitina. Derivados de substância anticorpo da invenção, como um anticorpo biespecífico, são ainda úteis como agentes terapêuticos e podem ser produzidos pelos métodos aqui.

[0271] A porção conjugada pode ser incorporada em ou ligada auma substância do anticorpo covalentemente ou por ligações iônicas, de van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, incorporação de nu- cleotídeos radioativos, ou nucleotídeos biotinilados que são reconhecidos por estreptavidina.

[0272] Polietileno glicol (PEG) pode ser ligado às substâncias doanticorpo para fornecer uma meia-vida maior in vivo. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG irá preferencialmente variar de cerca de 2 kiloDalton ("kD") a cerca de 100 kDa, mais preferencialmente de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, mais preferencialmente de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Os grupos PEG irão geralmente ser ligados às substâncias do anticorpo da revelação via acila- ção ou alquilação redutora através de um grupo reativo natural ou modificado na porção PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol, ou éster) a um grupo reativo na substância do anticorpo (por exemplo, um grupo aldeído, amino, ou éster). A adição de porções PEG às substâncias do anticorpo pode ser realizada usando técnicas bem co-nhecidas na prática. Ver, por exemplo, Publicação internacional No. WO 96/11953 e Patente US 4.179.337.

[0273] A ligação à substância do anticorpo com PEG geralmenteocorre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada por HPLC analítico de fase reversa. As substâncias peguiladas são purificadas por HPLC preparativa e caracterizadas por HPLC analítica, análise de aminoácidos e espectrometria de massa por dessorção a laser.

Conjugados de Anticorpos

[0274] Um anticorpo pode ser administrado em sua forma "naked" ou não conjugada, ou pode ser conjugado diretamente a outros fárma- cos ou agentes de diagnóstico ou podem ser conjugados indiretamente aos polímeros carreadores compreendendo ditos outros fármacos ou agentes de diagnóstico. Em algumas modalidades o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico como um agente quimioterápico, um fármaco, um agente que inibe o crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngicas, vegetal ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado). Agentes quimioterápicos apropriados incluem: daunomicina, doxorubicina, metotrexato, e vindesina(Rowland et al., (1986) supra). Toxinas apropriadas incluem: toxinas bacterianas como toxina diftértica; toxinas vegetais como ricina; toxinas de molécula pequena como geldanamicina (Mandler et al J. Natl. Cancer Inst. 92(19):1573-81 (2000); Mandler et al., Bioorg. Med.Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al., BioconjugateChem. 13.786-91 (2002)), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-23 (1996)), auristatinas (Doronina et al., Nat. Biotech. 21: 778-84 (2003) e caliqueamicina (Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:33363342 (1993)).

[0275] Anticorpos podem ser detectavelmente marcados pelo usode radioisótopos, marcadores de afinidade (como biotina, avidina, etc.), marcadores enzimáticos (como peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, etc.) marcadores fluorescentes ou luminescentes ou bioluminescentes (como FITC ou rodamina, etc.), átomos paramagné- ticos, e semelhantes. Procedimentos para obter dita marcação são bem conhecidos na técnica; por exemplo, ver (Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth. En- zym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972);Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).

[0276] Conjugação de porções de anticorpo é descrita na PatenteUS 6.306.393. Técnicas gerais são ainda descritas em Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); e Shih et al., patente US 5.057.313. Este método geral envolve reagir um componente do anticorpo contendo uma porção de carboidrato oxidada com um polímero carreador que tem pelo menos uma função amina livre e que é carregado com uma pluralidade de fárma- cos, toxinas, quelantes, adendos de boro ou outro agente terapêutico. Esta reação resulta em uma ligação inicial de base de Schiff (imina), que pode ser estabilizada por redução a uma amina secundária para formar o conjugado final.

[0277] O polímero carreador pode ser, por exemplo, um aminodex-trano ou polipeptídeo de pelo menos 50 resíduos de aminoácidos. Várias técnicas para conjugação de um fármaco ou outro agente ao polímero carreador são conhecidas na técnica. Um carreador polipeptídeo pode ser usado no lugar de aminodextrano, mas o carreador polipeptí- deo deve ter pelo menos 50 resíduos de aminoácidos na cadeia, preferencialmente 100-5000 resíduos de aminoácidos. Pelo menos alguns dos aminoácidos devem ser resíduos de lisina ou resíduos de glutama- to ou aspartato. As aminas pendentes de resíduos de lisina e carboxi- latos pendentes de glutamina e aspartato são convenientes para ligação do fármaco, toxina, imunomodulador, quelante, adendo de boro ou outro agente terapêutico. Exemplos de carreadores polipeptídeos incluem polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, copolímeros dos mesmos e polímeros mistos destes aminoácidos e outros, por exemplo, serinas, para conferir propriedades de solubilidade desejadas no carreador carregado resultante e conjugado. Exemplos de agentes aos quais o anticorpo pode ser conjugado incluem qualquer agente citotóxico ou quimioterápico descrito aqui.

[0278] Alternativamente, anticorpos conjugados podem ser prepa rados por conjugação direta de um componente anticorpo com um agente terapêutico. O procedimento geral é análogo ao método indireto de conjugação exceto que um agente terapêutico é diretamente ligado a um componente de anticorpo oxidado. Por exemplo, uma porção de carboidrato de um anticorpo pode ser ligada ao polietilenoglicol para estender a meia-vida.

[0279] Alternativamente, um agente terapêutico pode ser ligado àregião em dobradiça de um componente anticorpo reduzido via formação de ligação dissulfeto, ou usando um reticulante heterobifuncional, como N-succinila 3-(2-piridilditio) proprionato (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer56:244 (1994). Técnicas gerais para dita conjugação são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 6084 (Cambridge University Press 1995). Uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional são conhecidos na técnica, como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetila HCL), ésteres ativos (como disuccinimidila suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoila) hexa- nodiamina), derivados bis-diazônio (como bis-(p-diazôniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).

Proteínas de fusão ao anticorpo

[0280] Métodos para preparar proteínas de fusão ao anticorpo sãobem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US 6.306.393. Proteínas de fusão ao anticorpo compreendendo uma porção interleu- cina-2 são descritas por Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), e Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996). Além disso, Yang et al., (Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995)), descreve uma proteína de fusão que inclui um fragmento F(ab')2 e uma porção alfa de fator de necrose tumoral. Outros exemplos de proteínas de fusão ao anticorpo são descritos por Pastan et al, Nat. Reviews Cancer 6: 559-65 (2006).

[0281] Métodos para preparar proteínas de fusão a anticorpo-toxina em que uma molécula recombinante compreende um ou mais componentes de anticorpo e uma toxina ou agente quimioterápico também são conhecidos aos especialistas na técnica. Por exemplo, proteínas de fusão anticorpo-Pseudomonas exotoxina A foram descritas por Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996), e Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996). Proteínas de fusão anticorpo-toxina contendo uma porção de toxina diftérica foram descrias por Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), e Vallera et al., Blood 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995), descreveram uma proteína de fusão anticorpo-toxina contendo uma porção RNase, enquanto Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produziram uma proteína de fusão anticorpo-toxina compreendendo um componente DNase I. Gelonina foi usada como a porção de toxina na proteína de fusão anticorpo-toxina de Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Part 1, BIOT005. Como outro exemplo, Dohlsten et al., Proc. Na- t'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), reportaram uma proteína de fusão anticorpo-toxina compreendendo Staphylococcal enterotoxina-A.

[0282] Toxinas ilustrativas que são apropriadamente empregadasna preparação de ditas proteínas de fusão são ricina, abrina, ribonuclease, DNase I, Staphylococcal enterotoxina-A, proteína antiviral pokeweed, gelonina, toxina diftérica, Pseudomonas exotoxina, e Pseudomonas endotoxina. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), e Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Outras toxinas apropriadas são conhecidas aos especialistas na técnica.

[0283] Anticorpos da presente revelação podem ainda ser usadosem ADEPT por conjugação de anticorpo à enzima de ativação de pro- fármaco que converte uma profármaco (por exemplo, um agente qui- mioterápico peptidil, Ver WO81/01145) a um fármaco anticâncer ativa. Ver, por exemplo, WO88/07378 e Patente US 4.975.278.

[0284] O componente enzimático do imunoconjugado útil paraADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar em uma profármaco de modo a converter esta em uma forma mais ativa, citotóxica.

[0285] Enzimas que são úteis na presente revelação incluem, entre outras, fosfatase alcalina úteis para converter profármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase úteis para converter pro- fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina deaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticâncer, 5- fluoruracil; proteases, como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L), que são úteis para converter profármacos contendo peptídeo em fármacos livres; D- alanilcarboxipeptidases, úteis para converter profármacos que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas que clivam carboidratos como α- galactosidase e neuraminidase úteis para converter profármacos glico- siladas em fármacos livres; β-lactamase útil para converter fármacos derivadas com β-lactamas em fármacos livres; e penicilina amidases, como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter fármacos em seus nitrogênios amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, ainda conhecida na técnica como abzimas, podem ser usados para converter as profármacos da revelação em fármacos ativos livres (Ver, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados como descrito aqui para liberação de abzima a uma população de célula de tumor.

[0286] As enzimas acima podem ser covalentemente ligadas aosanticorpos por técnicas bem conhecidas na técnica como o uso de reagentes de reticulação heterobifuntionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antígeno de um anticorpo da revelação ligado a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima da revelação podem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica (Ver, por exemplo, Neuberger et al., Nature 312:604608 (1984))

Produção recombinante de anticorpos

[0287] DNA que codifica um anticorpo da presente revelação podeser isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de especificamente se ligarem aos genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos). Geralmente isto requer a clonagem de DNA ou, preferencialmente, mRNA (ou seja, cDNA) que codifica os anticorpos. Clonagem e sequenciamento é realizado usando técnicas padrões, como por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR), (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Labor atory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press; Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994)), que são incorporados aqui por referência).

[0288] Reações de sonda de nucleotídeo e outras reações de hi-bridização de nucleotídeo são realizadas em condições que permitem a identificação de polinucleotídeos que hibridizam a cada outra em condições especificadas. Um conjunto exemplar de condições é como a seguir: hibridização rigorosa a 42°C em 50% formamida, 5X SSC, 20 mM Na^PO4, pH 6.8; e lavagem em 1X SSC a 55°C por 30 minutos. A fórmula para calcular condições de hibridização equivalente e/ou selecionar outras condições para obter um nível desejado de rigor é conhecida na técnica. É entendido na técnica que as condições de rigor equivalentes podem ser obtidas por variação de temperatura e tampão, ou concentração de sal como descrito Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 a 6.4.10. Modificações em condições de hibridização podem ser empiricamente determinadas ou precisamente calculadas com base no comprimento e no percentual de pareamento de base de guanosi- na/citosina (GC) da sonda. As condições de hibridização podem ser calculadas como descrito em Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 a 9.51

[0289] Como usado aqui, uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou sequência de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é (1) identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com o qual esta é ordinariamente associado na fonte natural do ácido nucleico ou (2) clonada, amplificada, marcada, ou de outra forma distinta de ácidos nucleicos de fundo de modo que a sequência do ácido nucleico de interesse pode ser determinada, é considerada isolada. Uma molécula de ácido nucleico iso lada é outra além da forma ou ambiente em que é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distintas de uma molécula de ácido nucleico como esta existe nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que ordinariamente expressa o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local do cromossomo diferente daquele das células naturais.

[0290] Uma fonte para RNA usada para clonar e sequência é umhibridoma produzido por obtenção de uma célula B do camundongo transgênico e fundido a célula B a uma célula imortal. Uma vantagem de uso de hibridomas é que podem ser facilmente triadas e um hibri- doma que produz um anticorpo monoclonal humano de interesse selecionado. Alternativamente, RNA pode ser isolado de células B (ou baço total) do animal imunizado. Quando as fontes além dos hibridomas são usadas, pode ser desejável triar sequências que codificam imuno- globulinas ou polipeptídeos de imunoglobulinas com características de ligação específicas. Um método para dita triagem é o uso de tecnologia de exibição de fago. Phage exibição é descrito aqui e é ainda bem conhecida na técnica. Ver por exemplo, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, e Caton e Koprowski, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-54 (1990)), cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Em uma modalidade usando tecnologia exibição de fago, cDNA de um camundongo transgênico imunizado (por exem-plo, cDNA de baço total) é isolado, a reação em cadeia da polimerase é usada para amplificar uma sequência de cDNA que codifica uma porção de um polipeptídeo de imunoglobulina, por exemplo, regiões CDR, e as sequências amplificadas são inseridas em um vetor de fa- go. cDNAs que codificam peptídeos de interesse, por exemplo, peptí- deos de região variável com características de ligação desejada, são identificadas por técnicas padrões como panning.

[0291] Tipicamente a sequência que codifica uma região variávelinteira de polipeptídeo de imunoglobulina é determinada, no entanto, será, algumas vezes, por adequar à sequência somente uma porção da região variável, por exemplo, a porção que codifica CDR. Tipicamente, a porção sequenciada será pelo menos 30 bases em comprimento, mais frequente, baseado na codificação para pelo menos cerca de um terço ou pelo menos cerca de metade do comprimento da região variável será sequenciada.

[0292] O sequenciamento é realizado usando técnicas padrões(ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, e Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, que é incorporado aqui por referência). Ao comparar a sequência do ácido nucleico clo- nado com sequências publicadas de genes de imunoglobulina humana e cDNAs, um especialista irá prontamente ser capaz de determinar, dependendo da região sequenciada, (i) o uso do segmento de linhagem germinativa do polipeptídeo de imunoglobulina (incluindo o isotipo da cadeia pesada) e (ii) a sequência das regiões variáveis de cadeia pesada e leve, incluindo sequências que resultam da adição de N- região e processo de mutação somática. Uma fonte de informação de sequência do gene de imunoglobulina é o National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

[0293] Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores deexpressão, que são então transfectados em células hospedeiras como células de E. coli, células COS de símios, células 293 renais embrionárias humanas (por exemplo, células 293E), células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem, de outra forma, proteína imunoglobulina, para obter a síntese nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos é bem conhecida na técnica.

[0294] Expressão de sequência de controle se refere às sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são apropriadas para procarióticos, por exemplo, incluem uma promotora, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação ao ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizaram promotores, sinais de poliadenilação e potencializadoras.

[0295] Ácido nucleico é operacionalmente ligado quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretória é operacionalmente ligada a DNA para um polipeptídeo se este é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se esta afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se esta é posicionada de modo a facilitar a tradução. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguo e na fase de leitura. No entanto, potencializadores não devem ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restrição convenientes. Se ditos sítios não existem, os adaptadores de oli- gonucleotídeos sintéticos ou ligantes podem ser usados de acordo com a prática convencional.

[0296] Célula, linhagem celular e cultura de célula são geralmenteusados de modo intercambiável e todas ditas designações incluem progenia. Transformantes e células transformadas incluem células objeto primárias e culturas derivadas destes sem levar em consideração o número de transferências. É ainda entendido que toda a progenia pode não precisamente ser idêntica em teor de DNA, devido às mutações deliberadas ou inadvertidas A progenia mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como triada para a célula originalmente transformada é incluída. Onde designações distintas são pretendidas, isto ficará claro a partir do contexto.

[0297] Em uma modalidade alternativa, a sequência de aminoáci-do de uma imunoglobulina de interesse pode ser determinada por se- quenciamento de proteína direta. Sequências de nucleotídeo codifican- tes apropriadas podem ser desenhadas de acordo com uma tabela de códon universal.

[0298] Variantes de sequência de aminoácido podem ser preparadas por introdução de alterações de nucleotídeo apropriadas no DNA que codifica, ou por síntese de peptídeo. Ditas variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos dos anticorpos. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição é feita para chegar no construto final, contanto que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem alterar processos pós-tradução da molécula, como alteração do número ou posição de sítios de glicosilação.

[0299] Moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácido do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, entre outros, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por mu- tagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada por sítio), mu- tagênese por PCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo.

[0300] A presente revelação ainda fornece ácido nucleico isoladoque codifica anticorpos da revelação, opcionalmente operacionalmente ligada às sequências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira, vetores e células hospedeiras compreendendo os ácidos nuclei- cos e técnicas recombinantes para a produção de anticorpos, que podem compreender cultivar a célula hospedeira de modo que o ácido nucleico seja expresso e, opcionalmente, recuperando o anticorpo da cultura de célula hospedeira ou meio de cultura. Vários sistemas e métodos para a produção de anticorpo são revisados por Birch & Racher (Adv. Drug Deliv. Rev. 671-685 (2006)).

[0301] Para produção recombinante dos anticorpos, o ácido nu-cleico que codifica este é isolado e inserido em um vetor replicável para outra clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo monoclonal é prontamente isolada e sequenciada usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores seletivos, um elemento potencializador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição.(1) Componente de sequência sinal

[0302] Anticorpos da presente revelação podem ser produzidospor recombinação não somente diretamente, mas ainda como um poli- peptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferencialmente uma sequência sinal ou outros polipeptídeos contendo um sítio de clivagem específico em N-terminal da proteína ou polipeptídeo maduros. A sequência sinal selecionada preferencialmente é uma que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por um sinal peptidase) pela célula hospedeira. Se células hospedeiras procarióticas não reconhecem e processo a sequência sinal de anticorpo nativo, a sequência sinal pode ser substituída por uma sequência sinal selecionada, por exemplo, do grupo de pectato liase (por exemplo, pelB) fosfatase alcalina, penicilinase, lpp, ou líderes de enterotoxina estáveis ao calor II. Para secreção de levedura a sequência sinal nativa pode ser substituída por, por exemplo, a invertase líder de levedura, líder de fator α (incluindo lideres de fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder de fosfatase ácida, a líder de glicoamilase de C. albicans, ou o sinal descrito em WO90/13646. Em expressão em células de mamíferos, as sequências sinais mamíferas bem como líderes secretórias virais, por exemplo, o sinal gD herpes simplex, são disponíveis.

[0303] O DNA para dita região precursora é ligada em fases deleitura ao DNA que codifica o anticorpo.(2) Origem de componente de replicação

[0304] Ambos os vetores de expressão e clonagem contêm umácido nucleico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem esta sequência é uma que permite que o vetor se replique independentemente do DNA do cromossomo hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autonomamente. Ditas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação de plasmídeo pBR322 é apropriada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de 2 μ de plasmídeo é apropriada para levedura, e várias origens virais são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usado somente porque este contém o promotor precoce).(3) Componente marcador seletivo

[0305] Vetores de expressão e clonagem podem conter um geneseletivo, ainda chamado de marcador seletivo. Genes de seleção típi- cos codificam proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol, ou ácido micofenolico (b) complementar deficiências auxotróficas, ou (c) fornecer nutrientes críticos não disponíveis de meio complexo, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.

[0306] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármacopara interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas de modo bem sucedido com um gene heterólogo produz uma proteína que confere resistência à fármaco e assim sobrevive ao regime de seleção. Exemplos de dita seleção dominante usam os fármacos metotrexato, neomicina, histidinol, puromi- cina, ácido micofenolico e higromicina.

[0307] Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriadaspara células mamíferas são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico que codifica o anticorpo, como DHFR, timidina quinase, metalotionain-I e -II, preferencialmente genes de metalotionain de primata, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.

[0308] Por exemplo, as células transformadas com o gene de seleção DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os trans- formantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR tipo selvagem é empregado é a linhagem de célula de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade DHFR.

[0309] Alternativamente, células hospedeiras (particularmentehospedeiros tipo selvagens que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de DNA que codificam anticorpo da revelação, proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável como aminoglicosideo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável como um antibiótico aminoglico- sídeo, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Ver Patente US 4.965.199.

[0310] Um gene de seleção apropriado par auso em levedura é ogene trp1 presente em plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura desprovida de capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones, (Genetics 85:12 (1977)). A presença de lesão trp1 no genoma de célula hospedeira de levedura então fornece um ambiente efetivo para detectar transformação por crescimento na ausência de triptofa- no. De modo semelhante, cepas de leveduras deficientes em Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas por plasmídeos conhecidos contendo o gene Leu2. Cepas de leveduras deficientes em Ura3 são complementadas por plasmídeos contendo o gene ura3.

[0311] Além disso, vetores derivados de um plasmídeo circular de1,6 μm pKD1 podem ser usados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi reportado para K. lactis Van den Berg, (Bio/Technology, 8:135 (1990)). Vetores de expressão multi-cópia estáveis para secreção de albumina sérica humana recombinante madura por cepas industriais de Kluyve- romyces foram revelados (Fleer et al, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).(4) Componente promotor

[0312] Vetores de expressão e clonagem geralmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica o anticorpo. Promotores apropriados para uso como hospedeiros procarióticos incluem o promotor arabinose (por exemplo, araB), promotor phoA, sistemas promotores de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp), e promotores híbridos como o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são apropriados. Promotores para uso em sistemas bacterianos ainda irão conter uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o anticorpo da revelação.

[0313] Sequências promotoras são conhecidas para eucarióticos.Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases à montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrou 70 a 80 bases à montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos é uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são apropriadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticas.

[0314] Exemplos de sequências promotoras apropriadas para usocom hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3- fosgoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarbo- xilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glucoquinase.

[0315] Outros promotores de leveduras, que são promotores indu-zíveis contendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são então as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotionaina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis para maltose e utilização de galactose. Vetores e promotores apropriados para uso em expressão em leveduras são ainda descritos em EP 73.657. Potencializadores de levedura são vantajosamente usados com promotores de levedura.

[0316] Transcrição de anticorpo de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus como vírus de leucemina de Abelson, vírus po- lioma, vírus fowlpox, adenovírus (como Adenovírus 2), vírus de papi- loma bovino, vírus de sarcoma aviário, mais preferencialmente citome- galovírus, um retrovírus, vírus de hepatite B, Vírus símio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor actina ou um promotor de imunoglobulina, de protomores de choque térmico, contando que ditos promotores sejam compatíveis com sistemas de células hospedeiras.

[0317] Os promotores precoce e tardio de vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que ainda contêm a origem de replicação de SV40. O promotor precoce imediato do vírus de citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus de papiloma bovino como um vetor é revelado na Patente US 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrito na Patente US 4.601.978. Ver ainda Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) em expressão de cDNA de β-interferon humano em células de camundongos sob o controle de um promotor de timidina de vírus herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírus rous sarcoma pode ser usada como o promotor.(5) Componente elemento potencializador

[0318] A transcrição de um DNA que codifica o anticorpo destarevelação por eucarióticos superiores é geralmente aumentado por inserção de uma sequência potencializadora no vetor. Muitas sequên- cias potencializadoras são conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína, e insulina). Tipicamente, no entanto, poderá ser usado um potencializador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o potencializador SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o potencializador de promotor precoce de citomegalovírus, o potencializador polioma no lado tardio da origem de replicação e potencializadores de adenovírus. Ver ainda Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) em elementos potencializadores para ativação de promotores eucarióticos. O potencializador pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou 3' à sequência que codifica o anticorpo, mas é preferencialmente localizada em sítio 5' do promotor.(6) Componente de terminação de transcrição

[0319] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eu-carióticas (células de leveduras, fungos, insetos, vegetais, animais, humanos ou nucleadas de outros organismos multicelulares) terão ainda sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização de mRNA. Ditas sequências são comumente disponíveis de 5' e, ocasionalmente 3', regiões não traduzidas de DNAs eucarióti- cos ou virais ou cDNAs. Estas regiões contêm segmentos de nucleotí- deo transcritos como fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino. Ver WO94/11026 e o vetor de expresso revelado neste. Outro é o terminador de transcrição de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo.(7) Seleção e transformação de células hospedeiras

[0320] Células hospedeiras apropriadas para clonar ou expressaro DNA nos vetores aqui são as células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores descritas acima. Procarióticos apropriados para esta finalidade incluem eubactéria, como organismos Gram- negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P revelada em DD 266,710 publicado em 12 de abrila de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferencial é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325) seja apropriadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limi- tantes.

[0321] Além dos procarióticos, micróbios eucarióticos como fungosfilamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão apropriados para vetores que codificam anticorpos. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura comum de padaria, é o mais comumente usado entre os micro-organismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, um número de outros gêneros, espécies e cepas são comu- mente disponíveis e úteis aqui, como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypo- cladium, e hospedeiros Aspergillus como A. nidulans e A. niger.

[0322] Células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivados de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos. Várias cepas de baculovírus e variantes e correspondentes células de hospedeiros insetos permissivos de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção são publicamente disponíveis, por exemplo, o variante L-1 de Autogra- pha californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e ditos vírus podem ser usados como os vírus aqui de acordo com a presente revelação, particularmente para transfecção de células de Spodoptera fru- giperda.

[0323] Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja,petúnia, tomate, tabaco, lemna, e outras células vegetais podem ainda ser utilizadas como hospedeiros.

[0324] Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são células de ovário de hamster chinês, incluindo células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, e células de ovário de hamster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); células de rim de hamster recém nascidos (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli de camundongos (TM4, Mather, (Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco africano verde (VERO-76, ATCC CRL-1587); células carcinoma cervi-cal humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

[0325] Células hospedeiras são transformadas ou transfectadascom os vetores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção de anticorpos e cultivados em meio nutriente convencional como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. Além disso, novos vetores e linhagens de células transfectadas com várias cópias de unidades de transcrição separadas por um marcador seletivo são particularmente úteis e preferenciais para a expressão de anticorpos que se ligam ao alvo.(8) Cultivar as células hospedeiras

[0326] As células hospedeiras para produzir o anticorpo desta revelação podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios co-mercialmente disponíveis como Ham's F10 (Sigma), meio essencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são apropriados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., (Meth. Enz. 58: 44, 1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762;4.560.655; ou 5.122.469; WO90103430; WO 87/00195; ou patente U.S. Re. No. 30.985 pode ser usado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser complementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como fármaco gentamicina), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode ainda ser incluído em concentrações apropriadas que poderiam ser conhecidas ao especialistas na técnica. As condições de cultura, como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas anteriormente usadas com células hospedeiras selecionadas para expressão e serão aparentes aos especialistas na técnica.(9) Purificação de anticorpo

[0327] Quando usando técnicas recombinantes, o anticorpo podeser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico ou diretamente secretado no meio, incluindo de cultuas microbianas. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os debris particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Better et al. (Science 240:1041-43, 1988; ICSU Short Reports 10:105 (1990); e Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:457-461 (1993) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados ao espaço periplásmico de E. coli. [Ver ainda, (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)].

[0328] A composição de anticorpo preparada de células microbianas ou mamíferas pode ser purificada usando, por exemplo, cromato- grafia por hidroxilapatita, cromatografia de troca catiônica ou aviária, e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferencial. A adequabilidade de proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas y1, Y2, ou Y4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983). A proteína G é recomentada para todos os isotipos de camundongos e Y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é ligado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permite taxas de fluxo mais rápidos e tempos de processamento mais curtos podem ser obtidos com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH 3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína com fracionamento em coluna de troca iônica, precipitação por etanol, HPLC de fase reversa, cromato- grafia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE®, cromato- grafia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação por sulfato de amônio são ainda disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Métodos de triagem

[0329] Fármacos efetivos dependem da identificação de agenteseficazes destituído de toxicidade significativa. Anticorpos podem ser triados para afinidade de ligação por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, ensaios de mudança de gel, Western blots, de competição radiomarcada, cofracionamento por cromatografia, reticulação, ELISA, e semelhantes podem ser usados, que são descritos em, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0330] Em uma modalidade da presente revelação, métodos paratriagem de anticorpos que modulam a atividade de um antígeno alvo compreendem contatar anticorpos testes com um polipeptídeo alvo e avaliam para a presença de um complexo entre o anticorpo e o ligante alvo. Em ditos ensaios, o ligante é tipicamente marcado. Após incubação apropriada, ligante livre é separado daquele presente na forma ligada, e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do anticorpo particular para ligar ao ligante alvo.

[0331] Em outra modalidade da presente revelação, triagem dealto rendimento para fragmentos de anticorpo ou CDRs contendo afi- nidade de ligação apropriada a um polipeptídeo alvo é empregada. Resumidamente, grandes números de diferentes compostos testes de peptídeos pequenos são sintetizados em um substrato sólido. Os anticorpos testes de peptídeo são contatados com um polipeptídeo alvo e lavados. Polipeptiedos ligados são então detectados por métodos bem conhecidos na técnica. Anticorpos purificados da revelação podem ainda ser revestidos diretamente em placas para uso nas técnicas de triagem de fármaco acima mencionados. Além disso, anticorpos não neutralizantes podem ser usados para capturar o alvo e imobilizar este no suporte sólido.

[0332] Métodos para avaliar atividade biológica neutralizante deTGFβ e anticorpos anti-TGFβ são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US 7.867.496. Exemplos de bioensaios in vitro incluem: (1) indução de formação de colônia de células NRK em ágar mole na presença de EGF (Roberts et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5339-5343); (2) indução de diferenciação de células mesen- quimais primitivas para expressar um fenótipo cartilaginoso (Seyedin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:2267-2271); (3) inibição de crescimento de células epiteliais pulmonares Mv1Lu mink (Danielpour et al. (1989) J. Cell. Physiol., 138:79-86) e células renais de macaco BBC-1 (Holley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5989-5992); (4) inibição de mitogênese de timócitos de camundongos C3H/HeJ (Wrann et al. (1987) EMBO J., 6:1633-1636); (5) inibição de diferenciação de células de mioblasto L6 de rato (Florini et al. (1986) J. Biol. Chem., 261:16509-16513); (6) medição de produção de fibronectina (Wrana et al. (1992) Cell, 71:1003-1014); (7) indução de inibidor de ativador de plasminogênio I (PAI-1) promotor fundido a um gene repórter luciferase (Abe et al. (1994) Anal. Biochem., 216:276-284); (8) ensaios imunoabsorventes ligados a enzima em sanduiche (Danielpour et al. (1989) Growth Factors, 2:61-71); e (9) ensaios celulares descri- tos em Singh et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. Lett., 13(24):4355- 4359.

[0333] Em algumas modalidades, neutralização de anticorpo deTGFβ1 e TGFβ2 é e pelo menos 2-50 vezes, 10-100 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, ou 20-50%, 50100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% mais potente que a neutralização de TGFβ3.

[0334] Métodos adicionais para avaliar a atividade biológica e neutralização de TGFβ (por exemplo, por anticorpos TGFβ) são fornecidos nos Exemplos. Por exemplo, a neutralização pode ser medida por ensaios de neutralização e expressos como um valor IC50. O valor IC50 pode ser calculado para dada molécula determinando a concentração de molécula necessária para induzir metade da inibição da resposta biológica máxima de uma segunda molécula ou atividade de célula. Quanto menor o IC50, maior a potência da molécula em inibir a atividade de proteína desejada. Os ensaios de neutralização exemplares contemplados aqui incluem, entre outros, um ensaio de liberação de interleucina-11 e um ensaio de proliferação celular HT-2/IL-4. Além disso, um ensaio de atividade TGFβ pode ser realizado para determinar se o anticorpo inibe uma isoformas TGFβ preferencialmente, incluindo um ensaio de fosforilação de pSMAD em um ensaio de ligação a rhLAP. Em outra modalidade, o anticorpo tem um menor IC50 (ou seja, melhor ligação, maior potência) para TGFβ1 e TGFβ2 em comparação a TGFβ3.

Terapia de combinação

[0335] Em uma modalidade, um anticorpo da presente revelação éadministrado com um segundo agente útil para tratar uma doença ou distúrbio como descrito aqui. Se mais do que um anticorpo efetivo em ligação ao antígeno alvo é identificado, é contemplado que dois ou mais anticorpos para diferentes epítopos do antígeno alvo e/ou que ligam preferencialmente a isoformas diferentes de TGFβ podem ser misturados de modo que a combinação de anticorpos juntos fornece ainda eficácia melhorada contra uma condição ou distúrbio associado com o polipeptídeo alvo. As composições compreendendo um ou mais anticorpos da invenção podem ser administradas às pessoas ou mamíferos que sofrem de, ou predispostos a sofrerem de, uma condição ou distúrbio a ser tratado associado com o polipeptídeo alvo.

[0336] Administração concorrente de dois agentes terapêuticosnão requer que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo ou pela mesma via, contanto que haja uma sobreposição no período de tempo durante o qual os agentes estão exercendo seus efeitos terapêuticos. Administração simultânea ou sequencial é contemplada, como em administração em dias ou semanas diferentes.

[0337] Um segundo agente pode ser outros agentes terapêuticos,como citocinas, fatores de crescimento, anticorpos a outros antígenos alvos, agentes anti-inflamatórios, agentes anticoagulantes, agente que inibe a produção de matriz extracelular, agentes que reduzirão ou reduzem a pressão arterial, agentes que irão reduzir o colesterol, triglice- rídeos, LDL, VLDL, ou lipoproteína (a) ou aumento de HDL, agentes que irão aumentar ou reduzir os níveis de proteínas reguladoras de colesterol, fármacos ou moléculas antineoplásicas. Para pacientes com um distúrbio hiperproliferativo, como câncer ou em tumor, combinação com segundas modalidades terapêuticas como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, ou cirurgia é ainda contemplado.

[0338] É contemplado que o anticorpo da presente revelação e osegundo agente podem ser administrados simultaneamente, na mesma formulação. É ainda contemplado que os agentes são administrados em uma formulação separada e administrados concomitantemente, com simultaneamente se referindo aos agentes administrados em até 30 minutos de cada outro.

[0339] Em outro aspecto, o segundo agente é administrado antesda administração da composição anticorpo. Antes da administração se refere à administração do segundo agente dentro da faixa de uma semana antes do tratamento com o anticorpo, até 30 minutos antes da administração do anticorpo. É ainda contemplado que o segundo agente é administrado subsequente à administração da composição anticorpo. Subsequente administração entende-se administração de 30 minutos após tratamento do anticorpo até uma semana após a administração do anticorpo.

[0340] É ainda contemplado que outras terapias adjuntas podemser administradas, onde apropriado. Por exemplo, o paciente pode ainda ser administrado com uma proteína de degradação de matriz extracelular, terapia cirúrgica, quimioterapia, um agente citotóxico, ou terapia de radiação onde apropriado.

[0341] É ainda contemplado que quando o anticorpo é administrado em combinação com um segundo agente, como por exemplo, em que o segundo agente é uma citocina ou fator de crescimento, ou um agente quimioterápico, a administração ainda inclui uso de um agente radioterapêutico ou terapia de radiação. A terapia de radiação administrada em combinação com uma composição de anticorpo é administrada como determinado pelo tratamento médico, e em doses tipicamente administrados aos pacientes sendo tratados para câncer.

[0342] Um agente citotóxico se refere a uma substância que inibeou previne a função de células e/ou causa destruição das células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos, e toxinas como toxinas enzi- maticamente ativa de toxinas bacterianas, fúngicas, vegetais, plantas ou animais ou toxinas sintéticas, ou fragmentos dos mesmos. Um agente não citotóxico se refere a uma substância que não inibe ou previne a função de células e/ou não causa destruição de células. Um agente não citotóxico pode incluir um agente que pode ser ativado para ser citotóxico. Um agente não citotóxico pode incluir uma esfera, lipossoma, matriz ou partícula (ver, por exemplo, publicações de patente U.S. 2003/0028071 e 2003/0032995 que são incorporados por referência aqui). Ditos agentes podem ser conjugados, acoplados, ligados ou associados com um anticorpo de acordo com a revelação.

[0343] Agentes quimioterápicos contemplados para uso com osanticorpos da presente revelação incluem, entre outros, aqueles listados na Tabela I:

[0344] É ainda contemplado que o segundo agente é um agenteanti-fibrótico. Agentes anti-fibróticos exemplares incluem, entre outros, outros agentes que reduzem a atividade de fator de transformação de crescimento beta (TGF-β) (incluindo, entre outros, GC-1008 (Genzyme/MedImmune); lerdelimumab (CAT-152; Trabio, Cambridge Antibody); metelimumab(CAT-192,Cambridge Antibody,); LY-2157299 (Eli Lilly); ACU-HTR-028 (Opko Health)) incluindo anticorpos que direcionam para uma ou mais isoformas TGF-β, inibidores de TGF-β receptor quinases TGFBR1 (ALK5) e TGFBR2, e moduladores de vias de sinalização pós-receptor; sinalização de receptor de quimiocina; antagonistas de receptor de endotelina incluindo inibidores que direci-onam a ambos receptor A e B de endotelina e aqueles que seletivamente direcionam ao receptor A de endotelina (incluindo, entre outros, ambrisentan; avosentan; bosentan; clazosentan; darusentan; BQ-153; FR-139317, L-744453; macitentan; PD-145065; PD-156252;PD163610;PS-433540; S-0139; sitaxentan sódico; TBC-3711; ziboten- tan); agentes que reduzem a atividade de fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF) (incluindo, entre outros, FG-3019, FibroGen), e ainda incluindo outros anticorpos neutralizantes de CTGF; inibidores de metaloproteinase de matriz (MMP) (incluindo, entre outros, MMPI- 12, PUP-1 e tigapotide triflutato); agentes que reduzem a atividade de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) incluindo, entre outros, erlotinib, gefitinib, BMS-690514, cetuximab, anticorpos direcio-nando ao receptor EGF, inibidores de EGF receptor quinase, e modu- ladores de vias de sinalização pós-receptor; agentes que reduzem a atividade de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) (inclu-indo, entre outros, Imatinib mesilato (Novartis)) e ainda incluindo anti-corpos neutralizantes de PDGF, anticorpos direcionados para receptor PDGF (PDGFR), inibidores de atividade de PDGFR quinase, e vias de sinalização pós-receptor; agentes que reduzem a atividade de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (incluindo, entre outros, axiti- nib, bevacizumab, BIBF-1120, CDP-791, CT-322, IMC-18F1, PTC-299, e ramucirumab) e ainda incluindo anticorpos neutralizantes de VEGF, anticorpos direcionados para o receptor VEGF 1 (VEGFR1, Flt-1) e receptor VEGF 2 (VEGFR2, KDR), a forma solúvel de VEGFR1 (sFlt) e derivados dos mesmos que neutralizam VEGF, e inibidores de atividade de VEGF receptor quinase; inibidores de vários receptores quina- ses como BIBF-1120 que inibe receptor quinases para fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento de fibroblasto, e fator de crescimento derivado de plaqueta; agentes que interferem com função de integrina (incluindo, entre outros, STX-100 e IMGN-388) e ainda incluindo anticorpos direcionados a integrina; agentes que interferem com as atividades pró-fibróticas de IL-4 (incluindo, entre outros, AER-001, AMG-317, APG-201, e sIL-4Rα) e IL-13 (incluindo, entre outros, AER-001, AMG-317, anrukinzumab, CAT-354, cintredekin besu- dotox, MK-6105, QAX-576, SB-313, SL-102, e TNX-650) e ainda incluindo anticorpos neutralizantes a citocina, anticorpos que direcionam IL- 4 receptor ou IL-13 receptor, a forma solúvel de IL-4 receptor ou derivados dos mesmos que é reportado por ligar e neutralizar ambos IL-4 e IL-13, proteínas quiméricas incluindo todas ou parte de IL-13 e uma toxina particularmente endotoxina pseudomonas, sinalização por via de JAK-STAT quinase; agentes que interferem com transição mesen- quimal epitelial incluindo inibidores de mTor (incluindo, entre outros, AP-23573); agentes que reduzem os níveis de cobre como tetratiomo- libdato; agentes que reduzem estresse oxidativo incluindo N-acetila cisteína e tetratiomolibdato; e interferon gama. São ainda contemplados agentes que são inibidores de fosfodiesterase 4 (PDE4) (incluindo, entre outros, Roflumilast); inibidores de fosfodiesterase 5 (PDE5) (incluindo, entre outros, mirodenafil, PF-4480682, citrato de sildenafila, SLx-2101, tadalafil, udenafil, UK-369003, vardenafil, e zaprinast); ou modificados da via do ácido araquidônico incluindo inibidores de ci- clooxigenase e 5-lipoxegenase (incluindo, entre outros, Zileuton). São ainda contemplados compostos que reduzem remodelagem de tecido ou fibrose incluindo inibidores de prolil hidrolase (incluindo, entre outros, 1016548, CG-0089, FG-2216, FG-4497, FG-5615, FG-6513, fi- brostatina A (Takeda), lufironil,P-1894B, e safironila) e agonistas de receptor gama ativado por peroxisoma (PPAR) (incluindo, entre outros, pioglitazona e rosiglitazona).

[0345] Outros agentes anti-fibróticos contemplados incluem relaxi- na, pirfenidona, ufironil, surifonil, CAT-192, CAT-158; ambresentan, telina; FG-3019, um anticorpo CTGF; anticorpo anti-EGFR; um inibidor de EGFR quinase; tarceva; gefitinib; anticorpo PDGF, inibidor de PDGFR quinase; gleevec; BIBF-1120, VEGF, FGF, e inibidor de PDGF receptor; anticorpo anti-integrina; anticorpo IL-4; tetratiomolibdato, um agente quelante de cobre; interferon-gama; NAC, uma profármaco de cisteína; fator de crescimento hepatócito (HGF); KGF; bloqueadores de receptor de angiotensiona, inibidores de ACE, inibidores de renina; inibidores de COX e LO; Zileuton; monteleukast; avastina; estatinas; inibidores de PDE5, como sildenafil, udenafil, tadalafil, vardenafil, ou zaprinast; rofumilast; etanercept (Enbrel); pró-coagulante; prostaglan- dinas, como PGE2, PRX-08066, um antagonista de receptor 5HT2B; cintredekin besudotox, um IL13 humano quimérico conjugado a uma exotoxina de Pseudomonas geneticamente modificada; roflumilast, um inibidor PDE4; FG-3019, um anticorpo monoclonal humano de anti- fator de crescimento de tecido conectivo; GC-1008, um anticorpo monoclonal humano TGF-β; treprostinil, um análogo de prostaciclina; in- terferon-α; QAX-576, um modulador IL13; WEB 2086, um antagonista de receptor PAF; imatinib mesilato; FG-1019; Suramin; Bosentan; IFN- 1b; anti-IL-4; anti-IL-13; taurina, niacina, oligonucleotídeos antissenso NF-KB; e inibidores de óxido nítrico sintase.

Tratamento de Distúrbios

[0346] Em outra modalidade, a presente revelação fornece um método para inibir atividade alvo por administração de um anticorpo es-pecífico ao alvo para um paciente em necessidade do mesmo. Quaisquer dos tipos de anticorpos descritos aqui podem ser usados terapeu- ticamente. Em modalidades exemplares, o anticorpo específico alvo é um anticorpo humano, quimérico ou humanizado. Em outra modalidade exemplar, o alvo é humano e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa uma proteína alvo que o anticorpo específico alvo reage cruzado com. O anticorpo pode ser administrado a um mamífero não humano que ex-pressa uma proteína alvo com a qual o anticorpo reage cruzado (ou seja, um primata) para fins veterinários ou como um modelo animal da doença humana. Ditos modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos específicos alvos da revelação.

[0347] Em uma modalidade, a revelação fornece um método paratratar a condição ou distúrbio associada com expressão de TGF-β compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou uma composição farmacêutica como descrito aqui.

[0348] Doenças, condições ou distúrbios exemplares associadoscom expressão de TGFβ que podem ser tratadas com uma substância anticorpo que se liga a TGFβ (por exemplo, anticorpos da presente revelação) incluem cânceres, como câncer pulmonar, câncer de próstata, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer esofágico, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer ovariano, câncer de estômago, câncer fibrotico, glioma, e melanoma, doenças, condições ou distúrbios dos olhos (por exemplo, ocular, óptica, oftálmica ou oftalmológica), doenças, condições ou distúrbios associados com fibrose, por exemplo, doenças fibroproliferativa, condições ou distúrbios, ou doenças, condições ou distúrbios contendo uma fibrose associada.

[0349] Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativos ou doenças, contendo uma fibrose associada incluem aquelas que afetam qualquer órgão ou tecido no corpo, incluindo, entre outros, pele, pulmão, rins, coração, cérebro e olhos. Doenças, condições ou distúrbios fibroproliferativas ou doenças contendo uma fibrose associada incluem, entre outros, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose peribronquiolar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar obstru- tiva crônica (COPD), doença das vias aéreas pequenas (por exemplo, bronquiolite obstrutiva), enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI); fibrose pulmonar devido a agentes infecciosos ou tóxicos; fibrose renal, glomerulo- nefrite (GN) de todas as etiologias, por exemplo, GN proliferativa mesangial, GN imune e GN crescêntica, glomeruloesclerose, lesão tubu- lointersticial, fibrose intersticial renal, fibrose renal e todas as causas de fibrose intersticial renal, fibrose renal resultante de complicações de exposição ao fármaco, incluindo, tratamento com ciclosporina de receptores transplantados, por exemplo, tratamento com ciclosporina, nefropatia associada a HIV, necropatia de transplante, doença renal diabética, (por exemplo, nefropatia diabética), fibrose sistêmica nefro- gênica, diabetes, fibrose retroperitoneal idiopática, escleroderma, fibrose hepática, doenças hepáticas associadas com cicatrização excessiva e esclerose progressiva, incluindo cirrose hepática devido a todas as etiologias, distúrbios da árvore biliar, disfunção hepática atribuível a infecções, doenças fibrocísticas, doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia dilatada; mio- cardite; fibrose cardíaca de estenose vascular, (por exemplo, fibrose cardíaca pós-infarto), pós infarto do miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, doença veno-oclusiva, reestenose, (por exemplo, reesteno- se pós-angioplastia), insuficiência de enxerto arteriovenoso, ateroscle- rose, hipertensão, doença cardíaca hipertensiva, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, insuficiência cardíaca, doença da aorta, esclerose sistêmica progressiva, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, fasciste, síndrome de Raynaud, artrite reuma- toide, vitreoretinopatia proliferativa, vitreoretinopatia de qualquer etiologia ou fibrose associada com cirurgia ocular como tratamento de glaucoma, refixação de retina, extração da catarata, ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina, (por exemplo, queimadura alcalina à córnea) fibrose de cirurgia pós catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcapsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas dos olhos do segmento anterior, fibrose do estroma da córnea, (por exemplo, asso-ciada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular, (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas dos olhos do segmento posterior, cicatrização fibrovascular, (por exemplo, na retina ou na vasculatura da coroida do olho), fibrose de retina, fibrose epireti- nal, gliose retinal, fibrose subretinal, (por exemplo, associada com de-generação macular relacionada à idade), fibrose associada com cirurgia pós retina e glaucoma, descolamento de retina por tração em associação com contração do tecido em retinopatia diabética, doença de Peyronie, esclerose sistêmica, lesão do cordão pós-espinhal, osteopo- rose, doença de Camurati-Engelmann, doença de Crohn, cicatrizes, síndrome de Marfan, insuficiência ovariana prematura, a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, fibrose devida a incisões cirúrgicas ou trauma mecânico, fibrose associada com cirurgia ocular; e cicatriz hipertrófica ou excessiva ou formação de queloide na derme que ocorre durante cura de ferimento resultante de trauma ou ferimentos cirúrgicos.

[0350] Doenças oculares exemplares (por exemplo, ocular, óptica,oftálmica ou oftalmológica), condições ou distúrbios, incluem, entre ou-tras, distúrbios fibroproliferativos, fibrose do olho, fibroses oftálmicas, disfunção da retina, fibrose associada com disfunção da retina, degene-ração macular úmida ou seca, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorreti- nopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina (por exemplo, queimadura alcalina na córnea), fibrose de pós-cirurgia de ca-tarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcap- sular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatu- ra da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com con-tração do tecido na retinopatia diabética.

[0351] Doenças fibroproliferativas exemplares, condições ou distúrbios dos olhos, fibrose do olho, fibrose ocular ou fibroses oftálmicas, incluem, entre outras, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorretinopatia de qualquer etiologia, fibrose associada com disfunção de retina, fibrose associada com degeneração macular úmida ou seca, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da reti-na, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na córnea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, fibrose associada com queimadura alcalina, fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcap- sular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fibróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatu- ra da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com con-tração do tecido na retinopatia diabética.

[0352] Em várias modalidades, a doença, condição ou doença, oudistúrbio fibroproliferativo do olho é selecionada do grupo que consiste em vitreorretinopatia proliferativa, fibrose associada com cirurgia ocular, fibrose de cirurgia pós-catarata das lentes, fibrose do estroma corneal e queimadura alcalina.

[0353] Cânceres exemplares que podem ser tratados com umasubstância do anticorpo de acordo com a presente invenção incluem cânceres, como câncer pulmonar, câncer de próstata, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer esofágico, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer ovariano, câncer ovariano, câncer estomacal, câncer fibrótico, glioma e melanoma.

[0354] Foi observado que muitos tumores humanos (deMartin etal., EMBO J., 6: 3673 (1987), Kuppner et al., Int. J. Cancer, 42: 562 (1988)) e muitas linhagens celulares de tumor (Derynck et al., Cancer Res., 47: 707 (1987), Roberts et al., Br. J. Cancer, 57: 594 (1988)) produzem TGFβ e sugere um possível mecanismo para aqueles tumores para evadir sobrevivência imunológica normal.

[0355] Expressão da isoforma TGFβ em câncer é complexo e variável com diferentes combinações de isoformas TGFβ contendo papéis diferentes em cânceres particulares. Moléculas de TGFβ podem atuar como supressores de tumor e promotores de tumor. Por exemplo, de- leção ou regulação para baixo de sinalização TGFβ em animais pode resultar em câncer de mama aumentado, câncer intestinal, câncer pancreático, câncer de cólon, e carcinoma de célula escamosa, indicando a presença de TGFβ é importante para prevenir ou reduzir pro- gressão de tumor (Yang et al., Trends Immunol 31:220-27, 2010). No entanto, a sobre expressão de TGFβ é conhecida por ser pró- oncogênica é detectada em muitos tipos de tumor (Yang et al., supra)

[0356] Complexidades adicionais são ainda revelados na PatenteUS 7.927.593. Por exemplo, diferentes isoformas TGFβ parecem ser mais relevantes aos tipos diferentes de cânceres. TGFβ1 e TGFβ3 po-dem ter um papel importante em câncer ovariano e sua progressão do que TGFβ2; enquanto expressão de TGFβ1 e TGFβ2 é maior em maior grau de tumores condrossarcoma do que TGFβ3. Em câncer de mama humano, TGFβ1 e TGFβ3 são altamente expressos, com expressão de TGFβ3 correlacionando-se com sobrevida geral, enquanto que pacientes com metástase de nódulos e expressão positiva de TGFβ3 têm resultados prognósticos fracos. No entanto, em câncer de cólon, TGFβ1 e TGFβ2 são mais altamente expressos do que TGFβ3 e estão presentes em maiores níveis circulantes do que em indivíduos sem câncer. Em gliomas, TGFβ2 é importante para migração celular. A partir de estudos recentes, não é aparente quais isoformas de TGFβ poderiam ser mais úteis para inibir em um câncer particular e em qual grau.

[0357] A infiltração de células imunes em sítios de tumor pareceser um fator de contribuição comum ao fator de crescimento. Estes infiltrados de célula imune podem ter um efeito benéfico ajudando a reduzir o tumor, mas ainda podem ainda ter efeito prejudicial permitindo a tolerância aos antígenos do tumor. Foi demonstrado que TGFβ pode afetar os níveis de células imunes em tumores (ver, por exemplo, Yang et al., Trends Immunol 31:220-27, 2010; Flavell et al., Nature Immunol 10:554-567, 2010; Nagarau et al., Expert Opin Investig Drugs 19:77-91, 2010). Por exemplo, TGFβ suprime células natural killer que infiltram tumores para eliminar tumores do corpo. TGFβ ainda suprime a atividade de células T citotóxicas e células T helper CD4+, tipos celu- lares que auxiliam na eliminação de tumores (Yang, supra). TGFβ ainda tem um papel na regulação de atividade de célula dendríticas, inibindo a migração em sítios de lesão e apresentação de antígeno para promover uma resposta imune. As células dendríticas são ambas res- ponsivas ao TGFβ e secretam TGFβ. Por exemplo, as células dendríti- cas infiltram tumores e absorvem as células, secretam TGFβ e ativam células T regulatórias, que por sua vez previnem o clearance de tumor (Flavell et al., supra). Além disso, células supressoras derivadas de mieloide (MDSC) são células derivadas de medula óssea que expandem durante a progressão do tumor. MDSC inibe a proliferação de célula T, suprimem maturação de célula dendrítica, e inibem atividade de célula natural killer, assim, ajudando as células a evadirem à resposta imune (Li et al., J Immunol. 182:240-49, 2009). TGFβ demonstrou contribuir aos efeitos de MDSC na inibição de atividade de células natural (Li et al., supra; Xiang et al., Int J Cancer124:2621-33, 2009). O papel de várias isoformas TGFβ em cada um destes processos imunes é ainda não esclarecido. Seletivamente direcionado para isoformas TGFβ e inibindo as mesmas em vários graus podem ser instrumentais na modulação da resposta imune do hospedeiro para combater e eliminar o tumor.

[0358] Em determinadas modalidades, o anticorpo ou composiçãodescrito aqui modula células imunes em um tumor. Em algumas moda-lidades, o anticorpo ou composição aumenta o número de células natural killer (NK) em um tumor e/ou aumenta a atividade citolítica de células NK. Em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrito aqui aumenta o número de células T regulatórias em um tumor e/ou inibe a função de célula T regulatória. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrito aqui inibe a capacidade de Tregs em regular para baixo uma resposta imune ou para migrar a um sítio de uma resposta imune.

[0359] Em várias modalidades, o anticorpo ou composição descritoaqui células T citotóxicas em um tumor, e/ou aumenta a atividade de CTL, por exemplo, impulsiona, aumenta ou promove a atividade de CTL. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrito aqui aumenta a produção de perforina e granzima por CTL e aumenta atividade citolítica de CTL.

[0360] Em varias modalidade, o anticorpo ou composição descritoaqui reduzem o número de células-tronco derivadas de monócito (MDSC) em um tumor e/ou inibe a função MDSC. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrita aqui inibem a capacidade de MDSCs em suprimir uma resposta imune, inibem a ati-vidade supressiva imune de MDSCs, e/ou inibem a capacidade de MDSCs em promover a expansão e/ou função de Tregs.

[0361] Em várias modalidades, o anticorpo ou composição descritaaqui reduzem o número de células dendríticas (DC) em um tumor e/ou inibem a função tolerogênica (por exemplo, efeito tolerogênico) de células dendríticas. Por exemplo, em várias modalidades, o anticorpo ou composição descrita aqui aumentam o efeito tolerogênico de células dendríticas CD8+.

[0362] Em várias modalidades, quaisquer um dos anticorposXPA.42,068, XPA.42,089 ou XPA.42.681 ou variantes dos mesmos como descrito aqui modulam uma ou mais das atividades imunes descritas acima.

[0363] Como declarado acima, expressão de TGFβ ainda foi envolvida no início de várias fibroses de tecido, como nefrosclerose, fibrose pulmonar e cirrose; bem como o início de vários estados, como hepatite crônica, artrite reumatoide, restenose vascular, e queloide da pele. Em algumas modalidades exemplares, os anticorpos descritos aqui são usados para tratar fibrose ou uma condição fibrótica. Doenças de fibrose ou fibróticas exemplares incluem, entre outras, glomeru- lonefrite, síndrome de distresse respiratório do adulto ou aguda (ARDS), diabetes, doença renal diabética, fibrose hepática, fibrose renal, fibrose pulmonar, fibrose cardíaca pós-infarto, doenças fibrocísti- cas, câncer fibrótico, infarto pós-miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, fibrose pulmonar, cirrose hepática, doença veno-oclusiva, lesão pós-medula espinhal, pós-cirurgia de retina e glaucoma, pós- restenose angioplastia, fibrose intersticial renal, insuficiência de enxerto arteriovenoso e cicatrização.

[0364] Em uma modalidade, tratamento destes distúrbios ou condições em um animal em necessidade de dito tratamento, compreende administrar ao animal uma quantidade efetiva de um anticorpo ou composição compreendendo um anticorpo descrito aqui.

[0365] As condições tratáveis por métodos da presente revelaçãopreferencialmente ocorrem em mamíferos. Os mamíferos incluem, por exemplo, humanos e outros primatas, bem como animais de estimação ou de companha como cães e gatos, animais de laboratório como ratos, camundongos e coelhos, e animais de fazenda como cavalos, porcos, ovelha e gado.

Usos não terapêuticos

[0366] Os anticorpos da presente revelação podem ser usadoscomo agentes de purificação por afinidade para alvo ou em ensaios de diagnóstico para proteína alvo, por exemplo, detectando sua expressão em células específicas, tecidos ou soro. Os anticorpos podem ainda ser usados para ensaios de diagnóstico in vivo. Geralmente, para estas finalidades o anticorpo é marcado com um radionuclídeos (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S) de modo que o anticorpo possa ser localizado usando imunoscintilografia.

[0367] Os anticorpos da presente revelação podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduiche diretos e indiretos como ELI- SAs, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Os anti-corpos podem ainda ser usados para imunohistoquímica, para marcar tecido ou amostras de células usando métodos conhecidos na técnica.

[0368] Os anticorpos específicos alvos podem ser usados em umimunoensaio convencional, incluindo, entre outros, ELISA, RIA, FACS, imunohistoquímica de tecido, Western blot ou imunoprecipitação, que são todas bem conhecidos na técnica. Os anticorpos da revelação podem ser usados para detectar alvo em humanos e outros mamíferos. A presente revelação fornece um método para detectar em uma amostra biológica compreendendo contatar uma amostra biológica com um anticorpo específico alvo da revelação e detecção do anticorpo ligado. Em uma modalidade, o anticorpo específico alvo é diretamente marcado com um marcador detectável. Em outra modalidade, o anticorpo específico alvo (o primeiro anticorpo) é um segundo anticorpo e não marcado ou outra molécula que se liga ao anticorpo específico alvo é marcada. Como é bem conhecido a um especialista na técnica, um segundo anticorpo é escolhido que é capaz de especificamente ligar a espécies particulares e classes do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo específico alvo é um IgG humano, então o anticorpo secundário poderia ser um anti-IgG humano. Outras moléculas que podem se ligar aos anticorpos incluem, entre outros, proteína A e proteína G, ambos dos quais são disponíveis comerciais, por exemplo, de Pierce Chemical Co.

[0369] É contemplado que os imunoensaio revelados acima sãousados para um número de finalidades. Por exemplo, os anticorpos específicos alvo podem ser usados para detectar alvos em células ou na superfície de células em cultura de célula, ou secretadas no meio de cultura do tecido. Os anticorpos específicos alvos podem ser usados para determinar a quantidade de um alvo na superfície de células ou secretada no meio de cultura de tecido que foi tratado com vários compostos. Este método pode ser usado para identificar compostos que são úteis para inibir ou atiçar expressão ou secreção alvo. De acordo com este método, uma amostra de células é tratada com um composto teste por um período de tempo enquanto outra amostra é deixada não tratada. Se o nível total de alvo deve ser medido, as células são lisadas e o nível alvo total é medido usando um dos imunoen- saio descritos acima. O nível total de alvo nas células tratadas versus não tradas é em comparação para determinar os efeitos do composto teste.

Marcadores

[0370] Em algumas modalidades, a substância do anticorpo émarcada para facilitar sua detecção. Um "marcador" ou uma "porção detectável" é uma composição detectável por meio espectroscópico, fotoquímica, bioquímico, imunoquímico, químico ou outro meio físico. Por exemplo, marcadores apropriados para uso na presente revelação incluem, marcadores radioativos (por exemplo, 32P), fluoróforos (por exemplo, fluoresceína), reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigeni- na, ou haptenos bem como proteínas que podem ser preparadas de- tectáveis, por exemplo, por incorporação em um radiomarcador no ha- peto ou peptídeo, ou usado para detectar anticorpos especificamente reativos com hapetno ou peptídeo.

[0371] Exemplos de marcadores apropriados para uso na presenteinvenção incluem, entre outros, corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato fluoresceína, vermelho Texas, rodamina, e semelhantes), radiomarcadores (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32P), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e outras comumente usadas em um ELISA), e marcadores colorimétricos como ouro coloidal, vidro colorido ou esferas plásticas (por exemplo, poliesti- reno, polipropileno, látex, etc.).

[0372] O marcador pode ser acoplado direta ou indiretamente aocomponente desejado do ensaio de acordo com os métodos bem co-nhecidos na técnica. Preferencialmente, o marcador em uma modalidade é covalentemente ligado ao biopolímero usando um reagente isocianato para conjugação do agente ativo de acordo com a revelação. Em um aspecto da presente revelação, o reagente isocianato bi- funcional da revelação pode ser usado para conjugar um marcador a um biopolímero para formar um conjugado biopolímero marcador sem uma gente ativo ligado a este. O conjugado biopolímero marcador pode ser usado como um intermediário para a síntese de um conjugado marcado de acordo com a revelação ou pode ser usado para detectar o conjugado biopolímero. Como indicado acima, uma ampla variedade de marcadores pode ser usada como a escolha do marcador dependendo da sensibilidade requerida, facilidade de conjugação com o componente desejado do ensaio, requisitos de estabilidade, instrumentação disponível e provisões de descarte. Marcadores não radioativos são geralmente ligados por meios indiretos. Geralmente uma molécula de ligante (por exemplo, biotina) é covalentemente ligado à molécula. O ligante então se liga a outras moléculas (por exemplo, estreptavidi- na), que é inerentemente detectável ou covalentemente ligado a um sistema sinal, como uma enzima detectável, um composto fluorescente, ou um composto quimioluminescente.

[0373] Os compostos da presente revelação podem ainda ser conjugados diretamente para compostos de geração de sinal, por exemplo, por conjugação com uma enzima ou fluoróforo. As enzimas apropriadas para uso como marcadores incluem, entre outras, hidrolases, particularmente fosfatases, esterases e glicosidases, ou oxidotases, particularmente peroxidases. Compostos fluorescentes, ou seja, fluoró- foros, apropriados para uso como marcadores incluem, entre outros, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, um- belliferona, etc. Outros exemplos de fluoróforos apropriados incluem, entre outros, eosina, TRITC-amina, quinina, fluoresceína W, acridina amarela, lissamina rodamina, B sulfonila cloreto eritrosceína, rutênio (tris, bipiridinio), Texas vermelho, nicotinamida adenina dinucleotideo, flavina adenina dinucleotideo, etc. Compostos quimioluminescentes apropriados pra uso como marcadores incluem, entre outros, luciferina e 2,3-dihidroftalazinedionas, por exemplo, luminol. Para uma revisão de vários marcadores ou sistemas de produção de sinal que podem ser usados nos métodos da presente revelação, ver Patente US 4.391.904.

[0374] Meios para detectar marcadores são bem conhecidos aosespecialistas na técnica. Assim, por exemplo, onde o marcador é radi-oativo, meios para detecção incluem um contador de cintilação ou filme fotográfico, como em autorradiografia. Onde o marcador é um marcador fluorescente, este pode ser detectado excitando o fluorcro- mo com o comprimento de onda apropriado de luz e detecção da fluorescência resultante. A fluorescência pode ser detectada visualmente, pelo uso de detectores eletrônicos como dispositivos acoplados a carga (CCDs) ou fotomultiplicadores e semelhantes. De modo semelhante, marcadores enzimáticos podem ser detectados ao fornecerem os substratos apropriados para a enzima e detectando o produto de reação resultante. Marcadores colorimétricos ou quimioluminescentes podem ser detectados simplesmente ao observar cor associada com o marcador. Outros sistemas de marcação e detecção apropriados para uso nos métodos da presente revelação serão prontamente aparentes aos especialistas na técnica. Ditos moduladores e ligantes marcados podem ser usados no diagnóstico da doença ou condição de saúde.

Formulação de composições farmacêuticas

[0375] Para administrar substâncias do anticorpo da presente re- velação ao humano ou animais teste, é preferencial formular as subs-tâncias do anticorpo em uma composição compreendendo um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. A frase "farmaceuticamen- te ou farmacologicamente aceitável" se refere a entidades moleculares e composições que não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas quando administradas usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. "Carreadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer um e todos os solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos, isotôni- cos e agentes de retardadores de absorção e semelhantes.

[0376] Além disso, compostos podem formar solvatos com águaou solventes orgânicos comuns. Ditos solvatos são contemplados bem como.

[0377] O anticorpo é administrado por qualquer meio, incluindoparenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parentais incluem administração intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Além disso, o anticorpo é apropriadamente administrado por infusão em pulso, particularmente com doses de declínio do anticorpo. Preferencialmente a dosagem é administrada por injeções, mais preferencialmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração e breve ou crônica. Outros métodos de administração são contemplados, incluindo administração tópica, particularmente transdérmi- ca, transmucosa, retal ou local, por exemplo, por um cateter colocado próximo ao local desejado. Injeção, especialmente intravenosa é preferencial.

[0378] Composições farmacêuticas da presente revelação contendo uma substância do anticorpo da revelação como um ingrediente ativo podem conter carreadores ou aditivos farmaceuticamente aceitá- veis dependendo da via de administração. Exemplos de ditos carrea- dores ou aditivos incluem água, um solvente orgânico farmacêutico aceitável, solvente, colágeno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, um polímero carboxivinil, carboximetilcelulose de sódio, poliacrílico de sódio, alginato de sódio, dextrano solúvel em água, carboximetil amido de sódio, pectina, metil celulose, etil celulose, goma xantana, goma arábica, caseína, gelatina, ágar, diglicerina, glicerina, propileno glicol, polietileno glicol, Vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactose, um surfac- tente farmaceuticamente aceitável e semelhantes. Aditivos usados são escolhidos de, entre outros, os acima ou combinações das mesmas, como apropriado, dependendo da forma de dosagem da presente re-velação.

[0379] A formulação da composição farmacêutica irá variar deacordo com a via de administração selecionada (por exemplo, solução, emulsão). Uma composição apropriada compreendendo o anticorpo a ser administrado pode ser preparada em um veículo ou carreador fisio- logicamente aceitável. Para soluções ou emulsões, carreadores apro-priados incluem, por exemplo, soluções, emulsões ou suspensões aquosas ou alcoólicas/aquosas, incluindo salina e meio tamponado. Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Veículos intravenosos podem incluir vários aditivos, preservativos ou fluido, nutriente ou repositores de eletrólitos.

[0380] Uma variedade de carreadores aquosos, por exemplo, soluções de salina tamponada fosfato estéril, água bacteriostática, água, água tamponada, 0,4% salina, 0,3% glicina, e semelhantes, e podem incluir outras proteínas para estabilidade melhorada, como albumina, lipoproteína, globulina, etc., submetidos a modificações químicas leves ou semelhantes.

[0381] As formulações terapêuticas do anticorpo são preparadaspara armazenamento por mistura do anticorpo contendo o grau desejado de pureza com carreadores opcionais fisiologicamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicas aos receptores em dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto hexametônio; cloreto benzalcônio, cloreto benzetônio; fenol, álcool bu- tílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; ca- tocol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, gluta- mina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dis- sacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextri-nas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, mani- tol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou surfactantes não iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietile- no glicol (PEG).

[0382] As formulações aqui também podem conter mais de umcomposto ativo como necessário para a indicação particular a ser tra-tada, preferencialmente aquelas com atividades complementares que não prejudiquem uns aos outros. Essas moléculas estão devidamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade que se destinam.

[0383] Os ingredientes ativos podem ainda ser aprisionados em microcápsula preparadas, por exemplo, por técnica de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou mi- crocápsula de gelatina e poli-(metilmetacrilato) microcápsula, respecti-vamente, em sistemas de liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Ditas técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0384] As formulações para uso na administração in vivo devemser estéreis. Isso é facilmente realizado por filtração através de mem-branas de filtração estéreis.

[0385] Suspensões aquosas podem conter os compostos ativosem mistura com excipientes apropriados para a fabricação de suspen-sões aquosas. Ditos excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilme- tilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacante e goma acácia; agentes de dispersão ou molhantes podem ser um fosfa- tídeo de ocorrência natural, por exemplo, lecitina, ou produtos de con-densação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de eti- leno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadeca- etil-eneoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol como polioxietileno sorbitol monooleato, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e hexitol anidretos, por exemplo, polietileno sorbitano monooleato. As suspensões aquosas podem ainda conter um ou mais preservativos, por exemplo, etil, ou n-propil, p-hidroxibenzoato.

[0386] Os anticorpos da presente revelação podem ser liofilizadospara armazenamento e reconstituídos em um carreador apropriado antes do uso. Esta técnica demonstrou ser efetiva com imunoglobuli- nas convencionais. Qualquer técnica de liofilização e reconstituição pode ser empregada. Será apreciado pelos especialistas na técnica que a liofilização e reconstituição pode levar a graus variantes de perda de atividade do anticorpo e que níveis de uso podem ter que ser ajustados para compensar.

[0387] Pós e grânulos dispersíveis apropriados para a preparaçãode uma suspensão aquosa pela adição de água fornecem o composto ativo na mistura com um agente de dispersão ou molhante, agente de suspensão e um ou mais preservativos. Agentes dispersantes ou mo- lhantes apropriados ou agentes de suspensão são exemplificados pelos já mencionados acima.

[0388] A concentração do anticorpo nestas formulações pode variar amplamente, por exemplo, de menos do que cerca de 0,5%, geral-mente em ou pelo menos cerca de 1% tanto quanto 15 ou 20% em peso e será selecionada principalmente baseado em volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo de administração particular selecionado. Assim, uma composição farmacêutica típica para injeção parenteral poderia ser preparada até conter 1 mL de água tamponada estéril, e 50 mg de anticorpo. Uma composição típica para infusão in-travenosa poderia ser preparada até conter 250 mL de solução Ringer estéril, e 150 mg de anticorpo. Métodos atuais para preparar composi-ções administradas por via parenteral serão conhecidos ou aparentes aos especialistas na técnica e são descritos em mais detalhes em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publis-hing Company, Easton, Pa. (1980). Uma dosagem efetiva do anticorpo está dentro da faixa de 0,01 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administração.

[0389] As composições farmacêuticas podem estar na forma deuma solução aquosa injetável estéril, suspensão oleaginosa, disper- sões ou pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando aqueles agentes dispersantes ou molhantes apropriados e agentes de suspensão que foram mencio-nados acima. A preparação injetável estéril pode também ser uma so-lução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), misturas apropriadas dos mesmos, óleos vegetais, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleos fixos estéreis são con-vencionalmente empregados como um meio solvente ou de suspensão. Para esta finalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos graxos como o ácido oleico encontram uso na preparação de injetáveis.

[0390] Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida de modo que permita fácila seringabilidade. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento, como lecitina, pela manutenção da granulometria necessária em caso de dispersões e pelo uso de surfactantes. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser assegurada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida pelo uso nas composições de agentes de retar- damento de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e ge-latina.

[0391] Composições úteis para administração podem ser formuladas com melhoradores de absorção para aumentar suas eficácias. Ditos melhoradores incluem, por exemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, glicolato, aprotinina, bacitracina, SDS, caprato e semelhantes. Ver, por exemplo, Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285 (1996)) e Oliyai e Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544 (1993)).

[0392] Composição contemplada com anticorpos para uso parainibir atividade alvo, incluindo ligação do alvo ao seu receptor cognato ou ligante, sinalização mediada por alvo, e semelhantes. Em particular, as composições apresentam propriedades inibitórias em concentrações que são substancialmente livres de efeitos colaterais, e são, portanto, úteis para protocolos de tratamento estendidos. Por exemplo, coadministração de uma composição anticorpo com outro agente mais tóxico, citotóxica pode atingir inibição benéfica da condição ou distúrbio sendo tratado, enquanto efetivamente reduzindo os efeitos colaterais tóxicos no paciente.

[0393] Além disso, as propriedades de hidrofilicidade e hidrofobici-dade das composições contempladas para uso na presente revelação são bem equilibradas, assim, aumentando suas utilidades para usos in vitro e especialmente in vivo, enquanto outras composições desprovidas de dito equilíbrio são de utilidade substancialmente menor. Especi-ficamente, as composições contempladas para uso na revelação têm um grau apropriado de solubilidade em meio aquoso que permite a absorção e biodisponibilidade no corpo, enquanto ainda contendo um grau de solubilidade em lipídeos que permite que os compostos atravessem a membrana celular em um sítio putativo de ação. Assim, composição anticorpos contemplados são maximamente efetivos quando são liberados ao sítio de atividade do antígeno alvo.

Administração e Dosagem

[0394] Em um aspecto, métodos da presente revelação incluemuma etapa para administrar uma composição farmacêutica. Em deter-minadas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição estéril.

[0395] Métodos da presente revelação são realizados usandoqualquer meio clinicamente aceitável para introduzir um fármaco direta ou indiretamente em um sujeito mamífero, incluindo, entre outros, inje-ções, ingestão oral, administração intranasal, tópica, transdérmica, pa-renteral, spray por inalação, vaginal, ou retal. O termo parenteral como usado aqui inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, e intracisternais, bem como técnicas de cateter ou infusão. Administração por injeção intradérmica, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implante cirúrgico em um sítio particular é contemplada.

[0396] Em uma modalidade, administração é realizada no sítio deum câncer, fibrose ou tecido afetado necessitando tratamento por injeção direta no sítio ou via uma liberação sustentada ou mecanismo de liberação sustentada, que pode liberar a formulação internamente. Por exemplo, microesferas biodegradáveis ou cápsulas ou outro polímero biodegradável de configurações capazes de liberação sustentada de uma composição (por exemplo, um polipeptídeo solúvel, anticorpo, ou molécula pequena) podem ser incluídas nas formulações da revelação implantadas próximas ou no sítio do câncer, fibrose ou tecido ou órgão afetado.

[0397] Composições terapêuticas podem ainda ser liberadas aopaciente em vários sítios. As múltiplas administrações podem ser ge-radas simultaneamente ou podem ser administradas por um período de tempo. Em determinados casos, é benéfico fornecer um fluxo contínuo da composição terapêutica. Terapia adicional pode ser adminis- trada um período base, por exemplo, por hora, por dia, por semana, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, por mês, ou em um intervalo maior.

[0398] Ainda é contemplada na presente revelação a administração de vários agentes, como uma composição anticorpo em conjunto com um segundo agente como descrito aqui, incluindo, entre outros, um agente quimioterápico ou um agente útil para tratar fibrose.

[0399] As quantidades da composição do anticorpo em uma dosagem determinada podem variar de acordo com o tamanho do indivíduo ao qual a terapia está sendo administrada bem como as características do distúrbio sendo tratado. Em tratamentos exemplares, pode ser necessário administrar cerca de 1 mg/dia, 5 mg/dia, 10 mg/dia, 20 mg/dia, 50 mg/dia, 75 mg/dia, 100 mg/dia, 150 mg/dia, 200 mg/dia, 250 mg/dia, 500 mg/dia ou 1000 mg/dia. Estas concentrações podem ser administradas como uma forma de dosagem única ou doses múltiplas. Estudos de dose-resposta padrões, primeiro em modelos animais e então em teste clínico, revelam dosagens ideais para estados de doença particulares e populações de paciente.

[0400] Será ainda aparente que a dosagem pode ser modificadase fármacos tradicionais são administrados em combinação com fár- macos da revelação.

Kits

[0401] Como um aspecto adicional, a revelação inclui kits quecompreendem um ou mais compostos ou composições empacotadas de um modo que facilita seus usos para praticar métodos da revelação. Em uma modalidade, dito um kit inclui um composto ou composição descrito aqui (por exemplo, uma composição compreendendo um anticorpo específico para alvo isolado ou em combinação com um segundo agente), empacotado em um recipiente como uma garrafa vedada ou vaso, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluído no pa- cote que descreve o uso do composto ou composição na prática do método. Preferencialmente, o composto ou composição é empacotado em uma forma de dosagem unitária. O kit pode ainda incluir um dispo-sitivo apropriado para administrar a composição de acordo com uma via específica de administração ou para a prática de um ensaio de triagem. Preferencialmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso da composição anticorpo.

[0402] Aspectos e detalhes adicionais da revelação serão aparentes a partir dos exemplos a seguir, que são pretendidos para serem ilustrativos ao invés de limitantes.

EXEMPLOSExemplo 1. Isolamento de anticorpos anti-TGFβ de bibliotecas de exibição de fago de anticorpo

[0403] Para isolar um painel de anticorpos capazes de neutralizara atividade de TGFβ humano, três isoformas da proteína TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 foram usadas para panning de bibliotecas de exibição de fago de anticorpos humanos como descrito abaixo.

Panning:

[0404] Os antígenos TGFβ (PeproTech, Rocky Hill, NJ #100-21,100-35B, 100-36E) foram primeiro preparados por biotinilação comNHS-PEG4-Biotin (Pierce, Rockford, ILA) usando o protocolo do fabri-cante. Resumidamente, os antígenos TGFβ, que foram armazenados em tampão de baixo pH, foram neutralizados por adição de 20X PBS para trazer o pH a quase 6,0. Um excesso molar de 30 vezes da biotina pré-ativada acima foi adicionado e misturado, então mantido em temperatura ambiente por 20 minutos. Então volume igual de 10 mM Glicina pH 3,0 foi adicionado e as amostras foram colocadas imediatamente em diálise usando um cutoff de 6-8 kDa de unidade de diálise contra um tampão citrato 10mM, pH 3,5. Uma biblioteca de exibição de fago Fab (XOMA, Berkeley, CA) foi panned com o TGFβ biotinilado usando um método de panning solúvel. Cada isoforma TGFβ foi panned separadamente em três rodadas de seleção. Sub-bibliotecas capa e lambda foram panned separadamente.

[0405] Para a primeira rodada de phage panning, 50X equivalentes da biblioteca (~2x1012 cfu) da biblioteca foi bloqueada em gelo por 1 hr em 1 mL de 5% leite/PBS. Ligantes para estreptavidina foram de- selecionados dos fagos bloqueados por adição de fago bloqueado para magnético revestido por estreptavidina DYNABEADS® M-280 e in-cubando com rotação por 30 minutos. A etapa de desseleção foi repetida uma vez mais. Um magneto foi usado para separar as esferas do fago. Concomitante às etapas de desseleção, 200 pmoles de TGFβ foi deixado ligar a DYNABEADS® M-280 magnéticos revestidos por es- treptavidina incubando em temperatura ambiente com rotação por 30 minutos. Após ligação, as esferas de TGFβQ biotiniladas foram lavadas duas vezes com 5% Leite-PBS. A seleção foi realizada adicionando fago desselecionado ao TGFβ biotinilado ligado às esferas de es- treptavidina magnéticas e incubando com rotação por 1,5 a 2 horas. Após a seleção, fago não ligado foi lavado de esferas usando um processador de partículas magnéticas Kingfisher (Thermo Scientific) que foi programado para lavar esferas rapidamente 3 vezes com PBS- 0,1% TWEEN seguido por mais 3 lavagens rápidas com PBS. O fago ligado foi eluído de esferas após a etapa de lavagem pela adição de 100 mM trietilamina e incubando com rotação em temperatura ambiente por 30 minutos. O fago eluído foi neutralizado com a adição de volume igual 1M Tris-HCl, pH 7.4. Fago neutralizado eluído foi então coletado em um tubo 50 mL Falcon (Falcon No 352070) e usado para infectar log crescente de células bacterianas TG1 (OD600 ~0,5). A infecção foi a 37°C por 30 min sem agitação, seguido por 30 min adicionais de incubação a 37°C agitação a 90 rpm. As células foram plaque- adas em meio de 2YT suplementado com 100 ug/mL carbenicilina e 2% Glicose (2YTCG) em placas ágar de bioensaio e incubadas durante a noite a 30°C para permitir crescimento em relva durante a noite.

[0406] Na preparação para uso como entrada para a rodada seguinte, 100X da saída da rodada anterior foi resgatada por super infecção usando fago MK07 helper. Isto foi realizado inoculando meio 2YTCG com células raspadas de saída de rodada panning anterior. OD600nm foi medido para cultura inicial e ajustado para refletir um OD600nm inicial de ~0,05. As células foram crescidas a 37oC com agitação em células atingiram fase de crescimento em log de OD600nm ~0,5. As células foram infectadas com MK07 (New England Biolabs, MA) em uma multiplicidade de infecção (MOI) = ~20, a 37°C por 30 min sem agitação, seguido por 30 min adicionais de incubação a 37°C com agitação a 150 rpm. Após infecção a 37°C, as células foram peletizadas e transferidas a novo meio 2YT suplementado com 50 ug/mL Canamici- na e 100 ug/mL Carbenicilina (2YTCK). As culturas foram cultivadas durante a noite a 25°C. O fago foi separado de células e debris por centrifugação e sobrenadante resultante foi recuperado e usado como entrada para a rodada de panning seguinte. O enriquecimento de seleção foi monitorado pela quantidade de entrada usada para cada rodada de panning e o título de saída de fago resultante.

[0407] Para a segunda e terceira rodadas de panning, os mesmosprotocolos de fase de solução seguidos na rodada um foram usados com as seguintes exceções. Quantidade de entrada de fago usada em rodadas de panning dois e três foi ~1,0 x 1011 cfu. Para a rodada dois, 100 pmoles de antígeno biotinilado foi usado na seleção e para a rodada três, 50 pmoles de antígeno biotinilado foi usado. O Kingfisher foi usado para lavar fago não ligado de esferas após as seleções. Na rodada dois, o Kingfisher foi programado para lavar as esferas 3 vezes com PBS-0.1% TWEEN por 2 minutos seguido por 1 mL PBS lavagem por 2 minutos repetido 3 vezes. Na rodada de panning três, as esferas foram lavadas 3 vezes com PBS-0.1% TWEEN por 6 minutos, seguido por duas lavagens e quatro minutos e uma lavagem de seis minutos com PBS.

[0408] Extratos periplasmáticos bacterianos contendo fragmentosde anticorpo secretado para uso na triagem para ligantes TGFβ foram preparados por métodos padrões. Colônias individuais foram coletadas em placas de 96 poços enchidas com 2YTC suplementado com 100 ug/mL Carbenicilina e 0,1% glicose no meio. As culturas foram deixadas crescer a 37°C com agitação até fase de crescimento log ser atingida (OD600nm = 0,5). As colônias foram então induzidas para produzir anticorpos em fragmentos solúveis adicionando 1mM IPTG final e in-cubado durante a noite a 25°C com agitação. Extratos periplasmáticos (PPE) contendo anticorpos fragmentos solúveis foram preparados a partir das células induzidas usando o método padrão de adição de 1:3 volume em proporção de solução de PPB gelada (Teknova, Hollister, CA) e água dupla destilada (ddH2O) com comprimidos de coquetel inibidor de protease sem EDTA. PPE foram então usados para trair para ligantes TGF-β.

Triagem:

[0409] Dois formatos de ensaios de triagem alternativa foram usados para identificar clones que ligaram a TGFβ, incluindo clones que ligados às três isoformas TGFβ e foram únicos nas suas sequências. O primeiro ensaio de triagem usou um imuno ensaio baseado em placa e o outro ensaio de triagem foi realizado usando um método de triagem SPR. O ensaio baseado em placa envolveu revestimento de placas EIA brancas de 384 poços opaca com 1 ug/mL anticorpo Anti- His clone AD.1.10 (R&D Systems, Minneapolis, MN) em 1 ug/mL em tampão PBS por quatro horas em temperatura ambiente. Então a placa foi lavada 3X em PBS-TWEEN e então bloqueada com 0,5% BSA em PBS-TWEEN por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida 30 uL/polo de TGFβ biotinilado foi adicionado em entre 0,1 ug/mL para TGFβ1 e TGFβ2, e 0,2 ug/mL para TGFβ3, diluído em tampão de blo-queio. Então 30 uL de extrato periplasmático foi adicionado e incubado a 4°C durante a noite em agitador de placa suave. As placas foram lavadas 3X em PBS-TWEEN então adicionadas 50 uL/poço de 2,5 ug/mL estreptavidina-Európio (SA-Eu, PerkinElmer) diluídas em tampão de diluição de ensaio DELFIA (PerkinElmer) a cada poço e incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos em um agitador. As placas foram lavadas 7 vezes com PBS-TWEEN e adicionadas 50uL/poço do reagente melhorado DELFIA (PerkinElmer) e colocadas em agitador por 8 minutos em temperatura ambiente então lidos em leitor de placa Molecular Devices FlexStation 3 em modo TRF com 200-1200μs tempo de coleta e Exc.=345nm, Emm.=618nm, e cu-toff=590nm, High PMT setting, 20 leituras/poço. As amostras com sinal de mais do que 2,1 vezes maior do que o sinal do que o controle PPE foram consideradas positivas.

[0410] O ensaio SPR foi realizado por um ensaio de ligação diretaem BIACORE A100. Neste ensaio, um chip CM5 BIACORE foi preparado via química de acoplamento padrão usando o kit BIACORE de acoplamento de Amina (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Os antíge- nos TGFβ foram diluídos a 6 ug/mL em acetato pH 4,0 e injetados por 7 minutos (mancha 1, que é TGFβ1) e 10 minutos (manchas 2 e 4, que são TGFβ2, e TGFβ3). Isto imobiliza entre 3400 e 4800 RU de cada antígeno TGFβ. As amostras foram desativadas com 1M etanolamina. Extratos periplasmáticos foram diluídos 1:1 com HBS-EP+ (Teknova) com 2 mg/mL BSA e filtrados por uma placa de filtro 0,2 uM Millex GV (Millipore) e então injetados a 30 uL/minuto por 240 segundos com uma dissociação de 30 segundos. A regeneração após cada injeção PPE foi de 10 segundos de 100 mM HCl. O ponto de relato precoce de estabilidade no software BIACORE A100 foi usado para avaliar níveis de ligação PPE. Níveis de cutoff foram determinados para cada iso-formas TGFβ independentemente como sendo visualmente acima dos níveis de fundo. Cutoffs RU foram 245, 175, e 125 para TGFβ1,TGFβ2 e TGFβ3, respectivamente.

Maturação de afinidade

[0411] Um anticorpo, XPA.42,068, que teve ligação significativamente maior e atividade neutralizante para TGFβ 1 e TGFβ 2 em relação a TGFβ3, foi submetido a maturação de afinidade para aumentar sua afinidade e potência contra TGFβ3. Uma biblioteca de sequência de variantes gerada da maturação de afinidade foi panned usando TGFβ2 e TGFβ3, com clones de saída triados principalmente para ligação TGFβ3 melhorada.

[0412] Para triagem, o ensaio SPR foi realizado por um ensaio deligação direta em BIACORE A100. Neste ensaio, um chip CM5 BIA- CORE foi preparado via química de acoplamento padrão usando o kit BIACORE de acoplamento de Amina. Os antígenos TGFβ foram diluídos a 1 ug/mL em acetato pH4,0 e injetados por 5 minutos (manchas 1 e 5, que são TGFβ3 e TGFβ1 respectivamente) e 8 minutos (mancha 2, que é TGFβ2). Isto imobiliza entre 200 e 450 RU de cada TGFβ. As amostras foram desativadas com 1M etanolamina. Extratos periplas- máticos foram diluídos 1:1 com HBS-EP+ com 2 mg/mL BSA e filtrados por uma placa de filtro 0,2 μM Millex GV (Millipore) e então injetados a 30 uL/minuto por 240 segundos com uma dissociação de 600 segundos. A regeneração após cada injeção PPE foi de 10 segundos de 100 mM HCl. Dados subtraídos de referência foram plotados e avaliados visualmente para clones que pareceram ter maior estabilidade ou maiores níveis de ligação. Um clone derivado, designado XPA.42.681, que demonstrou ligação melhorada para TGFβ3, foi incluindo em outros estudos de caracterização.

[0413] Clones selecionados foram reformatados como anticorpos IgG2. As cadeias variáveis pesada (VH) e leve (VL) dos fragmentos Fab selecionados foram amplificados em PCR, clonados em vetores de plasmídeo contendo sequências de região constante de anticorpo, e transitoriamente transfectadas em células 293E usando métodos padrões para outra caracterização, incluindo os estudos descritos abaixo.Exemplo 2. Medição de afinidades de ligação de anticorpos TGFβ

[0414] Os anticorpos foram caracterizados contra TGFβ isoformasTGFβ1, TGFβ2, e TGFβ3 para suas afinidades de ligação (KD), taxa de desassociação (kd) e taxa de associação (ka) usando tecnologia de ressonância de plásmon de superfície (SPR). A análise foi realizada usando dois métodos. Um método foi um método de imobilização direta de antígeno em que as proteínas TGFβ foram imobilizadas em uma superfície em baixa densidade com os anticorpos injetados em várias concentrações para análise cinética. O outro método foi um anticorpo imobilizado usando injeções de várias concentrações de proteínas TGFβ injetadas.Método cinético de anticorpo imobilizado:

[0415] Um chip sensor CM4 (GE Healthcare) foi usado em um sistema BIACORE 2000 (GE Healthcare). O chip foi pré-condicionado com duas injeções de 30 segundos cada em 50 μL/minuto de taxa de fluxo de 100 mM HCl, Glicina pH 2,0, 50 mM NaOH, e tampão de corrida antes da imobilização. O tampão de corrida para imobilização foi HEPES salina tamponado (HBS-EP+) com 10 mM Hepes, 150 mM Cloreto de sódio, 3 mM EDTA, e 0,05% Polissorbato 20 (Teknova). A superfície do chip foi ativada com uma injeção de sete minutos a 10 μL/minuto de uma solução recém-preparada 1:1 de 0,1 M N- Hidroxisuccinimida (NHS) e 0,4 M 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropila) car- bodiimida cloridrato (EDC). Após a injeção de ativação, 1 ug/mL de anticorpo anti-TGFβ em acetato pH 4,5 foi injetada a 10 μL/minuto por um minuto, com injeções objetivando 120 RU. 8 minutos de 1M Etano- lamina cloridrato-NaOH pH 8,5 foi injetado para bloquear a superfície. NHS, EDC, e Etanolamina usados foram do kit BIACORE de acoplamento de amina.

[0416] Análise cinética foi realizada usando um tampão de corridada forma vigorosamente desgaseificada do HBS-EP+ tampão acima suplementado com 1 mg/mL BSA (Sigma Aldrich, St. Louis MO). Injeções de amostra de TGFβ foram realizadas a 50 μL/minuto por quatro minutos com um tempo de dissociação de 900 segundos. Cada proteína TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) foi injetada a 10 nM, 2 nM, 0.4 nM, 0,08 nM (350 ng/mL com 5 vezes de diluição serial) com brancos agrupando cada série de concentração e injeções em quadruplicata. A regeneração foi então realizada com três injeções de 30 segundos cada de 100 mM HCl em 3 M MgCl2 seguido por uma injeção de tampão em branco final de 30 segundos.

[0417] Os dados foram analisados usando Scrubber2 (BioLogicSoftware, Campbell Australia) e foi duplamente referenciado subtraindo os dados da célula de fluxo em branco e as injeções de branco agrupadas ponderadas. Os dados foram ajustados por ajuste simul-taneamente do (KD) taxa de desassociação (kd) e taxa de associação (ka), e são mostrados na Tabela 2 abaixo. Os dados para um anticorpo comparador medido anteriormente, designado BM-1 (1D11, R&D Systems MAB1835) ainda são incluídos na Tabela 2. Dados de BM-1 foram gerados em BIACORE A100. Resumidamente o anticorpo BM-1 foi capturado em aproximadamente 100 RU densidade em uma superfície de chip CM5 anti-Fc de camundongo de coelho (GE Healthcare). Proteínas TGFβ foram injetadas nas mesmas concentrações como descrito acima a 30 μL/minuto. Estes dados foram referenciados duas vezes e analisados em Software BIA- CORE A100. Tabela 2. Dados de afinidade do ensaio utilizando anticorpo imobili-zado e injetado com TGFβ

[0418] Os dados de afinidade como medidos neste ensaio usandoanticorpos imobilizados mostraram que XPA.42.681 tiveram ligação mais forte (mais justa) de qualquer um dos anticorpos para cada uma das três isoformas de TGFβ, e ainda ligaram a cada TGFβ isoforma com afinidades semelhantes. Além disso, os anticorpos XPA.42,068 e XPA.42,089 tiveram ligação semelhante ou mais forte para isoformas TGFβ1 e TGFβ2 em comparação com o anticorpo BM-1, mas mostraram ligação significativamente menor para a isoforma TGFβ3, em comparação ao anticorpo BM-1 ou em relação à ligação para TGFβ1 e TGFβ2.Método de afinidade de TGFβ imobilizado:

[0419] Um sensor chip CM1 (GE Healthcare) que tem uma superfície planar -COOH foi usada em um sistema BIACORE 2000. O chip foi pré-condicionado com duas injeções de 30 segundos cada em 50 μL/minuto de taxa de fluxo de 100 mM HCl, Glicina pH 2,0, 50 mM NaOH, 1% SDS e tampão de corrida antes da imobilização. Tampão de corrida para imobilização foi um HEPES salina tamponado (HBS- EP+) com 10 mM Hepes, 150 mM Cloreto de sódio, 3 mM EDTA, e 0,05% Polissorbato 20. A superfície do chip foi ativada com injeções de quatro minutos a 20μL/minuto em uma solução recém-preparada 1:1 de 0,1M N-Hidroxisuccinimida (NHS) e 0,4M 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropila) carbodiimida cloridrato (EDC). Após a injeção de ativação uma solução 0,1 ug/mL de TGFβ em acetato pH 4,0 foi injetada a 20 μL/minuto por vários minutos. Cada TGFβ utilizou uma etapa de ativação separada em seu próprio fluxo celular de modo que TGFβ1 foi imobilizado em Fc2, TGFβ2 em Fc3, e TGFβ3 em Fc4 com Fc1 como um branco ativado e inativado. As injeções de TGFβ foram realizadas como uma série de injeções de 1 a 2 minutos olhando em nível imobilizado entre cada injeção. A densidade imobilizada alvo de cada ligante TGFβ foi 30 RU. Após as injeções de imobilização de TGFβ, 4 minutos de 1 M Etanolamina cloridrato-NaOH pH 8,5 foi injetado para bloquear a superfície. NHS, EDC, e Etanolamina usados foram do kit BIACORE de acoplamento de amina e TGFβ1, TGFβ2, e TGFβ3 foram de R&D Systems.

[0420] Para análise de afinidade o tampão de corrida foi trocadopara uma forma vigorosamente desgaseificada do HBS-EP+ tampão acima suplementado com 1 mg/mL BSA (Sigma Aldrich, St. Louis MO). Cada um dos anticorpos foi diluído em tampão de corrida para 5 μg/mL (33,3 nM) e 4 subsequentes diluições de cinco vezes foram preparadas ajustando as concentrações de 33,33 nM, 6,67 nM, 1,33 nM, 267 pM, e 53 pM para cada. Estes foram então injetados usando o ajuste Kinject por quatro minutos a 50 μL/minuto, com um tempo de dissociação de 900 segundos. A regeneração foi então realizada com uma injeção de 12 μL (14,4 segundos) de 100 mM HCl a 50 μL/minuto seguido por uma segunda injeção de tampão de 18 segundos. As injeções foram através de todos os fluxos celulares simultaneamente e as amostras foram corridas injetadas em quadruplicatas com injeções embranco agrupando cada conjunto de grupos de injeção de concentração descendente para cada anticorpo. Isto significa que antes da mesma amostra ser injetada uma segunda vez todas as concentrações de todos os anticorpos foram injetadas de uma vez.

[0421] Os dados foram analisados usando Scrubber2 (BioLogicSoftware, Campbell Australia) e foram duplamente referenciados sub-traindo os dados de fluxo celular em branco e as injeções de branco agrupadas ponderadas. Os dados foram ajustados por ajuste simulta- neamente do (KD) taxa de desassociação (kd) e taxa de associação (ka), e são mostrados na Tabela 3 abaixo.Tabela 3. Dados de afinidade do ensaio utilizando TGFβ imobilizado e anticorpos injetados

[0422] Consistente com o anticorpo imobilizado os resultados daTabela 2, os dados de afinidade medidos em ensaios usando antígeno imobilizado (Tabela 3) ainda mostraram que XPA,42.681 teve ligação mais forte (mais justa) de qualquer um dos anticorpos para cada uma das três isoformas de TGFβ, com afinidade semelhante para cada uma das isoformas TGFβ. Além disso, XPA.42,068 e XPA.42,089 tiveram ligação semelhante ou mais forte para isoformas TGFβ1 e TGFβ2 em comparação com BM-1, mas menos ligação significativamente para a isoforma TGFβ3, em comparação ao anticorpo BM-1 ou em relação à ligação para TGFβ1. A diferença nas constantes de velocidade medidas usando o anticorpo imobilizado versus ensaios de antígeno imobilizados resulta de complexidades inerentes do sistema, mas não obstante cada um fornece dados cinéticos de qualidade relativamente alta e consistência em propriedades de ligação através de isoformas TGFβ e entre os anticorpos em relação a cada outro.Exemplo 3. Medida de competição receptora por anticorpos TGFβ

[0423] Anticorpos foram caracterizados por suas capacidades eminibir ou bloquear a ligação de cada um dos três ligantes TGFβ aos receptores TGFβ por ensaios de competição SPR. Sinais TGFβ através de receptor TGFβ tipo II (TGFβ-RII) que é uma proteína trans- membrana serina treonina e requer que a associação citoplasmática da proteína receptor TGFβ tipo 1 (TGFβ-R1) para ativação. O papel de ligação ao ligante de TGFβ-RI não é claro e uma forma recombinante de TGFβ-RI não demonstrou qualquer ligação em concentrações testadas em qualquer um dos ligantes TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3, ou as formas ligadas TGFβ-RII destes ligantes, e portanto, não poderia ser avaliadas em experimentos de competição de receptor. O receptor TGFβ tipo III (TGFβ-RIII) tem membrana ligada e formas solúveis e não parece estar envolvido na sinalização TGFβ. O TGFβ-RIIb é uma variante unida que contém uma inserção de 26 aminoácidos em N- terminal e tem a propriedade única de ligação a todas as três isoformas TGFβ com boa afinidade. TGFβ-RII se liga de modo justo somente aos ligantes TGFβ1 e TGFβ3, enquanto TGFβ-RIII se liga melhor ao ligante TGFβ2.

[0424] Um chip sensor CM5 (GE Healthcare) foi usado em umsistema BIACORE 2000. O chip foi pré-condicionado com várias injeções de 30 segundos cada em 50 μL/minuto de taxa de fluxo de 100 mM HCl, e 50 mM NaOH antes da imobilização. Tampão de corrida para imobilização foi um HEPES salina tamponado (HBS-EP+) com 10 mM Hepes, 150 mM Cloreto de sódio, 3 mM EDTA, e 0,05% Polissorbato 20. A superfície do chip foi ativada com injeções de quatro minutos a 10μL/minuto em uma solução recém-preparada 1:1 de 0,1M N-Hidroxisuccinimida (NHS) e 0,4M 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropila) carbodiimida cloridrato (EDC). Após a injeção de ativação, 5 ug/mL TGFβ-RII, TGFβ-RIIb, ou TGFβ-RIII (R&D Systems) em acetato pH 4,5 foi injetada em 20 μL/minuto por quatro minutos e resultou em 1000-4000 RU imobilizada para cada um dos receptores TGFβ. Então, 8 minutos de 1 M Etanolamina cloridrato- NaOH pH 8,5 foi injetado para bloquear a superfície. NHS, EDC, e Etanolamina usados foram do kit BIACORE de acomplamento de amina. Fc1 foi o controle ativado e desativado.

[0425] Ensaios de competição foram realizados usando um tam- pão de corrida de forma vigorosamente desgaseificada de tampão HBS-EP+ acima suplementado com 1 mg/mL BSA. Ligantes TGFβ foram usados em todas as injeções exceto controles brancos a 100 ng/mL (10 nM) para 40 ng/mL (4 nM) e foram preparados com 10 ug/mL (66,6 nM) de anticorpos controle competidores. As amostras foram deixadas entrar em equilíbrio por 40 minutos em temperatura ambiente antes de iniciar a corrida BIACORE. As amostras equilibradas foram então injetadas a 10 uL/minuto por dois minutos. A regeneração foi realizada a cada ciclo com uma injeção de pH 2,5 gli- cina a 50 uL/minuto por 9,6 segundos (8 μLs). As amostras foram corridas em pelo menos duplicatas e analisadas para o nível de TGFβ ligado.

[0426] Como mostrado na Tabela 4 abaixo, os resultados dos anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089, XPA.42.681 e o comparador BM-1 sugere que cada um destes anticorpos bloqueiam a associação de todos os três ligantes TGFβ para os receptores TFGβ-RII e TGFβ-RIII, e que nenhuma distinção clara foi feita. Este padrão de competição receptor não foi universal entre todos os outros anticorpos testados, mas para os quais os dados não são mostrados na presente revelaçãoTabela 4. Ensaio de competição de receptor EC50 (nM de anticorpo)

[0427] A potência de anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089,XPA.42.681 e BM-1 na competição ao receptor geralmente se correla-cionou com suas afinidades às várias isoformas de TGFβ.Exemplo 4. Medição de competição do epítopo entre anticorpos TGFβ

[0428] A capacidade de anticorpos XPA.42.068 e XPA.42.089 em se ligar aos epítopos independentes ou de sobreposição nas proteínas TGFβ foi avaliada. Enquanto esta análise de pair-wise não foi direta devido às afinidades variantes dos anticorpos entre as diferentes iso-formas de TGFβ, e a homodimerização covalente de ligantes TGFβ, que resultou em ligação em uma relação de duas IgG por homodímero (por exemplo, auto-pareamento), um ensaio baseado em competição solúvel foi desenvolvido.

[0429] Um chip sensor CM5 (GE Healthcare) foi usado em um sistema BIACORE 2000. O chip foi pré-condicionado com quatro injeções de 30 segundos a 50 uL/minuto taxa de fluxo de 100 mM HCl antes da imobilização. Tampão de corrida para imobilização foi um HEPES salina tamponado (HBS-EP+) com 10 mM Hepes, 150 mM Cloreto de sódio, 3 mM EDTA, e 0,05% Polissorbato 20. A superfície do chip foi ativada com injeções de sete minutos a 10uL/minuto em uma solução recém-preparada 1:1 de 0,1M N-Hidroxisuccinimida (NHS) e 0,4M clo- ridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Após a injeção de ativação, um anticorpo 1 ug/mL XPA.42.089 em acetato pH 4,5 e foi injetado a 10 μL/minuto para injeções de vários minutos. As injeções foram monitoras e realizadas sequencialmente para estabelecer níveis de imobilização muito próximos a 300 RU. Oito minutos de 1 M Etanolamina cloridrato-NaOH pH 8,5 foi injetado para bloquear a superfície. NHS, EDC, e Etanolamina usados foram do kit BIACORE de acomplamento de amina. Fc1 foi o controle ativado e desativado.

[0430] Ensaios de competição foram realizados usando um tampãode corrida de forma vigorosamente desgaseificada de tampão HBS- EP+ acima suplementado com 1 mg/mL BSA. TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 foram usados em todas as injeções a 0,1 ug/mL (4 nM), exceto controles brancos, e foram preparadas com 20 ug/mL (133 nM) de anticorpos competidores. O receptor TGFβ-RIIb-Fc recombinante (R&D Systems) foi ainda incluído como um competidor. As amostras foram deixadas entrar em equilíbrio por 40 minutos em temperatura ambiente antes de iniciar a corrida BIACORE. As amostras equilibradas foram então injetadas a 30 uL/minuto por três minutos em todos os fluxos celulares. A regeneração foi realizada em cada ciclo com uma injeção de 50 mM NaOH a 50 uL/minuto por 6 segundos (5 μLs) e seguido por uma segunda injeção de tampão de trinta segundos. As amostras foram corridas em duplicatas e analisadas para níveis de TGFβ ligados ao fim de três minutos.Tabela 5. Competição de ligação (XPA.42.089 imobilizado)

[0431] Como mostrado na Tabela 5 acima, os dados indicam queXPA.42.068 e XPA.42.089 apresentaram competição forte com cada outro para ligar cada uma das isoformas TGFβ. Os valores representam o RU médio ou intensidade de sinal de ligação de TGFβ que foi medida durante as injeções do complexo. Isto mostra que o sinal é muito reduzido quando o anticorpo complexado está presente. Qualquer dissociação do complexo durante a injeção poderia permitir TGFβ livre ou monovalentemente ligado para ser ligado pelo anticorpo de captura XPA.42.089. Foi demonstrado que a interação TGFβ-RIIb com TGFβ2 é muito mais fraca do que as proteínas TGFβ1 e TGFβ3 e o offrate rápido permite competição relativamente fraca para TGFβ2 contra a alta afinidade de XPA.42.089. O anticorpo XPA.42.681, que foi derivado de XPA.42.068, não foi testado nos ensaios de competição.Exemplo 5. Medição de competição rhLAP por anticorpos TGFβ

[0432] Ensaios de competição adicionais foram submetidos para determinar se os anticorpos ainda interagem com a forma latente de TGFβ. A pró-proteína TGFβ é clivada dentro do golgi por uma conver- tase tipo furina em um peptídeo associado à latência em N-terminal de 249 aminoácidos e um TGFβ1maduro de 112 aminoácidos C-terminal.

[0433] Um chip sensor CM5 (GE Healthcare) foi usado em um sistema BIACORE 2000. O chip foi pré-condicionado com várias injeções de 30 segundos cada em 50 μL/minuto de taxa de fluxo de 100 mM HCl, e 50 mM NaOH antes da imobilização. Tampão de corrida para imobilização foi um HEPES salina tamponado (HBS-EP+) com 10 mM Hepes, 150 mM Cloreto de sódio, 3 mM EDTA, e 0,05% Polissorbato 20. A superfície do chip foi ativada com injeções de quatro minutos a 10μL/minuto em uma solução recém-preparada 1:1 de 0,1M N- Hidroxisuccinimida (NHS) e 0,4M 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropila) car- bodiimida cloridrato (EDC). Após a injeção de ativação 2 ug/mL TGFβ1 peptídeo associado a latência humano recombinante (rhLAP) (R&D Systems) em acetato pH 4,5 foi injetado a 10 μL/minuto por quatro mi-nutos e resultou em 400 RU de rhLAP imobilizado. 8 minutos de 1M Etanolamina cloridrato-NaOH pH 8,5 foi injetado para bloquear a su-perfície. Fc1 foi o controle ativado e desativado.

[0434] Ensaios de competição rhLAP foram realizados usando umtampão de corrida de um tampão HBS-EP+ vigorosamente desgaseifi- cada como acima suplementado com 1 mg/mL BSA. TGFβ1 foi usado em todas as injeções exceto controles brancos a 0,25 ug/mL (10 nM) e foi preparado com 10 ng/mL (66,6 nM) de anticorpos controle e com-petidores. As amostras foram deixadas entrar em equilíbrio por 40 mi-nutos em temperatura ambiente antes de iniciar a corrida BIACORE. As amostras equilibradas foram então injetadas a 40 uL/minuto por dois minutos sobre o controle e a superfície rhLAP. A regeneração foi realizada a cada ciclo com uma injeção de 100 mM HCl a 100 uL/minuto por 9,6 segundos (16 μLs). As amostras foram corridas em duplicatas e analisadas para o nível de TGFβ ligado.

[0435] Os anticorpos comparador XPA.42.068, XPA.42.089 e BM-1 foram cada um testado no ensaio de competição rhLAP. O anticorpo XPA.42.681, que foi derivado de XPA.42.068, não foi testado. Como mostrado na Figura 1, XPA.42.068, XPA.42.089 e BM-1 cada um apresentou um nível alto de competição com rhLAP, indicando que os anticorpos interagem com a forma ativa de TGFβ e não reconhecem TGFβ latente.Exemplo 6. Medição de neutralização por anticorpos TGFβ em ensaio HT-2

[0436] Para determinar se os anticorpos funcionalmente neutralizaram isoformas TGFβ, os métodos de ensaio de Ruegemer et al. (J Immunol. 144:1767-76; 1990) foram adaptados por meio do qual células T murinas HT-2 são crescidas com IL-4, e com ou sem a adição de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3. Isoformas TGFβ inibem crescimento dependente de IL-4 de células HT-2 através da transativação de genes que promovem interrupção do ciclo celular. IL-4 transativa um programa de expressão de gene mitogênico por ativação de alvos como c- myc e GM-CSF; enquanto que a sinalização TGFβ transativa genes que suprimem expressão de c-myc e GM-CSF. Se a sinalização de TGFβ é anulada por um anticorpo neutralizante, células HT-2 se proliferam. As diferenças no crescimento foram classificadas por ensaio de viabilidade CELL TITERGLO® (Promega #G7571) que mede ATP como uma leitura para células metabolicamente ativas.

[0437] Células T murinas HT-2 foram mantidas por divisão a cada2-3 dias em 1,5e4 - 2,5e4 células/mL em RPMI + 10% FBS, 10 mM Hepes, 2 mM glutamina, 50 uM 2-ME. IL-2 de camundongo recombi- nante fresco (R&D Systems) foi adicionado a 200 IU/mL em cada frasco de um estoque concentrado. No dia 1, as células foram lavadas em meio para remover IL-2 e dispensadas em placas opacas de 96 poços em 10.000 células por poço com 2000 IU/mL IL-4 recombinante de camundongo (R&D Systems). TGFβ 1, TGFβ2 ou TGFβ3 (PeproTech #100-21, 100-35B, 100-36E) foi adicionado após 1 hora de pré- incubação com ou sem anticorpos através de uma série de titulação. Após 48 horas de incubação a 37oC, a população celular viável foi classificada em MDS Flexstation3 usando CELL TITERGLO® de acordo com as recomendações do fabricante.Tabela 6. Ensaio de neutralização de célula HT-2

[0438] Os anticorpos foram inicialmente testados para neutralização de atividade de TGFβ2 em um único ponto de diluição de 10 ug/mL no ensaio HT-2, e cada um dos anticorpos foi conformado como positivo, com os anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 contendo potência maior do que o anticorpo comparador BM-1 em um único ponto testado. A neutralização de TGFβ 1 e TGFβ3 foi então determinada e um IC50 calculado para cada anticorpo através de uma série de diluição de 6 pontos. Novamente, cada um de XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 demonstrou maior potência do que o com- parador BM-1 com relação à neutralização TGFβ 1, mas somente XPA.42.681 demonstrou apresentar potência maior de neutralização de TGFβ3, e assim foi o mais potente pan-inibidor de TGFβ (Tabela 6). XPA.42.681 apresentou potência melhorada neste ensaio com as menores concentrações testadas significativamente inibindo TGFβ 1, e assim um cálculo de IC50 específico não pode ser realizado.Exemplo 7. Medição de neutralização por anticorpos TGFβ em ensaio de liberação de IL-11

[0439] Um segundo ensaio de neutralização classificou secreçãode IL-11 mediada por TGFβ de células de carcinoma pulmonar A549, que é parte de uma resposta pró-fibrótica em fibroblastos pulmonares e células epiteliais. TGFβ ainda medeia a secreção de IL-11 de células MDA-MB-231 que promove metástase ao osso. Este ensaio modela respostas biológicas mediadas por TGFβ que contribui para fibrose e doença metastática. O ensaio de liberação de IL-11 foi adaptado de Rapoza et al. (J Immunol. Methods 316:18-26; 2006), em que as células A549 foram semeadas em placas de 96 poços e as células do dia seguinte foram tratadas com ou sem as isoformas TGFβ, pré- incubadas com ou sem anticorpos neutralizantes. Liberação de IL-11 foi classificada em sobrenadantes de cultura de célula por ELISA.

[0440] Neste ensaio, as células A549 foram crescidas em F12 +10% soro. O dia antes da análise, as células foram destacadas com versene (para reter a expressão do receptor) e semeadas em 40.000 células/poço em uma placa de fundo plano de 96 poços. No dia seguinte TGFβ 1, TGFβ2 ou TGFβ3 em EC80 foi pré-incubado por 1 hora com ou sem anticorpos através de uma série de diluições antes de adicionar as células. Como um controle, TGFβ isolado, TGFβ + anticorpo controle anti-KLH-G2 ou meio isolado foi adicionado nas placas. Após 24 horas a 37°C, sobrenadante foi coletado e IL-11 foi classificado por ELISA usando o kit IL-11 Duo Set ELISA (R&D Systems) de acordo com as recomendações do fabricante.Tabela 7. Ensaio de liberação IL-11 - IC50 (ng/mL)

[0441] Como mostrado na Tabela 7 acima, e semelhante ao en- saio HT-2, os resultados de ensaio de liberação de IL-11 indicaram que XPA.42.681 foi o mais potente de qualquer um dos anticorpos para cada uma das três isoformas de TGFβ. Em contraste ao ensaio HT- 2, o anticorpo XPA.42.681 apresentou um efeito dependente de dose em liberação de IL-11 que permitiu a determinação de IC50, e ainda revelou valores IC50 geralmente semelhantes para cada isoformas TGFβ. Anticorpos XPA.42.068 e XPA.42.089 ainda demonstraram boa neutralização de isoformas TGFβ 1 e TGFβ2 (mais potente do que o comparador BM-1), mas com significativamente menos neutralização de TGFβ3 em comparação com o anticorpo BM-1 ou em relação à neutralização de TGFβ1 e TGFβ2.Exemplo 8. Medição de neutralização por anticorpos TGFβ em ensaio pSMAD2

[0442] Para ainda caracterizar os anticorpos um ensaio fosfo-SMAD2 (pSMAD2) foi desenvolvido para classificar a neutralização de sinalização de TGFβ através do complexo receptor TGFβRII/TGFβRI. Células Detroit 562 foram mantidas em IMDM + 10% FBS. As células foram destacadas com versene e plaqueadas em uma placa de 6 poços a 500.000 células por poço. No dia seguinte, as células foram privadas de soro em IMDM sem soro por 3 horas antes da exposição de 30 minutos a TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 pré-incubados por 1 hora com ou sem anticorpos. Após 30 minutos a 37°C, as células foram lisadas e pSMAD2 e SMAD2 total foi classificado por ELISA usando kits comerciais (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) de acordo com as recomendações do fabricante para a detecção. O percentual de pSMAD2 foi normalizado a SMAD2 total e inibição percentual foi calculado para cada clone de % normalizado de pSMAD2 em relação ao controle anti- KLH (Figura 2). Teste T (duas caudas) mostrou que anticorpo XPA.42.681 foi significativamente mais potente do que o anticorpo comparador BM-1 em sinalização pSMAD neutralizante através de to das as TGFβ isoformas (p<0,05). Além disso, XPA.42.068 foi significati-vamente mais potente contra TGFβ2 em relação ao comparador BM-1.Exemplo 9. Medição de atividade de anticorpo TGFβ em um ensaio de célula T regulatório

[0443] Para caracterizar a atividade dos anticorpos em TGFβ endógeno, um ensaio de célula T regulatório (Treg) foi estabelecido, baseado em métodos semelhantes a Tran et al. (Blood 110:2983-2990; 2007). As células T foram isoladas de frascos congelados de PBMCs humanas usando o kit EasySep T cell Enrichment (StemCell Technologies, Van-couver, BC). As células T foram ativadas com anticorpo anti-CD3 huma-no ligado a placa (eBioscience, San Diego, CA) a 10ug/mL e anticorpo anti- CD28 humano solúvel (eBioscience) a 2 ug/mL. As células foram ainda tratadas concomitantemente com 15ug/mL de anticorpos TGFβ ou controles. Após 4 dias, as células foram coradas com anti-CD4-FITC hu-mano (BD Biosciences) e anti-CD25-A647 humano (BioLegend, San Di-ego, CA) por 30 minutos a 4°C. As células foram fixadas com tampão de fixação FOXP3 (BioLegend) por 20 minutos em temperatura ambiente, e permeabilizadas por 15 minutos em temperatura ambiente com tampão de permeabilização FOXP3 (BioLegend). As células foram coradas com 1:25 diluição de anti-FOXP3-PE humano (BioLegend) e analisadas em um sistema BD FACSCanto™. As células CD4+ foram fechadas e CD4+CD25+Foxp3+ subpopulações foram quantificadas com software Flowjo. Anticorpos foram avaliados neste ensaio usando 4 ou 5 diferentes doadores PBMC e dados representativos de 2 doadores são mostrados (Figura 3).

[0444] Embora uma faixa de atividade foi encontrada devido àsdiferenças dependentes do doador nas populações celulares, geralmente XPA.42.681 e os anticorpos BM-1 comparadores inibiram a população de célula Treg, enquanto os anticorpos XPA.42.068 e XPA.42.089 forneceram atividade parcial neste ensaio. Exemplo 10. Medição de atividade de anticorpo TGFβ em um ensaio EMT

[0445] A transição de epitelial para mesenquimal (EMT) permiteauto renovação de células de tumor para promover invasão e metásta- se de câncer. A indução de EMT é direcionada por citocinas, incluindo TGFβl, TGFβ2 e TGFβ3, e todas as três isoformas podem estar en-volvidas sequencialmente em EMT dependendo do tipo de tecido (Boyer et al., Dev. Biol. 208:530-545, 1999; Bhowmick et al., Mol. Biol. Cell 12:27-36, 2001; Camenisch et al., Dev. Biol. 248:170-181, 2002). Um ensaio EMT foi desenvolvido usando células epiteliais mamárias hu-manas primárias (HMEC), semelhante a Mani et al. (Cell 133:704-715; 2008) para determinar se os anticorpos inibem este processo in vitro.

[0446] Células epiteliais mamárias humanas (Lonza, Basel, Switzerland) foram cultivadas em meio completo MEGM (Lonza) como reco-mendado pelo fabricante. Para subcultura, as células foram tripsinizadas e tratadas com solução neutralizante de tripsina (Lonza) antes da seme-adura. As células HMEC foram semeadas a 3500 células/cm2 em lâminas de câmara de 8 poços com ou sem TGFβ a 2,5 ng/mL, pré- incubadas com ou sem anticorpos por 30 minutos. As células foram incubadas a 37°C por 8 dias e meio fresco + reagentes foram adicionados após 4 dias. No dia 8, as células foram fixadas com 4% paraformaldeído por 15 minutos em temperatura ambiente. As células foram rinsadas duas vezes em PBS e permeabilizadas em PBS + 0,25% Triton X-100 por 10 minutos, antes de bloquear com PBS-TWEEN + 10% soro de cabra por 30 minutos. As células foram coradas durante a noite a 4°C para um marcador mesenquimal usando anti-vimentina humana (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e para um marcador epitelial usando anti- E- Caderina humana (Cell Signaling Technology) diluído 1:200 ou 1:500, respectivamente. As células foram lavadas em PBS 3 vezes e incubadas com anticorpos secundários apropriados Alexa Fluor 488 de cabra anti coelho ou Alexa Fluor 568 de cabra anti-coelho (Invitrogen, Carlsbad, CA) diluídas em solução de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente e protegidas da luz. As lâminas foram lavadas e montadas com Gold Anti-Fade/DAPI antes da microscopia de fluorescência.

[0447] A exposição de células HMEC a TGFβ na presença de anticorpo de controle anti-KLH resulta em coração de vimentina aumentada e uma redução em densidade celular total, consistente com interrupção de crescimento e diferenciação mediados por TGFβ em um fe- nótipo mesenquimal. Neutralização de EMT mediada por TGFβ 1 foi evidente baseado em coração vimentina reduzida, que se correlacionou com densidade celular aumentada para anticorpos XPA.42.681, XPA.42.068 e XPA.42.089, enquanto uma resposta intermediária foi observada para o comparador BM-1, como a coloração vimentina estava presente, embora não no mesmo grau como controle anti-KLH (dados não mostrados). Além disso, cada um dos anticorpos inibiu EMT direcionado por TGFβ2, embora o anticorpo comparador BM-1 pareceu menos potente baseado em intensidade sinal de Vimentina, coloração de E-caderina e aumentou a densidade celular. Para a neutralização de EMT mediada por TGFβ3, o anticorpo XPA.42.681 foi mais potente, seguido por BM-1 e XPA.42.068, enquanto XPA.42.089 não pareceu diferir do controle anti-KLH.Exemplo 11. Inibição de tumor por anticorpos TGFβ em um modelo de camundongo de xenoenxerto

[0448] Os anticorpos XPA.42.068 e XPA.42.089 foram avaliadospara suas capacidades de inibir crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto derivado de Detroit 562, uma linhagem celular de câncer de faringe (Van Aarsen et al., Cancer Res. 68:561-70; 2008). Camundongos de oito a nove semanas de idade Nu/Nu (Charles River Laboratories) foram implantados subcutaneamente com 5x106 células Detroit 562 em BD MATRIGEL™ (1:1, 200 uL) por animal, na região the abdominal ventral esquerda inferior. Os animais foram randomiza- dos em grupos de testes de doze camundongos cada: Controle anti- KLH humano isotipo IgG2 (10 mg/kg), XPA.42.068 (1, 3, ou 10 mg/kg dose), XPA.42.089 (1, 3, ou 10 mg/kg dose), comparador BM-1 (3 mg/kg), ou controle isotipo IgG1 de camundongo (3 mg/kg). Medições de dosagem e volume do tumor foram realizadas bissemanalmente (Figura 4). Os animais foram sacrificados no dia após a última dose (dia 28), após 7 doses do tratamento com anticorpo. Para todas as medições, significância estatística foi determinara por um teste t de Student de uma cauda.

[0449] Como mostrado na Figura 4, os tumores tratados comXPA.42.089 tenderam a ficar menores do que os tumores tratados com XPA.42.068, com diferenças significativas em níveis de dose maiores quando em comparação ao controle anti-KLH IgG2 humano. Inibição percentual de crescimento de tumor (TGI) foi em comparação ao anticorpo controle IgG no dia 28 em todos os grupos de teste. Os tumores dos grupos tratados com XPA.42.068 (3 e 10 mg/kg),XPA.42.089 (3 e 10 mg/kg), e ainda o comparador BM-1 (3 mg/kg) foram significativamente menores no dia 28 então os grupos tratados com 1 mg/kg (valor P <0,05). Além disso, XPA.42.068 a 10mg/kg e XPA.42.089 a 3 e 10 mg/kg mostraram diferenças significativas em comparação ao controle IgG usando teste Tukey's ANOVA (Tabela 8).Tabela 8. Inibição de crescimento de tumor em modelo de tumor xe- noenxerto

[0450] Outra avaliação em modelo de xenoenxerto Detroit 562 foiconduzida usando os anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 eXPA.42.681. Camundongos de oito a nove semanas de idade Nu/Nu (Charles River Laboratories) foram implantados subcutaneamente com 5x106 células Detroit 562 em BD MATRIGEL™ (1:1, 200 uL) por animal, na região the abdominal ventral esquerda inferior. Controle anti- KLH humana isotipo IgG2 (3 mg/kg), XPA.42.068 (1 ou 3 mg/kg dose), XPA.42.089 (1 ou 3 mg/kg dose), XPA.42.681 (1 ou 3 mg/kg dose), comparador BM-1 (1 ou 3 mg/kg dose). Medições de dosagem e volume do tumor foram realizads bissemanalmente (Figura 5). Os animais foram sacrificados no dia após a última dose (dia 30), após 7 doses do tratamento com anticorpo. Para todas as medições, significância esta-tística foi determinara por um teste t de Student de uma cauda.

[0451] Como mostrado na Figura 5 e Tabela 9, tumores tratadoscom XPA.42.681, XPA.42.089, e o comparador BM-1 em 3 mg/kg mostraram diferenças significativas em percentual de TGI e volumes de tumor médios no dia 30 em comparação com anticorpo controle. As comparações entre estes grupos não mostraram diferenças significativas usando teste Tukey's ANOVA. Tabela 9. Inibição de crescimento de tumor em modelo de tumor xe- noenxerto

Exemplo 12. Inibição de tumor por anticorpos TGFβ em um modelo de camundongo singeneico

[0452] Os anticorpos XPA.42.068 e XPA.42.089 foram ainda avaliados para suas capacidades de inibir crescimento de tumor em um modelo singeneico, usando células de câncer de mama 4T1, usando um protocolo adaptado de Nam et al. (Cancer Res. 68:3915-23; 2008). Camundongos fêmeas Balb/c de oito semanas e idade foram implantadas subcutaneamente com células 250,000 4T1 no 4o chumaço de gordura mamária no dia 0. Os animais foram randomizados em grupos de teste de doze camundongos cada e administrados os anticorpos três vezes por semana (começando no dia -1) em um nível de dose única de 10 mg/kg, com controle anti-KLH humana isotipo IgG2, XPA.42.068, XPA.42.089, comparador BM-1, ou controle de camundongo isotipo IgG1. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana ao longo do curso do experimento e os dados são mostrados na Figura 6. Ao fim do estudo os dados de volume de tumor indicaram que ambos XPA.42.068 e XPA.42.089 significativamente inibiram crescimento de tumor em comparação ao anticorpo de controle KLH.

[0453] Além disso, os animais foram sacrificados no dia final doestudo (dia 23) e tumores foram removidos para determinar os pesos do tumor. Cada um de anticorpos XPA.42.089, XPA.42.068 e BM-1 significativamente reduziram massa de tumor em relação aos anticorpos controle humanos e de camundongo (Figura 7).

[0454] Outra avaliação no modelo singeneico 4T1 foi conduzidousando os anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681. Ca-mundongos Balb/c de oito semanas de idade foram implantados por via subcutânea com células 250,000 4T1 no 4o chumaço mamário de gordura no dia 0. Os animais foram randomizados nos grupos teste de doze camundongos cada e os anticorpos foram administrados três vezes por semana (começando no dia -1) em um nível de dose única de 10 mg/kg, com controle anti-KLH humano isotipo IgG2, XPA.42.068, XPA.42.089, XPA.42.681, BM-1, ou controle de isotipo IgG1 de camundongo. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana ao longo do curso do experimento e os dados são mostrados na Figura 8. Ao fim do estudo os dados de volume de tumor indicaram que cada um dos anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089, XPA.42.681 e BM-1 significativamente inibiu o crescimento do tumor como em comparação aos anticorpos de controle humanos ou de camundongos.

[0455] Além disso, os animais foram sacrificados no dia final doestudo (dia 21) e tumores foram removidos para determinar os pesos do tumor. Cada um de anticorpos XPA.42.089, XPA.42.068 e BM-1 significativamente reduziram massa de tumor em relação aos anticorpos controle humanos e de camundongo (Figura 9).Exemplo 13. Efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células NK em modelo de tumor em camundongo

[0456] Para avaliar se os anticorpos TGFβ apresentaram um efeito modulador imune in vivo em células natural killer (NK) presentes em tumores, os tumores isolados que foram removidos de camundongos nos experimentos acima de modelo singeneico 4T1 foram digeridos para gerar suspensões de células simples. Resumidamente, tumores recém-coletados foram picados e digeridos em 2,5 mg/mL colagenase II e 2,5 mg/mL colagenase IV em HBSS (15 minutos a 37oC). As células foram contadas e ressuspensas a 2e6/mL em PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3 e 10 ug/mL de anticorpo de bloqueio 2,4G2 anti-Fc de camundongo (eBioscience, San Diego, CA), e incubadas por 15 minutos a 4oC. Após lavagem em PBS com 0,5% BSA, as células foram coradas por 30 minutos a 4oC com um anticorpo anti-CD335 (anti-NKp46), conjugado por coloração imunofluorescente com análise de citometria de fluxo (BioLegend, San Diego, CA). CD335, também conhecido como NKp46, é um marcador de superfície celular exclusivamente expresso em células CD3-CD56+ NK, e considerado um marcador universal para células NK. As células foram fixadas em 2% paraformalde- ído recém-preparado e analisado em um sistema BD FACSCanto™. Controles de cor única foram ainda preparados para compensação. Como mostrado na Figura 10, o anticorpo XPA.42.089 significativamente aumentou a expressão de marcador NKp46 de célula NK (CD335) dentro de tumores removidos de camundongos, como em comparação ao isotipo de anticorpo controle. Os anticorpos BM-1, XPA.42.068 e XPA.42.681 não levaram a um aumento semelhante em NKp46.Exemplo 14. Efeito in vivo de anticorpos TGFβ em MDSC em modelo de tumor de camundongo

[0457] Para avaliar se os anticorpos TGFβ apresentaram um efeitomodulador imune in vivo em células supressoras derivadas de mieloi- de (MDSC) (CD11b+/Gr1+) presentes em tumores, os tumores isolados que foram removidos de camundongos em experimentos de modelo singeneico 4T1 foram preparados como descrito acima e corados por 30 minutos a 4oC com anticorpos anti-CD11b e anti-Gr1 conjugados para coloração imunofluorescente com análise de citometria de fluxo (BioLegend, San Diego, CA). CD11b, também conhecido como αM-integrina, e o antígeno de diferenciação de linhagem mieloide Gr1, também conhecido como Ly6G, os marcadores de superfície celular co-expressos em MDSC. As células foram fixadas em 2% paraformal- deído recém-preparado e analisado em um sistema BD FACSCanto™. Controles de cor única foram ainda preparados para compensação. Como mostrado na Figura 11, os anticorpos XPA.42.068, XPA.42.089 e XPA.42.681 significativamente reduziram o acúmulo de células su-pressoras derivadas de mieloide (MDSC, CD11b+/Gr1+) dentro de tu-mores removidos de camundongos, como em comparação ao anticorpo isotipo controle. O anticorpo comparador BM-1 não apresentou uma redução semelhante em MDSC.Exemplo 15. Efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células dendrí- ticas em modelo de tumor em camundongo

[0458] Para avaliar se os anticorpos TGFβ apresentaram um efeitomodulador imune in vivo em células dendríticas (DC) presentes em tumores, os tumores isolados que foram removidos de camundongos em experimentos de modelo singeneico 4T1 foram preparados como descrito acima e corados por 30 minutos a 4°C com anticorpos anti- CD11c conjugados para coloração imunofluorescente com análise de citometria de fluxo (BioLegend, San Diego, CA). CD11c, também conhecido como αX integrina, é um marcador de superfície celular encontrado em DC. As células foram fixadas em 2% paraformaldeído recém- preparado e analisado em um sistema BD FACSCanto™. Controles de cor única foram ainda preparados para compensação. Como mostrado na Figura 12, o anticorpo XPA.42.089 significativamente reduziu a expressão de marcador CD11c em DC dentro de tumores removidos de camundongos, como em comparação ao isotipo de anticorpo controle. Os anticorpos BM-1, XPA.42.068 e XPA.42.681 não mostraram uma redução semelhante em CD11c.Exemplo 16. Efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células T regu- latórias em modelo de tumor em camundongo

[0459] Para avaliar se os anticorpos TGFβ apresentaram um efeitomodulador imune in vivo em células T regulatórias (Treg) presentes em tumores, os tumores isolados que foram removidos de camundongos em experimentos de modelo singeneico 4T1 foram preparados como descrito acima e corados por 30 minutos a 4°C com anticorpos anti-CD4, anti-CD25, e anti-FOXP3 conjugados para coloração imuno- fluorescente com análise de citometria de fluxo (BioLegend, San Diego, CA). CD4, também conhecido como L3T4, bem como CD25, também conhecido como o IL-2Rα de baixa afinidade, e ainda FOXP3, também conhecido como proteína Forkhead box P3, são cada um marcadores de superfície celular encontrados em células Treg. As células foram fixadas em 2% paraformaldeído recém-preparado e analisado em um sistema BD FACSCANTO™. Controles de cor única foram ainda preparados para compensação. Como mostrado na Figura 13, o anticorpo XPA.42.068 significativamente reduziu o acúmulo de células Treg dentro de tumores removidos de camundongos, como em comparação ao isotipo de anticorpo controle. Os anticorpos BM-1, XPA.42.089 e XPA.42.681 não mostraram uma redução semelhante em células T-reg.Exemplo 17. Efeito in vivo de anticorpos TGFβ em células T cito- tóxicas em modelo de tumor em camundongo

[0460] Para avaliar se os anticorpos TGFβ apresentaram um efeitomodulador imune in vivo em células de linfócitos T (CTL) presentes em tumores, os tumores isolados que foram removidos de camundongos em experimentos de modelo singeneico 4T1 foram preparados como descrito acima e corados por 30 minutos a 4°C com anticorpos anti- CD8 conjugados para coloração imunofluorescente com análise de citometria de fluxo (BioLegend, San Diego, CA). CD8 é um marcador de superfície celular em CTL. As células foram fixadas em 2% para- formaldeído recém-preparado e analisado em um sistema BD FACS- CANTO™. Controles de cor única foram ainda preparados para com-pensação. Como mostrado na Figura 14, o anticorpo XPA.42.068 sig-nificativamente aumentou os níveis de CTL dentro de tumores removidos de camundongos, como em comparação ao isotipo de anticorpo controle. Os anticorpos BM-1, XPA.42.089 e XPA.42.681 não levaram a um aumento semelhante em CTL.

[0461] Os resultados acima demonstram que os anticorpos anti-TGFβ revelados aqui têm a capacidade de reduzir o tamanho do volume do tumor bem como modular células imunes que infiltram tumores e contribuem para o crescimento do tumor in vivo. Isto sugere que os anticorpos anti-TGFβ descritos aqui irão fornecer um beneficio tera-pêutico no tratamento de câncer, em particular, em cânceres em que qualquer uma ou mais das células imunes nos exemplos acima infiltram nas células de tumor.Exemplo 18. Melhora em atividade citolítica de célula NK

[0462] Um sistema de cocultura de célula natural killer (NK) foi desenvolvido para imitar a interação crônica entre células NK e células de tumor in vivo, para avaliar a capacidade de anticorpos anti-TGFβ em melhorar a atividade citolítica de célula NK. A linhagem de célula de carcinoma mamário de camundongo que produz TGFβ, 4T1, foi usada. As células NK foram purificadas de baços de camundongos Balb/c normais e co-cultivadas com células de tumor 4T1 marcadas com CFSE por 48 horas na presença de IL-2 (500 IU/mL) em placas de 6 poços. Anticorpos anti-TGFβ e controle foram adicionados em sistema de co-cultura e células NK foram coletados 48 horas depois. Produção de IFNY de células NK foi medida imediatamente após a co- cultura por coloração intracelular. As células NK foram classificadas como células negativas para CFSE e suas atividades citolíticas foram analisadas por ensaios de morte padrão contra a linhagem de célula de tumor Yac-1. As células NK foram co-cultivadas com células Yac-1 marcadas com CFSE em uma relação de efetor:alvo (E:T) de 20:1 por 4 horas em placa de fundo redondo de 96 poços. Coloração de iodeto de propídio (PI) foi usado para marcar morte celular.

[0463] As células NK mostraram um aumento elevado mas nãosignificativo em produção de IFNY entre grupos tratados com anticorpo em comparação ao grupo tratado com anti-KLH. Nos ensaios de morte, em uma relação efetor:alvo de 20:1, o anticorpo BM-1 e ambos os anticorpos XPA.42.089 e XPA.42.681 significativamente melhoraram a atividade citolítica da célula NK (Figura 15). Além disso, ambos os an-ticorpos XPA.42.089 e XPA.42.681 aumentaram a capacidade de células NK em matar células de tumor alvo a 97,8% e 96,7%, que tiveram níveis significativamente maiores do que o comparador de bancada (P<0,0001). Este resultado indica que os anticorpos neutralizantes TGFβ da presente revelação podem significativamente melhorar a atividade citolítica de célula NK que foi amortecida por interação crônica com células de tumor que produzem TGFβ in vitro.Exemplo 19. Inibição de função tolerogênica de células dendríti- cas CD8+

[0464] Um sistema in vitro baseado em reação de linfócito misto(MLR) foi desenvolvido para avaliar a capacidade de anticorpos anti- TGFβ para inibir a função tolerogênica de TGF-β em células dendríti- cas CD8+ (DC). MLR é um experimento clássico usado para testar apresentação de antígenos DCs sem adição externa de antígenos no sistema. Os baços de camundongos Balb/c normais foram cortados em fragmentos pequenos e incubados em 10% RPMI e 1mg/mL cola- genase tipo IV por 1 hora a 37° C em uma incubadora com agitação. Após adição de EDTA por mais 5 minutos, a solução foi filtrada por uma malha de náilon. CD11c+ DCs foram coradas com anticorpo anti- CD11c biotinilada e positivamente selecionadas usando um kit de purificação de biotina de Stemcell Technologies. CD11c+ DCs foram coradas com anticorpo CD8. Populações de CD8+ e CD8- foram classificadas no classificador de célula BD FACSARIA™. CD8+ DCs foram cultivadas com anticorpos anti-TGFβ ou anticorpo controle por 24 horas e misturados em uma relação de CD8- DCs a 1:10. As células T foram purificadas de baços B6 normais usando um kit de seleção negativa de célula T de Stemcell Technologies e marcados com CFSE. DCs misturados foram então co-cultivados com células T B6 por 5 dias em placas de fundo redondo de 96 poços. A função inibitória imune de DCs CD8+ foi avaliada por proliferação de célula T. Se DCs CD8+ inibem a capacidade de DCs CD8- em apresentar antígenos, as células T B6 se proliferam menos. Se anticorpos anti-TGFβ bloqueiam TGFβ autócrino e amortecem a função tolerogênica de DC CD8+, as células T B6 se proliferam mais.

[0465] Como mostrado na Figura 16, pouca mudança foi observada em proliferação de célula T para o grupo tratado com BM-1 em comparação ao grupo controle anti-KLH. Em contraste, ambos os anti-corpos XPA.42.089 e XPA.42.681 significativamente aumentaram a proliferação de célula T como em comparação ao grupo tratado com controle anti-KLH, e o efeito de XPA.42.681 em proliferação de célula T foi significativo em comparação ao anticorpo BM-1 de bancada. Estes dados mostram que ao bloquear TGF-β, o efeito tolerogênico de DCs CD8+ em DC imunogênico pode ser reduzido, que pode fornecer apresentação de antígeno melhorado por DCs imunogênicos.Exemplo 20. Melhora de função CTL

[0466] Um sistema in vitro foi desenvolvido para imitar a ativaçãode CTLs em condições de tumor e determina se a função CTL poderia ser melhorada pelos anticorpos anti-TGFβ. Ativação de CTL foi avaliada por expressão de CD25 e função por coloração de perforina e granzima B (GzmB) (Massague et al. Cancer Cell 8: 369-380, 2005). As células T foram purificadas de baços de Balb/c normais por seleção negativa de célula T (Stemcell Technologies). Esferas MACs foram revestidas com anticorpos com anti-CD3 e anti-CD28 com kit de ativa- ção/expansão de célula T por Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Esferas MACs revestidas com células T e anti-CD3 e anti-CD28 foram co- cultivadas em uma relação 1:1 em uma concentração de 2X10e6/mL em placa de fundo redondo de 96 poços na presença de 20 ul de cultura sobrenadante de 4T1 por 48 horas, com anticorpos anti-TGFβ e anticorpo controle. Ativação CTL foi avaliada com expressão de CD25 na superfície celular e a função foi avaliada com a expressão de GzmB (Figura 17A) e perforina (Figura 17B), determinada por coloração intracelular usando um protocolo de coloração de FoxP3.

[0467] Consistente com os dados publicados, alterações em expressão CD25 não foram observadas entre grupos tratados com anti-corpo e o grupo de controle. CTLs tratados com BM-1 mostraram alte-rações mínimas em expressão de GzmB e perforina. No entanto, ambos os anticorpos XPA.42.089 e XPA.42.681 significativamente aumentaram a expressão GzmB em CTLs como em comparação para controlar o tratamento anti-KLH (P<0,001). Além disso, o aumento na expressão de GzmB em CTLs tratados com XPA.42.089 foi significativamente maior do que o comparador BM-1 (P<0,05). Para a expressão de perforina, os CTLs tratados com ambos XPA.42.089 e XPA.42.681 produziram significativamente mais perforina em comparação aos CTLs tratados com controle anti-KLH (P<0,05). Além disso, XPA.42.681 melhorou a expressão de perforina em CTLs significativamente mais do que o comparador BM-1 (P<0,05). Assim, ambos XPA.42.089 e XPA.42.681 podem restabelecer a expressão de ambos GzmB e perforina suprimidos por TGF-β secretados por células de tumor neste sistema de cultura in vitro, e portanto, fornece um mecanismo para impulsionar a função CTL por TGFβ neutralizante produzido por células de tumor.Exemplo 21. Inibição de MDSC e função Treg

[0468] Um sistema de cocultura in vitro é desenvolvido para avaliaro efeito de células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs) na ex-pansão e função de células T regulatórias (Tregs), e a capacidade de anticorpos anti-TGFβ da presente revelação em inibir atividade de MDSC e Treg.

[0469] MDSCs são conhecidos por suprimirem a resposta imunecontra tumores e promovem invasão de tumor e metástase, bem como promovem a expansão e função de Tregs, que são conhecidos por re-gularem para baixo as respostas imunes. Camundongos fêmeas BALB/c são inoculados na glândula mamária abdominal com 7 X103 células de tumor 4T1 em 50 ul 1X PBS. Os baços são coletados no dia 21 e MDSCs purificados via anticorpo CD11b marcado com biotina e kit de seleção positivo para biotina (Stemcell Technologies). Ao mesmo tempo, baços de BALB/c normais são coletados e as células T são purificadas por um kit de seleção de célula T negativa (Stemcell Technologies). As células são coradas com anti-CD4-FITC e anti-CD25-PE. As células duplas positivas são classificadas com um classificador de célula FACSARIA™ (BD Bioscience). A população Treg é marcada com CFSE e co-cultivada com MDSCs de camundongos injetados com tumor 4T1 em uma relação 1:1 por 5 dias na presença de anticorpos anti-TGFβ ou controle. A expansão de Tregs é medida por divisões CFSE. Para avaliar o efeito de MDSCs em função Treg, MDSCs coletadas de camundongos BalB/c injetados com 4T1 são marcas com CFSE e co- cultivadas com Tregs por 5 dias na presença de anticorpos anti-TGFβ ou controle. As Tregs são classificadas em uma população negativa pa ra CFSE da co-cultura. As células T de camundongos BALB/c normais são marcados por CFSE e plaqueadas a 2X106 células/mL com esferas anti-CD3 e anti-CD28. Tregs classificados são adicionados no sistema de cultura. A função inibitória de Tregs é medida por análise de número de divisões CFSE das células T.Exemplo 22. Inibição de fibrose por anticorpos TGFβ em um modelo de camundongo

[0470] Os anticorpos da presente revelação são ainda avaliadospara suas capacidades em inibir fibrose (por exemplo, fibrose pulmonar, fibrose renal) em modelos animais de fibrose.

Fibrose renal

[0471] Um modelo de fibrose renal foi usado para avaliar os anticorpos anti-TGFβ (Ling et al., J. Am. Soc. Nephrol. 14:377-388; 2003). Ciclosporina A (CsA, 30 mg/kg) ou azeite de oliva como veículo controle foram injetados por via subcutânea uma vez ao dia por 4 semanas em camundongos ICR machos de 6-7 semanas de idade em uma dieta com baixo teor de sal (LSD, 50-100 ppm NaCl) para iniciar uma doença fibrótica renal. Camundongos de controle foram mantidos em uma dieta normal e não receberam CsA. Anticorpo anti-TGFβ XPA.42.089 ou anticorpo controle IgG foram dosados via intraperitoneal (2,5mg/kg, TIW) iniciando um dia antes do início do tratamento CsA. Os animais foram sacrificados, e soro, urina e rins foram coletados para avaliar a histologia e pontos de avaliação de função renal.

[0472] A avaliação histopatológica foi realizada por coloração deseções de rins fixadas em formalina e embutidas em parafina (5 μm) com hematoxilina-eosina (H&E) e tricoma Masson, usando técnicas padrões. A avaliação de alterações histopatológicas induzidas por CsA pode incluir classificação semi-quantitativa comumente aceita (Ling et al., Am. J. Physiol. 277:F383-F390, 1999) de seções codificadas e avaliação com base em qualquer um ou todos os dano tubulares, infil- trados intersticiais, espessamento de arteríolas, expansão tubulointers- ticial, e fibrose, incluindo por exemplo, classificação por contagem da área afetada por seção renal. As seções renais sagitais de controle normal, camundongos injetados com CsA e anticorpo XPA.42.089 foram coradas com corante tricoma de Masson. O desenvolvimento de fibrose induzida por CsA foi observado no tubulointerstício de camundongos injetados com CsA, mas não nos animais controle. Além disso, um aumento no diâmetro luminal de alguns túbulos foi observado em camundongos tratados com CsA. O tratamento com o anticorpo XPA.42.089 reduziu a quantidade de fibrose induzida por CsA observado no tubulointerstício e reduziu o diâmetro do túbulo.

[0473] A função renal ainda pode ser avaliada por qualquer um outodos de creatinina sérica, ureia sanguínea, e biomarcadores de urina e disfunção renal.

[0474] A ureia sérica (BUN) é um indicador de disfunção renal.Neste estudo, BUN foi significativamente aumentado em camundongos expostos a CsA como em comparação a camundongos controle alimentados com ração ou alimentados com LSD (Figura 18). Tratamento com XPA.42.089 significativamente reduziu BUN sérica em comparação ao anticorpo IgG controle.

[0475] Albuminuria, ou um aumento em acúmulo de albumina naurina, é característico de disfunção glomerular no rim doente. Neste estudo, albumina na urina aumentou quase quatro vezes em camun-dongos CsA em relação aos camundongos controle alimentados com ração ou LSD (Figura 19). Tratamento com XPA.42.089 resultou em uma melhora significativa em albuminuria como em comparação aos camundongos tratados com anticorpo IgG controle.

[0476] Os níveis de colágeno tipo IV na urina, que refletem a extensão de deposição de ECM e fibrose nos rins, foram significativamente aumentados em camundongos CsA em relação aos camundon- gos controle alimentados com ração ou alimentados com LSD (Figura 20). Tratamento com XPA.42.089 moderadamente reduziram o colá- geno tipo IV na urina em comparação ao anticorpo IgG controle.

[0477] RT-PCR quantitativo foi realizado em tecido renal para determinar a expressão de genes envolvidos na fibrose. RNA total foi iso-lado de rins (córtex e medula) usando o kit RNeasy (Qiagen, German-town, MD) de acordo com o protocolo do fabricante. cDNA de primeira fita foi sintetizado usando iniciadores aleatórios e MULTISCRIBE™ RT (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR quantitativo foi então realizado em 2 μl cDNA usando SYBR Green mix (Roche) no sistema LIGHTCYCLER 480 Real Time PCR (Roche Applied Science, Indiana-polis, IN). Os valores foram normalizados para ciclofilina e calculados usando o método CT comparativo. TGF-β1 é um potente inibidor de diferenciação de fibroblasto e a deposição de proteínas ECM, incluindo colágeno tipo III. Expressão de TGF-β1 foi quase duas vezes maior em animais tratados com CsA quando em comparação aos camundongos controle (Figura 21A). Tratamento com XPA.42.089 significativamente reduziu os níveis de expressão de TGF-β1 no rim como em comparação ao anticorpo IgG controle. Um efeito semelhante observado para a expressão de colágeno tipo III, com uma elevação moderada observada em camundongos tratados com CsA (Figura 21B). Tratamento com XPA.42.089 resultou em níveis de expressão de colágeno tipo III em comparação aos camundongos tratados com anticorpo IgG controle. Fibrose pulmonar

[0478] Um modelo de fibrose pulmonar pode ser usado, essencialmente como descrito por Wilson et al. (J. Exp. Med. 207:535-552; 2010). Camundongos C57BL/6 são anestesiados e instilados por via intratraqueal com 0,15 U sulfato de bleomicina (Calbiochem, La Jolla, CA) em salina, com ou sem anticorpo (por exemplo, n=10 por grupo, 500 ug) nos dias -1, 3 e 5. Os animais são sacrificados no dia 7 para análise de histologia pulmonar, teor de colágeno no pulmão (por exemplo, deposição de colágeno), e infiltração inflamatória. Para histologia pulmonar, seções de 5 μm de tecido pulmonar embutido em parafina são corados com tricroma de Masson. A lesão pulmonar, medida como lavagem broncoalveolar (BAL), colágeno e deposição de co- lágeno em pulmão, é quantificado usando o ensaio Sircol. A infiltração inflamatória é medida no BAL por citometria de fluxo.Exemplo 23. Tratamento de distúrbios oftalmológicos mediados por TGFβ

[0479] Anticorpos anti-TGF-β da presente revelação podem serusados para o tratamento de um número de doenças e condições of-talmológicas (ou seja, olhos), incluindo por exemplo, doenças fibróticas nos olhos (por exemplo, doenças associadas com estados fibroprolife- rativos).Neutralização de TGFβl em células epiteliais do pigmento de retina

[0480] A manutenção de fenótipo epitelial é crítica para homeosta-sia de tecido. Na retina, desdiferenciação de epitélio de pigmento de retina (RPE) leva à disfunção retinal e fibrose, e TGFβ contribui para desdiferenciação retinal por um número de mecanismos, alguns dos quais são dependentes na ativação da via SMAD2. Anticorpos da pre-sente revelação foram avaliados para suas capacidades de neutralizar a ativação de resposta de TGFβ em células RPE, usando um ensaio pSMAD2.

[0481] Células epiteliais de pigmento de retina (RPE) (Lonza#194987) foram mantidas em meio de crescimento de célula epitelial de retina (Lonza#00195409). As células foram destacadas com tripsi- na, a tripsina foi neutralizada (Trypsin Neutralization Solution, Lon- za#CC-5002), e as células foram peletizadas, ressuspensas em 1e6 Células/mL e plaqueadas a 100.000 - 200.000 células/poço em uma placa de 6 poços. No dia seguinte, as células foram lavadas e meio basal RPE (Lonza#00195406) foi adicionado para interromper as células na fase G0/G1. No dia seguinte, as células foram tratadas com 10ng/mL TGFβ1 (Peprotech #100-21) pré-incubadas por 5 minutos com ou sem anticorpos anti-TGFβ XPA.42.068, XPA.42.089, eXPA.42.681, os anticorpos de bancada BM-1 e BM-2, ou um anticorpo controle anti-KLH-G2 a 10ug/mL. Após 30 minutos a 37°C, as células foram lisadas em tampão de lise celular (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) contendo 1mM fenilmetilsulfonila fluoreto (PMSF) adici-onado fresco. Após agitação suave por 5 minutos a 4°C, as células foram raspadas e dispensadas em uma placa de 96 poços fundos para lisar em gelo por 20 minutos. Os lisados foram girados em 3K por 5 minutos a 4°C. Os lisados foram diluídos e corridos de acordo com as recomendações do fabricante para fosfo-SMAD2 (Cell Signaling #7348) e detecção de SMAD2 total (Cell Signaling #7244).

[0482] Como mostrado na Figura 22, TGFβ1 tratamento causa umaumento robusto em pSMAD2 nas células RPE, que foi significativa-mente neutralizado por cada um dos anticorpos XPA.42.089, XPA.42.068 e XPA.42.681, e os anticorpos de bancada. Estes dados sugerem que XPA.42.089, 068 e 681 podem neutralizar sinalização mediada por TGFβ em células RPE e indica que os anticorpos podem ser úteis para o tratamento de disfunções retinais.

Vitreorretinopatia proliferativa

[0483] Vitreoretinopatia proliferativa (PVR) é a causa mais comumde falha em cirurgia de deslocamento de retina. PVR é caracterizado por formação de membranas fibrovasculares dentro da cavidade vítrea acima e abaixo da retina, causando deslocamento de retina subsequente. Vários fatores contribuem para a progressão de PVR, e TGFβ parece desempenhar um papel pivotal. TGFβ é abundante no vítreo de pacientes PVR, e funções características de TGFβ, como a indução de transição de epitélio para mesênquima (EMT), estímulo de produção de matriz extracelular, contração da membrana celular, e indução de inflamação, são todos fatores negativos na progressão de PVR.

[0484] Para avaliar o efeito de anticorpos da presente revelação,PVR experimental é induzido em um modelo de coelho (Oshima et al., 2002, Gene Ther. 9:1214-1220; Fastenberg et al., Gene Ther. 2002, 9:1214-1220). Coelhos pigmentados adultos são anestesiados com uma injeção intramuscular de isoflurano ou cetamina e xilazina. As pupilas são dilatadas com uma gota de 10% fenilefrina cloridrato, 1% tro- picamida, e 1% atropina sulfato. Um olho de cada coelho é injetado com 5,0 x iθe5 células fibroblastos conjuntivais de coelho em 0,1 mL de solução BSS na cavidade vítrea através de pars plana. Vitrectomia de pars plana irá induzir o modelo PVR. Imediatamente depois, uma injeção única intravítrea de BSS, anticorpo anti-TGFβ (por exemplo, XPA.42.089, XPA.42.681, 5 mg) ou anticorpo controle (por exemplo, anti-KLH-G2) é administrada aos grupos de 10 animais, e opcionalmente repetida semanalmente. Todos os olhos injetados são oftalmos- copicamente avaliados nos dias 1, 3, 5, 7, 10, 14 e 28, com PVR classificados em seis estágios usando os critérios clínicos descritos por Fastenberg et al., Am. J. Ophthalmol. 93:565-572, 1982).Queimadura alcalina na córnea

[0485] Trauma ocular na forma de uma queimadura alcalina à córnea é um problema clínico sério e pode causar vários comprometimentos visuais permanentes e graves. A ativação de células de córnea, ou seja, células de queratócitos e epiteliais, e influxo de células inflamatórias como monócitos/macrófagos, são envolvidos em patogênese de lesão após dano alcalino de tecido na córnea e pode levar aos defeitos epiteliais persistentes. Além disso, a quebra de membrana de emba-samento por metaloproteinases de matriz (MMPs, gelatinases) secre- tadas por estas células contribuem para a ulceração patogênica e per-furação do estroma. Conjuntivalização da superfície da córnea na per- da de células-tronco límbicas junto com opacificação e neovasculari- zação do estroma da córnea todas comprometem a visão do paciente nas fases tardias de cicatrização. Um número de fatores de crescimento e citocinas, incluindo TGF-β, parece estar envolvido na destruição do tecido e cicatrização tardia que ocorre na córnea após a queima alcalina.

[0486] Para avaliar o efeito de anticorpos da presente revelação,um modelo de queimadura alcalina em camundongos é usado (Saika et al., Am. J. Pathol. 2005, 166:1405-18). Resumidamente, três μl de 1 N solução hidróxido de sódio é aplicado ao olho direito dos camundongos adultos C57BL/6 (n = 72) para produzir uma queimadura alcalina na superfície ocular em ambos anestesia tópica e geral. Anticorpos anti-TGF-β (por exemplo, XPA.42.089, XPA.42.681) ou anticorpo controle (por exemplo, anti-KLH-G2) são administrados (n = 24/grupo) em 2 horas e dias 5, 10, e 15 após a exposição alcalina. A coloração por fluoresceína da córnea é usada para visualizar defeitos de superfície (por exemplo, epitélio lesionado). Após a avaliação de fluoresceína na córnea, o globo ocular é enucleado 2 horas após marcação com bromodeoxiuridina e processado para avaliação histológica em parafina ou criosecções nos dias 3, 5, 10, e 20.

Fibrose das lentes

[0487] Após a lesão, as células epiteliais das lentes passam porEMT, que contribui para a formação de tecido fibrótico nas lentes lesi-onadas. Um fenômeno semelhante é observado na cápsula de lente humana após extração de catarata e implantação de uma lente intraocular artificial. Dita reação fibrótica relacionada a EMT é clinicamente desfavorável uma vez que causa opacificação e contração da cápsula da lente anterior, bem como opacificação na cápsula posterior. Humor aquoso do olho contém TGF-β abundante e um papel foi sugerido para TGF-β em EMT relacionada à lesão em células epiteliais da lente.

[0488] Para avaliar o efeito de anticorpos da presente revelação,fibrose córnea experimental é induzida em um modelo de camundongos (Saika, et al., Am J Pathol. 2004, 164:651-663). Camundongos adultos (4 a 6 semanas de idade) são anestesiados com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (70 mg/kg). Uma pequena incisão é feita na cápsula anterior central com a parte de lâmina de uma agulha hipodérmica de calibre 26 através de uma incisão na córnea no olho direito após aplicação tópica de colírios midriáticos e oxibuprocaí- na como anestésicos. Imediatamente depois, anticorpos anti-TGFβ (por exemplo, XPA.42.089, XPA.42.681) ou anticorpo controle (por exemplo, anti-KLH-G2) (n = 24/grupo) são administrados aos olhos duas vezes por semana pela duração do estudo. O olho esquerdo serve como um controle não lesionado. A profundidade da lesão é ~300 μm, ou aproximadamente um quarto do comprimento da parte da lâmina da agulha, que leva à formação de tecido fibrótico ao redor da quebra capsular. Após instilação de pomada de ofloxacina, os animais são deixados cicatrizar por 6 horas a 8 semanas. As células de proliferação são marcadas por uma injeção intraperitoneal de bromodeoxiuridi- na, seguido por sacrifício dos animais 2 horas depois e enucleação de cada olho para análise.Pós-operatório de cirurgia de glaucoma

[0489] O determinante principal de resultado de longo prazo decirurgia de glaucoma à a resposta à cicatrização de ferida. A cicatriza- ção excessiva pós-operatória em nível de locais de conjuntiva e escle- rotomia é associada com controle de pressão pó—operatório fraco. Uso de agentes antiproliferativos 5-fluoruracila (5-FU) e mitomicina C (MMC) em dita cirurgia podem ainda causar morte celular disseminada e apoptose e pode resultar em erosões da córnea e bolhas avascula- res císticas.

[0490] Para avaliar o efeito de anticorpos da presente revelação nestas condições associadas com cirurgia de glaucoma, um modelo de coelho é usado (Mead et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003, 44:3394-3401). Cirurgia de filtração de glaucoma é realizada nos olhos esquerdos de coelhos New Zealand White (12 e 14 semanas de idade) sob anestesia geral (cetamina e xilazina). Uma sutura de tração de córnea com seda 8-0 de espessura parcial é colocada em 12 horas, para ganhar exposição à conjuntiva superior. Uma aba conjuntival baseada em fornix é elevada, e dissecção do espaço subconjuntival é realizado em uma distância de 15 mm atrás do limbo. Uma lâmina MVR é usada para formar um túnel de esclera de espessura parcial, iniciando 4 mm atrás do limbo e continuando até a lâmina ser imediatamente visível no estroma da córnea anterior. Uma cânula intravenosa de calibre 22/25 mm é então passada pelo túnel escleral até a agulha da cânula ser visível na córnea clara. A agulha da cânula entra na câmara anterior, a cânula é avançada para a área pupilar média e a agulha é retirada. Finalmente, a cânula é aparada e chanfrada em sua extremidade escleral de modo que se projete 1 mm do ponto de inserção, e uma sutura de náilon 10-0 é usada para fixar o tubo da superfície escleral. A incisão conjuntival é fechada com duas suturas interrompidas e uma sutura de náilon 10-0 tipo colchão central em uma agulha para gerar um fechamento impermeável à água. Uma gota de sulfato de atropina 1% e betametasona fosfato sódico 0,1%, neomicina sulfato 0,5% pomada é instilada ao fim da cirurgia. Os animais são então aleatoriamente alocados para receber um curso pó—operatório de injeções subconjuntivais (100 μL) de anticorpo anti-TGFβ (por exem-plo, XPA.42.089, XPA.42.681) ou anticorpo controle (por exemplo, an- ti-KLH-G2) (por exemplo, 5 mg/mL; 16/grupo). As injeções subconjun- tivais são administradas nos dias 2, 3, 4, 7, 9, 11, e 14 após cirurgia (dia 0) em anestesia tópica (colírios de proximetacaína cloridrato 0,5%, 1 gota por olho), usando uma agulha de calibre 30. O anticorpo é inje- tado 5 mm atrás do limbo na margem nasal do músculo reto superior. 5-FU é administrado 180° do sítio da cirurgia.

[0491] Medição de pressão intraocular em ambos os olhos é feitacom um tonômetro manual em ambos os olhos após instilação tópica de colírio de 0,5% proximetacaína HCl. A aparência da conjuntiva e a área de drenagem são observadas. Todos os animais são avaliados por um observador mascarado em tempos ajustados após a cirurgia. A avaliação de ambos os olhos (olho não tratado contralateral usado como controle) é feito diariamente dos dias 0 a 4 e, em seguida, em períodos regulares, pelo menos duas vezes ao por semana. Bolhas características, incluindo comprimento, largura, e altura, são medidas com paquímetros, e a pressão intraocular é registrada. As características de vascularidade da bolha de drenagem são graduadas por divisão das áreas conjuntivais e classificadas pela aparência (0, avascular; +1, vascularidade normal; +2, hiperêmica; e +3, muito hiperêmica). Avaliação de lâmpada de fenda é realizada para identificar a atividade da câmara anterior (0, calmas; 1, células; 2, fibrina; e 3, hipopyon) e profundidade da câmara anterior, que é registrado como profunda (+2), raso (+1), ou plana (0). Uma avaliação da epiteliopatia da córnea é realizada após instilação tópica de lignocaína fluoresceína no olho esquerdo e é graduado de acordo com a área afetada (0, nil; 1, <5%; 2, <50%; 3, <75%; 4, <90%; 5, até 100%). A sobrevida da bolha é realizada como o ponto de avaliação de eficácia primário. A falha da bolha é definida como a aparência de uma bolha plana, vascularizada e cicatrizada na presença de uma câmara anterior profunda. Área de bolha e altura, profundidade e atividade da câmara anterior e vascularidade de conjuntiva por quadrante são todos analisados. Os tecidos são ainda processados para avaliação histológica (por exemplo, deposição de colágeno na subconjuntiva) de alguns animais.

[0492] É esperado que anticorpos anti-TGFβ revelados aqui ini- bem a atividade de TGFβ durante incidências fibróticas no olho assim reduzindo a deposição fibrótica e melhorando os sintomas associados com a fibrose dos olhos.

[0493] Várias modificações e variações nas revelações como estabelecidas nos exemplos ilustrativos acima são esperadas ocorrer aos especialistas na técnica. Consequentemente somente ditas limitações como aparecem nas reivindicações anexas podem ser colocadas na revelação.

Claims

1. Anticorpo que se liga ao fator de transformação de cres-cimento beta (TGFβ)1, TGFβ2 e TGFβ3, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada estabelecida em SEQ ID NO: 19;(b) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pe-sada estabelecida em SEQ ID NO: 20;(c) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pe-sada estabelecida em SEQ ID NO: 21;(d) uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve estabelecida em SEQ ID NO: 22;(e) uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve estabelecida em SEQ ID NO: 23; e(f) uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve estabelecida em SEQ ID NO: 24.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada estabelecida em SEQ ID NO: 6 e uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoáci- dos da região variável de cadeia leve estabelecida em SEQ ID N°: 8.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende:uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO: 6 e uma sequência de ami- noácidos da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ ID NO: 8.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que um ou mais aminoácido(s) de estrutura de cadeia pesada foi/foram substituído(s) por aminoáci- do(s) correspondente(s) de outra sequência de aminoácido de anticorpo humano.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada é uma IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificada ou não modificada, um fragmento das mesmas ou combinações das mesmas.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um ou mais aminoácido(s) de estrutura de cadeia leve foram substituídos por aminoácido(s) corres- pondente(s) de outra sequência de aminoácido de anticorpo humano.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região constante de cadeia leve humana fixada à dita região variável de cadeia leve.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que se liga ao TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 com uma afinidade Kd de 10-6 M ou menos.

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo:(i) se liga ao TGFβ 1 e TGFβ2 com afinidade maior que ao TGFβ3; e/ou(ii) neutraliza a atividade de TGFβ 1 e TGFβ2 a um valor maior que TGFβ3.

10. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de CDR ou região variável ou da cadeia pesada ou da cadeia leve como definida em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 9.

11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que com-preende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 10, operavelmente ligada a uma sequência de controle de expressão.

12. Método para produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo o vetor, como definido na reivindicação 11 ou uma molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 10em condições adequadas e recuperar o referido anticorpo.

13. Composição farmacêutica estéril, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

14. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar uma doença, condição ou distúrbio associado com expressão de TGFβ, em que a doença, condi-ção ou distúrbio é selecionado do grupo consistindo em câncer, doenças, condições ou distúrbios oculares, fibroses oftálmicas ou fibrose do olho, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose peribron- quiolar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), doença das vias aéreas pequenas (por exemplo, bron- quiolite obstrutiva), enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI); fibrose pulmonar devido a agentes infecciosos ou tóxicos; fibrose renal, glomerulonefrite (GN) de todas as etiologias, GN proliferativa mesangial, GN imune e GN crescêntica, glomeruloesclerose, lesão tubulointersticial, fibrose intersticial renal, fibrose renal e todas as causas de fibrose intersticial renal, fibrose renal resultante de complicações de exposição ao fárma- co, tratamento com ciclosporina de receptores transplantados, nefro- patia associada a HIV, necropatia de transplante, doença renal diabé- tica (nefropatia diabética), fibrose sistêmica nefrogênica, diabetes, fi-brose retroperitoneal idiopática, escleroderma, fibrose hepática, doenças hepáticas associadas com cicatrização excessiva e esclerose pro-gressiva, cirrose hepática, distúrbios da árvore biliar, disfunção hepática atribuível a infecções, doenças fibrocísticas, doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia dilatada; mio- cardite; fibrose cardíaca de estenose vascular (fibrose cardíaca pós- infarto), pós infarto do miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, doença veno-oclusiva, reestenose, reestenose pós-angioplastia, insuficiência de enxerto arteriovenoso, aterosclerose, hipertensão, doença cardíaca hipertensiva, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, insuficiência cardíaca, doença da aorta, esclerose sistêmica progressiva, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, fasciste, síndrome de Raynaud, artrite reumatoide, doença de Peyronie, esclerose sistêmica, lesão do cordão pós-espinhal, osteoporose, doença de Camurati-Engelmann, doença de Crohn, cicatrizes, síndrome de Marfan, insuficiência ovariana prematura, a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, fibrose devida a incisões cirúrgicas ou trauma mecânico, fibrose associada com cirurgia ocular; e cicatriz hipertrófica ou exces-siva ou formação de queloide na derme que ocorre durante cura de ferimento resultante de trauma ou ferimentos cirúrgicos.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a doença, condição ou distúrbio é uma doença, condição ou distúrbio ocular selecionado do grupo consistindo em distúrbios fibroproliferativos, fibrose do olho, fibroses oftálmicas, disfunção da retina, fibrose associada com disfunção da retina, degeneração macular úmida ou seca, vitreorretinopatia proliferativa, vitreorretinopa- tia de qualquer etiologia, fibrose associada com cirurgia ocular, tal como tratamento de glaucoma, refixação da retina, extração de catarata ou procedimentos de drenagem de qualquer tipo, cicatrização na cór- nea e conjuntiva, fibrose no endotélio da córnea, queimadura alcalina (por exemplo, queimadura alcalina na córnea), fibrose de pós-cirurgia de catarata da cápsula da lente, cicatrização excessiva no tecido ao redor dos músculos extraoculares na cirurgia de estrabismo, catarata subcapsular anterior e opacificação de cápsula posterior, doenças fi- bróticas do segmento anterior do olho, fibrose do estroma corneano (por exemplo, associada com opacificação da córnea), fibrose da rede trabecular (por exemplo, associada com glaucoma), doenças fibróticas de segmento posterior do olho, cicatrização fibrovascular (por exemplo, na vasculatura da retina ou coroide do olho), fibrose retinal, fibrose epirretinal, gliose retinal, fibrose subretinal (por exemplo, associada com degeneração macular relacionada a idade), fibrose associada com pós-cirurgia retinal e glaucoma e descolamento de retina tracional em associação com contração do tecido na retinopatia diabética.

16. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar câncer.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, carcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de próstata, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de rim, ovário câncer, câncer de estômago, câncer fibrótico, glioma e melanoma.

18. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a composição:(i) aumenta o número de células assassinas naturais (NK) em um tumor e/ou melhora a atividade citolítica de células NK;(ii) diminui o número de células T reguladoras em um tumor e/ou inibe a função de células T reguladoras;(iii) aumenta o número de células T citotóxicas (CTLs) em um tumor e/ou intensifica a função CTL;(iv) diminui o número de células supressoras derivadas de mieloide (MDSC) em um tumor e/ou inibe a função MDSC; e/ou(v) diminui o número de células dendríticas (DC) em um tumor e/ou inibe a função tolerogênica de células dendríticas.

19. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar fibrose.

20. Composição compreendendo um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou uma composição far-macêutica, como definida na reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma condição ou distúrbio associado com expressão de TGFβ, selecionado do grupo que consiste em câncer, doenças oculares, condições ou distúrbios, fibrose oftálmica ou fibrose do olho, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose peribronquiolar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), doença das pequenas vias aéreas (por exemplo , bronquiolite obstrutiva), enfisema, síndrome do desconforto respiratório agudo ou adulto (ARDS), lesão pulmonar aguda (LPA); fibrose pulmonar devido a agentes infecciosos ou tóxicos; fibrose renal, glomerulone- frite (GN) de todas as etiologias, GN proliferativa mesangial, GN imune e GN crescente, glomeruloesclerose, lesão tubulointersticial, fibrose intersticial renal, fibrose renal e todas as causas de fibrose intersticial renal, fibrose renal resultante de complicações da exposição ao medicamento, tratamento com ciclosporina de receptores de transplante, ne- fropatia associada ao HIV, necropatia do transplante, doença renal diabética (nefropatia diabética), fibrose nefrogênica sistêmica, diabetes, fibrose retroperitoneal idiopática, esclerodermia, fibrose hepática, doen-ças hepáticas associadas a cicatrizes excessivas e esclerose hepática progressiva, cirrose hepática, distúrbios da árvore biliar, disfunção hepá-tica atribuível a infecções, doenças fibrocísticas, doenças cardiovascula-res, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia dilatada; miocardi- te; estenose vascular, fibrose cardíaca (fibrose cardíaca pós-infarto), pós-infarto do miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, doença veno- oclusiva, reestenose, reestenose pós-angioplastia, insuficiência do en-xerto arteriovenoso, aterosclerose, hipertensão, doença cardíaca hiper- tensiva, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, insuficiência cardíaca, doença da aorta, esclerose sistêmica progressiva, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, fascistas, síndrome de Raynaud, artrite reumatóide, doença de Peyronie, esclerose sistêmica, lesão pós-medula espinhal, osteoporose, doença de Camurati- Engelmann, doença de Crohn, cicatrizes, síndrome de Marfan, insufici-ência ovárica prematura, doença de Alzheimer e doença de Parkinson, fibrose devido a incisões cirúrgicas ou trauma mecânico, fibrose associ-ada a cirurgia ocular; e cicatriz excessiva ou hipertrófica ou formação de quelóide na derme ocorrendo durante a cicatrização de feridas resultante de trauma ou feridas cirúrgicas.