CN114929739A - 具有可替换匹配的链间半胱氨酸的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

描述了在一个臂上具有移位的链间二硫键的同时在第二个臂上保持天然链间二硫键的工程化双特异性抗体。还描述了抗CD47/FRα双特异性抗体及其抗原结合片段。还描述了编码该抗体的核酸、包含该抗体的组合物、以及制备该抗体和使用该抗体治疗或预防疾病如癌症和/或相关并发症的方法。

Description

具有可替换匹配的链间半胱氨酸的双特异性抗体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月17日提交的美国临时申请号62/948,953；2019年12月23日提交的美国临时申请号62/952,747；2020年3月11日提交的美国临时申请号62/988,144；2020年4月10日提交的美国临时申请号63/007,996；2020年6月5日提交的美国临时申请号62/704,973；和于2020年8月21日提交美国临时申请号62/706,511的优先权。每个公开内容均通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及在一个臂上具有移位的链间二硫键同时在第二臂上保持天然链间二硫键的工程化双特异性抗体。这些双特异性抗体具有稳定性和生产优势，可用于治疗目的。本发明涉及双特异性抗体、编码该抗体的核酸和表达载体、含有该载体的重组细胞以及包含该抗体的组合物。还提供了制备抗体的方法，以及使用抗体治疗包括癌症和/或相关并发症的疾病的方法。

对以电子形式提交的序列表的引用

本申请包含一个序列表，该序列表通过EFSWeb以ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“065799.30WO1序列表”，创建日期为2020年11月24日，大小为36kb。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并通过引用整体并入本文。

背景技术

抗体(免疫球蛋白)是天然存在的蛋白质，在免疫系统保护身体免受细菌和病毒等异物侵害方面发挥重要作用。天然结构中的抗体以Y形蛋白的形式存在，由两个臂组成，每个臂包含相同的重链(HC)和相同的轻链(LC)。重链包含一个可变区(VH)和三个恒定区(分别为CH1、CH2和CH3)，从N端到C端按VH、CH1、CH2和CH3的顺序排列，并且轻链包含一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)，从N端到C端以VL和CL的顺序排列。每个臂中重链和轻链的结合通常称为“配对”，包括VH、CH1、VL和CL。VH和VL通过物理上的相互作用，形成抗体针对其抗原的结合域，使Y型抗体具有两个相同的结合域，每条臂上有一个针对相同抗原的结合域，因此具有二价单特异性，是单克隆抗体的典型特征。

作为抗体结构的一部分，CH1和CL也在物理上相互作用，这涉及物理接触以及由分别位于CH1和CL上的两个天然半胱氨酸的游离硫醇基形成的链间二硫键(也称为“二硫桥”)。链间二硫键有助于稳定由每个臂上的重链和轻链形成的整体结构。此外，链内二硫键也作为天然抗体结构的一部分形成。重链(CH2和CH3)的C末端形成紧密结构，这对于天然抗体的二价性很重要。

单克隆抗体(mAb)因其与抗原的高亲和力结合、较长的体内半衰期、天然存在的稳定结构、激活免疫系统对抗药物靶标的能力等许多其他方面，一直是一种出色的蛋白质治疗平台。然而，当治疗策略需要用一种抗体靶向两种不同的抗原时，例如同一癌细胞上的两种肿瘤特异性抗原，单克隆抗体就无法达到目的。在这种情况下，制造双特异性抗体以靶向同一细胞上的两种不同抗原，其中一个臂与第一个抗原结合，另一个臂与第二个抗原结合。尽管对于每种抗原结合是单价，但与同一细胞上的两种抗原的结合可以补偿由于失去针对每种抗原的二价而导致的亲合力损失。与mAb相比，双特异性抗体提供更高的选择性，因为它们与表达两种抗原的细胞的结合比仅表达一种抗原的细胞更高。当正常细胞或组织表达两种抗原之一时，这对于减少安全问题尤其重要。当双特异性抗体与两种不同的细胞表面抗原或可溶性配体/蛋白质结合时，它可以同时靶向两种途径，这是与mAb相比的另一个优势。

如果双特异性抗体由两种mAb制成，则产品将分别包含来自两种mAb的两个不同臂，每个臂具有独特的重链和独特的轻链。在制造过程中，双特异性抗体在生产细胞中的表达需要表达4种不同的蛋白质：两条不同的重链和两条不同的轻链。虽然目标是在生产过程中使双特异性抗体的每条臂上的每个HC与其对应的LC配对，但通常会发生错配(一个臂的LC与另一个臂的HC配对)并产生不需要的产物，因此很难生产和分离预期的双特异性抗体产品。已经采用了几种方法来改进双特异性抗体的制造方面。一个例子是通过蛋白质工程鉴定共同的轻链。然而，域交换和许多突变可以显著改变天然抗体结构，这会增加聚集的风险和/或降低稳定性。

FRα的表达在某些实体瘤如卵巢癌、肺癌和乳腺癌中升高(Toffoli等人，IntJCancer 1997；74:193-198和Boogerd等人，Oncotarget 2016；7:17442-17454)，但其在有限的正常人体组织中的表达水平较低(Weitman等人，Cancer Res 1992；52:3396-3401)。与这一观察结果一致，到目前为止，针对FRα的小分子和大分子进行的1期临床试验显示出良好的药物耐受性(Cheung等人，Oncotarget 2016；7:52553–52574)。因此，FRα是癌症治疗的理想靶点。此外，介导“不要吃我”信号的CD47在许多肿瘤中过度表达。一个臂与CD47结合，另一臂与FRα结合的双特异性抗体(称为抗CD47/FRα双特异性抗体)可用于选择性靶向表达两种抗原的细胞。由于亲和力，双特异性抗体与同一细胞上的两种抗原的结合可导致与任一臂相比增加的亲和力。由于与二价抗CD47 mAb相比缺乏亲和力，双特异性抗体预计对仅表达CD47(但不表达FRα)的细胞具有较弱的活性，这可能会增加安全性和/或耐受性范围。抗CD47/FRα双特异性抗体可以选择性地阻断CD47/SIRPα与同时表达CD47和FRα的细胞的相互作用，并激活针对该细胞的先天免疫系统，例如癌细胞。因此，抗CD47/FRα双特异性抗体可以成为卵巢癌和其他在细胞表面表达显著水平的CD47和FRα的肿瘤的有效疗法。

发明概述

在一个总的方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区；和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区；

其中CH1和CL区在对应于CH1的SEQ ID NO：15、21、22或23的氨基酸位置和对应于CL的SEQ ID NO：19或24的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代或天然氨基酸；

其中CH1和CL区的氨基酸取代或天然氨基酸选自：

(1)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的F209C和C214X；

(2)CH1中的S131C和C220X，以及CL中的P119C和C214X；

(3)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的K207C和C214X；

(4)CH1中的F170C和C220X，以及CL中的S176C和C214X；

(5)CH1中的P171C和C220X，以及CL中的S162C和C214X；

(6)CH1中的V173C和C220X，以及CL中的Q160C和C214X；

(7)CH1中的F170C和C131X，以及CL中的S176C和C214X；

(8)CH1中的P171C和C131X，以及CL中的S162C和C214X；

(9)CH1中的V173C和C131X，以及CL中的Q160C和C214X；

(10)CH1中的A129C和C220X，以及CL中的S121C和C214X；

(11)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的I117C和C214X；

(12)CH1中的C131，以及CL中的P119C和C214X；

(13)CH1中的A129C和C131X，以及CL中的S121C和C214X；

(14)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的K207C和C214X；

(15)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的I117C和C214X；

(16)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的L117C和C214X；

(17)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的L117C和C214X；

(18)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的F209C和C214X；

(19)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的V209C和C214X；或者

(20)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的V209C和C214X；

其中X选自S、A或G。

在另一个总的方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区和重链可变区(VH区)；

和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区和轻链可变区(VL区)；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区在对应于CH1的SEQ ID NO:15、21、22或23；VH的SEQID NO:13；CL的SEQ ID NO:19或24；和VL的SEQ ID NO:17的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区中的氨基酸取代选自：

(1)CH1中的C220X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；或者

(2)CH1中的C131X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；

其中X选自S、A或G。

在某些实施方式中，第一抗原结合域是CD47结合域。在某些实施方式中，VH区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，CHl区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL区包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和CL区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在某些实施方式中，包含H2和L2的第二臂不包含包含H1和L1的第一臂的氨基酸取代。在某些实施方式中，两条重链H1和H2各自包含VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列。在某些实施方式中，两条重链H1和H2各自包含VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，两条重链H1和H2各自包含VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列。在某些实施方式中，两条轻链L1和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列。在某些实施方式中，两条轻链L1和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。

在某些实施方式中，H1和H2形成异二聚体。

在某些实施方式中，分离的人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够阻断信号调节蛋白α(SIRP()与表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47的结合。

在某些实施方式中，分离的人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够诱导巨噬细胞介导的表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用。

在某些实施方式中，分离的人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够结合表达FRα和CD47的癌细胞，并将与人红细胞(RBC)的结合最小化到不可检测。

还提供了编码本文公开的本发明的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。

还提供了包含编码本文公开的本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离核酸的载体。

还提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本文公开的本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。

在某些实施方式中，提供了包含本发明的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。

还提供了靶向在有需要的受试者的癌细胞表面上表达的FRα和CD47的方法，包括向受试者施用包含本发明的分离的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或抗原结合片段的药物组合物。

还提供了在有需要的受试者中阻断SIRPα与表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47结合的方法，包括向受试者施用包含本发明的分离的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

还提供了在有需要的受试者中诱导巨噬细胞介导的表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用的方法，包括向受试者施用包含本发明的分离的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

还提供了在有需要的受试者中通过抗CD47/抗FRα双特异性抗体或抗原结合片段结合表达FRα和CD47的癌细胞而与人红细胞(RBC)的结合最小化至不可检测的方法，包括向受试者施用包含本发明的分离的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

还提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。癌症可以是任何液体或固体癌症，例如，可以选自但不限于肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性粒细胞白血病(AML)和其他液体肿瘤.

还提供了产生本发明的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码该抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，并回收来自细胞或培养物的抗体或其抗原结合片段。

还提供了制备包含本发明的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。

附图的简要说明

结合附图阅读时，将更好地理解上述概述以及以下对本申请的优选实施例的详细描述。然而，应当理解，本申请不限于附图中所示的具体实施例。

图1A和1B显示了包含针对一种抗原(例如CD47)的右臂和针对第二种抗原(例如FRα)的左臂的双特异性抗体的示意性结构。两个臂具有不同的重链VH和轻链VL区；出于举例的目的，双特异性抗体的重链(HC)和轻链(LC)分别位于IgG1和κ的框架内。在两个HC的CH3区域中引入了孔中的旋钮(KiH)突变，以促进异二聚体的形成。此外，分别将半胱氨酸残基引入两个CH3区域中的每一个，以促进链间二硫键的形成以稳定异二聚体。如图1A所示，通过将形成二硫键的天然半胱氨酸转化为丝氨酸，消除了CH1和CL之间的天然链间二硫键(由虚线标记)；分别在CH1和CL上的两个天然非半胱氨酸残基被转化为半胱氨酸，在CH1和CL之间形成新的链间二硫键。图1B中使用了类似的策略，除了右臂的HC和LC之间新形成的链间二硫键位于VH和VL区域之间。H1和L1分别是mAb 1臂的重链和轻链，H2和L2分别是mAb 2臂的重链和轻链。

图2A-2F显示了各种抗体组分的序列。图2A-2D分别显示了mAb 1(在人IgG1重链和κ轻链上)和mAb 2(在人IgG1重链和κ轻链上)的VH(图2A)、CH1(图2B)、VL(图2C)和CL(图2D)序列(mAb 1的VH(SEQ ID NO:13)；mAb 2的VH(SEQ ID NO:14)；mAb 1的CH1(SEQ ID NO:15)；mAb 2的CH1(SEQ ID NO:16)；mAb 1的VL(SEQ ID NO:17)；mAb 2的VL(SEQ ID NO:18)；mAb 1的CL(SEQ ID NO:19)；mAb 2的CL(SEQ ID NO:20))。通过Kabat方法确定的CDR区域被突出显示。还突出显示了参与每个臂的重链和轻链之间的链间二硫键形成的半胱氨酸残基。图2E显示了人IgG2(SEQ ID NO：21)、IgG3(SEQ ID NO：22)和IgG4(SEQ ID NO：23)的CH1区的比对。图2F显示了人λ轻链的CL区(SEQ ID NO：24)。*代表已知等位基因变异的位点。

图3A-3L显示了mAb 1臂中的Fab区(包含VH、CH1、VL和CL)的3-D建模，以识别半胱氨酸敲入的潜在位点以在HC和LC之间形成新的链间二硫键。虚线表示HC和LC之间的天然链间二硫键(天然链间二硫键区域不包括在bsAb 9、10、11和12的模型中，因此，在这4个bsAbs模型中没有虚线)；实线表示由新敲入的半胱氨酸形成的潜在的新链间二硫键。图3A，bsAb1的3-D模型；图3B，bsAb 2的3-D模型；图3C，bsAb 3的3-D模型；图3D，bsAb 4的3-D模型；图3E，bsAb 5的3-D模型；图3F，bsAb 6的3-D模型；图3G，bsAb 7的3-D模型；图3H，bsAb 8的3-D模型；图3I，bsAb 9的3-D模型；图3J，bsAb 10的3-D模型；图3K，bsAb 11的3-D模型；图3L，bsAb 12的3-D模型。

图4A-4H显示了含有不同移位链间二硫键的突变mAb在还原或非还原条件下的RP-HPLC图谱；图4I-4J显示了在ELISA测定中含有不同移位链间二硫键的突变mAb与CD47的结合。

图5A-5G显示了在热稳定性研究中含有不同移位链间二硫键的突变mAb的SEC(尺寸排阻色谱)图谱，其中样品在不同温度下孵育5分钟。显示了对应于每个温度的色谱图。每个图中的表格显示了对于每个给定温度的不同峰的％AUC(曲线下面积)。图5A，具有M1设计的突变mAb；图5B，具有M2设计的突变mAb；图5C，具有Z1设计的突变mAb；图5D，具有Z2设计的突变mAb；图5E，具有bsAb 10设计的突变mAb；图5F，具有bsAb 11设计的突变mAb；图5G，具有bsAb 12设计的突变mAb。HMW，高分子量物质；MMW，中等分子量物质(突变mAb)；LMW，低分子量物质。

图6A-6H显示了在pH稳定性研究中含有不同移位链间二硫键的突变mAb的SEC(尺寸排阻色谱)图谱，其中样品在室温下在pH3.0孵育不同时长。显示了对应于每个孵育时长(0、1、3、5和7小时)的色谱图；0小时色谱图代表未经过pH3.0孵育的样品。每个图中的表格显示了每个给定孵育期的不同峰的％AUC(曲线下面积)。图6A，具有M1设计的突变mAb；图6B，具有M2设计的突变mAb；图6C，具有Z1设计的突变mAb；图6D，具有Z2设计的突变mAb；图6E，具有bsAb 5设计的突变mAb；图6F，具有bsAb 10设计的突变mAb；图6G，具有bsAb 11设计的突变mAb；图6H，具有bsAb 12设计的突变mAb。HMW，高分子量物质；MMW，中等分子量物质(突变mAb)；LMW，低分子量物质。

图7A-7D显示了使用蛋白A色谱纯化的双特异性抗体的SDS-PAGE图像。图7C，SDS-PAGE在非还原条件下进行；图7D，SDS-PAGE在还原条件下进行。

图8A-8J显示的图表显示了蛋白A纯化的双特异性抗体与两种抗原(即，CD47和FRα)在桥接ELISA测定中的结合结果。

图9A-9N显示了使用蛋白A色谱法纯化的双特异性抗体(图9A-9E)或使用蛋白A色谱法后用疏水相互作用色谱法(HIC)纯化的双特异性抗体(图9F-9N)的尺寸排阻色谱(SEC)图谱。图9A，bsAb 1的SEC图谱；图9B，bsAb 5的SEC图谱；图9C，bsAb6的SEC图谱；图9D，bsAb7的SEC图谱；图9E，bsAb 8的SEC图谱；图9F，bsAb5b(E/K)的SEC图谱；图9G，bsAb 10(E/K)的SEC图谱；图9H，bsAb 12(E/K)的SEC图谱；图9I，bsAb 5b(K/E)的SEC图谱；图9J，bsAb 10(K/E)的SEC图谱；图9K，bsAb 12(K/E)的SEC图谱；图9L，bsAb 5b的SEC图谱；图9M，bsAb 10的SEC图谱；图9N，bsAb 12的SEC图谱。

图10A-10L显示了HIC纯化的双特异性抗体在非还原条件下的RP-HPLC图谱。图10A，bsAb 6的RP-HPLC图谱；图10B，bsAb 7的RP-HPLC图谱；图10C，bsAb 8的RP-HPLC图谱；图10D，bsAb 5b(E/K)的RP-HPLC图谱；图10E，bsAb 10(E/K)的RP-HPLC图谱；图10F，bsAb 12(E/K)的RP-HPLC图谱；图10G，bsAb 5b(K/E)的RP-HPLC图谱；图10H，bsAb 10(K/E)的RP-HPLC图谱；图10I，bsAb 12(K/E)的RP-HPLC图谱；图10J，bsAb 5b的RP-HPLC图谱；图10K，bsAb 10的RP-HPLC图谱；图10L，bsAb 12的RP-HPLC图谱。

图11A-11N显示了HIC纯化的双特异性抗体在还原条件下的RP-HPLC图谱。图11A，对照抗体#1与bsAb 7的H1、H2和L1组装并用蛋白A色谱法纯化的RP-HPLC图谱；图11B，对照抗体#2与bsAb 7的H1、H2和L2组装并用蛋白A色谱法纯化的RP-HPLC图谱；图11C，HIC纯化的bsAb 6的RP-HPLC图谱；图11D，HIC纯化的bsAb 7的RP-HPLC图谱；图11E，HIC纯化的bsAb 8的RP-HPLC图谱；图11F，HIC纯化的bsAb 5b(E/K)的RP-HPLC图谱；图11G，HIC纯化的bsAb 10(E/K)的RP-HPLC图谱；图11H，HIC纯化的bsAb 12(E/K)的RP-HPLC图谱；图11I，HIC纯化的bsAb5b(K/E)的RP-HPLC图谱；图11J，HIC纯化的bsAb 10(K/E)的RP-HPLC图谱；图11K，HIC纯化的bsAb 12(K/E)的RP-HPLC图谱；图11L，HIC纯化的bsAb 5b的RP-HPLC图谱；图11M，HIC纯化的bsAb 10的RP-HPLC图谱；图11N,HIC纯化的bsAb 12的RPHPLC图谱。H1和L1分别代表mAb1(抗CD47)臂的HC和LC；H2和L2分别代表mAb 2(抗FRα)臂(图11A-11E)或mAb 2b(抗FRα)臂(图11F-11N)的HC和LC。预测面积％代表根据每条链的氨基酸序列计算的AUC比率；面积％代表在还原条件下使用RP-HPLC上每种双特异性抗体的所有4个峰的AUC计算的AUC比率。

图12A-12F显示的图表显示了HIC纯化的双特异性抗体在桥接ELISA测定中与两种抗原(即CD47和FRα)结合的结果。图12A，bsAb 6、bsAb 7和bsAb 8的桥接ELISA数据；图12B，bsAb 5b(E/K)、bsAb 10(E/K)和bsAb 12(E/K)的桥接ELISA数据；图12C，bsAb 5b(K/E)的桥接ELISA数据；图12D，bsAb 10的桥接ELISA数据(K/E)；图12E，bsAb 12的桥接ELISA数据(K/E)；图12F，bsAb 5b、bsAb 10和bsAb 12的桥接ELISA数据。

图13A-13C显示了HIC纯化的双特异性抗体与已知表达CD47和FRα的SK-OV-3细胞的结合。

图14A-14C显示了HIC纯化的双特异性抗体的木瓜蛋白酶消化样品的质谱(MS)图谱。鉴定了从每个双特异性抗体的两个臂(mAb 1臂和mAb 2臂)产生的Fab片段。图14A，木瓜蛋白酶消化的bsAb 6的MS图谱；图14B，木瓜蛋白酶消化的bsAb 7的MS图谱；图14C，木瓜蛋白酶消化的bsAb 8的MS图谱。

图15A-15F显示了HIC纯化的双特异性抗体的胰蛋白酶消化样品的MS图谱。鉴定了从每个双特异性抗体的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段。形成二硫键的半胱氨酸以粗体形式显示。图15A，由胰蛋白酶消化的bsAb 6的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段的MS图谱；图15B，由胰蛋白酶消化的bsAb 7的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段的MS图谱；图15C，由胰蛋白酶消化的bsAb 8的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段的MS图谱；图15D，由胰蛋白酶消化的bsAb 5b的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段的MS图谱；图15E，由胰蛋白酶消化的bsAb 10的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段的MS图谱；图15F，由胰蛋白酶消化的bsAb 12的mAb 1臂产生的二硫键交联肽片段的MS图谱。

图16A-16C显示了HIC纯化的双特异性抗体的IdeZ蛋白酶消化样品的MS图谱。鉴定了从每种双特异性抗体产生的(Fab')2。图16A，bsAb 6(Fab’)2的MS图谱；图16B，bsAb 7(Fab')2的MS图谱；图16C，bsAb 8(Fab')2的MS图谱。

图17A-17C显示了在FACS测定中由抗CD47或抗FRα亲本mAb产生的F(ab')2对抗体结合SK-OV-3细胞的抑制。图17A，bsAb 5b；图17B，bsAb 10；图17C，bsAb12。抗FRα亲本mAb，源自该mAb的抗FRα臂用于构建双特异性抗体bsAb 5b、bsAb10和bsAb 12；抗CD47亲本mAb，源自该mAb的抗CD47臂用于构建双特异性抗体bsAb 5b、bsAb 10和bsAb 12；Ab，抗体。测定中使用的抗体浓度显示在每张图下方；5,000nM F(ab')2用于评估抑制作用。

图18A-18B显示了两种抗原(CD47和FRα)与双特异性抗体bsAb 12在Biacore上的顺序结合。

图19A-19C显示来自蛋白A纯化的双特异性抗体的木瓜蛋白酶消化样品的Fab片段的MS图谱。图19A，蛋白A纯化的野生型双特异性抗体；图19B，蛋白A纯化的bsAb 10；图19C，蛋白A纯化的bsAb 12。野生型双特异性抗体，通过共表达mAb1臂和mAb 2b臂产生的双特异性抗体，没有引入突变(天然链间二硫键在两个臂上)；H1和L1分别是mAb 1臂的重链和轻链，H2和L2分别是mAb 2b臂的重链和轻链；

H1/L2 Fab和H2/L1 Fab代表重链/轻链错配物质的Fab片段。ND，未检测到。

图20.来自木瓜蛋白酶消化的bsAb 12的Fab片段的MS图谱，该片段先用蛋白A纯化，然后进行HIC纯化。未检测到错配物种。

发明详述

在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一个都通过引用整体并入本文。已经包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品等的讨论是为了提供本发明的上下文。这样的讨论并不承认任何或所有这些事项构成与任何公开或要求保护的发明相关的现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文使用的某些术语具有说明书中规定的含义。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。

除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所列举值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围、该范围内的所有单独数值，包括此类范围内的整数和值的分数，除非上下文另有明确指示。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方式的许多等效物。这样的等效物意在被本发明所涵盖。

如本文所用，术语“包括”(comprises)、“包含”(comprising)、“包括”(includes)、“包括”(including)、“有”(has)、“具有”(having)、“含有”(contains)或“含”(containing)或其任何其他变体将被理解为暗示包含指定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备固有的其他元素。此外，除非有明确的相反说明，否则“或”是指包含性的或，而不是排他性的或。例如，条件A或B满足以下任一条件：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，并且两者A和B为真(或存在)。

如本文所用，多个列举的元素之间的连接术语“和/或”被理解为包括单独的和组合的选项。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指没有第二个元素的第一个元素的适用性。第二个选项是指没有第一个元素的第二个元素的适用性。第三种选项是指第一个和第二个要素一起的适用性。这些选项中的任何一个都应理解为落入该含义内，从而满足本文所用术语“和/或”的要求。多个选项的同时适用性也被理解为落入该含义内，从而满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“由……组成”(consistsof)或诸如“由……构成”(consist of)或“由……形成”(consisting of)之类的变体表示包括任何列举的整数或整数组，但没有附加的整数或整数组可以添加到指定的方法、结构或组合中。

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”(consists essentially of)或诸如“基本上由……构成”(consist essentially of)或“基本上由……形成”(consisting essentially of)之类的变体表示包括任何列举的整数或整数组，并且可选地包括不实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖性质的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人类。如本文所用，术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴子、人等，更优选人。

词语“右”、“左”、“下”和“上”表示参考的附图中的方向。

还应理解，本文使用的术语“大约”(about)、“大概”(approximately)、“一般”(generally)、“基本上”(substantially)和类似术语在指代优选发明的组件的尺寸或特征时表示所描述的尺寸/特征如本领域普通技术人员所理解的，不是严格的边界或参数，并且不排除功能相同或相似的微小变化。至少，包含数字参数的此类参考将包括使用本领域接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化.

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“不同的重链”或“不同的轻链”表示重链或轻链具有彼此不相同的序列。

在两个或多个核酸或多肽序列(例如，双特异性抗体、抗-FRα抗体、抗-CD47抗体、抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体、FRα编码它们的多肽和多核苷酸，以及编码它们的CD47多肽和多核苷酸)的情况下，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行比较或对比以获得最大对应时，两个或多个序列或子序列是相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列最佳比对可以通过以下进行，例如，通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过计算机实现这些算法(威斯康星州的575科学Madison博士的遗传学计算机组的遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(通常参见F.M.Ausubel等人编辑的《分子生物学当前技术》(Current Protocols inMolecular Biology)，格林联合出版公司(Greene Publishing Associates,Inc.)和约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)的合资企业，(1995年增补)(Ausubel))。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法示例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中进行了描述。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法首先通过识别查询序列中长度为W的短序列来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的序列对齐时，这些序列匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻近词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻近词命中充当启动搜索的种子，以查找包含它们的更长HSP。然后沿着每个序列在两个方向上延伸序列命中，直到累积对齐分数不再增加。

对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。在以下情况下，序列命中在每个方向上的扩展将停止：累积对齐分数从其最大达到值下降了X数量；由于一个或多个负分数残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或到达任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较中的最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本上相同的进一步指示是由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽免疫交叉反应，如下所述。因此，一种多肽通常与第二种多肽基本相同，例如，其中两种肽仅通过保守取代不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。

如本文所用，术语“多核苷酸”同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”，是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、以及作为单链和双链区域的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或更典型地是双链或单链和双链区域的混合物。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和不常见的碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的核酸链，通常称为寡核苷酸。

如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一个核酸区段以引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方式中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染的细胞。在另一个实施方式中，“宿主细胞”是这种转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可能与亲代细胞相同或可能不同，例如，由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语包括将基因转录成RNA。该术语还涵盖将RNA翻译成一种或多种多肽，并进一步涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的双特异性抗体可以在宿主细胞的细胞质内、细胞外环境例如细胞培养物的生长培养基中或锚定在细胞膜上。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可以指由氨基酸组成的分子并且可以被本领域技术人员识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸打断。该术语还包括天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的结合。定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。

本文所述的肽序列是根据通常的惯例编写的，其中肽的N-末端区域在左侧，C-末端区域在右侧。尽管氨基酸的异构形式是已知的，但除非另有明确说明，否则所代表的是氨基酸的L型。

双特异性抗体

本发明总体上涉及分离的双特异性抗体，其中通过将天然半胱氨酸残基转化为非半胱氨酸(例如，天然半胱氨酸残基到丝氨酸残基)来消除一个臂的重链CH1区和轻链CL区之间的链间二硫键的天然半胱氨酸残基残基；同时或随后，同一臂的CH1和CL区或VH和VL区中的两个天然非半胱氨酸残基被转化为半胱氨酸，从而在重链和轻链之间形成新的链间二硫键。两个天然非半胱氨酸残基，CH1区和CL区各一个或VH区和VL区各一个，通过结构建模确定它们的接近性和一旦转化为半胱氨酸形成链间二硫键的潜力。氨基酸取代对抗原结合结构域的整体结构造成的干扰最小。本发明的总体效果是双特异性抗体的一个臂中的CH1和CL区之间的天然链间二硫键随着重组引入的半胱氨酸转移到不同的位点，并且第二臂中的天然链间二硫键没有改变。

本发明总体上还涉及分离的双特异性抗体，其中一个臂具有如上所述的移位的链间二硫键，而另一臂具有产生异二聚体的天然链间二硫键，其中一个臂包含移位的链间二硫键并且第二臂包含天然链间二硫键。双特异性抗体能够结合两种抗原。由两条不同的重链(HC)和轻链(LC)形成的双特异性抗体难以生产，因为两条重链和两条轻链有不正确配对的倾向，而这导致其生产出在生产过程中难以消除的不需要的产品；即使在纯化过程中可以消除来自错配的不需要的产物，错配也会降低预期双特异性抗体产物的生产效率。已经尝试了不同的策略来减少或消除HC和LC的错配，但其中许多策略涉及蛋白质工程，包括结构域交换和诱变，因此导致聚集和免疫原性风险增加。通过在一个臂中引入“移位的链间二硫键”，而在第二臂中保持天然链间二硫键，同时在孔(hole)中引入旋钮(knob)和在Fc区中形成二硫键的半胱氨酸突变，可以以提高的效率产生异源二聚体双特异性抗体。可以通过共表达两条重链和两条轻链来产生此类双特异性抗体，包括但不限于抗CD47/抗FRα双特异性抗体。

抗体

本发明总体上涉及在一个臂上具有移位的链间二硫键而在第二臂上保留天然链间二硫键的分离的双特异性抗体。具体而言，本发明总体上涉及抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体、编码该抗体的核酸和表达载体、含有该载体的重组细胞以及包含该抗体的组合物。还提供了制备抗体的方法，以及使用抗体治疗疾病，包括癌症的方法。本发明的抗体具有一种或多种所需的功能特性，包括但不限于与FRα和CD47的高亲和力结合、对FRα和CD47的高特异性、诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解的能力、刺激补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力，抗体依赖性吞噬作用(ADPC)，和/或针对表达FRα和/或CD47的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，介导偶联药物募集的能力，以及单独或与其他抗癌疗法联合给药时在受试者和动物模型中抑制肿瘤生长的能力。

如本文所用，术语“抗体”在广义上使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人的、人源化的、复合的和嵌合的抗体以及单克隆或多克隆的抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类别(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五种主要类别或相应亚类中的任何一种。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。脊椎动物物种的抗体轻链可以归为两种明显不同的类型之一，即κ和λ，基于其恒定结构域的氨基酸序列。因此，本发明的抗体可以包含κ或λ轻链恒定结构域。根据特定实施方式，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定结构域外，抗体还含有一个由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每一个都包含三个结构域(即互补决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域可替代地称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，而重链可变区结构域可替代地称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

有几种系统用于对抗体中的氨基酸残基进行编号。Kabat编号方法是基于抗体可变区的方案(Elvin A.Kabat等人，《免疫学相关蛋白质序列》第5版(1991)。EU编号系统广泛用于恒定结构域(包括CH1、铰链和Fc部分)(Elvin A.Kabat等人，《免疫学相关蛋白质序列》第5版(1991)。

如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合FRα的分离抗体基本上不含不结合FRα的抗体，与CD47特异性结合的分离抗体基本上不含不与CD47结合的抗体，特异性结合CD47和FRα的双特异性抗体基本上不含不与CD47和FRα结合的抗体)。此外，分离的抗体基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的个体抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的突变。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA法制备。例如，单克隆抗体可以由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物如转基因小鼠或大鼠获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定双抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体、或任何其他与抗原结合但不包含完整的抗体结构的抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段所结合的相同抗原结合。根据具体实施方式，抗原结合片段包含轻链可变区，轻链恒定区，和重链的Fd片段。根据其他特定实施方式，抗原结合片段包含Fab和F(ab')。

如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域常规的单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域常规的单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。

如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体，其使用本领域已知的任何技术制造。人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指经过修饰以增加与人抗体序列同源性的非人抗体，从而保留抗体的抗原结合特性，但降低了其在人体内的抗原性。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链的可变区通常对应于源自具有所需特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区对应于源自另一种哺乳动物(例如人)的抗体序列，以避免在该物种中引发免疫反应。

如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性，和第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方式中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施方式中，第一和第二表位重叠或基本重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位不重叠或基本不重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一个实施方式中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变域序列。在一个实施方式中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施方式中，第一和第二表位重叠或基本重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变域序列和轻链可变域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变域序列和轻链可变域序列。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。

如本文所用，术语“FRα”是指叶酸受体α，也称为叶酸受体1(FOLR1)或叶酸结合蛋白(FBP)，它是细胞表面的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的膜蛋白，对叶酸的活性形式5-甲基四氢叶酸(5-MTF)及其衍生物具有高亲和力并将其转运到细胞中(Salazar和Ratnam，Cancer Metastasis Rev 2007；26：141-52)。FRα已成为肿瘤学靶点，因为它在某些实体瘤如卵巢癌、肺癌和乳腺癌中过度表达(Toffoli等人，Int J Cancer 1997；74:193-198和Boogerd等人，Oncotarget 2016；7:17442-17454)，但其在有限的正常人体组织中的表达水平较低(Weitman等人,Cancer Res 1992；52:3396-3401)。与这一观察一致，迄今为止，针对FRα的小分子和大分子进行的1期临床试验显示出良好的药物耐受性(Cheung等人，Oncotarget 2016；7:52553–52574)。所以，FRα是一种肿瘤相关/肿瘤特异性抗原，抗FRα单克隆抗体(mAb)和双特异性抗体可能是潜在的抗癌疗法。此外，FRα可用于将治疗分子特异性靶向癌细胞。人FRα的示例性氨基酸序列由GenBank登录号NP_057937.1表示。

如本文所用，术语“CD47”是指属于免疫球蛋白超家族的多跨膜受体，已表明其参与多种细胞过程，包括细胞迁移、粘附和T细胞功能。CD47，也称为整合素相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原(OA3)、Rh相关抗原和MER6，最初被确定为人类卵巢癌的肿瘤抗原，随后显示在多个人类肿瘤类型上表达，包括血液肿瘤和实体肿瘤。CD47与信号调节蛋白α(SIRP)(一种在巨噬细胞上表达的抑制性蛋白)之间的相互作用，阻止了表达CD47的细胞的吞噬作用。CD47在几乎所有非恶性细胞上也以低水平表达。术语“人CD47”指来源于人的CD47。人CD47的示例性氨基酸序列由GenBank登录号NP_001768.1表示。

如本文所用，“特异性结合CD47和/或FRα”的抗体是指结合CD47和/或FRα，优选人CD47和/或人FRα的抗体，其KD为1×10^-7M或更小，优选1×10^-8M或更小，更优选5×10^-9M或更小，1×10^-9M或更小，5×10^-10M或更小，或1×10^-10M或更小。术语“KD”是指解离常数，它由Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。鉴于本公开，可以使用本领域中的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振，例如通过使用生物传感器系统，例如

系统，或通过使用生物层干涉技术，例如Octet RED96系统来确定。

抗体的KD值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。

根据另一个具体方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区；和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区；

其中CH1和CL区在对应于CH1的SEQ ID NO：15、21、22或23的氨基酸位置和对应于CL的SEQ ID NO：19或24的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代或天然氨基酸；

其中CH1和CL区的氨基酸取代或天然氨基酸选自：

(1)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的F209C和C214X；

(2)CH1中的S131C和C220X，以及CL中的P119C和C214X；

(3)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的K207C和C214X；

(4)CH1中的F170C和C220X，以及CL中的S176C和C214X；

(5)CH1中的P171C和C220X，以及CL中的S162C和C214X；

(6)CH1中的V173C和C220X，以及CL中的Q160C和C214X；

(7)CH1中的F170C和C131X，以及CL中的S176C和C214X；

(8)CH1中的P171C和C131X，以及CL中的S162C和C214X；

(9)CH1中的V173C和C131X，以及CL中的Q160C和C214X；

(10)CH1中的A129C和C220X，以及CL中的S121C和C214X；

(11)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的I117C和C214X；

(12)CH1中的C131，以及CL中的P119C和C214X；

(13)CH1中的A129C和C131X，以及CL中的S121C和C214X；

(14)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的K207C和C214X；

(15)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的I117C和C214X；

(16)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的L117C和C214X；

(17)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的L117C和C214X；

(18)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的F209C和C214X；

(19)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的V209C和C214X；或者

(20)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的V209C和C214X；

其中X选自S、A或G。

根据另一个具体方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区和重链可变区(VH区)；

和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区和轻链可变区(VL区)；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区在对应于CH1的SEQ ID NO:15、21、22或23VH的SEQID NO:13，CL的SEQ ID NO:19或24和VL的SEQ ID NO:17的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区中的氨基酸取代选自：

(1)CH1中的C220X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；或者

(2)CH1中的C131X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；

其中X选自S、A或G。

根据另一个具体方面，第一抗原结合结构域是CD47结合结构域。在某些实施方式中，VH区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，CHl区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL区包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和CL区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

根据另一个具体方面，(a)包含H2和L2的第二臂不包含包含H1和L1的第一臂的氨基酸取代；(b)两条重链H1和H2各包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列；(c)两条重链H1和H2各包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列；(d)两条重链H1和H2各自包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列；(e)两条轻链L1和L2各自包含VL区和CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列；和/或(f)两条轻链Ll和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。

在另一个具体方面，H1和H2形成异二聚体。

在另一个具体方面，(a)H1的VH区和L1的VL区分别具有Q39E和Q38K取代突变，H2的VH区和L2的VL区分别具有Q39K和Q38E取代突变；或者H1的VH区和L1的VL区分别具有Q39K和Q38E取代突变，H2的VH区和L2的VL区分别具有Q39E和Q38K取代突变。

在另一个具体方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段是抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够阻断信号调节蛋白α(SIRPα)与表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47结合。在某些实施方式中，分离的人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够诱导巨噬细胞介导的对表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用。在某些实施方式中，分离的人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够结合表达FRα和CD47的癌细胞，而将与人红细胞(RBC)的结合最小化到不可检测。

在另一个具体方面，第一抗原结合结构域具有SEQ ID:13的VH序列和SEQ ID:17的VL序列，并且第二抗原结合结构域具有SEQ ID:33的VH序列和SEQ ID:35的VL序列；或者第一抗原结合结构域具有SEQ ID:13的VH序列和SEQ ID:17的VL序列，并且第二抗原结合结构域具有SEQ ID:14的VH序列和SEQ ID:18的VL序列。

本发明的全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过在每个半分子中的重链CH3界面处引入取代以有利于在体外在无细胞环境中两个具有明显特异性的抗体半分子的异二聚体形成或使用共表达来产生。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离结合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。所得亲本单特异性抗体之一的游离半胱氨酸与第二个亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离结合释放和重组。Fab臂的CH3结构域可以设计为有利于异二聚化而不是同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，每个分子结合不同的表位，即CD47上的表位和FRα上的表位。

如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用的“同源二聚体”是指具有两条具有相同CH3氨基酸序列的重链的抗体。

如本文所用的“异二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异二聚体”是指具有两条重链且CH3氨基酸序列不同的抗体。

“旋钮入孔(knob-in-hole)”策略(参见，例如，PCT公开号WO2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域界面的选定氨基酸可以在影响CH3结构域相互作用的位置发生突变，以促进异二聚体的形成。将具有小侧链(孔)的氨基酸引入特异性结合第一抗原的抗体的重链中，将具有大侧链(旋钮)的氨基酸引入特异性结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于带有“孔”的重链与带有“旋钮”的重链的优先相互作用，形成异二聚体。形成旋钮和孔的示例性CH3取代对是(表示为第一重链的第一个CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二个CH3结构域中的修饰位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。

可以使用其他策略，例如通过取代一个CH3表面上的带正电残基和第二个CH3表面上带负电的残基来使用静电相互作用来促进重链异二聚化，如美国专利公开号2010/0015133；美国专利公开号2009/0182127；美国专利公开号2010/028637；或美国专利公开号2011/0123532中所述。在其他策略中，异二聚化可以通过以下取代来促进(表示为第一重链的第一个CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二个CH3结构域中的修饰位置)：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405AY407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公开号2012/0149876或美国专利公开号2013/0195849中所述。

除了上述方法之外，本发明的双特异性抗体可以在无细胞环境中通过在两个单特异性同二聚体抗体的CH3区引入不对称突变，并在还原条件下由两个亲本单特异性同二聚体抗体形成双特异性异二聚体抗体，使得产生如PCT专利公开号第WO2011/131746所述方法中的二硫键异构化，从而在体外产生。在这些方法中，第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体被改造为在CH3结构域具有某些取代，从而促进异二聚体稳定性；在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将抗体一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。孵育条件可以任选地恢复到非还原条件。可以使用的示例性还原剂是2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选地还原剂选自下组：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦。例如，在至少20℃的温度下在至少25mM2-MEA的存在下或在至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下在5-8的pH值(例如在可以使用7.0或7.4的pH值)下孵育至少90分钟。

在另一个总体方面，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域技术人员将理解，蛋白质的编码序列可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下改变(例如，替换、缺失、插入等)。因此，本领域技术人员将理解，可以改变编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。

在另一个总体方面，本发明涉及包含编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离核酸的载体。可以使用本领域技术人员根据本公开已知的任何载体，例如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方式中，载体是重组表达载体，例如质粒。载体可以包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。许多能够将核酸递送至细胞的表达载体在本领域中是已知的并且可以在本文中用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。可以使用常规克隆技术或人工基因合成来产生根据本发明实施方式的重组表达载体。鉴于本公开，这些技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。

在另一个总体方面，本发明涉及包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何宿主细胞可用于本发明的抗体或其抗原结合片段的重组表达。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体实施方式，重组表达载体通过常规方法例如化学转染、热激或电穿孔转化到宿主细胞中，其中它被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到有效表达。

在另一个总体方面，本发明涉及产生本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或细胞培养物(例如，从上清液)回收双特异性抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并根据本领域已知的常规技术和如本文所述的方法进行纯化。

药物组合物

在另一个总体方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的产品。本发明的抗体和包含它们的组合物也可用于制备用于本文提及的治疗应用的药物。

如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含有脂质的囊泡、微球、脂质体包囊或本领域熟知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的有效性或根据本发明的组合物的生物活性的无毒材料。根据具体实施方式，鉴于本公开，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。

药物活性成分与药学上可接受的载体的制剂是本领域已知的，例如，《雷明顿：药学的科学与实践》(例如，第21版(2005)和任何后续版本)。附加成分的非限制性实例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。

在本发明的一个实施方式中，药物组合物是液体制剂。液体制剂的优选实例是水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可以包括溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％w/w的水。

在一个实施方式中，药物组合物可配制成可注射的可注射剂，例如可通过注射装置(例如注射器或输液泵)注射。例如，可以皮下、肌肉内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送注射剂。

在另一个实施方式中，药物组合物是固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可以原样使用，或者医生或患者在使用前向其中添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可以包括片剂，例如压制片剂和/或包衣片剂，以及胶囊剂(例如，硬或软明胶胶囊)。例如，药物组合物还可以是小袋、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、锭剂或用于重构的粉剂的形式。

剂型可以是立即释放的，在这种情况下它们可以包含水溶性或可分散的载体，或者它们可以是延迟释放、持续释放或改良释放的，在这种情况下它们可以包含调节溶解速率的水不溶性聚合物在胃肠道或皮肤下的剂型。

在其他实施方式中，药物组合物可以鼻内、颊内或舌下递送。

水性制剂中的pH可以在pH 3和pH 10之间。在本发明的一个实施方式中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH为约3.0至约7.0。

在本发明的另一个实施方式中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性实例包括：精氨酸、天冬氨酸、二辛酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)和三(羟甲基)-氨基甲烷，以及它们的混合物。缓冲液可以单独存在或以集合体形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在本发明的另一个实施方式中，药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞及其混合物。防腐剂可以单独或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在本发明的另一个实施方式中，药物组合物包含等渗剂。等渗剂的非限制性实例包括盐(例如氯化钠)、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(例如甘油、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。等渗剂的另一个例子包括糖。糖的非限制性实例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个例子是糖醇，其中术语“糖醇”定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性实例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、半乳糖醇、木糖醇和阿糖醇。包含本段中列出的每种等渗剂的药物组合物构成本发明的替代实施方案。等渗剂可以单独或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在本发明的另一个实施方式中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性实例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐及其混合物。螯合剂可以单独或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在本发明的另一个实施方式中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。

在本发明的另一个实施方式中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂是羧基/羟基纤维素及其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲硫乙醇、聚乙二醇(如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐类(如氯化钠)、含硫物质如单硫代甘油)或巯基乙酸。稳定剂可以单独或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在本发明的进一步实施方式中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水性)部分和脂溶性(亲油性)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可以例如选自下组：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可以单独或聚集存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在本发明的进一步实施方式中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA和/或苯甲脒盐酸(HCl)。蛋白酶抑制剂可以单独或聚集存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方案。

在另一个总的方面，本发明涉及制备包含本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。

使用方法

在另一个总的方面，本发明涉及靶向FRα和CD47的方法，所述FRα和CD47均在有需要的受试者的癌细胞表面上表达，该方法包括向需要的受试者施用本发明的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段或药物组合物。双特异性抗体或其抗原结合片段与FRα和/或CD47的结合可介导补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性吞噬作用(ADPC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或其他效应导致目标癌细胞死亡。例如，双特异性抗体或其抗原结合片段可用于募集偶联药物以介导靶向癌细胞的死亡。

在另一个总的方面，本发明涉及在有需要的受试者中阻断SIRPα与表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47结合的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

在另一个总的方面，本发明涉及在有需要的受试者中诱导巨噬细胞介导的对表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

在另一个总的方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中通过人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段结合表达FRα和CD47的癌细胞，并将其与人红细胞(RBC)的结合最小化到不可检测的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的分离的人源化抗-CD47/抗-FRα双特异性抗体或其抗原结合片段，或药物组合物。本发明的人源化抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段对癌细胞具有高选择性，与人红细胞(RBC)的结合最小至不可检测。

结合FRα和CD47的双特异性抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过本领域已知的方法和如本文所述的方法来表征。用于表征结合FRα和CD47的双特异性抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于亲和力和特异性测定，包括Biacore、ELISA、FACS和OctetRed分析。根据特定实施方式，用于表征结合FRα和CD47的双特异性抗体及其抗原结合片段的方法包括下文所述的那些。

在另一个总的方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本发明的分离的人源化抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段或药物组合物。癌症可以是任何液体或实体癌症，例如，可以选自但不限于肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。

根据本发明的实施方式，药物组合物包含治疗有效量的本发明的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引发期望的生物学或医学反应的活性成分或组分的量。治疗有效量可以根据所述目的以经验和常规方式确定。

如本文所用，关于抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指在有需要的受试者中调节免疫反应的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段的量。同样如本文所用，关于抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指疾病、紊乱或病症得以治疗；预防或减缓疾病、紊乱或状况的进展；或减少或完全缓解与疾病、病症或病状相关的症状的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段的量。

根据具体实施方式，待治疗的疾病、紊乱或病症是癌症，优选选自下组的癌症：肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性粒细胞白血病(AML)，和其他液体肿瘤。根据其他特定实施方式，待治疗的疾病、紊乱或病症是炎性疾病、代谢疾病、或任何其他可以使用双特异性抗体作为治疗的疾病。

根据具体实施方式，治疗有效量是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效果的治疗量：(i)降低或改善待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的严重性；(ii)缩短待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)防止待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的进展；(iv)导致待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状消退；(v)预防待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的发展或发作；(vi)防止待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的复发；(vii)减少患有待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的受试者的住院；(viii)缩短患有待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有待治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的受试者的存活率；(xi)抑制或减少受试者中待治疗的疾病、紊乱或病症，或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

治疗有效量或剂量可以根据各种因素而变化，例如待治疗的疾病、紊乱或病症，给药方式，靶点，受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)，受试者是人还是动物，给予的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。优化滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。

根据具体的实施方式，本文所述的组合物被配制为适合于对受试者的预期给药途径。例如，本文所述的组合物可以配制成适合静脉内、皮下或肌肉内给药。

如本文所用，术语“治疗”、“处理”和“诊治”均意指改善或逆转与癌症相关的至少一种可测量的物理参数，这在受试者中不一定是可辨别的，但可以在受试者中辨别出来。术语“治疗”、“处理”和“诊治”还可以指引起消退、防止进展或至少减缓疾病、紊乱或病状的进展。在一个具体实施方式中，“治疗”、“处理”和“诊治”是指减轻、预防与疾病、紊乱或病状(例如肿瘤或更优选癌症)相关的一种或多种症状的发展或发作，或减少持续时间。在一个具体的实施方式中，“治疗”、“处理”和“诊治”是指预防疾病、紊乱或病症的复发。在一个具体的实施方式中，“治疗”、“处理”和“诊疗”是指增加患有疾病、紊乱或病状的受试者的存活率。在一个具体实施方式中，“治疗”、“处理”和“诊疗”是指消除受试者中的疾病、紊乱或病症。

根据具体地实施方式，提供了用于治疗癌症的组合物。对于癌症治疗，该组合物可以与另一种治疗组合使用，包括但不限于化疗、抗-TIM-3mAb、抗-LAG-3mAb、抗-CD73 mAb、抗-apelin mAb、抗CTLA-4抗体、抗EGFR mAb、抗HER-2mAb、抗CD19 mAb、抗CD20 mAb、抗CD33mAb、抗TIP-1mAb、抗DLL3 mAb、抗CLDN18.2 mAb、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1疗法、其他免疫肿瘤药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物偶联物(ADC)、靶向疗法或其他抗癌药物。

如本文所用，在向受试者施用两种或更多种疗法的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用不限制向受试者施用疗法的顺序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可以在对受试者施用第二疗法之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周,、8周或12周之后)施用。

实施方式

本发明还提供以下非限制性实施例。

实施方式1是一种分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区；和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区；

其中CH1和CL区在对应于CH1的SEQ ID NO：15、21、22或23的氨基酸位置和对应于CL的SEQ ID NO：19或24的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代或天然氨基酸；

其中CH1和CL区的氨基酸取代或天然氨基酸选自：

(1)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的F209C和C214X；

(2)CH1中的S131C和C220X，以及CL中的P119C和C214X；

(3)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的K207C和C214X；

(4)CH1中的F170C和C220X，以及CL中的S176C和C214X；

(5)CH1中的P171C和C220X，以及CL中的S162C和C214X；

(6)CH1中的V173C和C220X，以及CL中的Q160C和C214X；

(7)CH1中的F170C和C131X，以及CL中的S176C和C214X；

(8)CH1中的P171C和C131X，以及CL中的S162C和C214X；

(9)CH1中的V173C和C131X，以及CL中的Q160C和C214X；

(10)CH1中的A129C和C220X，以及CL中的S121C和C214X；

(11)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的I117C和C214X；

(12)CH1中的C131，以及CL中的P119C和C214X；

(13)CH1中的A129C和C131X，以及CL中的S121C和C214X；

(14)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的K207C和C214X；

(15)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的I117C和C214X；

(16)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的L117C和C214X；

(17)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的L117C和C214X；

(18)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的F209C和C214X；

(19)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的V209C和C214X；或者

(20)CH1中的K133C和C220X，CL中的V209C和C214X；

其中X选自S、A或G。

实施方式2是一种分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区和重链可变区(VH区)；和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区和轻链可变区(VL区)；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区在对应于CH1的SEQ ID NO:15、21、22或23VH的SEQID NO:13，CL的SEQ ID NO:19或24和VL的SEQ ID NO:17的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区中的氨基酸取代选自：

(1)CH1中的C220X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；或者

(2)CH1中的C131X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；

其中X选自S、A或G。

实施方式3是实施方式1或2的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合结构域是CD47结合结构域。

实施方式4是实施方式3的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中VH区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，CH1区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL区域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，和CL区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方式5是实施方式1至4中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(a)包含H2和L2的第二臂不包含包含H1和L1的第一臂的氨基酸取代；

(b)两条重链H1和H2各包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列；

(c)两条重链H1和H2各包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列；

(d)两条重链H1和H2各自包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列；

(e)两条轻链L1和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列；和/或

(f)两条轻链L1和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。

实施方式6是实施方式5的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中H1和H2形成异二聚体。

实施方式7为如权利要求1至6中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(a)H1的VH区和L1的VL区分别具有Q39E和Q38K取代突变，H2的VH区和L2的VL区分别具有Q39K和Q38E取代突变；或者

(b)H1的VH区和L1的VL区分别具有Q39K和Q38E取代突变，H2的VH区和L2的VL区分别具有Q39E和Q38K取代突变。

实施方式8是实施方式1至7中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的双特异性抗体或抗原结合片段是抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合结构域特异性结合CD47，优选人CD47，第二抗原结合结构域特异性结合叶酸受体α(FRα)，优选人FRα。

实施方式9是如权利要求1至8中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(a)第一抗原结合结构域具有SEQ ID:13的VH序列和SEQ ID:17的VL序列，第二抗原结合结构域具有SEQ ID:33的VH序列和SEQ ID:35的VL序列；或者

(b)第一抗原结合结构域具有SEQ ID:13的VH序列和SEQ ID:17的VL序列，第二抗原结合结构域具有SEQ ID:14的VH序列和SEQ ID:18的VL序列。

实施方式10是实施方式8或9的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够阻断信号调节蛋白α(SIRPα)与同时表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47的结合，诱导巨噬细胞介导的对表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用，和/或结合表达FRα和CD47的癌细胞而与人红细胞(RBC)的结合最小化至无法检测。

实施方式11是编码实施方式1至10中任一项的双特异性抗体或抗原结合片段的分离的核酸。

实施方式12是包含实施方式11的分离的核酸的载体。

实施方式13是包含实施方式12的载体的宿主细胞。

实施方式14是一种药物组合物，包含实施方式1至10中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

实施方式15是一种靶向在有需要的受试者的癌细胞表面上都表达的FRα和CD47，在有需要的受试者中阻断SIRPα与表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47结合，在有需要的受试者中诱导巨噬细胞介导的表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用，在有需要的受试者中结合表达FRα和CD47的癌细胞而与人红细胞(RBC)的结合最小化至不可检测，和/或在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含实施方式8至10中任一项的分离的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体，任选地，所述癌症选自下组：肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性粒细胞白血病(AML)，和其他液体肿瘤。

实施方式16是产生实施方式1至10中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生双特异性抗体的条件下培养包含编码双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞或其抗原结合片段，以及从细胞或培养物中回收双特异性抗体或其抗原结合片段。

实施方式17是制备包含实施方式1至10中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物.

实施例

实施例1：构建具有改变的半胱氨酸位点的双特异性抗体

图1A和1B显示了在H1H2的异二聚体中具有两条不同的重链和两条不同的轻链的双特异性抗体，这可以通过诸如旋钮入孔(knob-in-hole)和带电对的常用方法来促进。在H1L1臂中形成链间二硫键的两个天然半胱氨酸可以转化为非半胱氨酸，从而消除天然链间二硫键(图1A和1B中的虚线)；同时，H1L1中3-D结构中彼此接近的两个天然非半胱氨酸残基可以转化为半胱氨酸，形成新的链间二硫键(图1A和1B中的实线)。新形成的链间二硫键可以在H1L1的CH1和CL之间(图1A)或H1L1的VH和VL之间(图1B)。通过移动H1L1中链间二硫键的位点，两条轻链可以分别与其相应的重链有利地配对。进一步地，mAb 1臂上的链间二硫键移位形成的不对称结构，可以更好地区分双特异性抗体的物理性质和潜在的杂质，有利于目标双特异性抗体的纯化和生产。鉴定了H1L1中可以形成新的链间二硫键的多对天然非半胱氨酸残基(也称为“敲入位点(knock-in sites)”)。以下示例显示了人IgG1重链VH和CH1以及κ轻链VL和CL序列中的双特异性抗体。只要存在保守的敲入位点，该概念也可应用于使用人IgG2、IgG3或IgG4重链的CH1和人λ轻链的CL构建双特异性抗体。每当敲入位点恰好是天然半胱氨酸(不是参与形成天然链间二硫键的半胱氨酸)时，可直接用于形成新的链间二硫键。

一种人源化抗CD47 mAb(描述于国际专利公布号WO2019/217145；此处称为mAb 1)和两种人源化抗FRαmAb(描述于国际专利公布号WO2019/177854；此处分别称为mAb 2和mAb2b)用于构建抗CD47/抗FRα双特异性抗体。图1A和1B显示了所需双特异性抗体的结构，其中mAb 1(抗-CD47)作为右臂并且mAb 2(抗-FRα)作为左臂(在一些双特异性抗体中，使用mAb2b而非mAb 2作为左臂)。双特异性抗体的VH和VL区分别与人IgG1重链(HC)和κ轻链(LC)的恒定区融合。mAb 1HC具有T366W(EU编号)突变以形成“旋钮”，mAb 2HC具有T366S、L368A和Y407V突变以形成“孔”，因此两条重链有利于形成具有异二聚体HC(mAb 1HC/mAb2HC)而不是同源二聚体HC(mAb 1HC/mAb 1HC或mAb 2HC/mAb 2HC)的双特异性抗体。此外，在mAb 1HC上引入了S354C半胱氨酸突变，在mAb 2HC上引入了Y349C半胱氨酸突变，以稳定异二聚体重链的异二聚体配对(Merchant等人，Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998))。当将两个HC和两个LC共转染到细胞中时，采用了一种转移mAb 1臂上HC和LC之间的链间二硫键的策略，以有利于所需双特异性抗体的表达、纯化和/或生产。为了实现这一目标，mAb 1臂的HC和LC上分别形成链间二硫键的两个天然半胱氨酸被转化为丝氨酸残基，而mAb 1的HC和LC上的两个天然非半胱氨酸残基分别通过结构建模确定了它们的紧密接近性，因此一旦将半胱氨酸引入这些位点(本文称为“敲入半胱氨酸”或“替代半胱氨酸”)，半胱氨酸残基可能会形成新的链间二硫键。通过替代半胱氨酸配对新形成的链间二硫键可以在CH1和CL区域之间，如图1所示，或在VH和VL区域之间，如图1B所示，其中mAb 1臂的CH1和CL区之间的天然链间二硫键用虚线标记，而mAb 1臂上通过敲入的半胱氨酸新形成的链间二硫键用实线标记。mAb 2臂的VH、VL、CH1或CL区域没有引入突变，因此mAb 2臂具有相同的天然链间二硫键。

mAb 1和mAb 2的VH、CH1、VL和CL序列，以及IgG2 CH1、IgG3 CH1、IgG4 CH1和λCL序列列于图2A-2F和表1中(对于mAb 1，分别为SEQ ID NO：13、15、17和19；对于mAb 2，分别为SEQ ID NO：14、16、18和20；和对于IgG2 CH1、IgG3 CH1、IgG4 CH1和λCL，分别为SEQ ID NO：21、22、23和24)。mAb 2b的VH、CH1、VL和CL序列列于表1(分别为SEQ ID NO：33、34、35和36)。选择抗CD47抗体mAb 1作为具有修饰的链间二硫键的臂。在Schrodinger Bio

(Schrodinger；纽约州纽约市)中生成了与公共领域中许多先前已解开的抗体结构的同源模型，并且使用半胱氨酸突变工具使用

的β-碳截止距离确定了可能的链间二硫键。对识别的配对进行使用诱变工具进行进一步地单独和成对分析，以识别非半胱氨酸到半胱氨酸的突变，这导致对整体结构的干扰最小，同时导致单个非半胱氨酸到半胱氨酸突变的链间结合亲和力降低，而不显著影响配对半胱氨酸突变的结合亲和力。选择最佳候选者进行表达和实验验证。由敲入半胱氨酸位点形成的潜在二硫键用实线标记，而天然链间二硫键用虚线标记，如图3A-3L所示。bsAb 9、10、11和12的模型中不包括天然链间二硫键区域，因此，这4个bsAb的模型中没有虚线。具有不同敲入半胱氨酸对的每个mAb 1臂与一个天然mAb 2臂配对以形成双特异性抗体(bsAb)。表2列出了mAb 1/mAb 2双特异性抗体的mAb 1臂上用于移位链间二硫键的氨基酸取代。

为了评估表2中列出的各种移位链间二硫键对对mAb稳定性的影响，将表2中的一些突变组(或称为设计)引入到mAb 1的两个臂上。代表来自专利文献(U.S.9,527,927 B2和U.S.10,344,099B2)的突变设计的M1、M2、Z1和Z2也被引入到两个臂上的mAb 1中以进行比较。使用蛋白A色谱和疏水相互作用色谱(HIC)表达和纯化突变mAb。使用常规方法进行蛋白A色谱。对于HIC，将蛋白A纯化样品缓冲交换到PBS中，并添加(NH₄F150)SO₄至最终浓度为800mM。将样品加载到预先用50mM MES pH6.0和1M(NH₄F150)SO₄缓冲液预平衡的Source15PHE柱(GE)上。使用线性或逐步梯度(缓冲液A：50mM MES pH6.0，1M(NH₄)₂SO₄；缓冲液B：50mM MES pH6.0，10％甘油)洗脱样品，主要级分在60％缓冲液B下洗脱。洗脱级分通过SDS-PAGE分析，主要含有145kDa条带且不含较低分子量杂质的级分合并为纯化蛋白。图4A-4H显示了在还原或非还原条件下，含有不同移位链间二硫键的纯化突变mAb的RP-HPLC图谱；图4I-4J显示了在ELISA测定中含有不同移位链间二硫键的突变mAb与CD47的结合。

分析纯化的突变mAb的热稳定性。将突变mAb以1mg/mL缓冲液交换到DPBS(康宁,货号:21-031-CM)中，并在赛默飞热循环仪(Simpliamp，赛默飞世尔)上于55℃、60℃、65℃、70℃或75℃孵育5分钟。孵育后，通过SEC(尺寸排阻色谱)分析mAb。量化每个峰以确定抗体(中等分子量物质)的百分比。结果示于图5A-5G中。分别含有bsAb 10和bsAb 12突变的突变mAb比任何其他突变mAb(包括分别含有M1、M2、Z1和Z2突变的那些)的热稳定性更好。这些令人惊讶的发现表明bsAb 10和bsAb 12设计优于任何M1、M2、Z1或Z2设计。抗体的热稳定性是制造过程和储存过程中所需的重要属性。良好的热稳定性显著提高了抗体的可开发性并增加了其成为治疗方法的机会。

还测试了突变mAb的pH稳定性或从低pH孵育中的恢复。使用Zeba^TM Spin脱盐柱(赛默飞世尔,货号:89882)将10mg/mL的mAb缓冲液置换到含有0.1M柠檬酸和0.1M氯化钠的缓冲液(pH3.0)中。将mAb在相同的缓冲液中稀释至2mg/mL并在室温下孵育1小时、3小时、5小时或7小时，然后通过添加1.0M Tris-HCl(pH9.0)来中和以调节样品的最终pH值为6.0-7.0。中和后，将mAb稀释到DPBS中至1mg/mL用于SEC分析。结果示于图6A-6H。含有bsAb 12设计的突变mAb比任何含有M1、M2、Z1或Z2突变的突变mAb的pH稳定性更高；在pH稳定性方面，它也优于其他测试的突变mAb(图6A-6H)。包含bsAb 10设计的突变mAb从pH稳定性研究中的恢复优于任何包含M1、M2、Z1或Z2突变的突变mAb。数据表明bsAb 12和bsAb 10设计在pH稳定性或从低pH孵育中恢复方面优于任何M1、M2、Z1或Z2设计。此外，当在pH3.0下孵育1或3小时时，含有bsAb 5设计的突变mAb的pH稳定性优于任何含有M1、M2、Z1或Z2设计的突变mAb。这些令人惊讶的发现表明bsAb 5、10和12设计优于任何M1、M2、Z1或Z2设计。抗体的pH稳定性或从低pH孵育中恢复是制造过程中所需的重要属性。良好的pH稳定性或从低pH孵育中恢复，尤其是在3小时的低pH条件下，显著提高抗体的可开发性并增加其成为治疗方法的机会。

表1：mAb 1，mAb 2，人IgG2、IgG3和IgG4重链(HC)，和人类λCL中的各个区域的序列

表2：mAb 1/mAb 2双特异性抗体(bsAb)的mAb 1臂上用于移位链间二硫键的氨基酸取代

注：Kabat编号用于VH和VL区；EU编号用于CH1和CL区。

实施例中的双特异性抗体位于IgG1 HC和κLC框架上(VH和VL区的Kabat编号；CH1和CL区的EU编号)。使用mAb 1和mAb 2构建了一些双特异性抗体，包括bsAb 1、bsAb 2、bsAb3、bsAb 4、bsAb 5、bsAb 6、bs Ab 7和bsAb 8(bsAb 1是指带有含有表2中相应突变(预期会导致HC/LC链间二硫键的重新定位(或“移位”))的mAb 1臂，并以mAb 2作为第二臂的双特异性抗体；该组中的其他双特异性抗体遵循相同命名规则)。没有在mAb 2臂的VH、CH1、VL或CL区域上引入突变。突变G44C是指残基44(G44)处的天然甘氨酸转化为半胱氨酸；所有其他突变都采用相同的命名规则。使用mAb 1和mAb 2b构建其他双特异性抗体，包括bsAb 5b，bsAb10，和bsAb 12(bsAb 5b是指mAb 1臂含有表2中相应的bsAb 5突变，并且mAb 2b作为第二臂的双特异性抗体；bsAb 10是指mAb 1臂含有表2中相应的bsAb 10突变和mAb 2b作为第二臂的双特异性抗体；bsAb 12是指mAb 1臂包含表2中相应的bsAb 12突变和mAb 2b作为第二臂的双特异性抗体)。双特异性抗体的mAb 1臂的CH1、CL、VH和VL区的序列列于表3。此外，给定双特异性抗体的每个臂的HC上的Q39(Kabat编号)和LC上的Q38(Kabat编号)引入带电荷的氨基酸对。这些双特异性抗体命名如下：bsAb 5b(E/K)是指在bsAb 5bd的mAb 1臂的HC上带有Q39E(Q改为E；相同的命名规则适用于以下其他突变)且LC上带有Q38K，以及在bsAb 5b的mAb 2b臂的HC上带有Q39K且LC上带有Q38E的双特异性抗体；bsAb 10(E/K)和bsAb 12(E/K)遵循相同的命名规则。此外，bsAb 5b(K/E)是指在bsAb 5b的mAb 1臂的HC上带有Q39K且LC上带有Q38E，以及在bsAb5b的mAb 2b臂的HC上带有Q39E且LC上带有Q38K的双特异性抗体；bsAb 10(K/E)和bsAb 12(K/E)遵循相同的命名规则。mAb 1HC具有T366W(EU编号)突变以形成“旋钮”，而mAb 2或mAb 2b HC具有突变T366S、L368A和Y407V以形成“孔”。此外，在mAb1HC上引入了S354C半胱氨酸突变，在mAb 2或mAb 2b HC上引入了Y349C半胱氨酸突变以稳定异二聚体配对。

表3：双特异性抗体mAb 1臂的CH1、CL、VH和VL区的序列

注：由氨基酸取代产生的残基以粗体和下划线形式显示。

实施例2：双特异性抗体的表征

两条重链和两条轻链在同一细胞中的同时表达导致所需双特异性抗体的表达和组装，该抗体包含抗CD47臂和抗FRα臂。使用蛋白A色谱法纯化双特异性抗体。使用疏水相互作用色谱法(HIC)进一步纯化了一些样品。

用SDS-PAGE分析蛋白A纯化的双特异性抗体。将蛋白质样品稀释至1mg/mL的浓度。对于非还原泳道，将3μL蛋白添加到4.5μL水和2.5μL 4x LDS样品缓冲液(Thermo NP0007；马萨诸塞州沃尔瑟姆)中并直接上样到凝胶上。对于还原泳道，添加3μL蛋白至3.5μL水、2.5μL 4x LDS样品缓冲液和1μL 1M DTT中并在95℃加热3分钟，并上样到凝胶上。Bolt 4-12％bis-tris凝胶用于所有样品(Thermo NP0323BOX)。样品在180V下电泳30分钟并用考马斯G-250显色。图7A-7B显示了使用蛋白A色谱法纯化的mAb 1/mAb 2双特异性抗体样品的SDS-PAGE图像。在还原和变性条件下，所有样品均显示出两条带，一条对应于重链(约50kDa)，另一条对应于轻链(约25kDa)。在非还原和变性条件下，所有样品都显示出多个条带，其中每个泳道的顶部条带代表完整抗体或完整抗体的混合物(约150kDa)，尽管尚不清楚这是否是异二聚体双特异性抗体(由H1H2相互作用促成)和同源二聚体抗体的混合物。较小的条带代表SDS-PAGE上的各种非完整抗体——例如，每条泳道顶部的第二条条带(约125kDa)可能代表缺少一条轻链的抗体；这可能来自完整抗体，其中一条轻链未形成链间二硫键，因此在SDS-PAGE上，该轻链与主抗体分离。图7C-7D显示了使用蛋白A色谱法纯化的mAb 1/mAb 2b双特异性抗体样品的SDS-PAGE图像。在非还原和变性条件下，所有样品均显示出对应于双特异性抗体分子量的一条主带(图7C)；在还原和变性条件下，所有样品均显示出两条对应于两条不同重链分子量的条带，一条对应两条不同轻链的分子量的条带(图7D)。

为了评估双特异性样品在桥接ELISA测定中的结合活性，将重组叶酸受体1(近岸蛋白(Novoprotein)C784；新泽西州萨米特市)在PBS中稀释至0.25μg/ml的浓度并用于包被96孔板(Genesee科学91-415F；加利福尼亚州圣地亚哥)。每孔加入50μL抗原并在4℃下过夜包被。板用含5％BSA的TBST封闭并用TBST洗涤。50μL抗体配制在含5％BSA的TBST中并以指定浓度添加，在室温下孵育，并用TBST洗涤。第二重组生物素化CD47抗原(AcroBio CD47-H82E9-258g；特拉华州纽瓦克)在含5％BSA的TBST溶液中稀释至0.05μg/mL)的浓度并添加到每个孔中，室温孵育，并用TBST洗涤。将链霉亲和素HRP(JIR 016-030-084)在含5％BSA的TBST溶液中稀释至浓度为0.2或0.5μg/mL并添加至每个孔中，室温孵育，洗涤。用TMB底物(Thermo 34028)对板进行显色并用终止溶液(Thermo SS04)淬灭，然后通过450nm处的吸光度对孔进行定量。图8A-8J显示了在桥接ELISA测定中纯化的双特异性抗体与两种抗原结合的结果。图8A中的数据表明bsAb 1、5、6、7和8具有抗CD47/FRα双特异性活性，证实这些构建体中的每一种形成了预期的抗CD47/FRα双特异性抗体。图8B-8J中测试的所有双特异性抗体表现出桥接ELISA活性。

为了确定通过蛋白A色谱法或蛋白A色谱法后随HIC纯化的样品的纯度，使用了尺寸排阻色谱法(SEC)。将蛋白质样品稀释至1mg/mL的浓度并进行亚微米过滤。将5μL蛋白质注入AdvanceBio SEC柱(300mm，2.7um，300A，Agilent PL1580-5301)。DPBS用作流动相，流速为0.35mL/min。伯乐凝胶过滤标准品被用作标准品(伯乐1511901；加利福尼亚州赫拉克勒斯)。样品通过测量280nm处的吸光度进行量化。图9A-9E显示了通过蛋白A色谱法纯化的样品的SEC曲线。主峰的出现在约150kDa表明样品中的主要种类是具有两条重链和两条轻链的全抗体(或抗体)。这些数据与图7A-7B中所示的SDS-PAGE观察结果一致。图9F-9N显示了通过蛋白A色谱法和HIC纯化的样品的SEC曲线。

在非还原条件下，使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步分析HIC纯化的双特异性抗体样品的纯度。图10A-10L显示了双特异性抗体的RP-HPLC曲线。在每种情况下，都有一个主要物种。也在还原条件下进行了RP-HPLC以确定预期双特异性抗体的两个HC(H1和H2)以及两个LC(L1和L2)的存在。通过分别瞬时表达bsAb 7(对照抗体#1)的H1、H2和L1以及bsAb 7(对照抗体#2)的H1、H2和L2，然后使用蛋白A色谱法纯化来产生对照抗体样品。这些样品用作对照以识别RP-HPLC上的LC峰(图11A和11B)。结合bsAb 6(图11C)、bsAb 7(图11D)和bsAb 8(图11E)的RP-HPLC曲线，识别了HC峰(H1和H2)和LC峰(L1和L2)(图11A-11E)。图11F-11N显示了用mAb 1和mAb 2b构建的双特异性抗体在还原条件下的RP-HPLC曲线。使用带有两个臂之一的适当对照转染来识别给定双特异性抗体的不同HC和LC峰(此处未显示数据)。量化每个HC或LC相对于RP-HPLC曲线中总AUC的曲线下面积(AUC)，并显示在图11C-11N中。H1、L1、H2和L2的比例与异二聚体双特异性抗体的比例一致。这些数据表明，HIC纯化的双特异性样品中的主要物种是异二聚体双特异性抗体，其预期成分为HC(H1和H2)和LC(L1和L2)。重要的是，图10A-10L和图11A-11N中的数据表明，在双特异性抗体的两个臂上的HC之间以及HC和LC之间存在链间二硫键。

使用桥接ELISA分析相同HIC纯化的双特异性抗体样品结合两种抗原的能力。与上述分析数据一致，所有双特异性抗体均显示能够同时结合CD47和FRα，这表明双特异性抗体的每个臂均由正确的HC和LC正确形成(图12A-12F)。测试了双特异性抗体与表达两种抗原(CD47和FRα)的SK-OV-3细胞结合的能力。在该测定中，SK-OV-3细胞与不同浓度的双特异性抗体在4℃下孵育15分钟。然后将细胞离心5分钟并用FACS缓冲液(HBSS添加了5％BSA和0.05％叠氮化钠)洗涤3次。然后将细胞与Alexa Fluor 488偶联的抗人IgG二抗(赛默飞世尔,货号:H10120)一起孵育，并在冰上再孵育15分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次并重悬于FACS缓冲液中。然后通过Attune NxT运行细胞，并通过Attune NxT软件分析数据。在FACS测定中，双特异性抗体显示出与SK-OV-3细胞的显著结合(图13A-13C)。

在非还原条件下对HIC纯化的双特异性抗体样品进行木瓜蛋白酶消化以确定预期的Fab片段是否由双特异性抗体产生。将样品浓缩至最终浓度为5-10mg/mL，并将缓冲液更换为木瓜蛋白酶消化缓冲液(20mM半胱氨酸、20mM磷酸钠、10mM EDTA，pH 7.0)。琼脂糖固定的木瓜蛋白酶(Thermo 20341)在木瓜蛋白酶消化缓冲液中预平衡，并以50％的浆液重悬。将蛋白质样品以2:1的体积比添加到浆液中，并在室温下摇动过夜。直接提取上清液进行质谱分析。每个Fab片段的计算分子量(mw)连同其观察到的mw一起显示(图14A-14C)。数据表明，在质谱上检测到了预期的木瓜蛋白酶消化产生的Fab片段，并且预期的双特异性抗体正确形成。

HIC纯化的双特异性抗体样品也在非还原条件下进行胰蛋白酶消化以确定是否产生了来自预期双特异性抗体的mAb 1臂的计算的胰蛋白酶消化肽片段。将样品在200mM盐酸胍中稀释至终浓度为1mg/mL，并在95℃下加热1分钟。以1:1的体积比(NEB P8101S)添加2x胰蛋白酶消化缓冲液(NEB P8101S)并添加2μg质谱级总胰蛋白酶(NEB P8101S)。将所得反应在37℃下振荡4小时并直接用于质谱分析。预期由bsAb 6的mAb 1臂(抗CD47臂)的胰蛋白酶消化产生的二硫键交联肽片段的氨基酸序列和二硫键位点显示在图15A中。形成二硫键的半胱氨酸残基以粗体形式显示；还指出了由敲入半胱氨酸形成的预期链间二硫键(图15A)。bsAb 7(图15B)、bsAb 8(图15C)、bsAb 5b(图15D)、bsAb 10(图15E)和bsAb 12(图15F)也分别显示了类似的图示。图15A-15F中的MS结果表明可以在MS上鉴定来自每个双特异性抗体(bsAb

6、bsAb 7、bsAb 8、bsAb 5b、bsAb 10和bsAb 12)的胰蛋白酶消化的mAb 1臂的预期二硫键交联肽片段。这些数据进一步证明敲入的半胱氨酸使得在每个双特异性抗体bsAb6、bsAb 7、bsAb 8、bsAb 5b、bsAb 10和bsAb 12中正确形成链间二硫键(图15A-15F)。

HIC纯化的双特异性抗体样品也在非还原条件下进行IdeZ蛋白酶消化，以确定是否生成了来自预期双特异性抗体的计算的(Fab')2部分。样品在1x糖缓冲液2(NEB)中稀释至最终浓度为0.5mg/mL。以每12.5μg抗体80U蛋白酶的比例添加IdeZ蛋白酶。将所得混合物在37℃温育4小时并直接用于质谱分析。图16A-16C显示了IdeZ蛋白酶消化的HIC纯化的双特异性抗体的样品的MS图谱。鉴定了从每种双特异性抗体产生的(Fab')2，表明预期的双特异性抗体是通过敲入半胱氨酸而形成的具有适当形成的链间二硫键形成的。

为了证明双特异性抗体的两个臂在与已知表达两种抗原的SK-OV-3细胞结合中的作用，在FACS测定中评估了由抗CD47或抗FRα亲本mAb产生的F(ab')2对抗体与细胞结合的抑制作用。测定中使用的Ab(抗体)浓度显示在图17A-17C的每个图的下方。用5000nM F(ab')2(图17A-17C)测试了抑制作用。此外，使用Biacore检测CD47和FRα与固定化bsAb 12的顺序结合(图18A-18B)。

用木瓜蛋白酶消化蛋白A纯化的双特异性抗体，并在MS上鉴定消化产生的Fab片段(图19A-19C)。在WT双特异性抗体样品中，检测到来自两个正确配对臂以及来自两个错配臂(H1/L2和H2/L1)的Fab片段(图19A)。然而，在bsAb 10(图19B)和bsAb 12(图19C)样品中，仅检测到两个错配臂之一。同时，在bsAb 10和bsAb 12设计中没有不形成HC/LC链间二硫键的HC/LC错配物种，因为在这些设计中在非还原性SDS-PAGE上未发现LC条带(图7C)。因此，这些数据表明bsAb 10和bsAb 12设计消除了H2/L1错配物种的形成；此外，缺乏H2L1配对的形成也支持了没有形成杂乱物种H1L2/H2L1的结论。与文献中揭示的使用移位HC/LC链间二硫键策略的其他双特异性抗体设计相比，bsAb 10和bsAb 12设计的优越性在于它们防止了一种错配物种和杂乱物种的形成。当通过HIC进一步纯化蛋白A 纯化的bsAb 12时，错配的H1/L2 Fab在MS谱图上消失(图20)。bsAb 12的纯化过程经过优化并显示在表4中。500mL瞬时转染的ExpiCHO细胞培养物的产量为77mg，这与同一瞬时转染系统中的mAb的范围相似。

表4：bsAb 12纯化过程的优化

表5：CH1和CL区中用于形成带电对的氨基酸残基

名称	CH1	CL
			bsAb 5CP	S131	P119
bsAb 9CP	A129	S121
			bsAb 10CP	K133	K207
bsAb 11CP	K133	I117
			bsAb 12CP	K133	F209
CP9	G166	S114
			CP10	T187	D170

注：EU编号用于CH1和CL区。CP，带电对。

为了进一步促进给定双特异性抗体每个臂上的HC和LC配对和/或提高使用常规制造工艺纯化的可行性，分别在CH1和CL区的一对残基处引入氨基酸突变，以形成带电对。每个带电对或多于一个带电对的任何组合可用于构建双特异性抗体，因为它们增加了HC和LC的正确配对和/或通过引入与杂质(即不匹配的分子种类)不同的物理特性来促进纯化。表5中的任何带电对或带电对的任何组合都可以与其他带电对(文献中已知的或新设计的)组合以实现和/或增强正确的HC/LC配对和/或通过引入与杂质(即不匹配的分子种类)不同的物理特性来促进纯化。用于形成带电对的两个残基之一可以用谷氨酸(E)取代，另一个可以用赖氨酸(K)取代，反之亦然。例如，在给定的由H1L1和H2L2组成的双特异性抗体上，如果在H1上引入“E”，在L1上引入“K”，则在H2上引入“K”，在L2上引入“E”。除了“E”和“K”之外，形成带电对的两个残基可以分别替换为酸性和碱性氨基酸。例如，如果不使用“E”，则引入“E”的残基也可以用天冬氨酸(D)取代。只要给定残基的天然氨基酸恰好是预期的取代氨基酸(即E、D或K)，就不需要突变。CH1和CL区中用于形成带电对的氨基酸残基列于表5。这些残基中的每一对都是通过3-D建模基于各种因素(包括接近度)来选择的。

本领域技术人员将理解，可以对上述实施例进行改变而不脱离其广泛的发明构思。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施例，而是旨在涵盖如本说明书所定义的本发明的精神和范围内的修改。

序列表

<110> 凡恩世制药公司

<120> 具有可替换匹配的链间半胱氨酸的双特异性抗体及其用途

<130> 065799.30WO1

<150> US 62/948,953

<151> 2019-12-17

<150> US 62/952,747

<151> 2019-12-23

<150> US 62/988,144

<151> 2020-03-11

<150> US 63/007,996

<151> 2020-04-10

<150> US 62/704,973

<151> 2020-06-05

<150> US 62/706,511

<151> 2020-08-21

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 114

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2 VH

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Met Ser Tyr Thr Pro Gly Thr Phe His Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val His Val Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 1 CH1

<400> 15

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 16

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2 CH1

<400> 16

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 1 VL

<400> 17

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2 VL

<400> 18

Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Ala

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 1 CL

<400> 19

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2 CL

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 21

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG2 CH1

<400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys

100

<210> 22

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG3 CH1

<400> 22

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly

100 105

<210> 23

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG4 CH1

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

100

<210> 24

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lambda CL

<400> 24

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

100

<210> 25

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 9 CH1

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Cys Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser

100

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 9 CL

<400> 26

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser

100 105

<210> 27

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 10 CH1

<400> 27

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser

100

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 10 CL

<400> 28

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Cys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser

100 105

<210> 29

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 11 CH1

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser

100

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 11 CL

<400> 30

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Cys Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser

100 105

<210> 31

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 12 CH1

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser

100

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bsAb 12 CL

<400> 32

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser

100 105

<210> 33

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2b VH

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gly Met Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Phe Cys

85 90 95

Thr Arg His Gly Asp Phe Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2b CH1

<400> 34

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 35

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2b VL

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb 2b CL

<400> 36

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

Claims (17)

1.一种分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区；和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区；

其中CH1和CL区在对应于CH1的SEQ ID NO：15、21、22或23和CL的SEQ ID NO：19或24的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代或天然氨基酸；

其中CH1和CL区的氨基酸取代或天然氨基酸选自：

(1)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的F209C和C214X；

(2)CH1中的S131C和C220X，以及CL中的P119C和C214X；

(3)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的K207C和C214X；

(4)CH1中的F170C和C220X，以及CL中的S176C和C214X；

(5)CH1中的P171C和C220X，以及CL中的S162C和C214X；

(6)CH1中的V173C和C220X，以及CL中的Q160C和C214X；

(7)CH1中的F170C和C131X，以及CL中的S176C和C214X；

(8)CH1中的P171C和C131X，以及CL中的S162C和C214X；

(9)CH1中的V173C和C131X，以及CL中的Q160C和C214X；

(10)CH1中的A129C和C220X，以及CL中的S121C和C214X；

(11)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的I117C和C214X；

(12)CH1中的C131，以及CL中的P119C和C214X；

(13)CH1中的A129C和C131X，以及CL中的S121C和C214X；

(14)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的K207C和C214X；

(15)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的I117C和C214X；

(16)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的L117C和C214X；

(17)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的L117C和C214X；

(18)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的F209C和C214X；

(19)CH1中的R133C和C131X，以及CL中的V209C和C214X；或者

(20)CH1中的K133C和C220X，以及CL中的V209C和C214X；

其中X选自S、A或G。

2.一种分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：

a.第一重链，H1；

b.第二重链，H2；

c.第一轻链，L1；和

d.第二轻链，L2；

其中Hl和Ll形成第一臂，其包含特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原的第一抗原结合结构域，和

其中H2和L2形成第二臂，其包含特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原的第二抗原结合结构域，其中

(a)H1包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区和重链可变区(VH区)；和

(b)L1包含人κ轻链或人λ轻链的CL区和轻链可变区(VL区)；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区在对应于CH1的SEQ ID NO:15、21、22或23，VH的SEQ IDNO:13，CL的SEQ ID NO:19或24和VL的SEQ ID NO:17的氨基酸位置的氨基酸残基处包含氨基酸取代；

其中CH1区、VH区、CL区和VL区中的氨基酸取代选自：

(1)CH1中的C220X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；或者

(2)CH1中的C131X，VH中的G44C，CL中的C214X和VL中的G101C；

其中X选自S、A或G。

3.根据权利要求1或2所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合结构域是CD47结合结构域。

4.根据权利要求3所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，CH1区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VL区包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，CL区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(a)包含H2和L2的第二臂不包含包含H1和L1的第一臂的氨基酸取代；

(b)两条重链H1和H2各包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含

CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列；

(c)两条重链H1和H2各包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含

CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列；

(d)两条重链H1和H2各自包含一个VH区、一个CH1区和一个Fc区(包含CH2和

CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列；

(e)两条轻链L1和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列；和/或

(f)两条轻链L1和L2各自包含一个VL区和一个CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中H1和H2形成异二聚体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(a)H1的VH区和L1的VL区分别具有Q39E和Q38K取代突变，H2的VH区

和L2的VL区分别具有Q39K和Q38E取代突变；或者

(b)H1的VH区和L1的VL区分别具有Q39K和Q38E取代突变，H2的VH区

和L2的VL区分别具有Q39E和Q38K取代突变。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的双特异性抗体或抗原结合片段是抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合结构域特异性结合CD47，优选人CD47，并且第二抗原结合结构域特异性结合叶酸受体α(FRα)，优选人FRα。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(a)第一抗原结合域具有SEQ ID:13的VH序列和SEQ ID:17的VL序列，第二抗原结合域具有SEQ ID:33的VH序列和SEQ ID:35的VL序列：或者

(b)第一抗原结合结构域具有SEQ ID:13的VH序列和SEQ ID:17的VL序列，第

二抗原结合结构域具有SEQ ID:14的VH序列和SEQ ID:18的VL序列。

10.根据权利要求8或9所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段能够阻断信号调节蛋白α(SIRPα)与在表达FRα和CD47的细胞上的CD47的结合，诱导巨噬细胞介导的对表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用，和/或结合表达FRα和CD47的癌细胞而与人红细胞(RBC)的结合最小化至无法检测。

11.一种分离的核酸，其编码权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体或抗原结合片段。

12.一种包含权利要求11所述的分离的核酸的载体。

13.一种包含权利要求12所述的载体的宿主细胞。

14.一种药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

15.一种靶向在有需要的受试者的癌细胞表面上都表达的FRα和CD47的方法，在需要的受试者中阻断SIRPα与表达FRα和CD47的癌细胞上的CD47的结合，在有需要的受试者中诱导巨噬细胞介导的表达FRα和CD47的癌细胞的吞噬作用，在有需要的受试者中结合表达FRα和CD47的癌细胞而与人红细胞(RBC)的结合最小化到不可检测，和/或在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求8至10中任一项的分离的抗CD47/抗FRα双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体，任选地，所述癌症选自下组：肺癌、胃癌、食道癌、胆道癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性粒细胞白血病(AML)和其他液体肿瘤。

16.一种制备权利要求1至10中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生所述双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或培养物中回收双特异性抗体或其抗原结合片段。

17.一种制备包含权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。

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