KR20230171944A - 시스테인 조작된 항체 작제물, 접합체 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20230171944A
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cysteine
ser
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antibody construct
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KR1020237036900A
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제임스 알. 리치
마리오 산체스
사미르 다스
패트릭 파버
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자임워크스 비씨 인코포레이티드
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Abstract

적어도 하나의 시스테인 삽입 돌연변이를 도입하도록 조작된 항체 작제물 ("시스테인 조작된 항체 작제물")이 기재된다. 삽입된 시스테인 잔기(들)는 접합체, 예컨대 항체-약물 접합체를 제공하기 위해 항체 작제물에 하나 이상의 활성 제제의 접합을 위한 부위로서 사용될 수 있다.

Description

시스테인 조작된 항체 작제물, 접합체 및 사용 방법
분야
본 개시내용은 항체의 분야 및, 특히, 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체 그리고 이들 항체 및 활성 제제를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
배경
항체 약물 접합체 (ADC)는 상대적으로 새롭고 유망한 부류의 치료제를 대표한다. ADC는 링커를 통해 작은 분자 치료제 ("약물")에 결합된 단클론성 항체로 일반적으로 구성된다. 약물-대-항체 비 (DAR) 및 약물 접합의 특이적 부위는 ADC의 안정성 및 노출에 영향을 줄 수 있다 (Hamblett, et al., 2004, Clin. Cancer Res., 10(20):7063-7070; Shen, et al., 2012, Nature Biotechnology, 30:184-189). 천연 시스테인 또는 리신 잔기를 통한 접합을 통해서 ADC의 생성을 위한 전통적 방법은 전형적으로, 양쪽 약물 로드 및 접합의 측면에서, 접합체의 이질 혼합물을 초래하여, 항체 안정성, 특이성, 생체내 분포, 약동학 및/또는 효능 중 하나 이상에서 가능한 의무로 이어진다.
부위-특이적 접합의 목적을 위하여 항체에서 천연 아미노산의 시스테인 잔기로의 대체는 표지화 항체의 맥락에서 Lyons에 의해 먼저 설명되었다 (Lyons, et al., 1990, Protein Eng Des Sel., 3(8):703-708). 이질성 쟁점을 해결하기 위해 항체에서 조작된 시스테인 잔기에 부위-특이적 약물 접합은 나중에 설명되었다 (THIOMAB™) (Junutula, et al., 2008, Nat Biotechnol.,　26:925-932; Vollmar, et al., 2017, Bioconjug Chem, 28(10):2538-2548; Ohri, et al., 2018, Bioconjug Chem., 29(2):473-485). 시스테인 잔기의 부위-지향 돌연변이유발성 편입의 다른 예는 또한 설명되었다 (예를 들어, Sussman, et al., 2018, Protein Eng Des Sel., 31(2):47-54).
천연 아미노산의 시스테인 잔기로의 치환보다 시스테인 잔기의 삽입을 포함하는 관련된 전략은 또한 보고되었다 (Dimasi, et al., 2017, Mol. Pharmaceutics, 14(5):1501-1516; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2018/0169255). C239i로서 지칭된, 이전에 보고된 THIOMAB™ 시스테인 치환 위치들 중 하나의 부위 (S239C) 뒤에 시스테인 잔기의 삽입은 임상 병기 ADC인 MEDI2228에서 사용되었다. C239i 삽입은 FcγR 결합 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)의 폐지를 초래한다. 기능에서 이들 변화에 대한 구조적 근거는 설명되었다 (Gallagher, et al., 2019, Pharmaceutics, 11:546). 다른 시스테인 삽입 접근법은 또한 설명되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 US 2020/0129635 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2018/233572).
이 배경 정보는 출원인이 본 개시내용과 관련이 있을 수 있다고 믿는 정보를 알리기 위한 목적으로 제공된다. 임의의 앞선 정보가 청구된 발명에 대한 선행 기술을 구성한다고 반드시 인정되거나 해석되지 않아야 한다.
개요
시스테인 조작된 항체 작제물, 접합체 및 사용 방법이 본원에 기재된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 VH 도메인, VH 도메인 및 VL 도메인, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것으로, Fc 영역은 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하고, 항체 작제물은 (a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입; (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입; (c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입; (d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입; (e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입; (f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입; (g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입; (h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입; (i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및 (j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 여기서 VL, CL, VH 및 CH1 도메인에서 아미노산의 넘버링은 카밧 넘버링이고 CH2 도메인에서 아미노산의 넘버링은 EU 넘버링이고, 여기서 항체 작제물은 면역글로불린 G (IgG)에 기반된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물, 및 하나 이상의 삽입된 시스테인 잔기의 각각에 접합된 하나 이상의 활성 제제를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)을 갖는 접합체에 관한 것으로
A-(L-(D)q)p (I)
식 중 A는 시스테인 조작된 항체 작제물이고; L은 링커이고; D는 활성 제제이고; q는 1 내지 4의 정수이고, 및 p는 1 내지 8의 정수이고, 여기서 시스테인 조작된 항체 작제물은 VH 도메인, VH 도메인 및 VL 도메인, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 포함하고, Fc 영역은 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 시스테인 조작된 항체 작제물은 (a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입; (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입; (c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입; (d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입; (e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입; (f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입; (g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입; (h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입; (i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및 (j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 여기서 VL, CL, VH 및 CH1 도메인에서 아미노산의 넘버링은 카밧 넘버링이고 CH2 도메인에서 아미노산의 넘버링은 EU 넘버링이고, 여기서 시스테인 조작된 항체 작제물은 면역글로불린 G (IgG)에 기반되고, 여기서 각 D는 L을 통해 삽입된 시스테인 잔기에 결합된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 접합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 접합체에 의해 포함된 활성 제제가 치료적 제제인, 유효량의 본원에 기재된 대로 접합체를 투여하기를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 접합체에 의해 포함된 활성 제제가 치료적 제제인, 요법에서 사용을 위한 본원에 기재된 대로 접합체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 접합체에 의해 포함된 활성 제제가 치료적 제제인, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 대로 접합체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 삽입된 시스테인 잔기의 티올 기가 환원되도록 시스테인 조작된 항체 작제물을 환원 조건에 적용하는 단계, 및 링커와 환원된 티올 사이 결합의 형성을 허용하는 조건 하에서 티올 반응성 링커-활성 제제를 항체 작제물과 반응시키는 단계를 포함하는 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 접합체의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 사전-결정된 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 항체-약물 접합체의 제조 방법으로서, (i) VH 도메인, VH 도메인 및 VL 도메인, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물을 제공하는 단계로서, Fc 영역이 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하고, 항체 작제물이 (a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입; (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입; (c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입; (d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입; (e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입; (f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입; (g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입; (h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입; (i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및 (j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 단계, 및 (ii) 시스테인 조작된 항체 작제물을 약물-링커와 반응시켜 항체-약물 접합체를 제공하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것으로; 여기서 사전-결정된 DAR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 시스테인 조작된 항체 작제물은 사전-결정된 DAR과 동일한 수의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 여기서 VL, CL, VH 및 CH1 도메인에서 아미노산의 넘버링은 카밧 넘버링이고 CH2 도메인에서 아미노산의 넘버링은 EU 넘버링이고, 여기서 시스테인 조작된 항체 작제물은 면역글로불린 G (IgG)에 기반된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 세트에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 약물 링커의 구조를 도시한다: (A) MCvcPAB-튜불리신 M, (B) MCvcPABC-MMAE, 및 (C) MTvc화합물 1.
도 2는 접합되지 않은 대조군 (v17427) 및 대조군 ADC와 비교된 경우에, 시스테인 삽입 변이체를 사용하여 제조된 30개 예시적 항체-약물 접합체 (ADC)의 (A) 비-환원 모세관-전기영동 SDS (CE-SDS) 겔 분석, 및 (B) 환원 CE-SDS 겔 분석을 도시한다. 레인 A: 접합되지 않은 대조군 (v17427); 레인 B-D. MCvcPABC-MMAE (B), MCvcPAB-튜불리신 M (C) 및 MTvc화합물 1 (D)에 접합된 변이체 v22760 (L_K39.5C); 레인 E-G: MCvcPABC-MMAE (E), MCvcPAB-튜불리신 M (F) 및 MTvc화합물 1 (G)에 접합된 변이체 v22761 (L_K126.5C); 레인 H-J: MCvcPABC-MMAE (H), MCvcPAB-튜불리신 M (I) 및 MTvc화합물 1 (J)에 접합된 변이체 v22765 (H_G237.5C); 레인 K-M: MCvcPABC-MMAE (K), MCvcPAB-튜불리신 M (L) 및 MTvc화합물 1 (M)에 접합된 변이체 v22768 (H_Q295.5C); 레인 N-P: MCvcPABC-MMAE (N), MCvcPAB-튜불리신 M (O) 및 MTvc화합물 1 (P)에 접합된 변이체 v27321 (L_W148.5C); 레인 Q-S: MCvcPABC-MMAE (Q), MCvcPAB-튜불리신 M (R) 및 MTvc화합물 1 (S)에 접합된 변이체 v27322 (L_K149.5C); 레인 T-V: MCvcPABC-MMAE (T), MCvcPAB-튜불리신 M (U) 및 MTvc화합물 1 (V)에 접합된 변이체 v28983 (L_P40.5C); 레인 W-Y: MCvcPABC-MMAE (W), MCvcPAB-튜불리신 M (X) 및 MTvc화합물 1 (Y)에 접합된 변이체 v28989 (H_A9.5C); 레인 Z-BB: MCvcPABC-MMAE (Z), MCvcPAB-튜불리신 M (AA) 및 MTvc화합물 1 (BB)에 접합된 변이체 v28993 (H_G169.5C); 레인 CC-EE: MCvcPABC-MMAE (CC), MCvcPAB-튜불리신 M (DD) 및 MTvc화합물 1 (EE)에 접합된 변이체 v29001 (H_T299.5C); 레인 FF-HH: MCvcPABC-MMAE (FF), MCvcPAB-튜불리신 M (GG) 및 MTvc화합물 1 (HH)에 접합된 변이체 v22758 (H_A114C; 대조군); 레인 II-KK: MCvcPABC-MMAE (II), MCvcPAB-튜불리신 M (JJ) 및 MTvc화합물 1 (KK)에 접합된 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군). MW 마커 (최상부에서 최하부로): 119, 68, 48, 29, 21, 16 kDa.
도 3은 마우스 혈장과 인큐베이션 후 약물-링커 MTvc화합물 1에 접합된 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)의 면역침전 질량 분석법 (IPMS)-매개 DAR 분석의 결과를 도시한다. 양쪽 남은 DAR (닫힌 원; 좌측 축) 및 % 말레이미드 개환 (열린 원; 우측 축)은 도시된다. (A) 변이체 v22760 (L_K39.5C), (B) 변이체 v22761 (L_K126.5C), (C) 변이체 v22765 (H_G237.5C), (D) 변이체 v22768 (H_Q295.5C), (E) 변이체 v27321 (L_W148.5C), (F) 변이체 v27322 (L_K149.5C), (G) 변이체 v28983 (L_P40.5C), (H) 변이체 v28989 (H_A9.5C), (I) 변이체 v28993 (H_G169.5C), (J) 변이체 v29001 (H_T299.5C), (K) 변이체 v22758 (H_A114C; 대조군), 및 (L) 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군).
도 4는 마우스 혈장과 인큐베이션 후 약물-링커 MCvcPABC-MMAE에 접합된 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)의 면역침전 질량 분석법 (IPMS)-매개 DAR 분석의 결과를 도시한다. 양쪽 남은 DAR (닫힌 원; 좌측 축) 및 % 말레이미드 개환 (열린 원; 우측 축)은 도시된다. (A) 변이체 v22760 (L_K39.5C), (B) 변이체 v22761 (L_K126.5C), (C) 변이체 v22765 (H_G237.5C), (D) 변이체 v22768 (H_Q295.5C), (E) 변이체 v27321 (L_W148.5C), (F) 변이체 v27322 (L_K149.5C), (G) 변이체 v28983 (L_P40.5C), (H) 변이체 v28989 (H_A9.5C), (I) 변이체 v28993 (H_G169.5C), (J) 변이체 v29001 (H_T299.5C), (K) 변이체 v22758 (H_A114C; 대조군), 및 (L) 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군).
도 5는 마우스 혈장과 인큐베이션 후 약물-링커 MCvcPAB-튜불리신 M에 접합된 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)의 면역침전 질량 분석법 (IPMS)-매개 DAR 분석의 결과를 도시한다. MCvcPAB-튜불리신 M의 남은 DAR (닫힌 원, 실선; 좌측 축), % 말레이미드 개환 (열린 원; 우측 축) 및 % 분해 (아세틸 손실) (닫힌 원, 점선)은 도시된다. (A) 변이체 v22760 (L_K39.5C), (B) 변이체 v22761 (L_K126.5C), (C) 변이체 v22765 (H_G237.5C), (D) 변이체 v22768 (H_Q295.5C), (E) 변이체 v27321 (L_W148.5C), (F) 변이체 v27322 (L_K149.5C), (G) 변이체 v28983 (L_P40.5C), (H) 변이체 v28989 (H_A9.5C), (I) 변이체 v28993 (H_G169.5C), (J) 변이체 v29001 (H_T299.5C), (K) 변이체 v22758 (H_A114C; 대조군), 및 (L) 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군).
도 6은, 대조군 ADC (v17427-MTvc화합물 1, DAR 4)와 비교하여, 상이한 c-Met 발현 세포주, (A) EBC-1 세포주 (고 c-Met-발현), 및 (B) HT-29 세포주 (중 c-Met-발현) 상에서 DAR 1, 2 또는 3으로 MTvc화합물 1에 접합된 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 ADC의 시험관내 세포독성 테스트하기의 결과를 도시한다.
도 7은 (A) 6 mg/kg (DAR1), 3 mg/kg (DAR2), 2 mg/kg (DAR3) 및 1.5 mg/kg (DAR4), 및 (B) 12 mg/kg (DAR1), 6 mg/kg (DAR2), 4 mg/kg (DAR3) 및 3 mg/kg (DAR4)의 독소-매칭 용량으로 DAR4 대조군과 비교하여 중 c-Met 발현 결장직장암 이종이식 모델 HT-29에서 DAR 1, 2 또는 3으로 MTvc화합물 1에 접합된 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 ADC의 생체내 항-종양 활성을 도시한다.
도 8은 (A) 4 mg/kg (DAR1), 2 mg/kg (DAR2), 1.3 mg/kg (DAR3) 및 1 mg/kg (DAR4), 및 (B) 24 mg/kg (DAR1), 12 mg/kg (DAR2), 8 mg/kg (DAR3) 및 6 mg/kg (DAR4)의 독소-매칭 용량으로 DAR4 대조군과 비교하여 고 c-Met 발현 비-소 세포 폐암 이종이식 모델 H1975에서 DAR 1, 2 또는 3으로 MTvc화합물 1에 접합된 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 ADC의 생체내 항-종양 활성을 도시한다.
도 9는 인간 IgG1 (대립유전자 *01 [서열번호:41] 및 대립유전자 *03 [서열번호:42]), IgG3 (대립유전자 *01 [서열번호:43], 대립유전자 *18 [서열번호:44] 및 대립유전자 *17 [서열번호:45]), IgG2 (대립유전자 *04 [서열번호:46]), IgG4 대립유전자 *01 [서열번호:47], IgG2 대립유전자 *01 [서열번호:48]) 및 IgG2 (대립유전자 *02 [서열번호:49])의 CH1 도메인의 서열 정렬을 제시한다.
도 10은 인간 IgG1 (대립유전자 *01 [서열번호:3]), IgG3 (대립유전자 *01 [서열번호:4], IgG3 (대립유전자 *16 [서열번호:4], 대립유전자 *09 [서열번호:5]), 대립유전자 *09 [서열번호:6], 대립유전자 *11 [서열번호:7], 대립유전자 *14 [서열번호:8] 및 대립유전자 *18 [서열번호:9], IgG4 (대립유전자 *01 [서열번호:10] 및 대립유전자 *02 [서열번호:11]), 및 IgG2 (대립유전자 *01 [서열번호:12], 및 대립유전자 *02 [서열번호:13]의 CH2 도메인의 서열 정렬을 제시한다.
도 11은 인간 IgG1 (대립유전자 *01 [서열번호:14], 대립유전자 *04 [서열번호:15] 및 대립유전자 *03 [서열번호:16]), IgG2 (대립유전자 *01 [서열번호:17] 및 대립유전자 *06 [서열번호:18]), IgG3 (대립유전자 *15 [서열번호:19], 대립유전자 *17 [서열번호:20], 인간 IgG4 (대립유전자 *03 [서열번호:21]), 인간 IgG3 (대립유전자 *14 [서열번호:22], 인간 IgG4 (대립유전자 *01 [서열번호:23]), 인간 IgG3 (대립유전자 *06 [서열번호:24], 인간 IgG3 (대립유전자 *08 [서열번호:25]), 인간 IgG3 (대립유전자 *01 [서열번호:26], 인간 IgG3 (대립유전자 *03 [서열번호:27]), 인간 IgG3 (대립유전자 *13 [서열번호:28])의 CH3 도메인의 서열 정렬을 제시한다.
도 12는 인간 카파 경쇄 (대립유전자 *01 [서열번호:29], 대립유전자 *04 [서열번호:30], 대립유전자 *05 [서열번호:31], 대립유전자 *02 [서열번호:32] 및 대립유전자 *03 [서열번호:33]) 및 인간 람다 경쇄 (대립유전자 3*02 [서열번호:34], 대립유전자 3*03 [서열번호:35], 대립유전자 6*01 [서열번호:36], 대립유전자 2*01 [서열번호:37], 대립유전자 7*01 [서열번호:38], 대립유전자 7*03 [서열번호:39] 및 대립유전자 1*02 [서열번호:40])의 CL 도메인의 서열 정렬을 제시한다.
도 13은 (A) 약물-링커 MCvcPABC-MMAE에 접합된 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군), 및 (B) 약물-링커 MCvcPABC-MMAE에 접합된 변이체 v29001 (H_T299.5C)에 대하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 프로파일을 도시한다.
도 14는 (A) 약물-링커 MTvc화합물 1에 접합된 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군), 및 (B) 약물-링커 MTvc화합물 1에 접합된 변이체 v29001 (H_T299.5C)에 대하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 프로파일을 도시한다.
도 15는, 시스테인 치환 돌연변이 (v27320, L_K149C)를 포함하는 대조군 변이체와 각각 비교하여, (A) 변이체 v29013 (H_S239.5C; 대조군), 및 (B) 변이체 v29001 (H_T299.5C)에 대하여 시차 주사 열량계 (DSC) 프로파일을 도시한다.
도 16은 (A) 2개 뚜렷한 피크가 관찰되었고; 7.07 분에 용출된 피크가 DAR 5를 나타내고 7.5 분에 용출된 피크가 DAR 6을 나타내는 ADC v35074-MTvc화합물 1 (DAR 6)의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 프로파일, 및 (B) 3.3 분에 용출된 분획이 단량체 (99%)를 나타내는 동일한 ADC의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 프로파일을 도시한다.
도 17은 EndoS 치료 후 ADC v35074-MTvc화합물 1 (DAR 6)의 경쇄 (LC) (A), 중쇄 1 (B) 및 중쇄 2 (C)에 대하여 환원된 LC-MS 프로파일을 도시한다.
도 18은 접합되지 않은 항체로서 그리고 약물-링커 MTvc화합물 1에 접합된 시스테인 삽입 변이체 v35074의 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS) 프로파일을 도시한다. 레인 1: 단백질 사다리; 레인 2: 트라스투주맙 대조군 (비-환원된 (NR)); 레인 3: 접합되지 않은 v35074 (NR); 레인 4: v35074-MTvc화합물 1 (NR); 레인 5: 트라스투주맙 (환원된 (R)); 레인 6: 접합되지 않은 v35074 (R); 레인 7: v35074-MTvc화합물 1 (R)
상세한 설명
본 개시내용은 적어도 하나의 시스테인 삽입 돌연변이를 도입하도록 조작된 항체 작제물 ("시스테인 조작된 항체 작제물")에 관한 것이다. "시스테인 삽입 돌연변이"는 이와 관련해서 친계 항체 작제물 서열에서 존재하는 2개 아미노산 잔기 사이 도입되는 비-천연 시스테인 잔기를 지칭한다. 삽입된 시스테인 잔기(들)는 접합체를 제공하기 위해 항체 작제물에 하나 이상의 활성 제제, 예컨대 치료적, 진단적 및 표지화 제제의 접합을 위한 부위로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 시스테인 조작된 항체 작제물 및 항체 작제물에서 삽입된 시스테인 잔기에 공유적으로 부착된 활성 제제를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 접합체는 다양한 치료적 및 진단적 응용에 사용할 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당업자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "약"은 주어진 값으로부터 대략 +/-10% 변동을 지칭한다. 이와 같은 변동이, 이것이 구체적으로 언급되든 아니든, 본원에 제공된 임의의 주어진 값에 항상 포함됨이 이해되어야 한다.
용어 "포함하는"과 공동으로 본원에 사용된 경우 단어 "한" 또는 "하나"의 사용은 "1개"를 의미할 수 있지만, "1개 이상의," "적어도 1개" 및 "1개 또는 1개 초과"의 의미와 또한 일치한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는", 그리고 이들의 문법적 변이는 포괄적 또는 개방형이고 추가의, 인용되지 않은 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "~으로 본질적으로 이루어지는"은 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 본원에 사용된 때 추가의 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있지만, 인용된 조성물, 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 이들 추가가 물질적으로 영향을 주지 않음을 나타낸다. 용어 "~으로 이루어지는"은 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 본원에 사용된 때 추가의 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 경우 본원에 기재된 조성물, 용도 또는 방법은 또한, 이들 구현예가 구체적으로 지칭되든 아니든, 특정 구현예에서 그들 요소 및/또는 단계로 본질적으로 이루어질 수 있고, 다른 구현예에서 그들 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있다.
용어 "항체 작제물"은 본원에 사용된 경우에 전장 항체 및 전장 항체의 기능적 단편을 포괄한다. 기능적 항체 단편은 항원-결합 단편 (예컨대 Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 단편, 단일 쇄 가변 영역 (scFv) 및 단일 도메인 항체 (sdAb)), 뿐만 아니라 하나 이상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합할 수 있는 Fc 영역을 포함하는 Fc 단편을 포함한다. 용어 "항체 작제물"은 또한 Fc 영역 및 하나 이상의 이종 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질을 포괄한다.
전장 항체는 2개 중쇄 및 2개 경쇄를 함유하는 헤테로-사량체로서 조립된 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 중쇄는 전형적으로 도메인 (N-에서 C-말단): VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하고, 경쇄는 전형적으로 도메인 (N-에서 C-말단): VL-CL을 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 본원에 사용된 VH, CH1, VL 및 CL 도메인에서 아미노산의 넘버링은 카밧 넘버링이고, 본원에 사용된 CH2 및 CH3 도메인 그리고 힌지 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 지수로도 불리는 EU 넘버링이다 (양쪽 넘버링 시스템은 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 설명된다).
용어 "Fc 영역" 및 "Fc"는, 본원에 교환가능하게 사용된 경우에, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있어도, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역 서열은 보통 중쇄의 위치 239 (EU 넘버링)에서 C-말단까지 확장하는 것으로서 정의된다. 이량체성 Fc의 "Fc 폴리펩타이드"는 이량체성 Fc 도메인을 형성하는 2개 폴리펩타이드 중 하나, 즉 안정한 자가-결합할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. Fc 영역은 전형적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하지만, 일부 구현예에서 CH2 도메인만 또는 CH3 도메인만을 포함할 수 있다. Fc 영역은 또한 특정 구현예에서 힌지 영역을 포괄하는 것으로 간주될 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 전형적으로 위치 239에서 위치 340까지 확장하는 것으로서 정의된다. "CH3 도메인"은 전형적으로 Fc 영역에서, 즉 위치 341에서 위치 447까지 CH2 도메인에 대한 C-말단에 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서 정의된다. 인간 IgG1의 "힌지 영역"은 일반적으로 위치 216에서 위치 238까지 확장하는 것으로서 정의된다 (Burton, 1985, Molec. Immunol., 22:161-206). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역은 중쇄간 디술피드 결합을 형성하는 처음 및 마지막 시스테인 잔기를 정렬함으로써 IgG1 서열로 정렬될 수 있다.
"Fc 융합 단백질"은, 본 개시내용의 맥락에서, 이종 단백질 또는 폴리펩타이드에 융합된 Fc 영역의 전부 또는 한 부분 (예를 들어, CH2 도메인 또는 CH3 도메인)을 포함하는 단백질이다.
아미노산 서열을 설명하기 위해 본원에 사용된 때 용어 "에서 유래된" 및 "에 기반된"은 대상 아미노산 서열이 언급된 참조 아미노산 서열과 실질적으로 동일함을 의미한다.
본원에 아미노산 서열과 관련한 때 용어 "실질적으로 동일한"은, 최적으로 정렬된 때 (예를 들어 아래 기재된 방법을 사용하는 때), 아미노산 서열이 이의 참조 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 2개 아미노산 서열 사이 퍼센트 동일성은 당업계에 알려진 다양한 식으로, 예를 들어, 공공으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 Smith Waterman Alignment (Smith & Waterman, 1981, J Mol Biol 147:195-7); "BestFit" (Smith & Waterman, 1981, Advances in Applied Mathematics, 482-489); BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, et al., 1990, J Mol Biol, 215:403-10) 그리고 이들의 이형 및 업데이트; ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 이밖에도, 당업자는 비교되는 중인 서열의 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위하여 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드의 경우, 비교 서열의 길이는 적어도 10개 아미노산일 것이지만, 당업자는 실제 길이가 비교되는 중인 서열의 전반적 길이에 의존할 것임을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 비교 서열의 길이는 단백질 또는 펩타이드 서열의 전장일 수 있다.
용어 "단리된"은, 물질을 참조하여 본원에 사용된 경우에, 물질이 이의 원래 환경 (예를 들어, 자연 발생이면 자연 환경)에서 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부에서 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 부분일 수 있고/거나 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 부분일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 이의 자연 환경의 부분이 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다.
본원에 기재된 일 구현예에서 한 속성의 긍정적 인용이 대안적 구현예에서 속성을 배제하기 위한 근거의 역할을 함이 이해되어야 한다. 특히, 옵션의 목록이 주어진 구현예 또는 청구항에 제시되는 경우, 하나 이상의 옵션이 목록에서 삭제될 수 있고 단축된 목록이 대안적 구현예를 형성할 수 있음이, 이러한 대안적 구현예가 구체적으로 언급되든 아니든, 이해되어야 한다.
본원에 논의된 임의의 구현예가 본원에 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조성물에 관하여 이행될 수 있고, 그 반대도 마찬가지임이 고려된다.
시스테인 조작된 항체 작제물
본 개시내용의 시스테인 조작된 항체 작제물은 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 항체 작제물이다. 시스테인 조작된 항체 작제물은, 예를 들어, 전장 항체, 전장 항체의 기능적 단편 또는 Fc 융합 단백질일 수 있다. 기능적 항체 단편은, 예를 들어, 항원-결합 단편 및 Fc 단편을 포함한다. 항원-결합 단편의 예는, 비제한적으로, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 영역 (VL, VH), 가변 단편 (Fv), Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 단편, 단일 쇄 가변 영역 (scFv), 상보성 결정 영역 (CDR) 및 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함한다. Fc 단편은 전형적으로 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고 하나 이상의 Fc 수용체 (FcR)를 결합시킬 수 있다. Fc 단편은 임의로 힌지 영역을 포함할 수 있다.
Fc 융합 단백질은 하나 이상의 이종 폴리펩타이드에 융합된 또는 공유적으로 부착된 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 융합 단백질은 하나 이상의 표적 결합 도메인에 융합된 또는 공유적으로 부착된 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서 Fc 융합 단백질에 포함될 수 있는 표적 결합 도메인의 예는, 비제한적으로, 수용체, 수용체 단편 (예컨대 세포외 부문), 리간드, 사이토카인 및 이종 항원-결합 항체 단편 (예컨대 상이한 항체 부류 또는 하위부류로부터 항원-결합 단편)을 포함한다. 하나 이상의 이종 폴리펩타이드는 직접적으로 또는 링커, 예를 들어, 아미노산-기반 링커를 통해 Fc 영역에 융합 또는 공유적으로 부착될 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 항원-결합 도메인, Fc 영역, 또는 양쪽 항원-결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 VH 도메인 또는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 전장 항체인 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 이러한 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 단클론성 항체, 인간 항체, 키메릭 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 이와 관련해서, 전장 항체는 하나 또는 하나 초과 Fab 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전장 항체는 1-아암된 (1가) 항체 (OAA), 2가 항체 또는 다가 항체일 수 있다.
특정 구현예는 기능적 항체 단편인 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 적어도 하나의 항원-결합 도메인, 예컨대 Fab, scFv 또는 sdAb을 포함하는 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 하나 초과 항원-결합 도메인을 포함하고, 여기에서 항원-결합 도메인은, 예를 들어, Fab, scFv 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은, 예컨대 탠덤 scFv 양식 또는 scFv-Fab 양식으로, 링커와 연합된 2개 이상 항원-결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체는, 상이한 항원성 에피토프에 각각 결합하는, 2개 이상 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다.
특정 구현예는 Fc 융합 단백질인 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다.
시스테인 조작된 항체 작제물이 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 때, 각 항원-결합 도메인은 표적 항원에 결합한다. 표적 항원은 전형적으로, 표적 세포, 예컨대 종양 세포, 바이러스에 감염된 세포, 세균에 감염된 세포, 손상된 적혈구, 동맥 플라크 세포, 염증된 조직 세포 또는 섬유성 조직 세포의 표면 상에서 발견된, 세포 표면 분자,　예컨대 단백질, 지질 또는 다당류이다. 표적 항원의 예는, 비제한적으로, 종양-연관 항원 (TAA), 세포 표면 수용체 단백질, 막관통 단백질, 신호전달 단백질, 세포 생존 조절성 인자, 세포 증식 조절성 인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 분자, 림포카인, 사이토카인, 세포 주기 조절에 관여된 분자, 혈관형성에 관여된 분자 그리고 혈관신생에 관여된 분자를 포함한다. 특정 구현예는 종양-연관 항원 (TAA)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 도메인을 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다.
본 개시내용의 시스테인 조작된 항체 작제물은 면역글로불린 G (IgG)에서 유래된다. 특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 인간 IgG에서 유래된다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서 유래된다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 IgG1에서 유래된다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 인간 IgG1에서 유래된다.
시스테인 조작된 항체 작제물이 경쇄에서 시스테인 삽입을 포함하는 특정 구현예에서, 항체 작제물은 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 시스테인 조작된 항체 작제물이 경쇄에서 시스테인 삽입을 포함하는, 일부 구현예에서, 항체 작제물은 카파 경쇄를 포함한다.
인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대하여 CH1, CH2 및 CH3 도메인의, 그리고 카파 및 람다 경쇄의 아미노산 서열은 당업계에 알려진다 (예를 들어, 국제 임뮤노제네틱스 정보 시스템 (IMGT®) 웹사이트에서 제공된 서열 참조). 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 다양한 대립유전자에 대하여 CH1, CH2 및 CH3 도메인의 대표적 아미노산 서열은 도 9-11, 각각에 또한 제공되고, 카파 및 람다 CL 도메인의 대립유전자에 대하여 대표적 아미노산 서열은 도 12에 제공된다.
특정 구현예에서, 시스테인 삽입 돌연변이는 용융 온도 (Tm)에 의해 결정된 경우에 시스테인 조작된 항체 작제물의 안정성에 관해 효과가 없거나 최소 효과를 갖는다. "효과 없음 또는 최소 효과"는 시스테인 잔기가 삽입되는 시스테인 조작된 항체 작제물의 도메인의 Tm이 (시스테인 삽입 돌연변이가 결여되는) 상응하는 친계 항체 작제물에서 동일한 도메인의 Tm의 (즉 ±) 0℃ 내지 8℃ 이내임을 의미한다. 예를 들어, CH2 도메인에서 삽입된 시스테인 잔기를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물의 경우, 시스테인 조작된 항체 작제물의 CH2 도메인 Tm은 상응하는 친계 항체 작제물의 CH2 도메인 Tm의 0℃ 내지 8℃ 이내이다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기가 삽입되는 시스테인 조작된 항체 작제물의 도메인의 Tm은 상응하는 친계 항체 작제물에서 동일한 도메인의 Tm의 0℃ 내지 7℃ 이내이다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기가 삽입되는 시스테인 조작된 항체 작제물의 도메인의 Tm은 상응하는 친계 항체 작제물에서 동일한 도메인의 Tm의 0℃ 내지 6℃ 이내, 또는 0℃ 내지 5℃ 이내이다.
항체 작제물의 Tm은 당업계에 알려진 다양한 기법, 예를 들어, 원편광 이색성 분광분석 (CD), 시차 주사 열량측정법 (DSC) 또는 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물과 상응하는 친계 항체 작제물 사이 Tm 차이는 DSC에 의해 결정된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스테인 조작된 항체 작제물은 항체 작제물의 각 쇄에서, 예를 들어 양쪽 중쇄에서 또는 양쪽 경쇄에서 동일한 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하여, 활성 제제에 접합된 때 2의 평균 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 항체 작제물을 초래한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 "DAR-조율된" 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 이와 관련해서 "DAR-조율된" 항체 작제물은 (DAR 1 접합체를 허용하는) 작제물의 단 1개 쇄에서 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 또는 (DAR ≥2, 예를 들어, DAR 3, DAR 4 또는 DAR 6을 갖는 접합체를 허용하는) 시스테인 삽입 돌연변이의 조합을 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물이다.
시스테인 삽입 돌연변이
구조-기반 전산적 접근법 및 실험적 테스트를 조합함으로써, 시스테인 삽입 돌연변이에 대하여 적절한 부위는 본원에 실시예에서 기재된 대로 IgG 구조에서 식별되었다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 시스테인 조작된 항체 작제물은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
주어진 항체 작제물에서 포함될 수 있는 시스테인 삽입 돌연변이(들)가 항체 작제물의 형식에 의존적일 것이 이해될 것이다. 전장 항체 작제물은, 예를 들어, VH, VL, CL, CH1 및/또는 CH2 도메인 중 임의의 것에서 상기 기재된 대로 시스테인 삽입 돌연변이(들)를 포함할 수 있는 반면, Fc 영역, 예컨대 Fc 융합 단백질만을 포함하는 항체 작제물은 CH2 도메인에서 상기 기재된 대로 시스테인 삽입 돌연변이(들)를 포함할 수 있다. 유사하게, 항원 결합 도메인, 예컨대 scFv 또는 Fab를 포함하지만, Fc 영역이 결여되는 항체 작제물은 VH, VL, CL 및/또는 CH1 도메인에서 시스테인 삽입 돌연변이(들)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 Fc 영역에서 다음으로부터 선택된 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(c) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 Fab 영역에서 다음으로부터 선택된 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 CL 도메인 또는 CH1 도메인에서 다음으로부터 선택된 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(d) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 가변 영역에서 다음으로부터 선택된 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(c) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 CH2 도메인에서 또는 가변 영역에서 상기 기재된 대로 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 CH2 도메인에서 또는 가변 영역에서 상기 기재된 대로 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 여기서 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(a) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(d) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
본원에 기재된 시스테인 삽입 돌연변이는 항체 작제물에 대칭적으로 도입될 수 있거나 (즉 동일한 시스테인 삽입 돌연변이가 각 개별 중쇄 또는 경쇄에 도입됨) 이들은 비대칭적으로 도입될 수 있다 (즉 1개 시스테인 삽입 돌연변이가 1개 중쇄 또는 경쇄에 도입되고 상이한 시스테인 삽입 돌연변이, 또는 시스테인 삽입 돌연변이 없음이 다른 중쇄 또는 경쇄에 도입됨). 특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 대칭 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 하나 이상의 비대칭 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 대칭 및 비대칭 시스테인 삽입 돌연변이의 조합을 포함한다.
항체 작제물에, 예를 들어 양쪽 중쇄 또는 양쪽 경쇄에 대칭적으로 2개 시스테인 삽입 돌연변이 도입하기는 활성 제제에 접합된 때 2의 평균 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 시스테인 조작된 항체 작제물을 초래한다. 항체 작제물에 비대칭 시스테인 삽입 돌연변이 및/또는 시스테인 삽입 돌연변이의 조합 도입하는 것은 최종 접합체의 DAR을 "조율"하도록 한다. 예를 들어, 작제물의 단 1개 쇄에서 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 항체 작제물은 DAR 1 접합체를 허용하고, 시스테인 삽입 돌연변이의 조합을 포함하는 항체 작제물은 DAR ≥2를 갖는 접합체를 허용한다. 시스테인 조작된 항체 작제물이 시스테인 삽입 돌연변이의 조합을 포함하는 그들 구현예에서, 돌연변이는 대칭적으로 (즉 동일한 시스테인 삽입 돌연변이가 항체 작제물의 양쪽 쇄에서 포함됨), 비대칭적으로 (즉 항체 작제물의 1개 쇄에서 시스테인 삽입 돌연변이 또는 돌연변이들이 항체 작제물의 다른 쇄와 상이하거나 부재임), 또는 이들의 조합 (즉 항체 작제물의 1개 쇄에서 적어도 하나의 시스테인 삽입 돌연변이가 항체 작제물의 다른 쇄에서 시스테인 삽입 돌연변이와 동일하고, 적어도 하나의 시스테인 삽입 돌연변이가 다른 쇄와 상이하거나 부재임)으로 도입될 수 있다. 전형적으로, 항체 작제물이 단일 시스테인 삽입 돌연변이 또는 비대칭 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 때, 시스테인 삽입 돌연변이(들)는 항체 작제물의 중쇄에 도입된다. 하지만, 비대칭 경쇄 시스테인 삽입 돌연변이는 특정 구현예에서 고려된다.
본 개시내용의 특정 구현예는 대칭적인 (즉 각 삽입된 시스테인 잔기가 각 개별 중쇄 또는 경쇄 상에서 동일한 위치에 있음) 2개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에 기재된 시스테인 삽입 돌연변이들 중 1개 또는 이의 조합을 포함하는 "DAR-조율된" 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 1 내지 8개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 1 내지 6개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 1 내지 4개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 홀수의 시스테인 삽입 돌연변이, 예를 들어, 1, 3, 5 또는 7개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 DAR-조율된 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예는 1, 3 또는 5개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 DAR-조율된 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예는 1 또는 3개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 DAR-조율된 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다.
특정 구현예는 단일 (1) 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 항체 작제물의 중쇄에서 단일 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 다음으로부터 선택된 단일 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(d) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(e) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 다음으로부터 선택된 단일 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다:
(a) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(c) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에 기재된 대로 3개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 이러한 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 3개 상이한 (비대칭) 시스테인 삽입 돌연변이를 포함할 수 있거나, 2개 대칭 시스테인 삽입 돌연변이 (즉 각 개별 중쇄 또는 경쇄 상에서 동일한 위치에) 및 1개 비대칭 시스테인 삽입 (1개 경쇄 또는 중쇄 상에서 1개 삽입된 시스테인 잔기)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 3개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 이들 중 2개는 동일하고 (대칭) 1개는 상이하다 (비대칭).
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 3개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 이들 중 2개는 동일하고 (대칭) 1개는 상이하고 (비대칭), 여기에서 대칭 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택되고:
(a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입,
비대칭 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(ii) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iii) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iv) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(v) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 3개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 이들 중 2개는 동일하고 (대칭) 1개는 상이하고 (비대칭), 여기에서 대칭 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택되고:
(a) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(c) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입,
비대칭 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(ii) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(iii) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
본 개시내용의 특정 구현예는 짝수의 시스테인 삽입 돌연변이, 예를 들어, 4, 6 또는 8개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 DAR-조율된 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 일부 구현예는 4 또는 6개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 DAR-조율된 시스테인 조작된 항체 작제물에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 구현예에서, 시스테인 삽입 돌연변이는 대칭 시스테인 삽입 돌연변이이다. 하지만, 비대칭 시스테인 삽입 돌연변이는 일부 구현예에서 또한 고려된다.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 4, 6 또는 8개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 여기에서 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(ii) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iii) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iv) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(v) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 4 또는 6개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고, 여기에서 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(ii) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iii) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iv) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(v) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
추가의 돌연변이
본 개시내용의 특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 항체 작제물에 관능성에서 원하는 변화를 제공하기 위해 당업계에 알려진 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 돌연변이는 시스테인 조작된 항체 작제물의 CH2 도메인에 도입되어 하나 이상의 Fc 수용체에의 결합을 변경할 수 있고/거나 돌연변이는 시스테인 조작된 항체 작제물의 CH3 도메인에 도입되어 항체 작제물이 헤테로이량체성 Fc 영역을 포함하는 때 헤테로이량체 형성을 개선할 수 있다. 항체 작제물이 이중특이적 또는 다중특이적인 일부 구현예에서, 돌연변이는 또한 각 중쇄와 경쇄 사이 정확한 페어링을 촉진시키기 위해 Fab 영역에 도입될 수 있다. 이러한 Fab 영역 돌연변이의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/082179, WO 2015/181805 및 WO 2017/059551에 기재된 것들을 포함한다.
CH2 도메인 돌연변이
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 CH2 도메인에서 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들어, 시스테인 조작된 항체 작제물은 하나 이상의 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체에 변경된 결합을 갖는 변형된 CH2 도메인을 포함할 수 있다.
상이한 Fcγ 수용체에 대하여 친화도를 선택적으로 변경하는 CH2 도메인에 대한 다양한 아미노산 돌연변이는 당업계에 알려진다. 증가된 결합을 초래하는 아미노산 돌연변이 및 축소된 결합을 초래하는 아미노산 변형은 둘 모두 특정 적응증에 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa (활성화 수용체)에 대하여 Fc의 결합 친화도 증가하기는 증가된 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 초래하고, 이는 차례로 표적 세포의 증가된 용해를 초래한다. FcγRIIb (억제성 수용체)에 대한 축소된 결합은 마찬가지로 일부 상황에서 유익할 수 있다. FcγRIIb에의 증가된 결합, 또는 Fcγ 수용체 ("녹-아웃" 변이체)의 전부에 Fc 영역의 축소된 또는 제거된 결합은 ADCC 및 보체-매개 세포독성 (CDC)에서의 축소, 또는 이의 제거가 바람직한 때 유용할 수 있다.
Fcγ 수용체에 의해 결합을 변경하는 아미노산 돌연변이의 예는, 비제한적으로, S298A/E333A/K334A 및　S298A/E333A/K334A/K326A (FcγRIIIa에 대하여 증가된 친화도) (Lu, et al., 2011, J Immunol Methods, 365(1-2):132-41); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L (FcγRIIIa에 대하여 증가된 친화도) (Stavenhagen, et al., 2007, Cancer Res, 67(18):8882-90); F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (FcγRIIIa에 대하여 증가된 친화도) (Nordstrom, et al., 2011, Breast Cancer Res, 13(6):R123); F243L (FcγRIIIa에 대하여 증가된 친화도) (Stewart, et al., 2011, Protein Eng Des Sel., 24(9):671-8); S298A/E333A/K334A (FcγRIIIa에 대하여 증가된 친화도) (Shields, et al., 2001, J Biol Chem, 276(9):6591-604); S239D/I332E/A330L 및 S239D/I332E (FcγRIIIa에 대하여 증가된 친화도) (Lazar, et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005-10), 및 S239D/S267E 및 S267E/L328F (FcγRIIb에 대하여 증가된 친화도) (Chu, et al., 2008, Mol Immunol, 45(15):3926-33)를 포함한다.
Fcγ 수용체에 대한 Fc 결합에 영향을 미치는 추가의 변형은 Therapeutic Antibody Engineering　(Strohl & Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012, page 283)에 기재된다.
다양한 간행물은 "녹-아웃" 변이체를 생산하기 위해 항체를 조작하는데 사용된 전략을 설명한다 (예를 들어, Strohl, 2009, Curr Opin Biotech 20:685-691; Strohl & Strohl, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing, 2012, pp 225-249 참조). 이들 전략은 글리코실화의 변형을 통해서 이펙터 기능의 감소, IgG2/IgG4 스캐폴드의 사용, 또는 Fc의 힌지 또는 CH2 도메인에서 돌연변이의 도입을 포함한다 (또한, 미국 특허 공개 번호 2011/0212087, 2012/0225058 및 2012/0251531, 국제 공개 번호 WO 2006/105338, 및 Strop et al., 2012, J. Mol. Biol., 420: 204-219 참조).
Fc에 대한 FcγR 및/또는 보체 결합을 감소시키기 위한 알려진 아미노산 돌연변이의 구체적, 비-제한 예는, 비제한적으로, N297A; L234A/L235A; C220S/C226S/C229S/P238S; C226S/C229S/E3233P/L235V/L235A; L234F/L235E/P331S; IgG2 V234A/G237A; IgG2 H268Q/V309L/A330S/A331S; IgG4 L235A/G237A/E318A 및 IgG4 S228P/L236E를 포함한다. 추가의 예는 아미노산 변형 L235A/L236A/D265S를 포함하도록 조작된 Fc 영역, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/190441에 기재된 비대칭 아미노산 변형을 포함한다.
CH3 도메인 돌연변이
특정 구현예에서, 본원에 기재된 시스테인 조작된 항체 작제물은 CH3 도메인에서 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들어, 시스테인 조작된 항체 작제물은 호모이량체성 Fc의 형성보다 헤테로이량체성 Fc의 형성을 촉진시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 헤테로이량체성 Fc 영역은, 예를 들어, 이중특이적 항체 작제물에서 그리고 단일 시스테인 삽입 돌연변이 또는 시스테인 삽입 돌연변이들의 비대칭 조합을 포함하는 그들 시스테인 조작된 항체 작제물에서 유용할 수 있다.
헤테로이량체성 Fc의 형성을 촉진시키기 위해 Fc의 CH3 도메인에 대해 실시될 수 있는 다양한 아미노산 돌연변이는 당업계에 알려지고, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/027011 ("놉 인투 홀(knobs into holes)"), Gunasekaran et al., 2010, J Biol Chem, 285, 19637-46 ("정전기 스티어링"), Davis et al., 2010, Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (가닥 교환 조작된 도메인 (SEED) 기술) 및 Labrijn et al., 2013, Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (Fab-아암 교환)에 기재된 것들을 포함한다. 다른 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/058768 및 WO 2013/063702에 기재된 대로 비대칭적으로 변형된 Fc 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 1개 Fc 폴리펩타이드가 위치 F405에서 F405A, F405S, F405T 및 F405V로부터 선택된 아미노산 돌연변이, 및 위치 Y407에서 Y407I 및 Y407V로부터 선택된 아미노산 돌연변이를 포함하고, 다른 Fc 폴리펩타이드가 위치 T366에서 T366I, T366L 또는 T366M으로부터 선택된 아미노산 돌연변이, 및 아미노산 돌연변이 T394W를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 T366에서 아미노산 돌연변이는 T366I 또는 T366L이다.
일부 구현예에서, 1개 Fc 폴리펩타이드는 상기 기재된 대로 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 아미노산 돌연변이 L351Y를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 1개 Fc 폴리펩타이드는 상기 기재된 대로 위치 T366 및 T394에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 위치 K392에서 K392F, K392L 또는 K392M으로부터 선택된 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 K392에서 아미노산 돌연변이는 K392L 또는 K392M이다.
일부 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 1개 Fc 폴리펩타이드가 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 임의로 추가로 위치 L351에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 다른 Fc 폴리펩타이드가 위치 T366 및 T394에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 임의로 추가로 위치 K392에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, Fc 폴리펩타이드의 한쪽 또는 양쪽이 추가로 아미노산 돌연변이 T350V를 포함하는 상기 기재된 대로 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 1개 Fc 폴리펩타이드가 아미노산 돌연변이 Y407I 또는 Y407V와 함께 아미노산 돌연변이 F405A, F405S, F405T 또는 F405V를 포함하고, 임의로 추가로 아미노산 돌연변이 L351Y를 포함하고, 다른 Fc 폴리펩타이드가, 아미노산 돌연변이 T394W와 함께, 아미노산 돌연변이 T366I 또는 T366L을 포함하고, 임의로 추가로 아미노산 돌연변이 K392L 또는 K392M을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 한쪽 또는 양쪽은 추가로 아미노산 돌연변이 T350V를 포함한다. 일부 구현예에서, 양쪽 Fc 폴리펩타이드는 추가로 아미노산 돌연변이 T350V를 포함한다.
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체 작제물은 표 1에 변이체 1, 변이체 2, 변이체 3, 변이체 4 또는 변이체 5 중 임의의 1개에 대하여 제시된 대로 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
시스테인 조작된 항체 작제물의 제조
본원에 기재된 시스테인 조작된 항체 작제물은 표준 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 재조합 생산은 일반적으로 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 합성하기, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적절한 벡터 또는 벡터들로 클로닝하기, 및 시스테인 조작된 항체 작제물의 발현을 위하여 적합한 숙주 세포에 벡터(들)를 도입하기를 포함한다. 단백질의 재조합 생산은 당업계에 잘-알려지고, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987 & 업데이트), John Wiley & Sons, New York, NY; 및 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)에 기재된 대로 표준 기법을 사용하여 달성될 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 그래서 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 세트에 관한 것이다. 이와 관련해서 폴리뉴클레오타이드는 그래서 시스테인 조작된 항체 작제물의 전부 또는 부분을 인코딩할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에 교환가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 어느 한쪽 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체의 중합체성 형태를 지칭한다. 주어진 폴리펩타이드를 "인코딩"하는 폴리뉴클레오타이드는 적절한 조절성 서열의 제어 하에서 발생된 때 생체내 폴리펩타이드로 (DNA의 경우에) 전사되고 (mRNA의 경우에) 번역되는 폴리뉴클레오타이드이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서 시작 코돈 및 3' (카르복시) 말단에서 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종료 서열은 코딩 서열에 대해 3' 위치할 수 있다.
시스테인 조작된 항체 작제물의 발현의 경우, 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는, 어느 한쪽 직접적으로 또는 하나 이상의 서브클로닝 단계후, 표준 결찰 기법을 사용하여 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 적합한 벡터의 예는, 비제한적으로, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 박테리오파지, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 또는 DNA 바이러스를 포함한다. 벡터는 이용될 특정한 숙주 세포에서 기능적이도록 전형적으로 선택된다, 즉 벡터는 폴리뉴클레오타이드(들)의 증폭 및/또는 발현을 허용하는 숙주 세포 기구와 양립가능하다. 이와 관련하여 적절한 벡터 및 숙주 세포 조합의 선택은 당업자의 통상적인 기술 범위 내에 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 그래서 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 (예컨대 발현 벡터)에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드(들)는 단일 벡터에 의해 또는 1개 초과 벡터에 의해 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 멀티시스트론성 벡터에 의해 포함된다.
전형적으로, 발현 벡터는 플라스미드 유지를 위하여 그리고 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위하여 하나 이상의 조절성 요소를 함유할 것이다. 이러한 조절성 요소의 예는 프로모터, 인핸서 서열, 복제의 기원, 전사적 종료 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위, 폴리펩타이드 분비를 위한 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선택 가능한 마커를 포함한다.
조절성 요소는 동종 (즉 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주 출신), 이종 (즉 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종), 하이브리드 (즉 1개 초과 공급원으로부터 조절성 서열의 조합) 또는 합성일 수 있다. 이와 같이, 조절성 서열의 공급원은 조절성 서열이 이용되는 중인 숙주 세포의 기구에서 기능적이고, 이에 의해 활성화될 수 있음을 감안하면 임의의 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다.
임의로, 벡터는 이종 펩타이드 서열, 예컨대 폴리His (예를 들어, 6xHis), FLAG®, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), myc, 금속-친화도, 아비딘/스트렙타비딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 또는 비오틴 태그를 인코딩하는 코딩 서열의 5' 또는 3' 단부에 자리잡은 핵산 서열인 "태그"-인코딩 서열을 함유할 수 있다. 이 태그는 전형적으로 발현된 단백질에 융합된 채로 남아있고 단백질의 친화도 정제 또는 검출을 위한 수단의 역할을 할 수 있다. 임의로, 태그는 후속적으로 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 절단을 위한 특정 펩티다제를 사용함으로써 정제된 단백질로부터 제거될 수 있다.
다양한 발현 벡터는 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용가능하다. 대안적으로, 모든 원하는 조절성 요소를 함유하는 상업적 벡터가 이용가능하지 않은 때, 발현 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터를 시작 벡터로서 사용하여 작제될 수 있다. 원하는 조절성 요소들 중 하나 이상이 벡터에서 이미 존재하지 않는 경우, 이들은 개별적으로 수득될 수 있고 벡터에 결찰될 수 있다. 다양한 조절성 요소를 수득하고 발현 벡터를 작제하는 방법은 당업자에 잘 알려진다.
일단 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 발현 벡터가 작제되었다면, 벡터는 증폭 및/또는 단백질 발현을 위하여 적합한 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 발현 벡터의 선택된 숙주 세포로의 형질전환은 형질감염, 감염, 인산칼슘 공침전, 전기천공, 미세주사, 리포펙션, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 및 기타 알려진 기법을 포함하는 잘-알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용될 숙주 세포의 유형에 의존적일 것이다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법은 숙련된 사람에 잘 알려진다 (예를 들어, Sambrook, et al., ibid. 참조).
발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는, 적절한 조건 하에서 배양된 때, 벡터에 의해 인코딩된 단백질을 발현시키고 단백질은 후속적으로 (숙주 세포가 단백질을 분비하면) 배양 배지로부터 또는 직접적으로 (단백질이 분비되지 않으면) 이것을 생산하는 숙주 세포로부터 수집될 있다. 숙주 세포는 원핵 (예를 들어, 박테리아성 세포) 또는 진핵 (예를 들어, 효모, 진균, 식물 또는 포유류 세포)일 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예컨대 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩타이드 변형 (예컨대 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적으로 활성 분자로의 폴딩의 용이성을 고려하여 숙련된 사람에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 그래서 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 숙주 세포 또는 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다.
예를 들어, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모는, 글리코실화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모를 포함하여, 숙주 세포로서 이용될 수 있다 (예를 들어, Gerngross,　2004, Nat. Biotech.,　22:1409-1414, 및 Li et al.,　2006, Nat. Biotech.,　24:210-215 참조). 식물 세포는 또한 숙주 세포로서 활용될 수 있다 (예를 들어, (PLANTIBODIES™ 기술을 설명하는 미국 특허 번호 5,959,177; 6,040,498; 6,420,548; 7,125,978 및 6,417,429 참조).
일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 다양한 포유류 세포주는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는, 비제한적으로, SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주, 인간 태아 신장 주 293 (예를 들어, Graham, et al.,　1977, J. Gen Virol.,　36:59에 기재된 대로 HEK293 세포), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK), 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather,　1980, Biol. Reprod.,　23:243-251에 기재된 대로 TM4 세포), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa), 갯과 신장 세포 (MDCK), 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 마우스 유선 종양 (MMT 060562), TRI 세포 (예를 들어, Mather, et al.,　1982, Annals N.Y. Acad. Sci.,　383:44-68에 기재된 대로), MRC 5 세포, FS4 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, et al.,　1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　77:4216에 기재된 대로 DHFR-　CHO 세포 포함) 및 골수종 세포주 (예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0)를 포함한다. 또한, Yazaki and Wu, 2003,　Methods in Molecular Biology, Vol. 248, pp. 255-268 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.) 참조.
본 개시내용의 특정 구현예는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터로서, 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 숙주 세포를 형질감염시키고, 숙주 세포를 인코딩된 시스테인 조작된 항체 작제물의 발현에 적합한 조건 하에서 배양시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물의 제조 방법에 관한 것이다.
전형적으로, 시스테인 조작된 항체 작제물은 발현후 숙주 세포로부터 단리되고 임의로 정제될 수 있다. 발현된 단백질을 단리 및 정제하는 방법은 당업계에 잘-알려진다. 표준 정제 방법은, 예를 들어, 대기압에서 또는 중압 또는 고압에서 시스템 예컨대 FPLC, MPLC 및 HPLC를 사용하여 실시될 수 있는 크로마토그래픽 기법, 이러한 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화도, 크기조정, 겔 여과 또는 역상을 포함한다. 다른 정제 방법은 전기영동, 면역학적, 침전, 투석, 및 크로마토포커싱 기법을 포함한다. 단백질 농축과 공동으로, 한외여과 및 정용여과 기법이 또한 유용할 수 있다.
다양한 자연 단백질은 항체의 Fc 영역 또는 다른 영역을 결합한다고 당업계에 알려지고, 이들 단백질은 그러므로 Fc-함유 단백질의 정제에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아성 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 마찬가지로, 박테리아성 단백질 L은 일부 항체의 Fab 영역에 결합한다. 정제는 상기 기재된 대로 특정한 융합 파트너 또는 친화도 태그에 의해 종종 가능해질 수 있다. 예를 들어, 항체는 GST 융합이 이용되면 글루타티온, His-태그가 이용되면 Ni+2　친화도 크로마토그래피, 또는 플래그-태그가 사용되면 부동화된 항-플래그 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 유용한 정제 기법의 예는 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), 및 Protein Purification: Principles and Practice, 3rd　Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY (1994)에 기재된다.
접합체
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물 및 삽입된 시스테인 잔기를 통해 항체 작제물에 접합된 활성 제제를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 활성 제제는, 예를 들어, 치료적 제제, 진단적 제제 또는 표지화 제제일 수 있다.
선택된 활성 제제의 시스테인 조작된 항체 작제물에의 접합은 당업계에 알려진 다양한 식으로 성취될 수 있고 직접 또는 링커를 통해 이루어질 수 있다. 활성 제제의 접합을 위한 링커는 하나 이상의 활성 제제를 항체 작제물에 결합시킬 수 있는 2작용성 또는 다작용성 모이어티이다. 2작용성 (또는 1가) 링커는 단일 활성 제제를 항체 작제물 상에서 단일 부위에 결합시키는 반면, 다작용성 (또는 다가) 링커는 1개 초과 활성 제제를 항체 작제물 상에서 단일 부위에 결합시킨다. 1개 활성 제제를 항체 작제물 상에서 1개 초과 부위에 결합시킬 수 있는 링커는 또한 다작용성인 것으로 간주될 수 있다.
링커가 활성 제제를 시스테인 조작된 항체 작제물에 접합하는데 이용되는 때, 링커는 항체 작제물에서 삽입된 시스테인 잔기와 반응하도록 하는 티올-반응성 작용기를 포함한다. 티올-반응성 작용기의 예는, 비제한적으로, 말레이미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소티오시아네이트 및 이소시아네이트를 포함한다.
링커는 또한 활성 제제 상에서 표적 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함한다. 적합한 작용기는 당업계에 알려지고, 예를 들어, Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press)에 기재된 것들을 포함한다. 링커 부착을 위하여 표적 기의 역할을 할 수 있는 활성 제제 상의 기는, 비제한적으로, 티올, 하이드록실, 카르복실, 아민, 알데하이드 및 케톤 기를 포함한다.
티올과 반응하기 위한 작용기의 비-제한 예는 위에 기재된다. 아민과 반응하기 위한 작용기의 비-제한 예는 활성화된 에스테르 (예컨대 N-하이드록시숙신아미드 (NHS) 에스테르 및 술포-NHS 에스테르), 이미도 에스테르 (예컨대 트라우트 시약), 이소티오시아네이트, 알데하이드 및 산 무수물 (예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA))을 포함한다. 다른 예는 숙신이미도-1,1,3,3-테트라-메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TSTU) 및 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)를 포함한다.
활성 제제 상에서 친전자성 기와 반응할 수 있는 작용기 (예컨대 알데하이드 또는 케톤 카르보닐 기)의 비-제한 예는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트 및 아릴하이드라지드를 포함한다.
링커는 절단가능 또는 비-절단가능할 수 있다. 절단가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건 하에서, 예를 들어, 리소좀성 과정을 통해서 절단하기 쉽다. 예는 프로테아제-민감성, 산-민감성 또는 환원-민감성인 링커를 포함한다. 비-절단가능한 링커는 대조적으로, 세포에서 항체의 분해에 의존하고, 이는 전형적으로 아미노산-링커-활성 제제 모이어티의 방출을 초래한다.
적합한 절단가능한 링커는, 예를 들어, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀성 프로테아제 또는 엔도솜성 프로테아제에 의해 절단가능한 펩타이드-함유 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 디펩타이드, 예컨대 발린-시트룰린 (Val-Cit) 또는 페닐알라닌-리신 (Phe-Lys)을 포함할 수 있다. 링커에서 포함을 위하여 적합한 디펩타이드의 다른 예는 Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, 페닐Gly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys 및 Met-(D)Lys를 포함한다. 링커는 또한 더 긴 펩타이드 서열, 예컨대 트리펩타이드 Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys 또는 (D)Ala-Phe-Lys, 또는 테트라펩타이드 Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Gly-Phe-Gly 또는 Ala-Leu-Ala-Leu를 포함할 수 있다.
절단가능한 링커의 추가의 예는 디술피드-함유 링커를 포함한다. 디술피드-함유 링커의 예는, 비제한적으로, N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오) 부타노에이트 (SPBD) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-술포 부타노에이트 (술포-SPBD)를 포함한다. 디술피드-함유 링커는 링커의 세포외 안정성, 예를 들어, 같은자리 디메틸기의 포함을 개선하기 위해 디술피드 결합에 인접한 입체 장애를 제공하도록 추가의 기를 임의로 포함할 수 있다. 다른 적합한 링커는 특정 pH에서 또는 pH 범위 내에서 가수분해가능한 링커, 예컨대 하이드라존 링커를 포함한다.
절단가능한 링커의 추가 예는 리소좀 및 종양 간질에 존재하는 효소인 β-글루쿠로니다제에 의해 절단가능한 β-글루쿠로니드를 포함하는 링커이다 (예를 들어, De Graaf, et al., 2002, Curr. Pharm. Des. 8:1391-1403 참조).
절단가능한 링커는 임의로 추가로 하나 이상의 추가의 관능성 예컨대 자기-희생적 및 자기-제거 기, 스트레처 또는 친수성 모이어티를 포함할 수 있다.
링커에서 사용할 수 있는 자기-희생적 및 자기-제거 기는, 예를 들어, p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB 또는 PABC) 및 p-아미노벤질 에테르 (PABE) 기, 및 메틸화된 에틸렌 디아민 (MED)을 포함한다. 자기-희생적 기의 다른 예는, 비제한적으로, PABC 또는 PABE 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물 예컨대 헤테로환식 유도체, 예를 들어 미국 특허 번호 7,375,078에 기재된 대로 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체를 포함한다. 다른 예는 아미드 결합 가수분해시 환화를 겪는 기, 예컨대 치환된 및 미치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues, et al., 1995, Chemistry Biology 2:223-227) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867-5877)를 포함한다. 자기-희생적/자기-제거 기는, 단독으로 또는 조합으로 펩타이드-기반 링커에 종종 포함되고, 다른 유형의 링커에 또한 포함될 수 있다.
ADC를 위한 링커에 사용하는 스트레처는, 예를 들어, 알킬렌 기 그리고 지방족 산, 이산, 아민 또는 디아민, 예컨대 디글리콜레이트, 말로네이트, 카프로에이트 및 카프로아미드에 기반된 스트레처를 포함한다. 다른 스트레처는, 예를 들어, 글리신-기반 스트레처 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 기반된 스트레처를 포함한다.
다양한 비-절단가능한 링커는 활성 제제를 항체에 결합하기 위하여 당업계에 또한 알려진다. 예는, 비제한적으로, N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)사이클로헥산카르복실레이트 (SMCC), 술포숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC), N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트) ("장쇄" SMCC 또는 LC-SMCC), κ-말레이미도운데칸산 N-숙신이미딜 에스테르 (KMUA), γ-말레이미도부티르산 N-숙신이미딜 에스테르 (GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-숙신이미드 에스테르 (AMAS), 숙신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트 (SMPH), N-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트 (SMPB), N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트 (PMPI), N-숙신이미딜-4-(요오도아세틸)-아미노벤조에이트 (SIAB), N-숙신이미딜 요오도아세테이트 (SIA), N-숙신이미딜 브로모아세테이트 (SBA) 및 N-숙신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP)에 기반된 링커를 포함한다.
주어진 시스테인 조작된 항체 작제물에 접합될 수 있는 활성 제제 분자의 수 (약물-대-항체 비 또는 DAR)는 항체 작제물에 의해 포함된 시스테인 삽입 돌연변이의 수 그리고 이용된 링커의 유형 (1가 또는 다가)에 의존할 것이다.
본 개시내용의 특정 구현예는 화학식 (I)을 갖는 접합체에 관한 것이다:
A-(L-(D)q)p (I)
식 중:
A는 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물이고;
L은 링커 (예를 들어, 위에 기재된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 링커)이고;
D는 활성 제제이고;
q는 1 내지 4의 정수이고,
p는 1 내지 8의 정수이고,
여기서 D는 L을 통해 시스테인 조작된 항체 작제물에서 삽입된 시스테인 잔기에 결합된다.
화학식 (I)의 일부 구현예에서, q는 1, 2 또는 3이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, q는 1 또는 2이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, p는 1 내지 6의 정수이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, p는 6이다.
화학식 (I)의 일부 구현예에서, q는 1, 2 또는 3이고, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, q는 1 또는 2이고, p는 1 내지 8의 정수이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, q는 1 또는 2이고, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 화학식 (I)의 일부 구현예에서, q는 1 또는 2이고, p는 6이다.
특정 구현예에서, 접합체는 화학식 (II)를 갖는다:
A-(L-D)p (II)
식 중:
A는 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물이고;
L은 링커 (예를 들어, 위에 기재된 구현예 중 임의의 하나에 기재된 대로 링커)이고;
D는 활성 제제이고,
p는 1 내지 8의 정수이고,
여기서 D는 L을 통해 시스테인 조작된 항체 작제물에서 삽입된 시스테인 잔기에 결합된다.
화학식 (II)의 일부 구현예에서, p는 1 내지 6의 정수이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, p는 1, 2 또는 3이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, p는 2이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, p는 1 또는 3이다. 화학식 (II)의 일부 구현예에서, p는 4 또는 6이다.
항체를 포함하여, 다양한 제제를 단백질 상에서 유리 티올 기에 접합하는 방법은 당업계에 알려지고 (예를 들어, Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press에서 참조) 예시적 방법은 본원에 실시예에서 또한 기재된다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본 개시내용의 시스테인 조작된 항체 작제물을 포함하는 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 대로 적어도 하나의 삽입된 시스테인 잔기를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물을 삽입된 시스테인 잔기의 티올 기가 환원되도록 하는 환원 조건에 따르게 하고, 링커와 환원된 티올 사이 결합의 형성을 허용하는 조건 하에서 항체 작제물과 티올 반응성 링커-활성 제제를 반응시키는 것을 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 사전-결정된 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 항체-약물 접합체의 제조 방법으로서, 본원에 기재된 대로 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물을 약물-링커와 반응시켜 항체-약물 접합체를 제공하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이고, 여기에서 사전-결정된 DAR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 시스테인 조작된 항체 작제물은 사전-결정된 DAR과 동일한 수의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, 사전-결정된 DAR은 2이다. 일부 구현예에서, 사전-결정된 DAR은 1 또는 3이다. 일부 구현예에서, 사전-결정된 DAR은 4 또는 6이다.
일부 구현예에서, 사전-결정된 DAR은 1 또는 3이고 시스테인 조작된 항체 작제물에 의해 포함된 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(a) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(c) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(d) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
일부 구현예에서, 사전-결정된 DAR은 1 또는 3이고 시스테인 조작된 항체 작제물에 의해 포함된 시스테인 삽입 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(ii) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iii) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
(iv) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
(v) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입.
활성 제제
시스테인 조작된 항체 작제물에 접합될 수 있는 활성 제제는 치료적 제제, 진단적 제제 및 표지화 제제를 포함한다.
치료적 제제의 예는, 비제한적으로, 항대사물질, 알킬화 제제, 안트라사이클린, 항생제, 항-유사분열 제제, 독소, 세포사멸 제제, 혈전성 제제, 항혈관신생 제제, 생물학적 반응 조절제, 성장 인자, 방사성 물질 및 방사성금속 이온 접합에 유용한 거대환식 킬레이트화제를 포함한다. 진단적 제제의 예는, 비제한적으로, 다양한 이미징 제제 예컨대 형광성 물질, 발광성 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 표지화 제제의 예는, 비제한적으로, 효소, 보결분자단, 형광성 물질, 발광성 물질, 방사성 물질을 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물 및 치료적 제제를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물 및 항-암 제제를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 예시적 항-암 제제는, 비제한적으로, 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 헤미아스텔린, 튜불리신, 돌라스타틴, 트리코테센, 듀오카르마이신, 캄프토테신, 칼리케아미신 및 기타 엔디인 항생제, 탁산, 안트라사이클린, 슈도모나스 외독소 (PE), 피롤로벤조디아자펜 (PBD), 그리고 이들의 유사체 및 유도체를 포함한다.
약학적 조성물
본 개시내용의 특정 구현예는 본원에 기재된 대로 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 치료적 또는 진단적 사용을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 조성물은 잘-알려지고 용이하게 이용가능한 구성성분을 사용하여 알려진 절차에 의해 제조될 수 있고, 예를 들어, 경구 (예를 들어, 협측 또는 설하 포함), 국부, 비경구, 직장 또는 질 경로에 의해, 혹은 흡입 또는 스프레이에 의해 대상체에게 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 용어 "비경구"는 본원에 사용된 경우에 피하, 피내, 관절내, 정맥내, 근육내, 혈관내, 흉골내 또는 척수강내 루트에 의해 주사 또는 주입을 포함한다.
조성물은 전형적으로 선정된 루트에 의해, 예를 들어, 시럽, 엘릭서, 정제, 트로키, 로젠지, 경질 또는 연질 캡슐, 알약, 좌약, 유성 또는 수성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 주사제 또는 용액으로서 대상체에게 투여에 적합한 형식으로 제형화될 것이다. 조성물은 단위 투약 제형으로서 제공될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 이용된 투약량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 비독성이다. 이러한 담체의 예는, 비제한적으로, 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 알코올, 벤질 알코올, 알킬 파라벤 (예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤), 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩타이드; 단백질 예컨대 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화 제제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 예컨대 Zn-단백질 복합체, 및 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 멸균 주사가능한 수성 또는 유질 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 당업계에 알려지는 적합한 분산 또는 습윤 제제 및/또는 현탁 제제를 사용하여 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액은 비-독성 친계로 허용가능한 희석제 또는 용매에서 접합체를 포함할 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 희석제 및 용매는, 예를 들어, 1,3-부탄디올, 물, 링거액 또는 등장성 염화나트륨 용액을 포함할 수 있다. 이밖에도, 멸균, 고정된 오일은 용매 또는 현탁 배지로서 이용될 수 있다. 이 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는, 다양한 무자극 고정된 오일이 이용될 수 있다. 이밖에도, 지방산 예컨대 올레산은 주사제의 제조에서 사용한다. 보조제 예컨대 국소 마취제, 방부제 및/또는 완충 제제는 당업계에 알려진 대로 주사가능한 용액 또는 현탁액에서 또한 포함될 수 있다.
다른 약학적 조성물 및 약학적 조성물의 제조 방법은 당업계에 알려지고, 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (이전에 "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)에 기재된다.
사용 방법
활성 제제에 접합된 본 개시내용의 시스테인 조작된 항체 작제물을 포함하는 접합체는 치료 방법, 진단 방법 및 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다. 본 방법의 정확한 성격은, 시스테인 조작된 항체 작제물에 접합된 활성 제제의 유형을 포함하여, 접합체의 성격에 의존적일 것이다.
예를 들어, 본 개시내용의 특정 구현예는 치료적 제제에 접합된 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 포함하는 접합체를 질환 또는 장애에 걸린 대상체에게 투여함으로써 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 치료적 제제가 항-암 제제인 일부 구현예에서, 접합체는 암의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예는 진단적 제제에 접합된 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 포함하는 접합체를 질환 또는 장애에 걸린 것으로 의심된, 또는 걸린 것으로 알려진 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 장애의 진단 방법에 관한 것이다. 일부 구현예는 진단적 제제에 접합된 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 포함하는 접합체와 질환 또는 장애에 걸린 것으로 의심된, 또는 걸린 것으로 알려진 대상체로부터 채집된 생물학적 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 질환 또는 장애의 진단 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 구현예는, 시스테인 조작된 항체 작제물이 표적 모이어티를 특이적으로 결합시키는, 표지화 제제에 접합된 본원에 기재된 대로 시스테인 조작된 항체 작제물을 포함하는 접합체와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 표적 모이어티의 존재에 대하여, 생물학적 샘플, 예컨대 대상체로부터 채집된 샘플의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
하기 실시예는 실례적 목적으로 제공되고 임의의 식으로 청구된 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
일반 절차
1. 시스테인 조작된 변이체의 클로닝, 발현 및 정제
c-Met 또는 FRα를 표적하고 헤테로이량체성 Fc 영역 (HetFc)을 갖는 IgG1 항체를 하기 실시예에서 기재된 시스테인 조작된 작제물 및 대조군을 작제하는 데 사용하였다. HetFc는 하기 돌연변이를 CH3 도메인에서 포함한다:
쇄 A (HC-A): T350V_L351Y_F405A_Y407V
쇄 B (HC-B): T350V_T366L_K392L_T394W
시스테인 조작된 작제물 및 대조군을 하기와 같이 클로닝 및 발현하였다. 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자를 인간/포유류 발현에 최적화된 코돈을 사용하여 유전자 합성을 통해 작제하였다. 신호 펩타이드 MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG [서열번호:1]를 각 폴리펩타이드 서열의 N-말단에 포함하였다. 일부 경우에, 경쇄는 C-말단 잔기에 직접적으로 융합된 펩타이드 ESSCDVKLV [서열번호:2]를 함유하였다.
최종 유전자 산물을 포유류 발현 벡터 PTT5 (NRC-BRI, 캐나다)로 서브-클로닝하였고 CHO 세포에서 발현하였다 (Durocher, et al., 2002, Nucl Acids Res., 30(2):E9). 간략히, CHO-3E7 세포를 생존력 ≥97%를 가진 1.5-2 백만 세포/ml의 세포 밀도까지 0.1% w/v 플루로닉 및 4 mM 글루타민으로 보충된 FreeStyle™ F17 배지 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)의 현탁액에서 성장하였다. 형질감염을 플라스미드 DNA: 5% pTTo-GFP 플라스미드 (형질감염 효율을 결정하기 위한 녹색 형광성 단백질), 15% pTT22-AKT 플라스미드, 항체 작제물 DNA의 21% (1:1:3 HC-A, HC-B, LC 비로), 68.37% 연어 정자 DNA의 혼합물을 사용하여 Durocher 및 공동작업자 (Delafosse, et al., 2016, J Biotechnol, 227:103-111; Raymond, et al., 2015, MAbs, 7(3):571-83)에 의해 기재된 대로 실시하였다. 형질감염 이후, 세포가 들어있는 진탕 플라스크를 37℃에 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 120 rpm으로 설정된 궤도 진탕기에 배치하였다. 형질감염후 24 시간에, 1% w/v 트립톤 N1 (TN1) 및 0.5 mM 발프로산을 배양물에 첨가하였다. 배양물을 그 다음 32℃에 5% CO2로 가습된 인큐베이터에서 배치된 궤도 진탕기 (120 rpm)로 옮겼다. 24-48 시간에, GFP 양성 세포는 유세포 분석법에 의해 결정된 경우에 30-60% 이어야 한다. 세포를 형질감염후 7-10 일에 수확하였고 4,000 rpm에서 회전하였고, 그 다음 0.45 μm 필터 (Millipore Sigma, Burlington, MA)를 사용하여 필터-멸균 (정화)하였고 -80℃에 냉동하였다.
해동된 정화 배양 배지를 MabSelect™ SuRe™ 단백질-A 컬럼 (GE Healthcare, Chicago, IL) 상에 로딩하였고 pH 7.2에서 10 컬럼 부피의 PBS 완충액으로 세정하였다. 항체를 pH 11에서 TRIS로 중성화된 항체가 들어있는 풀링된 분획과 pH 3.6에서 10 컬럼 부피의 시트레이트 완충액으로 용출하였다.
항체-함유 단백질-A 용출물을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 정제하였다. SEC의 경우, 샘플을 1mL/분의 유속으로 AKTA™ 정제 시스템 (GE Healthcare, Chicago, IL; Express, FPLC 또는 정화기 시스템)을 사용하여 Sephadex 200 HiLoad® 16/60 200 예비 등급 컬럼 (GE Healthcare, Chicago, IL) 상에 로딩하였다. pH 7.4에서 PBS 완충액을 1mL/분의 유속으로 사용하였다. 정제된 항체에 상응하는 분획을 SDS-PAGE 또는 모세관 전기영동 분석 (LabChip GX®; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA)에 기반하여 풀링하였고 필요한 경우 5-10mg/mL로 농축하였다. 이밖에도, 낮은 내독소가 다운스트림 분석론을 위한 요건이면, 시스템, 컬럼 및 수지를 (적용가능한 경우) 단백질 정제 전에 표준 프로토콜로 NaOH 용액을 사용하여 발열원물질 제거하였다.
2. 약물 접합
시스테인 조작된 변이체 및 대조군을 L-시스테인 캡, 글루타티온 캡, 또는 양쪽의 조합으로 시스테인 캡핑된 형태로 발현하였다. 샘플 이질성을 감소시키고 접합 효율을 증가시키기 위해, 모든 항체를 말레이미드 활성화된 약물-링커와 접합 전에 환원-산화 단계에 적용하였다. 대표적 절차를 아래 제공한다.
변이체 v28983 (표 2.2; MW 146301 Da 참조)의 5mg/mL 용액의 3 mg을 하기 계산 (표 A)에 기반된 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)의 존재 하에서 37℃ (수조)에 3 시간 동안 25 당량 몰 과량의 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP)으로 PBS, pH 7.4에서 환원하였다:
환원을 완료한 후, 과량 TCEP를 PBS, pH 7.4로 평형화된 5 mL 40 kD Zeba™ 회전 탈염 컬럼 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 제거하였다. 환원된 항체를 4℃에서 25 몰 과량 데하이드로아스코르브산 (DHAA) (Zeba™ 컬럼 정제에서 100% 회수 가정)으로 밤새 산화 (18 시간)에 적용하여 삽입된 시스테인을 환원된 (유리 티올) 형태로 유지하면서 쇄간 디술피드 결합을 재-형성하였다. DHAA의 첨가를 하기 계산 (표 B)에 기반하였다:
산화된 항체를 3개 상이한 약물 링커: MTvc화합물 1, MCvcPABC-MMAE 및 MCvcPAB-튜불리신 M에 대한 접합을 위하여 1 mg의 3개 분취량으로 나누었다. 3개 약물-링커의 구조를 도 1에 도시한다. 접합을 실온에서 5 몰 과량의 약물-링커로 인큐베이션에 의해 달성하였다. 약물-링커를 10 또는 20 mM DMSO 스톡으로서 제조하였고 하기 계산 (표 C)에 기반된 반응에 첨가하였다:
3. 시차 주사 열량계 (DSC)
시스테인 조작된 항체의 열적 안정성을 하기와 같이 DSC를 사용하여 측정하였다. PBS 중 어느 한쪽 0.2 mg/ml 또는 0.4 mg/mL의 농도에서 400 μL의 정제된 샘플을 MicroCal VP-모세관 DSC™ (GE Healthcare, Chicago, IL)로 DSC 분석에 사용하였다. 각 DSC 실행 시작 시, 기준선을 안정화하기 위해 5개 완충액 바탕 주사를 수행하였고, 완충액 주사를 참조하기 위하여 각 샘플 주사 전에 배치하였다. 각 샘플을 20에서 100℃까지 60℃/시간 속도로, 낮은 피드백, 8 초 필터, 5 분 preTstat, 및 70 psi 질소 압력을 사용해 스캐닝하였다. 생성된 온도기록도를 참조하고 Origin 7 소프트웨어 (OriginLab Corporation, Northampton, MA)를 사용하여 분석하였다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)
HIC 실행의 경우, TSK겔 부틸-NPR (2.5μm, 4.6 x 35mm) 컬럼 (TOSOH Bioscience GmbH, Griesheim, 독일)을 5 컬럼 부피의 완충액 A (1.5 M (NH4)2SO4, 25 mM PO4 3-, pH 6.95)으로 실온에서 평형화하였다. 전형적으로, 2-3 mg/mL 농도에서 20-30 ug의 샘플을 컬럼 상에서 95% 완충액 A 및 5% 완충액 B (75% 25 mM PO4 3- pH 6.95, 더하기 25% 이소프로판올)와 로딩하였고 15 분 동안 0.5 mL/분으로 하기 구배 (표 D)를 사용하여 실행하였다:
각 샘플의 경우, HIC 크로마토그램을 각 피크의 완전한, 기준선-대-기준선 통합, 이어서 합리적 분리를 보여주는 각 피크의 통합을 제공한 적절한 파라미터를 사용하여 통합하였다. 샘플 내에서 뚜렷한 DAR 종에 상응하는 피크를 식별하였다. DAR 0 피크는 네이키드 (환원된-산화된) 항체로 일관된 체류 시간을 나타냈다. 단일 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 ADC의 경우, 각 후속 피크는 DAR 1 및 DAR 2를 나타낸다.
HIC에 의한 DAR을 개별 DAR 종에 대하여 AUC에 기반하여 계산하였다 (0, 1 및 2):
계산된 DAR = (%AUCx0 + %AUCx1 + %AUCx2)/100
개별 ADC에 대하여 HIC 체류 시간 (HIC-RRT)을 하기와 같이 계산하였다:
HIC-RRT= 표적 DAR의 RT / DAR0의 RT
HIC-RRT 상에서 항체의 시스테인 캡핑의 효과를 최소화하기 위해, DAR0의 RT는 페이로드에 대한 접합 없이 환원된-산화된 항체의 체류 시간을 지칭한다. 각 변이체는 HIC-RRT 계산을 위하여 이의 자체 DAR0 RT를 갖는다.
5. 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
분석적 SEC 실행의 경우, Agilent Advance Bio SEC 컬럼 (300 Å, 2.7μm, 7.8x150mm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA; 시리얼 # 6377910-24)을 5 컬럼 부피의 완충액 A (150 mM NaxPO4, pH 6.95)로 실온에서 평형화하였다. 전형적으로, 20-30 ug의 샘플을 2-3 mg/mL 농도에서 컬럼에 로딩하였고 7 분 동안 1 mL/분에서 등용매 방식으로 실행하였고 280nm에서 흡광도를 보고하였다. 각 샘플의 경우, 크로마토그램을, 부분적으로 분해된 피크들 사이 합리적으로 배치된 분리와, 각 피크의 완전한, 기준선-대-기준선 통합을 제공하도록 통합하였다. IgG에 대하여 주요 구성요소에 상응하는 피크 (대략적 체류 시간 3.3 분)를 대조군 IgG1 항체, 트라스투주맙의 SEC 프로파일에 기반된 단량체로서 보고하였다. 용매 피크 (5.2 분 초과)를 제외하고, 3.3 분 전에 발생하는 임의의 피크를 HMWS로서, 그리고 3.3 분후 발생하는 임의의 피크를 LMWS로서 지정하였다.
6. 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)
LC-MS에 의한 DAR의 경우, ADC를 PBS, pH 7.4 중 1mg/mL로 희석하였고, 그 다음 탈글리코실화하였다. 탈글리코실화의 경우, 전형적으로 1ug EndoS를 매 10ug ADC에 사용하였고 반응 믹스를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 3uL 500mM TCEP를 각 10uL 샘플에 첨가하고 이어서 70℃에서 1 시간 동안 인큐베이션함으로써 환원하였다. 최종적으로, 샘플을 LC-MS 4중극 비행시간 (QTOF) 시스템 (Agilent 6545 QTOF에 연결된 Agilent 1290 HPLC; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) 상에서, 각 1uL 주사로 실행하였다. 상세된 절차를 아래 기재한다.
· 컬럼: PLRP-S 1000Å, 8uM, 50x2.1mm (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)
· 이동상 C: H2O 중 0.1% 포름산, 0.025% 트리플루오로아세트산 및 10% 이소프로필 알코올
· 이동상 D: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 및 10% 이소프로필 알코올
· 검출: 신호 A (280 nm, 4.0 대역 폭), 신호 B (220 nm, 4.0 대역 폭)
· 구배:
· 사후 실행 시간: 2 분
7. 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)
초기에, 모든 샘플을 1mg/mL로 희석한 다음 제조업체의 프로토콜 (단백질 익스프레스 검정 LabChip™; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA)을 따라 96-웰 PCR 플레이트에서 샘플을 제조하였다. 간략히, 2 uL ADC를 환원 제제로서 400 mM 디티오트레이톨 (DTT)의 존재 또는 부재 하에서 7 uL 단백질 익스프레스 완충액과 혼합하였고, 이어서 95℃에서 5 분 동안 열 변성하였다. 샘플을 그 다음 dH2O에 1:2 비로 희석한 다음 데이터를 획득하였다. 각 CE-SDS 실행후, 겔 및 상응하는 전기영동도를 LabChip™ 검토기 (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA)를 사용하여 분석하였다.
실시예 1: 인실리코 조작에 의한 잠재적 시스테인 삽입 부위의 식별
IgG1 중 추정 시스테인 삽입 부위의 식별을 하기 안내 기준에 따라 (PDB ID 1JPT, D3H44에서 유래된) 모델 Fab 및 (PDB ID 1E4K에서 유래된) 모델 Fc 분자에 대하여 명시적-용매 분자 동역학 (MD) 궤적에서 실시하였다:
· CDR의 배제
· 이차 구조의 회피
· 상대 용매 접근가능한 표면적 (SASA): rSASA > 30%
· 단백질 A 및 FcRn 결합 방해의 회피
위치를 그 다음 하기와 같이 rSASA 및 평균 제곱근 변동 (RMSF)에 따라 표지화하였다:
· 유형 1: 바람직한 rSASA (30-60%) 및 이동성 (평균 +1 표준 편차 (SD) 임계값 초과 RMSF)
· 유형 2:　바람직한 rSASA (30-60%) 그러나 정돈됨 (평균 +1SD 임계값 미만 RMSF)
· 유형 3: 노출됨 (rSASA >60%)　및 이동성 (평균 +1SD 임계값 초과 RMSF)
· 유형 4:　노출됨 (rSASA >60%)　그러나 정돈됨 (평균 +1SD 임계값 미만 RMSF)
위상 1에서 시스테인 삽입 부위 ("설계")를 구조-안내된, 절반-합리적 접근법에 기반하여 제안하였다. 추정 삽입 부위를 그들의 위험 (다른 알려진 리간드 및 디술피드 스크램블링으로 방해), 환경 (상기 기재된 대로 유형 1-4 표지) 그리고 구조적 영향 및 접합 안정성의 추정된 가능성에 기반하여 순위결정하였다. 총 13개 설계를 IgG1의 상이한 구조적 영역을 샘플링하였던 위상 I에서 제안하였다.
위상 2는 모델링된 삽입에 대하여 암시적-용매 분자 동역학 (MD) 궤적으로부터 계산된 파라미터에 기반된 변이체의 선택 및 각 개별 추정 시스테인 삽입에 대한 모델링 실험 실행하기를 포함하였다. 간략히, 관심의 각 루프 (n 잔기)를 제거하였고 RCSB PDB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics - Protein Data Bank)에서 증착된 구조로부터 n+1 루프를 앵커링 경계성 잔기로 최저 평균 제곱근 편차 (RMSD)에 기반하여 이의 위치에서 그라프팅하였다. 각 루프를 그 다음 돌연변이하여 각 관련한 위치에서 삽입된 시스테인 잔기와 원래 서열을 매칭하였다. 각 그라프팅된-루프 모델의 경우, 암시적-용매 MD 궤적을 계산하였고 설계를 아래 표 1.1에 기재된 파라미터 및 기준에 따라 순위결정하였다.
루프-그라프팅 알고리즘이 용액을 제공하는데 실패한 몇몇 사례의 경우, 그들 루프로부터 설계를 위상 1 설계에 대하여 기재된 방법론을 사용하여 선택하였다. 총체적으로 위상 1에서 13개 변이체 및 위상 2에서 19개 변이체인 32개 변이체 를 이 과정에 의해 생성하였다.
표 1.1: 순위결졍 설계를 위한 파라미터 및 기준
실시예 2: 초기 변이체의 시험관내 특성규명
실시예 1로부터 32개 변이체를, 표 2.1에 나타난 대조군과 함께, 일반 절차 1에 기재된 대로 클로닝 및 발현하였다. 2개 추가의 작제물, v27321 및 v27322를 또한 이 초기 특성규명에 포함하였다. 이들 2개 변이체는 각각, 위치 K149 전후 시스테인 삽입을 포함한다. 위치 K149에서 시스테인 치환을 이전에 기재하였다 (Vollmar, et al., 2017, Bioconjug Chem, 28(10):2538-2548).
실시예 전반에 걸쳐, 하기 명명법을 시스테인 삽입 돌연변이에 대하여 사용한다. 위치 넘버링은 Fab 영역 (VH, VL, CH1, 및 CL)의 경우 카밧이고 Fc 영역 (CH2 및 CH3)의 경우 EU이다. 모든 시스테인 삽입을 변형되지 않은 중쇄 (H) 또는 경쇄 (L) 이어서 ".5"를 참조하여 삽입 이전의 잔기에 기반하여 넘버링한다. 예를 들어, L_K149.5C는 경쇄에서 잔기 Lys 149 후에 삽입된 시스테인을 나타낸다.
각 항체를 그 다음 일반 절차 2에 기재된 대로 MTvc화합물 1 또는 MCvcPABC-MMAE에 접합하였다. 각 항체 및 ADC의 예비 시험관내 특성규명을 일반 절차 3-6에 기재된 대로 실행하였다. 변이체를 하기 기준에 기반하여 순위결정하였다:
· DSC: 다음으로서 정의된 친계 항체로부터 Tm 차이
o 변화 없음 (0 ℃ ≤ Tm 차이 ≤ 3 ℃)
o 작음 (3 ℃ < Tm 차이 ≤ 8 ℃)
o 큼 (Tm 차이 > 8 ℃) 높음
· CHO 세포에서 단일 500mL 형질감염으로부터 항체의 수율
· LC-MS에 의해 결정된 DAR (MS) 약물-항체 비
· HIC에 의해 결정된 DAR (HIC) 약물-항체 비
· DAR 0 종의 HIC 체류 시간으로 DAR 2 종의 HIC 체류 시간을 나눗셈함으로써 계산된 상대 체류 시간 (RRT D2/D0)
가장 유리한 특징을 보여준 10개 변이체를 추가 특성규명을 위하여 선택하였다. 이들 10개 변이체 및 5개 대조군의 예비 특성규명으로부터 결정된 특성을 표 2.2에 나타낸다.
MCvcPABC-MMAE 또는 MTvc화합물 1에 접합된 1개 변이체 (v29001 (H_T299.5C)) 및 대조군 변이체 (v29013 (H_S239.5C))에 대하여 HIC 프로파일의 예를 도 13 및 14, 각각에 도시한다. (접합되지 않은) 동일한 2개 변이체에 대하여 DSC 프로파일을 도 15에 도시한다.
대조군 변이체 v29013 (H_S239.5C)에 대하여 HIC 프로파일을 여러 종의 존재를 나타내는 여러 피크로 이루어진다고 볼 수 있는 반면 (도 13a 및 14a), 변이체 v29001 (H_T299.5C)에 대하여 HIC 프로파일은 단일 단량체성 피크 (도 13b 및 14b)를 보여준다. 도 14는 또한 변이체 v29001로 생성된 MTvc화합물 1 접합체가 대조군 변이체 v29013으로 생성된 MTvc화합물 1 접합체보다 덜 소수성 (더 낮은 HIC-RRT)으로 나타남을 보여준다. 도 15의 DSC 프로파일은 더 현저한 불안정화가 변이체 v29001 (CH2 도메인에 대하여 65℃의 Tm)보다 대조군 변이체 v29013 (CH2 도메인에 대하여 62℃의 Tm)에 대하여 관찰되었음을 보여준다. 양쪽 이들 변이체의 경우 CH3 도메인에 대하여 Tm은 매우 유사하여, 시스테인 삽입이 이 도메인의 안정성에 효과 없음을 확인하였다.
실시예 3: 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 항체-약물 접합체의 제조
대조군들 중 2개, v22758 (H_A114C) 및 v29013 (H_S239.5C)과 함께 표 2.2에 나타난 10개 변이체의 각각을 일반 절차 2를 따라 3개 상이한 약물-링커 (MTvc화합물 1, MCvcPABC-MMAE 및 MCvcPAB-튜불리신 M; 도 1 참조)에 접합하였다.
생성된 36개 ADC를 실시예 4-8에 기재된 대로 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 크기-배제 크로마토그래피 (SEC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS), 모세관 전기영동 SDA (CE-SDS) 및 세포내 결합 검정을 특징으로 하였다.
실시예 4: 시험관내 특성규명 - 소수성 상호작용 크로마토그래피
실시예 3으로부터 ADC를 일반 절차 4에 기재된 대로 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 특징으로 하였다. HIC는 그들의 고유한 소수성에 기반하여 상이한 단백질의 분리를 허용하고 이것이 비-변성 방법이기 때문에, HIC는 주어진 ADC에 의해 포함된 상이한 DAR 종의 분리를 허용한다. HIC는 또한 그들의 상대 체류 시간 (RRT)에 기반하여 ADC를 순위결정하는 유용한 기법이다. 소수성 ADC가 생체내 순환으로부터 더욱 빨리 청소할 수 있음에 따라, HIC-RRT 값은 가장 유용한 시스테인 삽입 부위를 식별하기 위한 잠재적으로 귀중한 생물물리학적 파라미터이다.
HIC를 MTvc화합물 1, MCvcPABC-MMAE 및 MCvcPAB-튜불리신 M에 접합된 모든 ADC에 대하여 DAR, 그리고 MTvc화합물 1 및 MCvcPABC-MMAE에 접합된 모든 ADC에 대하여 HIC-RRT를 결정하는데 이용하였다. 결과를 표 4.1 및 4.2에 나타낸다.
전반적으로, 모든 ADC는 1.4 내지 2.0 사이 DAR 범위를 보여주었다. 1개 변이체, v29001은, 3개 약물-링커의 각각에 접합된 때 각 경우에 DAR 2.0의 완전한 로딩으로 HIC 상에서 단일 피크를 보여주었다. 변이체 v22768은 각 약물-링커로 단지 1.4-1.5인, 최저 약물 로딩을 보여주었다. 접합 효율은 티올 pKa, SASA 및 삽입된 시스테인의 국소 환경의 영향으로 인해 부위-의존적인 것으로 예상되었고 이것을 DAR 값에서 반영하였다 (표 4.1).
약물-링커 MTvc화합물 1은 비교적 친수성이다. 이 약물-링커의 부위-특이적 시스테인 삽입 변이체 중 임의의 것에의 접합은 HIC 체류 시간에 관해 최소 효과를 가졌다. MTvc화합물 1에 접합된 변이체의 대부분의 경우, HIC-RRT 값은 1.15 미만이었고, 이는 동일한 약물-링커에 접합된 대조군 v22758 ADC에 대하여 또한 관찰된 HIC-RRT 값이었다. MTvc화합물 1에 접합된 2개 변이체, v22768 및 v28993은 동일한 약물-링커에 접합된 대조군 v22758보다 약간 더 높은 HIC-RRT 값을 보여주었다: 1.18 및 1.19, 각각. MTvc화합물 1에 접합된 변이체 v29001은 동일한 약물-링커에 접합된 양쪽 대조군 (v22758 및 v29013)보다 덜 소수성인 것으로 보였다.
약물-링커 MCvcPABC-MMAE는 MTvc화합물 1보다 더욱 소수성이고 그러므로 MCvcPABC-MMAE를 포함하는 모든 ADC에 대하여 HIC-RRT 값은 각각의 MTvc화합물 1 접합체보다 더 높았다. 전반적으로, 유사한 경향을 MCvc화합물 1 접합체에 대하여 관찰된 것처럼 MCvcPABC-MMAE 접합체에 대하여 관찰하였다: MCvcPABC-MMAE에 접합된 v28993은 최고 HIC-RRT 값을 보여주었고, MCvcPABC-MMAE에 접합된 v29001은 최저 HIC-RRT 값 (1.05)을 보여주었다. 1개 변이체, MCvcPABC-MMAE에 접합된 v27321, 뿐만 아니라 동일한 약물-링커에 접합된 대조군 v29013의 경우, HIC-RRT 값을 이들 2개 ADC의 각각에 대하여 HIC 프로파일의 불량한 분해로 인해 결정할 수 없었다.
실시예 5: 시험관내 특성규명 - 크기 배제 크로마토그래피
실시예 3으로부터 ADC는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 추가로 특징으로 하였다. SEC는 단백질의 크기를 추정하는데 그리고 단백질 제조물에서 응집/고 분자량 종 (HMWS) 및 단편화/저 분자량 종 (LMWS)의 존재를 결정하는데 유용한 기법이다.
ADC의 제조 동안, 삽입된 시스테인 잔기를 통해서 디술피드 결합 형성에서 비롯하는 임의의 부적절한 산화는 연쇄체 및 다른 HMWS의 형성을 초래할 수 있다. 상이한 종의 분자량 및 상대 존재비를 조사하기 위해, ADC의 각각을 일반 절차 5에 기재된 대로 SEC에 의해 분석하였다.
결과를 표 5.1에 나타낸다.
표 5.1로부터 볼 수 있는 바와 같이, 모든 ADC 제조물은 HPLC-SEC에 의해 >90% 단량체를 함유하였다. 일반적으로, 약물-링커 MTvc화합물 1을 포함하는 ADC는 변이체 v22768을 제외하고 최고 단량체 함량을 보여주었고, 이는 MTvc화합물 1 접합체에 대하여 최고 HMWS 함량 (6%) 및 최저 단량체 함량 (94%)을 보여주었다. MTvc화합물 1에 접합된 대조군 ADC, v22758 (A114C)은 95%의 단량체 함량을 보여주었다.
MCvcPABC-MMAE 약물-링커를 포함하는 ADC는, HMWS 및 LMWS의 적은 양과, 97% 내지 99%의 단량체 범위로, MTvc화합물 1을 포함하는 것들과 유사한 경향을 보여주었다.
대조적으로, MCvcPAB-튜불리신 M 약물-링커를 포함하는 ADC는 다른 2개 약물-링커들 중 어느 한쪽을 포함하는 ADC보다 더 적은 단량체 함량을 보여주었다. ADC, v29001-MCvcPAB-튜불리신 M은 테스트된 모든 ADC의 최저 단량체 함량 (92%) 및 최고 LMWS 함량 (7%)을 보여주었다.
실시예 6: 시험관내 특성규명 - 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)
실시예 3으로부터 ADC는 일반 절차 6에 기재된 대로 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)을 추가로 특징으로 하였다.
LC-MS는 ADC의 약물 로드 분포 및 약물-항체 비 (DAR)를 측정하기 위한 표준 분석적 방법이다. 온전한 ADC 수준에서 LC-MS 기반된 DAR 측정을 위한 일반 절차는 질량 스펙트럼을 일련의 "제로-전하" 질량으로 디컨볼루션하고, 그 다음 DAR 분포를 수득하거나 스펙트럼 피크 영역 또는 피크 강도를 통합하고 가중함으로써 평균 DAR을 컴퓨팅하는 것을 포함한다.
실시예 3으로부터 ADC의 분석의 경우, ADC를 EndoS로 치료에 의한 LC-MS 분석 전에 탈글리코실화하였고, 이는 환원 말단 N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc) 및 푸코스 (Fuc)와 별도로 모든 부착된 탄수화물 모이어티를 제거하였다. ADC의 일부를 또한, 중쇄의 위치 236G-G237에서 힌지 시스테인 후에 직접적으로 절단하는 프로테아제인, IdeS로 치료하였다. IdeS-치료 샘플의 환원은 3개 상이한 종: Fc/2, Fd 및 LC를 산출하였다. IdeS-치료 샘플에 대하여 MS에 의한 DAR 결정은 추가로 DAR 측정 정확도를 개선하였고 ADC의 보충 구조적 정보를 제공하였다.
ADC의 각각에 대하여 LC-MS에 의해 결정된 경우에 평균 DAR을 표 6.1에 나타낸다.
표 6.1에 나타난 대로, LC-MS에 의해 결정된 경우에 ADC에 대하여 DAR은 1.7 내지 2.0 범위이어서, 모든 3개 약물-링커가 유사한 접합 효율을 가졌음을 나타냈다. 검출가능한 접합을 힌지 또는 쇄간 디술피드 시스테인 잔기에 대하여 관찰하지 못했다.
전반적으로, LC-MS에 의해 결정된 DAR은 HIC에 의해 수득된 DAR과 잘 상관관계가 있었다 (표 4.1 참조). 예를 들어, 변이체 v29001은 3개 약물-링커의 각각에 접합된 때 양쪽 LC-MS 및 HIC 측정에 의해 DAR 2를 보여주었다. MCvcPABC-MMAE에 접합된 변이체 v27321 및 v29013의 경우, DAR의 계산은 관련한 피크의 불량한 분리로 인해 HIC에 의해 성공적이지 않았다. 하지만, 이들 2개 ADC에 대하여 DAR을 LC-MS (DAR 1.8 및 2.0, 각각)에 의해 성공적으로 결정하였다.
실시예 7: 시험관내 특성규명 - 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)
실시예 3으로부터 ADC의 각각을 샘플의 순도를 평가하기 위해 일반 절차 7에 기재된 대로 환원 및 비-환원 조건 하에서 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)에 의해 평가하였다.
환원 조건 하에서, ADC 항체에서 쇄간 디술피드 결합을 환원하여, 그들의 분자량에서 차이에 의해 분리될 수 있는, 상응하는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 산출한다. 대조적으로, 비-환원 조건 하에서, 항체는 온전하게 남아있고 임의의 부분적 항체 또는 항체 단편, 뿐만 아니라 임의의 연쇄체로부터 분리할 수 있다. 온전한 전장 IgG1 (2H-2L)은 대략 150 kDa의 최고 분자량을 갖고, 이어서 2H-L, HH, HL, H, L 단편은 대략 125, 100, 75, 50 및 25 kDa, 각각의 분자량을 가진다. ADC의 제조 동안 항체의 불완전한 또는 부분적 산화는 샘플에서 이들 LMWS의 일부 또는 전부의 존재를 초래할 것인 반면, 과-산화는 시스테인-시스테인 연쇄된 올리고머성 HMWS를 초래할 것이다.
결과를 도 2에 나타낸다. 접합되지 않은 대조군 (v17427)을 포함하는, 온전한 비-환원된 ADC가 계산된 150 kDa보다 (도 2(A)에 도시된 대로) ~160 kDa의 MW를 보여주었음을 주목한다. 이 불일치는 어느 한쪽 펩타이드 결합 상의 LabChip™ 프로토콜에서 사용된 결합 염료의 영향 또는 기구사용의 고유한 정확도 제한 (±20 % 크기 정확도, 제조업체의 프로토콜에 기반) 때문일 것 같다. 유사하게, 접합되지 않은 대조군 (v17427)을 포함하는, 모든 환원된 샘플은 LC의 경우 ~28 kDa 및 HC의 경우 ~64 kDa의 MW를 보여주었고, 양쪽은 ~23 kDa 및 50 kDa, 각각의 계산된 값보다 약간 더 높았다 (도 2(B) 참조).
접합되지 않은 대조군 (v17427)에 대해 도 2에 도시된 모든 36개 ADC 비교하기는 접합 프로토콜에서 환원-산화 단계가 성공적이었음 그리고 각 항체가 약물-링커에의 접합 전에 원래 전장 입체형태로 재-폴딩하였음을 나타낸다.
실시예 8: 유세포 분석법에 의한 세포내 항원 결합 검정
양쪽 네이키드 항체로서 및 접합체로서, 그들의 표적 c-Met에 대하여 실시예 3으로부터 ADC의 겉보기 결합 친화도를 아래 기재된 대로 유세포 분석법에 의해 평가하였고 대조군 접합되지 않은 친계 항체 (v17427)의 결합 친화도와 비교하였다.
고 c-Met-발현 세포주 EBC-1 (4 백만 수용체/세포) (XenoTech, LLC, Lenexa, KS)로부터의 세포를 최소 100 uL 시딩 부피로 25,000개 세포/웰로 시딩하였다. 간략히, 부착성 EBC-1 세포를 세포 해리 완충액을 사용하여 그들의 배양 용기로부터 탈착하였고 96-웰 플레이트에 25,000개 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 빙상에서 10 분 동안 유지하였고, 400g x 3 분으로 원심분리에 의해 펠렛화하였고 반전된 플레이트를 가볍게 침으로써 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 빙상에서 유지하였다. 시험품을 냉 FACS 완충액에 적정하였고 세포를 지정된 치료의 웰당 50uL로 치료하였고; 검정 플레이트를 파라필름 처리하였고 밤새 4℃에 인큐베이션하였다. 세포를 그 다음 세정하였고, 이차 A647-염소 항-인간 Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)와 2 ug/mL로 인큐베이션하였고, 재차 세정하였다. 세포를 25uL FACS 완충액에 재현탁하였고 BD LSRFortessa™ (X-20) 고-처리량 샘플러 (HTS) (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 수득된 GeoMean 값을 그 다음 Prism 8 소프트웨어 (GraphPad Prism Software)를 사용하여 특이적 결합을 플롯팅하는데 사용하였고 KD 및 Bmax 값을 계산하는데 사용하였다.
이 실시예에서, 실시예 3으로부터 모든 10개 시스테인 삽입 변이체 및 양쪽 대조군을 네이키드 항체로서 그리고 MTvc화합물 1 약물-링커를 포함하는 상응하는 ADC로서 평가하였다. 양쪽 대조군 그리고 어느 한쪽 경쇄 또는 중쇄 시스테인 삽입을 함유하는 2개 선택된 시스테인 삽입 변이체 (변이체 v27321 및 v22765, 각각)를 MCvcPABC-MMAE 약물-링커를 포함하는 ADC로서 또한 테스트하였다. 이밖에도, 대조군 v22758 (A114C) 및 2개 선택된 시스테인 삽입 변이체, v27321 및 v22765는 MCvcPAB-튜불리신 M 약물-링커를 포함하는 ADC로서 테스트하였다.
결과를 표 8.1에 나타낸다.
전반적으로, 시스테인 삽입 변이체는 친계 (v17427) 네이키드 항체 및 v17427-MTvc화합물 1 ADC에 비교가능한 결합을 표시하였다. 변이체 v29001 및 이의 MTvc화합물 1 접합체는, 하지만, 대조군 v17427과 비교하여 더 낮은 결합 (더 큰 Kd, 5-배)을 표시하였다.
모든 ADC는 일반적으로 그들의 네이키드 항체 상대방에 매우 유사한 결합을 표시하였다. 시스테인 삽입 변이체 v29001 및 대조군 v22758의 MTvc화합물 1 ADC는 그들의 각각의 네이키드 항체 상대방보다 약간 더 낮은 Bmax를 표시하였다.
대조군 v29013 (S239.5)은, 양쪽 네이키드 항체로서 그리고 어느 한쪽 약물-링커를 가진 ADC로서, 친계 항체 (v17427)와 비교하여 더 낮은 Bmax 값을 표시하였다.
전반적으로, 이 실시예는, 변이체 v29001을 제외하고, 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 ADC가 그들의 네이키드 항체 상대방과 비교하여 차등적 결합 없음을 보여주었고, 또한 친계 항체에 비교가능한 결합을 보여주었음을 입증한다. 변이체 v29001을 포함하는 ADC에 의해 나타난 결합은, 하지만, 대조군 v22758 및 v29013을 포함하는 상응하는 ADC의 것과 유사한 범위 내에 여전히 있었다.
실시예 9: 시험관내 세포독성
어느 한쪽 MCvcPABC-MMAE 또는 MTvc화합물 1을 포함하는 실시예 3으로부터 ADC의 세포독성을 아래 기재된 대로 표적 표면 항원 (c-Met)을 발현하는 다양한 종양 세포주에 대해 시험관내 테스트하였다. 하기 세포주를 사용하였다 (표 9.1).
표 9.1에 나타난 세포주의 각각을 검정 일까지 각각의 완전 성장 배지에서 성장시켰다. 트립신-EDTA를 사용하여 배양 용기로부터 제거후, 세포를 Scepter™ 세포 계수기 (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON)를 사용하여 계수하였다. 세포를 완전 성장 배지에 20,000 세포/mL까지 희석하여서, 달리 특정되지 않는 한, 384-웰 플레이트내 50 uL/웰이 1,000 세포/웰이 되도록 하였다. 모든 ADC를 완전 성장 배지 (RPMI 1640)내 15 nM 시작 농도로 희석하였고 이어서 멸균 96-웰 희석 플레이트 (최종 부피 200 uL/웰)에 1:3 희석하였다. 샘플 (20 uL/웰)을 이중으로 384-웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트에는 그 다음, 달리 특정되지 않는 한, 테스트 세포주 (50 uL/웰)의 20,000 세포/mL 현탁액을 씨딩하였다. 세포를 실온에서 5-10 분 동안 방치하고 이어서 37℃/5% CO2에서 4일 밤 동안 인큐베이션함으로써 웰들의 바닥에 침강시켰다. 인큐베이션후, 세포 생존력을 10 uL/웰로 1x CellTiter-Glo® 시약 (Promega Corporation, Madison, WI)을 첨가함으로써 정량화하였다. 암실에서 30 분 동안 인큐베이션하기 후, 발광을 Synergy™ H1 하이브리드 다중-모드 판독기 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT)를 사용하여 측정하였다. 데이터를 Prism 7 소프트웨어 (GraphPad Prism Software)를 사용하여 분석하였다.
결과를 표 9.2에 나타낸다.
표 9.2: C-Met 발현 종양 세포주에서 ADC에 대한 EC50 값1
예상된 대로, MTvc화합물 1을 포함하는 ADC는 더 낮은 c-Met 발현 세포주에서 활성과 비교하여 고 c-Met 발현 세포-주, EBC-1에서 가장 큰 효력을 보여주었다. HIC-정제된 DAR 2 야생형 대조군 (v17427-MTvc화합물 1)을 포함하여, 이 약물-링커를 포함하는 모든 ADC는 EBC-1 세포주에서 0.02-0.04 nM 범위에 EC50을 보여주었다. 저 c-Met 발현 BT-20 세포주에서, 더 높은 효력을 확률적 접합보다 부위-특이적 접합의 중요성을 표명하는 야생형 대조군 (v17427-MTvc화합물 1 DAR 2 분획) (EC50 0.15 nM)보다 시스테인 삽입 변이체 v28993 (EC50 0.11 nM), v29001 (EC50 0.12 nM), v28983 (EC50 0.12 nM), v28989 (EC50 0.13 nM), v22765 (EC50 0.14 nM) 및 v27321 (EC50 0.14 nM)에 대하여 관찰하였다. MTvc화합물 1 약물-링커를 포함하는 모든 ADC는 중 c-Met 발현 H292 세포주에서 EC50 >15 nM을 보여주었다. 중 c-Met 발현 HCC827 세포주의 경우, MTvc화합물 1에 접합된 시스테인 삽입 변이체는 0.24-0.71 nM 범위에 EC50 값을 보여주었다. 대조군 ADC, MTvc화합물 1에 접합된 v29013 (S239.5)은 이 세포주에서 최고 시험관내 효력 (EC50 0.16 nM)을 보여주었다.
MCvcPABC-MMAE를 포함하는 ADC의 경우, 대조군 v29013 (S239.5)은 고 c-Met 발현 세포주, EBC-1 (EC50 0.04 nM)에서 최고 효력을 보여주었다. MCvcPABC-MMAE에 접합된 모든 10개 시스테인 삽입 변이체는 EC50 0.05-0.09 nM 범위에서 효력을 보여주었다. 저 c-Met 발현 BT-20 세포주에서, MCvcPABC-MMAE (EC50 1.27 nM)에 접합된 v29003 (S239.5)인, 대조군보다 MCvcPABC-MMAE에 접합된 시스테인 삽입 변이체 v22761 (EC50 0.59 nM), v29001 (EC50 0.64 nM), v28983 (EC50 0.64 nM) 및 v27322 (EC50 1.03 nM)에 대하여 더 높은 효력을 관찰하였다. MCvcPABC-MMAE 약물-링커를 포함하는 모든 ADC는 중 c-Met 발현 세포주 H292 및 HCC827에서 EC50 값 >15 nM을 보여주었다.
전반적으로, 이 실시예는 시스테인 삽입 변이체를 포함하는 ADC의 효력이 개별 시스테인 삽입 부위의 위치에 의해 영향받는 것으로 보이지 않음을 입증한다.
실시예 10: 마우스 혈장내 항체 약물 접합체의 안정성
효소적 대사 및 레트로-마이클 반응을 포함하는 여러 이유로, ADC는 생체내 순환하면서 이의 페이로드를 손실할 수 있거나 ADC를 비효율적으로 만드는 방식으로 페이로드를 수정할 수 있다. 실시예 3으로부터 ADC를 아래 기재된 대로 마우스 혈장 안정성 검정에서 평가하여 페이로드 (약물-링커)의 손실을 결정하였다.
ADC를 마우스 혈장에서 0.5 mg/mL로 희석하였고, 각각에 대한 약물 손실을 평가하기 전에, 0, 1, 3 및 7 일 동안 37℃에 수조에서 인큐베이션하였다. 샘플을 표시된 시점에 수조로부터 제거하였고 -80℃에 즉시 냉동하였다. 24시간 이내 시점을 MCvcPAB-튜불리신 M 약물-링커를 포함하는 ADC에 대하여 별도로 준비하였다. ADC 및 항체를 면역침전에 의해 회수하였다. 샘플을 실온 (RT)에서 1 시간 동안 250 ng의 EndoS 효소 (50 uL PBS 중 2 ug ADC)로 먼저 탈글리코실화하였다. 탈글리코실화된 ADC를 그 다음 RT에서 1.5 시간 동안 샘플당 100 uL 자기 비드 슬러리당 15 ug 포착 항체인, 비오틴화된 염소 항-인간 IgG F(ab')2 포착 항체 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)에 사전-커플링된 스트렙타비딘 자기 비드 (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL) 상에 포착하였다. ADC 포착 이후, 샘플을 RT에서 1 시간 동안 100 uL의 샘플당 25 mM DTT (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)로 환원하였고, 그 다음 RT에서 1 시간 동안 20 uL의 용출 완충액 (20% 아세토니트릴, 1% 포름산, dH2O 중)에서 용출하였다. 2.0 ug에서 마우스 혈장에 스파이킹된 대조군 ADC (v22758)를 대조군으로서 포함하여 면역침전 절차를 검증하였다. 각 샘플에 대한 DAR을 약물-링커 손실의 양을 결정하기 위해 일반 절차 6에 기재된 대로 LC-MS에 의해 평가하였다.
약물-링커의 잠재적 손실 이외에, 링커에서 말레이미드 고리는 수-매개 개환을 잠재적으로 경험할 수 있고, 이는 차례로 ADC를 안정화시킨다. 말레이미드 개환은 ADC 질량에서 18 Da의 증가를 초래할 것이다. 모든 샘플에 대하여, 말레이미드 개환의 양을 약물-링커 손실 이외에 계산하였다.
튜불리신 M은 순환 동안 아세틸기의 손실을 통해 대사하기 쉽다. 이 유형의 분해가 시스테인 삽입 변이체 ADC에서 발생하는지 이해하기는 각각의 시스테인 삽입 부위의 안정성/노출/접근성에 관하여 추가의 정보를 제공한다. 시스테인 삽입 부위의 임의의 것이 아세틸 손실로부터 튜불리신 M 페이로드를 보호하는데 돕는지를 평가하기 위해, 혈장 안정성을 모니터링하였고 대조군 v22758 (Thiomab HC-A114C) 및 v29013 (S239.5)을 포함하는 ADC에 대해 비교하였다. 일반적으로, (개환된 및 비-개환된) 아세틸기 질량을 손실한 모든 약물-로딩된 종을 모든 약물-로딩된 종의 합계로 나눈 분율로서 튜불리신 M ADC에 대한 % 분해를 계산하였다.
안정성 연구의 결과를 도 3, 4 및 5에 도시한다.
도 3에서 볼 수 있는 대로, 약물-링커 MTvc화합물 1을 포함하는 ADC의 경우, DAR 손실은 대부분의 변이체에 걸쳐서 유사하였고, 가장 큰 축소가 처음 24 시간에서 발생하였고 7 일째까지 최종 DAR ~1.6에 도달하였다. 변이체 v27322, v29001 및 대조군 v29013을 포함하는 ADC의 경우, DAR 손실은 전체 인큐베이션 기간 동안 거의 무시할 수 있었다. 대부분의 변이체에 대하여 말레이미드 개환은 0-20%에서 시작하였고 진행하여 7 일까지 완전히 개환하였다. 변이체 v22765 및 대조군 v29013을 포함하는 ADC는 7 일째까지 단지 ~70% 개환에 도달하였다.
도 4는 약물-링커 MCvcPABC-MMAE를 포함하는 ADC의 경우, DAR 손실이 인큐베이션 기간 동안 대부분의 변이체에 대하여 ~10%이었음을 도시한다. 가장 덜 안정한 ADC는 7 일 동안 50% DAR을 손실한, 변이체 v22760 및 v22768을 포함하는 것들이었다. MCvcPABC-MMAE ADC의 경우, 개환 및 DAR 손실은 완전히 상관관계가 없었다: 변이체 v22760 및 v22768을 포함하는 ADC는 ~70% 개환을 보여주었지만 최고 DAR 손실을 또한 보여주었다. 가장 안정한 ADC는 대조군 v29013 및 v22758을 포함하는 것들, 그리고 시스테인 삽입 변이체 v22761, v22765, v27321 및 v27322를 포함하는 것들이었고, 이들 모두는 <10% DAR 손실을 보여주었다.
도 5는 약물-링커 MCvcPAB-튜불리신 M을 포함하는 ADC 중에, 변이체 v22761, v27321, v27322, 및 대조군 v22758을 포함하는 것들이, 24시간에 >70% 분해 및 7 일째까지 100%로, 신속 튜불리신 M 분해를 표시하였음을 보여준다. 변이체 v22761 및 v27321을 포함하는 ADC에서 DAR 손실의 대부분은 이 분해 때문이었다. 가장 안정한 MCvcPAB-튜불리신 M ADC는 7 일 동안 단지 ~20% 분해, 중간정도 개환, 및 매우 적은 DAR 손실을 표시하였던 변이체 v29001을 포함하였다. 이 ADC에서 분해는 대조군 v29013-MCvcPAB-튜불리신 M ADC에 의해 표시된 분해의 양보다 5% 적었다.
실시예 11: DAR-조율된 항체 약물 접합체의 제조
이전 실시예에서 기재된 ADC는, 어느 한쪽 양쪽 중쇄 (1xcys HC) 또는 양쪽 경쇄 (1xcys LC) 상에서 동일한 시스테인 삽입이 있는, ~2의 평균 DAR을 가졌다. 이 실시예에서, 시스테인 삽입을 아래 기재된 대로 1, 2 또는 3의 평균 DAR을 갖는 ADC의 생성을 허용하는 항체당 2개보다 많거나 적은 시스테인 잔기 삽입이 있는 작제물을 생성하기 위해 잠재적 조합에 대하여 평가하였다.
항체 분자당 1개 삽입 (1xcys Ab)을 함유하는 작제물을 중쇄의 헤테로이량체성 조립에 의해 생성하였다. 이들 작제물은 임의의 삽입 없이 1개 중쇄 및 단일 삽입된 시스테인 잔기 (1xcys HC)가 있는 1개 중쇄를 함유하였다.
항체 분자당 3개 삽입 (3xcys Ab)을 함유하는 작제물을 중쇄의 헤테로이량체성 조립에 의해 생성하였다. 이것을 어느 한쪽 각 단일 시스테인 삽입을 갖는 2개 경쇄 (1xcys LC)를 단일 시스테인 삽입을 갖는 1개 중쇄 (1xcys HC) 및 임의의 삽입 없이 1개 중쇄와 조합함으로써, 또는 단일 시스테인 삽입을 갖는 1개 중쇄 (1xcys HC)를 2개 시스테인 삽입을 갖는 1개 중쇄 (2xcys HC)와 조합함으로써 달성하였다.
상세를 표 11.1에 제공한다.
이밖에도, 항체 분자 당 4개 삽입된 시스테인 (4xCys Ab)을 가진 작제물을 2개 상이한 세트의 삽입 설계를 조합함으로써 - 어느 한쪽 각 단일 시스테인 삽입을 갖는 2개 경쇄 (1xCys LC)를 각 단일 시스테인 삽입을 갖는 2개 중쇄 (1xCys HC)와 조합함으로써, 또는 각 2개 시스테인 삽입을 갖는 2개 중쇄 (2xCys HC) 또는 각 2개 시스테인 삽입을 갖는 2개 경쇄 (2xCys LC)를 조합함으로써 창출할 수 있다.
항체를 일반 절차 1에 기재된 대로 제조하였고, ADC v34293을 생산하기 위해 DAR2에서 라이신 잔기에 NHS-에스테르 활성화된 화합물 1에 확률적으로 접합된 v17427을 제외하고 각 항체를 일반 절차 2에 기재된 대로 MTvc화합물 1에 접합하였다.
HIC, UPLC-SEC, LC-MS 및 CE-SDS에 의해 각 생성된 "DAR-조율된" ADC의 시험관내 특성규명을 일반 절차 4-7에 기재된 대로 실행하였다. 결과를 표 11.2에 나타낸다.
표 11.2로부터 볼 수 있는 대로, 모든 변이체를 LC-MS에 의해 결정된 경우에 그들의 각각의 표적 DAR에서 MTvc화합물 1에 성공적으로 접합하였다. 각 ADC에 대하여 HIC-RRT 값은 DAR 2 MTvc화합물 1 ADC에 대하여 추정된 값과 양호하게 상관관계가 있었다 (실시예 4 및 6 참조). UPLC-SEC 프로파일은 DAR-조율된 ADC의 각각에 대하여 >90% 단량체를 보여주었다.
CE-SDS는 모든 DAR-조율된 ADC가 미미한 양의 비-특이적 접합이 있는 전체-크기조정된 항체로서 주로 나타났음을 보여주었다.
실시예 12: 세포내 결합 검정 - DAR-조율된 ADC
세포 결합에 의한 실시예 11로부터 ADC의 시험관내 특성규명을 cMet-발현 세포주 EBC-1, H292 및 BT-20 상에서 실시예 8에 기재된 대로 평가하였다. ADC v34281 (DAR 3)을 EBC-1 및 H292 세포주에서만 테스트하였다. DAR 2 (확률적, 리신 접합)에서 약물-링커 ADvc화합물 1 또는 DAR 4 (확률적, 시스테인 접합)에서 MTvc화합물 1에 접합된 친계 항체 (v17427)를 추가의 대조군으로서 포함하였다.
결과를 표 12.1에 나타낸다. 예상된 대로, 모든 DAR-조율된 ADC는 DAR에 관계없이 접합되지 않은 친계 항체 (v17427)에 유사한 표적 결합을 보여주었다.
실시예 13: 시험관내 세포독성 - DAR-조율된 ADC
실시예 11로부터 ADC의 시험관내 세포독성을 실시예 9에 기재된 대로 평가하였다. DAR 4 (확률적, 시스테인 접합)에서 약물-링커 MTvc화합물 1에 접합된 친계 항체 (v17427)를 추가의 대조군으로서 포함하였다.
결과를 도 6 및 표 13.1에 나타낸다. 일반적으로, DAR 3 ADC의 세포독성은 DAR 2 및 DAR 1 ADC의 것보다 더 컸다. DAR 1 ADC들 사이, 유의미한 차이를 세포독성에서 관찰하지 못했다.
전반적으로, 결과는 DAR-조율된 ADC가 c-Met 발현 세포-주 EBC-1 및 HT-29에 대해 모두 활성이었음을 보여준다. 이들 ADC의 시험관내 효력은 DAR 값 (즉 접합된 독소의 수)과 양호하게 상관관계가 있었다.
실시예 14: 생체내 항-종양 활성
실시예 11로부터 ADC의 선택을 고 c-Met 발현 비-작은 세포 폐암 이종이식 모델 H1975에서 그리고 중 c-Met 발현 결장직장암 이종이식 모델 HT-29에서 생체내 항-종양 활성에 대하여 평가하였다. 대조군 ADC v17427-MCvcPABC-MMAE (DAR4), v17427-MTvc-화합물 1 (DAR4) 및 v17427-ADvc-화합물 1 (DAR2)의 활성을 비교를 위하여 평가하였다.
HT-29 모델의 경우, 종양 세포 현탁액 (0.1 ml PBS 중 3 x106 세포)을 balb/c 누드 마우스에 피하로 이식하였다. 평균 종양 부피가 ~160 mm3에 도달한 때, 동물을 그룹으로 무작위로 할당하였고 (그룹당 n=8) 표 14.1에 나타낸 대로 시험품의 단일 IV 용량으로 치료하였다. 상이한 DAR에서 ADC의 용량 수준을 독소에 몰 매칭하였다. 종양 부피 및 체중을 32 일의 연구 지속기간으로 매주 2회 측정하였다.
H1975 모델의 경우, 종양 세포 현탁액 (0.1 ml PBS 중 5 x106 세포)을 balb/c 누드 마우스에 피하로 이식하였다. 평균 종양 부피가 ~150 mm3에 도달한 때, 동물을 그룹으로 무작위로 할당하였고 (그룹당 n=8) 표 14.1에 나타낸 대로 시험품의 단일 IV 용량으로 치료하였다. 종양 부피 및 체중을 38 일의 연구 지속기간으로 매주 2회 측정하였다.
결과를 도 7 및 도 8에 도시한다.
HT-29 모델에서, 모든 부위-특이적 및 확률적 접합된 DAR2, DAR3 및 DAR4 화합물 1 ADC는 6, 4 및 3 mg/kg 각각의 독소-매칭 항체 용량에서 비히클과 비교하여 종양 성장을 유의미하게 억제하였다 (p <0.05, 종양 성장률에 대한 혼합된 효과 모델) (도 7b). DAR1 화합물 1 ADC는 12 mg/kg의 독소-매칭 용량에서 종양 성장을 억제하지 못했다 (도 7b). 모든 부위-특이적 및 확률적 접합된 DAR2, DAR3 및 DAR4 화합물 1 ADC는, v28983-MTvc-화합물 1을 제외하고, 3, 2 및 1.5 mg/kg 각각의 독소-매칭 항체 용량에서 비히클과 비교하여 종양 성장을 또한 유의미하게 억제하였다 (도 7a). 비교로, v17427-MCvcPABC-MMAE는 테스트된 1.5 mg/kg 용량에서 종양 성장을 유의미하게 억제하지 못했다 (도 7a). 항체 용량이 독소-매칭된 때, 항-종양 활성과 DAR의 양성 상관관계에 대한 경향이 있었다. 부위-특이적 v29001-MTvc-화합물 1 DAR2 ADC의 활성은 v17427-ADvc화합물 1 확률적 DAR2 대조군의 것과 비교가능하였다 (도 7a).
H1975 모델의 경우, 모든 DAR1, DAR2, DAR3 및 DAR4 화합물 1 ADC는 24, 12, 8 및 6 mg/kg 각각의 독소-매칭 항체 용량에서 비히클과 비교하여 종양 성장을 유의미하게 억제하였다 (p <0.05, 종양 성장률에 대한 혼합된 효과 모델) (도 8b). 모든 DAR2, DAR3 및 DAR4 화합물 1 ADC가 2, 1.3 및 1 mg/kg 각각의 독소-매칭 항체 용량에서 비히클과 비교하여 종양 성장을 또한 유의미하게 억제한 반면, DAR1 ADC는 4 mg/kg의 독소-매칭 항체 용량에서 종양 성장을 유의미하게 억제하지 못했다 (도 8a).
유의미한 체중 손실을 어느 한쪽 연구의 임의의 치료 그룹에서 관찰하지 못했다.
실시예 15: 시스테인 삽입 변이체의 FcγR 및 FcRn 결합
표 2.2에 나타난 10개 시스테인 삽입 변이체를 아래 기재된 대로 신생 Fc 수용체 (FcRn) 및 Fcγ 수용체 (FcγR) CD64a (FcγRI), CD32a (FcγRIIA; 대립유전자성 형태 His131 및 Arg131), CD32b (FcγRIIB) 및 CD16a (FcγRIIIA; 대립유전자성 형태 V158 및 F158)에 결합하는 그들의 능력에 대하여 평가하였다.
FcγR에 대한 결합 : 테스트된 변이체에 대하여 FcyR의 친화도를 0.05% Tween 20 및 3.4 mM EDTA를 함유하는 PBS 완충액 pH 7.4가 있는 Biacore™ T200 시스템 (Cytiva, Marlborough, MA)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.5 중 15ug/mL로 단백질 A (Genscript Biotech Corporation, Piscataway, NJ; Cat. Z02201)를 2000 RU (반응 단위)에 대한 표준 아민 커플링을 통해서 CM5 센서 칩에 공유적으로 부동화하였다. 2.5ug/mL에서 각 테스트 변이체를 단백질 A 포착을 위하여 30초 동안 10uL/분의 유속으로 주사하였다. FcγR을 단일 주기 동역학을 사용하여 항체-부동화된 표면에 걸쳐 25uL/분으로 주사하였다. 약한 친화도 그리고 신속한 온 및 오프 상호작용을을 갖는 CD32aH, CD32aR, 및 CD32bY의 경우, 0.15와 12 uM 사이 증가하는 농도의 15초를 사용하였다. CD16aF 및 CD16aV의 경우, 0.06과 5 uM 사이 증가하는 농도의 40초 주사를 사용하였다. CD64a의 경우, 0.41과 300nM 사이 증가하는 농도의 100초 주사를 사용하였다. 모든 FcγR의 경우, 120초의 해리를 사용하였고, 단백질 A 표면을 주사 주기들 사이 10 mM 글리신 pH 1.5의 30초 펄스로 재생하였다. 센서그램을 이중 참조하였고 해리 단계가 CD64a에 대하여 충분히 느리면 친화도 결정을 위한 정상 상태 모델 또는 동역학 및 친화도를 위한 1:1 결합 모델에 적합화하였다. 보고된 KD 값은 2개 독립적 실행의 평균이다. 모든 실험을 25℃에서 실행하였다.
FcRn에 대한 결합 : 테스트된 변이체에 대하여 FcRn의 친화도를 pH 5.9로 조정된 0.05% Tween 20 및 3.4 mM EDTA를 함유하는 PBS 완충액이 있는 Biacore™ T200 시스템 (Cytiva, Marlborough, MA)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.5 중 10ug/mL에서 뉴트라비딘 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA; Cat. 31000)을 2000 RU (반응 단위)에 대한 표준 아민 커플링을 통해서 CM5 센서 칩에 공유적으로 부동화하였다. 5ug/mL에서 큰 아단위로 C-말단 비오틴이 있는 인간 FcRn을 20초 동안 20uL/분의 유속으로 주사하여 70 RU의 FcRn 포착 수준에 도달하였다. 각 테스트 변이체를 단일 주기 동역학을 사용하여 FcRn-부동화된 표면에 걸쳐 주사하였다. 항체 변이체를 pH 5.9 실행 완충액에서 단일-주기 방법론을 사용하여 180초 해리와 50 uL/분으로 45초 동안 5 - 1200nM 사이 증가하는 농도로 주사하였다. FcRn 표면을 주사 주기들 사이 PBST pH 7.4의 30초 펄스로 재생하였다. 센서그램을 이중-참조하였고 정상 상태 결합 모델에 적합화하여 친화도 값을 생성하였다. 보고된 KD 값은 2개 독립적 실행의 평균이다. 모든 실험을 25℃에서 실행하였다.
결과 : 결과를 표 15.1에 나타낸다. 모든 시스테인 삽입 변이체는, 야생형 대조군 (v17427)에 대하여 KD의 2-배 내에서, 유사한 친화도로 FcRn에 결합하였다. FcγR에 대한 유의미하게 감소된 결합을 보여주었던 v29001 (H_T299.5C) 및 v22765 (H_G237.5C), 그리고 CD16aF, CD16aV, CD32aH, 및 CD32aR에 결합에서 감소를 보여주었던 변이체, v22768 (H_Q295.5C) (야생형 대조군, v17427의 KD의 >2-배)를 제외하고 대부분의 시스테인 삽입 변이체는 또한, 야생형 대조군 (v17427)의 KD의 2-배 내에서, 유사한 친화도로 모든 FcγR에 결합하였다. 대조군 시스테인 삽입 변이체 v29013 (H_S239.5C)은 또한 예상된 대로 FcγR에 대한 유의미하게 감소된 결합을 보여주었다.
실시예 16: 시스테인 삽입 돌연변이의 전이성
시스테인 삽입 돌연변이가 다른 항체로 전이가능함을 입증하기 위해, 삽입 부위들 중 4개를 선택하였고 총 7개 새로운 변이체에 대하여 표 16.1에 상세된 대로 4개 상이한 항체에 도입하였다.
시스테인 삽입 변이체를 일반 프로토콜 1에 기재된 대로 동일한 프로토콜을 따라 다양한 항체 배경에서 제조하였다. 트라스투주맙, CR8071, H3 및 SGNCD19a (v34014, v34012, v34010, v33996, v34004 및 v34015)에 기반된 변이체들은 하기를 제외하고 일반 절차 2에 기재된 대로 약물-링커 MTvc화합물 1에 접합하였다. 변이체 v34012 및 v34010의 경우, 일단 환원을 완료하면, 환원된 변이체를 RT에서 어느 한쪽 산화를 위하여 PBS, pH 6.5에 완충액 교환하였거나 이어서 MTvc화합물 1과 접합하였다. 4℃에서 산화로 제조된 샘플은 더 나은 생물물리학적 특성을 보여주었다.
변이체 v34217을 아래 기재된 대로 3개 상이한 캄프토테신-기반 약물-링커 (MC-GGFG-캄프토테신 1, MC-GGFG-캄프토테신 2 및 MC-GGFG-*캄프토테신 2)에 접합하였다. 약물-링커 MC-GGFG-*캄프토테신 2는 약물-링커 MC-GGFG-캄프토테신 2와 동일한 캄프토테신 유사체를 함유하지만 링커를 약물 분자에서 상이한 위치에 부착한다.
변이체 v34217 (6 mg)의 용액 (647.2 μL)을 PBS (pH 7.4) 중 5 mM 용액의 DTPA (디에틸렌트리아민 펜타아세트산, 최종 농도 1mM, 부피: 188 μL)를 이용해 6.4 mg/mL로 희석하였고, 이 용액에 25 mM 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP) (25 당량, 104 μL)을 첨가하였다. 37℃ 수조에서 3시간 동안 인큐베이션 이후, 환원된 항체를 10mM 아세트산나트륨 pH 5.5로 사전-조건화된 40kDa 5mL Zeba™ 회전 탈염 컬럼 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 정제하였다. 환원된 항체를 4℃에 25 몰 과량 데하이드로아스코브산 (DHAA) (Zeba™ 컬럼 정제로부터 100% 회수 추정)으로 밤새 산화 (18 시간)시켜 삽입된 시스테인을 환원된 (유리 티올) 형태로 유지하면서 쇄간 디술피드 결합을 재형성하였다. 재산화된 항체를 3개 균등한 분취량으로 분할하였고 피펫팅에 의해 철저히 혼합한 후 60-75 분 동안 실온에서 10 % (v/v) DMSO의 존재 하에 약물-링커의 10 mM DMSO 스톡의 4 몰 과량과 인큐베이션함으로써 말레이미드 관능화된 약물-링커 MC-GGFG-캄프토테신 1, MC-GGFG-캄프토테신 2 또는 MC-GGFG-*캄프토테신 2에 접합하였다. 형성된 접합체를 그 다음 10mM 아세트산나트륨 pH 4.5로 사전-평형화된 40K Zeba™ 컬럼에 의해 정제하였다.
일단 접합을 완료하였다면, 모든 ADC를 일반 프로토콜 4, 5, 6 및 7, 각각에 기재된 대로 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 크기-배제 크로마토그래피 (SEC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS) 및 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)에 의해 분석하였다.
결과를 표 16.2에 나타내고, 전반적으로, 시스테인 삽입 돌연변이가 상이한 항체에서 성공적으로 그리고 상이한 약물-링커를 접합하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 대부분의 ADC의 경우, 어느 한쪽 HIC 또는 LC-MS에 의해 측정된 DAR은 예상된 바와 같았다 (~ DAR 2). v33996의 경우, 심지어 네이키드 항체로서 HIC에서의 용출은 비교적 광범위이었고 그러므로, 뚜렷한 피크를 접합후 관찰하지 못했고 DAR도 HIC-RRT도 측정할 수 없었다. v34012의 경우, 2.1의 DAR을 초래한 특정 정도의 비-특이적 접합을 관찰하였다. ADC는 2개 ADC: MTvc화합물 1에 접합된 v34012 및 v34010을 제외하고 SEC에서 적어도 95% 단량체를 보여주었다. 이들 2개 ADC의 경우, ~15% LMWS는 산화후 (약물-링커의 첨가 전에) 관찰하였고, 이는 접합후 변화되지 않은 채로 남아있었다. 산화 단계의 추가 최적화는 이들 2개 변이체에 대하여 관찰된 LMWS의 양을 개선할 것이다.
실시예 17: 추가의 DAR-조율된 항체 약물 접합체의 제조
이 실시예에서, 부위-특이적 접합을 할 수 있는 항체를 생성하도록 여러 시스테인 삽입 부위를 조합하여 DAR 4 및 6 ADC를 제공하였다. 이용된 시스테인 삽입 부위의 조합을 표 17.1에 나타낸다.
시스테인 삽입 변이체를 일반 프로토콜 1에 기재된 프로토콜을 따라 제조하였다. DAR 4 및 DAR 6 항-cMet 변이체를 L-시스테인 캡, 글루타티온 캡, 또는 양쪽의 조합과 시스테인 캡핑된 형태로 발현하였다. 약물-링커 MTvc화합물 1에 대한 환원, 산화 및 접합을 하기 변형과 일반 절차 2에 기재된 대로 실시하였다. 추가의 시스테인 캡핑을 설명하기 위해, DAR 4 및 DAR 6 변이체에 대하여, 유사한 조건 하에서 30 및 40 당량 몰 과량의 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP), 각각으로 환원을 수행하였다. DAR 4 및 DAR 6 변이체, 각각에 대하여 30 및 40 당량 몰 과량 데하이드로아스코르브산 (DHAA)으로 산화를 수행하였다.
변이체 약물-링커 MC-GGFG-캄프토테신 1, MC-GGFG-캄프토테신 2 및 MC-GGFG-*캄프토테신 2에 대한 DAR 4 항-FRα의 접합을 실시예 16에 기재된 대로 실시하였다.
일단 접합을 완료하였다면, 모든 ADC를 일반 프로토콜 4, 5, 6 및 7, 각각에 기재된 대로 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 크기-배제 크로마토그래피 (SEC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS) 및 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)에 의해 분석하였다.
결과를 표 17.2 (항-cMet 항체) 및 표 17.3 (항-FRα 항체)에 나타낸다.
전반적으로, 항-cMet 항체 백본 상에 부위-특이적 DAR 4 및 DAR 6 접합은 항체에 도입되는 중이고 약물-링커에 접합되는 중인 최대 3개 상이한 시스테인 삽입으로 성공적이었다. DAR 6 ADC, v35074-MTvc화합물 1에 대하여 대표적 HIC, SEC, LC-MS 및 CE-SDS 프로파일을 도 16-18에 도시한다.
ADC v33943-MTvc화합물 1 및 v35074-MTvc화합물 1의 경우, HIC에 의해 계산된 DAR 값은 공-용출 피크의 존재로 인해 예상된 것보다 적었다. 다른 항-cMet ADC의 경우, 하지만, HIC에 의해 계산된 DAR은 표적 DAR에 근접하였다. LC-MS에 의해 측정된 DAR은 더욱 직접적 접근법이고 절대값에 가장 근접하게 반영해야 한다. v33952-MTvc화합물 1을 제외하고, 모든 다른 항-cMet ADC는 UPLC-SEC에서 적어도 99% 단량체를 보여주었다. 이 항체가 약물-링커의 첨가 전에 >10% LMWS 형성을 보여주었음에 따라 v33952에 대하여 산화 단계의 추가 최적화는 LMWS의 양을 감소시켜야 한다. 비-변성 조건 하에서 CE-SDS 실행은 이 변이체의 경우 전체 크기 항체와 비교하여 절반-항체의 더 높은 분율을 보여주었다.
항-FRα 항체 백본 상에 부위-특이적 DAR 4 접합의 경우, 모든 ADC는 UPLC-SEC에서 >99% 단량체로서 나타났다. HIC에 의해, 1개 피크만을 이들 ADC에 대하여 관찰하였다. 양쪽 접합된 및 접합되지 않은 항체는 매우 유사한 용출 시간을 가졌고, HIC에 의한 DAR 추정치는 LC-MS DAR 계산보다 덜 정확하였다. 6개 ADC 중 4개는 LC-MS에 의해 DAR 4를 보여주었다. 어느 한쪽 MC-GGFG-캄프토테신 1 또는 MC-GGFG-*캄프토테신 2에 접합된 변이체 v34456은 추가 최적화로 환원될 수 있는 ~25% 비-특이적 접합을 보여주었다.
실시예 18: DAR-조율된 항-FRα ADC의 시험관내 세포독성
실시예 16 및 17에서 생성된 항-FRα ADC (DAR 2 및 DAR 4)의 세포 성장 억제 (세포독성) 능력을 FRα-발현 암 세포주 JEG-3 (태반 융모막암종) 및 T-47D (유방 암종)을 사용하여 아래 기재된 대로 3D 세포독성 검정에서 확률적 DAR 4 ADC와 비교하였다.
간략히, 3,000 세포/웰을 384-웰 초저 부착 (ULA) 플레이트에 시딩하였고, 200 x g에서 2분 동안 원심분리하였고, 3 일 동안 표준 배양 조건 하에서 인큐베이션하여 회전타원체 형성 (1 회전타원체/웰)을 허용하였다. 3 일후, 회전타원체를 완전 성장 배지에서 제조된 시험품의 적정으로 치료하였고 6 일 동안 표준 배양 조건 하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션후, CellTiter-Glo® 3D 시약 (Promega Corporation, Madison, WI)을 모든 웰에서 스파이킹하였다. 플레이트를 1 시간 실온에 암실에서 인큐베이션하였고 BioTek Cytation 5 세포 이미징 다중-모드 판독기 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)를 사용하여 발광을 정량화하였다. 바탕 웰에 기반하여 (첨가된 시험품 없음), 퍼센트 세포독성 값을 계산하였고 GraphPad Prism 9 소프트웨어 (GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 시험품 농도에 대해 플롯팅하였다.
결과를 표 18.1에 나타낸다. 부위-특이적 DAR 4 ADC는 양쪽 JEG-3 및 T-47D 회전타원체에 대해 페이로드-매칭 확률적 DAR 4 ADC와 비교가능한 3D 시험관내 세포독성을 나타냈다. 부위-특이적 DAR 2 ADC는, DAR 2 ADC 상에서 더 낮은 약물 로딩으로 인해 예상된 대로, JEG-3 및 T-47D 회전타원체에 대해 페이로드-매칭 DAR 4 ADC보다 log-배 더 낮은 효력을 나타냈다.
캄프토테신 2를 포함하는 DAR 4 부위-특이적 및 확률적 ADC는 양쪽 JEG-3 및 T-47D 회전타원체에 대해 페이로드-매칭 DAR 8 확률적 ADC와 유사한 효력을 보여주었다.
캄프토테신 1을 포함하는 DAR 4 부위-특이적 및 확률적 ADC는 고 FRα-발현 JEG-3 회전타원체에 대해 페이로드-매칭 DAR 8 확률적 ADC와 유사한 효력을 보여주었다. 더 낮은 FRα-발현 T-47D 회전타원체에서, DAR 4 ADC는 약물-로딩 의존적 용량 반응을 보여주었고, 페이로드-매칭 DAR 8 확률적 ADC는 3-9-배 더 높은 효력을 보여주었다.
본 명세서에 참조된 모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이터베이스 항목의 개시내용은 각각의 그러한 개별 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이터베이스 항목이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 바와 동일한 정도로 그들의 전체가 참조로 구체적으로 이에 포함된다.
당업자에게 명백할 본원에 기재된 특정 구현예의 수정은 하기 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zymeworks Inc. <120> Cysteine Engineered Antibody Constructs, Conjugates and Methods of Use <130> V818153WO <140> not yet available <141> 2022-03-25 <150> US 63/166,450 <151> 2021-03-26 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> signal_peptide <400> 1 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly 20 25 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> light_chain_peptide <400> 2 Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val 1 5 <210> 3 <211> 110 <212> PRT <213> CH2_domain_of_human_IgG1_allele_*01 <400> 3 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 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Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 46 <211> 98 <212> PRT <213> CH1_domain_of_human_IgG2_allele_*04 <400> 46 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 47 <211> 98 <212> PRT <213> CH1_domain_of_human_IgG4_allele_*01 <400> 47 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 48 <211> 98 <212> PRT <213> CH1_domain_of_human_IgG2_allele_*01 <400> 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 49 <211> 98 <212> PRT <213> CH1_domain_of_human_IgG2_allele_*02 <400> 49 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val

Claims (40)

  1. 시스테인 조작된 항체 작제물로서, VH 도메인, VH 도메인 및 VL 도메인, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 포함하며, 상기 Fc 영역이 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하고,
    상기 항체 작제물이:
    (a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고,
    VL, CL, VH 및 CH1 도메인에서 아미노산의 상기 넘버링이 카밧 넘버링이고 CH2 도메인에서 아미노산의 상기 넘버링이 EU 넘버링이고,
    상기 항체 작제물이 면역글로불린 G (IgG)에 기반되는,
    시스테인 조작된 항체 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물의 도메인의 용융 온도 (Tm)가 시스테인 삽입 돌연변이가 결여되는 상응하는 친계 항체 작제물에서 동일한 도메인의 Tm의 0℃ 내지 8℃ 이내인, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 작제물이 1개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 작제물이 2개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2개 시스테인 삽입 돌연변이가 대칭적 돌연변이인, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 작제물이 3개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 3개 시스테인 삽입 돌연변이 중 2개가 대칭적 돌연변이인, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  8. 제3항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 각 시스테인 삽입 돌연변이가 독립적으로
    (a) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (d) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택되는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  9. 제3항에서, 상기 시스테인 삽입 돌연변이가
    (a) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (c) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택되는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 작제물이 4개 또는 6개 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 시스테인 삽입 돌연변이가
    (a) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) VH 도메인에서위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (d) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (e) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택되는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 항체 작제물이 VH 도메인 또는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 작제물이 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하고, 상기 항원-결합 도메인 중 적어도 하나가 상기 VH 도메인 또는 상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인을 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체 작제물이 2개 항원-결합 도메인을 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체 작제물이 이중특이적인, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인 중 적어도 하나가 종양-연관 항원에 결합하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 항체 작제물이 Fc 영역을 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 항체 작제물이 IgG1에 기반되는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 IgG가 인간 IgG인, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 항체 작제물이 헤테로이량체성 Fc 영역을 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 헤테로이량체성 Fc 영역이 호모이량체성 Fc보다 헤테로이량체성 Fc의 형성을 촉진시키는 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는, 시스테인 조작된 항체 작제물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 임의의 한 항에 따른 시스테인 조작된 항체 작제물, 및 각각의 하나 이상의 삽입된 시스테인 잔기에 접합된 하나 이상의 활성 제제를 포함하는, 접합체.
  23. 하기 화학식 (I)를 갖는 접합체로서,
    A-(L-(D)q)p (I)
    식 중:
    A는 시스테인 조작된 항체 작제물이고;
    L은 링커이고;
    D는 활성 제제이고;
    q는 1 내지 4의 정수이고,
    p는 1 내지 8의 정수이고,
    상기 시스테인 조작된 항체 작제물이 VH 도메인, VH 도메인 및 VL 도메인, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 Fc 영역이 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하고,
    상기 시스테인 조작된 항체 작제물이
    (a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고,
    상기 VL, CL, VH 및 CH1 도메인에서 아미노산의 상기 넘버링이 카밧 넘버링이고 상기 CH2 도메인에서 아미노산의 상기 넘버링이 EU 넘버링이고,
    상기 시스테인 조작된 항체 작제물이 면역글로불린 G (IgG)에 기반되고,
    각 D가 L을 통해 삽입된 시스테인 잔기에 결합되는,
    접합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 접합체가 하기 화학식 (II)를 갖는, 접합체:
    A-(L-D)p (II)
    식 중:
    A는 시스테인 조작된 항체 작제물이고;
    L은 링커이고;
    D는 활성 제제이고,
    p는 1 내지 8의 정수임.
  25. 제22항 내지 제24항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 활성 제제가 진단적 제제 또는 표지화 제제인, 접합체.
  26. 제22항 내지 제24항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 활성 제제가 치료적 제제인, 접합체.
  27. 제22항 내지 제26항 중 임의의 한 항에 따른 접합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  28. 유효량의 제26항에 따른 접합체를 투여하기를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법.
  29. 요법에서 사용을 위한, 제28항에 따른 접합체.
  30. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 약제의 제조에서 제28항에 따른 접합체의 용도.
  31. 제22항 내지 제26항 중 임의의 한 항에 따른 접합체의 제조 방법으로서, 상기 시스테인 조작된 항체 작제물을 상기 하나 이상의 삽입된 시스테인 잔기의 티올 기가 환원되도록 하는 환원 조건에 적용하는 단계, 및 상기 링커와 상기 환원된 티올 사이 결합의 형성을 허용하는 조건 하에서 티올 반응성 링커-활성 제제를 상기 항체 작제물과 반응시키는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  32. 사전-결정된 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 항체-약물 접합체의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    (i) VH 도메인, VH 도메인 및 VL 도메인, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 시스테인 조작된 항체 작제물을 제공하는 단계로서, 상기 Fc 영역이 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하고,
    상기 항체 작제물이:
    (a) VL 도메인에서 위치 39와 40 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (d) CL 도메인에서 위치 148과 149 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (e) CL 도메인에서 위치 149와 150 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (f) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (g) CH1 도메인에서 위치 169와 170 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (h) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (i) CH2 도메인에서 위치 295와 296 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (j) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택된 하나 이상의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하는, 단계, 및
    (ii) 상기 시스테인 조작된 항체 작제물을 약물-링커와 반응시켜 상기 항체-약물 접합체를 제공하는 단계
    를 포함하고;
    상기 사전-결정된 DAR이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 상기 시스테인 조작된 항체 작제물이 상기 사전-결정된 DAR과 동일한 수의 시스테인 삽입 돌연변이를 포함하고,
    VL, CL, VH 및 CH1 도메인에서 아미노산의 상기 넘버링이 카밧 넘버링이고 CH2 도메인에서 아미노산의 상기 넘버링이 EU 넘버링이고,
    상기 시스테인 조작된 항체 작제물이 면역글로불린 G (IgG)에 기반되는,
    제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 사전-결정된 DAR이 2인, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 사전-결정된 DAR이 1 또는 3인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 시스테인 삽입 돌연변이가
    (a) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (d) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 사전-결정된 DAR이 4 또는 6인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 시스테인 삽입 돌연변이가
    (a) VL 도메인에서 위치 40과 41 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (b) CL 도메인에서 위치 126과 127 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (c) VH 도메인에서 위치 9와 10 사이 시스테인 잔기의 삽입;
    (d) CH2 도메인에서 위치 237과 238 사이 시스테인 잔기의 삽입, 및
    (e) CH2 도메인에서 위치 299와 300 사이 시스테인 잔기의 삽입
    으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제21항 중 임의의 한 항에 따른 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 세트.
  39. 제1항 내지 제21항 중 임의의 한 항에 따른 시스테인 조작된 항체 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  40. 제39항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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