CN117242091A - 半胱氨酸工程化抗体构建体、偶联物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了被工程化以引入至少一个半胱氨酸插入突变的抗体构建体(“半胱氨酸工程化抗体构建体”)。插入的半胱氨酸残基能够用作将一种或多种活性剂与抗体构建体偶联以提供偶联物诸如抗体‑药物偶联物的位点。

Description

半胱氨酸工程化抗体构建体、偶联物及使用方法
技术领域
本公开涉及抗体领域，尤其涉及被工程化为包括一个或多个半胱氨酸插入突变的抗体，以及包含这些抗体和活性剂的偶联物。
背景技术
抗体药物偶联物(ADC)代表了一类相对较新且有前途的治疗剂。ADC通常由单克隆抗体经由接头连接到小分子治疗剂(“药物”)而构成。药物抗体比率(DAR)和药物偶联的特定位点可能影响ADC的稳定性和暴露(Hamblett等人，2004,Clin.Cancer Res.,10(20):7063-7070；Shen等人，2012,Nature Biotechnology,30:184-189)。通过经由天然半胱氨酸或赖氨酸残基进行偶联来生成ADC的传统方法通常产生在药物载量和药物偶联两方面不均匀的偶联物混合物，这是抗体稳定性、特异性、体内分布、药代动力学和/或疗效中的一者或多者可能出现缺陷的原因。
Lyons首先在标记抗体的背景下描述了出于位点特异性偶联的目的，用半胱氨酸残基替换抗体中的天然氨基酸(Lyons,et al.,1990,Protein Eng Des Sel.,3(8):703-708)。随后描述了在抗体中的工程化半胱氨酸残基处进行位点特异性药物偶联，以解决不均匀性问题(THIOMABTM)(Junutula等人，2008,Nat Biotechnol.,26:925-932；Vollmar等人，2017,Bioconjug Chem,28(10):2538-2548；Ohri等人，2018,Bioconjug Chem.,29(2):473–485)。还描述了定点诱变掺入半胱氨酸残基的其他实例(例如，Sussman等人，2018,Protein Eng Des Sel.,31(2):47-54)。
还报道了涉及插入半胱氨酸残基而不是用半胱氨酸残基取代天然氨基酸的相关策略(Dimasi等人，2017,Mol.Pharmaceutics,14(5):1501-1516；美国专利申请公开号US2018/0169255)。在先前报道的THIOMABTM半胱氨酸取代位置之一的位点(S239C)之后插入半胱氨酸残基，称为C239i，这应用于MEDI2228(一种临床阶段ADC)中。C239i插入导致FcγR结合与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的消除。已经描述过这些功能变化的结构基础(Gallagher等人，2019,Pharmaceutics,11:546)。还已经描述过其他半胱氨酸插入方法(美国专利申请公开号US 2020/0129635和国际专利申请公开号WO 2018/233572)。
提供该背景信息的目的在于使申请人相信的已知信息成为与本公开可能相关的信息。不一定旨在承认，也不应该解释为，任何前述信息构成了针对所要求保护的发明的现有技术。
发明内容
本文描述了半胱氨酸工程化抗体构建体、偶联物及使用方法。
在一个方面，本公开涉及一种半胱氨酸工程化抗体构建体，其包含VH结构域、VH结构域和VL结构域、Fc区，或它们的组合，Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域，该抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：(a)在VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；(b)在VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；(c)在CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；(d)在CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；(e)在CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；(f)在VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；(g)在CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；(h)在CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；(i)在CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及(j)在CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，其中VL、CL、VH和CH1结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，CH2结构域中的氨基酸编号是EU编号，并且其中抗体构建体基于免疫球蛋白G(IgG)。
在另一个方面，本公开涉及一种偶联物，其包含如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，以及与一个或多个插入的半胱氨酸残基中的每一者偶联的一种或多种活性剂。
在另一个方面，本公开涉及具有式(I)的偶联物：
A-(L-(D)q)p(I)
其中A是半胱氨酸工程化抗体构建体；L是接头；D是活性剂；q是介于1与4之间的整数，p是介于1与8之间的整数，其中半胱氨酸工程化抗体构建体包含VH结构域、VH结构域和VL结构域、Fc区，或它们的组合，Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域，并且其中半胱氨酸工程化抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；(c)在CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；(g)在CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，其中VL、CL、VH和CH1结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，CH2结构域中的氨基酸编号是EU编号，其中半胱氨酸工程化抗体构建体基于免疫球蛋白G(IgG)，并且其中每个D经由L与插入的半胱氨酸残基连接。
在另一个方面，本公开涉及一种组合物，其包含如本文所公开的任一个实施方案中所述的偶联物，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在另一个方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的如本文所述的偶联物，其中该偶联物所包含的活性剂是治疗剂。
在另一个方面，本公开涉及一种如本文所述用于治疗的偶联物，其中该偶联物所包含的活性剂是治疗剂。
在另一个方面，本公开涉及如本文所述偶联物在制造用于治疗有需要的受试者的药物中的用途，其中该偶联物所包含的活性剂是治疗剂。
在另一个方面，本公开涉及一种制备如本文所公开的任一个实施方案中所述的偶联物的方法，其包括将半胱氨酸工程化抗体构建体置于还原条件下，使得一个或多个插入的半胱氨酸残基的硫醇基团被还原，然后使硫醇反应性接头-活性剂与抗体构建体在允许接头与还原的硫醇之间形成键的条件下反应。
在另一个方面，本公开涉及一种制备具有预先确定的药物抗体比率(DAR)的抗体-药物偶联物的方法，该方法包括：(i)提供半胱氨酸工程化抗体构建体，其包含VH结构域、VH结构域和VL结构域、Fc区，或它们的组合，Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域，并且该抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；(c)在CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；(g)在CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，然后(ii)使半胱氨酸工程化抗体构建体与药物-接头反应，以提供抗体-药物偶联物；其中预先确定的DAR是1、2、3、4、5、6、7或8，并且半胱氨酸工程化抗体构建体包含与预先确定的DAR相同数目的半胱氨酸插入突变，其中VL、CL、VH和CH1结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，CH2结构域中的氨基酸编号是EU编号，并且其中半胱氨酸工程化抗体构建体基于免疫球蛋白G(IgG)。
在另一个方面，本公开涉及一种多核苷酸或一组多核苷酸，其编码如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。
在另一个方面，本公开涉及一种包含一个或多个多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。
在另一个方面，本公开涉及一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。
附图说明
图1示出了药物接头的结构：(A)MCvcPAB-微管溶素M，(B)MCvcPABC-MMAE，(C)MTvc化合物1。
图2示出了与未偶联对照(v17427)和对照ADC相比，使用半胱氨酸插入变体制备的30种示例性抗体-药物偶联物(ADC)的(A)非还原毛细管电泳SDS(CE-SDS)凝胶分析结果和(B)还原CE-SDS凝胶分析结果。泳道A：未偶联对照(v17427)；泳道B至D是变体v22760(L_K39.5C)与下列物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(B)，MCvcPAB-微管溶素M(C)，MTvc化合物1(D)；泳道E至G是变体v22761(L_K126.5C)与下列物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(E)，MCvcPAB-微管溶素M(F)，MTvc化合物1(G)；泳道H至J是变体v22765(H_G237.5C)与下列物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(H)，MCvcPAB-微管溶素M(I)，MTvc化合物1(J)；泳道K至M是变体v22768(H_Q295.5C)与下列物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(K)，MCvcPAB-微管溶素M(L)，MTvc化合物1(M)；泳道N至P是变体v27321(L_W148.5C)与下列物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(N)，MCvcPAB-微管溶素M(O)，MTvc化合物1(P)；泳道Q至S是变体v27322(L_K149.5C)与下列物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(Q)，MCvcPAB-微管溶素M(R)，MTvc化合物1(S)；泳道T至V是变体v28983(L_P40.5C)与以下物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(T)，MCvcPAB-微管溶素M(U)和MTvc化合物1(V)；泳道W至Y是变体v28989(H_A9.5C)与以下物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(W)，MCvcPAB-微管溶素M(X)，MTvc化合物1(Y)；泳道Z至BB是变体v28993(H_G169.5C)与以下物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(Z)，MCvcPAB-微管溶素M(AA)和MTvc化合物1(BB)；泳道CC至EE是变体v29001(H_T299.5C)与以下物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(CC)，MCvcPAB-微管溶素M(DD)，MTvc化合物1(EE)；泳道FF至HH是变体v22758(H_A114C；对照)与以下物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(FF)，MCvcPAB-微管溶素M(GG)，MTvc化合物1(HH)；泳道II至KK是变体v29013(H_S239.5C；对照)与以下物质的偶联物：MCvcPABC-MMAE(II)，MCvcPAB-微管溶素M(JJ)，MTvc化合物1(KK)。分子量标记(从上到下)：119、68、48、29、21、16kDa。
图3示出了包含与药物-接头MTvc化合物1偶联的半胱氨酸插入变体的抗体-药物偶联物(ADC)在与小鼠血浆一起孵育后的免疫沉淀质谱(IPMS)介导的DAR分析结果。示出了剩余DAR(实心圆；左侧轴)和马来酰亚胺开环百分比(空心圆；右侧轴)两者。(A)变体v22760(L_K39.5C)，(B)变体v22761(L_K126.5C)，(C)变体v22765(H_G237.5C)，(D)变体v22768(H_Q295.5C)，(E)变体v27321(L_W148.5C)，(F)变体v27322(L_K149.5C)，(G)变体v28983(L_P40.5C)，(H)变体v28989(H_A9.5C)，(I)变体v28993(H_G169.5C)，(J)变体v29001(H_T299.5C)，(K)变体v22758(H_A114C；对照)，(L)变体v29013(H_S239.5C；对照)。
图4示出了包含与药物-接头MCvcPABC-MMAE偶联的半胱氨酸插入变体的抗体-药物偶联物(ADC)在与小鼠血浆一起孵育后的免疫沉淀质谱(IPMS)介导的DAR分析结果。示出了剩余DAR(实心圆；左侧轴)和马来酰亚胺开环百分比(空心圆；右侧轴)两者。(A)变体v22760(L_K39.5C)，(B)变体v22761(L_K126.5C)，(C)变体v22765(H_G237.5C)，(D)变体v22768(H_Q295.5C)，(E)变体v27321(L_W148.5C)，(F)变体v27322(L_K149.5C)，(G)变体v28983(L_P40.5C)，(H)变体v28989(H_A9.5C)，(I)变体v28993(H_G169.5C)，(J)变体v29001(H_T299.5C)，(K)变体v22758(H_A114C；对照)，(L)变体v29013(H_S239.5C；对照)。
图5示出了包含与药物-接头MCvcPAB-微管溶素M偶联的半胱氨酸插入变体的抗体-药物偶联物(ADC)在与小鼠血浆一起孵育后的免疫沉淀质谱(IPMS)介导的DAR分析结果。示出了剩余DAR(实心圆，实线；左侧轴)、马来酰亚胺开环百分比(空心圆；右侧轴)和MCvcPAB-微管溶素M分解(乙酰基损失)百分比(实心圆，虚线)。(A)变体v22760(L_K39.5C)，(B)变体v22761(L_K126.5C)，(C)变体v22765(H_G237.5C)，(D)变体v22768(H_Q295.5C)，(E)变体v27321(L_W148.5C)，(F)变体v27322(L_K149.5C)，(G)变体v28983(L_P40.5C)，(H)变体v28989(H_A9.5C)，(I)变体v28993(H_G169.5C)，(J)变体v29001(H_T299.5C)，(K)变体v22758(H_A114C；对照)，(L)变体v29013(H_S239.5C；对照)。
图6示出了与对照ADC(v17427-MTvc化合物1，DAR 4)相比，在不同的c-Met表达细胞系(A)EBC-1细胞系(表达高c-Met)和(B)HT-29细胞系(表达中等c-Met)上对包含以DAR1、2或3与MTvc化合物1偶联的半胱氨酸插入变体的ADC进行体外细胞毒性测试的结果。
图7示出了在表达中等c-Met的结直肠癌异种移植物模型HT-29中包含以DAR 1、2或3与MTvc化合物1偶联的半胱氨酸插入变体的ADC在以下毒素匹配剂量下与DAR4对照相比的体内抗肿瘤活性：(A)6mg/kg(DAR1)、3mg/kg(DAR2)、2mg/kg(DAR3)和1.5mg/kg(DAR4)，以及(B)12mg/kg(DAR1)、6mg/kg(DAR2)、4mg/kg(DAR3)和3mg/kg(DAR4)。
图8示出了在表达高c-Met的非小细胞肺癌异种移植物模型H1975中包含以DAR 1、2或3与MTvc化合物1偶联的半胱氨酸插入变体的ADC在以下毒素匹配剂量下与DAR4对照相比的体内抗肿瘤活性：(A)4mg/kg(DAR1)、2mg/kg(DAR2)、1.3mg/kg(DAR3)和1mg/kg(DAR4)，以及(B)24mg/kg(DAR1)、12mg/kg(DAR2)、8mg/kg(DAR3)和6mg/kg(DAR4)。
图9呈现了以下各项中的CH1结构域的序列比对：人IgG1(等位基因*01[SEQ IDNO:41]和等位基因*03[SEQ ID NO:42])、IgG2(等位基因*04[SEQ ID NO:43]、等位基因*01[SEQ ID NO:44]和等位基因*02[SEQ ID NO:45])、IgG3(等位基因*01[SEQ ID NO:46]、等位基因*18[SEQ ID NO:47]和等位基因*17[SEQ ID NO:48])，以及IgG4(等位基因*01[SEQID NO:49])。
图10呈现了以下各项中的CH2结构域的序列比对：人IgG1(等位基因*01[SEQ IDNO:3])、IgG2(等位基因*01[SEQ ID NO:4]和等位基因*02[SEQ ID NO:5])、IgG3(等位基因*01[SEQ ID NO:6]、等位基因*16[SEQ ID NO:7]、等位基因*09[SEQ ID NO:8]、等位基因*11[SEQ ID NO:9]、等位基因*14[SEQ ID NO:10]和等位基因*18[SEQ ID NO:11])，以及IgG4(等位基因*01[SEQ ID NO:12]和等位基因*02[SEQ ID NO:13])。
图11呈现了以下各项中的CH3结构域的序列比对：人IgG1(等位基因*01[SEQ IDNO:14]、等位基因*04[SEQ ID NO:15]和等位基因*03[SEQ ID NO:16])，IgG2(等位基因*01[SEQ ID NO:17]和等位基因*06[SEQ ID NO:18])，IgG3(等位基因*15[SEQ ID NO:19]、等位基因*17[SEQ ID NO:20]、等位基因*14[SEQ ID NO:21]、等位基因*06[SEQ ID NO:22]、等位基因*08[SEQ ID NO:23]、等位基因*01[SEQ ID NO:24]、等位基因*03[SEQ ID NO:25]和等位基因*13[SEQ ID NO:26])，以及IgG4(等位基因*03[SEQ ID NO:27]和等位基因*01[SEQ ID NO:28])。
图12呈现了以下各项中的CL结构域的序列比对：人k轻链(等位基因*01[SEQ IDNO:29]、等位基因*04[SEQ ID NO:30]、等位基因*05[SEQ ID NO:31]、等位基因*02[SEQ IDNO:32]和等位基因*03[SEQ ID NO:33])，以及人λ轻链(等位基因3*02[SEQ ID NO:34]、等位基因3*03[SEQ ID NO:35]、等位基因6*01[SEQ ID NO:36]、等位基因2*01[SEQ ID NO:37]、等位基因7*01[SEQ ID NO:38]、等位基因7*03[SEQ ID NO:39]和等位基因1*02[SEQID NO:40])。
图13示出了(A)变体v29013(H_S239.5C；对照)与药物-接头MCvcPABC-MMAE的偶联物以及(B)变体v29001(H_T299.5C)与药物-接头MCvcPABC-MMAE的偶联物的疏水相互作用色谱法(HIC)分布图。
图14示出了(A)变体v29013(H_S239.5C；对照)与药物-接头MTvc化合物1的偶联物以及(B)变体v29001(H_T299.5C)与药物-接头MTvc化合物1的偶联物的疏水相互作用色谱法(HIC)分布图。
图15示出了(A)变体v29013(H_S239.5C；对照)和(B)变体v29001(H_T299.5C)的差示扫描量热法(DSC)分布图，每一者都与包含半胱氨酸取代突变的对照变体(v27320，L_K149C)进行比较。
图16示出了(A)ADC v35074-MTvc化合物1(DAR 6)的疏水相互作用色谱法(HIC)分布图，其中观察到两个不同的峰；在7.07分钟处洗脱的峰代表DAR 5，在7.5分钟处洗脱的峰代表DAR 6，以及(B)同一ADC的尺寸排阻色谱法(SEC)分布图，其中在3.3分钟处洗脱的级分代表单体(99％)。
图17示出了EndoS处理后ADC v35074-MTvc化合物1(DAR 6)的轻链(LC)(A)、重链1(B)和重链2(C)的降低的LC-MS分布图。
图18示出了作为未偶联抗体以及与药物-接头MTvc化合物1偶联的半胱氨酸插入变体v35074的毛细管电泳-SDS(CE-SDS)分布图。泳道1：蛋白梯；泳道2：曲妥珠单抗对照(非还原(NR))；泳道3：未偶联v35074(NR)；泳道4：v35074-MTvc化合物1(NR)；泳道5：曲妥珠单抗(还原(R))；泳道6：未偶联v35074(R)；泳道7：v35074-MTvc化合物1(R)。
具体实施方式
本公开涉及被工程化以引入至少一个半胱氨酸插入突变的抗体构建体(“半胱氨酸工程化抗体构建体”)。该语境中的“半胱氨酸插入突变”是指在亲本抗体构建体序列中存在的两个氨基酸残基之间引入的非天然半胱氨酸残基。插入的半胱氨酸残基可以用作将一种或多种活性剂(诸如治疗剂、诊断剂和标记剂)与抗体构建体偶联以提供偶联物的位点。
本公开的某些实施方案涉及包含半胱氨酸工程化抗体构建体和与该抗体构建体中插入的半胱氨酸残基共价连接的活性剂的偶联物。这些偶联物可以用于各种治疗应用和诊断应用。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
如本文所用，术语“约”是指与给定值相差大约+/-10％的变化。应当理解，无论是否特别提及，此种变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
当在本文中结合术语“包含”一起使用时，词语“一个/种(a/an)”的使用可意指“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素和/或方法步骤。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“基本上由……组成”表示可以存在附加的要素和/或方法步骤，但是这些附加不会实质性影响所列举的组合物、方法或用途起作用的方式。术语“由......组成”当在本文中与组合物、用途或方法相连使用时，排除了额外要素和/或方法步骤的存在。本文描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法也可以在某些实施方案中基本上由那些要素和/或步骤组成，而在其他实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否特别提及了这些实施方案。
如本文所用，术语“抗体构建体”涵盖全长抗体和全长抗体的功能片段。抗体功能片段包括抗原结合片段(诸如Fab’片段、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变区(scFv)和单结构域抗体(sdAb))，以及包含能够与一种或多种Fc受体(FcR)结合的Fc区的Fc片段。术语“抗体构建体”还涵盖包含Fc区和一种或多种异源多肽的Fc融合蛋白。
全长抗体包含的重链和轻链组装成含有两条重链和两条轻链的异四聚体。重链通常包含以下结构域(从N-末端到C-末端)：VH-CH1-铰链-CH2-CH3，轻链通常包含以下结构域(从N-末端到C-末端)：VL-CL。除非另外指明，否则本文所用的VH、CH1、VL和CL结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，而本文所用的CH2结构域和CH3结构域以及铰链区中的氨基酸残基编号是EU编号，也称为EU索引(这两种编号系统都在Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Public Health Service第5版，National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)中进行了描述)。
如本文可互换使用的术语“Fc区”和“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区域。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能有所不同，但是人IgG重链Fc区序列通常被定义为从第239位(EU编号)延伸到重链的C-末端。二聚体Fc的“Fc多肽”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽中的一个，即包含能够稳定自我缔合的免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽。Fc区通常包含CH2结构域和CH3结构域，但是在一些实施方案中，可以仅包含CH2结构域或仅包含CH3结构域。在某些实施方案中，也可认为Fc区涵盖铰链区。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常被定义为从位置239延伸至位置340。“CH3结构域”通常被定义为包含Fc区中CH2结构域的C端的氨基酸残基，即从位置341至位置447。人IgG1的“铰链区”通常被定义为从位置216延伸至位至238(Burton,1985,Molec.Immunol.,22:161-206)。可通过比对形成重链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基来将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。
在本公开的该语境中，“Fc融合蛋白”是Fc区的全部或部分(例如，CH2结构域或CH3结构域)与异源蛋白或多肽融合的蛋白质。
术语“来源于”和“基于”在本文中用于描述氨基酸序列时，意指主题氨基酸序列与提到的参考氨基酸序列基本上相同。
术语“基本上相同”在本文中与氨基酸序列相关时，意指当最佳比对时(例如使用下述方法)，氨基酸序列与其参考氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以本领域中已知的各种方式来确定，例如使用可公开获得的计算机软件，如SmithWaterman比对(Smith和Waterman,1981,J Mol Biol 147:195-7)；“BestFit”(Smith和Waterman,1981,Advances in Applied Mathematics,482-489)；BLAST(基本局部比对搜索工具；(Altschul等人，1990,J Mol Biol,215:403-10)及其变更和更新；ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的长度上实现最大比对所需的算法。一般而言，对于肽，比较序列的长度将是至少10个氨基酸，但本领域技术人员将理解实际长度将取决于所比较序列的总长度。在某些实施方案中，比较序列的长度可以是蛋白质序列或肽序列的全长。
如本文关于材料所用的术语“经分离的”是指材料从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，则为天然环境)中移除。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同的多核苷酸或多肽是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分并且/或者此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，且仍然是经分离的，因为此种载体或组合物不是其自然环境的一部分。
应当理解，本文描述的一个实施方案中对某个特征的正面叙述用作在替代性实施方案中排除该特征的基础。例如，在为给定实施方案或权利要求提出选项列表的情况下，应当理解，可从所述列表中删除一个或多个选项，并且缩短的列表可形成替代实施方案，而不管是否特别提及这种替代实施方案。
我们设想，本文讨论的任何实施方案可以关于本文所公开的任何方法、用途或组合物来实施，反之亦然。
半胱氨酸工程化抗体构建体
本公开的半胱氨酸工程化抗体构建体是包含一个或多个半胱氨酸插入突变的抗体构建体。半胱氨酸工程化抗体构建体可以是例如全长抗体、全长抗体的功能片段，或Fc融合蛋白。功能性抗体片段包括例如抗原结合片段和Fc片段。抗原结合片段的实例包括但不限于抗体的轻链可变区和/或重链可变区(VL，VH)、可变片段(Fv)、Fab’片段、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变区(scFv)、互补决定区(CDR)和单结构域抗体(sdAb)。Fc片段通常包括抗体的CH2结构域和CH3结构域，并且能够结合一种或多种Fc受体(FcR)。Fc片段可以任选地包含铰链区。
Fc融合蛋白包含Fc区以及与之融合或共价连接的一种或多种异源多肽。在某些实施方案中，Fc融合蛋白包含Fc区以及与之融合或共价连接的一个或多个目标结合结构域。在某些实施方案中，可以包含在Fc融合蛋白中的目标结合结构域的实例包括但不限于受体、受体片段(诸如细胞外部分)、配体、细胞因子和异源抗原结合抗体片段(诸如来自不同抗体类别或亚类的抗原结合片段)。一种或多种异源多肽可以直接或经由接头(例如，基于氨基酸的接头)融合或共价连接到Fc区。
本公开的某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体包含抗原结合结构域、Fc区，或者抗原结合结构域和Fc区两者。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体所包含的抗原结合结构域包括VH结构域，或VH结构域和VL结构域。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体所包含的Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体所包含的Fc区包含CH2结构域和CH3结构域。
本公开的某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体是全长抗体。在此类实施方案中，半胱氨酸工程化抗体可以是例如单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在该语境中，全长抗体可以包含一个或多于一个Fab区。例如，全长抗体可以是单臂(一价)抗体(OAA)、二价抗体或多价抗体。
某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体是抗体功能片段。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体是包含至少一个抗原结合结构域的功能片段，诸如Fab、scFv或sdAb。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含多于一个抗原结合结构域，其中这些抗原结合结构域可以是例如Fab、scFv或它们的组合。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含用接头连接的两个或更多个抗原结合结构域，诸如以串联scFv形式或scFv-Fab形式。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体可以是包含两个或更多个抗原结合结构域的双特异性或多特异性抗体，其中每个抗原结合结构域与不同的抗原表位结合。
某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体是Fc融合蛋白。
半胱氨酸工程化抗体构建体在包含一个或多个抗原结合结构域时，每个抗原结合结构域均与目标抗原结合。目标抗原通常是存在于目标细胞表面上的细胞表面分子，诸如蛋白质、脂质或多糖，其中目标细胞诸如肿瘤细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、受损的红细胞、动脉斑块细胞、发炎组织细胞或纤维化组织细胞。目标抗原的实例包括但不限于肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关联的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发生的分子，以及与血管生成相关联的分子。某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体包含至少一个与肿瘤相关抗原(TAA)结合的抗原结合结构域。
本公开的半胱氨酸工程化抗体构建体来源于免疫球蛋白G(IgG)。在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体来源于人IgG。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体来源于人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体来源于IgG1。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体来源于人IgG1。
在其中半胱氨酸工程化抗体构建体在轻链中包含半胱氨酸插入的某些实施方案中，该抗体构建体可以包含κ轻链或λ轻链。在其中半胱氨酸工程化抗体构建体在轻链中包含半胱氨酸插入的一些实施方案中，该抗体构建体包含k轻链。
人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的CH1、CH2和CH3结构域的氨基酸序列，以及k轻链和λ轻链的氨基酸序列在本领域中是已知的(参见例如，在国际ImMunoGeneTics信息系统网站上提供的序列)。图9至图11中还分别提供了人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的各种等位基因的CH1、CH2和CH3结构域的代表性氨基酸序列，图12提供了k和λCL结构域的等位基因的代表性氨基酸序列。
在某些实施方案中，如通过解链温度(Tm)测定的，半胱氨酸插入突变对半胱氨酸工程化抗体构建体的稳定性没有影响或只有很小的影响。所谓“没有影响或只有很小的影响”，意指半胱氨酸残基插入其中的半胱氨酸工程化抗体构建体的结构域的Tm与相应亲本抗体构建体(缺少半胱氨酸插入突变)中的相同结构域的Tm相差0℃至8℃(即，等于后一Tm±0℃至8℃)。例如，对于包含插入CH2结构域中的半胱氨酸残基的半胱氨酸工程化抗体构建体，半胱氨酸工程化抗体构建体的CH2结构域Tm与相应亲本抗体构建体的CH2结构域Tm相差在0℃至8℃的范围内。在一些实施方案中，半胱氨酸残基插入其中的半胱氨酸工程化抗体构建体的结构域的Tm与相应亲本抗体构建体中的相同结构域的Tm相差在0℃至7℃的范围内。在一些实施方案中，半胱氨酸残基插入其中的半胱氨酸工程化抗体构建体的结构域的Tm与相应亲本抗体构建体中的相同结构域的Tm相差在0℃至6℃，或者相差在0℃至5℃的范围内。
抗体构建体的Tm可以通过本领域已知的各种技术来测定，例如圆二向色性(CD)、差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光测定法(DSF)。在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体和相应的亲本抗体构建体之间的Tm差异由DSC测定。
在某些实施方案中，本公开的半胱氨酸工程化抗体构建体在该抗体构建体的每条链中(例如，在两条重链或两条轻链中)包括相同的半胱氨酸插入突变，使得该抗体构建体在与活性剂偶联时的平均药物抗体比率(DAR)为2。
本公开的某些实施方案涉及“DAR调整过的”半胱氨酸工程化抗体构建体。该语境中的“DAR调整过的”抗体构建体是这样的半胱氨酸工程化抗体构建体：其仅在构建体的一条链中包含半胱氨酸插入突变(允许形成DAR 1偶联物)，或者包含半胱氨酸插入突变的组合(允许形成DAR≥2(例如，DAR 3、DAR 4或DAR 6)的偶联物)。
半胱氨酸插入突变
通过将基于结构的计算方法和实验测试相结合，如本文的“实施例”部分中所述，在IgG结构中鉴定了半胱氨酸插入突变的适当位点。在某些实施方案中，本公开的半胱氨酸工程化抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；
(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(g)在所述CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
应当理解，可以包含在给定抗体构建体中的半胱氨酸插入突变将取决于抗体构建体的形式。例如，全长抗体构建体可以在VH、VL、CL、CH1和/或CH2结构域的任一者中包含如上所述的半胱氨酸插入突变，而仅包含Fc区的抗体构建体(诸如Fc融合蛋白)可以在CH2结构域中包含如上所述的半胱氨酸插入突变。类似地，包含抗原结合结构域(诸如scFv或Fab)但缺少Fc区的抗体构建体可以在VH、VL、CL和/或CH1结构域中包含半胱氨酸插入突变。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在Fc区中包含选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(c)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在Fab区中包含选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；
(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基，以及
(g)在所述CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在CL结构域或CH1结构域中包含选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基，以及
(d)在所述CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在可变区中包含选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基，以及
(c)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在CH2结构域或可变区中包含如上所述的半胱氨酸插入突变。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在CH2结构域或可变区中包含如上所述的半胱氨酸插入突变，其中所述半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(d)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
本文所述的半胱氨酸插入突变可以对称地引入抗体构建体中(即，相同的半胱氨酸插入突变被引入各自对应的重链或轻链中)，或者它们可以不对称地引入(即，一个半胱氨酸插入突变被引入一条重链或轻链中，而不同的半胱氨酸插入突变或没有半胱氨酸插入突变被引入另一条重链或轻链中)。在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含对称半胱氨酸插入突变。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含一个或多个不对称半胱氨酸插入突变。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含对称半胱氨酸插入突变和不对称半胱氨酸插入突变的组合。
将两个半胱氨酸插入突变对称地引入抗体构建体中(例如，引入两条重链或两条轻链中)产生的半胱氨酸工程化抗体构建体在与活性剂偶联时，平均药物抗体比率(DAR)为2。将不对称半胱氨酸插入突变和/或半胱氨酸插入突变的组合引入抗体构建体中允许最终偶联物的DAR得到“调整”。例如，仅在该构建体的一条链中包含半胱氨酸插入突变的抗体构建体允许形成DAR 1偶联物，而包含半胱氨酸插入突变的组合的抗体构建体允许形成DAR≥2的偶联物。在其中半胱氨酸工程化抗体构建体包含半胱氨酸插入突变的组合的那些实施方案中，可以对称地引入突变(即，相同的半胱氨酸插入突变包含在抗体构建体的两条链中)、不对称地引入突变(即，抗体构建体的一条链中的一个或多个半胱氨酸插入突变不同于抗体构建体的另一条链中的一个或多个半胱氨酸插入突变，或者不存在于抗体构建体的另一条链中)，或者这两者的组合(即，抗体构建体的一条链中的至少一个半胱氨酸插入突变与抗体构建体的另一条链中的半胱氨酸插入突变相同，而至少一个半胱氨酸插入突变不同于另一条链中的半胱氨酸插入突变，或者不存在于另一条链中)。通常，抗体构建体在包含单个半胱氨酸插入突变或不对称半胱氨酸插入突变时，半胱氨酸插入突变被引入抗体构建体的重链中。然而，在某些实施方案中考虑不对称轻链半胱氨酸插入突变。
本公开的某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体包含两个对称的半胱氨酸插入突变(即，每个插入的半胱氨酸残基在每条相应的重链或轻链上的相同位置处)。
本公开的某些实施方案涉及的“DAR调整过的”半胱氨酸工程化抗体构建体包含本文所述半胱氨酸插入突变中的一种或这些半胱氨酸插入突变的组合。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含1至8个半胱氨酸插入突变。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含1至6个半胱氨酸插入突变。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含1至4个半胱氨酸插入突变。
本公开的某些实施方案涉及以下DAR调整过的半胱氨酸工程化抗体构建体：其包含奇数个半胱氨酸插入突变，例如，1、3、5或7个半胱氨酸插入突变。一些实施方案涉及包含1、3或5个半胱氨酸插入突变的DAR调整过的半胱氨酸工程化抗体构建体。一些实施方案涉及包含1或3个半胱氨酸插入突变的DAR调整过的半胱氨酸工程化抗体构建体。
某些实施方案涉及包含单个(1个)半胱氨酸插入突变的半胱氨酸工程化抗体构建体。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体在该抗体构建体的重链中包含单个半胱氨酸插入突变。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含选自下列项的单个半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(e)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含选自下列项的单个半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(c)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
本公开的某些实施方案涉及的半胱氨酸工程化抗体构建体包含如本文所述的三个半胱氨酸插入突变。在此类实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体可以包含三个不同的(不对称)半胱氨酸插入突变，或者该抗体构建体可以包含两个对称半胱氨酸插入突变(即，在每条相应的重链或轻链上的相同位置处)和一个不对称半胱氨酸插入(在一条轻链或重链上插入的一个半胱氨酸残基)。在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含3个半胱氨酸插入突变，其中两个相同(对称)，另一个不同(不对称)。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含3个半胱氨酸插入突变，其中两个相同(对称)，另一个不同(不对称)，其中对称半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；
(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(g)在所述CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，
并且不对称半胱氨酸插入突变选自：
(i)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(ii)在所述CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(iii)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(iv)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(v)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含3个半胱氨酸插入突变，其中两个相同(对称)，另一个不同(不对称)，其中对称半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基，以及
(c)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，
并且不对称半胱氨酸插入突变选自：
(i)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(ii)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(iii)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
本公开的某些实施方案涉及以下DAR调整过的半胱氨酸工程化抗体构建体：其包含偶数个半胱氨酸插入突变，例如，4、6或8个半胱氨酸插入突变。一些实施方案涉及包含4或6个半胱氨酸插入突变的DAR调整过的半胱氨酸工程化抗体构建体。通常，在此类实施方案中，半胱氨酸插入突变是对称半胱氨酸插入突变。然而，在一些实施方案中也考虑了不对称半胱氨酸插入突变。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含4、6或8个半胱氨酸插入突变，其中这些半胱氨酸插入突变选自：
(i)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(ii)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(iii)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(iv)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(v)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含4或6个半胱氨酸插入突变，其中这些半胱氨酸插入突变选自：
(i)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(ii)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(iii)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(iv)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(v)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
另外的突变
在本公开的某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体可以包含本领域已知的另外的突变，以向该抗体构建体提供期望的功能改变。例如，在一些实施方案中，可以将突变引入半胱氨酸工程化抗体构建体的CH2结构域中，以改变与一种或多种Fc受体的结合，并且/或者当半胱氨酸工程化抗体构建体包含异二聚体Fc区时，可以将突变引入该抗体构建体的CH3结构域中，以改善异二聚体形成。在其中抗体构建体具有双特异性或多特异性的一些实施方案中，为了促进每条重链和轻链之间的正确配对，也可以将突变引入Fab区中。此类Fab区突变的实例包括国际专利申请公开号WO 2014/082179、WO 2015/181805和WO2017/059551中所述的那些。
CH2结构域突变
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体可以在CH2结构域中包含一个或多个另外的突变，例如，半胱氨酸工程化抗体构建体可以包含经修饰的CH2结构域，该CH2结构域与一种或多种Fc受体(诸如FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体)的结合发生改变。
选择性地改变对不同Fcγ受体的亲和力的CH2结构域的各种氨基酸突变在本领域中是已知的。引起结合增加的氨基酸突变和引起结合减少的氨基酸修饰均可以用于某些适应症。例如，增加Fc对FcγRIIIa(一种活化受体)的结合亲和力导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加，这转而导致靶细胞溶解增加。降低与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合在某些情况下同样可能是有益的。当希望降低或消除ADCC和补体介导的细胞毒性作用(CDC)时，增加与FcγRIIb的结合，或者减少或消除Fc区与所有Fcγ受体的结合(“敲除”变体)可能是有用的。
改变Fcγ受体的结合的氨基酸突变的实例包括但不限于：S298A/E333A/K334A和S298A/E333A/K334A/K326A(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Lu等人，2011,J ImmunolMethods,365(1-2):132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Stavenhagen等人，2007,Cancer Res,67(18):8882-90)；F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Nordstrom等人，2011,Breast Cancer Res,13(6):R123)；F243L(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Stewart等人，2011,Protein Eng Des Sel.,24(9):671-8)；S298A/E333A/K334A(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Shields等人，2001,J BiolChem,276(9):6591-604)；S239D/I332E/A330L和S239D/I332E(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Lazar等人，2006,Proc Natl Acad Sci USA,103(11):4005-10)以及S239D/S267E和S267E/L328F(增加对FcγRIIb的亲和力)(Chu等人，2008,Mol Immunol,45(15):3926-33)。
影响Fc与Fcγ受体的结合的另外的修饰在Therapeutic Antibody Engineering中有所描述(Strohl&Strohl,Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11,ISBN1907568 37 9，2012年10月，第283页)。
各种出版物描述了已经用于工程改造抗体以产生“敲除”变体的策略(参见，例如，Strohl,2009,Curr Opin Biotech 20:685-691；Strohl和Strohl,“Antibody Fcengineering for optimal antibody performance”In Therapeutic AntibodyEngineering,Cambridge:Woodhead Publishing,2012，第225-249页)。这些策略包括通过糖基化修饰、使用IgG2/IgG4支架或者在Fc的铰链或CH2结构域中引入突变来降低效应子功能(还可参见美国专利公开号2011/0212087、2012/0225058和2012/0251531，国际公开号WO2006/105338，以及Strop等人，2012,J.Mol.Biol.,420:204-219)。
用于减少FcγR和/或补体与Fc结合的已知氨基酸突变的具体且非限制性实例包括但不限于N297A、L234A/L235A、C220S/C226S/C229S/P238S、C226S/C229S/E3233P/L235V/L235A、L234F/L235E/P331S、IgG2 V234A/G237A、IgG2H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4L235A/G237A/E318A和IgG4 S228P/L236E。另外的实例包括的Fc区被工程化为包括氨基酸修饰L235A/L236A/D265S，以及国际专利申请公开号WO 2014/190441中描述的不对称氨基酸修饰。
CH3结构域突变
在某些实施方案中，本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体可以在CH3结构域中包含一个或多个另外的突变，例如，所述半胱氨酸工程化抗体构建体可以包含以下经修饰的CH3结构域：该结构域包含对异二聚体Fc形成的促进作用超过对同二聚体Fc形成的促进作用的一个或多个氨基酸突变。异二聚体Fc区可以用于例如双特异性抗体构建体中，以及那些包含单个半胱氨酸插入突变或半胱氨酸插入突变的不对称组合的半胱氨酸工程化抗体构建体中。
可对Fc的CH3结构域进行的以促进异二聚体Fc的形成的各种氨基酸突变是本领域已知的，并且包括例如国际专利申请公布号WO 96/027011(“杵入臼”)、Gunasekaran等人，2010,J Biol Chem,285,19637-46(“静电转向”)、Davis等人，2010,Prot Eng Des Sel,23(4):195-202(链交换工程化结构域(SEED)技术)和Labrijn等人，2013,Proc Natl AcadSci USA,110(13):5145-50(Fab-臂交换)中描述的那些。其他实例包括如国际专利申请公开号WO 2012/058768和WO 2013/063702中所述的不对称修饰的Fc区。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含以下经修饰的CH3结构域：其中一种Fc多肽在位置F405处包含选自F405A、F405S、F405T和F405V的氨基酸突变，并且在位置Y407处包含选自Y407I和Y407V的氨基酸突变，另一种Fc多肽在位置T366处包含选自T366I、T366L或T366M的氨基酸突变，并且包含氨基酸突变T394W。在一些实施方案中，位置T366处的氨基酸突变是T366I或T366L。
在一些实施方案中，一种Fc多肽在位置F405和Y407处包含如上所述的氨基酸突变，而且还包含氨基酸突变L351Y。
在一些实施方案中，一种Fc多肽在位置T366和T394处包含如上所述的氨基酸突变，而且还在位置K392处包含选自K392F、K392L或K392M的氨基酸突变。在一些实施方案中，位置K392处的氨基酸突变是K392L或K392M。
在一些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含如上所述经修饰的CH3结构域，其中一种Fc多肽包含位置F405和Y407处的氨基酸突变，任选地还包含位置L351处的氨基酸突变，另一种Fc多肽包含位置T366和T394处的氨基酸突变，任选地还包含位置K392处的氨基酸突变，并且这些Fc多肽中的一者或两者还包含氨基酸突变T350V。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含以下经修饰的CH3结构域：其中一种Fc多肽包含氨基酸突变F405A、F405S、F405T或F405V连同氨基酸突变Y407I或Y407V，并任选地还包含氨基酸突变L351Y，另一种Fc多肽包含氨基酸突变T366I或T366L，连同氨基酸突变T394W，并任选地还包含氨基酸突变K392L或K392M。在一些实施方案中，Fc多肽中的一个或两个还包含氨基酸突变T350V。在一些实施方案中，两个Fc多肽还包含氨基酸突变T350V。
在某些实施方案中，半胱氨酸工程化抗体构建体包含以下经修饰的CH3结构域：该结构域包含如表1中针对变体1、变体2、变体3、变体4或变体5中任一者所提出的氨基酸突变。
表1：经修饰的CH3结构域
制备半胱氨酸工程化抗体构建体
本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体可以使用标准重组方法来制备。重组生产通常涉及合成一种或多种编码半胱氨酸工程化抗体构建体的多核苷酸，将所述一种或多种多核苷酸克隆到一种或多种适当的载体中，然后将所述载体引入合适的宿主细胞中，以表达半胱氨酸工程化抗体构建体。蛋白质的重组生产在本领域是众所周知的，并且可使用如例如在Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,(1987年及更新版本),John Wiley&Sons,New York,NY；以及Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1990)中描述的标准技术来实现。
因此，本公开的某些实施方案涉及编码如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体的分离的多核苷酸或一组多核苷酸。该语境中的多核苷酸因此可以编码半胱氨酸工程化抗体构建体的全部或部分。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合形式核苷酸，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者它们的类似物。“编码”给定多肽的多核苷酸是当置于适当调控序列的控制下时在体内转录(在DNA的情况下)并且翻译(在mRNA的情况下)成多肽的多核苷酸。编码序列的边界由在5'(氨基)末端的起始密码子和在3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3’处。
为了表达半胱氨酸工程化抗体构建体，可以使用标准连接技术，将编码半胱氨酸工程化抗体构建体的一种或多种多核苷酸直接插入或者在一个或多个亚克隆步骤之后插入合适的表达载体中。合适载体的实例包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或DNA病毒。载体通常被选择为在将被采用的特定宿主细胞中具有功能性，即载体与宿主细胞机制相容，从而允许该一种或多种多核苷酸的扩增和/或表达。在这方面选择适当的载体和宿主细胞组合完全在本领域技术人员的普通技能范围内。
因此，本公开的某些实施方案涉及包含一种或多种编码如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体的多核苷酸的载体(诸如表达载体)。多核苷酸可包含在单一载体中，或者它可包含在多于一种载体中。在一些实施方案中，多核苷酸被包含在多顺反子载体中。
通常，表达载体将含有用于质粒维持以及用于克隆和表达外源性多核苷酸序列的一种或多种调控性元件。此类调控性元件的实例包括启动子、增强子序列、复制起点、转录终止序列、供体和受体剪接位点、多肽分泌的前导序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的多核苷酸的多接头区和选择性标记物。
调控性元件可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即，来自与宿主细胞的物种或品系不同的物种)、杂合的(即，来自多于一种来源的调控序列的组合)，或合成的。因此，调控序列的来源可以是任何原核或真核生物体，前提是该调控序列在所采用的宿主细胞的机制中具有功能并且可以被该机制激活。
任选地，载体可以包含“标签”编码序列，即位于编码异源肽序列的编码序列的5’或3’端处的核酸序列，诸如多聚His(例如，6xHis)、HA(血凝素流感病毒)、myc、金属亲和力、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或生物素标签。此标签通常与所表达的蛋白质保持融合，并且可充当亲和纯化或检测蛋白质的手段。任选地，随后可以通过各种手段从经纯化的蛋白质中除去标签，例如，通过使用某些肽酶进行裂解。
各种表达载体可容易地从商业来源获得。或者，当无法获得含有所有所需调控性元件的商业载体时，可使用市售载体作为起始载体来构建表达载体。当所需调控性元件中的一种或多种所需调控性元件尚未存在于载体中时，可单独地获得它们并且将它们连接至载体中。获得各种调控性元件和构建表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的。
一旦构建了包含编码半胱氨酸工程化抗体构建体的多核苷酸的表达载体，就可以将该载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或蛋白质表达。将表达载体转化至选定宿主细胞中可通过众所周知的方法来完成，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术。所选择的方法将部分地取决于待使用宿主细胞的类型。这些方法和其他合适的方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook等人，同上)。
用表达载体转化的宿主细胞当在适当的条件下培养时表达由该载体编码的蛋白质，随后可以从培养基中收集该蛋白质(如果宿主细胞分泌该蛋白质)或直接从产生该蛋白质的宿主细胞收集该蛋白质(如果蛋白质不分泌的话)。宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，酵母、真菌、植物或哺乳动物细胞)。适当宿主细胞的选择可容易地由熟练的技术人员考虑各种因素做出，所述因素如所需表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。
因此，本公开的某些实施方案涉及包含编码半胱氨酸工程化抗体构建体的多核苷酸的宿主细胞，或者包含编码半胱氨酸工程化抗体构建体的多核苷酸的一种或多种载体。在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。
例如，真核微生物如丝状真菌或酵母可用作宿主细胞，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株(参见例如，Gerngross,(2004),Nat.Biotech.,22:1409-1414和Li等人，(2006),Nat.Biotech.,24:210-215)。植物细胞也可以用作宿主细胞(参见例如，描述PLANTIBODIESTM技术的美国专利号5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978和6,417,429)。
在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。各种哺乳动物细胞系可用作宿主细胞。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于：由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系、人胚胎肾系293(如例如Graham等人，1977,J.Gen Virol.,36:59中所述的HEK293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(如例如Mather,1980,Biol.Reprod.,23:243-251中所述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞(MDCK)、大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)、TRI细胞(如例如Mather等人，1982,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68中所述)、MRC 5细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括DHFR-CHO细胞，如Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216中所述)，以及骨髓瘤细胞系(诸如Y0、NS0和Sp2/0)。还参见，Yazaki和Wu,2003,Methods in Molecular Biology,第248卷,第255-268页(B.K.C.Lo,编辑,Humana Press,Totowa,N.J.)。
本公开的某些实施方案涉及制备如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体的方法，包括用编码半胱氨酸工程化抗体构建体的一种或多种多核苷酸转染宿主细胞，例如作为包含所述多核苷酸的一种或多种载体，然后在适于表达编码的半胱氨酸工程化抗体构建体的条件下培养该宿主细胞。
通常，半胱氨酸工程化抗体构建体在表达后从宿主细胞中分离，接着可以任选地进行纯化。用于分离和纯化所表达的蛋白质的方法是本领域中众所周知的。标准纯化方法包括，例如色谱技术，如离子交换、疏水相互作用、亲和、尺寸排阻、凝胶过滤或反相色谱，这些技术可使用诸如FPLC、MPLC和HPLC的系统在常压下或在中等或高压下进行。其他纯化方法包括电泳、免疫学、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩结合也可以是有用的。
本领域中已知多种天然蛋白质结合抗体的Fc区或其他区域，并且这些蛋白质因此可用于纯化含Fc的蛋白质。例如，细菌蛋白质A和G结合至Fc区。同样，细菌蛋白质L结合至一些抗体的Fab区。纯化通常可通过如上所述的特定融合配偶体或亲和标签来实现。例如，如果采用GST融合物，可使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His标签，则可以使用Ni+2亲和色谱纯化抗体，或者如果使用Flag标签，则可以使用固定化抗Flag抗体纯化抗体。有用的纯化技术的实例在Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1990)和Protein Purification:Principlesand Practice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY(1994)中有描述。
偶联物
本公开的某些实施方案涉及包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和经由插入的半胱氨酸残基与该抗体构建体偶联的活性剂的偶联物。活性剂可以是例如治疗剂、诊断剂或标记剂。
所选择的活性剂与半胱氨酸工程化抗体构建体的偶联可以通过本领域已知的多种方式实现，可以是直接偶联或经由接头偶联。用于偶联活性剂的接头是能够将一种或多种活性剂连接到抗体构建体的双功能或多功能部分。双功能(或单价)接头将单一活性剂连接到抗体构建体上的单一位点，而多功能(或多价)接头将多于一种活性剂连接到抗体构建体上的单一位点。能够将一种活性剂连接到抗体构建体上的多于一个位点的接头也可以被认为是多功能的。
当采用接头将活性剂与半胱氨酸工程化抗体构建体偶联时，接头包含硫醇反应性官能团，从而使其能够与抗体构建体中插入的半胱氨酸残基反应。硫醇反应性官能团的实例包括但不限于马来酰亚胺、α-卤代乙酰基、活化酯，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异硫氰酸酯和异氰酸酯。
接头还包括能够与活性剂上的目标基团反应的官能团。合适的官能团是本领域已知的并且包括例如Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)中描述的那些官能团。活性剂上可以用作与接头附接的目标基团的基团包括但不限于硫醇基、羟基、羧基、胺基、醛基和酮基。
用于与硫醇反应的官能团的非限制性实例如上所述。用于与胺反应的官能团的非限制性实例包括活化酯(诸如N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯和磺基-NHS酯)、亚胺酯(诸如Traut试剂)、异硫氰酸酯、醛和酸酐(诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA))。其他实例包括琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)和苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。
能够与活性剂上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)反应的官能团的非限制性实例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头通常易于在细胞内条件下裂解，例如通过溶酶体过程裂解。实例包括蛋白酶敏感、酸敏感或还原敏感的接头。相比之下，不可裂解接头依赖于细胞中抗体的降解，这通常导致氨基酸-接头-活性剂部分的释放。
合适的可裂解接头包括例如能够被细胞内蛋白酶(诸如溶酶体蛋白酶或核内体蛋白酶)裂解的含肽接头。例如，接头可以包括二肽，诸如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)。包含在接头中的合适二肽的其他实例包括Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、PhenylGly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys和Met-(D)Lys。接头还可以包括更长的肽序列，诸如三肽Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys或(D)Ala-Phe-Lys，或者四肽Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly或Ala-Leu-Ala-Leu。
可裂解接头的另外的实例包括含二硫化物的接头。含二硫化物的接头的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPBD)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPBD)。含二硫键的接头可任选地包括另外的基团，以在二硫键附近提供空间位阻，以便改善接头的细胞外稳定性，例如，包含偕二甲基。其他合适的接头包括在特定pH下或在某一pH范围内可水解的接头，诸如腙接头。
可裂解接头的另一个实例是包含β-葡糖苷酸的接头，其能够被β-葡糖苷酸酶裂解，β-葡糖苷酸酶是一种存在于溶酶体和肿瘤间质中的酶(参见例如De Graaf等人，2002,Curr.Pharm.Des.8:1391–1403)。
可裂解接头可以任选地还包含一个或多个另外的官能团，诸如自消融和自消除基团、延伸段或亲水部分。
发现在接头中有用的自消融和自消除基团包括例如对氨基苄氧羰基(PAB或PABC)和对氨基苄醚(PABE)基团，以及甲基化乙二胺(MED)。自分解基团的其他实例包括但不限于：在电子特性上类似于PABC或PABE基团的芳族化合物，诸如杂环衍生物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物，如美国专利号7,375,078中所述。其他实例包括在酰胺键水解时发生环化的基团，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人，1995,ChemistryBiology 2:223-227)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人，1990,J.Org.Chem.55:5867-5877)。单独或组合的自消融/自消除基团通常包含在基于肽的接头中，也可以包含在其他类型的接头中。
可用于ADC的接头中的延伸段包括例如亚烷基和基于脂族酸、二酸、胺或二胺的延伸段，诸如二甘醇酸酯、丙二酸酯、己酸酯和己酰胺。其他延伸段包括例如基于甘氨酸的延伸段，以及基于聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的延伸段。
用于将活性剂连接至抗体的各种不可裂解接头也是本领域已知的。实例包括但不限于基于下列项的接头：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(“长链”SMCC或LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺十一酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
可以与给定的半胱氨酸工程化抗体构建体偶联的活性剂分子的数量(药物抗体比率或DAR)将取决于该抗体构建体所包含的半胱氨酸插入突变的数量和所采用接头的类型(单价或多价)。
本公开的某些实施方案涉及具有式(I)的偶联物：
A-(L-(D)q)p(I)
其中：
A是如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体；
L是接头(例如，如上述任一个实施方案中所述的接头)；
D是活性剂；
q是介于1与4之间的整数，并且
p是介于1与8之间的整数，
其中D经由L与半胱氨酸工程化抗体构建体中插入的半胱氨酸残基连接。
在式(I)的一些实施方案中，q是1、2或3。在式(I)的一些实施方案中，q是1或2。在式(I)的一些实施方案中，p是介于1与6之间的整数。在式(I)的一些实施方案中，p是1、2、3或4。在式(I)的一些实施方案中，p是6。
在式(I)的一些实施方案中，q是1、2或3，p是1、2、3或4。在式(I)的一些实施方案中，q是1或2，p是介于1与8之间的整数。在式(I)的一些实施方案中，q是1或2，p是1、2、3或4。在式(I)的一些实施方案中，q是1或2，p是6。
在某些实施方案中，偶联物具有式(II)：
A-(L-D)p(II)
其中：
A是如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体；
L是接头(例如，如上述任一个实施方案中所述的接头)；
D是活性剂，并且
p是介于1与8之间的整数，
其中D经由L与半胱氨酸工程化抗体构建体中插入的半胱氨酸残基连接。
在式(II)的一些实施方案中，p是介于1与6之间的整数。在式(II)的一些实施方案中，p是1、2、3或4。在式(II)的一些实施方案中，p是1、2或3。在式(II)的一些实施方案中，p是2。在式(II)的一些实施方案中，p是1或3。在式(II)的一些实施方案中，p是4或6。
将各种试剂偶联至蛋白质(包括抗体)上的游离巯基的方法在本领域中是已知的(参见例如Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)，示例性方法也在本文的“实施例”部分中加以描述。
本公开的某些实施方案涉及制备包含本公开的半胱氨酸工程化抗体构建体的偶联物的方法。在一些实施方案中，该方法包括将包含至少一个如本文所述的插入的半胱氨酸残基的半胱氨酸工程化抗体构建体置于还原条件下，使得插入的半胱氨酸残基的巯基被还原，然后使硫醇反应性接头-活性剂与抗体构建体在允许接头与还原的硫醇之间形成键的条件下反应。
本公开的某些实施方案涉及制备具有预先确定的药物抗体比率(DAR)的抗体-药物偶联物的方法，该方法包括使包含一个或多个如本文所述的半胱氨酸插入突变的半胱氨酸工程化抗体构建体与药物-接头反应，以提供抗体-药物偶联物，其中预先确定的DAR是1、2、3、4、5、6、7或8，并且半胱氨酸工程化抗体构建体包含与预先确定的DAR相同数目的半胱氨酸插入突变。在该方法的某些实施方案中，预先确定的DAR是2。在一些实施方案中，预先确定的DAR是1或3。在一些实施方案中，预先确定的DAR是4或6。
在一些实施方案中，预先确定的DAR是1或3，并且半胱氨酸工程化抗体构建体所包含的半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(d)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，预先确定的DAR是1或3，并且半胱氨酸工程化抗体构建体所包含的半胱氨酸插入突变选自：
(i)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(ii)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(iii)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(iv)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(v)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
活性剂
可以与半胱氨酸工程化抗体构建体偶联的活性剂包括治疗剂、诊断剂和标记剂。
治疗剂的实例包括但不限于抗代谢药、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、毒素、细胞凋亡剂、血栓形成剂、抗血管生成剂、生物反应调节剂、生长因子、放射性材料和用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂。诊断剂的实例包括但不限于各种显像剂，诸如荧光材料、发光材料和放射性材料。标记剂的实例包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。
本公开的某些实施方案涉及包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和治疗剂的偶联物。一些实施方案涉及包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和抗癌剂的偶联物。示例性抗癌剂包括但不限于美登木素生物碱、澳瑞他汀(auristatin)、哈米特林(hemiasterlin)、微管溶素、多拉司他汀、单端孢霉烯、倍癌霉素、喜树碱、卡奇霉素和其他烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类抗生素、假单胞菌外毒素(PE)、吡咯并苯并二氮杂(PBD)，以及它们的类似物和衍生物。
药物组合物
本公开的某些实施方案涉及用于治疗或诊断用途的药物组合物，其包含如本文所述的偶联物和药学上可接受的载剂或稀释剂。所述组合物可使用众所周知的和容易获得的成分通过已知程序制备，并且可被配制用于通过例如经口(包括例如经颊或舌下)、局部、胃肠外、直肠或阴道途径、或通过吸入或喷雾施用于受试者。如本文所用的术语“胃肠外”包括通过皮下、皮内、关节内、静脉内、肌内、血管内、胸骨内或鞘内途径注射或输注。
组合物通常将配制成适于通过选择的途径施用于受试者的形式，例如呈糖浆剂、酏剂、片剂、糖锭剂、锭剂、硬胶囊或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性混悬剂、可分散性粉剂或颗粒剂、乳液、注射剂或溶液剂的形式。组合物可作为单位剂量制剂提供。
药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒。此类载体的实例包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物，如Zn-蛋白质络合物；和非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，所述组合物可以呈无菌注射水性或油性溶液剂或混悬剂的形式。此类混悬剂可以使用本领域已知的合适的分散剂或润湿剂和/或悬浮剂来配制。无菌注射溶液剂或混悬剂可以包含在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的偶联物。可采用的可接受的稀释剂和溶剂包括例如1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液。另外，可采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸在可注射制剂中获得使用。如本领域中已知的佐剂，如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂也可包含在可注射溶液或悬浮液中。
其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(原名“RemingtonsPharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA (2000)中进行了描述。
使用方法
包含与活性剂偶联的本公开的半胱氨酸工程化抗体构建体的偶联物可以用于治疗方法、诊断方法和筛选方法中。该方法的确切性质将取决于偶联物的性质，包括与半胱氨酸工程化抗体构建体偶联的活性剂的类型。
例如，本公开的某些实施方案涉及通过向患有疾病或病症的受试者施用偶联物来治疗疾病或病症的方法，该偶联物包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和与之偶联的治疗剂。在其中治疗剂是抗癌剂的一些实施方案中，偶联物可以用于治疗癌症的方法中。
本公开的某些实施方案涉及诊断疾病或病症的方法，包括向怀疑患有或已知患有疾病或病症的受试者施用偶联物，该偶联物包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和与之偶联的诊断剂。一些实施方案涉及诊断疾病或病症的方法，包括使取自怀疑患有或已知患有疾病或病症的受试者的生物样品与偶联物接触，该偶联物包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和与之偶联的诊断剂。
本公开的某些实施方案涉及筛选生物样品(诸如取自受试者的样品)是否存在目标部分的方法，包括使该样品与包含如本文所述的半胱氨酸工程化抗体构建体和与之偶联的标记剂的偶联物接触，其中半胱氨酸工程化抗体构建体与目标部分特异性地结合。
提供以下实施例是为了说明的目的，而非旨在以任何方式限制要求权利的发明内容的范围。
实施例
一般程序
1.半胱氨酸工程化变体的克隆、表达和纯化
使用靶向c-Met或FRα并且具有异二聚体Fc区(HetFc)的IgG1抗体来构建以下实施例中所述的半胱氨酸工程化构建体和对照。HetFc在CH3结构域中包括以下突变：
链A(HC-A)：T350V_L351Y_F405A_Y407V
链B(HC-B)：T350V_T366L_K392L_T394W
如下克隆和表达半胱氨酸工程化构建体和对照。使用针对人类/哺乳动物表达优化的密码子，经由基因合成来构建编码抗体重链和轻链的基因。信号肽MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG[SEQ ID NO:1]包含在每个多肽序列的N-末端处。在一些情况下，轻链包含直接融合至C-末端残基的肽ESSCDVKLV[SEQ ID NO:2]。
将最终基因产物亚克隆到哺乳动物表达载体PTT5(NRC-BRI，Canada)中，然后在CHO细胞中表达(Durocher等人，2002,Nucl Acids Res.,30(2):E9)。简言之，使CHO-3E7细胞在补充有0.1％w/v Pluronic和4mM谷氨酰胺的FreeStyleTM F17培养基(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)中悬浮生长至细胞密度为150万至200万细胞/ml，且存活率≥97％。如Durocher及其同事所述(Delafosse等人，2016,J Biotechnol,227:103-111；Raymond等人，2015,MAbs,7(3):571-83)，使用以下物质的混合物来进行转染：质粒DNA：5％pTTo-GFP质粒(绿色荧光蛋白用于确定转染效率)、15％pTT22-AKT质粒、21％的抗体构建体DNA(HC-A、HC-B、LC之比为1:1:3)、68.37％鲑鱼精DNA。转染后，将装有细胞的摇瓶放置在37℃下具有5％ CO2的加湿孵育器中设定为120rpm的轨道式摇床上。转染后24小时，向培养物中添加1％w/v胰蛋白胨N1(TN1)和0.5mM丙戊酸。然后，将培养物转移到放置在32℃下具有5％CO2的加湿孵育器中的轨道式摇床(120rpm)上。在24至48小时，如通过流式细胞术测定的，GFP阳性细胞应当介于30％至60％之间。转染后7至10天收获细胞，以4,000rpm旋转，然后使用0.45μm过滤器(Millipore Sigma,Burlington,MA)过滤灭菌(澄清)，以-80℃冷冻。
将解冻的澄清培养基上样到MabSelectTM SuReTM Protein-A柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上，用10倍柱体积的PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤。将抗体用10柱体积的pH 3.6的柠檬酸盐缓冲液洗脱，将含有抗体的合并级分用pH 11的TRIS中和。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化含有抗体的Protein-A洗脱液。对于SEC，使用AKTATM纯化系统(GE Healthcare,Chicago,IL；Express、FPLC或Purifier系统)以1mL/min的流速将样品上样到Sephadex 20016/60 200制备级柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上。以1mL/min的流速使用pH为7.4的PBS缓冲液。基于SDS-PAGE或毛细管电泳分析(LabChip/>PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA)汇集对应于经纯化抗体的级分，在必要时浓缩至5mg/mL至10mg/mL。此外，如果下游分析需要低内毒素，则在蛋白质纯化之前，按照标准方案使用NaOH溶液对系统、色谱柱和树脂(适用时)进行去热原处理。
2.药物偶联
半胱氨酸工程化变体和对照以带有L-半胱氨酸帽、谷胱甘肽帽或这两者的组合的半胱氨酸加帽形式表达。为了降低样品不均匀性并提高偶联效率，所有抗体在与马来酰亚胺活化的药物-接头偶联之前都经过还原-氧化步骤。下面提供了代表性程序。
将3mg 5mg/mL变体v28983溶液(参见表2.2；MW 146301Da)在PBS(pH 7.4)中，基于以下计算(表A)在1mM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)存在下，在37℃(水浴)中用25当量摩尔过量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原3小时。
表A：半胱氨酸插入变体v28983的样品减少
/>
还原完成后，使用以PBS(pH 7.4)平衡的5mL 40kD ZebaTM旋转脱盐柱(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)去除多余的TCEP。在4℃下，用25摩尔过量的脱氢抗坏血酸(DHAA)对经还原的抗体进行过夜氧化(18小时)(假设ZebaTM柱纯化回收率为100％)，以重新形成链间二硫键，同时保持插入的半胱氨酸处于还原(游离硫醇)形式。DHAA的添加量基于以下计算(表B)求得：
表B：半胱氨酸插入变体v28983的样品氧化
抗体 v28983
目标SH/mAb 2
mAb分子量(Da) 146301
mAb浓度，mg/mL 5.00
mAb浓度，M 3.42E-05
amt mAb，mg 3
DHAA当量 25
15mM DHAA，μl 51.3
DHAA mM 10.0
将经氧化抗体分成三等份，每份1mg，用于与以下三种不同的药物接头偶联：MTvc化合物1、MCvcPABC-MMAE和MCvcPAB-微管溶素M。这三种药物-接头的结构在图1中示出。通过在室温下与5摩尔过量的药物-接头一起孵育来实现偶联。将药物-接头制备为10或20mMDMSO储备液，基于以下计算(表C)添加到反应中：
表C：半胱氨酸插入变体v28983与三种不同药物-接头的偶联
/>
3.差示扫描量热法(DSC)
如下使用DSC来测量半胱氨酸工程化抗体的热稳定性。使用MicroCal VP-Capillary DSCTM(GE Healthcare,Chicago,IL)对400μL浓度为0.2mg/ml或0.4mg/mL的经纯化样品的PBS溶液进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，并且在每次样品注射前布置缓冲液注射以进行参考。每个样品均以60℃/h的速率在20℃至100℃范围内进行扫描，采用低反馈、8秒过滤器、5分钟preTstat和70psi氮气压力。使用Origin 7软件(OriginLab Corporation,Northampton,MA)参考并分析所得热谱图。
4.疏水相互作用色谱法(HIC)
对于HIC运行，取TSKgel Butyl-NPR(2.5μm，4.6mm x 35mm)色谱柱(TOSOHBioscience GmbH,Griesheim,Germany)在室温下用5倍柱体积的缓冲液A(1.5M(NH4)2SO4，25mM PO4 3-，pH 6.95)平衡。通常，用95％缓冲液A和5％缓冲液B(75％25mM PO4 3-(pH 6.95)，加上25％异丙醇)将浓度为2至3mg/mL的20至30ug样品上样到色谱柱上，使用以下梯度(表D)以0.5mL/min运行15分钟：
表D：HIC梯度
/>
对于每个样品，使用适当参数对HIC色谱图进行积分，提供每个峰的完整的基线到基线积分，之后对每个峰的积分显示出合理的分离度。鉴定了样品内对应于不同DAR物质的峰。DAR 0峰表现出与裸(还原-氧化)抗体一致的保留时间。对于包含单个半胱氨酸插入变体的ADC，每个后续峰代表DAR 1和DAR 2。
通过HIC测定的DAR是基于个体DAR物质的AUC计算的(0、1和2)：
计算的DAR＝(％AUCx0+％AUCx1+％AUCx2)/100
各个ADC的HIC保留时间(HIC-RRT)如下计算：
HIC-RRT＝目标DAR的RT/DAR0的RT
为了使对抗体进行半胱氨酸加帽对HIC-RRT的影响最小化，DAR0的RT是指未与有效载荷偶联的还原-氧化抗体的保留时间。每个变体都有其自身的DAR0 RT来计算HIC-RRT。
5.分析性尺寸排阻色谱法(SEC)
对于分析性SEC运行，取Agilent Advance Bio SEC色谱柱(2.7μm，7.8mm x150mm)(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA；序列号6377910-24)在室温下用5倍柱体积的缓冲液A(150mM NaxPO4，pH 6.95)平衡。通常，将20至30ug浓度为2至3mg/mL的样品上样到色谱柱上，以1mL/min等度运行7分钟，报告280nm处的吸光度。对于每个样品，对色谱图进行积分以提供每个峰的完整的基线到基线积分，在部分解析峰之间合理设置分离度。基于对照IgG1抗体曲妥珠单抗的SEC分布图，将对应于IgG主要成分的峰(保留时间为约3.3min)报告为单体。将3.3min之前出现的任何峰指定为HMWS，将3.3min之后出现的任何峰指定为LMWS，排除溶剂峰(超过5.2min)。
6.液相色谱-质谱法(LC-MS)
对于通过LC-MS测定的DAR，取ADC在PBS(pH 7.4)中稀释至1mg/mL，然后去糖基化。对于去糖基化，通常每10ug ADC采用1ug EndoS，将反应混合物在室温下孵育1小时。通过向每个10uL样品中添加3uL 500mM TCEP，随后在70℃下孵育1小时，来减少样品。最后，取样品在LC-MS四极杆飞行时间(QTOF)系统(Agilent 1290HPLC与Agilent 6545QTOF连接；Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)上运行，每次进样1uL。详细过程如下所述。
·色谱柱：PLRP-S8uM，50x2.1mm(Agilent Technologies,Inc.,SantaClara,CA)
·流动相C：0.1％甲酸、0.025％三氟乙酸和10％异丙醇的H2O溶液
·流动相D：0.1％甲酸和10％异丙醇的乙腈溶液
·检测：信号A(280nm，4.0带宽)，信号B(220nm，4.0带宽)
·梯度：
·后运行时间：2分钟
7.毛细管电泳-SDS(CE-SDS)
最初，将所有样品稀释至1mg/mL，之后按照制造商的方案(Protein ExpressAssay LabChipTM；PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA)在96孔PCR板中制备样品。简言之，在存在或不存在作为还原剂的400mM二硫苏糖醇(DTT)的情况下，将2uL ADC与7uL ProteinExpress缓冲液混合，随后在95℃下热变性5分钟。然后在数据采集之前，将样品以1:2的比例稀释在dH2O中。每次CE-SDS运行后，使用LabChipTM Reviewer(PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA)分析凝胶和相应的电泳图谱。
实施例1：通过计算机模拟工程化来鉴定潜在的半胱氨酸插入位点
根据以下指导标准，在模型Fab(来源于PDB ID 1JPT，D3H44)和模型Fc分子(来源于PDB ID 1E4K)的显式溶剂分子动力学(MD)轨迹上鉴定IgG1中推定的半胱氨酸插入位点：
·排除CDR
·避免二级结构
·相对溶剂可及表面积(SASA)：rSASA>30％
·避免对蛋白A和FcRn的结合造成干扰
然后根据rSASA和均方根波动(RMSF)来标记位置，如下所示：
·类型1：rSASA理想(30％至60％)，移动性强(RMSF高于平均值+1个标准偏差(SD)阈值)
·类型2：rSASA理想(30％至60％)，但有序(RMSF低于平均值+1个SD阈值)
·类型3：暴露(rSASA>60％)，移动性强(RMSF高于平均值+1个SD阈值)
·类型4：暴露(rSASA>60％)，但有序(RMSF低于平均值+1个SD阈值)
第1阶段中的半胱氨酸插入位点(“设计”)是基于结构导向的半理性方法提出的。推定的插入位点基于其风险(干扰其他已知的配体和二硫化物扰动)、环境(如上所述的类型1至4标签)以及假定的结构影响和偶联稳定性的可能性进行排序。第1阶段共提出了13个设计，对IgG1的不同结构区域进行了采样。
第2阶段涉及对每个个体推定半胱氨酸插入进行建模实验，并基于根据建模插入的隐式溶剂分子动力学(MD)轨迹计算的参数来选择变体。简言之，去除每个感兴趣的环(n个残基)，基于最小均方根偏差(RMSD)与锚定边界残基将来自RCSB PDB(结构生物信息学研究合作机构–蛋白质数据库)中的储存结构的n+1个环接枝到其位置。然后对每个环进行突变，以匹配原始序列，并在每个相关位置处插入半胱氨酸残基。对于每个接枝环模型，计算隐式溶剂MD轨迹，并根据下表1.1中描述的参数和标准对设计进行排序。
对于环接枝算法未能提供解决方案的少数情况，使用针对第1阶段设计描述的方法从这些环中选择设计。该过程总共生成了32个变体，第1阶段生成了13个，第2阶段生成了19个。
表1.1：对设计进行排序的参数和标准
实施例2：初始变体的体外表征
如一般程序1中所述，克隆和表达来自实施例1的32个变体以及表2.1中所示的对照。该初始表征中还包括两个另外的构建体v27321和v27322。这两个变体分别在位置K149之前和之后包括半胱氨酸插入。先前已经描述了在位置K149处的半胱氨酸取代(Vollmar等人，2017,Bioconjug Chem,28(10):2538-2548)。
在所有实施例中，半胱氨酸插入突变均使用以下命名法。Fab区(VH、VL、CH1和CL)的位置编号为Kabat，Fc区(CH2和CH3)的位置编号为EU。所有半胱氨酸插入均基于参照未经修饰的重链(H)或轻链(L)该插入前面的残基后接“.5”进行编号。例如，L_K149.5C表示半胱氨酸在轻链中的残基Lys 149之后插入。
表2.1：用于初始体外表征的对照和另外的变体
1 H＝重链；L＝轻链
2 Junutula等人，2008,Nature Biotechnology,26:925-932
3 Sussman等人，2018,Protein Engineering,Design and Selection,31(2):47-54
4 Vollmar等人，2017,Bioconjug Chem,28(10):2538-2548
然后如一般程序2中所述将每种抗体与MTvc化合物1或MCvcPABC-MMAE偶联。对每种抗体和ADC的初步体外表征如一般程序3至6中所述进行。基于以下标准对这些变体进行排序：
·DSC：相对于亲本抗体的Tm差异定义为
ο无变化(0℃≦Tm差异≦3℃)
ο小(3℃<Tm差异≦8℃)
ο高(Tm差异>8℃)高
·CHO细胞中单次转染500mL所得到的抗体产量
·通过LC-MS测定的DAR(MS)药物抗体比率
·通过HIC测定的DAR(HIC)药物抗体比率
·通过将DAR 2物质的HIC保留时间除以DAR 0物质的HIC保留时间计算的相对保留时间(RRT D2/D0)
选择表现出最有利特征的10个变体用于进一步表征。从这10个变体和5个对照的初步表征中确定的特性在表2.2中示出。
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与MCvcPABC-MMAE或MTvc化合物1偶联的一种变体(v29001(H_T299.5C))和对照变体(v29013(H_S239.5C))的HIC分布图的实例分别在图13和图14中示出。图15示出了相同的两种变体(未偶联)的DSC分布图。
可以看出对照变体v29013(H_S239.5C)的HIC分布图是由多个峰组成的，表明存在多种物质(图13A和图14A)，而变体v29001(H_T299.5C)的HIC分布图显示单个单体峰(图13B和图14B)。图14还显示，用变体v29001生成的MTvc化合物1偶联物表现得相比用对照变体v29013生成的MTvc化合物1偶联物具有较低的疏水性(HIC-RRT较低)。图15中的DSC分布图显示，观察到对照变体v29013(CH2结构域的Tm为62℃)相比变体v29001(CH2结构域的Tm为65℃)存在更明显的去稳定化。这两种变体的CH3结构域的Tm非常相似，证实了半胱氨酸插入对该结构域的稳定性没有影响。
实施例3：制备包含半胱氨酸插入变体的抗体-药物偶联物
根据一般程序2，将表2.2中所示的10种变体中的每一种变体连同两种对照v22758(H_A114C)和v29013(H_S239.5C)与三种不同的药物-接头(MTvc化合物1、MCvcPABC-MMAE和MCvcPAB-微管溶素M；参见图1)偶联。
所得的36种ADC通过如实施例4至8中所述的疏水相互作用色谱法(HIC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、液相色谱-质谱法(LC－MS)、毛细管电泳SDA(CE-SDS)和细胞上结合测定法来表征。
实施例4：体外表征-疏水相互作用色谱法
如一般程序4中所述，通过疏水相互作用色谱法(HIC)表征来自实施例3的ADC。HIC允许基于蛋白质固有的疏水性来分离不同的蛋白质，而且因为HIC是一种非变性方法，所以允许分离给定ADC所包含的不同DAR物质。HIC也是一种基于相对保留时间(RRT)对ADC进行排序的有用技术。由于疏水性ADC在体内可以更快地从循环中清除，所以HIC-RRT值是用于鉴定最有用的半胱氨酸插入位点的潜在有价值的生物物理参数。
采用HIC来确定与MTvc化合物1、MCvcPABC-MMAE和MCvcPAB-微管溶素M偶联的所有ADC的DAR，以及与MTvc化合物1和MCvcPABC-MMAE偶联的所有ADC的HIC-RRT。结果在表4.1和4.2中示出。
表4.1：通过HIC测定的DAR值
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1变体包括与轻链的C-末端残基融合的肽ESSCDVKLV[SEQ ID NO:2]
表4.2：HIC-RRT值
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1变体包括与轻链的C-末端残基融合的肽ESSCDVKLV[SEQ ID NO:2]
2ND＝由于DAR物质分离不良而未确定
总体而言，所有ADC均显示出介于1.4与2.0之间的DAR范围。一种变体v29001在与三种药物-接头中的每一者偶联时在HIC上显示单峰，在每种情况下DAR 2.0均完全负载。变体v22768显示最低的药物负载，每种药物-接头仅1.4至1.5。由于硫醇pKa、SASA和插入的半胱氨酸的局部环境的影响，预期偶联效率是位点依赖性的，这反映在DAR值中(表4.1)。
药物-接头MTvc化合物1是相对亲水的。这种药物-接头与任何位点特异性半胱氨酸插入变体的偶联对HIC保留时间的影响极小。对于与MTvc化合物1偶联的大多数变体，HIC-RRT值低于1.15，这也是与相同药物-接头偶联的对照v22758 ADC所观察到的HIC-RRT值。与MTvc化合物1偶联的两种变体v22768和v28993显示出比与相同药物-接头偶联的对照v22758略高的HIC-RRT值：分别为1.18和1.19。与MTvc化合物1偶联的变体v29001表现得相比与相同药物-接头偶联的两种对照(v22758和v29013)具有较低的疏水性。
药物-接头MCvcPABC-MMAE相比MTvc化合物1具有较高的疏水性，因此所有包含MCvcPABC-MMAE的ADC的HIC-RRT值均高于相应的MTvc化合物1偶联物。总体而言，针对MCvcPABC-MMAE偶联物观察到的趋势与针对MCvc化合物1偶联物观察到的趋势相似：与MCvcPABC-MMAE偶联的v28993显示出最高的HIC-RRT值，而与MCvcPABC-MMAE偶联的v29001显示出最低的HIC-RRT值(1.05)。对于一种变体，即与MCvcPABC-MMAE偶联的v27321，以及与相同的药物-接头偶联的对照v29013，由于这两种ADC中每一者的HIC分布图的分辨率均较差，因此无法确定HIC-RRT值。
实施例5：体外表征-尺寸排阻色谱法
通过尺寸排除色谱法(SEC)进一步表征来自实施例3的ADC。SEC是用于估计蛋白质大小和确定蛋白质制备物中是否存在聚集/高分子量物质(HMWS)和片段化/低分子量物质(LMWS)的有用技术。
在ADC制备期间，通过插入的半胱氨酸残基形成二硫键所导致的任何不适当的氧化都可能导致形成多联体和其他HMWS。为了研究不同物质的分子大小和相对丰度，如一般程序5中所述通过SEC来分析这些ADC中的每一者。
结果示于表5.1中。
从表5.1中可以看出，通过HPLC-SEC确定，所有ADC制备物均含有>90％的单体。一般来讲，包含药物-接头MTvc化合物1的ADC显示出最高的单体含量，变体v22768除外，该变体在这些MTvc化合物1偶联物中显示出最高的HMWS含量(6％)和最低的单体含量(94％)。与MTvc化合物1偶联的对照ADC v22758(A114C)显示出95％的单体含量。
包含MCvcPABC-MMAE药物-接头的ADC显示出与包含MTvc化合物1的那些ADC相似的趋势，单体在介于97％与99％之间的范围内，具有少量的HMWS和LMWS。
相比之下，包含MCvcPAB-微管溶素M药物-接头的ADC显示出比包含另外两种药物-接头中任一者的ADC更低的单体含量。ADC v29001-MCvcPAB-微管溶素M在所有测试的ADC中显示出最低的单体含量(92％)和最高的LMWS含量(7％)。
实施例6：体外表征-液相色谱-质谱法(LC-MS)
如一般程序6中所述，通过液相色谱-质谱法(LC-MS)进一步表征来自实施例3的ADC。
LC-MS是用于测量ADC的药物抗体比率(DAR)和药物载量分布的标准分析方法。在完整ADC水平上基于LC-MS测量DAR的一般程序涉及将质谱解卷积为一系列“零电荷”质量，然后通过对谱峰面积或峰强度进行积分和加权来获得DAR分布或计算平均DAR。
为了分析来自实施例3的ADC，在LC-MS分析之前，通过用EndoS处理将ADC去糖基化，其中EndoS处理除了将末端的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和岩藻糖(Fuc)还原之外，还去除了所有附接的碳水化合物部分。其中一些ADC还用IdeS处理，IdeS是一种蛋白酶，其在重链上的位置236G-G237处的铰链半胱氨酸之后直接切割。经IdeS处理的样品还原产生三种不同的物质：Fc/2、Fd和LC。通过MS对经IdeS处理的样品进行DAR测定，进一步提高了DAR测量精度，并提供了ADC的补充结构信息。
如通过LC-MS测定的这些ADC中每一者的平均DAR在表6.1中示出。
表6.1：通过LC-MS测定的DAR值
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1变体包括与轻链的C-末端残基融合的肽ESSCDVKLV[SEQ ID NO:2]
如表6.1所示，如通过LC-MS测定的ADC的DAR在介于1.7与2.0之间的范围内，表明所有三种药物-接头具有相似的偶联效率。没有观察到铰链或链间二硫化物半胱氨酸残基的可检测的偶联。
总体而言，通过LC-MS测定的DAR与通过HIC获得的DAR密切相关(参见表4.1)。例如，变体v29001在与这三种药物-接头中的每一者偶联时，通过LC-MS和HIC测量均显示DAR2。对于与MCvcPABC-MMAE偶联的变体v27321和v29013，由于相关峰分离不良，通过HIC未能成功计算DAR。然而，通过LC-MS成功地测定了这两种ADC的DAR(DAR分别为1.8和2.0)。
实施例7：体外表征-毛细管电泳-SDS(CE-SDS)
如一般程序7中所述，在还原条件和非还原条件下，通过毛细管电泳-SDS(CE-SDS)评估来自实施例3的每种ADC，以便评价样品的纯度。
在还原条件下，ADC抗体中的链间二硫键被还原，产生相应的重链(HC)和轻链(LC)，这些重链和轻链可以通过它们的分子量差异来分离。相比之下，在非还原条件下，抗体保持完整，可以与任何部分抗体或抗体片段以及任何多联体分离。完整的全长IgG1(2H-2L)具有大约150kDa的最高分子量，之后是分子量分别为大约125、100、75、50和25kDa的2H-L、HH、HL、H、L片段。在ADC制备期间，抗体的不完全或部分氧化将导致样品中存在这些LMWS中的一部分或全部，而过度氧化将产生半胱氨酸-半胱氨酸连结而成的寡聚HMWS。
结果在图2中示出。请注意，完整的非还原ADC(包括未偶联对照(v17427))显示出约160kDa的MW(如图2(A)所示)，而不是计算出的150kDa。这种差异可能是由于LabChipTM方案中使用的结合染料对肽键的影响或测量仪器固有的精度限制(±20％尺寸精度，基于制造商的方案)造成的。类似地，所有还原样品(包括未偶联对照(v17427))显示LC的MW为约28kDa，HC的MW为约64kDa，均分别略高于约23kDa和50kDa的计算值(参见图2(B))。
将图2所示的所有36种ADC与未偶联对照(v17427)进行比较，结果表明，偶联方案中的还原-氧化步骤是成功的，并且每种抗体在偶联至药物-接头之前均重新折叠成原始全长构象。
实施例8：通过流式细胞术进行的细胞上抗原结合测定
如下所述通过流式细胞术评估来自实施例3的ADC对其目标c-Met(裸抗体和偶联物这两种形式)的表观结合亲和力，并且与对照未偶联亲本抗体(v17427)的结合亲和力进行比较。
将来自高c-Met表达细胞系EBC-1(400万个受体/细胞)(XenoTech,LLC,Lenexa,KS)的细胞以25,000个细胞/孔接种，最小接种体积为100uL。简言之，使用细胞解离缓冲液将贴壁的EBC-1细胞从其培养容器中分离出来，以25,000个细胞/孔接种于96孔板中。将细胞在冰上保存10分钟，以400g×3分钟离心，使细胞沉淀下来，然后轻弹倒置的接种板，移除上清液。将细胞沉淀物保存在冰上。在冷FACS缓冲液中滴定供试品，用50uL/孔的指定处理液处理细胞；用封板膜将测定板封好，在4℃下孵育过夜。然后洗涤细胞，与2ug/mL的第二A647-山羊抗人Fc(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)一起孵育，之后再次洗涤。将细胞重悬于25uL FACS缓冲液中，使用BD LSRFortessaTM(X-20)高通量取样器(HTS)(BD Biosciences,San Jose,CA)进行分析。然后使用Prism 8软件(GraphPadPrism软件)将获得的几何平均值用于绘制特异性结合，并用于计算KD值和Bmax值。
在该实施例中，来自实施例3的所有10个半胱氨酸插入变体和两个对照均以裸抗体和包含MTvc化合物1药物-接头的对应ADC的形式进行评估。两个对照和两个所选择的含有轻链或重链半胱氨酸插入的半胱氨酸插入变体(分别为变体v27321和v22765)还以包含MCvcPABC-MMAE药物-接头的ADC的形式进行测试。此外，对照v22758(A114C)和这两个所选择的半胱氨酸插入变体v27321和v22765以包含MCvcPAB-微管溶素M药物-接头的ADC的形式进行测试。
结果示于表8.1中。
表8.1：裸抗体和ADC与EBC-1细胞1结合的表观KD值和Bmax值
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1如预期的那样，对照人IgG没有显示出结合。
2变体包括与轻链的C-末端残基融合的肽ESSCDVKLV[SEQ ID NO:2]
总体而言，半胱氨酸插入变体显示出与亲本(v17427)裸抗体和v17427-MTvc化合物1ADC相当的结合。然而，与对照v17427相比，变体v29001及其MTvc化合物1偶联物显示出较低的结合(更大的Kd，5倍)。
所有ADC通常表现出与其裸抗体对应物非常相似的结合。半胱氨酸插入变体v29001和对照v22758的MTvc化合物1ADC显示出比它们各自的裸抗体对应物略低的Bmax。
对照v29013(S239.5)(以裸抗体和具有任一种药物-接头的ADC这两种形式)与亲本抗体(v17427)相比，显示出较低的Bmax值。
总体而言，该实施例证明，除变体v29001之外，包含半胱氨酸插入变体的ADC与其裸抗体对应物相比没有显示出差异性结合，而且还显示出与亲本抗体相当的结合。然而，包含变体v29001的ADC所显示的结合仍然在与包含对照v22758和v29013的相应ADC所显示结合的相似范围内。
实施例9：体外细胞毒性
如下所述，在体外针对多种表达目标表面抗原(c-Met)的肿瘤细胞系测试了来自实施例3的包含MCvcPABC-MMAE或MTvc化合物1的ADC的细胞毒性。使用了以下细胞系(表9.1)。
表9.1：用于细胞毒性测定的细胞系
表9.1中所示的每种细胞系在各自的完全生长培养基中生长，直到测定日。使用胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养容器中取出后，使用ScepterTM细胞计数器(Sigma-AldrichCanada,Oakville,ON)对细胞进行计数。除非另外指明，否则在完全生长培养基中将细胞稀释至20,000个细胞/mL，使得384孔板中的50uL/孔等于1,000个细胞/孔。在完全生长培养基(RPMI 1640)中将所有ADC稀释至15nM起始浓度，之后在无菌96孔稀释板中进行1:3稀释(最终体积为200uL/孔)。将样品以平行双样转移到384孔板中(20uL/孔)。除非另外指明，否则，接着用20,000个细胞/mL的测试细胞系悬浮液对板进行接种(50uL/孔)。将细胞留在室温下5至10分钟，之后在37℃/5％ CO2中孵育4夜，从而使细胞沉淀于孔底部。孵育后，以10uL/孔添加1x试剂(Promega Corporation,Madison,WI)，来对细胞存活率进行定量。在黑暗中孵育30分钟后，使用SynergyTM H1混合多模式读取器(BioTek InstrumentsInc.,Winooski,VT)测量发光。用Prism 7软件(GraphPad Prism软件)分析数据。
结果示于表9.2中。
表9.2：在表达C-Met的肿瘤细胞系中ADC的EC50值1
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1n＝2
2变体包括与轻链的C-末端残基融合的肽ESSCDVKLV[SEQ ID NO:2]
3IC＝供试品显示细胞毒性，但获得的曲线对于准确地测定EC50并不是最佳的
如预期的那样，与在表达较低c-Met的细胞系中的活性相比，包含MTvc化合物1的ADC在表达高c-Met的细胞系EBC-1中显示最大效力。包括经HIC纯化的DAR 2野生型对照(v17427-MTvc化合物1)在内的所有包含这种药物-接头的ADC在EBC-1细胞系中均显示EC50在0.02nM至0.04nM的范围内。在表达低c-Met的BT-20细胞系中，观察到半胱氨酸插入变体v28993(EC50 0.11nM)、v29001(EC50 0.12nM)、v28983(EC50 0.12nM)、v28989(EC50 0.13nM)、v22765(EC50 0.14nM)和v27321(EC50 0.14nM)相比于野生型对照(v17427-MTvc化合物1DAR2部分)(EC50 0.15nM)具有较高的效力，表明位点特异性偶联的重要性超过随机偶联。所有包含MTvc化合物1药物-接头的ADC在表达中等c-MET的H292细胞系中均显示EC50>15nM。对于表达中等c-Met的HCC827细胞系，与MTvc化合物1偶联的半胱氨酸插入变体显示EC50值在0.24nM至0.71nM范围内。与MTvc化合物1偶联的对照ADC即v29013(S239.5)在该细胞系中显示最高的体外效力(EC50 0.16nM)。
对于包含MCvcPABC-MMAE的ADC，对照v29013(S239.5)在表达高c-Met的细胞系EBC-1(EC50 0.04nM)中显示最高的效力。与MCvcPABC-MMAE偶联的所有10个半胱氨酸插入变体显示在EC50 0.05-0.09nM范围内的效力。在表达低c-MET的BT-20细胞系中，观察到与MCvcPABC-MMAE偶联的半胱氨酸插入变体v22761(EC50 0.59nM)、v29001(EC50 0.64nM)、v28983(EC50 0.64nM)和v27322(EC501.03nM)相比于与MCvcPABC-MMAE(EC50 1.27nM)偶联的对照v29003(S239.5)具有较高的效力。在表达中等c-Met的细胞系H292和HCC827中，包含MCvcPABC-MMAE药物-接头的所有ADC均显示EC50值>15nM。
总体而言，该实施例证明，包含半胱氨酸插入变体的ADC的效力似乎不受单个半胱氨酸插入位点位置的影响。
实施例10：小鼠血浆中抗体药物偶联物的稳定性
由于多种原因，包括酶促代谢和逆迈克尔反应，ADC在体内循环时可能会失去其有效载荷，或者该有效载荷可能会以使得ADC无效的方式改变。如下所述在小鼠血浆稳定性测定中评估来自实施例3的ADC，以确定有效载荷(药物-接头)的损失。
将ADC以0.5mg/mL稀释在小鼠血浆中，在37℃水浴中孵育0、1、3和7天，之后评估每个时间点的药物损失。在指出的时间点从水浴中取出样品，立即在-80℃冷冻。在24h内的时间点分别制备包含MCvcPAB-微管溶素M药物-接头的ADC。通过免疫沉淀回收ADC和抗体。取样品首先用250ng EndoS酶(50uL PBS中有2ug ADC)在室温(RT)下去糖基化1小时。然后将去糖基化ADC捕获到与生物素化羊抗人IgG F(ab')2捕获抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories,Inc.,West Grove,PA)预偶联的链霉抗生物素蛋白磁珠(GE HealthcareLife Sciences,Chicago,IL)上，每份样品每100uL磁珠浆含有15ug捕获抗体，在室温下捕获1.5小时。ADC捕获后，在室温下用每100uL样品25mM DTT(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)将样品还原1小时，然后在室温下在20uL洗脱缓冲液(20％乙腈、1％甲酸的dH2O溶液)中洗脱1小时。向小鼠血浆中添加2.0ug对照ADC(v22758)作为对照，以验证免疫沉淀程序。如一般程序6中所述，通过LC-MS评估每个样品的DAR，以便确定药物-接头损失的量。
除了药物-接头的潜在损失之外，接头中的马来酰亚胺环可能潜在地经历水介导的开环，这进而使ADC稳定。马来酰亚胺开环将导致ADC质量增加18Da。对于所有样品，除了药物-接头损失之外，还计算了马来酰亚胺开环的量。
微管溶素M在循环中易于经由乙酰基损失而代谢。理解这种类型的分解是否发生在半胱氨酸插入变体ADC中提供了关于相应半胱氨酸插入位点的稳定性/暴露/可及性的额外信息。为了评估这些半胱氨酸插入位点中的任一者是否有助于保护微管溶素M有效载荷免于损失乙酰基，监测血浆稳定性并与包含对照v22758(Thiomab HC-A114C)和v29013(S239.5)的ADC进行比较。一般来讲，微管溶素M ADC的分解百分比以失去乙酰基质量的所有载药物质(开环和非开环)除以所有载药物质的总和所得的比例来计算。
稳定性研究的结果在图3、图4和图5中示出。
从图3中可以看出，对于包含药物-接头MTvc化合物1的ADC，大多数变体的DAR损失相似，最大下降发生在前24小时，截至第7天达到约1.6的最终DAR。对于包含变体v27322、v29001和对照v29013的ADC，在整个孵育期中DAR损失几乎可以忽略不计。大多数变体的马来酰亚胺开环起始于0至20％，截至7天进展为完全开环。包含变体v22765和对照v29013的ADC截至第7天仅达到约70％的开环。
图4显示，对于包含药物-接头MCvcPABC-MMAE的ADC，大多数变体在孵育期中的DAR损失为约10％。最不稳定的ADC是那些包含变体v22760和v22768的ADC，其在7天内损失50％的DAR。对于MCvcPABC-MMAE ADC，开环和DAR损失并不完全相关：包含变体v22760和v22768的ADC显示出约70％的开环，但也显示出最高的DAR损失。最稳定的ADC是那些包含对照v29013和v22758的ADC，以及那些包含半胱氨酸插入变体v22761、v22765、v27321和v27322的ADC，所有这些ADC均显示<10％的DAR损失。
图5显示，在包含药物-接头MCvcPAB-微管溶素M的ADC中，包含变体v22761、v27321、v27322和对照v22758的那些ADC显示出快速的微管溶素M分解，24小时分解>70％，截至第7天分解100％。包含变体v22761和v27321的ADC中的DAR损失主要是由于这种分解导致的。最稳定的MCvcPAB-微管溶素M ADC包含变体v29001，其在7天内仅表现出约20％的分解、中等程度的开环和非常少的DAR损失。该ADC中的分解比对照v29013-MCvcPAB-微管溶素M ADC显示的分解量少5％。
实施例11：制备DAR调整过的抗体药物偶联物
前述实施例中描述的ADC具有约2的平均DAR，在两条重链(1xcys HC)或两条轻链(1xcys LC)上具有相同的半胱氨酸插入。在该实施例中，评价了半胱氨酸插入的潜在组合，以生成每个抗体具有多于或少于两个半胱氨酸残基插入的构建体，从而允许如下所述生成平均DAR为1、2或3的ADC。
通过重链的异二聚体装配生成每个抗体分子含有一个插入的构建体(1xcys Ab)。这些构建体包含一条没有任何插入的重链和一条具有单个插入的半胱氨酸残基的重链(1xcys HC)。
通过重链的异二聚体装配生成每个抗体分子含有三个插入的构建体(3xcys Ab)。这是通过将两条各自具有单个半胱氨酸插入的轻链(1xcys LC)与一条具有单个半胱氨酸插入的重链(1xcys HC)和一条没有任何插入的重链组合，或者通过将一条具有单个半胱氨酸插入的重链(1xcys HC)与一条具有两个半胱氨酸插入的重链(2xcys HC)组合来实现的。
详细信息在表11.1中提供。
此外，每个抗体分子具有四个插入的半胱氨酸的构建体(4xCys Ab)可以通过组合以下两组不同的插入设计来产生：将两条各自具有单个半胱氨酸插入的轻链(1xCys LC)与两条各自具有单个半胱氨酸插入的重链(1xCys HC)组合，或者将两条各自具有两个半胱氨酸插入的重链(2xCys HC)或两条各自具有两个半胱氨酸插入的轻链(2xCys LC)组合。
表11.1：所选择的半胱氨酸插入位点和预期的DAR值
1赖氨酸偶联
如一般程序1中所述制备抗体，然后如一般程序2中所述将每种抗体偶联至MTvc化合物1，但v17427除外，其以DAR2在赖氨酸残基处随机偶联至NHS-酯活化的化合物1，以产生ADC v34293。
如一般程序4至7中所述，通过HIC、UPLC-SEC、LC-MS和CE-SDS对每种所得的“DAR调整过的”ADC进行体外表征。结果示于表11.2中。
表11.2：DAR调整过的ADC的体外表征
1赖氨酸偶联
从表11.2中可以看出，如通过LC-MS测定的，所有变体都成功地以其各自的目标DAR与MTvc化合物1偶联。每种ADC的HIC-RRT值均与DAR 2MTvc化合物1ADC的估计值密切相关(参见实施例4和实施例6)。UPLC-SEC分布图显示，这些DAR调整过的ADC中的每一者均含有>90％的单体。
CE-SDS显示，所有DAR调整过的ADC主要表现为全尺寸抗体，非特异性偶联的量可忽略不计。
实施例12：细胞上结合测定法-DAR调整过的ADC
如实施例8中所述在表达cMet的细胞系EBC-1、H292和BT-20上评价通过细胞上结合对来自实施例11的ADC进行的体外表征。ADC v34281(DAR 3)仅在EBC-1和H292细胞系中进行了测试。以DAR 2与药物-接头ADvc化合物1偶联(随机，赖氨酸偶联)的亲本抗体(v17427)或以DAR 4与MTvc化合物1偶联(随机，半胱氨酸偶联)的该亲本抗体作为附加对照包括在内。
结果在表12.1中示出。如预期的那样，在不考虑DAR的情况下，所有DAR调整过的ADC均显示出与未偶联亲本抗体(v17427)相似的目标结合。
表12.1：DAR调整过的ADC的细胞上结合
1本实验中所使用的ADC v34278的DAR为1.4
实施例13：体外细胞毒性-DAR调整过的ADC
如实施例9所述评估来自实施例11的ADC的体外细胞毒性。以DAR 4与药物-接头MTvc化合物1偶联(随机，半胱氨酸偶联)的亲本抗体(v17427)作为附加对照包括在内。
结果在图6和表13.1中示出。一般来讲，DAR 3ADC的细胞毒性大于DAR 2和DAR1ADC的细胞毒性。在DAR 1ADC之间，没有观察到细胞毒性的显著差异。
表13.1：在表达cMet的肿瘤细胞系中ADC的EC50值
总体而言，结果显示DAR调整过的ADC对表达c-Met的细胞系EBC-1和HT-29都有活性。这些ADC的体外效力与DAR值(即，偶联毒素的数量)密切相关。
实施例14：体内抗肿瘤活性
在表达高c-Met的非小细胞肺癌异种移植物模型H1975和表达中等c-Met的结直肠癌异种移植物模型HT-29中评估来自实施例11的一批ADC的体内抗肿瘤活性。评估对照ADCv17427-MCvcPABC-MMAE(DAR4)、v17427-MTvc-化合物1(DAR4)和v17427-ADvc-化合物1(DAR2)的活性进行比较。
对于HT-29模型，将肿瘤细胞悬液(0.1ml PBS中含有3x 106个细胞)皮下植入balb/c裸鼠中。当平均肿瘤体积达到约160mm3时，将动物随机分组(n＝8只/每组)，用如表14.1中所示的单剂量静脉注射供试品来处理。不同DAR下ADC的剂量水平与毒素摩尔匹配。每周测量两次肿瘤体积和体重，研究持续时间为32天。
对于H1975模型，将肿瘤细胞悬液(0.1ml PBS中含有5x 106个细胞)皮下植入balb/c裸鼠中。当平均肿瘤体积达到约150mm3时，将动物随机分组(n＝8只/每组)，用如表14.1中所示的单剂量静脉注射供试品来处理。每周测量两次肿瘤体积和体重，研究持续时间为38天。
表14.1：体内研究的剂量
结果示于图7和图8中。
在HT-29模型中，所有位点特异性且随机偶联的DAR2、DAR3和DAR4化合物1ADC在分别为6、4和3mg/kg的毒素匹配抗体剂量下，与媒剂相比均显著抑制肿瘤生长(p<0.05，肿瘤生长速率的混合效应模型)(图7B)。DAR1化合物1ADC在12mg/kg的毒素匹配剂量下没有抑制肿瘤生长(图7B)。除v28983-MTvc-化合物1之外，所有位点特异性且随机偶联的DAR2、DAR3和DAR4化合物1ADC在分别为3、2和1.5mg/kg的毒素匹配抗体剂量下，与媒剂相比也显著抑制肿瘤生长(图7A)。相比之下，v17427-MCvcPABC-MMAE在1.5mg/kg的测试剂量下并未显著抑制肿瘤生长(图7A)。当抗体剂量与毒素匹配时，DAR与抗肿瘤活性呈正相关趋势。位点特异性v29001-MTvc-化合物1DAR2 ADC的活性与v17427-ADvc化合物1随机DAR2对照的活性相当(图7A)。
对于H1975模型，所有DAR1、DAR2、DAR3和DAR4化合物1ADC在分别为24、12、8和6mg/kg的毒素匹配抗体剂量下，与媒剂相比均显著抑制肿瘤生长(p<0.05，肿瘤生长速率的混合效应模型)(图8B)。尽管所有DAR2、DAR3和DAR4化合物1ADC在分别为2、1.3和1mg/kg的毒素匹配抗体剂量下，与媒剂相比也显著抑制肿瘤生长，但是DAR1 ADC在毒素匹配抗体剂量为4mg/kg时并未显著抑制肿瘤生长(图8A)。
两项研究中的任何处理组均未观察到明显的体重减轻。
实施例15：半胱氨酸插入变体与FcγR和FcRn的结合
如下所述评估表2.2中所示的10种半胱氨酸插入变体与新生Fc受体(FcRn)以及Fcγ受体(FcγR)CD64a(FcγRI)、CD32a(FcγRIIA；等位基因形式His131和Arg131)、CD32b(FcγRIIB)和CD16a(FcγRIIIA；等位基因形式V158和F158)结合的能力。
与FcγR的结合：通过使用BiacoreTM T200系统(Cytiva,Marlborough,MA)的表面等离振子共振(SPR)，用含有0.05％ Tween 20和3.4mM EDTA的PBS缓冲液(pH7.4)测量FcyR对测试变体的亲和力。通过到2000RU(响应单位)的标准胺偶联，将10mM乙酸钠(pH 4.5)中浓度为15ug/mL的蛋白质A(Genscript Biotech Corporation,Piscataway,NJ；目录号Z02201)共价固定在CM5传感器芯片上。取每种2.5ug/mL的测试变体以10uL/min的流速进样，持续30s，用于捕获蛋白A。使用单循环动力学将FcγR以25uL/min的速度进样到固定有抗体的表面上。对于具有弱亲和力与快速开关相互作用的CD32aH、CD32aR和CD32bY，使用浓度在0.15uM与12uM之间递增的15s进样。对于CD16aF和CD16aV，使用浓度在0.06uM与5uM之间递增的40s进样。对于CD64a，使用浓度在0.41nM与300nM之间递增的100s进样。对于所有FcγR，使用120s解离，并且在进样循环之间用10mM甘氨酸(pH 1.5)的30s脉冲再生蛋白A表面。双重参照传感图，将其拟合到稳态模型以测定亲和力，或者如果CD64a的解离阶段足够慢，则将其拟合到1:1结合模型以测定动力学性质和亲和力。报告的KD值是两次独立运行的平均值。所有实验都是在25℃下进行的。
与FcRn的结合：通过使用BiacoreTM T200系统(Cytiva,Marlborough,MA)的表面等离振子共振(SPR)，用含有0.05％ Tween 20和3.4mM EDTA的PBS缓冲液(调节至pH 5.9)测量FcRn对测试变体的亲和力。通过到2000RU(响应单位)的标准胺偶联，将10mM乙酸钠(pH4.5)中浓度为10ug/mL的中性抗生物素蛋白(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA；目录号31000)共价固定在CM5传感器芯片上。将在大亚基上具有C-末端生物素的人FcRn(5ug/mL)以20uL/min的流速进样20s，以达到70RU的FcRn捕获水平。使用单循环动力学将每种测试变体进样到固定有FcRn的表面上。在pH 5.9的运行缓冲液中，使用单循环方法，以50uL/min的流速对浓度在5nM至1200nM之间递增的抗体变体进样45s，接着解离180s。在进样循环之间，用PBST(pH 7.4)的30s脉冲再生FcRn表面。双重参照传感图，将其拟合到稳态结合模型中以生成亲和力值。报告的KD值是两次独立运行的平均值。所有实验都是在25℃下进行的。
结果：结果在表15.1中示出。所有半胱氨酸插入变体均以相似的亲和力与FcRn结合，该亲和力在野生型对照(v17427)的KD的2倍内。大多数半胱氨酸插入变体也以相似的亲和力与所有FcγR结合，该亲和力在野生型对照(v17427)的KD的2倍内，但v29001(H_T299.5C)和v22765(H_G237.5C)除外，它们显示与FcγR的结合显著减少，变体v22768(H_Q295.5C)也除外，其显示与CD16aF、CD16aV、CD32aH和CD32aR的结合减少(>野生型对照v17427的KD的2倍)。对照半胱氨酸插入变体v29013(H_S239.5C)也如预期的那样显示出与FcγR的结合显著减少。
实施例16：半胱氨酸插入突变的可转移性
为了证明半胱氨酸插入突变能够转移到其他抗体，从这些插入位点中选择4个引入如表16.1中所详述的4种不同的抗体中，总共得到7种新变体。
表16.1：为证明半胱氨酸插入突变的可转移性而生成的变体
1Dreyfus等人，2012,Science,337:1343-1348
2美国专利号9,249,230
3美国专利号10,808,039
按照如一般方案1中描述的相同方案，在各种抗体背景中制备半胱氨酸插入变体。如一般程序2中所述将基于曲妥珠单抗、CR8071、H3和SGNCD19a的变体(v34014、v34012、v34010、v33996、v34004和v34015)与药物-接头MTvc化合物1偶联，但有以下例外。对于变体v34012和v34010，一旦还原完成，就用pH 6.5的PBS对还原的变体进行缓冲液交换，以便在室温下氧化或随后与MTvc化合物1偶联。在4℃下氧化制备的样品显示出更好的生物物理特性。
如下所述将变体v34217与下列3种不同的基于喜树碱的药物-接头偶联：MC-GGFG-喜树碱1、MC-GGFG-喜树碱2和MC-GGFG-*喜树碱2。药物-接头MC-GGFG-*喜树碱2含有与药物-接头MC-GGFG-喜树碱2相同的喜树碱类似物，但是该接头附接到药物分子中的不同位置。
用5mM DTPA(二乙烯三胺五乙酸，最终浓度为1mM，体积：188μL)的PBS(pH 7.4)溶液将变体v34217(6mg)的溶液(647.2μL)稀释至6.4mg/mL，然后向该溶液中添加25mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)(25当量，104μL)。在37℃水浴中孵育3h后，使用40kDa 5mL ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)将经还原的抗体纯化，其中该柱用10mM乙酸钠(pH 5.5)进行了预调理。在4℃下，用25摩尔过量的脱氢抗坏血酸(DHAA)对经还原的抗体进行过夜氧化(18小时)(假设ZebaTM柱纯化回收率为100％)，以重新形成链间二硫键，同时保持插入的半胱氨酸处于还原(游离硫醇)形式。通过移液充分混合后，将再氧化的抗体分成3个均匀的等分试样，在10％(v/v)DMSO存在下，在室温下与4摩尔过量的10mM药物-接头的DMSO储备液一起孵育60至75分钟，从而与马来酰亚胺官能化的药物-接头MC-GGFG-喜树碱1、MC-GGFG-喜树碱2或MC-GGFG-*喜树碱2偶联。然后，通过用10mM乙酸钠(pH 4.5)预平衡的40K ZebaTM柱将所形成的偶联物纯化。
一旦偶联完成，就通过分别如一般方案4、5、6和7中所述的疏水相互作用色谱法(HIC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)和毛细管电泳-SDS(CE-SDS)分析所有ADC。
结果在表16.2中示出，证明总体而言，半胱氨酸插入突变可以成功地用于不同的抗体中，并且与不同的药物-接头偶联。对于大多数ADC，通过HIC或LC-MS测得的DAR与预期相符(约DAR 2)。对于v33996，甚至作为裸抗体在HIC上的洗脱也相对较宽，因此，在偶联后没有观察到明显的峰，而且既不能测量到DAR也不能测量到HIC-RRT。对于v34012，观察到一定程度的非特异性偶联，导致DAR为2.1。ADC在SEC上显示至少含有95％的单体，但以下两个ADC除外：与MTvc化合物1偶联的v34012和v34010。对于这两种ADC，氧化后(添加药物-接头之前)观察到约15％的LMWS，该值在偶联后保持不变。进一步优化氧化步骤将提高这两种变体观察到的LMWS的量。
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实施例17：制备另外的DAR调整过的抗体药物偶联物
在该实施例中，多个半胱氨酸插入位点组合在一起生成能够发生位点特异性偶联的抗体，从而提供DAR 4和DAR 6的ADC。所采用的半胱氨酸插入位点的组合在表17.1中示出。
表17.1：半胱氨酸插入位点的组合与目标DAR
按照一般方案1中描述的方案制备半胱氨酸插入变体。DAR 4和DAR 6抗cMet变体以带有L-半胱氨酸帽、谷胱甘肽帽或这两者的组合的半胱氨酸加帽形式表达。如一般程序2中所述进行还原、氧化以及与药物-接头MTvc化合物1偶联，但作出以下修改。为了说明额外的半胱氨酸加帽，对于DAR 4和DAR 6变体，在类似条件下分别用30和40当量摩尔过量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)进行还原。对于DAR 4和DAR 6变体，分别用30和40当量摩尔过量的脱氢抗坏血酸(DHAA)进行氧化。
如实施例16中所述，进行DAR 4抗FRα变体与药物-接头MC-GGFG-喜树碱1、MC-GGFG-喜树碱2和MC-GGFG-*喜树碱2的偶联。
一旦偶联完成，就通过分别如一般方案4、5、6和7中所述的疏水相互作用色谱法(HIC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)和毛细管电泳-SDS(CE-SDS)分析所有ADC。
结果在表17.2(抗cMet抗体)和表17.3(抗FRα抗体)中示出。
总体而言，抗cMet抗体骨架上的位点特异性DAR 4和DAR 6偶联是成功的，其中将多达三个不同的半胱氨酸插入引入抗体中并与药物-接头偶联。DAR 6ADC、v35074-MTvc化合物1的代表性HIC、SEC、LC-MS和CE-SDS分布图在图16至图18中示出。
对于ADC v33943-MTvc化合物1和v35074-MTvc化合物1，由于存在共洗脱峰，通过HIC计算的DAR值低于预期值。然而，对于其他抗cMet ADC，通过HIC计算的DAR与目标DAR接近。通过LC-MS测量DAR是更直接的方法，反映的值应当最接近绝对值。除v33952-MTvc化合物1外，所有其他抗cMet ADC在UPLC-SEC上均显示至少99％的单体。对v33952氧化步骤的进一步优化应当减少LMWS的量，因为该抗体在添加药物-接头之前显示形成>10％的LMWS。在非变性条件下运行的CE-SDS显示，与该变体的全尺寸抗体相比，半抗体的比例更高。
对于抗FRα抗体主链上的位点特异性DAR 4偶联，所有ADC在UPLC-SEC上均表现为>99％的单体。通过HIC，这些ADC仅观察到一个峰值。偶联抗体和未偶联抗体均具有非常相似的洗脱时间，HIC对DAR的估计值不如LC-MS计算的DAR值精确。LC-MS显示，6个ADC中有4个为DAR 4。与MC-GGFG-喜树碱1或MC-GGFG-*喜树碱2偶联的变体v34456显示约25％的非特异性偶联，这可以通过进一步优化来减少。
表17.2：抗cMet ADC(DAR 4和DAR 6)的生物物理特性
表17.3：抗FRαADC(DAR 4)的生物物理特性
#仅观察到单个HIC峰
实施例18：DAR调整过的抗FRαADC的体外细胞毒性
在如下所述的3D细胞毒性测定中，使用表达FRα的癌细胞系JEG-3(胎盘绒毛膜癌)和T-47D(乳腺癌)将实施例16和17中生成的抗FRαADC(DAR 2和DAR 4)的细胞生长抑制(细胞毒性)能力与随机DAR 4ADC进行比较。
简言之，将细胞以3,000个细胞/孔接种在384孔超低附着(ULA)板中，以200x g离心2分钟，然后在标准培养条件下孵育3天，以允许形成球状体(1个球状体/孔)。3天后，用在完全生长培养基中制备的供试品滴定液处理球状体，然后在标准培养条件下孵育6天。孵育后，在所有孔中添加3D试剂(Promega Corporation,Madison,WI)。将板在室温下于黑暗中孵育1小时，使用BioTek Cytation5细胞成像多模式读取器(AgilentTechnologies,Inc.,Santa Clara,CA)对发光进行定量。基于空白孔(未添加供试品)，使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software,San Diego,CA)计算细胞毒性百分比值并针对供试品浓度绘图。
结果在表18.1中示出。针对JEG-3和T-47D这两种球状体，位点特异性DAR 4ADC表现出与有效载荷匹配的随机DAR 4ADC相当的3D体外细胞毒性。针对JEG-3和T-47D球状体，位点特异性DAR 2ADC表现出比有效载荷匹配的DAR 4ADC低log倍的效力，如预期的那样，这是由于DAR 2ADC上的药物负载较低。
针对JEG-3和T-47D这两种球状体，包含喜树碱2的DAR 4位点特异性随机ADC显示出与有效载荷匹配的DAR 8随机ADC相似的效力。
针对表达高FRα的JEG-3球状体，包含喜树碱1的DAR 4位点特异性随机ADC显示出与有效载荷匹配的DAR 8随机ADC相似的效力。在表达较低FRα的T-47D球状体中，DAR 4ADC表现出药物负载依赖性剂量反应，其中有效载荷匹配的DAR 8随机ADC表现出3至9倍的高效力。
表18.1：DAR调整过的ADC的体外细胞毒性
#ADC具有超过1摩尔％/DAR的游离毒素，如通过RP-LCMS测量的
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对本领域技术人员来说显而易见的本文描述的特定实施方法的修改旨在包括在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 酵活生物制药有限公司
<120> 半胱氨酸工程化抗体构建体、偶联物及使用方法
<130> V818153WO
<140> 尚不可用
<141> 2022-03-25
<150> US 63/166,450
<151> 2021-03-26
<160> 49
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 信号_肽(signal_peptide)
<400> 1
Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
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<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 轻_链_肽(light_chain_peptide)
<400> 2
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<210> 3
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG1_等位基因_*01_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG1_allele_*01)
<400> 3
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1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*01_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG3_allele_*01)
<400> 4
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*16_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG3_allele_*16)
<400> 5
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Leu Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*09_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG3_allele_*09)
<400> 6
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*11_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG3_allele_*11)
<400> 7
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*14_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG3_allele_*14)
<400> 8
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Leu Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*18_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG3_allele_*18)
<400> 9
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Trp Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG4_等位基因_*01_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG4_allele_*01)
<400> 10
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 110
<212> PRT
<213> 人_IgG4_等位基因_*02_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG4_allele_*02)
<400> 11
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*01_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG2_allele_*01)
<400> 12
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*02_的_CH2_结构域(CH2_domain_of_human_IgG2_allele_*02)
<400> 13
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG1_等位基因_*01_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG1_allele_*01)
<400> 14
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG1_等位基因_*04_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG1_allele_*04)
<400> 15
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 16
<211> 105
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*01_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG2_allele_*01)
<400> 16
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
100 105
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*06_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG2_allele_*06)
<400> 17
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*15_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*15)
<400> 18
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 19
<211> 105
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*15_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*15)
<400> 19
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
100 105
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*17_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*17)
<400> 20
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Met Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG4_等位基因_*03_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG4_allele_*03)
<400> 21
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
100 105
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*14_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*14)
<400> 22
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG4_等位基因_*01_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG4_allele_*01)
<400> 23
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
100 105
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*06_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*06)
<400> 24
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*08_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*08)
<400> 25
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*01_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*01)
<400> 26
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*03_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*03)
<400> 27
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*13_的_CH3_结构域(CH3_domain_of_human_IgG3_allele_*13)
<400> 28
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人_k_轻_链_等位基因_*01_的_CL_结构域(CL_domain_of_human_kappa_light_chain_allele_*01)
<400> 29
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人_k_轻_链_等位基因_*04_的_CL_结构域(CL_domain_of_human_kappa_light_chain_allele_*04)
<400> 30
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人_k_轻_链_等位基因_*05_的_CL_结构域(CL_domain_of_human_kappa_light_chain_allele_*05)
<400> 31
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人_k_轻_链_等位基因_*02_的_CL_结构域(CL_domain_of_human_kappa_light_chain_allele_*02)
<400> 32
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Gly Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人_k_轻_链_等位基因_*03_的_CL_结构域(CL_domain_of_human_kappa_light_chain_allele_*03)
<400> 33
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Arg Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_3*02 (human_lambda_light_chain_allele_3*02)
<400> 34
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Pro Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_3*03 (human_lambda_light_chain_allele_3*03)
<400> 35
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_6*01 (human_lambda_light_chain_allele_6*01)
<400> 36
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_2*01 (human_lambda_light_chain_allele_2*01)
<400> 37
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_7*01 (human_lambda_light_chain_allele_7*01)
<400> 38
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_7*03 (human_lambda_light_chain_allele_7*03)
<400> 39
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp
20 25 30
Phe Asn Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人_λ_轻_链_等位基因_1*02 (human_lambda_light_chain_allele_1*02)
<400> 40
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 41
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG1_等位基因_*01_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG1_allele_*01)
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 42
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG1_等位基因_*03_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG1_allele_*03)
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 43
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*01_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG3_allele_*01)
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 44
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*18_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG3_allele_*18)
<400> 44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 45
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG3_等位基因_*17_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG3_allele_*17)
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 46
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*04_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG2_allele_*04)
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 47
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG4_等位基因_*01_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG4_allele_*01)
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 48
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*01_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG2_allele_*01)
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 49
<211> 98
<212> PRT
<213> 人_IgG2_等位基因_*02_的_CH1_结构域(CH1_domain_of_human_IgG2_allele_*02)
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val

Claims (40)

1.一种半胱氨酸工程化抗体构建体，其包含VH结构域、VH结构域和VL结构域、Fc区，或它们的组合，所述Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域，
所述抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；
(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(g)在CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，
其中所述VL结构域、所述CL结构域、所述VH结构域和所述CH1结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，所述CH2结构域中的氨基酸编号是EU编号，并且
其中所述抗体构建体基于免疫球蛋白G(IgG)。
2.根据权利要求1所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述半胱氨酸工程化抗体构建体中包含所述半胱氨酸插入突变的结构域的解链温度(Tm)与缺少所述半胱氨酸插入突变的相应亲本抗体构建体中的相同结构域的Tm相差在0℃至8℃的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含一个半胱氨酸插入突变。
4.根据权利要求1或2所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含两个半胱氨酸插入突变。
5.根据权利要求4所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述两个半胱氨酸插入突变是对称突变。
6.根据权利要求1或2所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含三个半胱氨酸插入突变。
7.根据权利要求6所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述三个半胱氨酸插入突变中的两个半胱氨酸插入突变是对称突变。
8.根据权利要求3、6或7所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中每个半胱氨酸插入突变独立地选自：
(a)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(d)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
9.根据权利要求3所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(c)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
10.根据权利要求1或2所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含四个或六个半胱氨酸插入突变。
11.根据权利要求10所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(e)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含VH结构域，或VH结构域和VL结构域。
13.根据权利要求12所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含一个或多个抗原结合结构域，所述抗原结合结构域中的至少一者包含所述VH结构域，或所述VH结构域和所述VL结构域。
14.根据权利要求13所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含两个抗原结合结构域。
15.根据权利要求14所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体是双特异性的。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗原结合结构域中的至少一者与肿瘤相关抗原结合。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含Fc区。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体基于IgG1。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述IgG是人IgG。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述抗体构建体包含异二聚体Fc区。
21.根据权利要求20所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，其中所述异二聚体Fc区包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域包含对所述异二聚体Fc形成的促进作用超过对同二聚体Fc形成的促进作用的氨基酸突变。
22.一种偶联物，其包含根据权利要求1至21中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，以及与一个或多个插入的半胱氨酸残基中的每一者偶联的一种或多种活性剂。
23.一种具有式(I)的偶联物：
A-(L-(D)q)p(I)
其中：
A是半胱氨酸工程化抗体构建体；
L是接头；
D是活性剂；
q是介于1与4之间的整数，并且
p是介于1与8之间的整数，
其中所述半胱氨酸工程化抗体构建体包含VH结构域、VH结构域和VL结构域、Fc区，或它们的组合，所述Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域，并且
其中所述半胱氨酸工程化抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；
(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(g)在CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，
其中所述VL结构域、所述CL结构域、所述VH结构域和所述CH1结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，并且所述CH2结构域中的氨基酸编号是EU编号，
其中所述半胱氨酸工程化抗体构建体基于免疫球蛋白G(IgG)，并且
其中每个D经由L与插入的半胱氨酸残基连接。
24.根据权利要求23所述的偶联物，其中所述偶联物具有式(II)：
A-(L-D)p(II)
其中：
A是所述半胱氨酸工程化抗体构建体；
L是所述接头；
D是所述活性剂，并且
p是介于1与8之间的整数。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的偶联物，其中所述活性剂是诊断剂或标记剂。
26.根据权利要求22至24中任一项所述的偶联物，其中所述活性剂是治疗剂。
27.一种组合物，其包含根据权利要求22至26中任一项所述的偶联物，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
28.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的根据权利要求26所述的偶联物。
29.一种根据权利要求28所述用于治疗的偶联物。
30.根据权利要求28所述的偶联物在制造用于治疗有需要的受试者的药物中的用途。
31.一种制备根据权利要求22至26中任一项所述的偶联物的方法，其包括将所述半胱氨酸工程化抗体构建体置于还原条件下，使得一个或多个插入的半胱氨酸残基的硫醇基团被还原，然后使硫醇反应性接头-活性剂与所述抗体构建体在允许所述接头与还原的硫醇之间形成键的条件下反应。
32.一种制备具有预先确定的药物抗体比率(DAR)的抗体-药物偶联物的方法，所述方法包括：
(i)提供半胱氨酸工程化抗体构建体，其包含VH结构域、VH结构域和VL结构域、Fc区，或它们的组合，所述Fc区包含CH2结构域和/或CH3结构域，并且
所述抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：
(a)在所述VL结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CL结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；
(e)在所述CL结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；
(f)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(g)在CH1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；
(h)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；
(i)在所述CH2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及
(j)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，以及
(ii)使所述半胱氨酸工程化抗体构建体与药物-接头反应，以提供所述抗体-药物偶联物；
其中所述预先确定的DAR是1、2、3、4、5、6、7或8，并且所述半胱氨酸工程化抗体构建体包含与所述预先确定的DAR相同数目的半胱氨酸插入突变，
其中所述VL结构域、所述CL结构域、所述VH结构域和所述CH1结构域中的氨基酸编号是Kabat编号，所述CH2结构域中的氨基酸编号是EU编号，并且
其中所述半胱氨酸工程化抗体构建体基于免疫球蛋白G(IgG)。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述预先确定的DAR为2。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述预先确定的DAR为1或3。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(d)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述预先确定的DAR为4或6。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述半胱氨酸插入突变选自：
(a)在所述VL结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；
(b)在所述CL结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；
(c)在VH结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；
(d)在所述CH2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基，以及
(e)在所述CH2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基。
38.一种多核苷酸或一组多核苷酸，其编码根据权利要求1至21中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。
39.一种载体，其包含一种或多种编码根据权利要求1至21中任一项所述的半胱氨酸工程化抗体构建体的多核苷酸。
40.一种宿主细胞，其包含根据权利要求39所述的载体。
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