TWI788321B

TWI788321B - 骨靶向抗體

Info

Publication number: TWI788321B
Application number: TW107101790A
Authority: TW
Inventors: 華偉邱; 朴晟惠; 詹姆士史蒂芬諾
Original assignee: 美商健臻公司
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2023-01-01
Also published as: AU2018210270A1; MX2019008549A; UY37576A; WO2018136698A2; IL268114A; SG11201906663VA; KR20230172039A; KR102613463B1; KR20190105236A; WO2018136698A3; MY194819A; US20180208650A1; TW202330597A; JP2020505919A; CA3050884A1; CN111032690B; TWI832600B; EP3571226A2; BR112019013986A2; MX2022008073A

Abstract

提供用一種或多種聚天冬胺酸(聚-D)肽(例如D10序列)修飾的重組和化學接合的抗體及其片段，以改善抗體或片段與骨骼的定位。還揭示製備和使用這些抗體和片段的方法。

Description

骨靶向抗體

【相關申請的交叉引用】

本申請案係請求於2017年1月20日申請的美國臨時申請案62/448,763的優先權，其公開內容藉由引用整體併入本文。

本發明涉及用骨靶向肽修飾的抗體及其用於治療病理生理性骨骼退化的方法。

恰當的骨骼發育和維持是正常健康的重要因素。在普通人中，骨骼發育發生到約20歲左右，此時骨骼密度通常達到其最大值。此後，如果沒有適當的飲食和體力消耗，骨骼密度會降低。然而，正常的骨骼維持要求內穩態骨轉換(homeostatic bone turnover)，其中去除舊骨骼並用新骨骼代替。

然而，存在會影響骨骼發育和維持的許多疾病和病症。例如，骨骼發育在諸如成骨骼不全的疾病中受到影響，其中骨骼強度受損，這導致兒童具有容易破裂的脆性骨骼(fragile bone)。此外，隨著年齡的增長，在其他方面都健康的個體中可能會出現內穩態骨轉換的缺失，導致骨骼質疏鬆，其中骨骼密度隨著時間的推移而受損，且最終導致脆性骨骼和骨折。

更進一步地，存在某些疾病，其中骨骼健康與原發疾病並行受到影響並且涉及其他共患後遺症，例如慢性腎病(CKD)。CKD是一種進行性疾病，其中腎功能隨著時間的推移而下降，通常導致心血管疾病與骨骼健康差和骨轉換率改變相關。已經表明，改善骨骼健康的治療伴隨地緩解了相關的心血管疾病。這些報告提示，正常的骨轉換率可能會對其他疾病造成影響，如果不是其原因的話。因此，用於調節骨骼發育和/或維持的改進方法可能對改善患有多種不同疾病和病症的個體的健康具有廣泛的直接或間接影響。

TGFβ是轉化生長因子-β(TGFβ)超家族的成員，並且在哺乳動物發育過程中在骨形成中是重要的(參見Chen等，Int.J.Biol.Sci.8(2)：272-88(2012))。TGFβ對於內穩態骨骼維持似乎同樣重要。有趣的是，TGFβ已被證明在CKD患者中以更高水平表現，提示它是治療性干預的可行目標。用抗TGFβ抗體對CKD的jck小鼠模型的全身性治療表現出高骨轉換率的降低(Liu等人，J.Bone Miner Res.29(5)：1141-57(2014))。然而，該研究沒有調查抗TGFβ抗體在骨中的定位可以改善治療功效的程度。鑒於TGFβ參與包括DNA損傷反應、過敏性的免疫反應和傷口上皮形成(這裡僅列舉了幾個)等細胞過程，用於控制TGFβ活性的更具針對性的方法是期望的，以最小化潛在的不期望的副作用。因此，需要更精確的調節TGFβ活性的方法來提供用於調節骨骼發育和/或維持的改善的治療。

本文提供了有效靶向骨的抗體，如抗TGFβ抗體。在第一方面，本揭示內容提供了包含重鏈、輕鏈和一個或多個聚天冬胺酸(聚-D)肽的抗體或其抗原結合片段。在一個特定的具體實例中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈、輕鏈和與重鏈和/或輕鏈的C-末端連接的一個或多個聚天冬胺酸(聚-D)肽。

在一個具體實例中，與具有相同重鏈和輕鏈但缺少所述一個或多個聚-D肽的抗體相比，所述抗體或其抗原結合片段對骨骼的定位(localization to bone)至少增加2倍。

在一個具體實例中，一個或多個聚-D肽通過化學接合連接至抗體或其抗原結合片段。在另一個具體實例中，所述一個或多個聚-D肽在重鏈的鉸鏈區連接。在另一個具體實例中，所述一個或多個聚-D肽連接至輕鏈的N-末端或C-末端。在又一個具體實例中，一個或多個聚-D肽藉由一個或多個PEG間隔子連接至抗體或其抗原結合片段。

在一個具體實例中，一個或多個聚-D肽與重鏈的胺基酸序列是整合的和/或一個或多個聚-D肽與輕鏈的胺基酸序列是整合的。與胺基酸序列“整合”的聚-D肽被包括在相同多肽鏈中。例如，整合聚-D肽可以從與重鏈或輕鏈序列相同的RNA鏈轉譯，所述重鏈或輕鏈序列可以由重組DNA質體編碼。在一個具體實例中，一個或多個聚-D肽與重鏈的N-末端整合和/或一個或多個聚-D肽與重鏈的C-末端整合。兩個或更多個聚-D肽可以串聯連接至重鏈的N-末端或C-末端，被零個、一個或多個其他胺基酸殘基(即，非天冬胺酸胺基酸)或肽接頭(linker)分隔開。在另一個具體實例中，一個或多個聚-D肽與輕鏈的N-端整合和/或一個或多個聚-D肽與輕鏈的C-端整合。例如，兩個或更多個聚-D肽可以串聯連接至輕鏈的N-末端或C-末端，被零個、一個或多個其他胺基酸殘基(即非天冬胺酸胺基酸)或肽接頭分隔開。在一個具體實例中，一聚-D肽與重鏈的C-末端整合。在另一個具體實例中，一聚-D肽與重鏈的C-末端整合，並且一聚-D肽與重鏈的N-末端整合。

在一個具體實例中，輕鏈不包含聚-D肽。在另一個具體實例中，重鏈不包含聚-D肽。

在一個具體實例中，所述一個或多個聚-D肽各自獨立地包含2-30個天冬胺酸殘基。例如，聚-D肽可以包括2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27或 28或29或30個天冬胺酸殘基。在另一個具體實例中，所述一個或多個聚-D肽各自獨立地包含6、7、8、9、10或11個天冬胺酸殘基。在另一個具體實例中，所述一個或多個聚-D肽各自包含10個天冬胺酸殘基；這樣的肽在本文中被稱為“D10”(SEQ ID NO：1)。

在另一個具體實例中，抗體是同種型IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂、IgM、IgE或IgD中的任一種。在另一個具體實例中，抗體是IgG₁或IgG₄同種型。在另一個具體實例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種，例如人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。

在一個具體實例中，考慮具有一個或多個聚天冬胺酸(聚-D)肽的抗體片段。可以設想，與相同的、但缺少一個或多個聚-D肽的抗體片段相比，所述抗體片段在骨中的定位增加至少2倍。抗體片段可以是以下的任何或組合：Fab、F(ab’)₂、單特異性Fab₂、雙特異性Fab₂、三特異性Fab₃、單價IgG、scFv、雙特異性雙抗體、三特異性三抗體、scFv-sc、微型抗體(minibody)、IgNAR、V-NAR、hcIgG或VhH。在一個具體實例中，抗體片段結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種，例如人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。本文的抗體或抗體片段可以完全是人的、是人源化的或是嵌合的。

第二方面，本揭示內容提供了產生靶向骨的抗體或其抗原結合片段的方法，其包括以下步驟：提供抗體重鏈，提供抗體輕鏈，提供與重鏈連接的一個或多個聚-D肽和/或與輕鏈連接的一個或多個聚-D肽，並將所述重鏈和輕鏈組合以產生靶向骨的抗體或其抗原結合片段。

在一個具體實例中，連接至重鏈的一個或多個聚-D肽和/或連接至輕鏈的一個或多個聚-D肽藉由化學接合連接。在另一個具體實例中，藉由重組連接與重鏈連接的一個或多個聚-D肽和/或與輕鏈連接的一個或多個聚-D肽。

第三方面，本揭示內容提供靶向骨的抗TGFβ抗體，其包括包含SEQ ID NO：2、3、4和5中任一者所示的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：6、7、8、11和12中任一者所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是當輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：6時所述重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：2。

第四方面，本揭示內容提供靶向骨的抗TGFβ抗體，其包括包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一者所示的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：15、18、19、20、21和22中任一者所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是當輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時所述重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。

第五方面，本揭示內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F6)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第六方面，本公開內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F16)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第七方面，本揭示內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F11)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第八方面，本揭示內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：17 的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F17)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第九方面，本揭示內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F12)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第十方面，本揭示內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F7)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第十一方面，本揭示內容提供了人IgG₄抗體，其包括包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈(例如，mAb2 F2)。該抗體特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在一個具體實例中，該抗體特異性結合TGFβ1。

第十二方面，本揭示內容提供了靶向骨的抗TGFβ抗體，其包括包含由SEQ ID NO：23、24、25和26中任一者所示的核酸序列編碼的胺基酸序列的重鏈，和包含由SEQ ID NO：27、28、29、30、31和32中任一者所示的核酸序列編碼的胺基酸序列的輕鏈，條件是當輕鏈胺基酸序列由SEQ ID NO：27所示的核酸序列編碼時重鏈胺基酸序列不由SEQ ID NO：23中所示的核酸編碼。

第十三方面，本揭示內容提供了一種人IgG₄抗體，其包括包含由SEQ ID NO：25所示的核酸序列編碼的胺基酸序列的重鏈和包含由SEQ ID NO：27所示的核酸序列編碼的胺基酸序列的輕鏈。該抗體特異性結合TGFβ1， TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。

第十四方面，本揭示內容提供了一種人IgG₄抗體，其包括包含由SEQ ID NO：26所示的核酸序列編碼的胺基酸序列的重鏈和包含由SEQ ID NO：27所示的核酸序列編碼的胺基酸序列的輕鏈。該抗體特異性結合TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。

第十五方面，本揭示內容提供了用於治療個體的骨流失(bone loss)的方法，其包括向個體施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗體或其抗原結合片段並檢測TGFβ水平的降低、TGFβ活性的降低、骨流失的降低、骨流失率的降低、骨密度的增加、骨強度的增加以及IL-11水平的降低中的至少一項。

在一個具體實例中，該個體是人。在另一個具體實例中，抗TGFβ抗體或抗體片段特異性結合TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。在另一個具體實例中，抗TGFβ抗體包含重鏈、輕鏈和一個或多個聚天冬胺酸(聚-D)肽。與具有相同重鏈和輕鏈但缺少所述一個或多個聚-D肽的抗體相比，該抗體在對骨的定位方面至少增加2倍。在一個具體實例中，抗體是同種型IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂、IgM、IgE和IgD中的任一種。在另一個具體實例中，抗體是IgG₁或IgG₄同種型。在一個具體實例中，個體患有慢性腎病和/或骨病，包括癌症轉移至骨。骨病可以是成骨不全或骨質疏鬆。在一個具體實例中，靶向骨的抗TGFβ抗體或抗體片段的有效量通過皮下、靜脈內或肌內施用。

第十六方面，本揭示內容提供了包含本發明的抗體或抗原結合片段和藥學上可接受的載體的醫藥組成物。例如，該抗體可以包括包含SEQ ID NO：2、3、4和5中任一所示的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO：6、7、8、11和12中任一所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是當輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：6時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：2。在另一個具體實例中，抗體可以包括包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一所示的胺基酸序列的重鏈；和包含SEQ ID NO：15、18、19、29、21和22中任一所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是當所述輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時，所述重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。

第十七方面，本揭示內容提供了分離的核酸分子，其包括編碼靶向骨的抗TGFβ抗體的重鏈、輕鏈或兩者的核酸序列，其中所述抗TGFβ抗體的重鏈包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一所示的胺基酸序列，並且所述抗TGFβ抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：15、18、19、20、21和22中任一所示的胺基酸序列，條件是當輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。

第十八方面，本揭示內容提供了表現載體，其包括編碼靶向骨的抗TGFβ抗體的重鏈、輕鏈或兩者的核酸序列，其中所述抗TGFβ抗體的重鏈包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一所示的胺基酸序列；並且所述抗TGFβ抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：15、18、19、20、21和22中任一所示的胺基酸序列，條件是當輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。

第十九方面，本揭示內容提供了包含一種或多種表現載體的宿主細胞，所述表現載體包括編碼靶向骨的抗TGFβ抗體的核酸序列，其中所述抗TGFβ抗體的重鏈包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一所示的胺基酸序列；並且所述抗TGFβ抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：15、18、19、20、21和22中任一所示的胺基酸序列，條件是當輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。在一個具體實例中，宿主細胞是哺乳動物細胞或原核細胞。在另一個具體實例中，宿主細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或大腸桿菌(Escherichia coli)(E.coli)細胞。

第二十方面，本揭示內容提供了產生靶向骨的抗TGFβ抗體或其抗原結合片段的方法。該方法包括在允許產生所述抗體或其抗原結合片段的條件下培養宿主細胞。所述宿主細胞包含(i)編碼包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一所示的胺基酸序列的重鏈的核酸序列；和(ii)編碼包含SEQ ID NO：15、18、19、29、21和22中任一所示的胺基酸序列的輕鏈的核酸序列，條件是輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。在一個具體實例中，所述方法還包括將所述抗體或其抗原結合片段配製成包含可接受載體的醫藥組成物。

第二十一方面，本揭示內容提供了包含靶向骨的抗TGFβ抗體的醫藥組成物。靶向骨的抗TGFβ抗體包括包含SEQ ID NOS：2、3、4和5中任一所示的胺基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NOS：6、7、8、11和12中任一所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是當所述輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：6時，所述重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：2，或者靶向骨的抗TGFβ抗體包括包含SEQ ID NO：13、14、16和17中任一所示的胺基酸序列的重鏈，和包含SEQ ID NO：15、18、19、29、21和22中任一所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是當所述輕鏈胺基酸序列是SEQ ID NO：15時，所述重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。在一個具體實例中，醫藥組成物配製成液體藥物產品。在另一個具體實例中，醫藥組成物被配製成凍乾藥物產品。

第二十二方面，本公開內容提供了靶向骨的抗TGFβ抗體。該抗體的重鏈包含：包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HCDR1)，包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的HCDR3。該抗體的輕鏈包含：包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LCDR1)，包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的LCDR3。並且，該抗體還包含在重鏈的N-末端、重鏈的C-末端、輕鏈的N-末端和輕鏈的C-末端中的一者或多者處的D10多肽。

第二十三方面，本揭示內容提供了靶向骨的抗TGFβ抗體，其中所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：39中的重鏈互補決定區(CDR)1-3以及SEQ ID NO：40中的輕鏈CDR1-3，其中所述抗體進一步包含在重鏈的N-末端、重鏈的C-末端、輕鏈的N-末端和輕鏈的C-末端中一者或多者處的D10多肽。在一些具體實例中，抗體包含含有SEQ ID NO：39的胺基酸序列的重鏈可變結構域(V_H或HCVD)和含有SEQ ID NO：40的胺基酸序列的輕鏈可變結構域(V_L或LCVD)。

第二十四方面，本揭示內容提供了多核苷酸序列，其編碼：靶向骨的抗TGFβ抗體，其中所述抗體的重鏈包含包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的HCDR3，所述抗體的輕鏈包含包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的LCDR3，並且所述抗體還包含在重鏈的N-末端、重鏈的C-末端、輕鏈的N-末端和輕鏈的C-末端中一者或多者處的D10多肽；或靶向骨的抗TGFβ抗體，其中所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：39中的重鏈互補決定區(CDR)1-3和SEQ ID NO：40中的輕鏈CDR1-3，其中所述抗體還包含在重鏈的N-末端、重鏈的C-末端、輕鏈的N-末端和輕鏈的C-末端中一者或多者處的D10多肽。

第二十五方面，本揭示內容提供了用於本文所述的治療方法的本發明的骨靶向抗體，諸如骨靶向抗TGFβ抗體或抗原結合片段。

第二十六方面，本揭示內容提供了本發明的骨靶向抗體，例如骨靶向抗TGFβ抗體或抗原結合片段，在製備用於本文所述的治療方法的藥物中的用途。

下面進一步描述在此考慮的特定具體實例。本發明的上述和其他特徵和優點將從以下對本發明的詳細描述連同所附的請求項中更充分地理解。應該注意的是，請求項的範圍由其中的敘述來定義，而不是由本說明書中所闡述的特徵和優點的具體討論內容來定義。

圖1描繪了與抗TGFβ(α-TGFβ)抗體化學接合的D10肽。

圖2描繪了將帶有接頭(肽接頭)和馬來醯亞胺官能團的肽化學接合至鼠IgG1抗體上還原性鉸鏈區二硫鍵(reduced hinge region disulfide)的過程。

圖3A描繪了D10肽-接頭與抗TGFβ鼠IgG1，mAb1的化學接合物的還原性SDS-PAGE凝膠。上面的帶表示重鏈，而下面的帶表示輕鏈。

圖3B描繪了實施例1的化學接合反應中肽對抗體比率(PAR)值與肽-馬來醯亞胺：mAb比率，其顯示隨著肽數量增加至8mol：mol PAR，PAR線性增加。

圖4A-4G描繪了TGFβ1與D10肽與曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin®)或抗TGFβ抗體mAb1的化學接合物的1：1莫耳混合物的尺寸排阻層析。圖4A描繪了D10肽與mAb1的化學接合物的SEC譜。圖4B描繪了mAb1-D10化學接合物與TGFβ1的1：1莫耳混合物的SEC譜。圖4C描繪了未修飾的mAb1的SEC譜。圖4D描繪了mAb1與TGFβ1的1：1莫耳混合物的SEC譜。圖4E描述了Herceptin®的SEC譜。圖4F描繪了D10肽與Herceptin®的化學接合物的SEC譜。圖4G描繪了D10與Herceptin®的化學接合物與TGFβ1以1：1比例混合的SEC譜。

圖5A描繪了來自mAb1和D10-mAb1接合物的羥基磷灰石層析的A₂₈₀跡線(x軸=分鐘，y軸=吸光度(標準化的))。

圖5B描繪了來自流通物(FT)和峰4的級分的SDS-PAGE凝膠。

圖6A描繪了具有增加數量的肽的化學接合物的羥基磷灰石層析。顯示了每種接合物洗脫液在280nm處的吸光度(x軸=分鐘，y軸=吸光度(標準化的))。

圖6B描繪了如通過SDS-PAGE測定，結合的分析物的分數(上方曲線，圓形，左側標尺)和保留時間(下方曲線，三角形，右側標尺)作為接合的肽的數量的函數。

圖7描述了與未修飾的mAb1相比，用對照接合物(PAR=0)和具有平均4或9個肽的接合物用A549細胞進行的體外TGFβ中和測定。

圖8A描繪了含有約4.5個肽的1mg/kg(1mpk)的螢光團標記的mAb1和化學接合物的時間依賴性生物分佈。在每個小圖中指示動物成像的時間。每張照片，左鼠接受mAb1，右鼠接受化學接合物。圖像強度已經調整以揭示分佈的差異。

圖8B描繪了在圖8A所示的圖像中對應於股骨遠端(distal femur)的感興趣區域和對應於心臟的感興趣區域中發現的螢光的比率。圓形對應於mAb1抗體，正方形對應於與mAb1接合的D10肽(D10mAb1)。

圖9A圖解描繪了IgG亞型抗體上D10肽的可能位置，用於產生有待通過使用重組方法將D10肽連接至重鏈和/或輕鏈末端而獲得的一系列mAb1融合變體抗體。D10肽的添加位點用圓圈表示，肽接頭序列的用法用波浪線表示。

圖9B描繪了通過放置肽衍生的一系列融合變體抗體(融合變體)，如圖9A所示。產生了具有連接位置和肽數目的多種組合的重組融合變體。為了清楚起見，每個圖表下方的較小數字表示在本文中提及的每種重組融合變體的身份。如本文所提及的，融合變體用“融合”或“F”指代，然後預期的變體編號。例如，“融合1”和“F1”都是指具有抗體“1”的構型沒有D10肽的抗體。

圖10描繪了在還原性(上方凝膠)或非還原性(下方凝膠)條件下所示的純化的重組mAb1融合變體的SDS-PAGE。

圖11描繪了通過差示掃描螢光測定法(DSF)測定的重組mAb1融合變體的熱穩定性。通過染料螢光的增加來檢測在每個溫度下向部分變性形式的轉變。計算螢光隨溫度升高的斜率(-d(RFU)/dT))並相對於樣品溫度顯示。在代表熱轉變的中點(Tm)的曲線的最小值處，變性率最大。作為參考，圖解顯示了每種重組mAb1融合變體的結構。

圖12A和12B描繪了通過圖9B中示意性顯示的八種重組mAb1融合變體在體外通過A549細胞對TGFβ引發IL-11產生的中和作用。

圖13描繪了重組mAb1融合變體和mAb1化學接合物對羥基磷灰石的親和力，如通過陶瓷羥基磷灰石柱上的柱層析評估的。

圖14描繪了在施用後不同時間通過實時成像獲得的CD-1小鼠中所選擇的螢光團標記的重組mAb1融合變體和mAb1化學接合物的生物分佈。

圖15描繪了施用於CD-1小鼠後，螢光染料標記的抗體/重組mAb1融合變體和mAb1化學接合物定位至脊柱的量。通過IVIS儀器在3周內測量螢光。顯示ROI內最大螢光的對數。

圖16描繪了在10和21天之後，在實施例13和圖15中描述的研究中，施用重組mAb1融合變體mAb1F6、mAb1F16和mAb1F17和mAb1化學接合物(“Conj”)的小鼠的切除的脊柱和股骨的螢光圖像。

圖17A和17B描繪了如實施例15中所述在24和96小時後10μL血清中的mAb2F1和mAb2F6的螢光水平，以及切除的脊柱的腰部部分、遠端(小梁) 股骨、腎和心臟。

圖18A顯示經由mAb1-D10(mAb1F6)的骨靶向在單次劑量施用後顯著影響血清PK。如通過ELISA所測量的，mAb1 F6顯示比mAb1低13至14倍的血清暴露(AUC)、更快的血清清除率和更短的血清半衰期(t_1/2)。數據表示為平均值±SD：通過方差分析(AVOVA)，Dunnet氏多重比較檢驗測量，觀察到統計顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比)。mAb1是鼠源化抑制性抗TGFβ單株抗體，而mAb1F6是具有連接到mAb1重鏈C-末端的天冬胺酸多肽D10的重組鼠源化抑制性抗TGFβ單株抗體。成像/骨的AUC標準化為1.0。每種mAb1 F6和mAb1的劑量為5mg/kg。

圖18B顯示與mAb1相比，通過光學成像測量的mAb1F6展現出在骨中高22倍的暴露(AUC)。數據表示為平均值±SD：通過AVOVA，Dunnet氏多重比較檢驗測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比)。每種mAb1 F6和mAb1的劑量為1mg/kg。

圖19示出了多劑量峰穀PK曲線。骨靶向(通過mAb1F6)顯著影響多劑量峰穀血清PK。mAb1 F6在給藥後24小時和48小時以及第一次劑量和劑量23後均表現出比mAb1更低的血清濃度。在24小時mAb1 F6的倍數差異較低為3至4.5倍，並且在48小時為6至9倍。mAb1 F6的積聚也少於mAb1。數據表示為平均值±SD：通過非配對t檢驗測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比)。通過質譜法測量血清濃度。

圖20顯示在G610C(OI)小鼠中骨靶向(mAb1F6)和mAb1以劑量響應方式增加BV/TV(%)。對於兩種處理，在1和5mg/kg的劑量下均觀察到與對照抗體13C4(小鼠IgG1抗體)處理的G610C小鼠相比BV/TV(%)的顯著變化。與WT背景菌株(WT 13C4)相比，用13C4(13C4)處理的G610C小鼠表現出BV/TV的顯著降低。數據表示為平均值±SD：通過單因素ANOVA測量，觀察到統計顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比；^#p

0.05 13C4與WT13C4相比)。BV/TV(%)經由μCT成像測量。

圖21顯示在G610C(OI)小鼠中骨靶向(mAb1F6)和mAb1以劑量響應方式增加最大破壞力(maximum force to failure)。對於mAb1 F6在1和5mg/kg，並且對於mAb1僅在5mg/kg下，觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比，最大破壞力的顯著變化。與WT背景菌株相比，用抗體對照(13C4)處理的G610C小鼠表現出最大破壞力的顯著下降。數據表示為平均值±SD：通過單因素ANOVA測量，觀察到統計顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比、^#p

0.05 13C4與WT13C4相比)。通過生物力學壓縮測試測量最大破壞力。

圖22顯示mAb1和mAb1F6對G610C小鼠中BV/TV的作用。以5mg/kg以不同頻率(每週3次，每週1次，每2周1次，或每4周1次)給藥抗體12周。使用抗體13C4作為對照。通過單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1 F6與mAb1比較；^#p

0.05 13C4與WT 13C4相比)。BV/TV通過μCT成像測量。

圖23顯示了mAb1和mAb1 F6對G610C小鼠中的最大破壞力的影響。以5mg/kg以不同頻率(每週3次，每週1次，每2周1次，或每4周1次)給藥抗體12周。使用抗體13C4作為對照。通過單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1或mAb1F6與13C4相比)。通過生物力學壓縮測試測量最大的破壞力。

圖24顯示mAb1和mAb1 F6對G610C小鼠中的BV/TV(%)和抗體的平均血清水平的影響。抗體以5mg/kg每2周給藥1次或每週給藥1次持續12周。使用抗體13C4作為對照。通過單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1或mAb1 F6與13C4相比；^#p

0.05 13C4與WT13C4相比)。通過μCT成像測量BV/TV(%)。

圖25顯示了mAb1和mAb1 F16對G610C小鼠中BV/TV(%)的影響。抗體以5mg/kg每週3次給藥8周。使用抗體13C4作為對照。通過單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1或mAb1 F16與13C4相比；^#p

0.05 13C4與WT13C4相比)。通過μCT成像測量BV/TV(%)。

圖26顯示了mAb1和mAb1 F11對野生型小鼠中BV/TV(%)的影響。抗體以5mg/kg每週3次給藥9周。通過單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1或mAb1 F11與13C4相比)。通過μCT成像測量BV/TV(%)。

圖27顯示接受載體或螢光標記的mAb1或mAb1F6的單次腹膜內劑量後野生型小鼠的腰部的總輻射效率。如藉由單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比)。

圖28顯示接受載體或螢光標記的mAb1或mAb1F6的單次腹膜內劑量後野生型小鼠的心臟的總輻射效率。如藉由單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比)。

圖29顯示接受載體或螢光標記的mAb1或mAb1F6的單次腹膜內劑量後野生型小鼠的肝臟的總輻射效率。如藉由單因素ANOVA測量，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1F6與mAb1相比)。

圖30顯示在接受載體或螢光標記的mAb1或mAb1F6的單次腹膜內劑量後野生型小鼠的腸道(intestine)中的總輻射效率。

圖31顯示了在接受螢光標記的mAb2或mAb2 D10的單次腹膜內劑量後24小時或96小時，野生型小鼠的指定組織中的總輻射效率。如藉由t檢驗所測量的，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb1與mAb1F6相比)。

圖32顯示在接受螢光標記的mAb2或mAb2 D10的單次腹膜內劑量後24小時或96小時，野生型小鼠的腰部/血清總輻射效率比。

圖33顯示在接受螢光標記的mAb2或mAb2 D10的單次腹膜內劑量後24小時或96小時，野生型小鼠的股骨/血清總輻射效率比。如通過t檢驗所測量的，觀察到統計學顯著性(*p

0.05 mAb2 D10與mAb2相比)。

本發明提供了與一種或多種骨靶向聚-D肽相連的抗體及其抗原結合片段，使得所述抗體和片段優先安置於(home to)有需要的患者的骨中。這樣的抗體或片段的骨靶向特徵允許該抗體和片段特異性地靶向骨組織，並減少患者對抗體或片段的全身暴露，從而增強了藥物的功效，同時使不希望的不良副作用最小化。

如本文所用，術語“聚-D肽”是指具有多個天冬胺酸(aspartic acid)或天冬胺酸(aspartate)或“D”胺基酸例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多個天冬胺酸胺基酸(殘基)的肽序列。在一個具體實例中，聚-D肽可以包括約2至約30，或約3至約15，或約4至約12，或約5至約10，或約6至約8，或約7至約9或約8至約10，或約9至約11，或約12至約14個天冬胺酸殘基。在一個具體實例中，聚-D肽僅包含天冬胺酸殘基。在另一個具體實例中，聚-D肽可以包括一種或多種其他胺基酸或類似化合物。如本文所使用的，術語“D10”是指10個天冬胺酸胺基酸的連續序列，如SEQ ID NO：1所示。

聚-D肽可以通過重組技術或化學接合連接至目的抗體或抗原結合片段。如本文所用，術語“融合變體”或“變體”是指組裝的抗體構築體(參見圖9B)，其包括重鏈或輕鏈或抗體片段或子部分中的至少一種，其摻入或以其他方式關聯聚-D肽，如D10序列。例如，聚-D肽可以通過重組技術(例如，其中聚-D肽序列與重鏈、輕鏈或抗體片段或子部分的胺基酸序列整合)、化學接合或兩者與融合變體中的抗體鏈連接。

如本文所用，術語“化學接合物”是指組裝的抗體，其包括至少一個重鏈或輕鏈或抗體片段或子部分，一個或多個聚-D肽與之通過與例如存在於重鏈、輕鏈、抗體片段或子部分的胺基酸序列中的半胱胺酸殘基的化學反應而連接。可以在接合中的聚-D肽和抗體組分之間使用間隔子，例如肽接頭或化學部分(例如，馬來醯亞胺官能團和聚乙二醇(PEG))。

如本文所用，術語“整合(integral)”是指經由重組技術整合聚-D肽與抗體鏈，使得聚-D肽從與抗體鏈相同的RNA轉錄物轉錄並存在於與抗體鏈相同的多肽序列中。在這種情況下，聚-D肽可以在抗體鏈的一端或兩端、在有或沒有任何肽接頭或胺基酸間隔子的情況下連接至抗體鏈，或者在抗體鏈內部整合，而不影響抗體鏈的正確折疊和抗體分子的組裝。

示例性骨靶向抗體及其抗原結合片段

本發明公開了具有與其連接的一個或多個聚-D(聚天冬胺酸或聚-Asp)肽(例如D10序列)的抗體和抗原結合片段。這些修飾的抗體和片段具有改善的對骨的定位。在一個特定的具體實例中，這些抗體是如本文所述的抗TGFβ抗體。儘管不希望受理論束縛，但認為用一種或多種聚-D肽有效靶向抗TGFβ抗體可以提供一種新的療法用於患有以與TGFβ相關的病理生理性骨骼退化為特徵的疾病的個體。

然而，雖然本文中許多具體實例和實施例在使用α-TGFβ抗體和D10序列的背景中表現，但預期可以類似地修飾與骨形成或維持相關的蛋白質結合的抗體或其它蛋白質，並且可以使用其他骨定位或靶向肽。

如本文所用，術語“α-TGFβ抗體”和“抗-TGFβ抗體”可互換使用，並且是指對TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3特異性的抗體或其抗原結合片段。例如，α-TGFβ抗體或其抗原結合片段的至少一個抗原結合位點(或互補位)與人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3上發現的表位結合。

在一個具體實例中，可以藉由化學接合產生預期的α-TGFβ抗體-D10構築體。例如，化學接合可以藉由本領域已知的方法進行，例如在美國專利號7,763,712、4,671,958和4,867,973中公開的那些方法，其每一個藉由引用併入本文。在另一個實例中，肽或其他接頭可以用於將D10肽連接至抗體(參見圖1和2)。在另一個具體實例中，減少抗體的鉸鏈區(例如鉸鏈區半胱胺酸殘基)處的巰基允許使用PEG間隔子化學接合聚-D肽。類似地，所預期的抗體和抗體片段的其他半胱胺酸殘基(對於抗體和片段是天然的或通過誘變引入的)可以與聚-D肽化學接合。在圖2中說明了一種這樣的與D10肽化學接合的αTGFβ抗體的組裝流程。

在另一個具體實例中，可以藉由重組表現來創造預期的α-TGFβ抗體-D10構築體，其中將D10序列添加到α-TGFβ抗體的重鏈和/或輕鏈的胺基酸序列。例如，可以修飾編碼重鏈和/或輕鏈的胺基酸序列的核酸序列以編碼將在α-TGFβ抗體的重鏈和/或輕鏈的N-末端、C-末端、或N-末端和C-末端兩者表現的D10序列。類似地，可將一個或多個D10序列添加至鉸鏈區處或附近的抗體重鏈的胺基酸序列和/或抗體輕鏈的胺基酸序列內。攜帶D10的重鏈和/或輕鏈的每個核酸序列可以摻入表現載體中，隨後轉染到能夠表現核酸序列並將其轉譯成相應的胺基酸序列的宿主細胞中。此外，宿主細胞能夠藉由將重鏈和輕鏈中的每一個與其互補序列組合來將所表現的胺基酸序列組裝成功能性蛋白質，從而形成α-TGFβ抗體-D10構築體。所考慮的重組α-TGFβ抗體-D10融合變體的實例在圖9A和9B中說明。

儘管本文討論了聚-D肽，但也可使用其他類似的肽來使抗體、另一種蛋白質或肽能夠靶向骨。例如，天冬胺酸重複序列可具有比D10序列更多或更少的殘基，例如約2，或約4，或約6，或約8，或約12，或約14，或約16，或約18或約20，或約30，或6、7、8、9、10或11個殘基等。此外，具有相似化學性質的其他天然胺基酸，例如谷胺酸，或非天然胺基酸和/或其他化學等效化合物也可以替代或與天冬胺酸組合使用。

在一個具體實例中，預期具有與其連接的一個或多個聚-D肽的抗體與沒有所述一個或多個聚-D肽的相同抗體相比，將表現出至少約2倍，或約3倍，或約5倍，或約10倍，或約20倍增加的向骨的定位。

此外，雖然本文描述了α-TGFβ抗體，但是根據預期，可以類似地修飾任何結合參與骨形成或骨維持的其他蛋白質的抗體以將抗體靶向骨。本文考慮的抗體或其抗原結合片段可以來自任何物種或代表組合了來自不同物種的重鏈和輕鏈的雜合抗體，並且可以對任何期望的表位具有特異性。另外，本文中可以使用的抗體不受同種型的限制，並且可以是IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂、IgM、IgE或IgD中的任一種。也可以使用抗體片段。例如，可以將D10序列或其他骨靶向化合物連接至Fab和/或Fc片段或任何其它抗體片段以獲得如本文所述的期望結果。此外，D10序列可以連接到scFv片段和其他類似的融合蛋白。在另一個具體實例中，可以將D10序列連接到具有S228P核心-鉸鏈突變的抗體(根據EU編號系統編號；或者根據Kabat系統的S241P；參見Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,4^th ed.,United States Government Printing Office,165-492(1987)；和Silva等Jour.Biol.Chem.290：5462-5469(2015))。

在進一步的具體實例中，本文考慮的抗體和/或其他蛋白質可以與另外的分子接合。例如，本文考慮的抗體或其他蛋白質可以與化學標記接合，所述化學標記物允許在注射或以其他方式引入受試者時追蹤抗體/蛋白質。例如，可以將放射性標記、螢光化合物等附著到抗體/蛋白質上以幫助它們的體內追蹤。此外，本文考慮的抗體和/或其它蛋白質還可以與具有治療效果的另外的化合物例如小分子、藥物、抗腫瘤劑、生長激素、維生素等接合，使得抗體和/或其他蛋白質可以用作一種或多種這種化合物的載體。

在一些具體實例中，骨靶向性抗TGFβ抗體包含含有SEQ ID NO：2、3、4和5中任一者所示的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO：6、7、8、11和12中任一者所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是在輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：6時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：2。示例性抗體是mAb1 F3、mAb1 F4、mAb1 F5、mAb1 F6、mAb1 F8、mAb1 F9、mAb1 F10、mAb1 F11、mAb1 F13、mAb1 F14、mAb1 F15、mAb1 F16、mAb1 F18、mAb1 F19和mAb1 F20(表1)。

在一些具體實例中，骨靶向性抗TGFβ抗體包含含有SEQ ID NOS：13、14、16和17中任一者所示的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NOS：15、18、19、20、21和22中任一者所示的胺基酸序列的輕鏈，條件是在輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：15時，重鏈胺基酸序列不是SEQ ID NO：13。示例性抗體是mAb2 F3、mAb2 F4、mAb2 F5、mAb2 F6、mAb2 F8、mAb2 F9、mAb2 F10、mAb2 F11、mAb2 F13、mAb2 F14、mAb2 F15、mAb2 F16、mAb2 F18、mAb2 F19和mAb2 F20(表7)。

在一些具體實例中，本發明的抗體，如抗TGFβ抗體，在重鏈中不具有C-末端賴胺酸。C-末端賴胺酸可以在製備期間或藉由重組技術(即，重鏈的編碼序列不包括C-末端賴胺酸的密碼子)被去除。因此，在本發明內考慮的還有包含的SEQ ID NO：2或13的重鏈胺基酸序列不含C-末端賴胺酸的抗體。聚-D肽可以連接到具有或不具有C-末端賴胺酸的重鏈的C-末端。

治療方法

在一個特定的具體實例中，治療個體如人類患者與TGFβ相關的骨流失的方法包括向個體施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗體。該方法可以進一步包括測量或檢測TGFβ水平或活性降低、骨流失或骨流失率降低、骨密度增加和/或骨強度增加的步驟。

如本文所用，“有效量”是指當施用於有需要的個體時改善個體的健康的治療劑(例如α-TGFβ抗體或抗體片段)的量，比如，例如，通過降低與骨相關的TGFβ水平或活性、降低骨流失或骨流失率、增加骨密度和/或增加骨強度。

如本文所用，術語“個體”是指動物。個人的實例包括但不限於人、家養動物、家庭寵物和其他動物。個體的其他例子包括具有與TGFβ相關的骨病的動物。

在另一個具體實例中，涵蓋藥物抗體製劑或組合物，其包括含有一種或多種骨靶向抗TGFβ抗體如化學接合物或重組融合變體的含水液體藥物產品製劑和凍乾藥物產品製劑。包含骨靶向抗TGFβ抗體和/或抗體片段的醫藥組成物可以如美國專利申請公開號US 2014/0286933 A9中所述配製，其藉由引用併入本文，或者如本領域已知的以其他方式配製。

在一個具體的具體實例中，用於治療骨病的方法包括將有效量的靶向骨的抗TGFβ抗體施用至患有骨病的個體，所述骨病例如與慢性腎病相關的骨病、癌症的骨轉移或不正常的代謝狀況。在另一個具體的具體實例中，用於治療成骨不全的方法包括向患有成骨不全的個體施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗體。在另一個具體的具體實例中，用於治療骨質疏鬆的方法包括向患有骨質疏鬆的個體施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗體。

在一些具體實例中，患者用本發明的骨靶向抗體或抗體片段與另一種治療劑(例如骨流失症的治療劑(例如雙膦酸鹽))的組合治療。抗體或抗體片段和其他治療劑可以同時或依次施用至患者。

製備抗體的方法

本發明的抗體或片段可以藉由本領域充分確立的方法製備。可將編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA序列插入到表現載體中，使得基因可操作地連接到必需的表現控制序列，例如轉錄和轉譯控制序列。表現載體包括質體、逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒、黏接質體(cosmid)、YAC、EBV衍生的游離基因體(episome)等。抗體輕鏈編碼序列和抗體重鏈編碼序列可以插入分開的載體中，並且可以可操作地連接至相同或不同的表現控制序列(例如啟動子)。在一個具體實例中，兩種編碼序列被插入到相同的表現載體中，並且可以可操作地連接到相同的表現控制序列(例如，共同的啟動子)，連接到分開的相同表現控制序列(例如啟動子)或連接到不同的表現控制序列(例如啟動子)。可以藉由標準方法(例如連接抗體基因片段和載體上的互補限制性位點，或者如果不存在限制性位點則進行平端連接)將抗體編碼序列插入表現載體中。

除抗體鏈基因外，重組表現載體可攜帶控制宿主細胞中抗體鏈基因表現的調節序列。用於哺乳動物宿主細胞表現的調節序列的實例包括指導哺乳動物細胞中高水平蛋白質表現的病毒元件，例如來源於如下的啟動子和/或增強子：逆轉錄病毒LTR、巨細胞病毒(CMV)(如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤病毒和強哺乳動物啟動子如天然免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子。

除了抗體鏈基因和調節序列之外，本發明的重組表現載體可以攜帶額外的序列，例如調節載體在宿主細胞中複製的序列(例如複製起點)和選擇標記基因。例如，選擇標記基因賦予載體已經導入其中的宿主細胞對藥物如G418、潮黴素或甲胺喋呤的抗性。選擇標記基因可以包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有甲胺喋呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞)、neo基因(用於G418選擇)和谷胺酸合成酶基因。

將編碼本發明抗體的表現載體導入宿主細胞中進行表現。宿主細胞在適合表現抗體的條件下培養，然後將抗體收穫並分離。宿主細胞包括哺乳動物、植物、細菌或酵母宿主細胞。可用作表現宿主的哺乳動物細胞系在本領域中是公知的，並且包括許多可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的永生化細胞系。這些中包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、293 Freestyle細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞和許多其他細胞系。特別較佳的細胞系係藉由確定哪些細胞系具有高表現水平來選擇。可以使用的其他細胞系是昆蟲細胞系，例如Sf9或Sf21細胞。

此外，使用許多已知技術可以增強抗體的表現。例如，谷胺醯胺合成酶基因表現系統(GS系統)是在某些條件下增強表現的常用方法。

用於宿主細胞的組織培養基可包含或不含動物衍生組分(ADC)，例如牛血清白蛋白。在一些具體實例中，無ADC的培養基對人的安全是較佳的。組織培養可以使用補料分批方法、連續灌注方法或任何其他適合宿主細胞和所需產率的方法進行。

醫藥組成物

本發明的抗體可以針對合適的儲存穩定性配製。例如，可以使用藥學上可接受的賦形劑將抗體凍乾或保存或重構以供使用。對於聯合療法，可以將兩種或更多種治療劑例如抗體共同配製，例如混合並以單一組成物提供。

本文使用術語“賦形劑”或“載體”來描述除本發明化合物之外的任何成分。賦形劑的選擇在很大程度上取決於諸如特定施用模式、賦形劑對溶解性和穩定性的影響以及劑型的性質等因素。“藥學上可接受的賦形劑”包括生理學相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學上可接受的賦形劑的一些實例是水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它們的組合。在許多情況下，較佳在組成物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。藥學上可接受的物質的另外的實例是潤濕劑或少量輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增加抗體的保質期或效力。

本發明的醫藥組成物可以作為單一單位劑量或作為多個單一單位劑量製備、包裝或散裝銷售(sold in bulk)。如本文所用，“單位劑量”是包含預定量的活性成分的醫藥組成物的離散量。活性成分的量通常等於將施用於受試者的活性成分的劑量或該劑量的方便的一部分，例如該劑量的一半或三分之一。

本發明的醫藥組成物通常適用於腸胃外施用。如本文所用，醫藥組成物的“腸胃外施用”包括任何特徵如下的施用途徑，其特徵在於物理破壞受試者組織並通過組織中的所述破裂施用醫藥組成物，因此通常導致直接施用到血液中、肌肉中或進入內部器官。因此，腸胃外施用包括但不限於通過注射組成物、通過手術切口施用組合物、通過組織穿透性非手術傷口施用組成物等來施用醫藥組成物。特別地，考慮的腸胃外給藥包括但不限於皮下、腹膜內、肌內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、心室內、尿道內、顱內、腫瘤內和滑膜內注射或輸注；以及腎透析輸注技術。也考慮區域灌注。較佳的具體實例包括靜脈內和皮下途徑。

適用於胃腸外施用的醫藥組成物的製劑通常包含與藥學上可接受的載體(例如無菌水或無菌等滲鹽水)組合的活性成分。這樣的製劑可以適合於推注施用(bolus administration)或連續施用的形式製備、包裝或出售。注射製劑可以以單位劑量形式製備、包裝或銷售，例如在安瓿或含有防腐劑的多劑量容器中。用於腸胃外施用的製劑包括但不限於混懸液、溶液、油性或水性載體中的乳劑、糊劑等。這樣的製劑可以進一步包含一種或多種另外的成分，包括但不限於懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於腸胃外施用的製劑的一個具體實例中，活性成分以乾燥(即粉末或顆粒)形式提供，用於在腸胃外施用重構組合物之前用合適的載體(例如無菌無熱原水)重構。胃腸外製劑還包括可含有賦形劑例如鹽、碳水化合物和緩沖劑(較佳pH 3-9)的水溶液，但是對於一些應用，它們可以更合適地配製成無菌非水溶液或作為乾燥形式與適宜的載體如無菌無熱原水一起使用。示例性腸胃外施用形式包括在無菌水溶液中的溶液或混懸液，例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液。如果需要，可以適當緩衝這種劑型。可用的其它可以腸胃外施用的製劑包括含有微晶形式的活性成分或脂質製備物的那些製劑。用於腸胃外施用的製劑可以配製成立即和/或調節釋放(modified release)。調節釋放製劑包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放和程序釋放。

在一些具體實例中，本發明的抗體或抗原結合片段可以以40、20或15mg/kg或更少(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/kg)施用。在一些其他具體實例中，劑量可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5mg/kg。給藥頻率可以是例如每天、每兩天、三天、四天或五天、每週、每兩周或三周、每月、每兩個月、每三個月、每六個月或每十二個月或根據需要。抗體可以通過靜脈內(例如，0.5-8小時的靜脈內輸注)、皮下、肌內或適合於病症和藥物製劑的任何其他施用途徑施用。

示例性具體實例

下面描述本發明的其他具體具體實例。

1. 抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈、輕鏈和與重鏈和/或輕鏈的C-末端連接的一個或多個聚天冬胺酸(聚-D)肽。

2. 具體實例1的抗體或抗原結合片段，其中所述一個或多個聚-D肽藉由化學接合與抗體或抗原結合片段連接。

3. 具體實例2的抗體或抗原結合片段，其中所述一個或多個聚-D肽在鉸鏈區與重鏈接合。

4. 具體實例2或3的抗體或抗原結合片段，其中所述一個或多個聚-D肽通過聚乙二醇(PEG)間隔子與所述抗體或抗原結合片段接合。

5. 具體實例1的抗體或抗原結合片段，其包含與重鏈或輕鏈的胺基酸序列整合的聚-D肽。

6. 具體實例5的抗體或抗原結合片段，其包含與重鏈的N-末端整合的聚-D肽。

7. 具體實例5的抗體或抗原結合片段，其包含與重鏈的C-末端整合的聚-D肽。

8. 具體實例5的抗體或抗原結合片段，其包含與重鏈的N-末端整合的第一聚-D肽和與重鏈的C-末端整合的第二聚-D肽。

9. 具體實例5-8中任一項的抗體或抗原結合片段，其包含與輕鏈的C-末端整合的聚-D肽。

10. 具體實例5-9中任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述聚-D肽藉由肽接頭與所述重鏈或輕鏈融合。

11. 具體實例10的抗體或抗原結合片段，其中所述肽接頭包含胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：9)的1-3個重複。

12. 前述具體實例中任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述一個或多個聚-D肽各自獨立地包含2-30個天冬胺酸殘基。

13. 具體實例12的抗體或抗原結合片段，其中所述一個或多個聚-D肽各自包含10個天冬胺酸殘基(SEQ ID NO：1)。

14. 前述具體實例中任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體是IgG。

15. 具體實例15的抗體或抗原結合片段，其中抗體是IgG₁或IgG₄。

16. 前述具體實例中任一項的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段特異性結合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一種或多種。

17. 具體實例16的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含SEQ ID NO：13中的重鏈互補決定區(CDR)1-3和SEQ ID NO：15中的輕鏈CDR1-3。

18. 具體實例17的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含對應於SED ID NO：13的殘基1-120的重鏈可變結構域(V_H)胺基酸序列和對應於SEQ ID NO：15的殘基1-108的輕鏈可變結構域(V_L)胺基酸酸序列。

19. 具體實例17或18所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含在第228位(EU編號)具有脯胺酸的人IgG₄恒定區。

20. 具體實例19的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，其具有或不具有C-末端賴胺酸，並且所述抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。

21. 具體實例17的抗體，其中所述重鏈包含具有或不具有C-末端賴胺酸的SEQ ID NO：13的胺基酸序列，具有或不具有緊接在C-末端D10序列之前的賴胺酸的SEQ ID NO：14，具有或不具有C-末端賴胺酸的SEQ ID NO：16或具有或不具有緊接在C-末端D10序列之前的賴胺酸的SEQ ID NO：17，並且輕鏈包含SEQ ID NO：15、19、21或22的胺基酸序列。

22. 具體實例16的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體是具有分別為具有或不具有C-末端賴胺酸的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6的重鏈和輕鏈胺基酸序列的小鼠抗體1D11。

23. 結合人TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3的IgG₄抗體，其中所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。

24. 結合人TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3的IgG₄抗體，其中所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。

25. 前述具體實例中任一項的抗體或抗原結合片段，其中與具有相同重鏈和輕鏈但是缺少聚D肽的抗體相比，所述抗體或抗原結合片段在向骨的定位方面至少增加2倍。

26. 醫藥組成物，其包含前述具體實例中任一項的抗體或抗原結合片段和藥學上可接受的賦形劑。

27. 用於治療受益於TGFβ抑制的患有骨病症的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的具體實例16-25中任一項的抗TGFβ抗體或抗原結合片段。

28. 具體實例27的方法，進一步包括檢測如下至少一項：(1)TGFβ水平降低，(2)TGFβ活性降低，(3)骨流失降低，(4)骨流失率降低，(5)骨密度增加，(6)骨強度增加，和(7)IL-11水平降低。

29. 具體實例16-25中任一項的抗TGFβ抗體或抗原結合片段，其用於治療受益於TGFβ抑制的患有骨病症的個體的用途。

30. 具體實例16-25中任一項的抗TGFβ抗體或抗原結合片段用於製備藥物的用途，所述藥物用於治療受益於TGFβ抑制的患有骨病症的個體。

31. 具體實例27的方法、具體實例29的用於所述用途的抗體或抗原結合片段或具體實例30的用途，其中所述個體是人。

32. 具體實例31的方法、用於所述用途的抗體或抗原結合片段或用途，其中所述人患有成骨不全。

33. 具體實例31的方法、用於所述用途的抗體或抗原結合片段或用途，其中所述人患有骨流失或骨質疏鬆。

34. 具體實例31的方法、用於所述用途的抗體或抗原結合片段或用途，其中所述人患有慢性腎病。

35. 具體實例31的方法、用於所述用途的抗體或抗原結合片段或用途，其中所述人是具有骨轉移的癌症患者。

36. 分離的核酸分子，其包含編碼具體實例1-25中任一項的抗體或抗原結合片段的重鏈、輕鏈或兩者的核苷酸序列。

37. 表現載體，其包含具體實例36的分離的核酸分子。

38. 宿主細胞，其包含具體實例37的表現載體。

39. 具體實例38的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。

40. 生產具體實例1-25中任一項的抗體或抗原結合片段的方法，所述方法包括：提供包含分別編碼抗體或抗原結合片段的重鏈和輕鏈的第一和第二核苷酸序列的宿主細胞，在允許產生所述抗體或抗原結合片段的條件下培養所述宿主細胞，和回收所述抗體或抗原結合片段。

41. 具體實例40的方法，其中所述第一核苷酸序列包含SEQ ID NO：23、24、25或26，並且所述第二核苷酸序列包含SEQ ID NO：27、29、 31或32。

42. 生產骨靶向抗體或抗原結合片段的方法，其包括：提供抗體或其抗原結合片段和一個或多個聚-D肽，和藉由化學接合通過共價鍵將所述聚-D肽連接至所述抗體。

43. 具體實例40-42中任一項的方法，其進一步包括將所述抗體或抗原結合片段配製成包含藥學上可接受的載體的醫藥組成物。

44. 生產骨靶向醫藥組成物的方法，其包括：提供具體實例1-25中任一項的抗體或抗原結合片段，和將所述抗體或抗原結合片段與藥學上可接受的載體混合。

在以下實施例中將進一步描述本發明，這些實施例不限制請求項中描述的本發明的範圍。

實施例

下面的實施例是對本發明的具體實施方式及其各種用途的說明。它們僅僅是為了說明的目的而提出的，並不被認為是對本發明的限制。

TGFβ抗體

本文稱為mAb1的第一種抗TGFβ抗體是對人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(“泛特異性”)特異性的小鼠IgG1單株抗體，並且可從R&D Systems(選殖株號1D11，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)獲得。實施例中mAb1抗體充當模板。

實施例中使用的第二種抗TGFβ抗體(在本文中稱為mAb2)是具有鉸鏈突變S228P(EU編號)的人抗TGFβIgG4抗體。mAb2抗體與美國專利號9,090,685中公開的抗體相似，其藉由引用併入本文。當未糖基化時，抗體mAb2具有144 KD的分子量估計值。其重鏈和輕鏈胺基酸序列分別是SEQ ID NO：13和15。這兩個序列如下所示。可變結構域以斜體表示，並且在本文中被稱為重鏈可變結構域(HCVD，SEQ ID NO：39)和輕鏈可變結構域(LCVD，SEQ ID NO：40)。CDR在方框中顯示並且被稱為重鏈互補決定區1(HCDR1，SEQ ID NO：33)；HCDR2(SEQ ID NO：34)；和HCDR3(SEQ ID NO：35)，以及輕鏈互補決定區區域1(LCDR1，SEQ ID NO：36)；LCDR2(SEQ ID NO：37)；和LCDR3(SEQ ID NO：38)。重鏈恒定結構域中的糖基化位點以黑體字表示(N157)。

(SEQ ID NO：13)

(SEQ ID NO：15)

如本文所述，可以使用結合參與骨形成或骨維持的蛋白質的其他抗體、抗體片段、蛋白質或肽。

實施例1：製備D10肽與mAb1α-TGFβ抗體的化學接合物

以圖2所示的方式製備α-TGFβ抗體mAb1的D10肽化學接合物。通過在Amicon® Ultra 50kDa MWCO離心過濾器(EMD Millipore)上進行三輪超濾，將mAb1(2.0mg)交換至脫氣的硼酸鹽緩衝液(25mM氯化鈉，1mM DTPA，20mM硼酸鈉pH 8.0)中。然後將鉸鏈區二硫鍵用12mol：mol二硫蘇糖醇(DTT)每mAb在37℃下還原2小時。使用脫氣的硼酸鹽緩衝液將產物在4mL Amicon® Ultra過濾器上脫鹽。將等分試樣(1nmol，150μg)在25℃與遞增量(1-15mol：mol)的D10-馬來醯亞胺肽(Ac-D10-C2-PEG12-C6-馬來醯亞胺，其中PEG12由含有12個環氧乙烷基團的限定長度PEG組成)。1.5小時後，通過加入12當量N-乙基馬來醯亞胺封閉剩餘的未反應的硫醇基團，然後溫育1.5小時。產物通過超濾脫鹽。圖3A描繪了用SimplyBlue^TM(Thermo Scientific)染色並由Odyssey近IR掃描儀(LiCor)成像的4-12%NuPAGE凝膠上0.5μg各產物的SDS-PAGE。使用AlphaView軟件(ProteinSimple Corp.)整合泳道螢光分佈圖並測定肽與抗體比率(PAR)。假設每條重鏈或輕鏈中的移動性的小變化代表添加單個D10肽，其與重鏈的最多5個可鑑定的條帶和輕鏈的1個相一致，並且與各自的鉸鏈區半胱胺酸數目匹配。重鏈和輕鏈上肽的平均數分別由每個次要帶的相對豐度與其指代的肽數的乘積之和計算。PAR由來自重鏈和輕鏈的那些數的總和乘以2來計算，因為每條鏈在整個IgG中出現兩次。化學偶聯反應中的PAR值與肽-馬來醯亞胺：mAb的比率如圖3B所示，其顯示隨著接合肽的數量增加至8mol：mol，PAR線性增加。

實施例2：mAb1-D10化學接合物與TGF-β1的結合

在本實施例中，以與實施例1中所述相同的方式製備一組不同的PAR的化學接合物，不同之處在於DTT的比率從8-10mol：mol變化並且馬來醯亞胺-肽：單株抗體是3或15mol：mol。作為對照，通過將其鉸鏈二硫鍵在氬氣中37℃通過3mol：mol三(2-羧乙基膦)(TCEP)還原2小時，隨後與15mol：mol馬來醯亞胺-肽在25℃過夜並通過使用超濾脫鹽來純化，由此製備人IgG1(Herceptin®)化學接合物。

為了評估它們與TGF-β1結合的能力，將化學接合物與TGF-β1以1：1的莫耳比混合，隨後在Superdex 200(GE Healthcare)上在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH 7.2中進行尺寸排阻層析。如圖4A所示，單獨的mAb1-D10化學接合物產生了比未修飾的mAb1更早洗脫的稍不均勻的峰，這可能是由於接合的肽產生的電荷效應。向接合物中加入TGF-β1產生了比mAb1或mAb1-D10化學接合物更早的洗脫峰，表明形成了更高分子量的複合物(圖4B)。類似地，向未修飾的mAb1抗體添加TGF-β1產生了向更早的保留時間的轉變(圖4C，4D)。相反，雖然D10與Herceptin®的化學接合導致單獨的抗體的保留時間的改變(與mAb1接合物一樣)(圖4E，4F)，但將TGF-β1(1mol：mol)添加到Herceptin®-D10接合物沒有對其洗脫時間或表觀MW產生任何變化(圖4F，4G)，表明與接合物的結合不作為接合的結果發生。

實施例3：mAb1-D10化學接合物與羥基磷灰石的肽依賴性結合

在本實施例中，如圖2所示，D10與mAb1的化學接合物藉由在25mM NaCl、1mM DTPA、20mM硼酸鈉pH 8中用12當量DTT在37℃還原鉸鏈區二硫鍵2小時，隨後與2mol：mol 2,2'-聯吡啶二硫化物(Sigma)反應以將部分游離硫醇轉化回二硫化物而產生。隨後與實施例1中描述的D10-馬來醯亞胺肽反應。最終產物通過超濾純化。通過離心柱將一部分(25μg)交換成5mM磷酸鈉pH7.4，並在100μL陶瓷羥基磷灰石(CHT)II型(BioRad)柱上進行色譜，並用5-500mM磷酸鈉pH 7.4以0.5mL/min的流速洗脫。未修飾的mAb1用作對照。圖5A中描述了A₂₈₀柱的圖譜。mAb1僅顯示與柱的痕量結合，而約一半的接合物在約0.2M磷酸鹽結合並洗脫。將級分濃縮並通過SDS-PAGE分析(圖5B)。未結合的(流通物或“FT”)部分顯示大部分為未修飾的mAb，而主要峰4包含通過SDS-PAGE估計PAR為6的接合物。

實施例4：一系列肽載量對羥基磷灰石結合的影響

在本實施例中，如實施例3中所述，將實施例1中描述的具有不同數目的肽的一系列D10肽化學接合物在CHT II型柱上進行色譜分析。A₂₈₀譜和結合的接合物部分的圖和峰保留時間如圖6A所示。如圖6B所示，與柱結合的接合物的量增加至PAR 3.8，變平，並開始隨著更多數量的肽而減少。相反，接合物(指示相互作用的強度)與樹脂的保留時間隨著肽數目增加至9而增加。

實施例5：D10肽與mAb1的化學接合對其體外中和TGF-β1的效力的影響

在本實施例中，如實施例1中所述製備一組三種mAb1-D10接合物，例如圖2所示。通過在接合過程中省略D10-馬來醯亞胺肽來製備對照接合物。通過SDS-PAGE分析，例如圖3所示，這三種接合物的肽加載量(PAR)被確定為0、5或9。然後通過與TGF-β1共溫育1小時來測定這些接合物失活TGF-β1的能力。然後將生長培養基中的連續稀釋液應用於表現人TGF-β1受體的人A549細胞，然後溫育過夜。然後通過IL-11釋放到生長培養基中來測定對活性TGF-β1的細胞反應，所述釋放通過對IL-11特異性的ELISA測定來檢測。圖7描繪了三種接合物和mAb1對照的IL-11反應。在所有情況下，IL-11釋放的半數最大抑制(EC₅₀)發生在0.1nM抗體附近。兩種接合物(PAR=5和PAR=9)和缺少肽的模擬接合物(PAR=0)顯示比mAb1略好的抑制。接合肽的數量對EC₅₀沒有影響。

實施例6：接合的D10肽對施用至小鼠的mAb1的生物分佈的影響

以與實施例1中所述類似的方式製備D10-mAb1化學接合物，例如圖2所示。將mAb1(19.6mg)交換至脫氣的硼酸鹽緩衝液中，與10.6當量(1.06μmol)DTT在37℃下反應1.5小時，然後在不進行緩衝液交換的條件下與6當量D10肽(Ac-D10-C2-PEG12-C6-馬來醯亞胺)在25℃下在氬氣下反應1.5小時。通過加入12當量N-乙基馬來醯亞胺封閉未接合的游離巰基，然後在25℃溫育30分鐘。最終產物通過超濾純化。使用SDS-PAGE(PAR~4.8) 測定肽與抗體的比率。輕鏈顯示痕量的條帶，對應於向輕鏈半胱胺酸殘基添加單個肽。

使用製造商描述的條件，用AlexaFluor® 750(Thermo Fisher)分別標記接合物和mAb1抗體對照。將螢光測試物品施用給SKH-1無毛小鼠，其在施用後立即(0.3-1小時)用IVIS儀器(Perkin Elmer)成像，並且在4小時後，和1、2、3、4、7、8和9天後成像。圖8A中描繪了注射1mg/kg標記的mAb1和接合物的小鼠的圖像。標記的mAb1的螢光均勻分佈在整個身體中，並且該模式得到保持但在9天期間強度下降。相反，在1天後，mAb1-D10接合物濃縮在背側中線、肢體和尾部處或附近，與骨定位一致，但在身體其他地方幾乎檢測不到。與圖8A的圖像一致，在24小時與對照相比，圖8A的圖像中測量的與心臟螢光相比的遠端股骨螢光的比率顯著升高(P<0.05)，並且在168小時過程中保持顯著升高(見圖8B)。這種分佈保持了9天以上，只有輕微的強度變化。

實施例7：重組鼠抗TGFβ-D10抗體融合變體的製備

如下所述製備了圖9A和9B所示的一組重組抗TGFβ-D10肽融合變體。

重鏈和輕鏈表現載體構築體

產生了表現在不同位置具有D10肽的mAb1重鏈和輕鏈的一組質體。另外，還產生了兩種質體，用於不含D10肽的野生型mAb1重鏈和輕鏈。所有密碼子優化的序列都是合成生成的(GeneArt)，側翼為選殖目的框內設計的適當的限制酶位點。將編碼具有或不具有C-末端D10肽的小鼠IgG1恒定區和mAb1野生型完整輕鏈的三個基因片段選殖到空的附加型哺乳動物表現載體pFF中，其為Durfher等人描述的pTT載體的類似物(2002,Nucl.Acids Res.30(2)：E9)，以使用ApaLI/HindIII限制酶和隨後的連接產生“mIgG1_CH123_pFF”，“mIgG1_CH123D10_pFF”和“mAb1_VLCL_pFF”。使用ApaLI/EagI(用於重鏈)和ApaLI/MfeI(用於輕鏈)將編碼具有或不具有N-末端D10肽的編碼可變區的基因片段選殖到載體中。使用MfeI/HindIII將編碼具有C-末端D10和不同長度的G4S(SEQ ID NO：9)間隔子的小鼠Igκ輕鏈的恒定區的基因片段選殖到“mAb1_VLCL_pFF”中，以取代野生型恒定區。藉由DNA測序(ACGT，Inc.)確認每個構築體的預期的正確DNA序列。

融合變體組裝和表現

通過選擇用於共轉染的每種重鏈和輕鏈載體中的一種來產生融合變體，以產生如表1中所述的融合變體和無肽對照。“PAR”(肽-抗體比)反映了預期在最終表現的抗體的重鏈和輕鏈上附加的肽的總數。融合變體ID“mAb1F1”代表與未經修飾的mAb1序列基本相同的“野生型”(“wt”)構築體。“HC”表示mAb1的重鏈，“LC”表示mAb1的輕鏈，“D10”表示D10肽(SEQ ID NO：1)，而“G4S”表示摻入一些構築體中的由gly-gly-gly-gly-ser(SEQ ID NO：9)組成的間隔子序列。

為了評估期的重組融合變體被表現的能力，使用製造商描述的條件藉由共轉染入Expi293F^TM細胞(Life Technologies)來評估來自表1的十六種變體。4天後，藉由條件培養基的SDS-PAGE確定表現。所有變體均以估計在10-30μg/mL之間的水平表現。5天和7天後觀察到略高的水平，但表現水平取決於變體。WT(mAb1F1)、HC-D10：LC-D10(mAb1F8)和HC-D10：LC-G4S-D10(mAb1F9)表現出特別高的表現，而D10-HC：D10-LC(mAb1F12)表現不佳。

大規模表現

全部20個重組mAb1-D10融合變體在30mL規模下在Expi293-F細胞中表現。在第6天收穫條件培養基(CM)，並通過非還原性SDS-PAGE評估表現水平。與初始評估相比，觀察到更高水平的表現(30-150μg/ml)，但相對表現水平與較小規模轉染一致。

實施例8：重組mAb1-D10融合變體表徵 表現水平和TGF-β1結合

使用Octet® QK384評估表現水平的定量和重組mAb1-D10融合變體結合TGF-β1的能力。將用於鼠IgG的Octet®生物感應器浸入到樣品稀釋液(PBS，pH 7.4，含有0.01% BSA和0.02%吐溫20)中1：10稀釋的條件培養基中，或純化的mAb1標準品在1.25至100μg/mL範圍的2倍系列稀釋液中。收集結合數據2分鐘，同時以500rpm搖動樣品。使用初始結合率的4參數擬合和與從標準品獲得的結果的比較來計算效價。然後將生物感應器用稀釋劑洗滌1分鐘以除去任何培養基並重新建立基線，然後浸入含有40nM TGF-β1的孔中，以1000rpm離心3分鐘以追蹤結合。隨後通過將感應器在1000rpm 下轉移至稀釋劑3分鐘進行解離步驟。如表2所示，培養基中融合變體的濃度範圍為11至178μg/mL(“Octet濃度”)，並且大體上匹配通過SDS-PAGE(“表現水平”)觀察到的趨勢。另外，所有融合變體都能夠結合TGF-β1，表明在任何所示位置存在D10肽不會嚴重影響抗原結合。

小鼠FcRn結合

使用Octet QK384評估重組mAb1-D10融合變體的小鼠FcRn結合。所有步驟均以1000rpm進行。將稀釋達到10μg/mL的抗體濃度的條件培養基與抗鼠IgG Fv生物感應器接觸5分鐘。然後將生物感應器浸入PBSP pH 6.0(50mM磷酸鈉pH 6.0，150mM氯化鈉，0.005%表面活性劑P20)中以建立基線。然後將感應器轉移至含有在PBSP pH 6.0中稀釋至1μM的可溶性小鼠FcRn的孔中3分鐘，然後在含有PBSP pH 6.0的孔中解離3分鐘。如表2所示，所有變體都與小鼠FcRn結合。

蛋白G結合

使用Octet QK384評估重組mAb1-D10融合變體與蛋白G的結合。將蛋白G生物感應器浸入含有在樣品稀釋液中稀釋至10μg/mL抗體的條件培養基的孔中，然後在1000rpm下跟蹤信號3分鐘。如表2所示，所有變體都結合蛋白G。

SDS-PAGE

純化的WT構築體和重組融合變體mAb1F2，mAb1F6，mAb1F7，mAb1F11，mAb1F12，mAb1F16和mAb1F17在處於還原和非還原條件下並用考馬斯藍染色的4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠(Novex，Life Sciences)上分析。由ProteinSimple®成像儀收集的可見光圖像如圖10所示。觀察到重鏈和/或輕鏈的移動性(mobility)的輕微降低，其與各鏈上D10肽的預期存在和數目相匹配。雜質和共價聚集體不可檢測。

藉由差示掃描量熱法(DSF)的熱穩定性

使用SYPRO® Orange(Thermo Scientific)作為報道染料，藉由差示掃描螢光測定法確定了幾種重組mAb1-D10融合變體的熱穩定性，所述重組mAb1-D10融合變體代表D10肽在重鏈和輕鏈上的末端的所有可能組合。通常認為，在較高溫度下蛋白質的穩定性可預測其在典型儲存條件下的穩定性，因此可用於評估它們作為治療劑的製造和使用適合性。熱穩定性可以在實時PCR儀器上使用在結合通過展開蛋白質結構而暴露的疏水性區域時表現出螢光增加的染料來評估(Lo et al.,2004,Anal.Biochem.332(1)：153-9)。在CFX96實時PCR檢測系統上升高溫度的同時，追蹤含有1：1000稀釋的SYPRO® Orange的樣品的螢光(10μL，0.5mg/ml蛋白質)。使用CFX Manager 3.0(Bio-Rad Laboratories)分析數據。圖11描述了幾種變體的螢光隨溫度的變化率。通常使用變化率而不是絕對螢光，從而區分染料與不受結構轉變影響的蛋白質結構部分的結合。負位移反映螢光變化率的增加，最小值表示向未折疊狀態(“Tm”)轉變的中點。測試的幾種變體(mAb1F6，mAb1F11，mAb1F16)顯示Tm分佈與未修飾的抗體對照(“WT”=mAb1F1)不可區分。其他兩種(mAb1F2和mAb1F7)顯示主要轉變的Tm顯著降低。兩個變體(mAb1 F12和mAb1 F17)顯示最低的Tm值。值得注意的是，在輕鏈N-末端含有D10肽的所有四種重組mAb1-D10融合變體都顯示Tm顯著降低，這表明在mAb1抗體的該位置放置肽使其結構不穩定。相反，在重鏈的任一末端放置D10肽與Tm的任何變化都不相關。如圖11所示觀察到的幾種融合變體的主要轉變的Tm值列於表3中。

表3. 表現的重組融合變體的差示掃描量熱法

^A 參見表2；^B mAb1 F1為mAb1的重組版本

實施例9：重組mAb1-D10融合變體在體外中和TGF-β1的效力

重組mAb1-D10融合變體在中和TGF-β1活性中的效力通過響應於添加到培養基中的TGF-β1抑制A549腫瘤細胞體外分泌IL-11而測定。該程序如實施例3所述進行。根據其對蛋白G的親和力(作為其純化容易度的指標)選擇來自實施例7的幾種代表性融合變體。圖12A和12B中描繪了八種變體(mAb1F1，mAb1F2，mAb1F6，mAb1F7，mAb1F11，mAb1F12，mAb1F16和mAb1F17)的TGF-β1抑制曲線。所有融合蛋白顯示與mAb1對照相似的EC₅₀。

實施例10：重組融合變體對TGF-β1的結合

還使用表面等離子體共振(SPR)定量評估了實施例7的重組mAb1-D10融合變體的TGF-β1結合，如通過Biacore®所檢測的。將含有純化變體的樣品通過具有胺偶聯的TGF-β1的感應器芯片以確定平衡常數K_D。選擇小於100個反應單位(RU)的TGF-β1的目標固定水平以最小化芯片上結合相鄰TGF-β1分子引起的親合力效應的可能性。在NHS/EDC活化芯片表面之後但在用乙醇胺淬滅之前，通過響應單位的變化確定固定的水平。將融合變體，WT融合變體F1和mAb1對照在HBS-EP緩衝液中稀釋至30、10、3、1和0.37nM，並以30μL/min通過TGF-β1芯片3分鐘，隨後在相同的緩衝液中解離5分鐘。在運行之間，通過在芯片上以75μL/min的流速通過兩次30秒的40mM HCl注射，再生芯片表面以除去任何結合的抗體。如表4所示，所有融合變體和WT構築體(F1)的平衡常數(K_D)在mAb1對照的2.4倍以內。出乎意料地，由融合變體引起的最大信號(RU)隨著肽數量的增加而減少，其中變體F17(D10-HC-D10/D10-LC，PAR=6)顯示最低信號。這與實施例9中描述的A549細胞效力測定相反，其顯示所有測試的融合變體在中和TGF-β1時與mAb1或WT構築體相比都是相當的或更加有效。這種下降的可能解釋可能反映了芯片基質(羧甲基葡聚糖)和帶負電的D10肽之間的靜電排斥。

^A 參見表2

實施例11：重組mAb1-D10融合變體與羥基磷灰石的結合

還如實施例3中所述針對結合陶瓷羥基磷灰石(CHT)柱測試了來自實施例7的重組mAb1-D10融合變體，以評估它們結合骨的礦物結構的潛力。將重組mAb1-D10融合變體(每種25μg，在5mM磷酸鈉pH7.4中)施加到100μL羥基磷灰石柱(CHT II型，BioRad)上，並使用0.005至0.5M磷酸鈉pH 7.4的梯度洗脫。通過A₂₈₀追蹤流動相中的蛋白質從柱上洗脫。在每組運行的開始和結束時運行標準品(通常是mAb1-D10化學接合物)以確保柱性能的一致性。圖13描繪了每次運行的A₂₈₀圖譜。保留時間(RT)和結合分數顯示於下表5中。除了其中一種，所有重組融合變體幾乎定量結合，但表現出親和力的差異，這反映在它們的保留時間中。保留時間的等級順序與PAR沒有很好的相關性，表明肽位置對結合的顯著作用。具體而言，用變體F7(PAR4)觀察到最強結合(最高RT)，而變體F17(PAR6)顯示出稍弱結合。一個變體(F6，PAR2)顯示出比大多數PAR4變體弱的結合，但明顯優於其他PAR2變體(F2和F11)。一個僅在輕鏈N-末端具有肽的變體(F2)僅顯示弱結合，如其RT和結合分數(23%)所示。mAb1-D10化學接合物(“CC”；PAR~4)產生了兩個峰，在比所有PAR4融合變體更早的RT處洗脫84%。

實施例12：重組融合變體在小鼠中的生物分佈

在尾靜脈注射入CD-1小鼠後，測定如實施例6中所述產生的重組mAb1-D10融合變體的選定子集(F6，F16和F17)和mAb1-D10化學接合物的生物分佈。基於幾種因素選擇重組變體，包括表現和純化產率，TGF-β1結合親和力，基於細胞的效力和與羥基磷灰石的結合。這些變體包括含有2、4或6個D10肽的實例，以評估靶向是否概括了與羥基磷灰石的結合或其是否是肽數目的函數。蛋白質在HEK293細胞中表現並在蛋白質A上純化。將三種重組mAb1融合變體在體外和體內詳細表徵。在這些中，將D10肽單獨重組地添加到重鏈的C-末端(mAb1F6)，重鏈的N-末端和C-末端(mAb1F16)，或重鏈的N和C-末端以及輕鏈的C-末端(mAb1 F17)。mAb1 F6，F16和F17重組變體分別具有2、4和6的肽對抗體比率(PAR)。選擇在實施例6的研究中顯示出靶向骨的mAb1-D10肽化學接合物(~4.8 PAR)作為陽性對照。

通過與Dylight® 800-4xPEG NHS酯(Thermo Scientific)在50mM硼酸鈉pH 8.65和大約5：1的染料：蛋白質莫耳比下反應來標記重組融合變體和化學接合物。通過調整染料：蛋白質比例，標記程度(DOL)保持在20%(~1.2mol：mol)內。然後通過尾靜脈注射將標記的蛋白質以1mg/kg施用至CD-1小鼠。隨後在給藥後24、48、168和504小時(3周)將麻醉的動物在IVIS小動物近紅外成像儀(Perkin Elmer)上成像。在240和504小時從每組的動物回收股骨和脊柱以驗證至骨骼的遞送。

如圖14中的背部視圖圖所示，所有mAb1-D10融合變體和化學接合物都在靠近脊柱的背側中線處濃縮並在那裡保持了3周(504小時)，儘管在測試物品的信號強度之間觀察到顯著差異。使用感興趣區域(ROI)進行定量，包括肩部和骨盆之間的脊柱部分，如圖14所示。計算針對DOL標準化的ROI內的最大輻射效率並繪圖，如圖15所示。在整個研究過程中(3周)，在每個重鏈C-末端具有D10肽的重組融合變體F6顯示出所有構築體在脊柱中的最高水平。48小時後，ROI內的信號強度的等級順序為變體F6>變體F16>變體F17

化學接合物，並且在整個研究過程中保持該順序(圖15)。表6中示出了使用Phoenix® WinNonlin®軟件(Pharsight)計算的ROI內的最大輻射效率隨時間變化的曲線下面積(AUC)(減去背景自發螢光(來自僅含運載體的對照動物))。與mAb1對照相比，骨暴露(AUC)增加8至22倍，含D10構築體之間的差異適度(最高2.5倍)。與mAb1相比，變體F6顯示出最高的增加(21.8倍，p<0.05)。使用WinNonlin®計算的組織半衰期類似地表明，與mAb1相比，變體F6在骨中的半衰期增加>10倍(p<0.05)。

在240和504小時後分離來自每組(cohort)中代表性動物的脊柱和股骨，與周圍組織分離並成像(圖16)。這些樣品的相對螢光強度與在活體動物中觀察到的背側圖像信號一致，表明它們反映了骨上存在重組融合變體和化學接合物。

實施例13：製備重組人抗TGFβ-D10抗體融合變體

用於製備重鏈上攜帶C-末端D10序列的mAb2(具有鉸鏈突變S228P的人抗TGFβIgG4抗體)(即，mAb2 HC-D10/mAb2 wt LC(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15)，其具有如變體F6中的相應構型(參見圖9B)，以下稱為mAb2 F6；參見表7)的表現載體以與實施例7中所述相同的方式產生。將Expi293F細胞用小量製備DNA轉染，6天後，收穫條件培養基(60mL)，產物蛋白經HiTrap蛋白A(GE Healthcare)純化。

實施例14：人抗TGFβ-D10抗體融合蛋白在小鼠內的生物分佈

用AlexaFluor® 647(Thermo Scientific)標記重組mAb2變體F6(mAb2 F6)和mAb2對照抗體，並以1mg/kg的劑量腹膜內施用至C57BL/6小鼠。24和96小時後，處死一些小鼠，並在IVIS儀器上切割並成像脊柱和股骨。將處死時獲得的血清樣品(10μL)平行成像。圖17A和17B顯示了股骨遠端(小梁)ROI和腰椎的平均總輻射效率。表8中列出了相對強度。這些結果表明由於將D10重組添加到mAb2中導致96小時後血清中的抗體在腰椎和股骨中的量大大增加，而血清中顯著減少。

實施例15：鼠抗TGFβ-D10抗體融合蛋白在小鼠中的單劑量血清和骨藥代動力學

在本實施例中，在小鼠中測量了鼠抗-TGFβ-D10抗體融合蛋白的藥代動力學。

向G610C小鼠(成骨不全動物模型；每個時間點n=12)腹膜內施用單劑量mAb1或重組mAb1 F6(參見表2)，並在給藥後4小時或2、7、15、22和43天收集血液樣品。利用針對檢測和定量相關抗體的血清濃度優化的ELISA。

對於骨成像，將單劑量的螢光團標記的mAb1、重組mAb1 F6或各種其他D10替代物靜脈內施用於裸鼠CD-1小鼠(每個時間點n=3)，並在給藥後4小時或1、2、4、7、10和21天進行體內光學成像。產生小鼠脊柱的螢光圖像，其允許骨中mAb1與mAb1 F6之間的相對測試物品比較(未顯示)。

血清和骨中的藥代動力學曲線分別可見於圖18A和18B，而所得的藥代動力學參數在下表9中。

結果顯示單次劑量後血清和骨中mAb1和mAb1 F6之間藥代動力學的基本對比。與mAb1相比，mAb1 F6展現出低13倍的血清中的AUC(暴露)和高22倍的骨中的暴露。另外，mAb1 F6在血清中展現出比mAb1短14倍的t_1/2，相應地快13倍的清除率。最後，對於骨骼，mAb1 F6表現出比mAb1長11倍的t_1/2，相應地慢17倍的清除率。對於臨床領域中的mAb1-D10的人用形式，這些屬性可能是有利的，其中從安全角度來看可能不期望對TGFβ的外周(血清)抑制，而在骨中的更高暴露可提高效力。

*p<0.05，與mAb1相比；^#AUC標準化至mAb1的1.0

實施例16：鼠抗-TGFβ-D10抗體融合蛋白在小鼠中的多劑量峰穀血清藥代 動力學

在本實施例中，在成骨不全的動物模型中進行了多劑量峰-穀藥代動力學研究。

向G610C小鼠(n=10)以0.3mg/kg和1mg/kg的濃度腹膜內給藥mAb1和mAb1F6(參見表2)，每週3次，持續8周(24個總劑量)，並在劑量1和23(研究的開始和結束)之後，在劑量後24和48小時收集血液樣品。僅顯示1mg/kg劑量的結果(見圖19)。使用質譜分析，其針對檢測和定量相關抗體的血清濃度進行了優化。

結果在下表10中量化。結果顯示在劑量1和23兩者之後血清中的mAb1和mAb1F6之間的藥代動力學的基本對比。在劑量1和23兩者給藥後24和48小時，均觀察到mAb1 F6與mAb1相比顯著更低的血清濃度。另外，mAb1 F6劑量後24-48小時之間的斜率與mAb1相比在劑量1和23處更陡峭，表明mAb1 F6以比mAb1更快的速率離開血清(全身循環)，這可能是由於其對骨骼(羥基磷灰石)的高親和力。最後，mAb1 F6和mAb1二者似乎均在劑量1至23的血清中累積，但與mAb1相比，mAb1 F6似乎以降低的濃度積累(mAb1F6：2.5-3.5倍累積和mAb1：4-5.5倍累積，從劑量1到23)。這些屬性對於臨床領域中mAb1的F6的人用形式可能是有利的，其中從安全角度來看可能不期望對TGFβ的外周(血清)抑制。

* p

0.05，與mAb1相比

實施例17：用mAb1和mAb1 F6在腰骨中進行多劑量效力研究

在本實施例中，在成骨不全的動物模型中進行了多劑量效力研究，以確定骨靶向型(mAb1 F6)相對於非靶向型mAb1對骨密度和強度的有效性。

將mAb1和mAb1 F6以0.3、1和5mg/kg每週3次腹膜內給藥G610C小鼠，持續8周。在最終劑量之後，對小鼠進行解剖，並通過μCT成像第6腰椎骨以確定總體積上的骨體積(BV/TV)並進行生物力學測試以確定最大破壞力(骨強度)。

結果顯示在圖20和21中。對於兩種處理，在1和5mg/kg均觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比BV/TV(%)的顯著變化。對於mAb1 F6在1和5mg/kg而對於mAb1僅在1mg/kg觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比最大破壞力的顯著變化。與WT背景株相比，用抗體對照(13C4)處理的G610C小鼠在BV/TV和最大破壞力方面均表現出顯著的降低。這些結果表明，在每週3次給藥的這種方案中，兩種治療在G610C小鼠中在BV/TV和最大破壞力方面都誘導了類似的劑量相關的變化。的確存在mAb1 F6對骨強度有增強的效力的趨勢，因為在5mg/kg組內一半小鼠顯示比用1mg/kg或5mg/kg的mAb1處理的小鼠顯著更高的最大破壞力值(40牛頓或更高)。

實施例18：用mAb1和mAb F6在腰骨中的給藥頻率研究

在本實施例中，在成骨不全的動物模型中進行給藥頻率研究以確定mAb1 F6的合適給藥頻率，從而實現其骨靶向抗體的最佳效力。

向G610C小鼠以5mg/kg以各種頻率(每週3次，每週1次，每2周1次，或每4周1次)腹膜內給藥mAb1和mAb1 F6，持續12周。在研究開始和結束時採集藥代動力學(PK)血清樣品以確定mAb1和mAb1 F6二者的峰值和穀值。在最終劑量之後，對小鼠進行解剖，並通過μCT成像第6腰椎骨以確定對比總體積的骨體積(BV/TV)並進行生物力學測試以確定最大破壞力(骨強度)。

結果顯示在圖22、23和24中。以每週3次，每週1次，每2周1次和每4周1次針對mAb1觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比的BV/TV(%)的顯著變化。以每週3次和每週1次針對mAb1 F6觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比BV/TV(%)的顯著變化。與每2周1次和每4周1次的給藥頻率的mAb1 F6處理相比，mAb1處理表現出顯著更高的BV/TV。對於mAb1，以每週3次，每週1次和每2周1次觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比的最大破壞力的顯著變化。以每週3次和每週1次對於mAb1 F6觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比的最大破壞力的顯著變化。與WT背景株相比，用對照抗體(13C4)處理的G610C小鼠表現出BV/TV的顯著降低以及最大破壞力降低的趨勢。

這些結果表明，mAb1和mAb1 F6二者都可以在G610C小鼠中在BV/TV和最大破壞力方面誘導相似的最大作用。與mAb1 F6相比，mAb1似乎在效力持久性方面具有優勢，當BV/TV每4周給藥一次時維持顯著的對BV/TV的效力，並且當每2周給藥一次時維持針對最大破壞力的顯著效力。然而，對於mAb1和mAb1 F6，在等效有效給藥方案(mAb1，1x每2周和mAb1F6，1x每週)下的PK血清樣品平均值分別的結果為約38μg/mL和8μg/mL。這表明mAb1 F6的血清暴露可能較少，這可能為OI患者提供安全優勢。

實施例19：用mAb1 F16在腰骨中的給藥頻率研究

在本實例中，在成骨不全的動物模型中進行給藥頻率研究以確定mAb1 F16的合適給藥頻率以實現其對骨密度的最佳影響。

在G610C小鼠中以5mg/kg每週3次腹膜內給藥mAb1和mAb1 F16達8周。在最終劑量後，對小鼠進行屍體解剖，並通過μCT成像第6腰椎骨以確定相對於總體積的骨體積(BV/TV)。

結果顯示在圖25中。mAb1和mAb F16均以5mg/kg觀察到與13C4處理的G610C小鼠相比BV/TV(%)的顯著變化。與WT背景株相比，用對照抗體(13C4)處理的G610C小鼠表現出BV/TV的顯著降低。這些結果表明，在該給藥方案下，mAb1和mAb F16在G610C小鼠中在BV/TV方面誘導相似的劑量相關變化。

實施例20：用mAb1 F11在骨中的給藥頻率研究

在本實施例中，在野生型小鼠中進行給藥頻率研究以確定mAb1 F11的合適給藥頻率以實現其對骨密度的最佳影響。

在野生型小鼠中以5mg/kg每週3次腹膜內給藥mAb1和mAb1 F16達11周。在研究的生命部分中，採取了幾個體內μCT時間點。對於相對於總體積的骨體積(BV/TV%)僅顯示劑量後9周的數據。

結果顯示在圖26中。兩種處理在5mg/kg觀察到與13C4處理的野生型小鼠相比BV/TV(%)的顯著變化。這些結果表明，在該給藥方案下，mAb1和mAb1 F11在野生型小鼠中在BV/TV方面誘導類似的劑量相關變化。

實施例21：在小鼠中小鼠和人骨靶向抗TGFβ抗體mAb1 F6和mAb2 D10的生物分佈

在本實施例中，進行了研究以比較野生型小鼠中螢光標記的mAb1，mAb1F6，mAb2和mAb2 D10(接合到mAb2的重鏈C-末端的D10；mAb2 F6)的生物分佈。將每種測試品和運載體的單次腹膜內劑量施用於小鼠，將小鼠在不同時間點安樂死用於組織收集。在收穫的其它組織中(數據未顯示)，在用mAb1和mAb1 F6給藥後1、4、10、20、43和98天收集腰椎，心臟，肝臟和腸。在24和96小時用mAb2和mAb2 D10給藥後也對組織進行取樣。

結果顯示在圖27-33中。圖27-30顯示了在給藥後1-98天來自給藥mAb1、mAb1 F6或運載體的小鼠的組織中的總輻射效率(TRE)。與mAb1相比，腰椎表現出強烈的持續存在的mAb1 F6，在每個時間點都具有顯著更高的總輻射效率(TRE)。在心臟和肝臟中，相對於mAb1，mAb1 F6表現出低得多的TRE。最後，在腸內運載體與任一測試品之間沒有發現顯著差異。

這些結果表明mAb1 F6的特徵在於高骨親和力，其反過來導致在其他組織(例如心臟和肝臟)中的暴露較低。結果還表明使TGF-β抑制的部位靶向骨中的安全性優勢，同時限制了系統性TGF-β抑制並減少了不良副作用。在腸中相對於運載體的任何TRE的缺乏表明螢光團在各自的抗體上保持其標記。以前的數據已經顯示，如果螢光團沒有將其標記保持在抗體上，則會在腸中被檢測到。

圖31-33顯示了給藥mAb2或mAb2 D10的小鼠的組織中的TRE。圖31顯示了與mAb2相比mAb2 D10的高骨親和力。與mAb2相比，對於mAb2 D10在股骨中觀察到顯著更高的TRE。在腰部觀察到相同的整體趨勢。給藥mAb2 D10的小鼠中的腰/血清和股骨/血清比例與給藥mAb2的小鼠中的那些相比也強烈支持了mAb2 D10的骨靶向能力(圖32和33)。

已經詳細並且通過參考其具體具體實例描述了本發明，顯而易見的是，在不背離所附請求項限定的本發明的範圍的情況下，可以進行修改和變化。更具體地說，雖然本發明的一些方面在本文中被認為是特別有利的，但是可以預期，本發明不一定限於本發明的這些特定方面。在一些具體實例中，本文公開的值可以可選地在所公開的值的±10、20或30%的量上變化，並且保持在所考慮的發明的範圍內。

除非本文另外定義，否則結合本發明使用的科學和技術術語應該具有本領域普通技術人員通常理解的含義。以下描述示例性方法和材料，儘管與本文所述相似或等同的方法和材料也可以用於本發明的實踐或測試中。本文提及的所有出版物和其他參考文獻的全部內容通過引用併入。如有衝突，以本說明書(包括定義)為准。雖然本文引用了許多文獻，但是這種引用不構成承認這些文獻中的任何文獻構成本領域公知常識的一部分。此外，除非上下文另有要求，單數形式的術語應包括複數形式，並且複數形式的術語應包括單數形式。通常，本文記載的與細胞和組織培養，分子生物學，免疫學，微生物學，遺傳學，分析化學，合成有機化學，醫學和藥物化學以及蛋白質和核酸化學和雜交有關的命名法和技術是那些在本領域中熟知並且通常使用的。根據製造商的說明書進行酶促反應和純化技術，如本領域通常完成的或如本文所述。在整個說明書和具體實例中，詞語“具有”和“包含”或諸如“含有”或“包括”的變化將被理解為暗示包含所述整數或整數的組，但不排除任何其他整數或整數組。此外，單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數指示物，除非上下文另有明確說明。例如，提到“一種抗體”是指一種或多種抗體。

為了描述和限定本發明，注意到術語“基本上”在本文中用於表示可歸因於任何定量比較，值，測量或其他表示的不確定性的固有程度。術語“基本上”在本文中也用於表示定量表示可以從所述參考變化、而不導致所討論主題的基本功能變化的程度。

如本文所用，術語“約”是指給定量的±10%，然而當所討論的量是指不可分離的物體時，例如胺基酸或其他被細分將失去其身份的物體，那麼“約”是指該不可分割對象的±1。例如，約2%的水是指1.8%至2.2%的水，而約6個胺基酸殘基是指5-7個胺基酸殘基。

如本文所使用的，術語“或”和“和/或”被用於描述彼此組合或彼此排他的多個組分。例如，“x，y和/或z”可以指單獨的“x”，單獨的“y”，單獨的“z”，“x，y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。

說明書中提及的序列提供於下表以及序列表中。

序列

<110> 健臻公司(GENZYME CORPORATION)

<120> 骨靶向抗體(BONE-TARGETING ANTIBODIES)

<130> 022548.00012

<140>

<141>

<150> 62/448,763

<151> 2017-01-20

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 1

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 2

<210> 3

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 3

<210> 4

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 4

<210> 5

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 5

<210> 6

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 6

<210> 7

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 7

<210> 8

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 10

<210> 11

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 11

<210> 12

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 12

<210> 13

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 13

<210> 14

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 14

<210> 15

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 15

<210> 16

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 16

<210> 17

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 17

<210> 18

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 18

<210> 19

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 19

<210> 20

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 20

<210> 21

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 21

<210> 22

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 22

<210> 23

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 23

<210> 24

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 24

<210> 25

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 25

<210> 26

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 26

<210> 27

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 27

<210> 28

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 28

<210> 29

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 29

<210> 30

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 30

<210> 31

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 31

<210> 32

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 32

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 33

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 34

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 35

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 36

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 37

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成肽

<400> 38

<210> 39

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 39

<210> 40

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 40

Claims

一種結合至人類TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈、輕鏈和一個或多個與重鏈和/或輕鏈的C-末端連接的聚天冬胺酸(聚D)肽，其中該一或多個聚D肽係與該重鏈或該輕鏈的胺基酸序列整合，以及其中該抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO：33-35之重鏈互補決定區(CDR)1-3以及分別含有SEQ ID NO：36-38之輕鏈CDR1-3。
如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其包含(i)與該重鏈的N-末端整合的聚D肽，(ii)與該重鏈的C-末端整合的聚D肽，或(iii)(i)與(ii)二者。
如請求項1或2的抗體或其抗原結合片段，其包含與該輕鏈的C-末端整合的聚D肽。
如請求項1或2的抗體或其抗原結合片段，其中該聚D肽經由肽接頭與該重鏈或輕鏈融合。
如請求項1或2的抗體或其抗原結合片段，其中該一個或多個聚D肽各自獨立地包含2-30個天冬胺酸殘基。
如請求項1或2的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是IgG。
如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含對應於SED ID NO：13的殘基1-120的重鏈可變結構域(V_H)胺基酸序列和對應於SEQ ID NO：15的殘基1-108的輕鏈可變結構域(V_L)胺基酸序列。
如請求項1、2、或7的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含在第228位置(EU編號)上具有脯胺酸的人IgG₄恒定區。
如請求項7的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體的重鏈包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，並且該抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
如請求項1的抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈包含SEQ ID NO：13、14、16或17的胺基酸序列，並且該輕鏈包含SEQ ID NO：15、19、21或22的胺基酸序列。
一種結合人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的IgG₄抗體，其中該抗體的重鏈包含SEQ ID NO：14或17的胺基酸序列，並且輕鏈包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1、7、9、10、或11中任一項的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的賦形劑。
一種如請求項1、7、9、10、或11中任一項的抗體或其抗原結合片段用於製備藥物的用途，該藥物用於治療受益於TGFβ抑制之患有骨病症的人。
如請求項13的用途，其中該治療在該人中造成如下至少一項：(1)TGFβ水平降低，(2)TGFβ活性降低，(3)骨流失降低，(4)骨流失率降低，(5)骨密度增加，(6)骨強度增加，和(7)IL-11水平降低。
如請求項13的用途，其中該人患有成骨不全、骨流失或骨質疏鬆、慢性腎病或具有骨轉移的癌症。
一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項1、7、9、10、或11中任一項的抗體或其抗原結合片段的重鏈、輕鏈或兩者的核苷酸序列。
一種表現載體，其包含如請求項16的分離的核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項17的表現載體。
如請求項18的宿主細胞，其中該宿主細胞是哺乳動物細胞。
一種生產如請求項1、7、9、10、或11中任一項的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括：提供包含分別編碼該抗體或抗原結合片段的重鏈和輕鏈的第一和第二核苷酸序列的宿主細胞，在允許生產該抗體或抗原結合片段的條件下培養該宿主細胞，和回收該抗體或抗原結合片段。
如請求項20的方法，其中該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO：23、24、25或26，並且該第二核苷酸序列包含SEQ ID NO：27、29、31或32。