CN112996809A - 结合4-1bb和肿瘤相关抗原的抗体构建体以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了包含4‑1BB结合结构域和结合至肿瘤相关抗原(TAA)的抗原结合结构域的抗体构建体，其中所述4‑1BB结合结构域和所述TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。所述支架可为具有修饰的Fc构建体，所述修饰使所述Fc构建体介导效应功能的能力降低。

Description

结合4-1BB和肿瘤相关抗原的抗体构建体以及其用途
背景技术
4-1BB为TNF受体超家族的成员，它在若干类型的免疫细胞上表达，包括但不限于活化T细胞、NK和NKT细胞、调控T细胞、树突细胞、B细胞以及被刺激的肥大细胞。静止性T细胞不表达高水平的4-1BB；它在通过T细胞受体(TCR)活化之后上调。4-1BB也称为CD137或TNFRSF9，它同样在非免疫细胞，包括在脑中发现的神经细胞群体上表达(Bartkowiak和Curran(2015),Front.Oncol.5:117)。4-1BB为通过与它的配体(4-1BBL或CD137L)结合而活化的跨膜受体，所述配体在诸如巨噬细胞和活化B细胞等细胞上表达。在活化后，4-1BB用以促进T细胞的分化和存活，增强活化T细胞的效应功能以及产生免疫记忆。
鉴于4-1BB在调节T细胞功能中的关键作用，4-1BB和特别是4-1BB激动剂已成为开发癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。事实上，许多临床试验已检验了不同4-1BB靶向疗法的功效，包括单独抗4-1BB抗体或与肿瘤靶向抗体、检查点抑制剂或化学疗法的组合。这些临床试验中大部分使用抗4-1BB抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)进行。由Bristol-Myers Squibb研发的乌瑞鲁单抗为一种人IgG4抗体，目前处于为检验在治疗癌症中的功效而设计的许多1期和2期临床试验中。然而，乌瑞鲁单抗施用被限制在0.1mg/kg的剂量，因为更高的剂量产生严重肝脏毒性(Segal等,Clin Cancer Res.2017年4月15日；23(8):1929-1936)。
由Pfizer研发的乌托米单抗(Utomilumab)为一种人IgG2抗体，所述抗体目前处于也为评估在癌症治疗中的功效而设计的各种1期、2期以及3期临床试验中。虽然乌托米单抗似乎不诱导剂量限制性毒性，但早期临床数据表明它作为单一疗法的有效性似乎不显著(Makkouk等(2016)European Journal of Cancer 54:112-119)。
此背景信息是出于使申请人认为的已知信息与本公开具有可能的关联性的目的而提供。不一定旨在承认，也不应理解为承认前述信息中的任一者构成所要求的发明的现有技术。
发明内容
本文描述了结合4-1BB和肿瘤相关抗原的双特异性抗体构建体以及其用途。本公开的一个方面涉及一种抗体构建体，所述抗体构建体包含：a)第一4-1BB结合结构域，所述第一4-1BB结合结构域结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)，以及b)肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域(TAA抗原结合结构域)，所述TAA抗原结合结构域结合至TAA，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
本公开的另一方面涉及一种特异性结合于4-1BB的抗体构建体或其抗原结合片段，所述抗体构建体或其抗原结合片段包含：包含三个CDR的重链可变序列以及包含三个CDR的轻链可变序列，并且重链可变序列和轻链可变序列来自变体v28726、v28727、v28728、v28730、v20022、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v20036、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v20023、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28695中的任一者。
本公开的另一方面涉及包含本文所描述的抗体构建体的药物组合物。
本公开的另一方面涉及编码本文所描述的抗体构建体的一种或多种核酸。
本公开的另一方面涉及包含编码本文所描述的抗体构建体的一种或多种核酸的一种或多种载体。
本公开的另一方面涉及一种分离的细胞，所述分离的细胞包含编码本文所描述的抗体构建体的一种或多种核酸，或包含一种或多种核酸的一种或多种载体。
本公开的另一方面涉及一种制备本文所描述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合于表达抗体构建体的条件下培养本文所描述的分离的细胞，以及将抗体构建体纯化。
本公开的另一方面涉及治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的抗体构建体。
本公开的另一方面涉及有效量的本文所描述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
本公开的另一方面涉及本文所描述的抗体构建体在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。
附图说明
在参考随附图式的以下具体实施方式中，所要求的发明的这些和其他特征将变得更清楚。
图1展示了示例性抗体模式。图1A提供了天然存在的抗体模式(FSA模式)的图示；图1B提供了抗原结合结构域呈Fab模式的单臂抗体模式(OAA)的图示；图1C提供了抗原结合结构域呈scFv模式的单臂抗体模式(OAA)的图示；图1D提供了一个抗原结合结构域呈scFv模式并且另一个呈Fab模式的二价抗体模式(也称为杂合模式)的图示；并且图1E提供了两个抗原结合结构域均呈scFv模式的二价抗体模式(也称为双scFv模式)的图示。在图1中，示例性抗体的Fc部分以白色标识，而抗原结合结构域以灰色标识。
图2展示了预期用于本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体的许多额外的示例性模式。图2A提供了1x1模式的实例，其中抗体构建体包含一个4-1BB结合结构域(在此展示为4-1BB配体)，以及一个TAA抗原结合结构域(在此以Fab模式展示)。图2B提供了2x1模式的实例，其中抗体构建体包含两个4-1BB抗原结合结构域(在此均以Fab模式展示)，以及一个TAA抗原结合结构域(在此以scFv模式展示)。图2C提供了2x2模式的实例，其中抗体构建体包含两个4-1BB抗原结合结构域(在此均以Fab模式展示)，以及两个TAA抗原结合结构域(在此均以scFv模式展示)。图2D提供了1x1模式的另一实例，其中抗体构建体包含一个4-1BB结合结构域(在此以Fab模式展示)，以及一个TAA抗原结合结构域(在此以scFv模式展示)。图2E提供了2x1模式的另一实例，其中抗体构建体包含两个4-1BB抗原结合结构域(在此均以Fab模式展示)，以及一个连接至4-1BB抗原结合结构域中的一者的TAA抗原结合结构域(在此以scFv模式展示)。图2F提供了1x1模式的另一实例，其中抗体构建体包含一个4-1BB结合结构域(在此以Fab模式展示)，以及一个TAA抗原结合结构域(在此以scFv模式展示)；此类型的抗体构建体也称为杂合模式。图2F提供了1x1模式的另一实例，其中抗体构建体包含一个4-1BB结合结构域(在此以Fab模式展示)，以及一个连接至4-1BB抗原结合结构域的TAA抗原结合结构域(在此以scFv模式展示)。图2中的图示仅为示例性的，并且应了解虽然4-1BB抗原结合结构域在此以Fab模式展示，但它们也可呈scFv或sdAb模式，或者如果存在两个4-1BB抗原结合结构域，那么它们可呈不同模式或可结合至4-1BB的不同表位。同样地，虽然TAA抗原结合结构域在此以scFv模式展示，但它们也可呈Fab或sdAb模式，或者如果存在两个TAA抗原结合结构域，那么它们可呈不同模式，或可结合至不同TAA。
图3展示了如实施例1中所描述而构建的示例性4-1BB x HER2抗体构建体的模式。
图4示出了在使用4-1BB-NFkB-荧光素酶Jurkat报告细胞以及SKOV3或MDA-MB-468肿瘤细胞的共培养实验中呈不同模式的4-1BB x HER2抗体构建体和对照活化4-1BB的能力。示出了由以下每种抗体构建体诱导的发光的量：v16675(图4A)；v16679(图4B)；v15534(图4C)；v16601(图4D)；v16605(图4E)；v19353(图4F)；v1040(图4G)；v16992(图4H)；以及v12952(图4I)。
图5示出了在存在和不存在SKBR3肿瘤细胞的情况下在原代CD4+ T细胞共培养实验中呈不同模式的4-1BB x HER2抗体构建体和对照活化4-1BB的能力。通过ELISA测量由T细胞产生的IL-2。
图6比较了在将CD4+、CD8+或全T细胞与HER2+SKBR3细胞共培养的分析中4-1BB xHER2抗体构建体v16679、4-1BB抗体v12592、4-1BB x HER2抗转运蛋白构建体v19353以及阴性对照抗体v13725刺激IFNγ产生的能力。
图7展示了在4-1BB-NF-κB报告基因分析中当与抗Fc抗体交联时嵌合4-1BB抗体刺激4-1BB活性的能力。每个变体的四个柱子对应(按从右到左的顺序)于所测试的抗体构建体的浓度：2.5μg/ml、0.833μg/ml、0.277μg/ml、0.092μg/ml。
图8示出了用于结合至4-1BB的抗体的结构域定位的构建体。图8A示出了人、狗以及狗-人嵌合4-1BB构建体；图8B示出了全长跨膜人4-1BB以及截短的人结构域3和4构建体。
图9示出了嵌合4-1BB抗体和对照结合至人和狗4-1BB的能力。图9A中示出了v12592的结果；图9B中示出了v12593的结果；图9C中示出了v20022的结果；图9D中示出了v20023的结果；图9E中示出了v20025的结果；图9F中示出了v20029的结果；图9G中示出了v20032的结果；图9H中示出了v20036的结果，并且图9I中示出了v20037的结果。
图10展示了嵌合抗体结合至293E6细胞中所表达的各种4-1BB蛋白的能力。
图11A示出了嵌合抗体结合至食蟹猴4-1BB的能力。图11B展示了这些嵌合抗体结合至小鼠4-1BB的能力。
图12示出了移植至人构架上的A)1C8、B)1G1以及C)5G8的小鼠重链可变结构域CDR以及移植至人构架上的D)1C8、E)1G1以及F)5G8的小鼠轻链可变结构域CDR的序列。根据Kabat对序列进行编号，并且使用AbM定义分配CDR并且通过“*”进行标识。
图13展示了来源于小鼠1C8抗体的代表性人源化4-1BB抗体的SPR传感器图。
图14展示了来源于小鼠1G1抗体的代表性人源化4-1BB抗体的SPR传感器图。
图15展示了来源于小鼠5G8抗体的代表性人源化4-1BB抗体的SPR传感器图。
图16A展示了来源于1C8的人源化4-1BB抗体如通过流式细胞术所测量结合表达4-1BB的细胞的能力。图16B展示了来源于1G1的人源化4-1BB抗体如通过流式细胞术所测量结合表达4-1BB的细胞的能力。图16C展示了来源于5G8的人源化4-1BB抗体如通过流式细胞术所测量结合表达4-1BB的细胞的能力。
图17展示了来源于1C8的人源化抗体的DSC热谱图。
图18展示了来源于1G1的人源化抗体的DSC热谱图。
图19展示了来源于5G8的人源化抗体的DSC热谱图。
图20展示了来源于1C8的代表性纯化人源化抗体的LC-MS型态。
图21A示出了在4-1BB-NF-κB-luc报告子分析中来源于1C8的人源化4-1BB抗体刺激4-1BB活性的能力。图21B示出了在4-1BB-NF-κB-luc报告子分析中来源于1G1的人源化4-1BB抗体刺激4-1BB活性的能力。图21C示出了在4-1BB-NF-κB-luc报告子分析中来源于5G8的人源化4-1BB抗体刺激4-1BB活性的能力。
图22展示了如实施例17中所描述而制备的示例性4-1BB x TAA抗体构建体的模式。
图23A展示了在使用4-1BB-NF-κB-荧光素酶Jurkat报告细胞和MSLN高H226肿瘤细胞或MSLN低A549细胞的共培养实验中4-1BB x MSLN抗体构建体v22329和v22639刺激4-1BB活性的能力。图23B展示了在相同分析中4-1BB x MSLN抗体构建体v22353和v22630刺激4-1BB活性的能力。
图24示出了在4-1BB-NF-κB-荧光素酶Jurkat报告细胞共培养分析中4-1BB x FRα抗体构建体v22638刺激4-1BB活性的能力。
图25A示出了当与以不同水平表达NaPi2b的肿瘤细胞共培养时4-1BB x NaPi2b构建体v22345使CD8细胞产生IFNγ增强的能力。图25B示出了当与以不同水平表达MSLN的各种肿瘤细胞共培养时4-1BB x MSLN构建体v22630使CD8细胞产生IFNγ增强的能力。图25C示出了当与以不同水平表达FRα的各种肿瘤细胞共培养时4-1BB xFRα构建体v22638使CD8T细胞产生IFNγ增强的能力。图25D表明当与表达不同水平的TAA的各种肿瘤细胞共培养时对照4-1BB单特异性抗体v12592不能使CD8 T细胞产生IFNγ增强。
图26示出了如实施例20中所描述而制备的示例性4-1BB x FRα抗体构建体的模式。此图中所展示的scFv取向仅用于说明的目的；如表11中所描述构建体中的scFv可呈VH-VL或VL-VH取向。
图27展示了4-1BB x FRα抗体构建体如通过流式细胞术所测量结合至表达4-1BB的Jurkat细胞的能力。图27A示出了具有来源于小鼠抗体1C8的4-1BB互补位的抗体构建体的数据；图27B来自小鼠抗体2E8；图27C来自小鼠抗体4E6；图27D来自小鼠抗体5G8；图27E来自小鼠抗体6B3，并且27F来自抗体MOR7480.1。
图28展示了4-1BB x FRα抗体构建体如通过流式细胞术所测量结合至293E细胞上所表达的FRα的能力。图28A展示了v23656、v23657、v23658、v23659以及v23660结合至细胞的能力；28B展示了v23661、v23662、v23663、v23664以及v23665结合至细胞的能力，并且28C展示了v23651、v17721以及IgG1结合至细胞的能力。
图29A展示了在使用FRα高IGROV1细胞或FRα低A549细胞的CD8+T细胞共培养分析中具有FRα互补位8K22的4-1BB x FRα抗体构建体刺激IFNγ产生的能力。图29B展示了在CD8+T细胞共培养分析中具有FRα互补位1H06的4-1BB x FRα抗体构建体刺激IFNγ产生的能力。图29C展示了在CD8+ T细胞共培养分析中单特异性4-1BB抗体v20022、v20036或v12592以及单特异性FRα抗体v17721刺激IFNγ产生的能力。
图30A和图30B分别展示了纯化的亲本嵌合8K22变体23820的UPLC-SEC和Caliper型态，而图30C和图30D分别展示了纯化的代表性人源化8K22变体23807的UPLC-SEC和Caliper型态。
图31A展示了上清液中的亲本嵌合8K22抗体v23820以及两个代表性人源化8K22抗体v23801和v23807的BLI传感器图。图31B展示了纯化之后亲本嵌合8K22抗体v23820以及两个代表性人源化8K22抗体v23801和v23807的BLI传感器图。
图32A展示了展现单一转变的纯化的代表性人源化8K22抗体的DSC热谱图。图32B展示了展现双态转变的纯化的代表性人源化8K22抗体的DSC热谱图。
图33A展示了纯化的代表性人源化8K22抗体v23801的LC/MS型态。图33B展示了纯化的代表性人源化8K22抗体v23807的LC/MS型态。
图34展示了具有8K22结合臂的抗体的DSC热谱图。
图35A展示了v29675的BLI传感器图；图35B展示了v29677的BLI传感器图；图35C展示了v29680的BLI传感器图。
图36展示了如实施例33中所描述而制备和测试的额外的4-1BB x FRα双特异性抗体的图示。
图37展示了在使用IGROV1细胞的原代T细胞:肿瘤细胞共培养分析中各种4-1BB xFRα双特异性抗体刺激IFNγ产生的能力。
图38A展示了在使用IGROV1细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38B展示了在使用A431细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38C展示了在使用HCC827细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38D展示了在使用OVKATE细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38E展示了在使用OVCAR3细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38F展示了在使用H661细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38G展示了在使用H441细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。图38H展示了在使用H1975细胞的NFκB报告基因分析中4-1BB x FRα双特异性抗体活化4-1BB的能力。
图39A展示了小鼠抗4-1BB互补位1C8结合至食蟹猴4-1BB的能力；图39D展示了人源化抗4-1BB互补位1C8结合至食蟹猴4-1BB的能力。图39B展示了小鼠抗4-1BB互补位1G1结合至食蟹猴4-1BB的能力；图39E展示了人源化抗4-1BB互补位1G1结合至食蟹猴4-1BB的能力。图39C展示了小鼠抗4-1BB互补位5G8结合至食蟹猴4-1BB的能力；图39F展示了人源化抗4-1BB互补位5G8结合至食蟹猴4-1BB的能力。
图40A示出了移植至人构架上的8K22的兔重链可变结构域CDR的序列；图40B示出了移植至人构架上的8K22的兔轻链可变结构域CDR的序列。根据Kabat对序列进行编号，并且使用AbM定义分配CDR并且通过“*”进行标识。
具体实施方式
本公开涉及特异性结合于4-1BB细胞外结构域(ECD)以及肿瘤相关抗原(TAA)的4-1BB x TAA抗体构建体。在一些实施方案中，TAA可为叶酸受体-α(FRα)、溶质载体家族34成员2(SLC34A2或NaPi2b)、HER2、间皮素(MSLN)或溶质载体家族39成员6(SLC39A6或LIV-1)。在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可能能够有条件地增强肿瘤内T细胞的活性。在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体能够促进4-1BB的条件性激动。在一些实施方案中，如通过细胞因子产生所测量，与单特异性、单价抗4-1BB抗体相比，4-1BB x TAA抗体构建体在存在表达TAA的细胞的情况下在活化T细胞上的4-1BB时可更有效。在一些实施方案中，与在存在以低水平表达TAA的肿瘤细胞的情况下相比，在存在以中等水平至高水平表达TAA的肿瘤细胞的情况下，4-1BB x TAA抗体构建体在活化T细胞上的4-1BB时可更有效。因此，在相关实施方案中，可使用4-1BB x TAA抗体构建体来治疗癌症。
本公开还提供了特异性结合4-1BB的抗体序列(抗4-1BB抗体序列)。可将这些抗4-1BB抗体序列用于制备结合至4-1BB的单特异性、双特异性或多特异性抗体构建体(4-1BB抗体构建体)。还可将这些单特异性、双特异性或多特异性4-1BB抗体构建体单独地或与其他抗癌疗法组合用于治疗癌症。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与所要求的主题所属领域技术人员通常所理解相同的含义。在关于本文中的术语存在多个定义的情况下，以此部分中的定义为准。在提到URL或其他此类标识符或地址的情况下，应了解此类标识符可变化并且在因特网上的特定信息可能过时，但可通过检索因特网发现等效信息。对它们的参考证明此类信息的可获得性和公共传播。
应了解，前述一般描述和以下具体实施方式仅为示例性和说明性的并且不限制所要求的任何主题。在本申请中，除非另外具体说明，否则单数的使用包括复数。
除非另外指出，否则在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所叙述范围内的任何整数和(适当时)其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)的值。除非另外指出，否则如本文所用，“约”意指所指示的范围、值、序列或结构±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。应了解，除非另外指出或由上下文指示，否则如本文所用的术语“一个”和“一种”是指“一个或多个(一种或多种)”所列举的组分。替代(例如“或”)的使用应理解为意指替代物中的一者、两者或它们的任何组合。
如本文所用，术语“包括”、“具有”、“含有”、“包含”以及其语法变化型式按同义使用。这些术语为包括性的或开放性的并且不排除额外的未列举的元件和/或方法步骤。术语“大体上由……组成”当在本文中结合组合物、用途或方法使用时，表示可存在额外的元件和/或方法步骤，但是这些添加不会在实质上影响所叙述的组成、方法或用途发挥功能的方式。术语“由……组成”当在本文中结合组合物、用途或方法使用时，排除存在额外的元件和/或方法步骤。本文描述为包括某些元件和/或步骤的组合物、用途或方法还可在某些实施方案中大体上由所述元件和/或步骤组成，并且在其他实施方案中由所述元件和/或步骤组成，无论是否特别提到这些实施方案。
还应了解，在一个实施方案中明确叙述一个特征作为在一个特定实施方案中排除所述特征的基础。举例来说，在给定实施方案或权利要求中存在一系列选择的情况下，应了解，可从列表中去除一个或多个选择并且缩短的列表可形成替代实施方案，无论是否特别提到此类替代实施方案。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被视为限制所描述的主题。本申请中所引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书、手册以及专著，在此出于任何目的明确地以全文引用的方式并入本文中。
应了解，本文所描述的方法和组合物不限于本文所描述的特定方法论、方案、细胞系、构建体以及试剂并且因此可变化。还应了解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本文所描述的方法和组合物的范围。
本文提到的所有出版物和专利出于描述和公开例如出版物中所描述的构建体和方法论的目的以全文引用的方式并入本文中，所述构建体和方法论可结合本文所描述的方法、组合物以及化合物使用。本文所论述的出版物被提供仅仅是由于其公开内容在本申请提交日期之前。不应将本文中的任何内容视为承认本文所描述的发明人无权借助于现有发明或由于任何其他原因而先于此类公开内容。
在本申请中，如蛋白质数据库(PDB)(www.pdb.org)所定义来使用氨基酸名称和原子名称(例如N、O、C等)，蛋白质数据库是基于IUPAC命名法(IUPAC Nomenclature andSymbolism for Amino Acids and Peptides(residue names,atom names etc.),Eur.J.Biochem.,138,9-37(1984)以及Eur.J.Biochem.,152,1(1985)中对它们的校正。术语“氨基酸残基”主要旨在指示由20种天然存在的氨基酸，即丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)以及酪氨酸(Tyr或Y)残基组成的组中所含的氨基酸残基。
除非本文中明确不同地定义，否则抗体技术领域技术人员所理解的术语各自被给予本领域中所获得的含义。已知抗体具有可变区、铰链区以及恒定结构域。在例如Harlow等编,Antibodies:A Laboratory Manual,第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,1988)中对免疫球蛋白结构和功能进行了综述。
如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。“抗体”是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因编码的多肽或其一个或多个片段，所述多肽或其一个或多个片段特异性结合分析物(抗原)。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε以及μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链归类为κ或λ。重链归类为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别确定免疫球蛋白同型IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。另外，抗体可属于许多亚型中的一者，例如人IgG可属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一条免疫球蛋白“轻”链(约25kD)和一条免疫球蛋白“重”链(约50-70kD)。此类型的免疫球蛋白或抗体结构单元被视为“天然存在的”或呈“天然存在的模式”。术语“轻链”包括全长轻链和其具有充足可变结构域序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变结构域VL和恒定结构域CL。轻链的可变结构域位于多肽的氨基端。轻链包括κ链和λ链。术语“重链”包括全长重链和其具有充足可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变结构域VH、铰链区以及恒定结构域CH1、CH2和CH3，任选包括CH4结构域。VH结构域位于多肽的氨基端，并且CH结构域位于羧基端，其中CH3(或CH4(若存在))结构域最靠近多肽的羧基端。重链可属于任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4亚类)、IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgM、IgD以及IgE。术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链中通常负责抗原识别的部分，典型地包括重链(VH)中氨基端大致120至130个氨基酸以及轻链(VL)中约100至110个氨基端氨基酸。
术语“抗原”、“免疫原”、“抗体靶标”、“靶分析物”以及类似术语在本文中用于指由抗体识别(即可由抗体特异性结合)的分子、化合物或复合物。所述术语可指可由抗体特异性识别的分子，例如多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、化学部分或它们的组合(例如磷酸化或糖基化多肽等)。本领域技术人员将了解所述术语不表明分子在每种背景中均具免疫原性，而是简单地表明它可由抗体靶向。
“抗原结合结构域”为抗体中能够特异性结合于表位或抗原的部分。抗体的表位结合功能或抗原结合功能可由呈天然存在的模式的抗体片段执行。抗原结合结构域的实例包括(i)Fab片段，由VH、VL、CH1以及CL结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，所述Fd片段由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，所述Fv片段由抗体的单一臂的VH和VL结构域组成，(v)sdAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546)，所述sdAb片段包含单一可变结构域；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。本文所描述的抗原结合结构域的示例性模式包括但不限于Fab、scFv、VHH或sdAb模式。此外，抗原结合结构域类型之间的转化方法为本领域中已知的(参见例如Zhou等(2012)Mol Cancer Ther 11:1167-1476中所描述的用于使scFv转化为Fab模式的方法)。因此，如果抗体以包括为scFv的抗原结合结构域的模式为可获得的，但理想的是抗体构建体包含呈Fab模式的抗原结合结构域，那么本领域技术人员将能够进行此类转化，并且反之亦然。
“Fab片段”(也称为抗原结合Fab模式片段)包括轻链的恒定结构域(CL)序列和重链的恒定结构域1(CH1)以及分别位于轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含CDR，CDR参与抗原结合。Fab′片段因在重链CH1结构域的C端增加几个氨基酸残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段。
“单链Fv”或“scFv”模式包括单一多肽链中抗体的VH和VL结构域。scFv多肽可任选还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York，第269页至第315页(1994)。
“单域抗体”或“sdAb”模式是指单一免疫球蛋白结构域。sdAb可例如来源于骆驼。骆驼抗体缺乏轻链并且其抗原结合位点由单域组成，称为“VHH”。sdAb包含形成抗原结合位点的三个CDR/高变环：CDR1、CDR2以及CDR3。sdAb相当稳定并且可以与抗体Fc区的融合物形式表达(参见例如Harmsen MM,De Haard HJ(2007)“Properties,production,andapplications of camelid single-domain antibody fragments,”Appl.MicrobiolBiotechnol.77(1):13-22)。
抗体结合至抗原上的“表位”。表位为抗原上由抗体识别和结合的局部位点。表位可包括几个氨基酸，例如5个或6个或更多个，例如20个或更多个氨基酸。在一些情况下，表位包括例如来自碳水化合物、核酸或脂质的非蛋白组分。在一些情况下，表位为三维部分。因此，举例来说，在靶标为蛋白质的情况下，表位可包含连续氨基酸，或来自通过蛋白质折叠带至附近的不同蛋白质部分的氨基酸(例如不连续表位)。对于其他类型的形成三维结构的靶分子同样如此。
可通过获得抗体:抗原复合物的X射线晶体结构来确定表位并且确定抗原上哪些残基在所关注的抗体上的残基的指定距离内，其中指定的距离为
Figure BDA0003013068510000161
或更小，例如
Figure BDA0003013068510000162
或更小，或其间的任何距离。在一些实施方案中，将表位定义为沿抗原序列的一段8个或更多个相邻氨基酸残基，其中至少50％、70％或85％的残基在X射线晶体结构中在抗体或结合蛋白的指定距离内。还可如由Glenn E.Morris ISBN-089603-375-9(1996)在“Epitope Mapping Protocols”(Methods in Molecular Biology)中以及由Olwyn M.R.Westwood,Frank C.Hay.(2001)在“Epitope Mapping:A PracticalApproach”Practical Approach Series,248中所详细描述的来进行由抗体识别的表位的定位。举例来说，可使用X射线共结晶学、低温电镜显微术、基于阵列的寡肽扫描、定点诱变定位、氢-氘交换、交联偶联质谱法来确定或定位表位。这些方法为本领域中熟知的。
如本文所用的术语“特异性结合”是指结合剂辩别发生结合的环境中的可能的配偶体的能力。结合剂可为例如抗体、抗体构建体或抗原结合结构域。当存在其他潜在靶标时与一种特定靶标相互作用的结合剂被认为“特异性地结合”至与它相互作用的靶标。在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂与其配偶体之间的缔合程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂竞争其配偶体与另一实体之间的替代相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过在一系列浓度下进行此类检测或测定来评估特异性结合。如本文关于抗原结合结构域、抗体或抗体构建体所用的术语“特异性结合”意味着抗原结合结构域、抗体或抗体构建体结合至其靶抗原而不结合至或不显著结合至其他抗原。
“互补决定区”或“CDR”为促成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“构架”区(FR)可帮助维持CDR的适当构象以促进抗原结合区与抗原之间的结合。在结构上，构架区可定位于抗体中的CDR之间。可变区典型地展现由三个高变区(也称为CDR)连接的相对保守的构架区(FR)的相同一般结构。来自重链和轻链的可变结构域的CDR典型地通过构架区排列，此可实现与特定表位的结合。从N端到C端，轻链与重链可变结构域均典型地包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。除非另外说明，否则将氨基酸分配至每种结构域典型地是根据免疫相关蛋白的Kabat序列的定义来进行(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987年和1991年))。典型地，在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链CDR和三个轻链CDR(或CDR区)。三个重链CDR在本文中称为HCDR1、HCDR2以及HCDR3，而三个轻链CDR称为LCDR1、LCDR2以及LCDR3。因此，如本文所用的“CDR”可指所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或所有重链CDR与所有轻链CDR(若适当))。CDR提供用于使抗体结合至抗原或表位的大部分接触残基。常常，需要三个重链CDR和三个轻链CDR来结合抗原。然而，在一些情况下，即使单一可变结构域也可赋予对抗原的结合特异性。此外，如本领域中已知，在一些情况下，还可通过选自VH和/或VL结构域的最少一个或多个CDR(例如HCDR3)的组合进行抗原结合。
CDR序列的许多不同定义为常用的，包括由Kabat等(1983,Sequences ofProteins of Immunological Interest,NIH出版号369-847,Bethesda,MD)、由Chothia等(1987,J Mol Biol,196:901-917)描述的那些定义以及IMGT、AbM(巴斯大学(Universityof Bath))以及Contact(MacCallum R.M.和Martin A.C.R.以及Thornton J.M,(1996),Journal of Molecular Biology,262(5),732-745)定义。举例来说，下表A中提供了根据Kabat、Chothia、IMGT、AbM以及Contact的CDR定义。因此，如本领域技术人员将轻易显而易知的，CDR的精确编号和位置可根据所采用的编号系统而有所不同。然而，应了解，本文中公开VH包括公开如已知编号系统中的任一者所定义的相关(固有)重链CDR(HCDR)。类似地，本文中公开VH包括公开如已知编号系统中的任一者所定义的相关(固有)重链CDR(HCDR)。
表A：常用CDR定义1
Figure BDA0003013068510000171
Figure BDA0003013068510000181
1除使用Chothia编号的Contact外，对于所有定义来说，可将Kabat或Chothia编号系统用于HCDR2、HCDR3以及轻链CDR
2使用Kabat编号。Kabat编号方案中区别Chothia和IMGT CDR-H1环的末端的位置根据环的长度而改变，因为Kabat在那些CDR定义外部在位置35A和35B处进行了插入。然而，使用Chothia编号可清楚地确定IMGT和Chothia CDR-H1环。使用Chothia编号的CDR-H1定义：Kabat H31-H35、Chothia H26-H32、AbM H26-H35、IMGT H26-H33、Contact H30-H35。
除非另外指出，否则在本说明书通篇中，根据Kabat方案对VH和VL序列中的氨基酸残基进行编号。
如本文所用的“嵌合抗体”是指氨基酸序列包括在第一物种中发现的VH和VL序列以及在不同于第一物种的第二物种中发现的恒定结构域序列的抗体。在许多实施方案中，嵌合抗体具有连接至人恒定结构域序列的鼠VH和VL序列。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者的高变区的残基由具有所需特异性、亲和力以及能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)(供给者抗体)的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由对应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体中或供给者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含至少一个并且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地为人免疫球蛋白的恒定区。其他细节参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
如本文所用的“CDR接枝抗体”或“CDR移植抗体”是指氨基酸序列包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列但VH和/或VL序列的CDR序列中的一者或多者的序列用另一物种的CDR序列置换的抗体，诸如小鼠VH和VL序列中的小鼠CDR中的一者或多者(例如HCDR3)已用人CDR序列置换的抗体。同样地，“CDR接枝抗体”还可指人VH和VL区中的人CDR中的一者或多者(例如CDR3)已用小鼠CDR序列置换的抗体。
如本文所用，当与不存在第一抗体的情况下第二抗体的结合相比在存在第一抗体的情况下第二抗体与靶标的结合可检测地降低时，第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分“竞争”结合至靶标。可能但不需要出现在存在第二抗体的情况下第一抗体与靶标的结合也可检测地降低的替代情况。换句话说，第二抗体可在第一抗体不抑制第二抗体结合至靶标的情况下抑制第一抗体结合至靶标。然而，在每种抗体在相同、更大或更低程度上可检测地抑制另一抗体结合至其同源表位或配体的情况下，所述抗体被认为彼此“交叉竞争”结合其一个或多个相应表位。本公开涵盖竞争与交叉竞争性抗体两者。如本领域技术人员可确定，术语“竞争”抗体可适用于第一或第二抗体。在一些情况下，竞争抗体(例如第一抗体)的存在使第二抗体与靶标的结合减少至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多中的任一者，例如使得在存在第一(竞争)抗体的情况下第二抗体与靶标的结合为不可检测的。
如本文所用的术语“解离常数(KD或Kd)”意在指特定配体-蛋白质相互作用的平衡解离常数。如本文所用，配体-蛋白质相互作用是指但不限于蛋白质-蛋白质相互作用或抗体-抗原相互作用。KD度量复合在一起的两种蛋白质(例如AB)可逆地解离为组成组分(A+B)的倾向，并且定义为解离的速率(也称为“解离速率(k解离)”)与缔合的速率(或“缔合速率(k缔合)”)的比率。因此，KD等于k解离/k缔合并且以摩尔浓度(M)表示。由此可见，KD越小，结合亲和力越强，并且因此KD降低指示亲和力增加。因此，KD为1mM指示与KD为1nM相比的弱结合亲和力。有时以作为KD或Kd的倒数的KA或Ka来度量亲和力。可使用本领域中充分确立的方法来测定抗原结合构建体的KD值。一种测定抗原结合构建体的KD的方法为通过使用表面等离子体共振(SPR)，典型地使用生物传感器系统，诸如
Figure BDA0003013068510000201
系统。等温滴定量热法(ITC)为可用于测量KD的另一种方法。还可使用OctetTM系统来测量抗体对靶抗原的亲和力。
如本文所用，术语“条件性激动”意在指4-1BB x TAA抗体构建体主要在免疫细胞(诸如T细胞或NK细胞)位于表达TAA的细胞附近时激动免疫细胞中的4-1BB活性的能力。在一个实施方案中，“条件性激动”是指4-1BB x TAA抗体构建体仅在免疫细胞位于表达TAA的细胞附近时激动免疫细胞中的4-1BB活性的能力。
如本文所用的术语“氨基酸修饰”包括但不限于氨基酸插入、缺失、取代、化学修饰、物理修饰以及重排。在一些实施方案中，氨基酸修饰为氨基酸取代。
可根据若干惯例对免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸残基进行编号，包括Kabat(如Kabat和Wu,1991；Kabat等,Sequences of proteins of immunological interest.第5版-US Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242,第647页(1991)中所描述)、IMGT(如Lefranc,M.-P.等
Figure BDA0003013068510000211
the international ImMunoGeneTicsinformation
Figure BDA0003013068510000212
Nucl.Acids Res,37,D1006-D1012(2009)以及Lefranc,M.-P.,IMGT,the International ImMunoGeneTics Information System,Cold Spring HarbProtoc.2011年6月1日；2011(6)中所阐述)、1JPT(如Katja Faelber,Daniel Kirchhofer,Leonard Presta,Robert F Kelley,Yves A Muller,The
Figure BDA0003013068510000213
resolution crystalstructures of tissue factor in complex with humanized fab d3h44 and of freehumanized fab d3h44:revisiting the solvation of antigen combining sites1,Journal of Molecular Biology,第313卷,第1期,第83页至第97页中所描述)以及EU(根据如EU抗体编号的Kabat参考中的EU索引(Edelman等,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85))。除非另外指出，否则本文中将Kabat编号用于VH、CH1、CL以及VL结构域。除非另外指出，否则本文中将EU编号用于CH3和CH2结构域以及铰链区。
抗体构建体
如本文所用的“抗体构建体”是指特异性结合于表位或抗原并且包括一个或多个免疫球蛋白结构特征的多肽或多肽集合。一般来说，抗体构建体为氨基酸序列包括抗原结合结构域所特有的元件(例如任选在存在一个或多个构架区的情况下，抗体轻链或可变区或其一个或多个互补决定区("CDR")，或抗体重链或可变区或其一个或多个CDR)的多肽或多肽集合。在一些实施方案中，抗体构建体为或包含呈天然存在的模式的抗体。在一些实施方案中，术语“抗体构建体”涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的蛋白质。在一些实施方案中，抗体构建体包含天然存在的抗体中包括至少一个抗原结合结构域的片段。在一些实施方案中，抗体构建体可还包含不是抗原结合结构域的结合结构域，例如靶蛋白的配体。
在特定实施方案中，“抗体构建体”涵盖具有显示与免疫球蛋白结合结构域的至少99％同一性的抗原结合结构域的多肽。在一些实施方案中，“抗体构建体”为具有显示与免疫球蛋白结合结构域(例如参考免疫球蛋白结合结构域)的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的结合结构域的任何多肽。“抗体构建体”可具有与在天然来源中发现的抗体(或其片段，例如其抗原结合片段)同一的氨基酸序列。抗体的“抗原结合片段”包括含有具有所需特异性的抗原结合结构域的抗体片段。因此，抗原结合片段包括抗体片段、抗体的衍生物、功能等效物以及同系物、人源化抗体，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的。还包括包含融合至另一多肽的免疫球蛋白结合结构域或等效物的嵌合分子。
抗体构建体可为单特异性、双特异性或多特异性的，并且可结合至至少一个独特的靶标、抗原或表位。可将抗体构建体制备成许多模式，并且图1和图2以及申请中别处描述了示例性抗体构建体模式。如本文所用的术语“抗体构建体”意在涵盖单特异性、双特异性或多特异性抗体构建体。“单特异性”抗体构建体为结合至一种靶标、抗原或表位的抗体构建体。单特异性抗体构建体可包含一个或多个抗原结合结构域，所述一个或多个抗原结合结构域各自结合至相同的表位。单特异性抗体构建体可为单价的(即仅具有一个臂或互补位)、二价的(即具有两个臂或互补位，两者结合至相同的表位)或多价的(即具有多个臂或互补位，全部结合至相同的表位)。“双特异性”抗体构建体为靶向两种不同的抗原或表位的抗体构建体。一般来说，双特异性抗体构建体可具有两个抗原结合结构域，不过在一些实施方案中，双特异性抗体构建体可具有超过两个抗原结合结构域，前提条件为抗原结合结构域识别不超过两种独特的表位。双特异性抗体构建体的两个或更多个抗原结合结构域将结合至两种不同的表位，这两种不同的表位可存在于相同或不同的分子靶标上。在两种不同的表位存在于相同的分子靶标上的情况下，本文中将双特异性抗体构建体称为“双互补位的”。在一些实施方案中，单特异性或双特异性抗体构建体呈天然存在的模式，本文中也称为全尺寸(FSA)模式。换句话说，在后面的实施方案中，单特异性或双特异性抗体构建体具有与天然存在的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体相同的模式。
多特异性抗体构建体可包括三个或更多个抗原结合结构域，所述三个或更多个抗原结合结构域各自能够结合至不同的靶标或表位。在一些实施方案中，多特异性抗体构建体包含与天然存在的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体相同的模式，但还包括一个或多个额外的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗体构建体可具有嵌合或人源化抗体所特有的结构元件或可具有来源于嵌合或人源化抗体的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体构建体可具有人抗体所特有的结构元件。
本文描述了能够结合至4-1BB的细胞外结构域(ECD)以及肿瘤相关抗原(TAA)的抗体构建体。本文还描述了包含特异性结合于4-1BB的ECD的序列的抗体构建体。
结合至4-1BB以及TAA的抗体构建体(4-1BB x TAA抗体构建体)
能够结合至4-1BB的ECD以及TAA的抗体构建体包含结合至4-1BB ECD的4-1BB结合结构域以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。因此，在某些实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体为结合至两种独特靶标的双特异性抗体构建体。在某些其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可为多特异性抗体构建体，其中4-1BB x TAA抗体构建体结合至4-1BB以及两种或更多种独特的TAA。在相关实施方案中，支架为Fc构建体。在某些实施方案中，支架为具有修饰的Fc构建体，所述修饰使其介导效应功能的能力降低。
在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体能够结合至表达4-1BB的细胞。在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体能够结合至癌细胞表面上所表达的TAA。在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体能够活化表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体能够使CD3刺激的T细胞活化增强。
4-1BB结合结构域
4-1BB(也称为TNFRSF9或CD137)为TNF受体超家族的成员。人4-1BB为255氨基酸蛋白(mRNA和多肽序列分别为登录号NM-001561和UniProt Q07011)。SEQ ID NO:79中提供了完整人4-1BB氨基酸序列。SEQ ID NO:1中所示的序列包括信号序列(氨基酸残基1-23)、细胞外结构域(ECD，氨基酸残基23-187)、跨膜区(氨基酸188至213)以及细胞内结构域(氨基酸214至255)(Bitra等J.Biol.Chem.(2018)293(26)9958-9969)。
4-1BB受体以单聚和二聚形式在细胞表面表达并且可能与4-1BB配体三聚化以允许信号传导。哺乳动物4-1BB蛋白的结构由显示与其他TNFR超家族成员的同源性的四个富含半胱氨酸的结构域(CRD)组成。CRD1由氨基酸24至45组成，并且小鼠与人4-1BB均缺乏在其他TNFR超家族成员中发现的二硫化物。CRD2和CRD3分别从氨基酸47延伸至86和从87延伸至118，并且为接触4-1BBL的结构域(Bitra等，同上)。CRD4包含氨基酸119至159并且随后为氨基酸160至氨基酸187处的跨膜结构域上所包含的短茎部区域(参考SEQ ID NO:79)。CRD1、CRD2、CRD3以及CDR4在本文中也分别称为结构域1、结构域2、结构域3以及结构域4。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含一个4-1BB结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可包含超过一个4-1BB结合结构域。在某些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含两个4-1BB结合结构域以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在相关实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含两个4-1BB结合结构域以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架，并且其中4-1BB结合结构域中的至少一者为4-1BB抗原结合结构域。在相关实施方案中，在4-1BB x TAA抗体构建体包含两个或更多个4-1BB抗原结合结构域的情况下，每个4-1BB抗原结合结构域可结合4-1BB的ECD的相同表位，或它们可结合至4-1BB的ECD的不同表位。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含为抗原结合结构域的4-1BB结合结构域以及TAA抗原结合结构域。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB的ECD的三个或更多个4-1BB结合结构域。在一个实施方案中，所述三个或更多个4-1BB结合结构域包括至少一个4-1BB抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述三个或更多个4-1BB结合结构域包括至少两个4-1BB抗原结合结构域。在后面的实施方案中，两个4-1BB抗原结合结构域可结合至4-1BB的相同表位，或它们可结合至4-1BB的不同表位。
4-1BB抗原结合结构域可呈scFv、Fab或sdAb模式。因此，在一个实施方案中，4-1BBx TAA抗体构建体的4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式。在替代实施方案中，4-1BB抗原结合结构域呈scFv模式。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含超过一个4-1BB抗原结合结构域，其中至少一个4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式。在4-1BB x TAA包含超过一个4-1BB抗原结合结构域的其他实施方案中，抗原结合结构域中的至少两者呈Fab模式。
4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB的ECD的4-1BB结合结构域。在某些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可结合至人4-1BB的ECD的4-1BB结合结构域。适合的4-1BB结合结构域包括天然存在的分子，诸如配体或其4-1BB结合片段。此类分子的实例包括4-1BB配体(例如参见NP_003802.1)，也称为TNFSF9或CD137L。因此，在一个实施方案中，抗体构建体包含结合至4-1BB配体的4-1BB结合结构域以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
如上文所指出，在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含为抗原结合结构域的4-1BB结合结构域。可从结合至4-1BB的ECD的抗体的序列构建抗原结合结构域。适合的抗体包括本领域中已知的可商购获得的那些抗体或者根据本领域中熟知的和本文所描述的方法鉴定和制备那些抗体。可从小鼠、人、人源化或嵌合抗4-1BB抗体构建4-1BB抗原结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB抗原结合结构域来源于激动性抗4-1BB抗体。激动性抗4-1BB抗体结合至4-1BB并且能够刺激4-1BB信号传导活性。4-1BB信号传导活性是指可由4-1BB在体外或体内展现的活性中的至少一者。举例来说，这些活性可包括刺激细胞因子从T或NK细胞释放，或增加由T或NK细胞引起的代谢活性或增强由T或NK细胞引起的细胞毒性活性。
结合人4-1BB的许多抗体为本领域中已知的，例如并且不限于乌托米单抗(在WO2012/032433，Pfizer中描述)、乌瑞鲁单抗(在WO2004/010947和WO2005/035584，BMS中描述)以及WO2018/156740(Macrogenics)、US 8,337,850(Pfizer)、US 2018/0258177(Eutilex)WO2017/077085(Cancer Research Technologies)以及WO2006126835(University of Ulsan)中所描述的抗体。乌瑞鲁单抗和乌托米单抗为示例性激动性抗4-1BB抗体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与前一段中所描述的抗体中的一者竞争结合至4-1BB ECD的表位的4-1BB抗原结合结构域。在一个实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含可与乌托米单抗竞争结合至4-1BB ECD的表位的4-1BB抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与乌瑞鲁单抗竞争结合至4-1BBECD的表位的4-1BB抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与US 8,337,850中所描述的抗4-1BB抗体竞争结合至4-1BB ECD的表位的4-1BB抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与US 2018/0258177中所描述的抗4-1BB抗体竞争结合至4-1BB ECD的表位的4-1BB抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与WO2018/156740中所描述的抗4-1BB抗体竞争结合至4-1BBECD的表位的4-1BB抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与乌托米单抗或乌瑞鲁单抗或者US 8,337,850、US 2018/0258177或WO2018/156740中所描述的抗4-1BB抗体中的任一者结合至4-1BB ECD的相同表位的4-1BB抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至除结构域3或结构域4外的4-1BB ECD的4-1BB抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至至少部分在成熟4-1BB蛋白(SEQ ID NO:79)的氨基酸残基24-85内的表位的4-1BB抗原结合结构域。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB的结构域1的4-1BB抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB的结构域2的4-1BB抗原结合结构域。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB的结构域3的4-1BB抗原结合结构域。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB的结构域4的4-1BB抗原结合结构域。
在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至人和食蟹猴4-1BB的ECD的4-1BB抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含乌瑞鲁单抗、乌托米单抗或者US 8,337,850、US 2018/0258177或WO2018/156740中所描述的抗4-1BB抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR和/或至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在一个替代实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含乌瑞鲁单抗、乌托米单抗或者US 8,337,850、US 2018/0258177或WO2018/156740中所描述的抗4-1BB抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR以及至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在其他实施方案中，4-1BB x TAA构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与乌瑞鲁单抗、乌托米单抗或者US 8,337,850、US 2018/0258177或WO2018/156740中所描述的抗4-1BB抗体中的任一者的VH序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。表15中分别以SEQ ID NO:71和72形式提供MOR7480.1(US 8,337,850中所描述的抗体中的一者)的特定VH和VL序列。下表B中提供了MOR7480.1的CDR。上文所描述的其他4-1BB抗原结合结构域的VH、VL以及CDR序列可由本领域技术人员参考US 8,337,850、US 2018/0258177、WO2018/156740 WO2004/010947、WO2005/035584、US 2018/0258177、WO2017/077085或WO2006126835的公开内容容易地确定。
表B：MOR7480.1 CDR
Figure BDA0003013068510000281
Figure BDA0003013068510000291
下文和表13中描述了结合4-1BB的抗体的额外的VH、VL以及CDR序列；这些抗体被标识为1B2、1C3、1C8、1G1、2A7、2E8、2H9、3D7、3H1、3E7、3G4、4B11、4E6、4F9、4G10、5E2、5G8以及6B3。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体1B2、1C3、1C8、1G1、2A7、2E8、2H9、3D7、3H1、3E7、3G4、4B11、4E6、4F9、4G10、5E2、5G8或6B3中的任一者的VH序列和VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列和VL序列。在一个实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体1B2的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体1B2的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体1C3的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体1C3的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体1C8的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体1C8的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体1G1的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体1G1的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体2A7的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体2A7的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体2E8的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体2E8的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体2H9的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的VH序列同一以及与如表13中所列的抗体2H9的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体3D7的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体3D7的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体3H1的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体3H1的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体3E7的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体3E7的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体3G4的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体3G4的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体4B11的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体4B11的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体4E6的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体4E6的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体4F9的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体4F9的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体4G10的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体4G10的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体5E2的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体5E2的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体5G8的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体5G8的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含与如表13中所列的抗体6B3的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与如表13中所列的抗体6B3的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含表13中所列的抗体中的一者的重链CDR和轻链CDR。在表18中可找到这些抗体的CDR。在相关实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含表13中所描述的抗体1C3、1C8、1G1、2E8、3E7、4E6、5G8或6B3中的任一者的重链CDR和轻链CDR。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含抗体1B2、1C3、1C8、1G1、2A7、2E8、2H9、3D7、3H1、3E7、3G4、4B11、4E6、4F9、4G10、5E2、5G8或6B3中的任一者的人源化VH序列和人源化VL序列。表14中描述了若干示例性人源化VH和VL序列并且已用于构建包含抗4-1BB抗体1C8、1G1以及5G8的基于小鼠VH和VL序列的人源化VH和VL序列的若干4-1BB抗体构建体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含抗体1C8的人源化VH序列和人源化VL序列。在一个相关实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28726的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28726的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28727的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28727的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28728的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28728的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28730的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28730的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含抗体1G1的人源化VH序列和人源化VL序列。在一个相关实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28683的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28683的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28684的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28684的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28685的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28685的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28686的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28686的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28687的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28687的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28688的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28688的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28689的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28689的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28690的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28690的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含与v28691的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28691的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BBx TAA抗体构建体包含与v28692的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28692的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28693的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28693的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28694的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28694的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含抗体5C8的人源化VH序列和人源化VL序列。在一个相关实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28700的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28700的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28704的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28704的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28705的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28705的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含与v28706的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28706的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28711的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28711的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28712的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28712的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28713的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28713的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28696的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28696的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含与v28697的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28697的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BBx TAA抗体构建体包含与v28698的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28698的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28701的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28701的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28702的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28702的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28703的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28703的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与v28707的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列，以及与变体28707的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含人源化抗体v28726、v28727、v28728、v28730、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694以及v28695中的任一者的重链CDR和轻链CDR。在表18中可找到这些抗体的CDR。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域和TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架，并且4-1BB抗原结合结构域包含v28726、v28727、v28728、v28730、v20022、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v20036、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v20023、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694以及v28695的一个、两个或三个重链CDR和/或一个、两个或三个轻链CDR。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含能够结合至人4-1BB的ECD并且具食蟹猴交叉反应性的4-1BB结合结构域。如本文所用的术语“食蟹猴交叉反应性”意在描述结合至来自一个物种(例如人或小鼠)的靶标并且也能够结合至在食蟹猴中表达的相同靶标的结合结构域。在一些实施方案中，抗体构建体包含可结合至小鼠4-1BB的ECD的4-1BB结合结构域。
TAA和TAA抗原结合结构域
本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BBECD)的4-1BB结合结构域以及结合至TAA的肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在一些实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含直接或间接连接至支架的第一TAA抗原结合结构域和第二TAA抗原结合结构域。
如本文所用，“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指由癌细胞表达的抗原。肿瘤相关抗原可能由或可能不由正常细胞(非肿瘤细胞)表达。当TAA不由正常细胞表达时(即当它为肿瘤细胞特有时)，它也可被称为“肿瘤特异性抗原”。当TAA不为肿瘤细胞特有时，它在未能诱导对抗原的免疫耐受性状态的条件下也在正常细胞上表达。肿瘤上抗原的表达可发生在使免疫系统能够对抗原作出反应的条件下。TAA可为通常以低水平存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上以较高水平表达的抗原。临床最受关注的那些TAA为与对应正常组织相比差异表达的并且允许特定T细胞或免疫球蛋白优先识别肿瘤细胞。在一些实施方案中，TAA可为膜结合抗原，或定位在肿瘤细胞的表面的抗原。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至在肿瘤细胞中以高水平表达的TAA的TAA抗原结合结构域。举例来说，肿瘤细胞可以每个细胞大于约1百万个拷贝表达TAA。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至在肿瘤细胞中以中等水平表达的TAA的至少一个TAA抗原结合结构域。举例来说，肿瘤细胞可以每个细胞大于约100,000至约1百万个拷贝表达TAA。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至在肿瘤细胞中以低水平表达的TAA的至少一个TAA抗原结合结构域。举例来说，肿瘤细胞可以每个细胞小于约100,000个拷贝表达TAA。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体结合至与正常细胞上相比在肿瘤细胞上以更高水平表达的TAA。
在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体结合至在乳腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、皮肤癌细胞、膀胱癌细胞、淋巴瘤或白血病细胞、肾癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、食管癌细胞、前列腺癌细胞、甲状腺癌细胞或其他非肝癌细胞上表达的TAA。
4-1BB x TAA抗体构建体可包含不同数目的TAA抗原结合结构域。因此，在某些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在其他实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含两个4-1BB结合结构域和一个TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含一个或多个4-1BB结合结构域以及两个TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在相关实施方案中，在抗体构建体包含两个或更多个TAA抗原结合结构域的情况下，每个TAA抗原结合结构域可结合至一个TAA的相同表位，或结合至相同TAA的不同表位，或结合至不同TAA。
TAA抗原结合结构域可呈scFv、Fab或sdAb模式。因此，在一个实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体的TAA抗原结合结构域呈Fab模式。在替代实施方案中，TAA抗原结合结构域呈scFv模式。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含超过一个TAA抗原结合结构域，其中至少一个TAA抗原结合结构域呈scFv模式。在4-1BB x TAA包含超过一个TAA抗原结合结构域的其他实施方案中，抗原结合结构域中的至少两者呈scFv模式。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含TAA抗原结合结构域，所述TAA抗原结合结构域结合至选自但不限于以下的TAA：碳酸酐酶IX、甲胎蛋白(AFP)、α-放线素-4、A3、对A33抗体具特异性的抗原、ALK(间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶)、ART-4、B7、B7-H4、Ba733、BAGE、BCMA、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD171、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CSF1R、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1a、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA、CEACAM5、CEACAM6、c-Met、DAM、DL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、EphA2、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GD2、gp100、GPC3、GRO-13、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺素(HCG)和其亚单元、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-X、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL13Rα2、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞移行抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、mCRP、MCP-1、黑素瘤糖蛋白、间皮素、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NaPi2B、NCA66、NCA95、NCA90、NY-ESO-1、PAM4抗原、胰腺癌粘蛋白、PD-1、PD-1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、ROR1、T101、SAGE、5100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAG-3、TRAIL受体、TGFβ、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-佛莱登瑞奇抗原(Thomson-Friedenreich antigen)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、致癌基因标记物以及致癌基因产物(参见例如Sensi等,Clin Cancer Res 2006,12:5023-32；Parmiani等,J Immunol 2007,178:1975-79；Novellino等Cancer ImmunolImmunother2005,54:187-207)。
在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)的4-1BB结合结构域以及结合至叶酸受体(FRα)的TAA抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BBECD)的4-1BB结合结构域以及结合至溶质载体家族34成员2(SLC34A2、NaPi2b)的肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)的4-1BB结合结构域以及结合至HER2的肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)的4-1BB结合结构域以及结合至间皮素的肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BBECD)4-1BB结合结构域以及结合至溶质载体家族39成员6(SLC3A6、LIV-1)的肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
可从针对TAA的已知抗体的序列构建TAA抗原结合结构域。许多此类抗体为本领域中已知的并且可在商业上从许多来源获得。举例来说，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas,Va.)获得多种抗体分泌杂交瘤株。此外，针对各种TAA的许多抗体已保藏在ATCC和/或具有已公布的可变结构域序列并且可用于制备抗体构建体的TAA抗原结合结构域。熟练技工将了解，可通过简单检索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库获得针对各种TAA的抗体序列或抗体分泌杂交瘤。或者，可根据本领域中已知并且在本文别处描述的方法来产生特异性结合于所需TAA的抗体。
FRα抗原结合结构域
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体为包含4-1BB抗原结合结构域和FRα抗原结合结构域的4-1BB x FRα抗体构建体，其中4-1BB结合结构域和FRα抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
FRα为用以结合叶酸并且将5-甲基四氢叶酸盐转运至细胞中的叶酸受体家族成员。FRα也称为叶酸受体1、FOLR、FOLR1、FBP或MOv18并且在正常细胞和肿瘤细胞中表达为所分泌的蛋白质，所述所分泌的蛋白质以可溶性形式存在并且通过糖苷基-磷脂酰肌醇(GPI)键联锚定至细胞膜。Cheung等(2016)Oncotarget 7:52553-52574中进一步描述了FRα。基因库登录号AAB05827.1和UniProt P15328中描述了此蛋白质的多肽序列，并且在此以SEQ IDNO:80形式提供。
FRα抗原结合结构域可来源于本领域中已知的抗FRα抗体，包括但不限于：法勒珠单抗(farletuzumab)(Morphotek，在WO2004/003388和WO2005/080431中描述)、米罗维妥昔单抗(mirvetuximab)(ImmunoGen，在WO2011106528中描述)。US 8,388,972(AdvancedAccelerator Applications)、WO2018/098277(Eisai R&D Management Co.)、US 9,695,237(Kyowa Hakko Kirin Co.)、WO2015/196167(Bioalliance)、WO2016/079076(Roche)以及WO2018/071597(Sutro)中描述了其他抗FRα抗体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与法勒珠单抗竞争结合至FRα的表位的FRα抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与米罗维妥昔单抗竞争结合至FRα的表位的FRα抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与US 8,388,972、WO2018/098277、US 9,695,237、WO2015/196167、WO2016/079076或WO2018/071597中所描述的抗FRα抗体中的任一者竞争结合于FRα的表位的FRα抗原结合结构域。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与法勒珠单抗或米罗维妥昔单抗或者US 8,388,972、WO2018/098277、US 9,695,237、WO2015/196167、WO2016/079076或WO2018/071597中所描述的FRα抗体中的任一者结合至FRα的相同表位的FRα抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含FRα抗原结合结构域，所述FRα抗原结合结构域包含法勒珠单抗、米罗维妥昔单抗或者US 8,388,972、WO2018/098277、US9,695,237、WO2015/196167、WO2016/079076或WO2018/071597中所描述的抗FRα抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR和/或至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在一个替代实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含FRα抗原结合结构域，所述FRα抗原结合结构域包含法勒珠单抗、米罗维妥昔单抗或者US 8,388,972、WO2018/098277、US 9,695,237、WO2015/196167、WO2016/079076或WO2018/071597中所描述的抗FRα抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR以及至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在其他实施方案中，4-1BB x TAA构建体包含FRα抗原结合结构域，所述FRα抗原结合结构域包含与法勒珠单抗、米罗维妥昔单抗或者US 8,388,972、WO2018/098277、US 9,695,237、WO2015/196167、WO2016/079076或WO2018/071597中所描述的抗FRα抗体中的任一者的VH序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。表C中描述了米罗维妥昔单抗和法勒珠单抗的CDR的特定序列并且表17中提供了这些抗体的VH和VL序列；其他可由本领域技术人员参考US 8,388,972、WO2018/098277、US 9,695,237、WO2015/196167、WO2016/079076或WO2018/071597的公开内容容易地确定。
表C：示例性抗FRα抗体的CDR序列
Figure BDA0003013068510000431
Figure BDA0003013068510000441
或者，FRα抗原结合结构域可来源于根据本领域中已知的方法产生的新颖抗体。
表17中提供了额外的抗FRα抗体VH和VL序列。在一个实施方案中，4-1BB x FRα抗体构建体包含FRα抗原结合结构域，所述FRα抗原结合结构域具有与抗体8K22或1H06的VH序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH序列以及与抗体8K22或1H06的VL序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL序列。表18中提供了这些抗体的CDR。在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含抗体8K22或1H06的重链CDR和轻链CDR。
在一个实施方案中，4-1BB x FRα抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含人源化抗体v28726、v28727、v28728、v28730、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694、以及v28695中的任一者的CDR；以及连接至支架的FRα抗原结合结构域。在一个实施方案中，4-1BB xFRα抗体构建体包含4-1BB抗原结合结构域，所述4-1BB抗原结合结构域包含人源化抗体v28726、v28727、v28728、v28730、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694以及v28695中的任一者的CDR；以及包含8K22或1H06的CDR的FRα抗原结合结构域。
SLC34A2/NaPi2b抗原结合结构域
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体为包含4-1BB抗原结合结构域和NaPi2b抗原结合结构域的4-1BB x NaPi2b抗体构建体，其中4-1BB结合结构域和NaPi2b抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
SLC34A2为pH敏感性钠依赖性磷酸盐转运体。此蛋白质也称为NaPi2b以及NAPI-3B、NAPI-IIb、NPTIIb，它在肺、肠道以及乳腺中的一些正常上皮细胞中表达并且在转运磷酸盐离子中发挥作用。NaPi2b被发现主要在肺和卵巢癌中在肿瘤细胞上高度表达(Lin K等,Clin Cancer Res.2015年11月15日；21(22):5139-50)。NaPi2b为具有14、129、57以及6个氨基酸的细胞外结构域的多跨膜蛋白。NCBI参考序列：NP_001171470.1和UniProtO95436中描述了此蛋白质的多肽序列，并且在本文中以SEQ ID NO:81形式提供。
NaPi2b抗原结合结构域可来源于本领域中已知的抗体，包括但不限于：利法珠单抗(lifastuzumab)(Genentech,Seattle Genetics，在WO2011/066503中描述)、MX-35(Ludwig Institute，在WO2009/097128中描述)以及在US2017/0266311中由MersanaTherapeutics描述的抗体。或者，NaPi2b抗原结合结构域可来源于根据本领域中已知以及本文中别处描述的方法产生的新颖抗体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与利法珠单抗竞争结合至NaPi2b的表位的NaPi2b抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与MX-35竞争结合至NaPi2b的表位的NaPi2b抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BBx TAA抗体构建体包含可与WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311中所描述的抗NaPi2b抗体中的任一者竞争结合于NaPi2b的表位的NaPi2b抗原结合结构域。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与利法珠单抗或MX-35或者WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311中所描述的抗NaPi2b抗体中的任一者结合至NaPi2b的相同表位的NaPi2b抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含NaPi2b抗原结合结构域，所述NaPi2b抗原结合结构域包含利法珠单抗或MX-35或者WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311中所描述的抗NaPi2b抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR和/或至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在一个替代实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含NaPi2b抗原结合结构域，所述NaPi2b抗原结合结构域包含利法珠单抗或MX-35或者WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311中所描述的抗NaPi2b抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR以及至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在其他实施方案中，4-1BB x TAA构建体包含NaPi2b抗原结合结构域，所述NaPi2b抗原结合结构域包含与利法珠单抗或MX-35或者WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311中所描述的抗NaPi2b抗体中的任一者的VH序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。表D中描述了示例性抗NaPi2b抗体的CDR的特定序列；在表17中找到这些抗体的VH和VL序列。其他抗NaPi2b抗体序列可由本领域技术人员参考WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311的公开内容容易地确定。
表D：示例性抗NaPi2b抗体的CDR序列
Figure BDA0003013068510000461
Figure BDA0003013068510000471
或者，NaPi2b抗原结合结构域可来源于根据本领域中已知的方法产生的新颖抗体。
HER2抗原结合结构域
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体为包含4-1BB抗原结合结构域和HER2抗原结合结构域的4-1BB x HER2抗体构建体，其中4-1BB结合结构域和HER2抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
HER2(也称为ErbB2)为属于人表皮生长因子受体(HER)家族的受体蛋白酪氨酸激酶，HER家族包括EGFR、HER2、HER3以及HER4受体。HER2的细胞外(ecto)结构域包含四个结构域：结构域I(ECD1，氨基酸残基约1-195)、结构域II(ECD2，氨基酸残基约196-319)、结构域III(ECD3，氨基酸残基约320-488)以及结构域IV(ECD4，氨基酸残基约489-630)(在不存在信号肽的情况下的残基编号)。参见Garrett等Mol.Cell.11:495-505(2003)；Cho等Nature421:756-760(2003)；Franklin等Cancer Cell 5:317-328(2004)；Tse等Cancer TreatRev.2012年4月；38(2):133-42(2012)；或Plowman等Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。UniProt P04626中描述了HER2的多肽序列并且以SEQ ID NO:82包括在本文中。
HER2抗原结合结构域可来源于本领域中已知的抗体，包括但不限于：曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech，例如在US 5,821,337和US 6,528,624中描述)，或帕妥珠单抗(pertuzumab)(Genentech，US 7,862,217)。线上治疗剂抗体数据库(Tabs，由CraicComputing LLC代管，tabs.craic.com)列出了提供适合用于制备4-1BB x TAA抗体构建体的抗HER2抗原结合结构域的序列的许多额外的抗HER2抗体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与曲妥珠单抗竞争结合至HER2的表位的HER2抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与帕妥珠单抗竞争结合至HER2的表位的HER2抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BBxTAA抗体构建体包含可与US 5,821,337、US 6,528,624或US 7,862,217中所描述的抗HER2抗体中的任一者竞争结合于HER2的表位的HER2抗原结合结构域。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或者US 5,821,337、US 6,528,624或US 7,862,217中所描述的抗HER2抗体中的任一者结合至HER2的相同表位的HER2抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含HER2抗原结合结构域，所述HER2抗原结合结构域包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或马格妥昔单抗(margetuximab)或者US 5,821,337、US 6,528,624或US 7,862,217中所描述的抗HER2抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR和/或至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在一个替代实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含HER2抗原结合结构域，所述HER2抗原结合结构域包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或马格妥昔单抗或者US 5,821,337、US 6,528,624或US 7,862,217中所描述的抗HER2抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR以及至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在其他实施方案中，4-1BB x TAA构建体包含HER2抗原结合结构域，所述HER2抗原结合结构域包含与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或马格妥昔单抗或者US 5,821,337、US 6,528,624或US 7,862,217中所描述的抗HER2抗体中的任一者的VH序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。表E中描述了示例性抗HER2抗体的CDR的特定序列；在表17中找到这些抗体的VH和VL序列。其他抗HER2抗体序列可由本领域技术人员至少参考WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311的公开内容容易地确定。
表E：示例性抗HER2抗体的CDR序列
Figure BDA0003013068510000491
或者，HER2抗原结合结构域可来源于根据本领域中已知的方法产生的新颖抗体。
SLC39A6/LIV-1抗原结合结构域
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体为包含4-1BB抗原结合结构域和LIV-1抗原结合结构域的4-1BB x LIV-1抗体构建体，其中4-1BB结合结构域和LIV-1抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
SLC39A6也称为LIV-1或ZIP6，属于充当锌转运体的蛋白质家族。它在全身的正常细胞上以低水平表达，但在一些肿瘤细胞上以高水平表达，特别是乳腺癌(Takatani-Nakase等,(2016)Biomed Res Clin Prac 1:71-75)。UniProt登录号Q13433中描述了LIV-1的多肽序列并且以SEQ ID NO:83形式包括在本文中。
LIV-1抗原结合结构域可来源于本领域中已知的抗体，包括但不限于WO 2012/078688(Seattle Genetics)、WO 2004/067564(Abbvie)以及WO 2001/055178(Genentech)中所描述的那些抗体。US2008/0175839中描述了结合至LIV-1的其他抗体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与WO 2012/078688、WO 2004/067564、WO 2001/055178或US2008/0175839中所描述的抗体中的任一者竞争结合于LIV-1的表位的LIV-1抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含可与WO2012/078688、WO 2004/067564、WO 2001/055178或US2008/0175839中所描述的抗LIV-1抗体中的任一者竞争结合于LIV-1的表位的LIV-1。
在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与WO 2012/078688、WO 2004/067564、WO 2001/055178或US2008/0175839中所描述的抗LIV-1抗体中的任一者结合至LIV-1的相同表位的LIV-1抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含LIV-1抗原结合结构域，所述LIV-1抗原结合结构域包含WO 2012/078688、WO 2004/067564、WO 2001/055178或US2008/0175839中所描述的抗LIV-1抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR和/或至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在一个替代实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体包含LIV-1抗原结合结构域，所述LIV-1抗原结合结构域包含WO 2012/078688、WO 2004/067564、WO 2001/055178或US2008/0175839中所描述的抗LIV-1抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR以及至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在其他实施方案中，4-1BB xTAA构建体包含LIV-1抗原结合结构域，所述LIV-1抗原结合结构域包含与WO 2012/078688、WO 2004/067564、WO 2001/055178或US2008/0175839中所描述的抗LIV-1抗体中的任一者的VH序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。WO2011/066503、WO2009/097128或US2017/0266311的公开内容中描述了示例性抗LIV-1抗体的CDR、VH以及VL的特定序列。
或者，LIV-1抗原结合结构域可来源于根据本领域中已知以及本文中别处描述的方法产生的新颖抗体。
间皮素(MSLN)抗原结合结构域
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体为包含4-1BB抗原结合结构域和MSLN抗原结合结构域的4-1BB x MSLN抗体构建体，其中4-1BB结合结构域和MSLN抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
间皮素(MSLN)也被称为CAK抗原或前巨核细胞强化因子(Pre-pro-megakaryocyte-potentiating factor)，它在正常肺间皮细胞中表达并且以低水平在其他正常器官中表达。间皮素在卵巢癌和肺癌中以高水平表达。UniProt登录号Q13421中描述了间皮素的多肽序列并且以SEQ ID NO:84形式包括在本文中。
MSLN抗原结合结构域可来源于本领域中已知的抗MSLN抗体，包括但不限于：安妥单抗(anetumab)(Bayer，在WO2009/068204中描述)、6A4/BMS-986148(BMS，在WO2009/045957中描述)或WO2018/060480中所描述的Mab Designs抗MSLN抗体。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与安妥单抗竞争结合至MSLN的MSLN抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与6A4/BMS-986148竞争结合至MSLN的MSLN抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含与Mab Designs抗MSLN抗体竞争结合至MSLN的MSLN抗原结合结构域。
在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至与安妥单抗结合至MSLN相同的表位的MSLN抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至与6A4/BMS-986148结合至MSLN相同的表位的MSLN抗原结合结构域。在另一实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至与Mab Designs抗MSLN抗体结合至MSLN相同的表位的MSLN抗原结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含MSLN抗原结合结构域，所述MSLN抗原结合结构域包含WO2009/068204、WO2009/045957或WO2018/060480中所描述的抗MSLN抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR和/或至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在一个替代实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含MSLN抗原结合结构域，所述MSLN抗原结合结构域包含WO2009/068204、WO2009/045957或WO2018/060480中所描述的抗MSLN抗体中的任一者的至少一个、两个或所有三个重链CDR以及至少一个、两个或所有三个轻链CDR。在其他实施方案中，4-1BB x TAA构建体包含MSLN抗原结合结构域，所述MSLN抗原结合结构域包含与WO2009/068204、WO2009/045957或WO2018/060480中所描述的抗MSLN抗体中的任一者的VH序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。表F中描述了示例性抗MSLN抗体的CDR的特定序列；在表17中找到这些抗体的VH和VL序列。其他抗MSLN抗体序列可由本领域技术人员参考WO2009/068204、WO2009/045957或WO2018/060480的公开内容容易地确定。
表F：示例性抗MSLN抗体RG7787的CDR序列
Figure BDA0003013068510000531
支架
如本文所描述，4-1BB x TAA抗体构建体包含结合至4-1BB ECD的4-1BB结合结构域以及TAA抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。当这些结构域中的每一者在没有接头的情况下直接连接至支架时产生4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域的直接连接。因此，在一个实施方案中，4-1BB结合结构域在没有接头的情况下连接至支架并且TAA抗原结合结构域也在没有接头的情况下连接至支架。实现直接连接的方法为本领域中已知的并且包括例如重组DNA方法和/或化学缀合。
可通过使用接头将4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域中的一者或两者连接至支架来实现间接连接。因此，在一个实施方案中，将4-1BB结合结构域用接头连接至支架并且也将TAA抗原结合结构域用接头连接至支架。在其他实施方案中，将4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域中的一者用接头连接至支架并且将另一者在没有接头的情况下直接连接至支架。在其他实施方案中，将4-1BB结合结构域用接头连接至支架，并且将TAA抗原结合结构域用接头连接至4-1BB结合结构域。在后面的实施方案中，认为TAA抗原结合结构域间接连接至支架。在一个替代实施方案中，将TAA抗原结合结构域用接头连接至支架，并且将4-1BB结合结构域用接头连接至TAA抗原结合结构域。在后面的实施方案中，认为4-1BB结合结构域间接连接至支架。
接头和接头多肽
如上文所指出，在一些实施方案中，通过使用接头来实现4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域间接连接至支架。接头可为接头肽、接头多肽或非多肽接头。在一些实施方案中，本文所描述的抗体构建体包括4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域，所述4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域各自可操作地连接至接头多肽，其中接头多肽能够彼此形成复合物或界面。在一些实施方案中，接头多肽能够彼此形成共价键。具有接头多肽的构建体的空间构象类似于通过木瓜蛋白酶消化产生的F(ab')2片段的互补位的相对空间构象，尽管是在抗体构建体具有两个抗原结合结构域背景下。
在一个实施方案中，接头多肽选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区。
在一些实施方案中，选择接头多肽，使得它们维持F(ab’)片段的互补位的相对空间构象并且能够形成等效于IgG的核心铰链中的二硫键的共价键。适合的接头多肽包括IgG铰链区，诸如来自IgG1、IgG2或IgG4那些IgG铰链区。还可使用这些示例性接头的修饰型式。举例来说，用于改善IgG4铰链的稳定性的修饰为本领域中已知的(参见例如Labrijn等(2009)Nature Biotechnology 27,767-771)。
许多适合的支架为本领域中已知的，包括肽、多肽、聚合物、纳米粒子或其他化学实体。在一个实施方案中，支架为Fc构建体。基于替代蛋白质或分子结构域的许多支架为本领域中已知的并且可用于形成两种不同的靶标结合多肽的选择性配对。此类替代结构域的实例包括国际专利公布号WO2008/097817所描述的粘连蛋白-锚定蛋白支架，以及WO 2012/116453和WO 2014/012082中所描述的分离白蛋白支架。另一实例为一起选择性配对的亮氨酸拉链结构域，诸如Fos和Jun[S A Kostelny等J Immunol 1992 148:1547-53；BerndJ.Wranik等J.Biol.Chem.2012 287:43331-43339]。或者，还可采用其他选择性配对分子对，诸如芽孢杆菌rna酶-芽胞杆菌rna酶抑制剂对(barnase barstar pair)[Deyev等(2003).Nat Biotechnol 21,1486-1492]，或分离荧光蛋白对[WO 2011135040]。
在其他实施方案中，接头多肽可操作地连接至不是Fc的支架。基于替代蛋白质或分子结构域的许多支架为本领域中已知的并且可用于形成两种不同的靶标结合多肽的选择性配对。此类替代结构域的实例为WO 2012/116453和WO 2014/012082中所描述的分离白蛋白支架。另一实例为一起选择性配对的亮氨酸拉链结构域，诸如Fos和Jun[S AKostelny,M S Cole以及J Y Tso.Formation of a bispecific antibody by the use ofleucine zippers.J Immunol 1992 148:1547-53；BerndJ.Wranik,ErinL.Christensen,Gabriele Schaefer,Janet K.Jackman,Andrew C.Vendel以及Dan Eaton.LUZ-Y,a NovelPlatform for the Mammalian Cell Productionof Full-length IgG-bispecificAntibodies J.Biol.Chem.2012 287:43331-43339]。或者，还可采用其他选择性配对分子对，诸如芽孢杆菌rna酶-芽孢杆菌rna酶抑制剂对[Deyev,S.M.,Waibel,R.,Lebedenko,E.N.,Schubiger,A.P.以及Plückthun,A.(2003).Design of multivalent complexesusing the barnase*barstar module.Nat Biotechnol 21,1486-1492]、DNA链对[ZahidaN.Chaudri,Michael Bartlet-Jones,George Panayotou,Thomas Klonisch,IvanM.Roitt,Torben Lund,Peter J.Delves,Dual specificity antibodies using adouble-stranded oligonucleotide bridge,FEBS Letters,第450卷，第1-2期，1999年4月30日，第23页至第26页]、分离荧光蛋白对[Ulrich Brinkmann,AlexanderHaas.Fluorescent antibody fusion protein，its production and use，WO 2011135040A1]。
在支架为肽或多肽的实施方案中，抗体构建体的4-1BB结合结构域和/或TAA抗原结合结构域可通过基因融合直接或间接连接至支架。在其他实施方案中，在支架为聚合物或纳米粒子的情况下，抗体构建体的4-1BB结合结构域和/或TAA抗原结合结构域可通过化学缀合连接至支架。
在一个实施方案中，本文所描述的抗体构建体包含4-1BB结合结构域和肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域，其中第一4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至Fc构建体。
如本文所用的术语“Fc”或“Fc构建体”是指免疫球蛋白重链C端含有至少一部分的恒定区的区域(也称为“Fc结构域”或“Fc区”)，包括CH3结构域。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非另外指明，否则在本文中，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据如Edelman,G.M.等,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)中所描述的EU编号系统，也称为EU索引来进行。
“二聚Fc构建体”包含两个Fc多肽。二聚Fc构建体的“Fc多肽”是指形成构建体的两个多肽中的一者，即包含能够稳定自我缔合的免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽。Fc多肽来源于重链同型，包括IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE。Fc多肽还可来源于重链亚型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。在一些实施方案中，Fc构建体为人Fc构建体。在一些实施方案中，Fc构建体为人IgG Fc构建体。在其他实施方案中，Fc构建体为人IgG1 Fc构建体。
每个Fc多肽包含CH3序列并且可任选包含CH2序列。在一些实施方案中，每个Fc多肽包含具有一个或多个氨基酸修饰的CH3序列。在一些实施方案中，每个Fc多肽包含含有一个或多个氨基酸修饰的CH2序列。在一些实施方案中，Fc构建体由单一多肽组成，例如其中Fc多肽通过接头连接。在其他实施方案中，Fc构建体为异二聚Fc构建体，其中构成Fc构建体的Fc多肽具有不同的CH3或CH2序列。
CH3序列修饰
在某些实施方案中，支架为包含CH3序列修饰的异二聚Fc构建体，如国际专利申请号PCT/CA2011/001238或国际专利申请号PCT/CA2012/050780中所描述，与均二聚Fc相比，所述CH3序列修饰促进形成异二聚Fc构建体，所述专利申请中的每一者的整个公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
表G提供了人IgG1 Fc序列的氨基酸序列，对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。
典型地，Fc包括能够二聚化的两个连续重链序列或Fc多肽序列(A和B)。在一些实施方案中，这些序列中的一个或两个序列可在以下位置包括一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390，使用EU编号。在一些实施方案中，Fc可包括如表G中所示的突变体序列。在一些实施方案中，Fc可包括变体1A-B的突变。在一些实施方案中，Fc可包括变体2A-B的突变。在一些实施方案中，Fc可包括变体3A-B的突变。在一些实施方案中，Fc可包括变体4A-B的突变。在一些实施方案中，Fc可包括变体5A-B的突变。
表G：IgG1 Fc序列
Figure BDA0003013068510000581
用于修饰Fc构建体的Fc多肽以促进异二聚Fc形成的额外的方法为本领域中已知的，并且包括例如国际专利公布号WO 96/027011中(杵入臼)、Gunasekaran等(GunasekaranK.等(2010)J Biol Chem.285,19637-46,electrostatic design toachieve selective heterodimerization)中、Davis等(Davis,JH.等(2010)Prot Eng DesSel；23(4):195-202,strand exchange engineered domain(SEED)technology)中以及Labrijn等[Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange.Labrijn AF,Meesters JI,de Goeij BE,van den Bremer ET,Neijssen J,van Kampen MD,Strumane K,VerploegenS,Kundu A,Gramer MJ,van Berkel PH,van deWinkel JG,Schuurman J,Parren PW.Proc Natl Acad Sci U S A.2013年3月26日；110(13):5145-50中所描述的那些方法。
CH2序列修饰
在一些实施方案中，支架为Fc构建体，其中Fc构建体的每个Fc多肽包含CH2序列和CH3序列。Fc的CH2序列的一个实例为表B中所示序列的氨基酸231-340。若干效应功能由Fc受体(FcR)介导，Fc受体结合至抗体的Fc。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合至抗体的Fc区的受体。举例来说，FcR可为天然序列人FcR。通常，FcR为结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII以及FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体以及替代地这些受体的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在胞质结构域中有所不同的类似氨基酸序列。其他同型的免疫球蛋白也可由某些FcR结合(参见例如Janeway等,ImmunoBiology:the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(第4版,1999))。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)(在
Figure BDA0003013068510000591
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中综述)。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及deHaas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中对FcR进行了综述。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来要鉴定的那些FcR。所述术语还包括新生儿受体FcRn，FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
CH2序列中的修饰可影响FcR与Fc构建体的结合。Fc区中的许多氨基酸修饰在本领域中已知用于选择性改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力。在一些方面中，Fc包含用于促进Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰。
以下列举改变FcR与Fc的结合的示例性突变：
S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y,Vernes JM,Chiang N等JImmunol Methods.2011年2月28日；365(1-2):132-41)；
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB,Gorlatov S,Tuaillon N等Cancer Res.2007年9月15日；67(18):8882-90；Nordstrom JL,Gorlatov S,Zhang W等Br east Cancer Res.2011年11月30日；13(6):R123)；
F243L(Stewart R,Thom G,Levens M等Protein Eng Des Sel.2011年9月；24(9):671-8。)
S298A/E333A/K334A(Shields RL,Namenuk AK,Hong K等J Biol Chem.2001年3月2日；276(9):6591-604)；
S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(Lazar GA,Dang W,Karki S等Proc Natl AcadSci U S A.2006年3月14日；103(11):4005-10)；
S239D/S267E、S267E/L328F(Chu SY,Vostiar I,Karki S等Mol Immunol.2008年9月；45(15):3926-33)；
S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及WO2011/120134和WO2011/120135中列举的其他突变，所述专利以引用的方式并入本文中。
Therapeutic Antibody Engineering(William R.Strohl和Lila M.Strohl,伍德海德出版系列,Biomedicine第11期,ISBN 1 907568 37 9,2012年10月)在第283页列举了突变。
在一些实施方案中，异二聚Fc包含具有包含一个或多个非对称氨基酸修饰的CH2序列的Fc多肽。国际专利申请号PCT/CA2014/050507中描述了示例性非对称氨基酸修饰。在一个实施方案中，异二聚Fc包含具有氨基酸取代L234A、L235A以及D265S的Fc多肽，所述氨基酸取代使FcγR结合减少。
用于改善效应功能的额外修饰
在一些实施方案中，Fc构建体包括改善其介导效应功能的能力的氨基酸修饰。此类修饰为本领域中已知的并且包括非海藻糖基化，或对Fc对活化受体(对于ADCC主要为FCγRIIIa)以及对C1 q(对于CDC)的亲和力的工程化。
在不改变氨基酸序列的情况下产生Fc糖基化位点(Asn 297 EU编号)上几乎没有海藻糖的抗体Fc区的方法为本领域中熟知的。
Figure BDA0003013068510000611
技术(ProBioGen AG)是基于引入使海藻糖生物合成的细胞路径偏移至用于产生抗体Fc区的细胞中的酶的基因。这防止细胞向N-连接抗体碳水化合物部分添加“海藻糖”。(von Horsten等(2010)Glycobiology.20(12):1607-18)。在美国专利号8,409,572中可找到获得具有海藻糖基化水平较低的Fc构建体的抗体构建体的另一方法，所述专利教示基于在抗体上得到较低水平的海藻糖基化的能力选择用于产生抗体的细胞系。在一些实施方案中，抗体构建体的Fc或抗体构建体可为完全非海藻糖基化的(意味着它们不含可检测的海藻糖)或它们可为部分非海藻糖基化的，意味着双特异性抗体模式中的TAA呈递诱导剂含有针对通过哺乳动物表达系统产生的类似抗体通常检测到的小于95％、小于85％、小于75％、小于65％、小于55％、小于45％、小于35％、小于25％、小于15％或小于5％的海藻糖量。
因此，在一些实施方案中，本文所描述的抗体构建体可包括包含如表H中提到的一个或多个氨基酸修饰的二聚Fc，所述一个或多个氨基酸修饰赋予改善的效应功能。在一些实施方案中，构建体可为非海藻糖基化的以改善效应功能。
表H：CH2结构域和效应功能工程化
Figure BDA0003013068510000621
降低FcgR和/或补体结合和/或效应功能的Fc修饰为本领域中已知的。各种出版物描述了已用于对抗体进行工程化使其具有降低或沉默的效应子活性的策略(参见Strohl,WR(2009),Curr Opin Biotech 20:685-691，以及Strohl,WR和Strohl LM,“Antibody Fcengineering for optimal antibody performance”,Therapeutic AntibodyEngineering,Cambridge:Woodhead Publishing(2012),第225-249页)。这些策略包括通过糖基化的修饰降低效应功能，使用IgG2/IgG4支架或在Fc的铰链或CH2区中引入突变。举例来说，美国专利公布号2011/0212087(Strohl)、国际专利公布号WO 2006/105338(Xencor)、美国专利公布号2012/0225058(Xencor)、美国专利公布号2012/0251531(Genentech)以及Strop等((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述了用于减少FcgR或补体与Fc的结合的特定修饰。
用于减少FcγR或补体与Fc的结合的已知氨基酸修饰的特定非限制性实例包括表I中所列的那些氨基酸修饰。
表I：用于减少FcγR或补体与Fc的结合的修饰
公司 突变
GSK N297A
Ortho Biotech L234A/L235A
Protein Design labs IGG2 V234A/G237A
Wellcome Labs IGG4 L235A/G237A/E318A
GSK IGG4 S228P/L236E
Alexion IGG2/IGG4combo
Merck IGG2 H268Q/V309L/A330S/A331S
Bristol-Myers C220S/C226S/C229S/P238S
Seattle Genetics C226S/C229S/E3233P/L235V/L235A
Amgen 大肠杆菌产生，非糖基化
Medimune L234F/L235E/P331S
Trubion 铰链突变体，可能为C226S/P230S
在一些实施方案中，Fc包含表I中所列的至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，Fc包含L234、L235或D265中的至少一者的氨基酸修饰。在一些实施方案中，Fc包含在L234、L235以及D265处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，Fc包含氨基酸修饰L234A、L235A以及D265S。
在支架为Fc的实施方案中，4-1BB结合结构域可连接至Fc多肽中的一者的N端。在其他实施方案中，4-1BB结合结构域可连接至Fc多肽中的一者的C端。在某些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可包含连接至Fc多肽中的一者的N端的4-1BB结合结构域以及连接至另一Fc多肽的N端的另一4-1BB结合结构域。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可包含连接至Fc多肽中的一者的C端的4-1BB结合结构域。在某些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可包含连接至Fc多肽中的一者的C端的4-1BB结合结构域以及连接至另一Fc多肽的C端的另一4-1BB结合结构域。
在支架为Fc的其他实施方案中，TAA抗原结合结构域可连接至Fc多肽中的一者的N端。在其他实施方案中，TAA抗原结合结构域可连接至Fc多肽中的一者的C端。在某些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体可包含连接至Fc多肽中的一者的N端的TAA抗原结合结构域以及连接至另一Fc多肽的N端的另一TAA抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BB x TAA可包含连接至Fc多肽中的一者的C端的TAA抗原结合结构域。在某些实施方案中，4-1BB xTAA抗体构建体可包含连接至Fc多肽中的一者的C端的TAA抗原结合结构域以及连接至另一Fc多肽的C端的另一TAA抗原结合结构域。
如本领域技术人员将了解，在一些实施方案中，以上连接的组合也是可能的。特定示例性组合描述如下。
抗体构建体的模式
4-1BB x TAA抗体构建体
本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体包含4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域，其中4-1BB结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。如本领域中已知的，可将这些4-1BB x TAA抗体构建体构建成许多模式；以下描述示例性非限制性模式。
在4-1BB x TAA抗体构建体的4-1BB结合结构域为4-1BB抗原结合结构域的实施方案中，4-1BB抗原结合结构域可呈Fab模式、scFv模式或sdAb模式。在一个实施方案中，抗体构建体包含呈Fab模式的4-1BB抗原结合结构域，以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB抗原结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在另一实施方案中，抗体构建体包含呈scFv模式的4-1BB抗原结合结构域，以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB抗原结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在一个实施方案中，抗体构建体包含呈sdAb模式的4-1BB抗原结合结构域，以及TAA抗原结合结构域，其中4-1BB抗原结合结构域和TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。在这些实施方案中的一些中，4-1BB抗原结合结构域连接至支架的N端并且TAA抗原结合结构域连接至支架的C端。在其他实施方案中，4-1BB抗原结合结构域与TAA抗原结合结构域均连接至支架的N端。
在一些实施方案中，支架为Fc构建体。在一个此类实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至第一Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域以及连接至第一Fc多肽的C端的TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二4-1BB抗原结合结构域均呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。图2B提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至第一Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域、连接至第一Fc多肽的C端的第一TAA抗原结合结构域以及连接至第二Fc多肽的C端的第二TAA。在一些实施方案中，第一和第二4-1BB抗原结合结构域均呈Fab模式并且第一和第二TAA抗原结合结构域均呈scFv模式。图2C提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至Fc构建体的Fc多肽中的一者的N端的4-1BB抗原结合结构域，以及连接至相同Fc多肽的C端的第一TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。图2D提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至第一Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域以及连接至第一4-1BB抗原结合结构域的VH结构域的N端的TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二4-1BB抗原结合结构域均呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。图2E提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至第一Fc多肽的N端的4-1BB抗原结合结构域，以及连接至第二Fc多肽的N端的TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB抗原结合结构域均呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。图2F提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至Fc构建体的Fc多肽中的一者的N端的4-1BB抗原结合结构域以及连接至4-1BB抗原结合结构域的VH区域的N端的TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。图2G提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至Fc构建体的Fc多肽中的一者的N端的4-1BB抗原结合结构域、连接至相同Fc多肽的C端的TAA抗原结合结构域以及连接至第二Fc多肽的C端的TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。图2G提供了与这些实施方案有关的示例性构建体的图示。
在支架为Fc构建体的其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含连接至Fc构建体的Fc多肽中的一者的N端的4-1BB抗原结合结构域，以及连接至第二Fc多肽的C端的TAA抗原结合结构域。在一些实施方案中，4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式并且TAA抗原结合结构域呈scFv模式。
在一个实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含为4-1BB配体的4-1BB结合结构域，所述4-1BB配体连接至Fc构建体的Fc多肽中的一者的C端；以及呈Fab模式的TAA抗原结合结构域，所述TAA抗原结合结构域连接至Fc构建体的另一Fc多肽的N端。
4-1BB x TAA抗体构建体的功能活性
本文所提供的4-1BB x TAA抗体构建体可以一定范围的亲和力结合4-1BB和TAA。可使用本领域中已知的方法(参见例如Berzofsky等,“Antibody-Antigen Interactions,”Fundamental Immunology,Paul,W.E.编,Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,JanisImmunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)；以及本文所描述的方法)通过实验来测定抗体对抗原的亲和力或亲合力。
如果在不同条件(例如盐浓度、pH值)下测量，那么所测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可改变。因此，优选使用抗体和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(诸如本文所描述的缓冲液)来进行亲和力和其他抗原-结合参数的测量。亲和力KD为k缔合/k解离的比率。通常，KD在微摩尔范围内被认为对单特异性二价抗体来说为低亲和力。通常，KD在皮摩尔范围内被认为对单特异性二价抗体来说为高亲和力。如本领域中已知的，被衡量为单价结合剂的抗体亲和力通常低于被衡量为二价结合剂的抗体亲和力。
在一些实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含对人4-1BB的KD介于约15nM与100nM、约15nM与200nM或约15nM与500nM之间、约100pM与1μM之间并且被衡量为单价结合剂的4-1BB抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含对人4-1BB的KD介于约1nM与约1000nM之间或约10nM至约500nM之间或约20nM与约400nM之间并且被衡量为单价结合剂的4-1BB抗原结合结构域。在其他实施方案中，4-1BB x TAA抗体构建体包含对TAA的KD介于约0.1nM至约50nM或约1nM至约20nM或约1nM至约10nM之间的TAA抗原结合结构域。可通过许多已知方法(例如如本文别处所描述的SPR)来测量KD。如本节中所用，术语“约”意指在每个范围内所确定的KD值±10％。
在一些实施方案中，如通过例如ELISA、BiaCoreTM和/或流式细胞术所测定或如实施例中所描述，4-1BB x TAA抗体构建体结合至一个或多个表达TAA的细胞系。在某些实施方案中，表达TAA的细胞系为卵巢腺癌细胞系，诸如IGROV1、SKOV3或OVCAR3。在某些实施方案中，表达TAA的细胞系为肺癌细胞系。在某些实施方案中，肺癌细胞系为肺鳞状细胞系，诸如H226；或肺腺癌细胞系，诸如H441、HCC827、H1573、H1975或H1563；或肺癌细胞系，诸如H1299；或肺大细胞癌，诸如H661。在一些实施方案中，表达TAA的细胞系为表达HER2的细胞系(诸如SKBr3)、表达FRα的细胞系、表达LIV-1的细胞系、表达NaPi2b的细胞系或表达间皮素的细胞系。
在一些实施方案中，在存在表达TAA的细胞的情况下，4-1BB x TAA抗体构建体也许能如通过细胞因子产生所测量刺激T细胞中的4-1BB活性。在一些实施方案中，如通过定量流式细胞术或其他定量方法所测量，表达TAA的细胞以每个细胞大于约500,000个分子在细胞表面表达TAA。在一些实施方案中，如通过定量流式细胞术或其他定量方法所测量，表达TAA的细胞以每个细胞大于约100,000个分子在细胞表面表达TAA。在一些实施方案中，如通过定量流式细胞术或其他定量方法所测量，表达TAA的细胞以每个细胞约100,000至500,000个分子在细胞表面表达TAA。在一些实施方案中，如通过定量流式细胞术或其他定量方法所测量，表达TAA的细胞以每个细胞约50,000至500,000个分子在细胞表面表达TAA。
在一些实施方案中，如通过上文所描述的方法所测定，4-1BB x TAA抗体构建体结合至表达4-1BB的细胞。在一些实施方案中，表达4-1BB的细胞为原代T、NK或NKT细胞；活化原代T、NK或NKT细胞；调控T细胞；或从肿瘤提取的T、NKT或NKT细胞。
在一些实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体也许能够刺激表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。测试4-1BB活性的方法为本领域中已知的。举例来说，可使用如实施例中所描述的NF-κB报告基因分析来评估4-1BB x TAA抗体构建体促进NF-κB活化以及转位至核，随后驱动报告基因表达的能力。作为另一实例，可采用如实施例中所描述的原代T细胞共培养分析通过测量细胞因子(诸如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-22、IL-35、IFN-γ、TNF-α、TGF-β)的产生的增加或降低、趋化因子受体(CXCR3、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10)的表达的增加或降低、主要转录因子(Tbet、GATA3、FOXP3、EOMES、TOX)的表达的增加或降低、代谢活性的增加或降低或者调控代谢活性的蛋白质的增加或减少、抗凋亡或促凋亡蛋白(Bcl2、Bcl-Xl、Bim、Mcl1)的表达的增加或降低、表面标记物(PD1、TIGIT、LAG3、ICOS、CD45RA、CD45RO、CD44、CD69、CD44、KLRG1)的表达的增加或降低、T细胞杀死肿瘤细胞的能力的增加或降低或信号传导蛋白(Akt/PkB、PI3K、CD3ζ、LAT、SLP76、IκK、N FκB、TRAF家族、MEK、MEKK、NIK、ERK、p38 MAPK、c-fos、c-jun、ATF、Foxo)或调控细胞循环的蛋白质(CyclinD3、p27kip1)的磷酸化、定位或活性。可在蛋白质、mRNA或染色体可获得性的水平对此进行评估。还可通过检验总细胞DNA含量的增加或降低(通过测量3H-胸苷、溴脱氧尿苷或类似示踪剂的合并)或通过能够确定分析中细胞用染料(CFDA-SE、细胞示踪剂Violet、PKH26)标记的分区的数目的示踪染料的水平的增加或降低来评估原代T细胞分析中的活性。这些分析为本领域技术人员熟知的，并且在许多情况下，用于执行这些分析的试剂和试剂盒为可商购获得的，诸如CellTrackerTMViolet BMQC染料(ThermoFisher Scientific)或CellTraceTM Violet细胞增殖试剂盒、ThermoFisher Scientific/InvitrogenTM。
4-1BB抗体构建体
本公开还提供了特异性结合于4-1BB ECD的抗体构建体或其抗原结合片段(4-1BB抗体构建体)。在一些实施方案中，这些4-1BB抗体构建体包含如表13和表14中所列的VH和VL序列，并且可在表18中找到这些VH和VL序列的CDR序列。在某些实施方案中，4-1BB抗体构建体如本文中别处所描述能够激动4-1BB活性。在一些实施方案中，4-1BB抗体构建体结合至人4-1BB的CRD1、CRD2、CRD3或CDR4中的任一者。
在一个实施方案中，4-1BB抗体构建体或其抗原结合片段包含含有三个重链CDR的重链可变序列以及含有三个轻链CDR的轻链可变序列，其中重链CDR和轻链CDR来自抗体1G1、1B2、1C3、1C8、2A7、2E8、2H9、3D7、3H1、3E7、3G4、4B11、4E6、4F9、4G10、5E2、5G8或6B3中的任一者，并且4-1BB抗体构建体结合至人4-1BB。在一些实施方案中，4-1BB抗体构建体或抗原结合片段包含含有三个CDR的重链可变(VH)序列以及含有三个CDR的轻链可变(VL)序列，其中重链CDR和轻链CDR来自抗体1G1、1C3、1C8、2E8、3E7、4E6、5G8或6B3中的任一者，并且4-1BB抗体构建体结合至人4-1BB。
在某些实施方案中，4-1BB抗体构建体包含人VH和VL序列或人源化VH和VL序列。在其他实施方案中，4-1BB抗体构建体包含与变体v28726、v28727、v28728、v28730、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28695中的任一者的VH和VL序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH序列和VL序列。
可使用抗4-1BB CDR、VH以及VL序列来构建如本领域中已知的各种模式的抗体构建体。举例来说，可使用这些序列来构建Fab片段或scFv，Fab片段或scFv可连接至支架，诸如Fc或如本文所描述的其他支架。图1中展示了包含这些CDR、VH以及VL序列的抗体构建体的示例性模式。抗体构建体可为单价、二价或多价的。在一些实施方案中，抗体构建体为单特异性的。在一些实施方案中，抗体构建体为单特异性的并且呈天然存在的模式(FSA)。
还可将如表13、表14中所列的抗4-1BB VH和VL序列以及在表18中找到的抗4-1BBCDR序列用于构建双特异性或多特异性抗体，诸如在此描述的4-1BB x TAA抗体构建体，或包含结合至4-1BB的ECD的至少一个抗原结合结构域的其他抗体构建体。
在一些实施方案中，呈单价形式的4-1BB抗体构建体以介于约15nM与100nM、约15nM与200nM或约15nM与500nM之间、约100pM与1μM之间的对4-1BB的KD结合人4-1BB。在其他实施方案中，呈单价形式的4-1BB抗体构建体包含对人4-1BB具有介于约1nM与约1000nM之间或约10nM至约500nM之间或约20nM与约400nM之间的KD的4-1BB抗原结合结构域。如上文所指出，可通过许多已知方法来测量KD，例如如本文别处所描述的SPR。如本节中所用，术语“约”意指在每个范围内所确定的KD值±10％。在一个相关实施方案中，术语“约”意指如通过SPR所测量的KD值±20％。
可如本文别处所描述来制备、测试并且使用本文所描述的4-1BB抗体构建体。
FRα抗体构建体
本公开还提供了特异性结合于FRα的抗体构建体或其抗原结合片段(FRα抗体构建体)。这些FRα抗体构建体包含如表17和表20中所列的VH和VL序列，并且可在表18中找到这些VH和VL序列的CDR序列。在一个实施方案中，FRα抗体构建体结合至人FRα。
在一些实施方案中，FRα抗体构建体包含含有三个重链CDR的重链可变序列以及含有三个轻链CDR的轻链，其中重链CDR和轻链CDR来自抗体8K22或抗体1H06。
在某些实施方案中，FRα抗体构建体包含人VH和VL序列或人源化VH和VL序列。在相关实施方案中，FRα抗体构建体包含与来源于8K22抗体的变体23794、23795、23796、23797、23798、23799、23800、23801、23802、23803、23804、23805、23806、23807、23808、23809、23810、23811、23812、23813、23814、23815、23816、23817或23818中的任一者的VH和VL序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH序列和VL序列。
在其他实施方案中，FRα抗体构建体包含含有抗体1H06的重链CDR和轻链CDR的人源化VH和VL序列。
在一些实施方案中，人源化FRα抗体构建体包含比衍生出人源化Fab结构域的亲本Fab更稳定的人源化FRα Fab结构域。在相关实施方案中，人源化FRαFab结构域可展现比亲本Fab高多达10℃的Tm。在一些实施方案中，人源化FRα Fab结构域可展现比亲本Fab高多达5℃的Tm。
在某些实施方案中，FRα抗体构建体对人FRα具有在100pM至100nM范围内的结合亲和力或KD。在一些实施方案中，FRα抗体构建体对人FRα具有在10pM至100nM范围内的结合亲和力或KD。在相关实施方案中，FRα抗体构建体对人FRα具有在1nM至50nM范围内的KD。在其他相关实施方案中，通过生物层干涉术(BLI)来测量FRα抗体构建体对人FRα的亲和力。
可使用表17、表18以及表20中描述的这些抗FRα CDR、VH以及VL序列来构建如本领域中已知的各种模式的抗体构建体。举例来说，可使用这些序列来构建Fab片段或scFv，Fab片段或scFv可连接至支架，诸如Fc或如本文所描述的其他支架。图1中展示了包含这些CDR、VH以及VL序列的抗体构建体的示例性模式。抗体构建体可为单价、二价或多价的。在一些实施方案中，抗体构建体为单特异性的。在一些实施方案中，抗体构建体为单特异性的并且呈天然存在的模式(FSA)。
还可将如表17、表20中所列的抗FRα VH和VL序列以及在表18中找到的抗FRαCDR序列用于构建双特异性或多特异性抗体，诸如在此描述的4-1BB x FRα抗体构建体，或包含结合至FRα的至少一个抗原结合结构域的其他抗体构建体。
可如本文别处所描述来制备、测试并且使用本文所描述的FRα抗体构建体。
制备抗体构建体的方法
可例如如美国专利号4,816,567中所描述使用重组方法和组合物产生本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体、FRα抗体构建体以及4-1BB抗体构建体。此方法和用于产生这些构建体的其他方法描述如下。
因此，某些实施方案涉及编码本文所描述的抗体构建体的一种或多种核酸。此类核酸可编码对应于4-1BB x TAA抗体构建体或4-1BB抗体构建体的氨基酸序列。
某些实施方案涉及包含编码本文所描述的抗体构建体的核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在一些实施方案中，编码抗体构建体的核酸包括于多顺反子载体中。在其他实施方案中，抗体构建体的每个多肽链由单独的载体编码。还预期载体的组合可包含编码单一抗体构建体的核酸。
某些实施方案涉及包含此类核酸或含有所述核酸的一种或多种载体的宿主细胞。在一些实施方案中，例如在抗体构建体为多特异性或双特异性抗体的情况下，宿主细胞包含(例如已经转化具有)：(1)包含编码包含抗原结合结构域的VL的氨基酸序列以及包含抗原结合结构域的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗原结合结构域的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体以及包含编码包含抗原结合结构域的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或人胚胎肾(HEK)细胞，或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
某些实施方案涉及一种制备抗体构建体的方法，其中所述方法包括在适合抗体构建体表达的条件下培养如上文所描述的包含编码抗体构建体的核酸的宿主细胞，以及任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体构建体。
对于抗体构建体的重组制备，将例如如上文所描述的编码抗体构建体的核酸分离并且插入一种或多种载体中以便进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可使用常规程序(例如通过使用寡核苷酸探针，寡核苷酸探针能够特异性结合于编码抗体构建体的重链和轻链的基因)轻易地对此类核酸进行分离和测序。
术语“基本上纯化”是指本文所描述的构建体或其变体可基本上或大体上不含通常伴随有如在天然存在的环境(即天然细胞或在重组产生的构建体的情况下为宿主细胞)中发现的蛋白质或与在天然存在的环境中发现的蛋白质相互作用的组分。在某些实施方案中，基本上不含细胞材料的构建体包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当构建体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当构建体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质以细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少存在于培养基中。
在某些实施方案中，在应用于包含异多聚体Fc并且通过本文所描述的方法产生的构建体时，术语“基本上纯化”如通过适当的方法(诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC以及毛细管电泳)所测定具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，特别地，至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更特别地，至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或更大的纯度水平。
适合用于克隆或表达编码抗体构建体的载体的宿主细胞包括本文所描述的原核细胞或真核细胞。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源性多核苷酸的细胞，与用于插入的方法(例如直接摄入、转导、f-配合或本领域中已知用于形成重组宿主细胞的其他方法)无关。外源性多核苷酸可保持为非整合载体，例如质粒，或者，可整合至宿主基因组中。
如本文所用，术语“真核生物”是指属于系统发生结构域真核生物的有机体，诸如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫目、原生生物等。
如本文所用，术语“原核生物”是指原核有机体。举例来说，非真核有机体可属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光极毛杆菌(Pseudomonasfluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭极毛杆菌(Pseudomonasputida)等)系统发生结构域，或古生菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、盐杆菌属(诸如沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)和盐杆菌属物种NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发生结构域。
举例来说，特别是在不需要糖基化和Fc效应功能时，可在细菌中产生抗体构建体。关于抗原结合构建体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199以及5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245页至第254页，所述文献描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达之后，可从可溶性级分中的细菌细胞糊分离抗原结合构建体并且可进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是适合用于抗体构建体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已“人源化”从而使得以部分或完全人糖基化模式产生抗体构建体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，以及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合用于表达糖基化抗原结合构建体的宿主细胞还来源于多细胞有机体(无脊椎生物和脊椎生物)。无脊椎生物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已对可与昆虫细胞结合使用特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株进行了鉴定。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978以及6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗原结合构建体的PLANTIBODIESTM技术)。
还可使用脊椎生物细胞作为宿主。举例来说，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可为可用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为用SV40转化的猴肾CV1株(COS-7)；人胚胎肾株(293或293细胞，如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠足细胞(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0以及Sp2/0。对于适合用于产生抗原结合构建体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.),第255页至第268页(2003)。
在一些实施方案中，通过包括以下的方法在稳定哺乳动物细胞中产生本文所描述的抗体构建体：以预定比率用编码抗体构建体的核酸转染至少一个稳定的哺乳动物细胞；以及使核酸在所述至少一个哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，在瞬时转染实验中确定核酸的预定比率以确定在所表达的产物中产生最高百分比的抗原结合构建体的输入核酸的相对比率。
在一些实施方案中，在于稳定的哺乳动物细胞中产生抗体构建体的方法中，与单聚重或轻链多肽或其他抗体相比，稳定的哺乳动物细胞的表达产物包含更大百分比的所需的糖基化抗原结合构建体。
如果需要，那么可在表达之后对抗体构建体进行纯化或分离。可以本领域技术人员已知的多种方式对蛋白质进行分离或纯化。标准纯化方法包括在大气压下或在高压下使用诸如FPLC和HPLC等系统进行的色谱技术，包括离子交换、疏水相互作用、亲和力、尺寸调节或凝胶过滤以及逆相色谱。纯化方法还包括电泳、免疫、沉淀、渗析以及色谱聚焦技术。结合蛋白质浓缩的超滤和透滤技术也是可用的。如本领域中熟知的，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，并且这些蛋白质可用于纯化抗原结合构建体。举例来说，细菌蛋白A和G结合至Fc区。同样地，细菌蛋白L结合至一些抗体的Fab区。常常可通过特定融合配偶体来实现纯化。举例来说，可使用谷胱甘肽树脂(如果采用GST融合)、Ni+2亲和色谱(如果采用His标签)或固定的抗flag抗体(如果使用flag标签)将抗体纯化。对于适合的纯化技术中的一般指导，参见例如以引用的方式完全并入本文中的Protein Purification:Principles andPractice,第3版，Scopes，Springer-Verlag,NY,1994，所述文献以引用的方式完全并入本文中。必需的纯化程度将根据抗原结合构建体的使用而改变。在一些情况下，纯化不是必需的。
在某些实施方案中，可使用阴离子交换色谱，包括但不限于在Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱上的色谱将抗体构建体纯化。
在一些实施方案中，使用阳离子交换色谱，包括但不限于SP-琼脂糖、CM琼脂糖、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱以及其等效物和类似物将抗体构建体纯化。
在一些实施方案中，使用无细胞翻译或表达系统使抗体构建体表达。适合的系统为本领域中已知的，诸如由Stech等在Nature Scientific Reports 7:12030中描述的方法，或由Gregorio等在Methods Protoc.2019 2:24中描述的那些方法。
此外，可使用本领域中已知的技术化学合成抗体构建体(例如参见Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y以及Hunkapiller等,Nature,310:105-111(1984))。举例来说，可通过使用肽合成器来合成对应于多肽片段的多肽。此外，如果需要，那么可以取代或添加的形式将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物引入多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、eAhx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸(诸如α-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)以及一般来说的氨基酸类似物。此外，氨基酸可为D(右旋)或L(左旋)。
翻译后修饰
在某些实施方案中，在翻译期间或之后对本文所描述的抗体构建体进行差异修饰。
如本文所用，术语“修饰”是指任何对给定多肽做出的改变，诸如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变、多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。
术语“翻译后修饰”是指在天然或非天然氨基酸已合并至多肽链中之后对此类氨基酸进行的任何修饰。所述术语涵盖(仅举例来说)共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰以及翻译后体外修饰。
在一些实施方案中，抗体构建体可包含以下修饰：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解或连接至抗体分子或抗原结合构建体或其他细胞配体或者这些修饰的组合。在一些实施方案中，通过已知技术对抗体构建体进行化学修饰，包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；以及在存在衣霉素的情况下代谢合成。
抗原结合构建体的额外任选翻译后修饰包括例如N-连接或O-连接碳水化合物链、N端或C端末端的加工)、化学部分连接至氨基酸骨架、N-连接或O-连接碳水化合物链的化学修饰以及因原核宿主细胞表达而添加或缺失N端甲硫氨酸残基。本文所描述的抗原结合构建体经修饰具有可检测标记，诸如酶、荧光、同位素或亲和标记以允许检测和分离蛋白质。在某些实施方案中，适合的酶标记的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素以及水母发光蛋白；并且适合的放射性物质的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在一些实施方案中，可使本文所描述的抗原结合构建体连接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
在一些实施方案中，可通过自然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中熟知的化学修饰技术对本文所描述的抗体构建体进行修饰。在某些实施方案中，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽中的若干位点。在某些实施方案中，来自本文所描述的抗原结合构建体的多肽例如因泛素化而为分支的，并且在一些实施方案中为具有或不具有分支的环状。环状、分支以及分支环状多肽由翻译后自然过程或通过合成方法制备产生。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的将氨基酸添加至蛋白质(诸如精氨酰化)以及泛素化。(参见例如PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；POST-TRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson编,Academic Press,New York,第1页至第12页(1983)；Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。
在某些实施方案中，可使本文所描述的抗原结合构建体连接至固体支撑物，所述固体支撑物特别适合用于由本文所描述的蛋白质结合、结合至本文所描述的蛋白质或与本文所描述的蛋白质缔合的多肽的免疫分析或纯化。此类固体支撑物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
额外的任选修饰
在一个实施方案中，可对本文所描述的抗体构建体进一步修饰(即，通过共价连接各种类型的分子)，使得共价连接不妨碍或影响4-1BB x TAA抗体构建体结合至4-1BB或TAA的能力，或影响4-1BB抗体构建体结合至4-1BB的能力，或负面地影响这些抗体构建体的稳定性。类似地，可通过共价连接对4-1BB抗体构建体和FRα抗体构建体进行修饰，使得它们的稳定性或结合至其靶标的能力不显著受影响。此类修饰包括例如但不限于糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其他蛋白质等。可通过已知技术进行许多化学修饰中的任一者，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
某些实施方案涵盖使抗体构建体缀合至药物部分，例如毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素。制备抗体药物缀合物(ADC)的许多方法为本领域中已知的。实例包括美国专利号8,624,003(釜法)、美国专利号8,163,888(一步法)以及美国专利号5,208,020(两步法)中所描述的方法。还参见Antibody-Drug Conjugates,Series:Methods inMolecular Biology,Laurent Ducry(编),Humana Press,2013。
ADC的药物部分典型地为具有细胞抑制效应或细胞毒性效应的化合物或部分。在一些实施方案中，ADC所包含的药物为细胞毒性剂。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。所述术语旨在包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P以及177Lu)、化学治疗剂以及毒素(诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)，包括其片段和/或变体。本领域技术人员将了解，这些类别的药物中的一些重叠并且因此不旨在互相排斥。举例来说，还可在毒素为可用于治疗癌症的化合物的意义上将它们视为化学治疗剂。在一些实施方案中，ADC所包含的药物为天然存在的毒素的类似物或衍生物。此类天然存在的毒素的实例包括但不限于美登素(maytansine)、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、土布来辛(tubulysin)、半阿司特林(hemiasterlin)、加利车霉素(calicheamicin)、多卡霉素(duocarmycin)、吡咯并苯并二氮杂卓、鹅膏毒素、喜树碱、假单胞菌属外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、去糖基化篦麻毒素A(dgA)以及白树毒素。
在某些实施方案中，ADC所包含的药物为微管破坏剂或DNA修饰剂。为微管破坏剂的毒素的实例包括但不限于美登素、澳瑞他汀、多拉司他汀、土布来辛、半阿司特林以及其类似物和衍生物。为DNA修饰剂的毒素的实例包括但不限于加利车霉素和其他烯二炔抗生素、多卡霉素、吡咯并苯并二氮杂卓、鹅膏毒素、喜树碱以及其类似物和衍生物。
示例性类美登素包括DM1(美坦辛(mertansine)、恩坦辛(emtansine)、N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素)、DM3(N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素)以及DM4(拉夫坦辛(ravtansine)、索拉坦辛(soravtansine)、N2'-脱乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)美登素)(参见美国专利申请公布号US 2009/0202536)。Cassady等,2004,Chem.Pharm.Bull.,52(1):1-26中以及美国专利号4,256,746；4,361,650；4,307,016；4,294,757；4,424,219；4,331,598；4,364,866；4,313,946；4,315,929；4,362,663；4,322,348以及4,371,533中描述了天然存在的、合成的以及半合成的类美登素的其他实例。
示例性多拉司他汀和澳瑞他汀包括澳瑞他汀E(本领域中也称为多拉司他汀-10的衍生物)和澳瑞他汀F，以及其类似物和衍生物。澳瑞他汀类似物包括例如澳瑞他汀E与酮酸之间形成的酯。举例来说，可使澳瑞他汀E与对乙酰苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，以分别产生澳瑞他汀EB(AEB)和澳瑞他汀EVB(AEVB)。其他典型澳瑞他汀包括澳瑞他汀F亚苯基二胺(AFP)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)以及单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。美国专利号6,884,869；7,098,308；7,256,257；7,423,116；7,498,298以及7,745,394中描述了示例性澳瑞他汀的合成和结构。澳瑞他汀类似物，特别是适合用于经由药物分子的C端缀合的类似物的其他实例，包括国际公布号WO 2002/088172和WO 2016/041082中所描述的那些澳瑞他汀类似物。
示例性半阿司特林和半阿司特林类似物和衍生物包括国际公布号WO 1996/33211和WO 2004/026293；美国专利号7,579,323(所述专利描述半阿司特林类似物，HTI-286)以及国际公布号WO 2014/144871中所描述的那些半阿司特林和半阿司特林类似物和衍生物。
示例性加利车霉素和加利车霉素类似物和衍生物包括国际公布号WO 2015/063680以及美国专利号5,773,001；5,714,586以及5,770,701)中所描述的那些加利车霉素和加利车霉素类似物和衍生物。
示例性多卡霉素和多卡霉素类似物和衍生物包括天然存在的多卡霉素，诸如多卡霉素A、B1、B2、C1、C2、D以及SA，以及CC-1065，以及类似物和衍生物，诸如阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)以及森坦霉素(centanamycin)。美国专利号4,912,227；5,070,092；5,084,468；5,332,837；5,641,780；5,739,350以及8,889,868中描述了其他加利车霉素类似物和衍生物。
示例性吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)包括各种PBD二聚体，诸如美国专利号6,884,799；7,049,311；7,511,032；7,528,126；7,557,099以及9,056,914中以及国际公布号WO2007/085930、WO 2009/016516、WO 2011/130598、WO 2011/130613以及WO 2011/130616以及美国专利申请公布号US 2011/0256157中所描述的那些PBD。
示例性鹅膏毒素包括a-鹅膏蕈碱、b-鹅膏蕈碱、g-鹅膏蕈碱以及e-鹅膏蕈碱以及其类似物和衍生物。已描述各种鹅膏毒素和鹅膏毒素类似物(参见例如欧洲专利号EP 1859811、美国专利号9,233,173以及国际公布号WO 2014/043403)。
示例性喜树碱(CPT)包括伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)、10-羟基喜树碱、拓扑替康(topotecan)、勒托替康(lurtotecan)、9-氨基喜树碱以及9-硝基喜树碱。CPT类似物和衍生物的其他实例包括7-丁基-10-氨基-喜树碱和7-丁基-9-氨基-10,11-亚甲基二氧基-喜树碱(参见美国专利申请公布号US 2005/0209263)以及如Burke等,2009,Bioconj.Chem.20(6):1242-1250以及Sharkey等,2012,Mol.CancerTher.11:224-234中所描述的这些化合物的含有苯胺的衍生物。
在某些实施方案中，ADC所包含的药物为化学治疗剂。在一些实施方案中，ADC所包含的药物为蒽环类(anthracycline)，诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、柔红比星(daunorubicin)(也称为道诺霉素(daunomycin))、奈莫柔比星(nemorubicin)或其类似物或衍生物。已描述用于缀合至抗体的柔红比星和多柔比星的衍生化(参见例如Kratz等,2006,Current Med.Chem.13:477-523以及美国专利号6,630,579)。
用于ADC中的药物的其他实例包括mTOR抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))以及其类似物(“雷帕霉素类似物(rapalogs)”)。雷帕霉素类似物被认为是在结构上与雷帕霉素有关的保留mTOR抑制活性的化合物并且包括例如雷帕霉素的酯、醚、肟、腙以及羟胺，以及雷帕霉素核心结构上的官能团已例如通过还原或氧化被修饰的化合物。示例性雷帕霉素类似物包括但不限于替西罗莫司(temsirolimus)(CC1779)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、依维莫司(everolimus)(RAD001)、地磷莫司(deforolimus)(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)以及OSI-027(OSI)。
可在存在或不存在接头的情况下通过本领域中已知的多种方法中的任一者使所选药物缀合至抗体构建体。典型地，使药物经由接头缀合至抗体构建体中的半胱氨酸或赖氨酸残基，所述接头可为可裂解接头或非可裂解接头。Antibody-DrugConjugates,Series:Methods in Molecular Biology,Laurent Ducry(编),Humana Press,2013中提供了示例性方法和接头。
在一些实施方案中，抗体构建体可表达为包含标签的融合蛋白，以有助于纯化和/或测试等。如本文中所提到的，“标签”为提供于蛋白质的C端、N端或内部从而促进蛋白质的鉴定或纯化的任何所添加的一系列氨基酸。适合的标签包括但不限于本领域技术人员已知适合用于纯化和/或测试的标签，诸如白蛋白结合结构域(ABD)、His标签、FLAG标签、谷胱甘肽-s-转移酶、血球凝集素(HA)以及麦芽糖结合蛋白。还可对此类标记过的蛋白质进行工程化以包含裂解位点，诸如凝血酶、肠激酶或因子X裂解位点，以便于在纯化之前、期间或之后移除标签。
产生抗体的方法
如果需要，那么可通过标准技术产生针对所关注的特定抗原的抗体并且用作制备4-1BB x TAA抗体构建体的抗原结合结构域的基础，例如用于制备4-1BB、FRα、NaPi2B、HER2或间皮素或LIV1抗原结合结构域。简单来说，可通过用纯化的抗原对兔子进行免疫，从兔子的血液制备血清以及将血清吸收至正常血浆级分中以产生对抗原具特异性的抗体来制备针对抗原的抗体。可通过将纯化的蛋白质注射至小鼠中，收获脾脏和淋巴结细胞，使这些细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合并且使用所得杂交瘤细胞产生单克隆抗体来制备针对抗原的单克隆抗体制剂。这两种方法均为本领域中熟知的。在一些实施方案中，可如本文别处所描述将由这些方法产生的抗体人源化。
作为人源化的替代方案，可产生人抗体。举例来说，可使用在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整人抗体谱的转基因动物(例如小鼠)。参见例如Jakobovits等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551；Jakobovits等,1993,Nature362:255-258；Bruggermann等,1993,Year in Immuno.7:33；以及美国专利号5,591,669；5,589,369；5,545,807；6,075,181；6,150,584；6,657,103；以及6,713,610。
或者，可使用噬菌体展示技术(参见例如McCafferty等,1990,Nature 348:552-553)在体外由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱产生人抗体和抗体片段。可以多种模式进行噬菌体展示；关于其综述参见例如Johnson和Chiswell,1993,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571。还可由体外活化的B细胞产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。还可使用诸如HuTargTM平台(InnovativeTargeting Solutions Inc.,Vancouver Canada)等平台从头产生新颖抗体序列。
抗体对抗原的亲和力可根据本领域中已知的方法而改变。
对抗体构建体进行测试
可根据本领域中已知的包括抗原结合分析或细胞结合分析的方法对4-1BB x TAA抗体构建体结合至4-1BB和TAA的能力进行测试。通过将纯化的或呈混合物形式的抗体构建体与抗原(4-1BB或TAA)一起孵育，并且评估与对照相比结合至抗原的4-1BB x TAA抗体构建体的量来进行抗原结合分析。可通过例如ELISA或SPR(表面等离子体共振)来评估结合至抗原的4-1BB x TAA抗体构建体的量。通过将抗体构建体与表达4-1BB或所关注的TAA的细胞(此类细胞可商购获得)一起孵育来进行细胞结合分析。可通过例如流式细胞术来评估结合至细胞的4-1BB x TAA抗体构建体的量并且与在存在对照的情况下所观测的结合相比较。用于执行这些类型的分析的方法为本领域中熟知的。可使用类似方法来评估4-1BB抗体构建体结合至4-1BB的能力。同样地，可确定FRα抗体构建体结合至纯化的FRα或在细胞上所表达的FRα的能力。
还可对4-1BB x TAA抗体构建体或4-1BB抗体构建体进行测试以确定它们是否促进表达4-1BB的细胞的活化。适合的分析包括实施例中所描述的共培养分析，诸如NF-κB-荧光素酶/表达4-1BB的Jurkat细胞分析或原代T细胞共培养分析。由本领域技术人员容易地鉴定适合用于这些分析中的表达TAA的细胞系。举例来说，为评估在存在表达FRα的细胞的情况下4-1BB x FRα抗体构建体促进4-1BB活化的能力，可使用许多细胞系，例如但不限于IGROV1、OVCAR3、OVKATE、NCI-H441、NCI-H661、NCI-H1975或HCC827。基于如经由例如定量流式细胞术实验通过参考抗体与这些表达FRα的细胞系的结合所测量的在这些细胞中所表达的受体数目，可将这些细胞分为FRα高、FRα中以及FRα低。在一些实施方案中，FRα高细胞可表达每个细胞大于约500,000个FRα分子，FRα中则为介于每个细胞约200,000与约500,000个FRα分子之间，而FRα低则为低于每个细胞约200,000个FRα分子。在一些实施方案中，FRα阴性细胞为通过流式细胞术不能检测到参考抗体与FRα的结合的那些细胞。
还可通过标准技术评估4-1BB x TAA抗体构建体、4-1BB抗体构建体或FRα抗体构建体的体内功效。举例来说，可在各种肿瘤模型中检验抗体构建体对肿瘤生长的效应。本领域中已知若干适合的动物模型用于测试候选疗法治疗癌症(诸如乳腺癌或胃癌)的能力。一些模型为可商购获得的。适合的模型包括同源或异种移植模型(参见下文)。通常在肿瘤在动物中已建立之后施用所要测试的构建体，但在一些情况下，可将构建体与细胞系一起施用。对肿瘤的体积、动物的存活和/或可能与功能有关的反应进行监测以确定构建体是否能够治疗肿瘤。可静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.)施用构建体。给药时间表和量不同，但可由熟练人员容易地确定。示例性剂量将为10mg/kg，每周一次。可通过标准程序监测肿瘤生长。举例来说，当已使用标记的肿瘤细胞时，可通过适当的成像技术监测肿瘤生长。对于实体肿瘤，还可通过卡尺测量肿瘤大小。可指示构建体功效的其他反应可包括全身或局部化的细胞因子或趋化因子反应(诸如但不限于IFNγ、IL-2、TNFα、CXCL8、IP-10、RANTES)增加或降低、免疫细胞(诸如T、NK、NKT、B、DC、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)的数目增加或降低、免疫细胞上或中(诸如但不限于PD1、Tim3、Lag3、4-1BB、CD163、EOMES、TOX)或肿瘤表面上(PDL1)的主要表面细胞内或核蛋白的表达增加或降低。还预期还可在体外分析(诸如本文和实施例中所描述的免疫细胞共培养分析)中对这些反应进行评估，以测试候选4-1BB x TAA抗体构建体的活性。
体内小鼠肿瘤模型可为同源或异种移植模型。同源模型涉及将来自一个小鼠的肿瘤移植至另一小鼠，其中两个小鼠的遗传背景足够接近，使得接受者小鼠免疫系统不排斥肿瘤(Teicher, BA Tumor models in cancer research,Springer 2011)。这可从小鼠到小鼠直接进行，或经由在培养中稳定的细胞系来进行。如果细胞系不天然地表达TAA，那么可使用标准分子生物学技术将细胞系工程化以表达TAA，这使得能够控制表达水平。
异种移植肿瘤模型涉及将来自另一物种(通常为人)的肿瘤移植至小鼠中。小鼠通常将因非自身而排斥肿瘤，但通过阻止T、B以及NK细胞发育并且损害骨髓细胞功能的一组突变而工程化从而缺乏功能性适应性免疫系统。适合于移植人肿瘤细胞的常见小鼠品种为NSGTM、NOGTM以及NRG小鼠，所述小鼠在NOD背景下将Prkdcscid或Rag1-/-与IL2rg突变组合(Morton等,Cancer Research 2016；76:21第6153页至第6158页)。这些小鼠可植入了人肿瘤，但缺乏适应性免疫系统。人肿瘤细胞可来自在细胞培养中稳定的细胞(诸如OVCAR3、HCC827、IGROV1或H1975)或来自已移除肿瘤的患者。然后可通过添加来自人供体的PBMC、T细胞或CD34+HSC来概述免疫系统。然后，这些免疫细胞可以T细胞在实验期间充当效应子使宿主重建。
竞争性结合分析和抗体序列的表位定位
可通过标准竞争性结合分析来确定由本文所描述的4-1BB抗体构建体结合的4-1BB表位或由FRα抗体构建体结合的表位(Fendly等,Cancer Research 50:1550-1558(1990))。举例来说，对于4-1BB，可通过将荧光引导至经工程化以表达4-1BB的完整细胞上使用适合的方法定量荧光来对抗体进行交叉阻断研究。使用已建立的程序使每种测试抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合(Wofsy等,Selected Methods in Cellular Immunology,第287页,Mishel和Schiigi (编)San Francisco:W.J.Freeman Co.(1980))。如果与不相关的抗体对照相比并且在相同抗体浓度下每一者均阻断另一者的结合达40％或更大，那么将抗体视为共享表位。使用此分析，本领域技术人员可鉴定与本文所描述的那些抗体结合至相同表位的其他抗体。可进行缺失分析以鉴定抗原表位在4-1BB的多肽序列中的近似位置。以类似方式，还可鉴定由4-1BB x TAA抗体构建体的TAA抗原结合结构域或FRα抗体构建体结合的表位。
药物组合物
某些实施方案涉及包含本文所描述的抗体构建体以及药学上可接受的载体的药物组合物。
术语“药学上可接受”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常认可的药典中被列举用于动物，并且更特别是用于人。
术语“载体”是指与构建体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、媒介物或它们的组合。此类药物载体可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些方面中，载体为自然界中不存在的人造载体。当静脉内施用药物组合物时，可使用水作为载体。还可采用盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液作为液体载体，特别是对于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可含有微小量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。E.W.Martin在“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述了适合的药物载体的实例。
药物组合物可呈溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。可使用传统结合剂和载体(诸如三酸甘油酯)将组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，诸如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
药物组合物将含有治疗有效量的抗体构建体，以及适当量的载体，以便提供用于向患者适当施用的形式。制剂应适合施用模式。
在某些实施方案中，根据常规程序将包含抗体构建体的组合物配制为适合于向人静脉内施用的药物组合物。典型地，用于静脉内施用的组合物为于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂(诸如利诺卡因(lignocaine))以缓解注射位点的疼痛。通常，将成分分开地或以单位剂型混合在一起例如以干燥冻干粉末或无水浓缩物形式供应于指示活性剂的量的密闭容器(诸如安瓿或药囊(sachette))中。在要通过输注施用组合物的情况下，可使用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶对它进行分配。在要通过注射施用组合物的情况下，可提供具有灭菌注射用水或盐水的安瓿，使得可在施用之前将成分混合。
在某些实施方案中，将本文所描述的组合物配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐；以及与阳离子形成的那些盐，诸如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的那些盐。
使用抗体构建体的方法
在某些实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括以有效治疗或改善癌症的量向需要此类治疗、预防或改善的受试者施用本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体。在其他实施方案中，提供了一种将4-1BB x TAA抗体构建体用于制备用于治疗、预防或改善受试者的癌症的药剂的方法。在其他实施方案中，可将4-1BB x TAA抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症。如下文所描述还可将4-1BB抗体构建体和FRα抗体构建体用于治疗癌症。
在一些实施方案中，可将4-1BB x TAA抗体构建体、4-1BB抗体构建体或FRα抗体构建体用于受试者中以治疗、预防或改善选自以下的癌症：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、头颈癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、肾癌或甲状腺癌。在特定实施方案中，可使用4-1BB x TAA抗体构建体来治疗、预防或改善受试者的肺癌或卵巢癌。在某些实施方案中，可将4-1BB x TAA抗体构建体用于治疗实体肿瘤。在4-1BB x TAA为4-1BB x FRα抗体构建体的实施方案中，可使用构建体来治疗、预防或改善受试者的肺癌或卵巢癌。在4-1BB xTAA为4-1BB x NaPi2b抗体构建体的实施方案中，可使用构建体来治疗、预防或改善受试者的肺癌。
术语“受试者”是指动物，在一些实施方案中指哺乳动物，所述哺乳动物为治疗、观测或实验的目标。动物可为人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、犬、猫、鼠、牛、马以及猪。
“治疗(treatment/treat)”是指进行临床干预以求改变所治疗的个体或细胞的天然过程，并且可在临床病理学过程期间进行。治疗的所要效果包括预防疾病复发、缓解症状、消除疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减缓疾病状态以及缓和或改善预后。在一些实施方案中，使用本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体来延迟受试者中疾病或病症的发展。在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体和方法在受试者中实现肿瘤消退。在一个实施方案中，本文所描述的4-1BB x TAA抗体构建体和方法在受试者中实现对肿瘤/癌症生长的抑制。
如本文所用的术语“有效量”是指所施用的抗体构建体的量，所述量将实现所叙述的方法的目标，例如在某种程度上缓解所治疗的疾病、疾患或病症的症状中的一者或多者。可通过标准临床技术来确定本文所描述的组合物将有效治疗、抑制以及预防与治疗性蛋白质的表达和/或活性异常相关的疾病或病症的量。此外，可任选采用体外分析来帮助鉴定最佳剂量范围。配制中要采用的精确剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断以及每个患者的情况来决定。可由从体外或动物模型测试系统得到的剂量反应曲线推断出有效剂量。
如本文所用，“治疗有效量”意指产生施药要达到的所需效应的量。在一些实施方案中，所述术语是指当根据治疗性给药方案向罹患或易患疾病、病症和/或疾患的群体施用时，足以治疗所述疾病、病症和/或疾患的量。在一些实施方案中，治疗有效量为使疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状的发生率和/或严重程度降低和/或使其发作延迟的量。本领域一般技术人员将了解，术语“治疗有效量”实际上不要求在特定个体中实现成功治疗。相反地，治疗有效量可为当向需要此类治疗的患者施用时在大量受试者中提供特定所需药理学反应的量。在一些实施方案中，提到治疗有效量可为提到如在一个或多个特定组织(例如受疾病、病症或疾患影响的组织)或流体(例如血液、唾液、血清、汗液、眼泪、尿液等)中所测量的量。本领域一般技术人员将了解，在一些实施方案中，可以单个剂量配制和/或施用治疗有效量的特定药剂或疗法。在一些实施方案中，可以多个剂量配制和/或施用治疗有效的剂，例如作为给药方案的一部分。
可向受试者施用4-1BB x TAA抗体构建体。各种递送系统为已知的并且可用于施用本文所描述的抗体构建体制剂，例如囊封于脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))；将核酸构建为逆转录病毒或其他载体的一部分等。引入方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外以及经口途径。可通过任何方便的途径施用化合物或组合物，例如通过输注或快速注射、通过经上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身的或局部的。此外，在某些实施方案中，需要通过包括心室内和鞘内注射的任何适合的途径将本文所描述的抗体构建体组合物引入中枢神经系统中；可通过例如连接至储集器(诸如奥马耶储集器(Ommayareservoir))的心室内导管促进心室内注射。还可采用经肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及含有粉雾剂的制剂。
在一个特定实施方案中，需要将本文所描述的抗体构建体或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如但不限于在手术期间局部输注、表面施加(例如手术后结合伤口敷料)、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物来实现，所述植入物具有多孔、非多孔或凝胶材料，包括膜(诸如硅橡胶(sialastic)膜)或纤维。优选地，当施用包括本文所描述的抗体构建体的蛋白质时，必须谨慎的是使用不吸收蛋白质的材料。
在另一实施方案中，可在囊泡，特别是脂质体中递送抗体构建体或组合物(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等,Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,第353页至第365页(1989)；Lopez-Berestein,同前,第317页至第327页；参见总体上同前)。
在另一实施方案中，可在控制释放系统中递送抗体构建体或组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer,同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等,Surgery 88:507(1980)；Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一实施方案中，可使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy等,Science 228:190(1985)；During等,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等,J.Neurosurg.71:105(1989))。在另一实施方案中，可将控制释放系统放置于治疗目标(例如脑)附近，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applicationsof Controlled Release,第2卷,第115页至第138页(1984))。
在包含编码本文所描述的抗体构建体的核酸的一个特定实施方案中，可如下在体内施用核酸以促进它编码的蛋白质的表达：通过将核酸构建为适当的核酸表达载体的一部分并且例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；生物弹射击，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知进入核的同源框样肽连接施用(参见例如Joliot等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868(1991))等来施用它以使得它变得在细胞内。或者，可将核酸引入细胞内并且通过同源重组合并在宿主细胞DNA内用于表达。
可通过标准临床技术确定将在治疗、抑制或预防疾病或病症中有效的抗体构建体的量。此外，可任选采用体外分析来帮助鉴定最佳剂量范围。配制中要采用的精确剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断以及每个患者的情况来决定。可由从体外或动物模型测试系统得到的剂量反应曲线推断出有效剂量。
可将本文所描述的抗体构建体单独地或与其他替代形式的治疗或抗癌疗法(例如放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法、双特异性抗体以及抗肿瘤剂)组合施用。通常，施用物种与患者相同的物种来源或物种反应性(在抗体的情况下)的产物为优选的。
在一些实施方案中，可将抗体构建体用于治疗已经历一种或多种替代形式的抗癌疗法的患者。在一些实施方案中，患者已复发或未能对一种或多种替代形式的抗癌疗法作出反应。在其他实施方案中，向患者施用抗体构建体与一种或多种替代形式的抗癌疗法的组合。在其他实施方案中，向已变得对于一种或多种替代形式的抗癌疗法来说具难治性的患者施用抗体构建体。
药盒和制品
本文还描述了包含一个或多个抗体构建体的药盒。药盒的个别组分将包装在单独的容器中，并且呈由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构指定的形式的须知可与此类容器相关联，所述须知反映所述机构批准制造、使用或销售。药盒可任选含有概括抗体构建体的使用方法或施用方案的说明书或用法说明。
当以溶液(例如水溶液或无菌水溶液)形式提供药盒的一个或多个组分时，容器构件可本身为吸入器、注射器、移液管、眼药水滴管或其他像这类的设备，可从所述设备向受试者施用溶液或施加至药盒的其他组分中并且与其混合。
还可以干燥或冻干形式提供药盒的组分，并且药盒可另外含有适合用于复原冻干组分的溶剂。不管容器的数目或类型，本文所描述的药盒还可包含用于帮助将组合物施用至患者的仪器。此类仪器可为吸入器、鼻用喷雾装置、注射器、移液管、镊子、测量过的勺子、眼药水滴管或类似医学上批准的递送媒介物。
某些实施方案涉及含有适合用于治疗如本文所描述的患者的材料的制品。制品包括容器以及容器上或与容器缔合的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、静脉溶液袋等。容器可由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器装有包含单独的或与有效治疗患者的另一组合物组合的抗体构建体的组合物，并且可具有无菌存取孔(例如容器可为静脉溶液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选疾患。在一些实施方案中，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中组合物包含本文所描述的抗体构建体；以及(b)其中含有组合物的第二容器，其中第二容器中的组合物包含另一细胞毒性剂或者治疗剂。在此类实施方案中，制品可还包括指示组合物可用于治疗特定疾患的包装插页。或者或另外，制品可还包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑细菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)以及右旋糖溶液。制品可任选还包括由商业和用户观点来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头以及注射器。
多肽和多核苷酸
如本文所描述，抗体构建体包含至少一种多肽。某些实施方案涉及编码本文所描述的此类多肽的多核苷酸。
本文所描述的抗体构建体、多肽以及多核苷酸典型地为分离的。如本文所用，“分离”意味着一种剂(例如多肽或多核苷酸)已被从其天然细胞培养环境的组分中鉴定并且分离和/或回收。其天然环境的污染物组分为将妨碍抗体构建体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素以及其他蛋白或非蛋白溶质。分离也指已例如经由人为干预合成产生一种剂。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。换句话说，关于多肽的描述同样适用于描述肽以及描述蛋白质，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基础化学结构(即结合至氢、羧基、氨基以及R基团的a碳)的化合物，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰过的R基团(诸如正亮氨酸)或修饰过的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。提到氨基酸包括例如天然存在的蛋白原性L-氨基酸；D-氨基酸、化学修饰的氨基酸，诸如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白原性氨基酸，诸如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域中已知为氨基酸特征的特性的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、侧链中具有额外的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及侧链中的羧酸官能团用磺酸基置换的氨基酸(例如磺基丙氨酸)。将非天然氨基酸，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸合并至本文所描述的抗体构建体中可以许多不同的方式为有利的。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比展现增加的体外或体内稳定性。因此，当需要或要求更大的细胞内稳定性时，构建合并了D-氨基酸的肽等可特别有用。更具体地说，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具抗性，由此提供分子的改善的生物利用率以及延长的体内寿命(当需要此类特性时)。另外，D-肽等因II类主要组织相容性复合物呈递至T辅助细胞受限而不能被高效加工，并且因此，不太可能在整个有机体中诱导体液免疫反应。
在本文中可通过通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的一字母符号提到氨基酸。同样地，可通过通常接受的单字母编码提到核苷酸。
本文还包括编码抗体构建体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”旨在指示两个或更多个核苷酸分子的连续延伸段。核苷酸序列可具有基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源，或它们的任何组合。
术语“核苷酸序列”或“核酸序列”旨在指示两个或更多个核苷酸分子的连续延伸段。核苷酸序列可具有基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源，或它们的任何组合。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”以及“细胞培养物”在本文中可互换使用并且所有此类术语应理解为包括由细胞的生长或培养产生的后代。“转化”和“转染”可互换地用于指将核酸序列引入细胞中的过程。
术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其呈单链或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有与参考核酸具有类似结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外特别限制，否则所述术语也指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽基核酸)、用于反义技术中的DNA的类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺等)。除非另外指出，否则特定核酸序列还隐式地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地说，可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸与核酸序列两者。相对于特定核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码同一或大体上同一的氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不编码大体上同一的序列的氨基酸序列。由于遗传密码的简并度，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在通过密码子指定丙氨酸的每个位置，可将密码子改变为所描述的对应密码子中的任一者而不会改变所编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异”，这是一个种类的保守修饰变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还涵盖核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可对核酸中的每个密码子(除了通常为唯一用于甲硫氨酸的密码子的AUG，以及通常为唯一用于色氨酸的密码子的TGG)进行修饰，得到功能相同的分子。因此，在各个所描述的序列中暗示了编码多肽的核酸的每种沉默变异。
关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的使所编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸改变、增加或缺失的个别取代、缺失或添加为“保守修饰的变体”，其中所述改变引起氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸用化学上类似的氨基酸取代。
提供功能类似的氨基酸的保守取代表为本领域一般技术人员已知的。此类保守修饰的变体为除本文所描述的多态变体、种间同源物以及等位基因外的并且不排除本文所描述的多态变体、种间同源物以及等位基因。以下八个组各自含有对彼此为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情形中，术语“同一”是指两个或更多个序列或子序列相同。如果当在比较窗或指定区域内进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法中的一者(或本领域技术人员可获得的其他算法)或通过人工比对和视觉检查所测量，序列具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域内约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，那么所述序列为“基本上同一”的。此定义也称为测试序列的互补性。同一性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域中，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域中，或(在未指定时)跨越多核苷酸或多肽的整个序列。可通过包括以下步骤的方法来获得编码本文所描述的多肽的多核苷酸，包括来自除人外的物种的同源物：在严格杂交条件下，用具有本文所描述的多核苷酸序列或其片段的标记过的探针对文库进行筛选，以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA以及基因组克隆。此类杂交技术为熟练技工熟知的。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与参考序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗”包括提到选自由20至600组成的组，通常为约50至约200，更通常为约100至约150的连续位置数目中的任一者的区段，其中在将两个序列最佳比对之后，可将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列相比较。用于比较的序列比对方法为本领域一般技术人员已知的。可如下进行用于比较的序列最佳比对，包括但不限于通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性检索法、通过这些算法的计算机化实现方式(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group),575位理学博士,Madison,Wis.)或通过人工比对以及视觉检查(参见例如Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
适合用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。公众通过在万维网ncbi.nlm.nih.gov可获得的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可获得用于进行BLAST分析的软件。BLAST算法参数W、T以及X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认值：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并且比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认值：字长为3并且期望值(E)为10，并且BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并且比较两条链。典型地在关闭“低复杂性”过滤程序的情况下进行BLAST算法。
BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性度量为最小总和概率(P(N))，最小总和概率指示两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然出现匹配的概率。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么认为核酸与参考序列类似。
如本文所用，术语“工程化”和其语法变化型式被认为包括对肽骨架的任何操纵或天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或个别氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法组合。通过标准分子生物学技术来表达和产生工程化的蛋白质。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始多肽的100氨基酸序列具有至少50％同一性，那么所述衍生物或变体被认为与多肽享有“同源性”或与多肽“同源”。在某些实施方案中，衍生物或变体与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的多肽或多肽片段至少75％相同。在各个实施方案中，衍生物或变体与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的多肽或多肽片段至少85％、90％、95％或99％相同。
在一些方面中，抗体构建体包含与本文所公开的表格或登录号中所列的相关氨基酸序列或其片段至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些方面中，分离的抗体构建体包含由与本文所公开的表格或登录号中所列的相关核苷酸序列或其片段至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸编码的氨基酸序列。
实施方案
A1.一种抗体构建体，所述抗体构建体包含：
a)第一4-1BB结合结构域，所述第一4-1BB结合结构域结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)，以及
b)肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域(TAA抗原结合结构域)，所述TAA抗原结合结构域结合至TAA，
其中所述第一4-1BB结合结构域和所述TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
A2.根据实施方案A1所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB结合结构域为第一4-1BB抗原结合结构域或4-1BB配体。
A3.根据实施方案A2所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域结合至4-1BB ECD的第一表位。
A4.根据实施方案A1至A3中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含第二4-1BB结合结构域。
A5.根据实施方案A4所述的抗体构建体，其中所述第二4-1BB结合结构域为第二4-1BB抗原结合结构域。
A6.根据实施方案A5所述的抗体构建体，其中所述第二4-1BB抗原结合结构域结合至4-1BB ECD的第二表位。
A7.根据实施方案A5或A6所述的抗体构建体，其中4-1BB ECD的所述第一表位与4-1BB ECD的所述第二表位相同。
A8.根据实施方案A5或A6所述的抗体构建体，其中4-1BB ECD的所述第一表位与4-1BB ECD的所述第二表位不同。
A9.根据实施方案A4至A8中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域或所述第二4-1BB抗原结合结构域结合至人和食蟹猴4-1BB。
A10.根据实施方案A4至A9中的任一者所述的抗体构建体，其中所述4-1BB抗原结合结构域结合至4-1BB的结构域1或结构域2。
A11.根据实施方案A4至A9中的任一者所述的抗体构建体，其中所述4-1BB抗原结合结构域结合至除4-1BB的结构域3和4外的结构域。
A12.根据实施方案A1至A9中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB结合结构域为第一4-1BB抗原结合结构域，所述第一4-1BB抗原结合结构域包含含有三个CDR的重链可变序列以及含有三个CDR的轻链可变序列，并且所述重链可变序列和所述轻链可变序列来自变体v28726、v28727、v28728、v28730、v20022、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v20036、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v20023、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28995中的任一者。
A13.根据实施方案A4至A12中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和/或所述第二4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式。
A14.根据实施方案A4至A12中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域或所述第二4-1BB抗原结合结构域中的一者呈scFv模式。
A15.根据实施方案A1至A14中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域为叶酸受体-α(FRα)抗原结合结构域、溶质载体家族34成员2(NaPi2b)抗原结合结构域、HER2抗原结合结构域、间皮素抗原结合结构域或溶质载体家族39成员6(LIV-1)抗原结合结构域。
A16.根据实施方案A1至A15中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域为FRα抗原结合结构域。
A17.根据实施方案A16所述抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域包含抗体8K22或1H06的三个重链CDR和三个轻链CDR。
A18.根据实施方案A17所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域为人抗原结合结构域或人源化抗原结合结构域。
A19.根据实施方案A1至A18中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域呈scFv模式。
A20.根据实施方案A1至A18中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域呈Fab模式。
A21.根据实施方案A1至A20中的任一者所述的抗体构建体，其中所述支架为具有第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚Fc构建体，每个Fc多肽包含CH3序列，或其中所述支架为接头或白蛋白多肽。
A22.根据实施方案A21所述的抗体构建体，其中所述支架为具有不同于所述第二Fc多肽的第一Fc多肽的异二聚Fc构建体，并且其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽的CH3序列包含促进形成异二聚Fc的氨基酸取代。
A23.根据实施方案A22所述的抗体构建体，其中：
a)一个Fc多肽包含氨基酸取代T350V_L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T350V_T366L_K392L_T394W；
b)一个Fc多肽包含氨基酸取代T350V_T366L_K392M_T394W并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T350V_L351Y_F405A_Y407V；
c)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366L_K392M_T394W；
d)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366L_K392L_T394W；或
e)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_S400E_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366I_N390R_K392M_T394W，
其中残基的编号是根据EU编号系统进行。
A24.根据实施方案A21至A23中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含降低效应功能的一个或多个氨基酸修饰。
A25.根据实施方案A21至A24中的任一者所述的抗体构建体，其中
所述第一4-1BB抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的N端，并且所述TAA抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的C端。
A26.根据实施方案A25所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含连接至所述第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域。
A27.一种特异性结合于4-1BB的抗体构建体或其抗原结合片段，所述抗体构建体或其抗原结合片段包含：包含三个CDR的重链可变序列以及包含三个CDR的轻链可变序列，并且所述重链可变序列和所述轻链可变序列来自变体v28726、v28727、v28728、v28730、v20022、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v20036、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v20023、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28995中的任一者。
A28.根据实施方案A27所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含与变体v28726、v28727、v28728、v28730、v20022、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v20036、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v20023、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28995的VH和VL序列中的任一者具有至少85％序列同一性的VH序列和VL序列。
A29.根据实施方案A1至A28中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
A30.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案A1至A29中的任一者所述的抗体构建体。
A31.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据实施方案A1至A28中的任一者所述的抗体构建体。
A32.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据实施方案A31所述的一种或多种核酸。
A33.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据实施方案A31所述的一种或多种核酸，或根据实施方案A32所述的一种或多种载体。
A34.一种制备根据实施方案A1至A29中的任一者所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如实施方案A33所述的分离的细胞，以及将所述抗体构建体纯化。
A35.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案A1至A29中的任一者所述的抗体构建体。
A36.有效量的根据实施方案A1至A29中的任一者所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
A37.根据实施方案A1至A29中的任一者所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
A38.根据实施方案A1至A29中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
B1.一种抗体构建体，所述抗体构建体包含：
a)第一4-1BB结合结构域，所述第一4-1BB结合结构域结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)，以及
b)第一肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域(TAA抗原结合结构域)，所述第一TAA抗原结合结构域结合至TAA，
其中所述第一4-1BB结合结构域和所述第一TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
B2.根据实施方案B1所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB结合结构域为第一4-1BB抗原结合结构域。
B3.根据实施方案B1或B2所述的构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域来源于激动性抗4-1BB抗体。
B4.根据实施方案B1至B3中的任一者所述的构建体，其中：
a)呈单价形式的所述第一4-1BB抗原结合结构域对人4-1BB具有介于约1μM与100pM之间的KD；和/或
b)所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过流式细胞术所测定结合至一种或多种表达TAA的细胞系；和/或
c)所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过SPR所测量结合至人4-1BB并且如通过SPR所测量结合至所述TAA；和/或
d)在存在表达TAA的细胞的情况下，所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过细胞因子产生所测量刺激T细胞中的4-1BB活性；和/或
e)所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过流式细胞术所测量结合至表达4-1BB的细胞并且结合至表达TAA的细胞；和/或
f)在存在表达TAA的细胞的情况下，所述4-1BB x TAA抗体构建体能够刺激表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。
B5.根据实施方案B1至B4中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域包含：a)包含抗体1C3的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1C3的三个轻链CDR的轻链可变结构域；b)包含抗体1C8的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1C8的三个轻链CDR的轻链可变结构域；c)包含抗体1G1的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1G1的三个轻链CDR的轻链可变结构域；d)包含抗体2E8的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体2E8的三个轻链CDR的轻链可变结构域；e)包含抗体3E7的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体3E7的三个轻链CDR的轻链可变结构域；f)包含抗体4E6的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体4E6的三个轻链CDR的轻链可变结构域；g)包含抗体5G8的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体5G8的三个轻链CDR的轻链可变结构域；或h)包含抗体6B3的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体6B3的三个轻链CDR的轻链可变结构域。
B6.根据实施方案B1至B5中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域为人抗原结合结构域或人源化抗原结合结构域。
B7.根据实施方案B6所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域包含：
a)与v28726的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28726的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
b)与v28727的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28727的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
c)与v28728的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28728的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
d)与v28730的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28730的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
e)与v28700的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28700的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
f)与v28704的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28704的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
g)与v28705的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28705的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
h)与v28706的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28706的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
i)与v28711的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28711的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
j)与v28712的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28712的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
k)与v28713的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28713的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
l)与v28696的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28696的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
m)与v28697的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28697的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
n)与v28698的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28698的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
o)与v28701的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28701的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
p)与v28702的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28702的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
q)与v28703的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28703的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
r)与v28707的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28707的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
s)与v28683的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28683的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
t)与v28684的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28684的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
u)与v28685的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28685的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
v)与v28686的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28686的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
w)与v28687的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28687的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
x)与v28688的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28688的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
y)与v28689的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28689的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
z)与v28690的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28690的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
aa)与v28691的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28691的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
ab)与v28692的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28692的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
ac)与v28694的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28694的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；或
ad)与v28695的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28695的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列。
B8.根据实施方案B1至B7中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含第二4-1BB结合结构域。
B9.根据实施方案B1至B8中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第二4-1BB结合结构域为第二4-1BB抗原结合结构域。
B10.根据实施方案B9所述的抗体构建体，其中所述第二4-1BB抗原结合结构域与所述第一4-1BB抗原结合结构域相同。
B11.根据实施方案B10所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和/或所述第二4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式。
B12.根据实施方案B1至B11中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域为叶酸受体-α(FRα)抗原结合结构域、溶质载体家族34成员2(NaPi2b)抗原结合结构域、HER2抗原结合结构域、间皮素抗原结合结构域或溶质载体家族39成员6(LIV-1)抗原结合结构域。
B13.根据实施方案B1至B12中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含第二TAA抗原结合结构域。
B14.根据实施方案B13所述的抗体构建体，其中所述第一TAA抗原结合结构域和所述第二TAA抗原结合结构域结合至相同的TAA。
B15.根据实施方案B1至B14中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一TAA抗原结合结构域为FRα抗原结合结构域。
B16.根据实施方案B15所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域包含：a)包含抗体8K22的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体8K22的三个轻链CDR的轻链可变结构域；或b)包含抗体1H06的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1H06的三个轻链CDR的轻链可变结构域。
B17.根据实施方案B16所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域为人抗原结合结构域或人源化抗原结合结构域。
B18.根据实施方案B17所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域包含：
a)与v23794的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23794的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
b)与v23795的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23795的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
c)与v23796的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23796的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
d)与v23797的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23797的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
e)与v23798的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23798的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
f)与v23799的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23799的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
g)与v23800的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23800的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
h)与v23801的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23801的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
i)与v23802的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23802的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
j)与v23803的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23803的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
k)与v23804的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23804的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
l)与v23805的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23805的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
m)与v23806的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23806的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
n)与v23807的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23807的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
o)与v23808的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23808的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
p)与v23809的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23809的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
q)与v23810的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23810的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
r)与v23811的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23811的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
s)与v23812的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23812的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
t)与v23813的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23813的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
u)与v23814的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23814的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
v)与v23815的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23815的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
w)与v23816的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23816的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
x)与v23817的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23817的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；或
y)与v23818的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23818的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列。
B19.根据实施方案B1至B18中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域呈scFv模式。
B20.根据实施方案B1至B18中的任一者所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域呈Fab模式。
B21.根据实施方案B1至B20中的任一者所述的抗体构建体，其中所述支架为具有第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚Fc构建体，每个Fc多肽包含CH3序列，或其中所述支架为接头或白蛋白多肽。
B22.根据实施方案B21所述的抗体构建体，其中所述支架为具有不同于所述第二Fc多肽的第一Fc多肽的异二聚Fc构建体，并且其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽的CH3序列包含促进形成异二聚Fc的氨基酸取代。
B23.根据实施方案B22所述的抗体构建体，其中：
a)一个Fc多肽包含氨基酸取代T350V_L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T350V_T366L_K392L_T394W；
b)一个Fc多肽包含氨基酸取代T350V_T366L_K392M_T394W并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T350V_L351Y_F405A_Y407V；
c)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366L_K392M_T394W；
d)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366L_K392L_T394W；或
e)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_S400E_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366I_N390R_K392M_T394W，
其中残基的编号是根据EU编号系统进行。
B24.根据实施方案B21或B23中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含降低效应功能的一个或多个氨基酸修饰。
B25.根据实施方案B24所述的抗体构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰为L234A、L235A以及D265S，其中残基的编号是根据EU编号系统进行。
B26.根据实施方案B1至B25中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的N端，并且所述第一TAA抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的C端。
B27.根据实施方案B1至B25中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的N端，并且所述第一TAA抗原结合结构域连接至所述第二Fc多肽的C端。
B28.根据实施方案B26或B27所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含连接至所述第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域。
B29.根据实施方案B1至B25中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含连接至所述第一Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第一Fc多肽的C端的第一TAA抗原结合结构域以及连接至所述第二Fc多肽的C端的第二TAA抗原结合结构域。
B30.根据实施方案B1至B25中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含连接至所述第一Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第一Fc多肽的C端的第一TAA抗原结合结构域以及连接至所述第二Fc多肽的C端的第二TAA抗原结合结构域。
B31.根据实施方案B1至B30中的任一者所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和或所述第二4-1BB抗原结合结构域包含含有抗体1G1的三个重链CDR的重链可变结构域以及含有抗体1G1的三个轻链CDR的轻链可变结构域，并且所述第一FRα抗原结合结构域和/或所述第二FRα抗原结合结构域包含含有抗体8K22的三个重链CDR的重链可变结构域以及包含抗体8K22的三个轻链CDR的轻链可变结构域。
B32.根据实施方案B31所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和所述第二4-1BB抗原结合结构域包含与v28614的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28614的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列，并且所述第一FRα抗原结合结构域和/或所述第二FRα抗原结合结构域包含与v23807的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23807的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列。
B33.根据实施方案B32所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含如SEQ ID NO:353中所列的第一重链多肽序列、如SEQ ID NO:349中所列的第二重链多肽序列以及如SEQ IDNO:346中所列的轻链多肽序列。
B34.根据实施方案B1至B33中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
B35.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案B1至B33中的任一者所述的抗体构建体。
B36.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据实施方案B1至B34中的任一者所述的抗体构建体。
B37.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据实施方案B36所述的一种或多种核酸。
B38.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据实施方案B36所述的一种或多种核酸，或根据实施方案B37所述的一种或多种载体。
B39.一种制备根据实施方案B1至B34中的任一者所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如实施方案B38所述的分离的细胞，以及将所述抗体构建体纯化。
B40.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案B1至B34中的任一者所述的抗体构建体。
B41.有效量的根据实施方案B1至B34中的任一者所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
B42.根据实施方案B1至B34中的任一者所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
B43.根据实施方案B1至B34中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
C1.一种特异性结合于4-1BB的抗体构建体或其抗原结合片段，所述抗体构建体或其抗原结合片段包含：包含三个重链CDR的重链可变序列以及包含三个轻链CDR的轻链可变序列，其中所述重链CDR和所述轻链CDR来自抗体1G1、1B2、1C3、1C8、2A7、2E8、2H9、3D7、3H1、3E7、3G4、4B11、4E6、4F9、4G10、5E2、5G8或6B3中的任一者。
C2.根据实施方案C1所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体激动4-1BB。
C3.根据实施方案C2所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含含有三个CDR的重链可变(VH)序列以及含有三个CDR的轻链可变(VL)序列，其中所述重链CDR和所述轻链CDR来自抗体1G1、1C3、1C8、2E8、3E7、4E6、5G8或6B3中的任一者。
C4.根据实施方案C1至C3中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段为或包含人源化抗体。
C5.根据实施方案C1或C2所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含与变体v28726、v28727、v28728、v28730、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28695的VH和VL序列中的任一者具有至少85％序列同一性的VH序列和VL序列。
C6.根据实施方案C1至C5中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段对人4-1BB分子具有约10nM至约500nM的结合亲和力(KD)。
C7.根据实施方案C1至C6中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段结合至人4-1BB多肽的细胞外结构域内的表位。
C8.根据实施方案C1至C7中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括免疫球蛋白恒定结构域，其中所述恒定结构域来自IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体、IgA或其变体、IgE或其变体、IgM或其变体或者IgD或其变体。
C9.根据实施方案C1至C8中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体为或包含人IgG1。
C10.根据实施方案C1至C9中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
C11.根据实施方案C1至C7中的任一者所述的抗体构建体，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、单域抗体或双体抗体。
C12.根据实施方案C1至C11中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
C13.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案C1至C12中的任一者所述的抗体构建体。
C14.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据实施方案C1至C11中的任一者所述的抗体构建体。
C15.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据实施方案C14所述的一种或多种核酸。
C16.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据实施方案C14所述的一种或多种核酸，或根据实施方案C15所述的一种或多种载体。
C17.一种制备根据实施方案C1至C12中的任一者所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如实施方案C16所述的分离的细胞，以及将所述抗体构建体纯化。
C18.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案C1至C12中的任一者所述的抗体构建体。
C19.有效量的根据实施方案C1至C12中的任一者所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
C20.根据实施方案C1至C12中的任一者所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
C21.根据实施方案C1至C12中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
D1.一种特异性结合于FRα的抗体构建体或其抗原结合片段，所述抗体构建体或其抗原结合片段包含：包含三个CDR的重链可变(VH)序列以及包含三个CDR的轻链可变(VL)序列，其中所述重链CDR和所述轻链CDR来自抗体8K22或1H06。
D2.根据实施方案D1所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为或包含人源化抗体。
D3.根据实施方案D1或D2所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，所述抗FRα抗体或抗原结合片段包含与变体23794、23795、23796、23797、23798、23799、23800、23801、23802、23803、23804、23805、23806、23807、23808、23809、23810、23811、23812、23813、23814、23815、23816、23817或23818的VH和VL序列中的任一者具有至少85％序列同一性的VH序列和VL序列。
D4.根据实施方案D1或D2所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，所述抗FRα抗体或抗原结合片段包含与如SEQ ID NO:300中所列的VH序列具有至少85％序列同一性的VH序列以及与如SEQ ID NO:301中所列的VL序列具有至少85％序列同一性的VL序列。
D5.根据实施方案D1至D4中的任一者所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段对人FRα分子具有介于约100pM至约100nM之间的的结合亲和力(KD)。
D6.根据实施方案D1至D5中的任一者所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括免疫球蛋白恒定结构域，其中所述恒定结构域选自IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体、IgA或其变体、IgE或其变体、IgM或其变体以及IgD或其变体。
D7.根据实施方案D1至D6中的任一者所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为或包含人IgG1。
D8.根据实施方案D1至D7中的任一者所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
D9.根据实施方案D1至D8中的任一者所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、单域抗体或双体抗体。
D10.根据实施方案D1至D9中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
D11.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案D1至D10中的任一者所述的抗体构建体。
D12.一种或多种核酸，一种或多种核酸编码根据实施方案D1至D9中的任一者所述的抗体构建体。
D13.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据实施方案D12所述的一种或多种核酸。
D14.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据实施方案D12所述的一种或多种核酸，或根据实施方案D13所述的一种或多种载体。
D15.一种制备根据实施方案D1至D10中的任一者所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如实施方案D14所述的分离的细胞，以及将所述抗体构建体纯化。
D16.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案D1至D10中的任一者所述的抗体构建体。
D17.有效量的根据实施方案D1至D10中的任一者所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
D18.根据实施方案D1至D10中的任一者所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
D19.根据实施方案D1至D10中的任一者所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
实施例
以下为与本文所描述的抗体构建体有关的特定实施方案的实施例。所述实施例仅为说明目的而提供，并且不旨在以任何方式限制本公开的范围。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是当然会允许一些实验误差和偏差。
除非另外指出，否则本发明的实践将采用在本领域的技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。此类技术在文献中有充分解释。参见例如T.E.Creighton，Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,现行版)；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。
实施例1:示例性4-1BB x HER2双特异性抗体构建体的设计和制备
如下文所描述构建靶向4-1BB和TAA HER2的许多示例性双特异性抗体构建体(或双特异性抗体)，以及对照。以如图2中所描述的不同示例性模式制备抗体和对照。制备这些抗体构建体，以允许检验条件性激动4-1BB的潜能，以及对于4-1BB x HER2构建体的活性来说的最佳模式。
靶向4-1BB和HER2的示例性双特异性抗体构建体的设计
将双特异性抗体构建体制备成HER2抗原结合结构域为scFv并且4-1BB抗原结合结构域为Fab的模式。除非另外指出，否则构建体(包括对照)包含IgG1 Fc(参见表1)。这些双特异性抗体构建体包含具有促进形成异二聚Fc的CH3结构域氨基酸取代集合的人IgG1异二聚Fc。这些氨基酸取代集合在本文中称为Het FcA(具有氨基酸取代T350V/L351Y/F405A/Y407V)和Het FcB(具有氨基酸取代T350V/T366L/K392L/T394W)。在表1中将具有这些氨基酸取代集合的变体称为具有“Het Fc”修饰。在表1中指明具有“FcKO”的变体具有破坏FcγR结合的以下CH2氨基酸取代：L234A、L235A以及D265S。根据EU索引标识Fc区中的氨基酸残基。
制备二价、三价以及四价抗体构建体，所述二价、三价以及四价抗体构建体全部具有三条多肽链：一条含有Het FcA突变的重链、含有Het FcB突变的第二重链以及单一轻链。将重链构建成一系列模式，这些模式全部包含呈Fab模式的一个或两个抗4-1BB抗原结合结构域以及呈scFv模式的单一抗HER2抗原结合结构域。下文从N端到C端对这些重链模式进行描述：
-VL-VH-VH-CH1-铰链-CH2-CH3
-VH-CH1-铰链-CH2-CH3-VL-VH
-VH-CH1-铰链-CH2-CH3
-VL-VH-铰链-CH2-CH3
表1提供了所制备的4-1BB x HER2双特异性抗体构建体的描述。“模式”栏中指示了靶向4-1BB的结构域和靶向HER2的结构域的数目。举例来说，在表1中，1x1表明双特异性抗体构建体具有一个4-1BB结合结构域和一个HER2结合结构域，2x1表明双特异性抗体构建体具有两个4-1BB结合结构域和一个HER2结合结构域，等。图3中也呈现了下文所描述的特定双特异性抗体构建体的模式。
表1：靶向4-1BB和HER2的示例性双特异性抗体构建体
Figure BDA0003013068510001261
表15中提供了用于构建构建体的4-1BB抗原结合结构域的VH和VL序列，以及用于构建含有HER2 scFv的构建体的scFv序列。表X列出了构成抗体构建体中的每一者的克隆。在表Y中可找到每个克隆的多肽序列。
4-1BB x HER2双特异性抗体的产生
为允许产生双特异性抗体，将具有5'-EcoR1限制位点-信号肽-以CH3的G446(EU编号)封端的重链克隆-TGA终止点-BamH1切割位点-3'的重链载体连结至pTT5载体中以产生重链表达载体。将具有5'-EcoRI切割位点-信号肽-轻链-TGA终止点-BamH1切割位点-3'的轻链载体连结至pTT5载体中(Durocher Y等,Nucl.Acids Res.2002；30,第2期e9)以产生轻链表达载体。对所得重链和轻链表达载体进行测序，以验证编码DNA的恰当的阅读框和序列。使用两个信号肽中的一者：人工设计的序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:1]，Barash S等,Biochem and Biophys Res.Comm.2002；294,835-842)或HLA-A信号肽MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG[SEQ ID NO:2]。
使变体的重链和轻链在CHO-3E7细胞的200ml培养物中表达。将CHO-3E7细胞以1.7-2x106个细胞/ml的密度在37℃°下在补充有4mM谷氨酰胺(GELife Sciences,Marlborough,MA)和0.1％KoliphorP188(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)的FreeStyleTM F17培养基(Thermo Fisher,Watham,MA)中培养。使用PEI-max(Polyscience,Philadelphia,PA)以1:4(w/w)的DNA:PEI比率将200ml的总体积用总共200μg DNA(100μg的变体DNA和100μg的GFP/AKT/充填DNA)转染。在添加DNA-PEI混合物之后二十四小时，将0.5mM丙戊酸(最终浓度)+1％w/v胰蛋白胨(最终浓度)+1x抗生素/抗霉物质(GE Life Sciences,Marlborough,MA)添加至细胞中，然后将其转移至32℃并且孵育7天，然后收获。°
将澄清的上清液样品分批地与用NaOH清洗并且在DPBS中平衡的MabSelectTMSuReTM树脂(GE Healthcare,Chicago,IL)一起孵育。将树脂倾入清洁的柱子中，将柱子用DPBS洗涤并且将蛋白质用100mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0洗脱。通过添加10％(v/v)1M HEPESpH 8对洗脱的抗体进行pH调节，得到6-7的最终pH值。将样品缓冲液交换至PBS中并且无菌过滤。基于A280nm(NanoDropTM)对蛋白质进行定量。使用
Figure BDA0003013068510001281
便携式系统(CharlesRiver,Wilmington,MA)测定内毒素水平。对于超过0.1EU/mg的样品，这些样品经历使用Proteus NoEndoTM离心柱(Charles River,Wilmington,MA)的内毒素移除。
在蛋白质-A纯化后，将样品缓冲液交换至DPBS中并且无菌过滤，或根据其通过UPLC-SEC所评估的均质性进行SEC纯化。将样品于DBPS中以0.5mL/min的流速加载至AktaAvant 25色谱系统(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)上的Superdex 20010/30增加柱(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)上。基于A280nm收集洗脱的蛋白质的级分，并且使用Caliper LabChip GXII(Perkin Elmer,Waltham,MA)通过非还原型和还原型高通量蛋白质表达分析对级分进行评估。根据HT蛋白质表达LabChip用户指南第2版LabChip GXII用户手册执行程序，进行以下修改。将2μl或5μl(浓度范围5-2000ng/μl)的抗体样品以及7μl的HT蛋白质表达样品缓冲液(Perkin Elmer#760328)添加至96孔板(BioRad,Hercules,CA)中的单独孔中。然后使抗体样品在70℃下变性15min。使用HT蛋白质表达芯片(Perkin Elmer,Waltham,MA)和Ab-200分析设定操作LabChip仪器。
使用
Figure BDA0003013068510001282
便携式测试系统(PTS,Charles River,Wilmington,MA)通过LAL(鲎阿米巴样细胞溶解产物(limulus amebocyte lysate))分析测定内毒素水平。在蛋白质-A和SEC后基于A280nm(Nanodrop)对蛋白质进行定量。
使用设定至30℃并且安装于具有PDA检测器的Waters Acquity UPLC H类生物系统上的Waters Acquity BEH200 SEC柱(2.5mL，4.6x150mm，不锈钢，1.7μm粒子)(WatersLTD,Mississauga,ON)进行UPLC-SEC。运行时间由7min以及使用含0.02％吐温20(Tween20)的DPBS或DPBS(pH 7.4)的运行缓冲液以0.4ml/min每次注射2.8mL的总体积组成。根据在210-500nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并且在280nm下提取色谱图。使用Empower 3软件进行峰整合。
通过LC/MS对双特异性抗体的纯度评估
在如下文所描述的纯化和非变性去糖基化之后，使用质谱法对变体的表观纯度进行评估。
因为抗体仅含有Fc N-连接聚糖，所以仅使用一种酶(N-糖苷酶F(PNG酶-F))来处理样品。使用PNG酶F如下将纯化的样品去糖基化：含每微克抗体0.1U PNG酶F的50mM Tris-HCl pH 7.0，在37℃下孵育过夜，最终蛋白质浓度为0.48mg/mL。°在去糖基化之后，将样品储存在4℃下，然后进行LC-MS分析。
经由最大电喷雾离子源(Ion Max electrospray source)使用与LTQ-OrbitrapXL质谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)联用的Agilent 1100 HPLC系统通过完整的LC-MS对去糖基化蛋白质样品进行分析。将样品(5μg)注射至2.1x 30mm Poros R2逆相柱(AppliedBiosystems)上并且使用以下梯度条件进行拆分：0-3min：20％溶剂B；3-6min：20-90％溶剂B；6-7min：90-20％溶剂B；7-9min：20％溶剂B。溶剂A为脱气的0.1％甲酸水溶液并且溶剂B为脱气的乙腈。流速为3mL/min。将液流进行柱后分离以将100μL/mL引导至电喷雾接口中。将柱子加热至82.5℃并且将溶剂柱前加热至80℃以改善蛋白质峰形。
Figure BDA0003013068510001291
在分析之前，使用ThermoFisher Scientific的LTQ阳离子ESI校准溶液(咖啡因、MRFA以及Ultramark 1621)对LTQ-Orbitrap XL进行校准，并且使用乳白蛋白的1mg/mL溶液进行调整以获得较大蛋白质(>50kDa)的最佳检测。锥孔电压(源片段化设定)为约40V，FT拆分为7,500并且扫描范围为m/z 400-4,000。使用去糖基化IgG标准物(Waters IgG标准物)以及去糖基化抗体标准混合物(25:75半尺寸:全尺寸抗体)针对IgG样品分析对LC-MS系统进行评估。
对于每次LC-MS分析，将在抗体峰(典型地3.6-4.1分钟)上所获得的质谱图汇总，并且使用仪器控制和数据分析软件MassLynxTM(Waters LTD,Missassaugua,ON)的MaxEnt 1模块将整个多电荷离子包络线(m/z 1,400-4,000)反卷积为分子量型态。简单来说，首先在XcaliburTM(Thermo Fisher,Waltham,MA)的察谱模块QualBrowser中打开原始蛋白质LC-MS数据，并且使用由Waters提供的文件转换程序DatabridgeTM转化为与MassLynxTM相容。在MassLynxTM的谱图模块中察看转化的蛋白质谱并且使用MaxEnt 1反卷积。从所得分子量型态中的峰高确定每个样品中每种抗体物质的表观量。+在大多数情况下，抗体包含>95％的所需构建体，没有主要糖变体。
实施例2:如通过表面等离子体共振(SPR)所评估的4-1BB x HER2双特异性抗体构建体结合至4-1BB和HER2的能力
为检验实施例1中所描述的4-1BB x HER2双特异性抗体的产生和特征，通过SPR评估这些抗体结合至人4-1BB和HER2的能力。对4-1BB x HER2双特异性变体16601、16605、16675、16679，以及对照抗体变体19353(在结合至4-1BB的两条重链的C端具有两个抗转运蛋白结构域的曲妥珠单抗)进行评估。
根据SPR的4-1BB与抗体的结合
在25℃的温度下，使用PBS-T(PBS+0.05％(v/v)吐温20)运行缓冲液(添加0.5MEDTA储备溶液达到3.0mM最终浓度)，在BiacoreTM T200仪器(GE Healthcare,Mississauga,ON,Canada)上进行用于测定4-1BB对4-1BB抗体变体的结合亲和力的表面等离子体共振(SPR)结合分析。CM5系列S传感器芯片、BiacoreTM胺偶联试剂盒(NHS、EDC以及1M乙醇胺)以及10mM乙酸钠缓冲液全部购自GE Healthcare。含0.05％吐温20的PBS运行缓冲液(PBS-T)购自Teknova Inc.(Hollister,CA)。山羊多克隆抗人Fc抗体购自Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.(West Grove,PA)。
抗体与4-1BB抗原的SPR结合以两个步骤进行：将抗体直接捕获至抗人Fc特异性多克隆抗体表面，随后注射五种浓度的纯化的人单聚4-1BB(SEQ ID NO:70)。通过裂解4-1BB-Fc融合蛋白(v16730)产生单聚4-1BB蛋白。使4-1BB-Fc表达并且以与以上实施例1中的抗体相同的方式用蛋白质A纯化。使用4-1BB与Fc之间的因子Xa裂解位点并且使用在Fc的C端的10xHis标签制备构建体。
使用5mL Zeba离心柱(ThermoFisher)将dPBS中的v16730缓冲液交换至因子Xa裂解缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、2mM CaCl2 pH 8)中，并且在室温下用0.45％(w/w)的因子Xa(New England Biolabs,Whitby,ON,Canada)裂解过夜。通过添加0.372μM最终浓度的1,5-丹酰-Glu-Gly-Arg-氯甲基酮(Calbiochem,San Diego,California, USA)作为抑制剂来停止裂解反应。通过NR+R SDS-PAGE验证裂解令人满意。随后将裂解反应混合物施加于在dPBS中平衡的1mL HiTrap Ni琼脂糖Excel(GE Heathcare)柱并且将柱子用5xCV dPBS洗涤。将裂解的41BB蛋白收集于流穿级分中。使用蛋白质A纯化通过利用重力将蛋白质样品施加至mAb Select SuRe来移除残余Fc。将流穿物施加至在dPBS中平衡的Superdex 200 10/30柱。收集对应于主要41BB产物的级分并且用于SPR。
如制造商(GE Healthcare)所描述通过标准胺偶联法在CM5系列S传感器芯片上准备抗人Fc表面。简单来说，在EDC/NHS活化之后立即将抗人Fc于10mM NaOAc pH 4.5中的25μg/mL溶液以10μL/min的流速注射420s，直至所有四个流动池上固定约2000个共振单位(RU)。通过以10μL/min进行420s的1M乙醇胺注射使剩余的活性基团中止反应。
通过将5μg/mL溶液以10μL/min的流速注射60s将用于分析的抗体捕获至抗Fc表面。使用单循环动力学，将五种浓度的以40nM开始的两倍稀释系列的4-1BB(对于上清液与纯化抗体运行两者)与空白缓冲液对照依序以40μL/min注射180s，加上600s解离阶段，产生具有缓冲液空白参考的一组传感器图。在25℃的恒定温度下进行实验。将抗人Fc表面再生以准备用于通过以40μL/min持续120s的一个脉冲的10mM甘氨酸/HCl pH 1.5进行的下一注射循环。使用BiacoreTM T200评估软件v3.0对扣除空白的传感器图进行分析。然后用1:1朗缪尔结合模型对扣除空白的传感器图进行拟合。
根据SPR的HER2与抗体的结合
以与上文相同的方式制备抗Fc捕获芯片，然后以10μl/min的流速将50μg/ml的用于分析的抗体注入芯片持续60s。使用单循环动力学，将五种浓度的以40nM开始的两倍稀释系列的Her2(具有重组人HER-2氨基酸23-652；eBioscience)(对于上清液与纯化抗体运行两者)与空白缓冲液对照依序以50μL/min注射180s，加上1800s解离阶段，产生具有缓冲液空白参考的一组传感器图。在25℃的恒定温度下进行实验。将抗人Fc表面再生以准备用于通过以40μL/min持续120s的一个脉冲的10mM甘氨酸/HCl pH 1.5进行的下一注射循环。使用BiacoreTM T200评估软件v3.0对扣除空白的传感器图进行分析。然后用1:1朗缪尔结合模型对扣除空白的传感器图进行拟合，以获得下表2中所示的ka、kd以及KD值。
表2：双特异性抗体构建体结合至靶标的能力
Figure BDA0003013068510001321
Figure BDA0003013068510001331
表2表明呈不同模式的抗体仍能以类似亲和力结合至其靶标，与模式无关。与具有N端scFv的抗体相比，具有C端曲妥珠单抗scFv的变体v16605和v16679显示约2-3倍的KD降低，但这被判定为微小变化并且预期不影响功能。所有4-1BB抗体显示类似的KD值，其中抗4-1BB抗转运蛋白v19353对4-1BB显示比所述抗体更低的亲和力。
实施例3:在NF-kB-荧光素酶报告子分析中4-1BB x HER2双特异性抗体构建体刺激4-1BB活性的能力
为测试在存在表达HER2的肿瘤细胞的情况下双特异性4-1BB x HER2抗体刺激4-1BB活性的能力，将报告基因分析用作对4-1BB下游信号传导至驱动荧光素酶的NF-kB报告子的测量。所测试的4-1BB x HER2双特异性抗体包括变体16675、16679、15534、16601以及16605。还测试了对照构建体19353、1040、16992以及12952。
使用共培养分析测量在HER2+肿瘤细胞的背景下双特异性抗体活化4-1BB的能力。此分析使用经过工程化以表达4-1BB和由NF-kB位点驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞。此分析测量从细胞表面的4-1BB向下至核的信号传导。使用两种不同的肿瘤系；SKOV3，SKOV3表达高水平的HER2；以及MDA-MB-468，MDA-MB-468表达低水平的HER2。如果4-1BB的活化为HER2依赖性的，那么在与SKOV3细胞的共培养中应观察到活化，而在与MDA-MB-468细胞的共培养中不应观察到活化。
在分析前一天，将白色的TC处理的聚苯乙烯384孔板(Corning)用40μL/孔的于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco)中的5μg/mL的小鼠-抗人-CD3抗体OKT3(Biolegend)处理。通过包裹在石蜡膜中将板密封至板盖。将板在4℃下孵育过夜。°第二天，将板的内含物吸出，并且使用405HT ELISA板垫圈(Biotek)将板用更换3次的蒸馏水(120μL/孔)洗涤。然后板已可在分析中使用。
将双特异性抗体在分析缓冲液(RPMI(Gibco)/1％FBS(Gibco))中稀释至400nM(最终分析浓度100nM)。将15μL的体积移液至接受最高浓度的变体的如上文用OKT3处理的384孔板的孔中。将5μL的体积移液至用于第二高浓度的孔的下一孔中的体积为10μL的分析缓冲液中并且混合，得到3倍稀释液。在从第二高的孔转移至第三高的孔时将此举重复，直到最低浓度的孔，其中残余5μL体积被移除。然后添加密度为2x106个细胞/mL的10μL的SKOV3或MDA-MB-468肿瘤细胞，以得到2x104个细胞/孔。根据制造商的说明书将NFκB luc2P/4-1BB解冻使用Jurkat细胞(Promega)在37℃下解冻并且用5.8mL的分析缓冲液稀释。°将体积为20μL的约1x106个细胞/mL的报告细胞悬浮液(约2x104个细胞)添加至含有变体/效应细胞混合物的每个孔中。
然后将与变体共培养的细胞在37℃°下在5％CO2气氛中孵育5小时，然后在工作台上平衡至室温持续10分钟。将体积为40μL的Bio-GloTM(Promega)荧光素酶底物试剂添加至板的每个孔中并且在室温下孵育10分钟。将板在发光模式的SynergyTMH1(Biotek)多模式读板仪上扫描。使用Prism 7(GraphPad)和四参数可变斜率非线性拟合对数据进行分析。
结果
当与SKOV-3细胞共培养时，如在此分析中通过荧光素酶产生所测量，具有4-1BB结合臂的所有变体均诱导4-1BB下游的剂量依赖性NF-kB信号传导(图4A至图4I)。比较起来，具有活性的变体对MDA-MD-468细胞显示较低的活性，表明HER2存在于SKOV-3细胞表面诱导抗体的交联并且增强4-1BB信号传导。在v16601变体情况下观察到4-1BB的最低活化。v16605和v16675显示较高活性。如通过最大效力(EC50)和活性(最大RLU)所确定，v16679显示最高活性。阳性对照4-1BB x HER2双特异性抗体v19353显示中等效力，高于v16601和v16605，但低于v16675和v16679。然而，与基于抗体的4-1BB激动剂相比，v19353(具有脂质运载蛋白4-1BB结合结构域)显示如由最大RLU所给出的低活性。4-1BB单特异性对照变体v12592在较低浓度下显示低活性，活性随浓度而增加；然而，与MDA-MD-468细胞相比，在存在SKOV3细胞的情况下此抗体的活性未增加。对照变体v1040显示在活化4-1BB中没有活性，表明HER2结合臂对实验不存在直接影响。v16992类似地显示非结合对照抗体没有影响。表3中提供了结果的概述。
表3：4-1BB x HER2双特异性抗体构建体的活性
变体 EC<sub>50</sub>(pM) 最大活性(RLU)
v16601 2624 27917
v16605 400.7 92032
v16675 56.92 80946
v16679 30.09 131190
v19353 101.9 67157
v15534 237.3 74426
从此数据来看，与具有一个抗4-1BB臂的构建体相比，具有两个抗4-1BB结合臂的构建体似乎显示更大的活性。与具有远离4-1BB结合位点的Her2结合位点的构建体(例如v16605和v16679)相比，具有靠近4-1BB结合位点的Her2结合位点的构建体(例如v16601和v16675)似乎活性较小。
实施例4:原代T细胞-肿瘤共培养分析
还使用与肿瘤细胞共培养的原代T细胞比较了4-1BB x HER2构建体的活性。为更广泛地调查T细胞的活化以及4-1BB的效应，将T细胞的细胞因子(诸如IFNγ或IL-2)的产生用作增强的T细胞活化和功能的代表。IL-2也是T细胞在活化之后所产生的一种主要细胞因子，所述细胞因子促进它们存活并且与T细胞的活化有关。此实验检验了4-1BB x HER2抗体如通过IL-2产生所测量增强T细胞活化的能力，其中T细胞已由欠佳量的抗CD3抗体活化。在此实施例中测试了双特异性4-1BB x HER2抗体变体16601、16605、16675以及16679，以及对照变体1040、12592以及人IgG1阴性对照。使用CD4+ T细胞如下文所描述进行分析。
在实验前，通过将100μl 1μg/ml UCHT1添加至孔中将96孔板用抗CD3包被。然后将板在4℃下孵育过夜。°从健康供体获得血液，在1500rpm下离心5分钟并且弃去血浆。然后将血液在PBS中稀释，在FicollTM上分层并且在室温下在2000rpm下离心20分钟。然后取PBMC的界面层，用PBS洗涤以移除血小板，并且再悬浮。然后对细胞进行计数，在PBS2％FBS 1mMEDTA中稀释至5x107个细胞/ml，并且以50μl/ml细胞添加CD4+ T细胞富集混合物(StemcellTechnologies)。然后将细胞在室温下放置10分钟。然后以100μl/ml细胞添加EasySepTM D磁性粒子(Stemcell Technologies)，混合并且在室温下放置5分钟。然后使用PBS/2％FCS/1mM EDTA将细胞稀释至10ml的体积并且放入EasySepTM磁体中。然后将未选择的细胞倾析，并且放入EasySepTM磁体中的新管中，并且将所述细胞倾析至新管中。
然后将CD4+ T细胞在RPMI-1640 10％FCS 1％青霉素-链霉素中洗涤两次并且稀释至106个细胞/ml并且向已预包被有抗CD3(UCHT1)的96孔板中每孔添加100μl。获得SKBR3细胞，稀释至2x105个细胞/ml并且向孔中添加50μl。还将抗体样品在RPMI-1640 10％FCS1％青霉素-链霉素中稀释至40nM并且每孔添加50μl的所得溶液(10nM最终浓度)。在一些情况下，使用抗Fc抗体使抗体交联。然后将板在37℃下在5％CO2气氛中孵育三天，并且取上清液以便通过ELISA分析IL-2浓度。°
结果
与4-1BB NF-kB报告基因分析类似，在v16679情况下观察到最大的IL-2产生，并且v16675和v16605显示相等水平的IL-2(图5，左图)。在培养中没有SKBR3细胞的情况下，未因4-1BB双特异性抗体中的任一者而观察到IL-2的产生增加。将由抗Fc交联的v12592用作阳性对照并且代表由完全交联的抗体诱导的信号传导的水平(图5，右图)。此数据表明在所测试的变体中，v16679(具有图2B中描述的模式)在T细胞中能够诱导的4-1BB信号传导水平超过了由v12592刺激的水平。
实施例5:如通过IFN-γ产生所测量的由v16679、v19353以及v12592对T细胞的活化的比较
因为v16679似乎在报告基因分析以及原代T细胞-肿瘤共培养中均为最具活性的4-1BB x HER2双特异性抗体，所以将此变体刺激与SKBR3细胞共培养的T细胞产生细胞因子能力与阳性对照构建体v19353和v12592相比较。在此实验中，如下文所描述将IFNγ的产生用作T细胞活化的度量。
将4-1BB x HER2双特异性抗体在分析培养基(含有5％人AB血清加1％青霉素-链霉素的RPMI(Gibco))中制备成150nM。然后将20μl的150nM的稀释抗体添加至无菌384孔细胞培养板(Thermo Scientific)的最高浓度孔中，然后将抗体1:3连续稀释以产生较低的抗体浓度。
将SKBR3肿瘤细胞在RPMI 10％ FCS中培养，用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理以将它们从板移除，收集并且计数。离心之后，将肿瘤细胞以106个细胞/ml的浓度再悬浮于分析培养基中。根据每种条件每孔添加104个肿瘤细胞(10μl)。使用细胞解离缓冲液收集人工APC(aAPC/CHO-K1细胞，Promega)并且计数。这些细胞在细胞表面表达抗CD3(OKT3)和PD-L1并且用于以非特异性方式刺激T细胞。离心之后，将人工APC细胞以106个细胞/ml的浓度再悬浮于分析培养基中。将T细胞解冻，集结成粒，计数并且以2x106个细胞/ml的浓度再悬浮于分析培养基中。CD8+ T细胞、CD4+ T细胞以及全T细胞购自BioIVT,Westbury,NY,USA或Stemcell,Vancouver,BC,Canada。
然后将各自来自单独供体的aAPC/CHO-K1以及CD8+、CD4+ T细胞或全T细胞以1:2比率混合，并且将30μl的细胞混合物与10μl SKBR3肿瘤细胞一起添加至384孔板。然后将板在5％CO2气氛中在37℃下孵育。°
四天之后，收集上清液以进行均匀时间分辨荧光ELISA(HTRFTM)。将5μl上清液、5μl连续稀释的IFNγ标准物或5μl PBS添加至白色圆底384浅孔板(Thermo Scientific)的孔中。将抗IFNγ-穴合物抗体(Cisbio,Bedford,MA)和抗IFNγ-XL(Cisbio,Bedford,MA)抗体在检测缓冲液#3(Cisbio,Bedford,MA)中稀释20倍，并且将2μl的每种稀释抗体与每孔11μlPBS混合。将15μl的此抗体混合物在5μl实验上清液或标准物旁边添加至384孔板的孔中。然后将板密封并且在室温下放置过夜。第二天，将板在Biotek读数器上在665和620nm下读取并且在使用仅PBS孔针对板吸收进行校正之后，将值报道为665nm/620nm读数的比率。使用标准曲线计算IFNγ浓度。使用非线性四参数模型，使用GraphPad Prism v7进行数据分析。
结果
图6中示出了在多个独立的CD4和CD8 T细胞供体以及单一全T细胞供体情况下的结果。进行此举是为了测试反应是否仅在少量供体中发现。在所有CD4、CD8以及全T细胞供体中，v16679显示由与SKBR3细胞共培养的T细胞产生的剂量依赖性IFNγ产生增加。v16679还显示与v19353相比大得多的最大细胞因子产生以及更高的效力。v12592在此实验中不具活性，并且未显示大于由阴性对照v13725观察到的活性的活性，表明v16679在v12592不具活性的条件下为活性的。
实施例6:结合4-1BB的抗体的产生以及小鼠-人嵌合抗体的产生
由ImmunoPrecise(Victoria,Canada)使用它们专有的快速启动(RapidPrime)免疫策略对小鼠进行免疫来产生额外的靶向4-1BB的抗体。
简单来说，将Balb/c和NZB/W小鼠用人4-1BB-His蛋白或人4-1BB-His与小鼠4-1BB-Fc的混合物(Acro Biosystems,Newark,DE)免疫，并且取脾脏并且解离以获得单一细胞。然后将脾细胞与骨髓瘤配偶体系融合以形成杂交瘤。通过有限稀释将杂交瘤细胞克隆并且取上清液进行筛选。
通过ELISA鉴定抗体与人、食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))和/或小鼠(小家鼠(Mus musculus))4-1BB的结合。在4℃下通过添加100μl的人、食蟹猴或小鼠4-1BB于碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的0.1μg/ml溶液对96孔板进行包被过夜。°然后，在室温下通过使用含3％脱脂奶粉的PBS将孔封闭1小时，随后在振荡下，在37℃下添加纯杂交瘤上清液(100μl/孔)持续1小时。°然后在振荡下，在37℃下，使用100μl/孔于PBS 0.05％吐温-20中的1:10000山羊抗小鼠IgG/IgM(H+L)-HRP检测抗体持续1小时。°然后，在黑暗中使用TMB底物(50μl/孔)检测孔中HRP的存在持续3分钟，随后添加50μl 1M HCl以停止反应。然后，将板在450nm下读取。还使用相同方法对抗体进行反筛选，以排除结合至TNF超家族成员Ox40和CD40和GITR的抗体。
结果
取结合至人4-1BB的二十四种抗体进行测序并且进一步表征。这些抗体中的一些还结合至食蟹猴或小鼠4-1BB。
抗体回收
然后对通过ELISA选择的二十四种抗体进行测序以获得完全的VH和VL序列。为从杂交瘤细胞制备RNA，将细胞在冷磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中洗涤一次并且立即通过RNeasy Plus微试剂盒(QIAgen)进行加工。将总RNA在不含核酸酶的水中洗脱，并且使用AMV逆转录酶(NEB)使mRNA转化为cDNA，用寡核苷酸(dT20)引发。
使用从Babcook等(Proc Natl Acad Sci USA 1996年7月23日；93(15):7843)和von Boehmer等(NatProtoc.2016年10月；11(10):1908)改良的引物和方法，使用cDNA作为核酸模板，进行重链和轻链抗体编码序列的初始PCR。使用Zero BluntTM TOPOTM PCR克隆试剂盒(Thermofisher Scientific)将PCR产物克隆至pCRTOPO4载体中并且转化至E.cloniTM细胞(Lucigen)中。对抗生素抗性克隆进行测序并且针对独特的抗体编码序列进行分析。
然后使用V-区段家族和J-区段家族特异性引物对这些独特的序列进行巢式PCR反应。然后将所得扩增子克隆至基于pTT5的表达质粒(National Research Council,Montreal,QC)中。使从单一杂交瘤样品产生的独特的重链序列和轻链序列以所有可能的组合在HEK293-6E细胞(National Research Council)中共表达以确定恰当的重链和轻链配对。针对与HEK293细胞上瞬时表达的抗原的结合对所产生的抗体进行分析。
结果
在最初鉴定为结合至人4-1BB的24种抗体中，从杂交瘤获得总共18对配对的抗体VH和VL序列(在表13中示出)并且以具有小鼠VH和VL结构域以及人IgG1 Fc的人-小鼠嵌合抗体的形式克隆至pTT5载体中。将小鼠VH结构域克隆与人CH1-铰链-CH2-CH3构建体一起符合读框地克隆，并且将小鼠VL结构域与人κCL结构域一起符合读框地克隆。
4-1BB嵌合抗体的表达
通过将两个质粒转染至HEK293-6E细胞中产生18种嵌合小鼠-人4-1BB抗体，一个质粒含有重链并且另一个质粒含有轻链。
在转染之前72小时，使HEK293-6E细胞1:10分裂以确保为生长阶段细胞。然后对这些细胞进行计数并且以106个细胞/ml再悬浮于OptiMEMTM(Thermofisher)中。通过将30μl293fectinTM(Thermofisher)与1.5ml OptiMEMTM混合来制备转染混合物。然后将此混合物在室温下孵育。五分钟之后，添加1.5ml OptiMEMTM和15μg的含有pTT5载体中的抗体重链或轻链的各个质粒。然后将此混合物在室温下放置20分钟，然后逐滴添加至细胞中，总体积为3ml。然后将细胞在37C下5％CO2气氛中在振荡孵育器中在120rpm下放置五天。
在一些情况下，使用具有蛋白质A端部的OctetTM RED96(ForteBio)定量上清液内的抗体水平，并且将上清液立即用于分析中。
还使用蛋白质A将上清液纯化。为将抗体纯化，首先通过在1000rcf下离心15分钟从抗体上清液移除细胞。然后通过使用10ml PBS平衡来准备蛋白质A GravitrapTM柱，随后以10ml分批施加抗体上清液。在所有上清液已流穿柱子后，将柱子洗涤两次，每次使用10mlPBS。通过添加3ml 0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.7)来进行抗体洗脱。然后使用1M Tris-HCl(pH9)将洗脱的抗体样品中和。
为浓缩抗体样品并且进行缓冲液交换，将抗体样品加载至VivaspinTM 30kDa MWCO蛋白质浓缩离心柱(GE Healthcare)中。然后，将柱子在3000rcf下离心7分钟以浓缩抗体。然后将4ml PBS添加至柱子中以交换缓冲液，并且然后将柱子再次离心，以交换缓冲液至PBS中。然后使用NanodropTM分光光度计(Thermofisher)使用260nm/280nm吸收度比率测量所得溶液中的抗体水平。
实施例7:在4-1BB NF-kB-荧光素酶报告子分析中嵌合4-1BB抗体的活性
为测试嵌合小鼠-人4-1BB抗体刺激4-1BB活化以及下游信号传导的能力，使用了报告基因分析。当信号传导由连结4-1BB受体诱导时，此实验中所用的细胞在NF-kB启动子的控制下产生荧光素酶。
以类似于实施例3中所描述的方式设置此实验，除了使用抗体上清液代替双特异性抗体，并且不使用肿瘤细胞。将抗体上清液在分析缓冲液(RPMI(Gibco)/1％FBS(Gibco))中稀释至5000ng/ml、1666ng/ml、554ng/ml以及184ng/ml。然后添加兔-抗人IgG Fc(Thermofisher)多克隆第二抗体达到15000ng/ml的浓度并且将抗体混合物放置在室温下。
45分钟之后，将30μl的抗体混合添加至孔中。如果上清液中抗体的浓度低于5000ng/ml，那么从纯物质(v20023、v20025、v20028、v22033、v22034)稀释上清液。作为阳性对照，将v12592在上清液(ESN)或RPMI中稀释。阴性对照为在ESN中稀释的v16992。然后添加4-1BB解冻使用Jurkat细胞(Promega)，随后进行5小时孵育，然后如实施例3中所描述添加Bio-GloTM试剂(Promega)。获得数据并且如实施例3中一般进行分析。
结果
八种抗体诱导产生荧光素酶：v20021、v20022、v20023、v20025、v20029、v20032、v20036、v20037，表明它们激动4-1BB(图7)。然后，从上清液纯化这些抗体并且用于评估它们结合至哪个4-1BB结构域。
实施例8:4-1BB结构域结合的测定
为确定嵌合抗体识别人4-1BB的哪个结构域，测试了嵌合抗体与人4-1BB、狗4-1BB以及嵌合人-狗4-1BB蛋白的结合。人-狗4-1BB蛋白在结构域4内包括将人4-1BB修饰为狗4-1BB的一组突变。
人、狗以及人-狗4-1BB的制备
为产生用于可溶性人、狗以及人-狗嵌合4-1BB的表达构建体，制备具有4-1BBECD-TEV-IgG1铰链-CH2-CH3-10xHis的合成的DNA。下表4提供了这些构建体的序列并且图8A提供了这些构建体的4-1BB部分的图示。狗与人4-1BB细胞外结构域包括取自UniProt(对于狗和人4-1BB分别为ID E2R1R9和Q07011)的4-1BB蛋白序列的残基24-186。人-狗嵌合体中用于模拟结构域4中的狗4-1BB的突变为K115Q、C121R、R134Q、R154S以及V156A(在WO2012/032433中描述)。
表4：结合4-1BB结构域的构建体
Figure BDA0003013068510001431
Figure BDA0003013068510001441
然后以类似于实施例1中的抗体的方式产生含有4-1BB表达构建体的pTT5载体并且纯化，除了使用500ml培养体积。Caliper结果表明以基本上纯形式制备了人、狗以及嵌合人-狗4-1BB构建体。
通过ELISA对4-1BB抗体的结构域定位
进行可溶性抗原结合ELISA以评估抗体结合在4-1BB结构域4外部的能力。目标是确定相较于人4-1BB样品对杂合或嵌合人-狗4-1BB是否具有差异结合，从而表明结合是否在结构域4外部。然而，如果所测试的抗体能够结合至狗4-1BB，那么不会实现通过此方法评估与结构域4的结合。
在PBS pH 7.4(Thermo Fisher,Whetham,MA)中以400ng/mL制备可溶性人、狗或人-狗4-1BB-Fc蛋白。将4-1BB-Fc蛋白以50μL/孔添加至96孔平底ELISA板(Corning 3368)的孔中。将板用盖覆盖，用石蜡膜密封，并且在4℃下放置过夜。第二天，使用BioTek 405 HT微板垫圈(BioTek,Winooski,VT)将板用300μL/孔蒸馏水洗涤三次并且轻拍至干燥。然后通过每孔添加200μL封闭缓冲液(含2％w/v脱脂奶粉的PBS)将孔封闭并且在室温下放置1小时。如先前一般将板洗涤并且轻拍至干燥。然后将抗体样品在分析缓冲液(含2％w/v脱脂奶粉的PBS)中稀释至最终10μg/mL，或者如果样品低于10μg/mL，那么使用纯物质。直接在分析板中，将样品一式两份地在分析缓冲液中1:8连续稀释五次，最终体积为50μL/孔。类似地，制备对照抗体并且在分析缓冲液中稀释。对于不含抗体样品的孔，以50μL/孔添加分析缓冲液。然后将板用盖覆盖，用石蜡膜密封，并且在4℃下孵育过夜。第二天，如先前一般将板用板垫圈洗涤并且拍干。为检测样品与可溶性抗原的结合，在分析缓冲液中以0.4μg/mL制备过氧化酶AffiniPure山羊抗人F(ab')2(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)。为检测包被的抗原，在分析缓冲液中以1μg/mL制备过氧化酶AffiniPure山羊抗人Fc(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)。以50μL/孔添加两种辅助液并且将板在室温下孵育30分钟。如先前一般将板洗涤并且干燥，并且以50μL/孔添加TMB底物(Cell SignalingTechnology,Danvers,MA)。在室温下孵育十分钟之后，将反应物用1M HCl(VWR,Radnor,PA)中和。在BioTek SynergyTM H1读板仪(BioTek,Winooski,VT)上扫描OD450下的板吸光度。
结果
如图9A至图9I中所示，所测试的所有嵌合抗体均能够结合人4-1BB。然而，v20023和v20029还结合狗4-1BB，表明这两种抗体的结构域结合不能通过此方法来评估。其余抗体不结合狗4-1BB。
v20022、20025、v20032、v20036以及v20037对人和人-狗嵌合4-1BB显示相等结合，表明所有这些抗体结合在结构域4(氨基酸115-156)外部。正如所料，MOR7480.1-IgG1(变体12592)显示与人4-1BB相比与狗-人嵌合4-1BB的结合减少，表明其结合结构域在氨基酸115-156内。v12593(具有IgG1 Fc的一种型式的乌瑞鲁单抗)类似于所测试的抗体，同等地结合人和人-狗嵌合4-1BB，表明其结合结构域也位于氨基酸115-156外部。v20027在此实验中未显示结合并且从将来的分析中排除。
使用截短的4-1BB蛋白的抗体的结构域结合
因为抗体中的一些与狗4-1BB交叉反应，所以需要另一方法来确定抗体结合至哪个结构域。作为替代方案，制备截短的跨膜4-1BB构建体，其中仅4-1BB结构域3和4将被表达。图8B提供了所制备的截短的跨膜4-1BB构建体的图示。
4-1BB结构域载体的构建
合成具有全长人4-1BB(残基24-255)或细胞外结构域3和4(残基86-255)以及天然人4-1BB跨膜和细胞内部分的构建体。还克隆了全长小鼠4-1BB。所有载体还含有天然信号肽(MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRS，SEQ ID NO:42)并且通过SignalP4.1(www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)运行以预测信号肽的成功裂解。以3'-EcoRI-4-1BB-BamHI-5'形式合成所有构建体并且克隆至EcoRI-BamHI消化的pTT5载体中。
为测试抗体与4-1BB的结合，如前所述转染293E6细胞，除了将所有人4-1BB构建体用小鼠4-1BB共转染，以充当载体蛋白。转染之后二十四小时，在冰上将2x105个细胞用2.5μg的抗体标记一小时，然后使用Attune细胞计数器(ThermoFisher,Waltham,Massachusetts,U.S.)通过流式细胞术进行分析。已使用制造商的说明书使抗体与Zenon-Alexa-647试剂(ThermoFisher)预复合。
结果
图10中示出了此实验的结果。所有抗体显示与用人4-1BB转染的细胞并且与用人和小鼠4-1BB转染的细胞结合。将变体16992(抗RSV抗体)用作阴性对照。正如所料，v12592显示与用仅4-1BB结构域3和4构建体(氨基酸86-255)转染的细胞结合，因为其假设结合结构域介于氨基酸115与156(结构域4)之间。v20022、v20023、v20025、v20029、v20032、v20036以及v20037抗体未显示与用仅结构域3和4构建体转染的细胞结合，表明所有抗体结合在所述结构域外部，并且结合至至少部分在成熟4-1BB蛋白的氨基酸24-85内的表位。此数据加强了人-狗嵌合体实验的v20022、v20025、v20029、v20036以及v20037不结合结构域4的结论。
实施例9:嵌合抗4-1BB抗体与食蟹猴和小鼠4-1BB的结合
为评估v20022、v20023、v20025、v20029、v20032、v20036以及v20037与天然跨膜食蟹猴(食蟹猕猴)以及小鼠(小家鼠)4-1BB的结合，使用CellInsight CX5平台(ThermoFisher,Watham,MA)进行均质细胞结合分析。此实验使用瞬时表达食蟹猴或小鼠4-1BB的细胞。
为使细胞准备用于转染，在37℃，5％CO2下在以115rpm转动的湿润孵育器中，在250mL依氏烧瓶(Erlenmeyer flask)(Corning,Corning,NY)中的含1％FBS(Corning,Corning,NY)的293Freestyle培养基(ThermoFisher,Watham,MA)中培养悬浮液HEK293-6e细胞(National Research Council Canada,Montreal,QB)。转染之前，将HEK293-6e细胞在新鲜293Freestyle培养基中再悬浮至1x106个细胞/mL。然后使用293fectinTM转染试剂(Thermo Fisher,Watham,MA)在Opti-MEMTM减血清培养基(Thermo Fisher,Watham,MA)中以1μg DNA/106个细胞的比率转染细胞。将细胞用含有如表5中所示的具有flag标签的全长食蟹猴4-1BB(CL#_11070 SEQ ID NO:43)、小鼠4-1BB-flag(CL#_11063SEQ ID NO:44)的pTT5DNA载体，或作为转染效率的对照的含有GFP的载体转染。将细胞在37℃，5％CO2下在以115rpm转动的湿润孵育器中孵育24小时。
表5，食蟹猴或小鼠4-1BB序列
Figure BDA0003013068510001481
将抗体样品在艾本德管(Eppendorf tube)中制备成最终于PBS pH 7.4(ThermoFisher,Watham,MA)+2％FBS中纯、1:4以及1:16的浓度，并且将30μl的抗体混合物添加至384孔黑色光学底板(ThermoFisher)的孔中。将v12592用作与食蟹猴4-1BB的结合的阳性对照，并且人IgG1作为阴性对照。将抗小鼠4-1BB抗体LOB12.3(BioXCell,West Lebanon,NH)以及其相应大鼠IgG1同型对照(R&D Systems,Minneapolis,MN)用作小鼠结合的对照。制备转染的HEK293-6e细胞(每30μL10,000个细胞)、最终2μM的VybrantTM DyeCycleTM Violet核染色剂(Thermo Fisher)以及0.6μg/mL的山羊抗人IgG Fc A647(JacksonImmunoResearch,Westgrove,PA)的细胞混合物。将细胞简单涡旋以混合，以30μL/孔添加至孔中。将板在室温下孵育3小时，然后扫描。使用具有10x目镜的BioApplication“CellViability”，在具有HCS高含量筛选平台的CellInsight CX5(ThermoFisher)上进行数据分析。将样品在385nm通道上扫描以目视观察核染色，并且在650nm通道上扫描以评估细胞结合。在通道2上测量A647目标平均荧光强度的平均值以确定结合强度。然后用此强度除以在GFP转染的孔中所观察的染色强度，得到由抗体诱导的结合倍数。
结果
除v20020(1B2)和v20031(4B1)外的所有抗体似乎均结合食蟹猴4-1BB(图11A)。将v12952用作食蟹猴4-1BB结合的阳性对照，并且hIgG1为其匹配的不显示结合的同型对照。没有抗体结合小鼠4-1BB(图11B)。将LOB12.3用作与小鼠4-1BB的结合的阳性对照，并且大鼠IgG为匹配的不显示结合的同型对照。
实施例10:小鼠5G8、1G1以及1C8 VH和VL序列的人源化
如下文所描述制备实施例6中产生的小鼠抗人4-1BB抗体中的三者的人源化型式。
如下进行小鼠1C8、1G1以及5G8可变轻(VL)结构域和可变重(VH)结构域的人源化。小鼠1C8 VH和VL序列与相应人生殖系的序列比对将IGHV3-66*03和IGKV1D-33*01鉴定为人中的最靠近并且相对频繁的生殖系。小鼠1G1 VH和VL序列与相应人生殖系的序列比对将IGHV3-48*03和IGKV3-11*01鉴定为人中的最靠近并且相对频繁的生殖系。小鼠5G8 VH和VL序列与相应人生殖系的序列比对将IGHV4-59*08和IGKV1-16*01鉴定为人中的最靠近并且相对频繁的生殖系。将根据AbM定义(参见表A)鉴定的CDR移植至这些所选人生殖系的构架上。图12提供了所得VH(图12A至图12C)和VL序列(图12D至图12F)的序列。在此类所生成的序列中在被判断为对于保留对人4-1BB的结合亲和力来说可能重要的位置处以一定方式包括向小鼠残基的反向突变，以形成若干人源化序列，其中下一个建立在前一个上，并且其中第一人源化序列含有最小数目的反向突变或没有反向突变。
对于1C8，此方法产生四种可变重链人源化序列和三种可变轻链人源化序列。对于1G1，此方法产生三种可变重链人源化序列和四种可变轻链人源化序列。对于5G8，此方法产生四种可变重链人源化序列和四种可变轻链人源化序列。针对1C8、1G1以及5G8，形成含有人源化重链可变结构域(VH)和hIgG1重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2、CH3)的完全重链序列，以及含有人源化轻链可变结构域(VL)和人κ轻链恒定结构域(κCL)的完全轻链序列。然后组装抗体，使得每条人源化重链与各个人源化轻链配对，从而针对1C8和1G1各制备总共十二种人源化变体，并且针对5G8制备16种变体(表6)。表14中提供了人源化重链和人源化轻链中的每一者的氨基酸序列。
表6：人源化1C8、1G1以及5G8变体以及其组成.
Figure BDA0003013068510001501
Figure BDA0003013068510001511
人源化抗体的产生
使用表6中所描述的人源化1C8、1G1以及5G8 VH和VL序列中的每一者以及亲本小鼠VH和VL序列来制备呈天然存在的或FSA抗体模式的人源化抗体，所述模式含有两条相同的全长重链和两条相同的κ轻链。表X列出了构成抗体构建体中的每一者的克隆。在表Y中可找到每个克隆的多肽序列。
将人源化VH结构域序列(SEQ ID NO:45、46、47、51、52、53、56、57、61、62以及63)中的每一者附加至IGHG1*01(SEQ ID NO:68)的人CH1-铰链-CH2-CH3结构域序列，以获得四种人源化1C8、三种人源化1G1以及四种人源化5G8完全重链序列的蛋白质序列。将人源化VL结构域序列(SEQ ID NO:48、49、50、54、55、58、59、60、64、65以及66)中的每一者附加至IGKC*01(SEQ ID NO:67)的人κCL序列，以获得三种人源化1C8、四种人源化1G1以及四种人源化5G8完全轻链序列的蛋白质序列。以类似方式，组装1C8、1G1以及5G8小鼠-人亲本抗体嵌合体重链和轻链序列，差异在于可变结构域序列为小鼠序列(SEQ ID NO:7、9、35(VH)以及8、10、36(VL))并且恒定结构域序列为人序列(相应地为SEQ ID NO:68和67)。将这些序列反向翻译为DNA，针对哺乳动物表达进行密码子优化，并且进行基因合成。
所有小鼠-人亲本和人源化完全重链和完全轻链序列的前面是信号肽，信号肽为人工设计的序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:1](参考：Barash S等，Biochemand Biophys Res.Comm.2002；294,835-842)。对于所有亲本和人源化重链和轻链，如实施例1中所描述制备载体插入物并且克隆至pTT5中以产生表达载体。
使抗体变体的重链和轻链在100mL CHO培养物中表达并且如实施例1中所描述进行纯化。在蛋白质-A纯化之后，如实施例1中所描述通过非还原型和还原型高通量蛋白质表达分析对样品的纯度进行评估。
在蛋白质-A纯化后，将样品缓冲液交换至DPBS中并且无菌过滤，或如实施例1中所描述根据其通过UPLC-SEC所评估的均质性进行SEC纯化。
结果
对于人源化1C8变体来说，蛋白质-A纯化后的蛋白质产量在约3.5-9mg范围内，对于人源化1G1变体为约4.5-9.5mg，而对于人源化5G8变体为约4.5-8mg。在所有情况下，蛋白质-A后的非还原型和还原型LabChip反映了对应于完全尺寸抗体和完整重链和轻链的单一物质(数据未示出)。内毒素水平在规格范围内。
实施例11：纯化的人源化1C8、1G1以及5G8抗体的生物物理学评估
对人源化抗体变体的样品进行UPLC-SEC，以评估蛋白质-A纯化后的物质均质性。如实施例1中所描述进行UPLC-SEC。
结果
蛋白质A纯化的人源化1C8抗体变体的UPLC-SEC分析反映了在变体28717、28719、28720、28721情况下的高物质均质性(数据未示出)。如根据小峰(可能反映聚集物)以及主峰的肩(可能反映不同抗体构象)的存在所判断，所有其他人源化1C8变体的UPLC-SEC型态(数据未示出)均反映了良好均质性。
蛋白质A纯化的人源化1G1抗体变体的UPLC-SEC分析反映了变体28683、28684、28685以及28686的高物质均质性。所有其他人源化1G1变体的UPLC-SEC型态均反映出稍微较低的均质性(数据未示出)。
蛋白质A纯化的人源化5G8抗体变体的UPLC-SEC分析显示所有变体的良好物质均质性。对SEC纯化后的最终样品汇集物重复进行UPLC-SEC分析并且这些样品显示在99.2-100.0％范围内的均质性(数据未示出)。
实施例12：根据SPR的人源化1C8、1G1以及5G8抗体与人4-1BB的结合
为比较人源化抗体结合人4-1BB的能力，通过表面等离子体共振(SPR)将人源化抗体的亲和力与亲本嵌合抗体相比较。
针对与人4-1BB的结合对蛋白质-A或SEC后的蛋白质材料进行评估。如实施例2中所描述通过SPR测定抗原结合亲和力。
结果
如由表7(在实施例13中示出)可见，对人源化1C8变体进行的SPR结合分析表明人源化1C8抗体变体中的四者(v28726、v28727、v28728、v28730)以与亲本嵌合体抗体(变体v20022)类似的亲和力结合h4-1BB，并且八种变体未结合h4-1BB。这些变体具有共同的人源化1C8重链H5和H6与人源化1C8轻链L1、L2或L3的组合。当与人源化1C8重链H7组合时，人源化1C8轻链L1和L2也不结合4-1BB。这些结果表明，合并于人源化1C8重链H8以及人源化1C8轻链L3中的在特定位置的向小鼠残基的反向突变对维持CDR构象来说为重要的，使得结合至h4-1BB可保留。图13提供了亲本嵌合体和能够结合人4-1BB的代表性人源化变体的SPR传感器图。
如由表7可见，对人源化1G1变体进行的SPR结合分析表明所有人源化1G1抗体变体均以在亲本嵌合抗体(变体v20023)的KD的2倍以内的亲和力结合h4-1BB。这表明不具有向小鼠残基的反向突变的人源化1G1重链和轻链的构架足以维持结合至h4-1BB所必需的CDR构象。图14提供了亲本嵌合体和能够结合人4-1BB的代表性人源化变体的SPR传感器图。
如表7和图15中可见，对人源化5G8变体进行的SPR结合分析显示七种人源化5G8抗体变体(v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713)以在亲本嵌合抗体(变体v20036)的KD的2倍以内的亲和力结合h4-1BB。七种人源化5G8变体以与亲本嵌合抗体的KD相比降低2-3倍的亲和力结合h4-1BB(v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707)并且两种变体未结合h4-1BB。这两种变体具有共同的人源化轻链L1。对4-1BB具有稍微降低的亲和力的七种5G8变体具有共同的人源化重链H1或H2，或人源化重链H3或H4与人源化轻链1的组合。人源化5G8抗体的结果表明合并至L2中以及H3中的在特定位置的向小鼠残基的反向突变为维持所需CDR构象从而以类似于亲本嵌合变体v20036的KD结合h4-1BB所必需的。
实施例13:根据流式细胞术的人源化变体的结合的比较
为检验抗体与天然细胞表面表达的4-1BB的结合，如下文所描述进行流式细胞术结合分析。
使用经过工程化以稳定表达人4-1BB的Jurkat T细胞来测量抗体与人4-1BB的结合。将抗体在96V孔板的孔中在50μl FB(PBS 2％FCS)中从储备物1:3稀释，并且在顶部添加细胞。然后将细胞在冰上放置30分钟以使抗体结合。然后将细胞在FB中洗涤两次，然后在含有2μg/ml山羊抗人Alexa647抗体(Jackson Immunoresearch)的50μl FB中孵育。然后将细胞在冰上再放置20分钟，在FB中洗涤两次，再悬浮于100μl FB中并且在BD FortessaTM X20上分析。使用FlowJoTM和Prism 7(GraphPad)使用四参数非线性回归对后续数据文件进行分析。
结果
图16A、16B以及16C展示了1C8、1G1以及5G8人源化抗体分别结合至表达4-1BB的Jurkat T细胞的能力。与SPR结果类似，来源于1C8互补位的抗体(包括亲本抗体v20022)结合不良。如由SPR结果将预期，原始小鼠1G1互补位v22023与4-1BB结合良好。基于1G1互补位的人源化抗体也结合良好，并且有一点因人源化而观察到的结合降低。类似地，5G8抗体也结合良好，其中当与亲本小鼠-人嵌合抗体v22036相比时，一些抗体展示更大的与4-1BB的结合。
下表7中概述了SPR和流式细胞术分析的结果。
表7：通过SPR对人源化抗体变体的抗原结合评估
Figure BDA0003013068510001551
Figure BDA0003013068510001561
Figure BDA0003013068510001571
DNB＝未结合
ND＝未测得
NF＝不符合(对于4-参数非线性回归模型)
实施例14:人源化抗体的热稳定性评估
为了对对人4-1BB具有亲和力的人源化1C8、1G1以及5G8变体进行充分表征，如下文所描述通过差示扫描量热法(DSC)对所选抗体样品的热稳定性进行评估。
如下使用DSC测量人源化1C8、1G1以及5G8抗体变体的热稳定性。使用400μL的含浓度主要为0.4mg/mL的纯化样品的PBS使用VP-毛细管DSC(GE Healthcare,Chicago,IL)进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以使基线稳定，并且在每次样品注射之前进行缓冲液注射用于参考。以60℃/小时的速率从20℃到100℃对每个样品进行扫描，使用低反馈、8秒过滤、3或5min扫描前恒温以及70psi氮气压力。参考所得热谱图并且使用Origin 7软件分析以确定作为热稳定性的指示的熔解温度(Tm)。
结果
下表8中示出了结果。
表8；人源化抗体的热稳定性
变体标识符 Fab Tm(℃)
v20022 1C8小鼠-人亲本嵌合体 88.1
v28726 92.0
v28727 93.3
v28730 94.0
v20023 1G1小鼠-人亲本嵌合体 73.2
v28683 84.0
v28684 84.0
v28685 83.4
v28688 82.7
v28689 81.8
v28692 82.2
v28693 81.1
v20036 5G8小鼠-人亲本嵌合体 82.6
v28696 90.8
v28700 89.2
v28704 89.9
v28705 90.9
v28711 90.5
v28712 91.4
如表8中可见，与亲本小鼠嵌合体v20022相比，所确定的所选人源化1C8抗体变体的Fab Tm值高约4-6℃。图17示出了所测试的1C8变体的对应DSC热谱图。
对于人源化1G1抗体变体，如由表8可见，所确定的所选变体的Fab Tm值比亲本小鼠嵌合体v20023的Tm高9至11℃。图18示出了所测试的1G1变体的对应DSC热谱图。
对于人源化5G8抗体变体，如由表8可见，所确定的所选变体的Fab Tm值比亲本小鼠嵌合体v20036的Tm高约7至9℃。图19示出了所测试的5G8变体的对应DSC热谱图。
实施例15：人源化1C8、1G1以及5G8抗体变体的纯度评估
在非变性去糖基化之后使用质谱法对如实施例10中所描述制备的人源化抗体变体的表观纯度进行评估。制备人源化变体的样品并且如实施例1中所描述通过LCMS进行分析。
结果
所有人源化1C8、1G1以及5G8抗体变体均具有100％物质纯度。图20中示出了1C8人源化抗体中的一者的代表性LC-MS型态。
实施例16：人源化抗体对4-1BB的活化
为确定人源化抗体在人源化后是否保留功能性，根据实施例3中所描述的方法在4-1BB NF-kB报告基因分析中对它们进行测试。
结果
如图21A中所见，如由在图16A中所见的结合略微降低所预期的一般，1C8显示与亲本v20022抗体相比效力略微降低。与图16B中的流式细胞术结合类似，1G1保留功能性，并且抗体显示与亲本嵌合4-1BB抗体v20023类似的效力(图21B)。类似于基于1C8的人源化抗体，基于5G8的人源化抗体显示与亲本抗体相比效力略微降低(图21C)。
实施例17：额外4-1BB x TAA抗体构建体的产生
实施例1-3中所描述的实验鉴定了一种模式，其中4-1BB x HER2抗体能够交联4-1BB并且刺激下游4-1BB信号传导以及T细胞的细胞因子产生。为确定此效应是否对靶向HER2或表达HER2的肿瘤具特异性或者它是否还可转移至其他肿瘤相关抗原，制备了4-1BBx间皮素(MSLN)、4-1BB x NaPi2b以及4-1BB x FRα抗体。
4-1BB x MSLN、4-1BB x NaPi2b以及4-1BB x FRα双特异性抗体的设计
为允许测试不同的肿瘤相关抗原，以类似于大多数活性4-1BB x HER2双特异性构建体的如图2B中所示具有两个4-1BB Fab和在Fc的C端的一个TAA scFv的模式制备双特异性抗体构建体。像实施例1中所描述的4-1BB x HER2双特异性抗体构建体一样，这些双特异性抗体构建体包含具有CH3结构域氨基酸取代Het FcA和Het FcB的人IgG1异二聚Fc，此驱动两种组分Fc多肽的缔合。指示为“FcKO”的双特异性抗体构建体包括经过设计消除或减少FcγR结合的以下CH2突变：L234A、L235A以及D265S。表9概述了所制备的抗体构建体并且图22提供了这些抗体构建体的模式的图示。图22中还展示了并且在实施例18中描述了每种TAA互补位的对照构建体17717(米罗维妥昔单抗)、17449(法勒珠单抗)、18490(RG7787)以及18993(利法珠单抗)。
表9：4-1BB x TAA抗体的描述
Figure BDA0003013068510001601
Figure BDA0003013068510001611
表15中提供了对应于MOR7480.1的VH和VL的序列。表16中提供了用于构建抗体构建体的抗TAA臂的scFv的序列。表X列出了构成抗体构建体中的每一者的克隆。在表Y中可找到每个克隆的多肽序列。
4-1BB x TAA抗体的产生
为允许产生双特异性抗体，以类似于实施例1的方式制备构建体。
双特异性抗体的产生和纯化
通过转染CHO-2E7细胞产生抗体，并且如实施例1中所描述，使用蛋白质A和制备型SEC纯化。纯化之后，使用LC/MS和UPLC-SEC检查抗体的纯度以及聚集的缺乏。
实施例18：肿瘤细胞上表面TAA蛋白的定量
为确定为刺激T细胞中的4-1BB信号传导在肿瘤上需要什么样的TAA表达阈值，在若干肿瘤细胞系中测量间皮素(MSLN)、NaPi2b以及FRα表面蛋白的水平。这使用如下文所描述具有已知水平的所结合抗体的一组珠粒使用定量流式细胞术来实现。
将IGROV1、OVCAR3、H441、H661、H226、H1975以及A549肿瘤细胞在10cm3板中在RPMI10％FCS中培养。选择这些细胞系，因为RNA数据表明它们将为表达高、中或低MSLN、NaPi2b以及FRα的一组代表性卵巢和肺细胞系。添加细胞解离缓冲液(Invitrogen)，并且必要时使用机械手段使用移液管或细胞刮刀从板中移除细胞。将细胞与预定过量水平的缀合抗体一起放置于冰上，以确保悬浮液中的细胞为完全标记的。将具有预定水平的抗人包被抗体的一系列珠粒用作标准物(816；Bangs Laboratories)。通过将肿瘤细胞上AlexaFluor647荧光的水平与使用校准珠粒构建的标准曲线比较来计算每个细胞的受体数目。
为与Alexa Fluor 647缀合，使用40kDa Zeba柱将抗体缓冲液交换至碳酸氢钠缓冲液pH 8.4中。然后使缓冲液交换的材料中的每一者的等分试样与10当量的NHS-AlexaFluor 647(Thermofisher A20006，10mM)反应。允许每个反应在室温下避光进行90分钟。孵育之后，将每个反应物然后使用用PBS pH7.4预平衡的40kDa Zeba柱进行纯化。通过SEC色谱(激发：650nm，发射：665nm)证实缀合。SEC分析还估计了未纯化的NHS-Alexa Fluor 647的量。
靶标 所用的抗体 抗TAA互补位
FRα v17717 米罗维妥昔单抗
FRα v17449 法勒珠单抗
间皮素(MSLN) v18490 RG7787
NaPi2b v18993 利法珠单抗
结果
表10提供了表面TAA定量的结果并且列出了具有高、中以及低的TAA MSLN、FRα以及NaPi2b表达的肿瘤细胞系。
表10：肿瘤细胞系上的表面TAA定量
Figure BDA0003013068510001621
Figure BDA0003013068510001631
实施例19：4-1BB x TAA双特异性抗体构建体刺激4-1BB活性的能力
为测试在存在肿瘤细胞的情况下双特异性4-1BB x MSLN、4-1BB x NaPi2b以及4-1BB x FRα抗体刺激4-1BB活性的能力，采用了共培养报告基因分析。
4-1BB NF-kB-荧光素酶报告子分析
类似于实施例3中的实验进行此实验，除了使用H226、H661、H441、H1975、IGROV1、H1299或A549肿瘤细胞。简单来说，将NFκB-luc2P/4-1BB Jurkat细胞与肿瘤细胞在CD3包被的板中混合并且放置5小时。然后使用Bio-GloTM底物测量荧光素酶的产生。使用Prism 7(GraphPad)和四参数可变斜率非线性拟合对数据进行分析。
结果
图23A和图23B中示出了结果。4-1BB x MSLN抗体对H226细胞但不对A549细胞显示活性。模式类似于双特异性抗体构建体但不具有C端抗TAA scFv的抗体v12592在此实验中对细胞系中的任一者均未显示活性，表明经由TAA交联可为发挥功能所必需的。
图24示出了4-1BB x FRα抗体v22638对与呈现一系列表达的一系列肿瘤系共培养的4-1BB报告细胞的活性。当在存在v22638和每个细胞具有大于约150,000个FRα蛋白的肿瘤细胞(IGROV1、H441、H661)的情况下培养4-1BB报告细胞时，观察到报告基因的活化。在与具有较低水平的FRα的肿瘤细胞(诸如H1299细胞)的共培养中，未观察到4-1BB的活化。4-1BB x FRα构建体v22638刺激4-1BB活性的能力似乎取决于此共培养实验中FRα由肿瘤细胞表达的水平。v22638对FRα高IGROV1细胞和FRα中H441以及H661细胞显示活性，但对FRα低A549或H1975细胞未显示活性。
原代T细胞-肿瘤共培养分析
类似于实施例5，将CD8+ T细胞与IGROV1、OVCAR3、H441、H661、H226、H1975或A549肿瘤细胞以及aAPC/CHO-K1细胞一起培养。四天之后，取上清液并且通过HTRF测量IFNγ。使用非线性四参数模型，使用GraphPad Prism v7进行数据分析。
结果
与在报告基因分析中所观察的结果类似，当与表达交联肿瘤抗原的肿瘤细胞共培养时，双特异性抗体诱导T细胞产生细胞因子。当与表达高水平的MSLN的H226细胞共培养时，4-1BB x MSLN抗体v22630诱导T细胞产生IFNγ，而每个细胞表达<300,000个MSLN分子的其他肿瘤细胞并不如此(图25B)。靶向4-1BB和FRα的双特异性抗体v22638对与IGROV1、OVCAR3以及H441细胞共培养的T细胞显示活性，表明类似的每个细胞表达约200,000个FRα分子的截止值(图25C)。NaPi2b x 4-1BB抗体构建体v22345能够使与NaPi2b高IGROV1或OVCAR3细胞以及NaPi2b中H441细胞共培养的T细胞产生IFNg增强，但NaPi2b中-低H661、H226、A549或H1975细胞并不如此。这表明每个细胞约200,000-300,000个NaPi2b分子的截止值为体外功能所需的(图25A)。未观察到不具有TAA交联臂的亲本4-1BB抗体v12592对与肿瘤细胞系中的任一者共培养的T细胞的效应，表明经由TAA臂交联为活性绝对需要的(图25D)。
实施例20：额外4-1BB x FRα抗体的制备
根据实施例1中描述的方法制备额外4-1BB x FRα抗体构建体(抗体)。表11描述了这些额外4-1BB xFRα抗体的组成，而图26提供了示例性抗体的模式的图示。使用实施例7中所描述的显示对4-1BB具激动性的小鼠抗4-1BB互补位的子集以及抗FRα互补位米罗维妥昔单抗、兔互补位1H06以及兔互补位8K22来构建这些4-1BB xFRα抗体构建体。FRα互补位1H06和8K22为如实施例23中所描述产生的新颖兔抗FRα互补位。
表11：4-1BB x FRα抗体的组成
Figure BDA0003013068510001651
Figure BDA0003013068510001661
表X列出了构成抗体构建体中的每一者的克隆。在表Y中可找到每个克隆的多肽序列。
然后，如实施例21和22中所描述对表达和纯化的抗体进行测试。
实施例21：结合至4-1BB和FRα的4-1BB x FRα抗体构建体的表征
为测试实施例20中所制备的4-1BB x FRα抗体构建体结合4-1BB的能力，通过SPR以及通过流式细胞术测量这些构建体对人4-1BB的亲和力。
SPR
针对与人4-1BB的结合对通过SEC纯化的变体进行评估。根据实施例2中所描述的方法通过SPR测定抗原结合亲和力。表12中提供了SPR结合数据的概述。
表12：4-1BB x FRα双特异性抗体的结合数据
Figure BDA0003013068510001662
Figure BDA0003013068510001671
所测试的4-1BB x FRα抗体全部显示与4-1BB结合，并且代表亲和力的KD如通过SPR所测量介于比对照抗4-1BB抗体MOR7480.1(v12592)低约20-100倍之间。
根据流式细胞术的4-1BB x FRα抗体构建体与表达4-1BB的Jurkat T细胞的结合
为检验这些抗体与天然细胞表面表达的4-1BB的结合，进行了流式细胞术结合分析。
使用经过工程化以稳定表达人4-1BB的Jurkat T细胞来测量抗体与人4-1BB的结合。将抗体在96V孔板的孔中在50μl FB(PBS 2％FCS)中从储备物1∶3稀释，并且在顶部添加细胞。然后将细胞在冰上放置30分钟以使抗体结合。然后将细胞在FB中洗涤两次，并且在含有2μg/ml山羊抗人Alexa647抗体(Jackson Immunoresearch)的50μl FB中孵育。然后将细胞在冰上再放置20分钟，在FB中洗涤两次，再悬浮于100μl FB中并且在BD FortessaTM X20上分析。使用FlowJoTM和PrismTM 7(GraphPad)使用四参数非线性回归对后续数据文件进行分析。
结果
除v23663外的所有变体均显示结合。与SPR结果类似，此实验中所测试的抗体显示与v12592相比较低的亲和力(图27A至图27F)。图27F示出了具有MOR7480.1(4-1BB)和米罗维妥昔单抗(FRα)互补位的4-1BB x FRα双特异性抗体对照变体22638的结果。
根据流式细胞术的4-1BB x FRα抗体构建体与293E细胞上所表达的FRα的结合
为检验抗体与细胞表面所表达的FRα的结合，将293E细胞用全长FRα(SEQ ID NO:80)瞬时转染。将抗体在96V孔板的孔中在50μl FB(PBS 2％FCS)中从储备物1:3稀释，并且在顶部添加细胞。然后将细胞在冰上放置30分钟以使抗体结合。然后将细胞在FB中洗涤两次，并且在含有2μg/ml山羊抗人Alexa647抗体(Jackson Immunoresearch)的50μl FB中孵育。然后将细胞在冰上再放置20分钟，在FB中洗涤两次，再悬浮于100μlFB中并且在BDFortessaTMX20上分析。使用FlowJoTM和Prism 7(GraphPad)对后续数据文件进行分析。
图28中示出了结果并且证实所有抗体均显示与FRα结合。含有8K22 scFv(图28A)的样品显示比1H06 scFv(图28B)高的结合，表明它作为scFv具有较高亲和力。含有米罗维妥昔单抗scFv的抗体(图28C)显示介于8K22与1H06之间的中等结合，表明其亲和力介于两者之间。
实施例22:4-1BB x FRα双特异性抗体对T细胞的活化
在确认4-1BB x FRα抗体与4-1BB和FRα两者结合之后，在原代T细胞活性分析中对双特异性抗体进行检验。实验调查了4-1BB刺激培养物中的T细胞产生IFNγ的能力。T细胞与肿瘤细胞共培养允许研究肿瘤细胞上的TAA对4-1BB抗体的交联。IGROV1细胞因其高FRα表达而被选择，而A549因低FRα表达而被选择。
所用的方法类似于实施例5中所用的方法。将双特异性抗体、CD8+T细胞以及IGROV1或A549肿瘤细胞与aAPC/CHO-K1细胞一起培养。四天之后，取上清液并且通过HTRF测量IFNγ。
结果
所有4-1BB x FRα抗体当与FRα高IGROV1细胞共培养时均刺激T细胞产生IFNγ(图29A和图29B)。在与FRα低A549细胞一起培养时，未观察到4-1BB x FRα抗体对T细胞的效应，表明此细胞系可能不会以足以使4-1BB x FRα抗体刺激T细胞产生IFNγ的水平表达FRα。在不存在肿瘤靶向臂的情况下，4-1BB单特异性抗体v12592、v20022以及v20036当与IGROV1或A549细胞一起培养时不能刺激细胞因子产生(图29C)。v22368充当阳性对照和比较物。
还发现在此实验中4-1BB抗体亲和力不影响T细胞的反应。抗体之间的活性差异可能归因于1H06与8K22 scFv之间的结合差异(8K22根据流式细胞术展现比1H06更大的与FRα的结合，并且还在刺激IFNγ产生中显示更大的活性)。
实施例23:结合人FRα的兔抗体的产生
在用可溶性HIS标记的人叶酸受体1抗原(FRα-HIS，AcroBiosystems目录号FO1-H82E2)免疫的兔中，针对叶酸受体α(FRα)抗体增加。通过在此所描述的方法鉴定实施例20中所描述的8K22和1H06互补位。
简单来说，给予新西兰白兔首次注射，随后进行与佐剂混合的FRα-HIS抗原的4次额外加强免疫。加强免疫中的每一者相隔14天。使用瞬时表达人FRαCHO细胞选择哪个动物来收获B细胞，通过FACs测定抗人FRα抗体效价。
回收B细胞以及通过SLAM发现抗人FRa抗体：
将具有约100,000的所需效价的经免疫兔子处死，并且收获脾脏。通过在FACs缓冲液(PBS 2％FBS)中研磨以从组织释放细胞来解离淋巴样细胞。使细胞集结成粒，然后在5ml的BD Pharm溶解液中悬浮1min以溶解红血细胞。添加相等体积的FACs缓冲液以中和Pharm溶解液并且使所得淋巴细胞样品集结成粒并且悬浮于FACs缓冲液中。
然后将淋巴细胞悬浮液用抗兔IgG Alexa-Fluor 647染色以鉴定IgG+ B细胞。在30min的染色之后，在FACSAria(BD Biosciences)上分选IgG+ B细胞并且计数。使用所选淋巴细胞抗体方法(SLAM)(Proc Natl Acad Sci U S A.1996年7月23日；93(15):7843-7848.John Babcook等)，将B细胞以从单细胞到多达50个细胞范围内的不同密度涂铺于384孔板中，在培养物中扩增7天并且收获上清液以检测抗人FRα抗体。将384孔板在-80C冷冻器中冷冻。
通过ELISA针对人FRα特异性单克隆抗体对上清液进行筛选。将384孔ELISA板用每孔25μL含人FRα-HIS(2μg/mL)的PBS包被，然后在4℃下孵育过夜。孵育之后，将板用水洗涤2次。每孔添加90μL封闭缓冲液(2％脱脂乳，PBS)并且将板在室温下孵育1小时。孵育之后，将板洗涤并且每孔添加12.5μL的含有抗体的上清液+12.5μl封闭缓冲液以及阳性和阴性对照并且将板在室温下孵育2小时。
孵育之后，将板洗涤，将25μl的0.4ug/ml山羊抗兔IgG Fc-HRP检测抗体添加至每个孔中并且将板在室温下孵育1小时。孵育之后，将板洗涤并且添加25μl的TMB并且允许板显色约10分钟(直至阴性对照孔刚刚开始显示颜色为止)。然后，将25μl停止溶液(1N HCL)添加至每个孔中并且将板在ELISA读板仪上在波长450nm下读取。
抗人FRα单克隆抗体的测序：
将含有具有所需特征的抗体的孔用RNA溶解缓冲液(Qiagen RNeasy)处理用于抗体重链和轻链的分子拯救。使用从Babcook等(Proc Natl Acad Sci USA 1996年7月23日；93(15):7843)和von Boehmer等(Nat Protoc.2016年10月；11(10):1908)改良的引物和方法，使用cDNA作为核酸模板，进行重链和轻链抗体编码序列的初始PCR。使用Zero BluntTMTOPOTM PCR克隆试剂盒(Thermofisher Scientific)将PCR产物克隆至pCRTOPO4载体中并且转化至E.cloniTM细胞(Lucigen)中。对抗生素抗性克隆进行测序并且针对独特的抗体编码序列进行分析。
然后使用V-区段家族和J-区段家族特异性引物对这些独特的序列进行巢式PCR反应。然后将所得扩增子克隆至基于pTT5的表达质粒(加拿大国家研究委员会)中。使从单一孔样品产生的独特的重链序列和轻链序列以所有可能的组合在HEK293-6E细胞(加拿大国家研究委员会)中共表达以确定恰当的重链和轻链配对。针对与HEK293细胞上瞬时表达的抗原的结合对所产生的抗体进行分析。
实施例24:兔8K22VH和VL序列的人源化
如下文所描述将如实施例23中所描述产生的兔抗人叶酸受体α(抗hFRα)抗体8K22人源化。
兔8K22 VH和VL序列与相应人生殖系序列的序列比对将IGHV3-66*01和IGKVI-39*01鉴定为最靠近的并且频繁的人生殖系序列。如图40中所示将根据AbM定义(<http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef>)的CDR移植至这些所选人生殖系序列的构架上。在所得序列中在被判断为对于保留对抗原hFRα的结合亲和力来说可能重要的位置包括向兔残基的反向突变，从而形成若干人源化序列，其中所产生的序列大部分建立在先前的序列上，并且其中第一人源化序列(H1和L1，表19)含有最小数目的反向突变。变体中无一者改变如AbM方法所定义的8K22抗体的CDR。
此方法提供五种可变重链人源化序列和五种可变轻链人源化序列。将含有人源化重链可变结构域(VH)和hIgG1重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2、CH3)的完全重链序列，以及含有人源化轻链可变结构域(VL)和人κ轻链恒定结构域(κCL)的完全轻链序列组装。然后组装单克隆抗体(mAb)变体，使得人源化重链中的每一者与人源化轻链中的每一者配对，从而提供要以实验评估的总共二十五种人源化变体(表19)。
实施例25:人源化8K22抗体制备
如下制备实施例24和表19中所描述的人源化8K22抗体。
人源化8K22构建体中的每一者以及亲本8K22构建体呈天然存在的或FSA模式，含有两条相同的全长重链和两条相同的κ轻链。表20中提供了抗体可变重链和可变轻链中的每一者的氨基酸序列。将人源化VH结构域序列(SEQ ID NO:307、308、309、310以及312)中的每一者附加至IGHG1*01(SEQ ID NO:318)的人CH1-铰链-CH2-CH3结构域序列以提供五种人源化8K22完全重链序列。将人源化VL结构域序列(SEQ ID NO:313、314、315、316以及317)中的每一者附加至IGKC*01(SEQ ID NO:67)的人κCL序列以提供五种人源化8K22轻链序列。以类似方式，将8K22兔-人亲本抗体嵌合体重链和轻链序列组装，差异在于可变结构域序列为兔序列(SEQ ID NO:298(VH)和299(VL))并且恒定结构域序列为人序列(SEQ ID NO:318(CH1-铰链-CH2-CH3链)和67(IGKC*01的CL序列))。将这些序列反向翻译为DNA，针对哺乳动物表达进行密码子优化，并且进行基因合成。表20中提供了人源化VH和VL序列。
将包含信号肽(人工设计的序列：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO:1)(Barash等,(2002),Biochem and Biophys Res.Comm.,294:835-842))以及在CH3的G446(EU编号)处封端的重链克隆的重链载体插入物连结至pTT5载体中以产生重链表达载体。将包含相同信号肽的轻链载体插入物连结至pTT5载体中以产生轻链表达载体。对所得重链和轻链表达载体进行测序，以验证编码DNA的恰当的阅读框和序列。
使抗体变体的重链和轻链在CHO-3E7细胞的400ml培养物中表达。简单来说，将密度为1.7-2x106个细胞/ml、活力>95％的CHO-3E7细胞在37℃°下在补充有4mM谷氨酰胺(GELife Sciences,Marlborogh,MA)和0.1％
Figure BDA0003013068510001721
F-68(Gibco，Life Technologies)的FreeStyleTM F17培养基(ThermoFisher,Watham,MA)中培养。将400ml的总体积使用PEI-max(Polyscience,Philadelphia,PA)以1:4(w/w)的DNA:PEI比率用总共400ug DNA(200ug的抗体DNA和200ug的GFP/AKT/充填DNA)转染。添加DNA-PEI混合物之后二十四小时，将0.5mM丙戊酸(最终浓度)+1％w/v胰蛋白胨(最终浓度)+1x抗生素/抗霉物质(GE Life Sciences,Marlborogh,MA)添加至细胞中，然后将其转移至32℃并且孵育9天，然后收获。°使亲本8K22兔-人抗体嵌合体以类似方式在1L培养物中表达。
将澄清的上清液样品分批地与用NaOH就地清洗(CIP'd)并且在杜尔贝科氏PBS(DPBS)中平衡的mAb Select SuRe树脂(GE Healthcare,Chicago,IL)一起孵育。将树脂倾入CIP’d柱中，将柱子用DPBS洗涤并且将蛋白质用100mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0洗脱。通过添加10％(v/v)1M HEPES pH 8对洗脱的级分进行pH调节，得到6-7的最终pH值。将样品缓冲液交换至PBS中并且无菌过滤。基于在280nm下的吸光度(A280nm)对蛋白质进行定量(在样品中和后存在沉淀的情况下，在A280nm测量之前将这些样品简单离心)。使用
Figure BDA0003013068510001734
便携式系统(Charles River,Wilmington,MA)测定内毒素水平。具有超过0.2EU/mg的内毒素的样品经历使用NoEndoTM离心柱(Viva Products Inc.,Littleton,MA)的内毒素移除。在蛋白质-A纯化之后在DPBS流动相中通过制备型SEC(Superdex 200 26/60)对亲本8K22兔-人抗体嵌合体变体进行进一步纯化。
纯化之后，使用Caliper
Figure BDA0003013068510001731
GXII(Perkin Elmer,Waltham,MA)通过非还原型和还原型高通量蛋白质表达分析对样品的纯度进行评估。根据HT蛋白质表达
Figure BDA0003013068510001732
用户指南2版来进行程序，进行以下修改。将2μl或5μl(浓度范围5-2000ng/μl)的抗体样品以及7μl的HT蛋白质表达样品缓冲液(Perkin Elmer#760328)添加至96孔板(BioRad,Hercules,CA)中的单独孔中。然后使抗体样品在70℃下变性15min。使用HT蛋白质表达芯片(Perkin Elmer,Waltham,MA)和Ab-200分析设定操作
Figure BDA0003013068510001733
仪器。
结果
在蛋白质-A纯化后二十五种人源化8K22抗体变体的产量在约10-30mg(或约25-75mg/L)范围内。图30B和图30D示出了亲本嵌合抗体v23820和代表性人源化变体v23807的Caliper结果。如图30D中所示，基于代表性人源化抗体样品，非还原型(NR)和还原型(R)Caliper反映了对应于全尺寸抗体以及完整重链和轻链的单一物质，所有人源化变体均为这种情况。对于以下变体：23804、2805、23807、23808、23814、23816、23817、23818，包括亲本嵌合体v23820，在蛋白质-A洗脱之后在样品中和后观测到低水平的沉淀。与未产生任何沉淀的具有类似效价的蛋白质样品的比较表明所观测到的沉淀水平为相对可忽略的，因为这两种类型的样品的所得产量为类似的。人源化8K22抗体样品中的一些需要在蛋白质-A纯化之后进行内毒素移除。对二十五种人源化8K22抗体样品中的两者进行内毒素移除并且使得内毒素水平成功降至所必需的规范。
实施例26：纯化的人源化8K22抗体的质量评价
对人源化8K22抗体变体的样品进行UPLC-SEC，以评估在亲本嵌合体抗体v23820的情况下在蛋白质-A纯化之后或制备型SEC纯化之后的物质均质性。
使用设定至30℃并且安装于具有光二极管矩阵(PDA)检测器的Waters AcquityUPLC H类生物系统上的Waters Acquity BEH200 SEC柱(2.5mL，4.6x150mm，不锈钢，1.7μm粒子)(Waters LTD,Mississauga,ON)进行UPLC-SEC。运行时间由7min以及使用含0.02％吐温20的DPBS(pH 7.4)的运行缓冲液以0.4ml/min每次注射2.8mL的总体积组成。根据在210-500nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并且在280nm下提取色谱图。使用Waters Empower 3软件进行峰整合。
结果
如图30A(对于亲本嵌合体v23820)和图30C(对于代表性人源化抗体)中所示，与纯化的亲本嵌合体抗体样品类似，代表性人源化抗体样品的UPLC-SEC型态反映了高物质均质性。亲本嵌合体在蛋白质-A纯化之后含有较高分子量物质(图中未示)，所述较高分子量物质通过制备型SEC移除。其余的人源化8K22抗体样品具有与代表性人源化抗体样品类似的型态。
实施例27:人源化8K22抗体对hFRα的亲和力评估
为确定人源化方法是否影响人源化变体对其靶标的亲和力，通过生物层干涉术(BLI)对人源化8K22抗体变体结合hFRα抗原的能力进行评估。
针对与hFRα的结合对收获后的上清液材料进行筛选，随后针对所选变体对纯化的抗体样品进行结合分析重复。
使用Octet RED96系统通过经以下步骤进行循环对抗原结合进行评估：历时200s将抗体(0.9μg/mL)加载至AHC生物传感器上；使基线稳定60s；在跨越预期KD的多个相关浓度下与重组His标记的人FRα(Acrobiosystem)缔合500s；记录解离持续1200s；并且通过在10mM甘氨酸pH 1.5(15s)与分析缓冲液(15s)之间循环3次来进行再生，然后进行下一个抗体。所用的分析缓冲液为补充有0.06％吐温20的KB缓冲液(动力学缓冲液，由PBS pH 7.4、0.1％BSA、0.02％吐温20、0.05％叠氮化钠组成)。在25℃下以1000rpm的振荡速度进行实验。
使用‘数据分析软件9.0’(ForteBio)进行数据分析。用1:1相互作用模型对扣除参考的结合曲线进行整体拟合，以产生结合动力学参数k缔合、k解离以及解离常数KD。
结果
表21和图31中示出了结果。图31A示出了使用上清液得到的亲本嵌合抗体v23820以及两种代表性人源化抗体v23801和v23807的BLI传感器图。图31B示出了使用纯化的抗体得到的亲本嵌合抗体v23820以及两种代表性人源化抗体v23801和v23807的BLI传感器图。针对与hFRα的结合对抗体上清液的筛选辨别出了与亲本嵌合体抗体相比，具有在约2倍以内的微小亲和力降低的排在前面的一组(组A)人源化8K22抗体变体(变体23798、23804、23806、23807、23809、23814、23816以及23817)。所获得的KD值在约14nM至9.3nM范围内，亲本嵌合体抗体(变体23820)的KD经测定为5.9nM。大部分人源化8K22抗体变体的特征为与亲本嵌合体mAb相比大于2倍并且最高4倍的亲和力降低；这些抗体变体称为组B变体。变体23795、23800、23810、23803以及23813与亲本嵌合体mAb相比展现约5-6倍的亲和力进一步降低；这些变体称为组C变体。人源化8K22抗体变体之间所测定的KD值的差异主要是源于k解离值的差异。
因此针对如在对上清液材料进行的分析中所测定展现高达约4倍的亲和力降低的变体进行基于纯化的抗体样品的BLI结合分析。在这种对纯化材料进行的分析中所获得的绝对KD值系统地比从在对上清液材料进行的分析中获得的值低，因为k缔合值较高(k解离值大部分类似于在对上清液材料进行的分析中所获得的值)，然而8K22人源化变体的相对排列非常类似。对于变体23809和23816(来自组A至组B)以及变体23794和23818(来自组B至组A)来说观测到放置于组A、组B以及组C内的差异。
如通过对上清液与纯化的样品材料进行的结合分析所测定，变体23804、23806、23807、23814以及23817就在人源化后对hFRα的亲和力维持在2倍以内来说作为顶层表现变体出现。这些变体具有共同的L3或L5人源化轻链，它们与其余三条人源化轻链的不同之处在于在FR环中存在两个向兔残基的氨基酸反取代。这些结合分析中所获得的数据表明这两个特定氨基酸残基对于人源化变体中保留亲本嵌合体样抗原结合亲和力来说为重要的。所出现的顶层抗体变体的次要决定因素为存在H1或H4人源化重链。
实施例28:人源化8K22抗体的热稳定性评估
如下文所描述通过差示扫描量热法(DSC)对人源化8K22抗体变体的热稳定性进行评估。
使用400μL的含浓度主要为0.4mg/mL的纯化样品的PBS使用VP-毛细管DSC(GEHealthcare,Chicago,IL)进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以使基线稳定，并且在每次样品注射之前进行缓冲液注射用于参考。以60℃/小时的速率从20℃到100℃对每个样品进行扫描，使用低反馈、8秒过滤、3min扫描前恒温以及70psi氮气压力。参考所得热谱图并且使用Origin 7软件(OriginLab Corporation,Northampton,MA)分析以确定作为热稳定性的指示的熔解温度(Tm)。
结果
针对与亲本嵌合体抗体相比展现低于约5-6倍的抗原亲和力降低的人源化8K22抗体变体测定Fab Tm值。针对所表征的人源化变体所确定的Fab Tm值与亲本嵌合体抗体类似或高多达10℃，在约70℃至约81.0℃范围内(表22)。如表22和图32(代表性变体的热谱图)中可见，除通常观测的单一转变型态(图32A)外，人源化8K22抗体变体(变体23796、23798、23801以及23818)展现双态转变型态(图32B)并且一些展现不太明显的双态转变型态(变体23802、23814、23815、23816、23817)(图32B)。尽管此类型态通常不是κFab的特征，但它们有时被观测到并且可能反映Fab结构域的非协同熔解，即恒定结构域和可变结构域分开去折叠。
所确定的Fab Tm值最低的人源化变体中共同地在人源化轻链的FR环中存在两个向兔残基的氨基酸反取代，不过Tm值最高的变体在人源化轻链的可变结构域中与所述链的恒定结构域接触的位置具有共同的向兔残基的氨基酸反取代。就变体的特定重链和轻链组成来说未鉴定出可解释在一些变体之间所观测到的转变型态(单态或两态)的差异的特定趋势。
实施例29:人源化8K22抗体的纯度评估
在蛋白质A纯化(实施例25)和非变性去糖基化之后，使用质谱法对抗体变体的表观纯度进行评估。
因为抗体变体样品仅含有Fc N-连接聚糖，所以仅使用一种酶(N-糖苷酶F(PNG酶-F))来处理样品。使用PNG酶F如下将纯化的样品去糖基化：含每微克抗体0.1U PNG酶F的50mM Tris-HCl pH 7.0，在37℃下孵育过夜，最终蛋白质浓度为0.48mg/mL。°在去糖基化之后，将样品储存在4℃下，然后进行LC-MS分析。
经由最大电喷雾离子源使用与LTQ-OrbitrapTM XL质谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)(经调整以进行较大蛋白质(>50kDa)的最佳检测)偶联的Agilent 1100 HPLC系统通过完整LC-MS对去糖基化的蛋白质样品进行分析。将样品注射至2.1x30mm Poros R2逆相柱(Applied Biosystems)上并且使用由增加浓度(20-90％)的乙腈组成的0.1％甲酸水溶液/乙腈(脱气)线性梯度进行拆分。将柱子加热至82.5℃并且将溶剂柱前加热至80℃以改善蛋白质峰形。
Figure BDA0003013068510001781
锥孔电压(源片段化设定)为约40V，FT拆分设定为7,500并且扫描范围为m/z 400-4,000。使用去糖基化IgG标准物(Waters IgG标准物)以及去糖基化mAb标准混合物(25:75半尺寸:全尺寸mAb)针对IgG样品分析对LC-MS系统进行评估。对于每次LC-MS分析，将在抗体峰(典型地3.6-4.3分钟)上所获得的质谱图汇总，并且使用仪器控制和数据分析软件MassLynx(Waters,Milford,MA)的MaxEnt 1模块将整个多电荷离子包络线(m/z1,400-4,000)反卷积为分子量型态。从所得分子量型态中的峰高确定每个样品中每种抗体物质的表观量。
结果
所有所表征的人源化8K22抗体变体具有100％物质纯度，在图33中通过两个代表性人源化抗体样品的LC/MS型态例示。图33A展示了v23801的LC/MS型态，而图33B展示了v23807的LC/MS型态。在所有样品的LC/MS型态中，存在约+422Da下的峰。在标准样品运行中也观测到此峰，表明它可能是系统污染物而不是样品污染物。
实施例30:Fab 8K22至scFv的转化
如下文所描述将实施例24和25中所描述的人源化抗人叶酸受体α(抗hFRα)抗体8K22变体23807(H4L3)的VH和VL序列从Fab模式转变成scFv模式。进行此举以有助于产生实施例1和图2B中所描述的呈2x 1模式的抗4-1BB x抗FRα双特异性抗体。
8K22 scFv的设计
设计了许多8K22 scFv，其中改变了VH和VL结构域的顺序，改变了两个结构域之间接头的长度，或评估了包括稳定二硫键的影响。制备并且测试了如实施例1和图1C中所描述呈单臂抗体模式的8K22scFv。对于大多数设计，8K22 scFv融合至Fc的C端，但在一些情况下8K22 scFv融合至Fc的N端。在表23中找到所设计的8K22 scFv的概述。在实施例32中的表27中找到每个变体的8K22 scFv部分的序列。
表23：scFv转化
Figure BDA0003013068510001791
Figure BDA0003013068510001801
更详细地，如下使人源化8K22可变轻(VL)结构域和可变重(VH)结构域转化为scFv：根据Kabat定义产生VL(SEQ ID NO:316)和VH(SEQ ID NO:310)氨基酸序列。将VL和VH序列组合为由短接头序列隔开的单一序列。接头序列为(G4S)3(短，GGGGSGGGGSGGGGS，SEQID NO:320)或(G4S)4(长，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO:321)。结构域的顺序为VL-接头-VH或VH-接头-VL(参见表23中的“取向”栏)，其中VL-VH指示VL序列在VH序列前面并且由短接头连接。VH-VL指示VH序列在VL序列前面并且由短接头连接。在一些变体中根据Kabat编号系统在位置VL-G100C和VH-G44C引入VL与VH之间的稳定化二硫化物。在表23中在二硫化物栏下将此以是表示。表23中描述了所用的scFv设计。举例来说，v29683-C-端VH-(短)-VL+二硫化物通过VH结构域融合至Fc的C端，随后为(G4S)3接头，以及VL结构域。VH和VL结构域在VL-G100C以及VH-G44C处含有二硫键。以使用实施例17中描述的异二聚Fc设计所产生的单臂模式来构建变体。
使表23中所描述的8K22 scFv序列中的每一者在N端或C端融合至如实施例17中所描述具有Het FcA突变的Fc序列。如果融合至Het FcA的N端，那么在scFv与Het FcA的铰链之间包括短Ala-Ala接头。如果融合至Het FcA的C端，那么在Het FcA与scFv之间包括短Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:336)接头。在所有构建体中，定位于上部铰链中位置Kabat：233的半胱氨酸突变至SER。将这些序列反向翻译为DNA，针对哺乳动物表达进行密码子优化，并且进行基因合成。
所有亲本(人源化8K22)和scFv转化序列的前面为人工设计的信号肽序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:1](参考：Barash S等,Biochem andBiophysRes.Comm.2002；294,835-842)。对于所有亲本和scFv转化链，如实施例1中所描述制备载体插入物并且克隆至pTT5表达载体中。
实施例31:Fc融合型8K22 scFv变体的产生
在瞬时哺乳动物表达条件下制备实施例30中所描述的变体并且随后纯化并且针对稳定性和抗原结合进行表征。对蛋白质-A后Fc融合型8K22 scFv变体的样品进行UPLC-SEC以评估高分子物质的量。另外，如下文所描述通过差示扫描量热法(DSC)对Fc融合型8K22 scFv变体中的8K22 scFv的热稳定性进行评估。进行此举以鉴定8K22 scFv的最佳设计。
方法
使Fc融合型scFv变体中的两条不同重链以及含有Fab的(29675和29686)抗体变体中的重链和轻链在200mL CHO培养物中共表达并且如实施例1中所描述进行纯化。在蛋白质-A纯化之后，如实施例1中所描述通过非还原型和还原型高通量蛋白质表达分析(LabChip)对样品的纯度进行评估。
在蛋白质-A纯化后，将样品缓冲液交换至DPBS(杜尔贝科氏PBS)中并且无菌过滤，或如实施例1中所描述根据其通过UPLC-SEC所评估的均质性进行SEC纯化。如实施例1中所描述进行UPLC-SEC。
使用DSC对最终纯化的样品进行分析以确定其热稳定性。如实施例14中所描述进行DSC实验。
结果
Fc融合型8K22 scFv变体在蛋白质-A后的变体产量在85-109mg/L范围内。蛋白质-A后的非还原型和还原型LabChip反映了具有所需分子量的超优势物质。
如基于表24可见，UPLC-SEC型态显示在不同变体中的多种均质性。一些变体含有多达56％(v29676)的高分子量(HWM)物质(即二聚体、三聚体、更高级的聚集物)。具有(G4S)4接头的变体(v29677、v29680以及v29681)具有21-34％的最低所测量HMW物质。其中v29680具有21.8％的最低所测量HMW物质。所有样品均使用制备型SEC移除了HMW物质。
表24：Fc融合型8K22 scFv样品中的高分子量物质
Figure BDA0003013068510001821
图34示出了所测试的Fc融合型8K22 scFv抗体的DSC热谱图。下表25中示出了由热谱图确定的对应于Ab的scFv部分的Tm值。
表25：Fc融合型变体中的8K22 scFv的热稳定性
Figure BDA0003013068510001822
Figure BDA0003013068510001831
热谱图上的每个峰对应于热转变。存在三个预期热转变：Fab/scFv、CH2(约71℃)以及CH3(约80℃)。Fab的转变反映了VH-VL和CH1-CL结构域的协同熔解。scFv的预期转变将对应于VH-VL结构域的熔解。一些scFv不经历协同熔解并且观测到两次转变。在这些情况下，在表25中报道较低的Tm。8K22 Fab转变与CH2结构域转变重叠，并且因此在8K22亲本Fab抗体变体的热谱图中仅观测到2个转变峰。如图34中可见，对于含有8K22 scFv的所有变体来说，可观测到三次独特的转变。8K22 scFv的Tm比亲本Fab抗体低10-15℃。工程化的二硫键使scFv的Tm增加1-6.5℃。在具有二硫键的scFv中，v29683和v29684的scFv具有最高热稳定性。在没有二硫键的scFv中，v29679的scFv具有最高热稳定性。
实施例32:根据生物层干涉术的Fc融合型8K22 scFv抗体与人FRα的结合
为评估Fc融合型8K22 scFv抗体维持与人FRα的Fab样结合的能力，通过生物层干涉术(BLI)将实施例31中所描述的scFv转化抗体的亲和力与实施例24和25中所描述的亲本嵌合抗体相比较。
针对与人FRα的结合对实施例31中所描述的SEC后蛋白质材料进行评估。如实施例27中所描述使用Octet RED 96(FortéBio)通过生物层干涉术(BLI)来测量结合。所有参数保持相同，除了解离阶段记录为持续1500s。
结果
表26中提供了针对每种Fc融合型8K22 scFv变体所测量的KD。
表26：Fc融合型8K22 scFv变体与hFRα的结合α
Figure BDA0003013068510001841
如由表26可见，对Fc融合型8K22 scFv变体进行的BLI结合分析表明，所有scFv变体均以在亲本Fab抗体的2倍以内的亲和力结合至hFRα。图35提供了亲本Fab抗体(图35A)和能够结合人FRα的两个代表性Fc融合型scFv变体(图35B以及35C)的BLI传感器图。这些结果表明，转化为scFv模式和添加二硫键不影响与抗原结合，并且scFv的位置在N-端或C-端对结合没有影响。
表27：变体的8K22 scFv氨基酸序列
Figure BDA0003013068510001842
Figure BDA0003013068510001851
Figure BDA0003013068510001861
实施例33:使用人源化互补位产生4-1BBxFRα双特异性抗体
设计了额外的4-1BB x FRα抗体构建体(抗体)v31330、v31331、v31332、v31333、v31334以及v31335，以评估模式对这些4-1BB x FRα双特异性构建体有条件活化4-1BB的能力的影响。图36提供了在此实例中所测试的抗体的模式的图示。使用实施例10中所描述的对应于变体28684(H1L2)的人源化抗4-1BB互补位1G1以及实施例30中所描述的基于转化成scFv的变体23807(H4L3)的抗FRα人源化互补位8K22制备这些4-1BB x FRα抗体构建体。表X1列出了构成抗体构建体中的每一者的克隆。在表Y1中可找到每个克隆的多肽序列。
使抗体表达并且如实施例1中所描述进行纯化。然后如后续实施例中所描述对纯化的抗体进行测试。
实施例34:原代T细胞:肿瘤共培养分析中人源化4-1BB x FRα双特异性抗体的活性
根据先前在实施例22中所描述的方法，在原代T细胞:肿瘤共培养分析中对前一实例中所描述的抗体进行测试，以评估它们活化4-1BB的能力。简单来说，将CD8+ T细胞与IGROV1肿瘤细胞和aAPC/CHO-K1细胞以及抗体样品一起放入384孔板的孔中。
四天之后，取上清液并且通过MesoScale Discovery(MSD)U-Plex IFNγ384孔分析试剂盒(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)测量IFNγ的浓度。在使用之前，在室温下通过向MA6000 384孔SA板的孔中添加50μl稀释剂100(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)将MSD板封闭30分钟。然后移除封闭溶液，并且将10μl的捕获抗体添加至每个孔中(228μl的生物素化IFNγ捕获抗体在3.77ml稀释剂100中稀释)。将板在4℃下放置过夜，然后用PBS 0.05％吐温-20洗涤三次。
用稀释剂43(Meso Scale Diagnostics)将组织培养上清液样品1:20稀释并且将5μL的稀释上清液放入含有5μL的稀释剂43的孔中。将板在室温下放置一小时以允许结合，然后用PBS 0.05％吐温-20洗涤三次。将SULFO-TAG IFNγ检测抗体(MesoScaleDiagnostics)在稀释剂3中稀释100倍并且将10μl的所得溶液添加至每个孔中，并且将板再孵育一小时。然后将板在PBS 0.05％吐温-20中洗涤三次。将40μl的MSD GOLD读取缓冲液添加至每个孔中，并且将板在MesoSector R600仪器(MesoScale Diagonistics)上读取。根据由重组IFNγ(R&D System)产生的标准曲线计算每个样品中的IFNγ的量。
结果
如由图37可见，4-1BB x FRα双特异性抗体在与IGROV1细胞的共培养中显示对IFNγ的诱导作用。如由IFNγ的总产生所示，具有两个4-1BB结合结构域的样品v31332、v31362以及v31330显示最高效力与最高活性。v31332、v31362以及v31330还与不依赖于Fc介导的交联的单特异性4-1BB抗体v30335相比显示较高的活性。仅具有单一4-1BB结合臂的样品(v31333、v31334以及v31335)以剂量依赖性方式诱导IFNγ产生，但细胞因子的总产生比对于具有两个4-1BB结合臂的样品所观察的低。v31331虽然具有两个4-1BB结合结构域，但所显示的活性类似于具有单一4-1BB结合结构域的抗体(v31333、v31334以及v31335)，表明4-1BB和FRα结合结构域位于v31331的相同臂上可产生防止4-1BB与FRα同时接合的几何结构，从而使活性降低至在单一4-1BB臂情况下所观察的活性。
将两种抗体用作非特异性活性的对照抗体。不结合哺乳动物蛋白质的v16952以及含有与v31332相同的4-1BB结合结构域和相同的模式但不结合FRα的v31354在此实验中未显示任何活性，表明此实验中所观察的IFNg产生是归因于4-1BB共刺激以及经由FRα的4-1BB抗体群集。
实施例35:在与肺细胞系和卵巢细胞系的共培养中4-1BB x FRα双特异性抗体对4-1BB的活化
针对在与肺细胞系和卵巢癌细胞系的共培养中对4-1BB信号传导的诱导作用对实施例33中所描述的4-1BB x FRα抗体进行评估。使用实施例3中所描述的NFκB报告基因分析进行分析，但使用下表28中所描述的肿瘤细胞系：
表28：卵巢细胞系和肺细胞系
Figure BDA0003013068510001881
Figure BDA0003013068510001891
从ATCC(Manassas,Virginia,USA)获得细胞系，除了OVKATE(JapaneseCollection of Research Bioresources Cell Bank,Osaka,Japan)和IGROV1(NationalCancer Institute,Bethesda,Maryland,USA)。如实施例18中所描述，基于根据流式细胞术的直接缀合至Alexa647的v17717的结合将细胞分配为FRα高、FRα中以及FRα低。
结果
与先前的实验类似，使用4-1BB NFκB报告子系统的与Jurkat T细胞共培养的IGROV1细胞显示以剂量依赖性方式由4-1BB x FRα抗体活化(图38A)。与仅具有单一4-1BB结合结构域的抗体(v31333、v31334以及v31335)相比，具有两个4-1BB结合结构域的4-1BBx FRα抗体(v31332、v31330以及v31362)显示更大的活性(图38A至图38H)。例外为v31331，v31331具有两个4-1BB结合结构域但具有与v31333、v31334以及v31335类似的活性。v31331仅能够同时接合Jurkat上的单一4-1BB与肿瘤细胞上的FRα，这可能是归因于4-1BB和FRα结合袋的邻近。
还测试了对来源于患有卵巢癌或肺癌的患者的细胞系的活性。这些细胞系也表达不同水平的FRα，从而使得能够检验FRα水平对活性的影响。当抗体与FRα高细胞共培养时，最大活性和效力更高，并且与肿瘤细胞表面的FRα水平相关联(图38A至图38H)。然而，抗体的相对活性不变，其中与其他抗体相比由v31332、v31330以及v31362观察到最高效力和活性。在与各种来源的FRα-阳性卵巢癌和肺癌细胞系的共培养中也观察到活性。基于FRα低细胞系，可观察到活性，但比在单特异性4-1BB抗体v30335情况下所观察的低。
实施例36:所选抗4-1BB互补位结合至来自食蟹猴(食蟹)猴的4-1BB的能力
通过SPR评估所选人源化抗体结合食蟹猴4-1BB的能力并且与亲本小鼠互补位1C8、1G1以及5G8相比较。已如实施例9中所描述使用均质细胞结合分析对这些抗体的食蟹猴交叉反应性进行了评估；在此实验中，使用SPR评估食蟹猴交叉反应性。所用的SPR方法类似于实施例2中所描述的SPR方法，除了使用SEC纯化的食蟹猴4-1BB-His(AcroBiosystems)代替人4-1BB。下表29中描述了所测试的抗体：
表29：所测试的抗体
Figure BDA0003013068510001901
结果
食蟹猴4-1BB与v20023和v28684两者的结合为类似的，表明1G1互补位在人源化之前和之后结合食蟹猴4-1BB。与在人4-1BB情况下所观察的类似，如在v20022与v28727之间的差异中可见，1C8互补位在人源化之后损失一些结合。与其中v20036似乎结合食蟹猴4-1BB的图11A相比之下，根据SPR，v20036与食蟹猴4-1BB结合不良。图11A与图39中的数据之间的差异可能是归因于图11A中所用的方法不能区别同食蟹猴4-1BB结合良好的抗体与结合不良的抗体。
表13至表22
表13：回收的抗人4-1BB抗体序列
Figure BDA0003013068510001911
Figure BDA0003013068510001921
Figure BDA0003013068510001931
Figure BDA0003013068510001941
表14.重链和轻链人源化1C8、1G1以及5G8的氨基酸和DNA序列
Figure BDA0003013068510001942
Figure BDA0003013068510001951
Figure BDA0003013068510001961
Figure BDA0003013068510001971
Figure BDA0003013068510001981
表15：用于构建4-1BB x HER2抗体的序列
Figure BDA0003013068510001982
Figure BDA0003013068510001991
表16：用于制备额外的4-1BB x TAA双特异性抗体构建体的序列
Figure BDA0003013068510001992
Figure BDA0003013068510002001
表17：用于制备构建体的VH和VL序列
Figure BDA0003013068510002002
Figure BDA0003013068510002011
Figure BDA0003013068510002021
Figure BDA0003013068510002031
Figure BDA0003013068510002041
Figure BDA0003013068510002051
Figure BDA0003013068510002061
Figure BDA0003013068510002071
Figure BDA0003013068510002081
Figure BDA0003013068510002091
Figure BDA0003013068510002101
Figure BDA0003013068510002111
Figure BDA0003013068510002121
Figure BDA0003013068510002131
Figure BDA0003013068510002141
Figure BDA0003013068510002151
Figure BDA0003013068510002161
Figure BDA0003013068510002171
Figure BDA0003013068510002181
Figure BDA0003013068510002191
表19：人源化8K22抗体变体的VH和VL组成
变体编号 描述 组成
23820 8K22兔-人亲本嵌合体 HL
23794 人源化8K22变体 H1L1
23795 人源化8K22变体 H2L1
23796 人源化8K22变体 H3L1
23797 人源化8K22变体 H4L1
23798 人源化8K22变体 H5L1
23799 人源化8K22变体 H1L2
23800 人源化8K22变体 H2L2
23801 人源化8K22变体 H3L2
23802 人源化8K22变体 H4L2
23803 人源化8K22变体 H5L2
23804 人源化8K22变体 H1L3
23805 人源化8K22变体 H2L3
23806 人源化8K22变体 H3L3
23807 人源化8K22变体 H4L3
23808 人源化8K22变体 H5L3
23809 人源化8K22变体 H1L4
23810 人源化8K22变体 H2L4
23811 人源化8K22变体 H3L4
23812 人源化8K22变体 H4L4
23813 人源化8K22变体 H5L4
23814 人源化8K22变体 H1L5
23815 人源化8K22变体 H2L5
23816 人源化8K22变体 H3L5
23817 人源化8K22变体 H4L5
23818 人源化8K22变体 H5L5
表20.重链和轻链人源化8K22的氨基酸序列
Figure BDA0003013068510002201
Figure BDA0003013068510002211
Figure BDA0003013068510002221
Figure BDA0003013068510002231
表21：通过Octet对人源化8K22抗体变体的抗原结合评估
Figure BDA0003013068510002232
Figure BDA0003013068510002241
ND-未测得
表22：通过DSC对人源化8K22抗体变体的热稳定性评估
变体编号 描述 FabTm(℃)
23820 8K22兔-人亲本嵌合体 69.16
23794 人源化8K22变体 74.21
23795 人源化8K22变体 ND
23796 人源化8K22变体 71.0、76.61*
23797 人源化8K22变体 75.51
23798 人源化8K22变体 72.61、77.5*
23799 人源化8K22变体 72.99
23800 人源化8K22变体 ND
23801 人源化8K22变体 70.0、75.56*
23802 人源化8K22变体 74.56
23803 人源化8K22变体 ND
23804 人源化8K22变体 69.88
23805 人源化8K22变体 71.37
23806 人源化8K22变体 71.2
23807 人源化8K22变体 70.46
23808 人源化8K22变体 69.55
23809 人源化8K22变体 77.35
23810 人源化8K22变体 ND
23811 人源化8K22变体 81.07
23812 人源化8K22变体 79.18
23813 人源化8K22变体 ND
23814 人源化8K22变体 73.91
23815 人源化8K22变体 75.84
23816 人源化8K22变体 75.48
23817 人源化8K22变体 75.19
23818 人源化8K22变体 71.41、75.0*
ND-未测得，*展现双态转变
表X：变体克隆组成
Figure BDA0003013068510002251
Figure BDA0003013068510002261
Figure BDA0003013068510002271
表X1：变体克隆组成
Figure BDA0003013068510002272
*N端重链连接至C端轻链
**此克隆为重链Fab。它将与H1克隆的C端轻链配对
表Y：序列
Figure BDA0003013068510002273
Figure BDA0003013068510002281
Figure BDA0003013068510002291
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Figure BDA0003013068510002381
Figure BDA0003013068510002391
Figure BDA0003013068510002401
Figure BDA0003013068510002411
Figure BDA0003013068510002421
Figure BDA0003013068510002431
Figure BDA0003013068510002441
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Figure BDA0003013068510002461
Figure BDA0003013068510002471
Figure BDA0003013068510002481
Figure BDA0003013068510002491
Figure BDA0003013068510002501
Figure BDA0003013068510002511
Figure BDA0003013068510002521
Figure BDA0003013068510002531
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Figure BDA0003013068510002581
Figure BDA0003013068510002591
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Figure BDA0003013068510002621
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Figure BDA0003013068510002721
Figure BDA0003013068510002731
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Figure BDA0003013068510002751
Figure BDA0003013068510002761
Figure BDA0003013068510002771
Figure BDA0003013068510002781
Figure BDA0003013068510002791
Figure BDA0003013068510002801
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Figure BDA0003013068510002821
Figure BDA0003013068510002831
Figure BDA0003013068510002841
Figure BDA0003013068510002851
Figure BDA0003013068510002861
Figure BDA0003013068510002871
Figure BDA0003013068510002881
Figure BDA0003013068510002891
Figure BDA0003013068510002901
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Figure BDA0003013068510002921
Figure BDA0003013068510002931
Figure BDA0003013068510002941
Figure BDA0003013068510002951
Figure BDA0003013068510002961
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Figure BDA0003013068510003021
Figure BDA0003013068510003031
Figure BDA0003013068510003041
Figure BDA0003013068510003051
Figure BDA0003013068510003061
Figure BDA0003013068510003071
Figure BDA0003013068510003081
Figure BDA0003013068510003091
Figure BDA0003013068510003101
Figure BDA0003013068510003111
Figure BDA0003013068510003121
Figure BDA0003013068510003131
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Figure BDA0003013068510003151
Figure BDA0003013068510003161
Figure BDA0003013068510003171
Figure BDA0003013068510003181
Figure BDA0003013068510003191
Figure BDA0003013068510003201
Figure BDA0003013068510003211
Figure BDA0003013068510003221
Figure BDA0003013068510003231
Figure BDA0003013068510003241
Figure BDA0003013068510003251
Figure BDA0003013068510003261
Figure BDA0003013068510003271
Figure BDA0003013068510003281
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Figure BDA0003013068510003301
Figure BDA0003013068510003311
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Figure BDA0003013068510003361
Figure BDA0003013068510003371
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Figure BDA0003013068510003391
Figure BDA0003013068510003401
Figure BDA0003013068510003411
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Figure BDA0003013068510003491
Figure BDA0003013068510003501
Figure BDA0003013068510003511
Figure BDA0003013068510003521
Figure BDA0003013068510003531
Figure BDA0003013068510003541
Figure BDA0003013068510003551
Figure BDA0003013068510003561
Figure BDA0003013068510003571
Figure BDA0003013068510003581
Figure BDA0003013068510003591
Figure BDA0003013068510003601
Figure BDA0003013068510003611
Figure BDA0003013068510003621
Figure BDA0003013068510003631
Figure BDA0003013068510003641
Figure BDA0003013068510003651
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Figure BDA0003013068510003691
Figure BDA0003013068510003701
Figure BDA0003013068510003711
Figure BDA0003013068510003721
Figure BDA0003013068510003731
Figure BDA0003013068510003741
Figure BDA0003013068510003751
Figure BDA0003013068510003761
Figure BDA0003013068510003771
Figure BDA0003013068510003781
Figure BDA0003013068510003791
表Y1：序列
Figure BDA0003013068510003792
Figure BDA0003013068510003801
Figure BDA0003013068510003811
Figure BDA0003013068510003821
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Figure BDA0003013068510003841
本说明书中提到的所有专利、专利申请、出版物以及数据库条目的公开内容在此以全文引用的方式特定地并入本文中，其程度如同各个此类个别专利、专利申请、出版物以及数据库条目特定地并且个别地被指示以引用的方式并入一般。
对本文所描述的特定实施方案所作的对本领域技术人员来说将显而易见的修改旨在包括在以下权利要求范围内。

Claims (83)

1.一种抗体构建体，所述抗体构建体包含：
a)第一4-1BB结合结构域，所述第一4-1BB结合结构域结合至4-1BB细胞外结构域(4-1BB ECD)，以及
b)第一肿瘤相关抗原(TAA)抗原结合结构域(TAA抗原结合结构域)，所述第一TAA抗原结合结构域结合至TAA，
其中所述第一4-1BB结合结构域和所述第一TAA抗原结合结构域直接或间接连接至支架。
2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB结合结构域为第一4-1BB抗原结合结构域。
3.根据权利要求1或2所述的构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域来源于激动性抗4-1BB抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中：
a)呈单价形式的所述第一4-1BB抗原结合结构域对人4-1BB具有介于约1μM与100pM之间的KD；和/或
b)所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过流式细胞术所测定结合至一种或多种表达TAA的细胞系；和/或
c)所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过SPR所测量结合至人4-1BB并且如通过SPR所测量结合至所述TAA；和/或
d)在存在表达TAA的细胞的情况下，所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过细胞因子产生所测量刺激T细胞中的4-1BB活性；和/或
e)所述4-1BB x TAA抗体构建体如通过流式细胞术所测量结合至表达4-1BB的细胞并且结合至表达TAA的细胞；和/或
f)在存在表达TAA的细胞的情况下，所述4-1BB x TAA抗体构建体能够刺激表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域包含：a)包含抗体1C3的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1C3的三个轻链CDR的轻链可变结构域；b)包含抗体1C8的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1C8的三个轻链CDR的轻链可变结构域；c)包含抗体1G1的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1G1的三个轻链CDR的轻链可变结构域；d)包含抗体2E8的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体2E8的三个轻链CDR的轻链可变结构域；e)包含抗体3E7的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体3E7的三个轻链CDR的轻链可变结构域；f)包含抗体4E6的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体4E6的三个轻链CDR的轻链可变结构域；g)包含抗体5G8的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体5G8的三个轻链CDR的轻链可变结构域；或h)包含抗体6B3的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体6B3的三个轻链CDR的轻链可变结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域为人抗原结合结构域或人源化抗原结合结构域。
7.根据权利要求6所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域包含：
a)与v28726的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28726的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
b)与v28727的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28727的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
c)与v28728的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28728的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
d)与v28730的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28730的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
e)与v28700的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28700的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
f)与v28704的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28704的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
g)与v28705的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28705的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
h)与v28706的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28706的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
i)与v28711的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28711的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
j)与v28712的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28712的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
k)与v28713的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28713的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
l)与v28696的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28696的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
m)与v28697的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28697的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
n)与v28698的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28698的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
o)与v28701的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28701的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
p)与v28702的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28702的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
q)与v28703的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28703的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
r)与v28707的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28707的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
s)与v28683的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28683的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
t)与v28684的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28684的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
u)与v28685的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28685的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
v)与v28686的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28686的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
w)与v28687的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28687的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
x)与v28688的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28688的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
y)与v28689的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28689的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
z)与v28690的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28690的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
aa)与v28691的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28691的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
ab)与v28692的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28692的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
ac)与v28694的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28694的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；或
ad)与v28695的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28695的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含第二4-1BB结合结构域。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二4-1BB结合结构域为第二4-1BB抗原结合结构域。
10.根据权利要求9所述的抗体构建体，其中所述第二4-1BB抗原结合结构域与所述第一4-1BB抗原结合结构域相同。
11.根据权利要求10所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和/或所述第二4-1BB抗原结合结构域呈Fab模式。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域为叶酸受体-α(FRα)抗原结合结构域、溶质载体家族34成员2(NaPi2b)抗原结合结构域、HER2抗原结合结构域、间皮素抗原结合结构域或溶质载体家族39成员6(LIV-1)抗原结合结构域。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含第二TAA抗原结合结构域。
14.根据权利要求13所述的抗体构建体，其中所述第一TAA抗原结合结构域和所述第二TAA抗原结合结构域结合至相同的TAA。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一TAA抗原结合结构域为FRα抗原结合结构域。
16.根据权利要求15所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域包含：a)包含抗体8K22的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体8K22的三个轻链CDR的轻链可变结构域；或b)包含抗体1H06的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1H06的三个轻链CDR的轻链可变结构域。
17.根据权利要求16所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域为人抗原结合结构域或人源化抗原结合结构域。
18.根据权利要求17所述的抗体构建体，其中所述FRα抗原结合结构域包含：
a)与v23794的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23794的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
b)与v23795的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23795的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
c)与v23796的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23796的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
d)与v23797的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23797的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
e)与v23798的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23798的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
f)与v23799的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23799的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
g)与v23800的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23800的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
h)与v23801的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23801的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
i)与v23802的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23802的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
j)与v23803的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23803的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
k)与v23804的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23804的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
l)与v23805的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23805的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
m)与v23806的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23806的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
n)与v23807的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23807的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
o)与v23808的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23808的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
p)与v23809的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23809的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
q)与v23810的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23810的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
r)与v23811的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23811的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
s)与v23812的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23812的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
t)与v23813的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23813的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
u)与v23814的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23814的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
v)与v23815的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23815的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
w)与v23816的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23816的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；
x)与v23817的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23817的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列；或
y)与v23818的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23818的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域呈scFv模式。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体构建体，其中所述TAA抗原结合结构域呈Fab模式。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体构建体，其中所述支架为具有第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚Fc构建体，每个Fc多肽包含CH3序列，或其中所述支架为接头或白蛋白多肽。
22.根据权利要求21所述的抗体构建体，其中所述支架为具有不同于所述第二Fc多肽的第一Fc多肽的异二聚Fc构建体，并且其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽的所述CH3序列包含促进异二聚Fc形成的氨基酸取代。
23.根据权利要求22所述的抗体构建体，其中：
a)一个Fc多肽包含氨基酸取代T350V_L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T350V_T366L_K392L_T394W；
b)一个Fc多肽包含氨基酸取代T350V_T366L_K392M_T394W并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T350V_L351Y_F405A_Y407V；
c)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366L_K392M_T394W；
d)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366L_K392L_T394W；或
e)一个Fc多肽包含氨基酸取代L351Y_S400E_F405A_Y407V并且另一Fc多肽包含氨基酸取代T366I_N390R_K392M_T394W，
其中残基的编号是根据EU编号系统进行。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含降低效应功能的一个或多个氨基酸修饰。
25.根据权利要求24所述的抗体构建体，其中所述一个或多个氨基酸修饰为L234A、L235A以及D265S，其中残基的编号是根据EU编号系统进行。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的N端，并且所述第一TAA抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的C端。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域连接至所述第一Fc多肽的N端，并且所述第一TAA抗原结合结构域连接至所述第二Fc多肽的C端。
28.根据权利要求26或27所述的抗体构建体，所述抗体构建体还包含连接至所述第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域。
29.根据权利要求1至25中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含连接至所述第一Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第二Fc多肽的N端的第二4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第一Fc多肽的C端的第一TAA抗原结合结构域以及连接至所述第二Fc多肽的C端的第二TAA抗原结合结构域。
30.根据权利要求1至25中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含连接至所述第一Fc多肽的N端或所述第二Fc多肽的N端的第一4-1BB抗原结合结构域、连接至所述第一Fc多肽的C端的第一TAA抗原结合结构域以及连接至所述第二Fc多肽的C端的第二TAA抗原结合结构域。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和或所述第二4-1BB抗原结合结构域包含：包含抗体1G1的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体1G1的三个轻链CDR的轻链可变结构域；并且第一FRα抗原结合结构域和/或第二FRα抗原结合结构域包含：包含抗体8K22的三个重链CDR的重链可变结构域，以及包含抗体8K22的三个轻链CDR的轻链可变结构域。
32.根据权利要求31所述的抗体构建体，其中所述第一4-1BB抗原结合结构域和所述第二4-1BB抗原结合结构域包含与v28614的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v28614的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列，并且所述第一FRα抗原结合结构域和/或所述第二FRα抗原结合结构域包含与v23807的VH序列至少85％相同的重链可变结构域(VH)序列以及与v23807的VL序列至少85％相同的轻链可变结构域(VL)序列。
33.根据权利要求32所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含如SEQ ID NO:353中所列的第一重链多肽序列、如SEQ ID NO:349中所列的第二重链多肽序列以及如SEQ ID NO:346中所列的轻链多肽序列。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至34中任一项所述的抗体构建体。
36.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据权利要求1至33中任一项所述的抗体构建体。
37.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据权利要求36所述的一种或多种核酸。
38.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据权利要求36所述的一种或多种核酸，或根据权利要求37所述的一种或多种载体。
39.一种制备根据权利要求1至34中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如权利要求38所述的分离的细胞，以及纯化所述抗体构建体。
40.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的抗体构建体。
41.有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
42.根据权利要求1至34中任一项所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
43.根据权利要求1至34中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
44.一种特异性结合于4-1BB的抗体构建体或其抗原结合片段，所述抗体构建体或其抗原结合片段包含：包含三个重链CDR的重链可变序列以及包含三个轻链CDR的轻链可变序列，其中所述重链CDR和所述轻链CDR来自抗体1G1、1B2、1C3、1C8、2A7、2E8、2H9、3D7、3H1、3E7、3G4、4B11、4E6、4F9、4G10、5E2、5G8或6B3中的任一者。
45.根据权利要求44所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体激动4-1BB。
46.根据权利要求45所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含含有三个CDR的重链可变(VH)序列以及含有三个CDR的轻链可变(VL)序列，其中所述重链CDR和所述轻链CDR来自抗体1G1、1C3、1C8、2E8、3E7、4E6、5G8或6B3中的任一者。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段为人源化抗体或包含人源化抗体。
48.根据权利要求44或45所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含与变体v28726、v28727、v28728、v28730、v28700、v28704、v28705、v28706、v28711、v28712、v28713、v28696、v28697、v28698、v28701、v28702、v28703、v28707、v28683、v28684、v28685、v28686、v28687、v28688、v28689、v28690、v28691、v28692、v28694或v28695中的任一者的VH和VL序列具有至少85％序列同一性的VH序列和VL序列。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段对人4-1BB分子具有约10nM至约500nM的结合亲和力(KD)。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段结合至人4-1BB多肽的细胞外结构域内的表位。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括免疫球蛋白恒定结构域，其中所述恒定结构域来自IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体、IgA或其变体、IgE或其变体、IgM或其变体或者IgD或其变体。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体为人IgG1或包含人IgG1。
53.根据权利要求44至52中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
54.根据权利要求44至50中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、单域抗体或双体抗体。
55.根据权利要求44至54中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
56.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求44至55中任一项所述的抗体构建体。
57.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据权利要求44至54中任一项所述的抗体构建体。
58.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据权利要求57所述的一种或多种核酸。
59.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据权利要求57所述的一种或多种核酸，或根据权利要求58所述的一种或多种载体。
60.一种制备根据权利要求44至55中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如权利要求59所述的分离的细胞，以及纯化所述抗体构建体。
61.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求44至55中任一项所述的抗体构建体。
62.有效量的根据权利要求44至55中任一项所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
63.根据权利要求44至55中任一项所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
64.根据权利要求44至55中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
65.一种特异性结合于FRα的抗体构建体或其抗原结合片段，所述抗体构建体或其抗原结合片段包含：包含三个CDR的重链可变(VH)序列以及包含三个CDR的轻链可变(VL)序列，其中所述重链CDR和所述轻链CDR来自抗体8K22或1H06。
66.根据权利要求65所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或包含人源化抗体。
67.根据权利要求65或66所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，所述抗FRα抗体或抗原结合片段包含与变体23794、23795、23796、23797、23798、23799、23800、23801、23802、23803、23804、23805、23806、23807、23808、23809、23810、23811、23812、23813、23814、23815、23816、23817或23818中的任一者的VH和VL序列具有至少85％序列同一性的VH序列和VL序列。
68.根据权利要求65或66所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，所述抗FRα抗体或抗原结合片段包含与如SEQ ID NO:300中所列的VH序列具有至少85％序列同一性的VH序列以及与如SEQ ID NO:301中所列的VL序列具有至少85％序列同一性的VL序列。
69.根据权利要求65至68中任一项所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段对人FRα分子具有介于约100pM至约100nM之间的结合亲和力(KD)。
70.根据权利要求65至69中任一项所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包括免疫球蛋白恒定结构域，其中所述恒定结构域选自IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体、IgA或其变体、IgE或其变体、IgM或其变体以及IgD或其变体。
71.根据权利要求65至70中任一项所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为人IgG1或包含人IgG1。
72.根据权利要求65至71中任一项所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。
73.根据权利要求65至72中任一项所述的抗FRα抗体或抗原结合片段，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、单域抗体或双体抗体。
74.根据权利要求65至73中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体缀合至药物。
75.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求65至74中任一项所述的抗体构建体。
76.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码根据权利要求65至73中任一项所述的抗体构建体。
77.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含根据权利要求76所述的一种或多种核酸。
78.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据权利要求76所述的一种或多种核酸，或根据权利要求77所述的一种或多种载体。
79.一种制备根据权利要求65至74中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在适合表达所述抗体构建体的条件下培养如权利要求78所述的分离的细胞，以及纯化所述抗体构建体。
80.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求65至74中任一项所述的抗体构建体。
81.有效量的根据权利要求65至74中任一项所述的抗体构建体用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。
82.根据权利要求65至74中任一项所述的抗体构建体用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。
83.根据权利要求65至74中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体用于治疗受试者的癌症。
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