CN111032690B - 靶向骨的抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了用一个或多个聚‑天冬氨酸(聚‑D)肽(例如，D10序列)修饰的重组和化学缀合的抗体及其片段，以改善该抗体或片段到骨的定位。还公开了制造和使用这些抗体和片段的方法。

Description

靶向骨的抗体
相关申请的交叉引用
此申请要求2017年1月20日提交的美国临时申请62/448,763的优先权，其公开内容通过提述以其整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，且通过提述以其整体并入本文。将创建于2018年1月11日的该ASCII拷贝命名为022548_WO012_SL.txt，大小为75,113字节。
发明领域
本发明涉及用靶向骨的肽修饰的抗体和其用于治疗病理生理性骨退化的方法。
发明背景
适当的骨发育和维持是正常健康的重要因素。在普通人中，骨发育发生直至约20岁的年龄，此时骨密度通常达其最大值。此后，在没有适当的饮食和强体力活动的情况下，骨密度可变小。然而，正常骨维持需要稳态的骨转换，其中旧骨被去除并用新骨取代。
然而，存在许多可影响骨发育和维持的疾病和病况。例如，在疾病诸如成骨不全中骨发育受影响，其中骨强度受损，这导致儿童具有容易折断的脆弱骨。而且，随着他们变老，稳态的骨转换的缺乏可在其他情况中发生在健康个体中，导致骨质疏松，其中骨密度随时间受损，并最终导致脆弱骨和骨折。
更进一步地，存在某些疾病，其中骨健康受原发性疾病并行地影响，且涉及其他共患后遗症，诸如涉及慢性肾病(CKD)。CKD是一种进行性疾病，其中肾功能随时间衰退，常导致与骨健康不良和改变的骨转换率相关的心血管疾病。已经显示改善骨健康的治疗伴随着减轻相关联的心血管疾病。此类报道表明正常骨转换率可能对其他疾病产生影响，如果骨转换率不是其他疾病的原因的话。因此，用于调控骨发育和/或维持的改进的方法学可以对改善患有多种不同疾病和病况的个体的健康产生广泛的直接或间接影响。
TGFβ是转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员且在哺乳动物发育期间的骨形成中是重要的(参见Chen等，Int.J.Biol.Sci.8(2):272–88(2012))。TGFβ似乎对稳态的骨维持同样重要。有趣的是，已经显示TGFβ在患有CKD的个体中以较高水平表达，这表明其是治疗性干预的可行靶标。用抗TGFβ抗体全身性治疗具有CKD的jck小鼠模型证明了高骨转换率的降低(Liu等,J.Bone Miner Res.29(5):1141-57(2014))。然而，此研究并未研究抗TGFβ抗体在骨中的定位可以改善治疗功效的程度。考虑到TGFβ涉及众多细胞过程，包括DNA损伤应答、过敏性免疫应答和伤口上皮形成，仅列举几例，因此需要一种更具靶向性的控制TGFβ活性的方法以使潜在的不想要的副作用降到最少。因此，需要一种更精确的调控TGFβ活性的方法以提供用于调控骨发育和/或维持的改进的治疗。
发明概述
本文提供了有效靶向骨的抗体，诸如抗TGFβ抗体。在第一方面中，本公开提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链、轻链和一个或多个聚-天冬氨酸(聚-D)肽。在一个特定的实施方案中，该抗体或抗原结合片段包含重链、轻链、和一个或多个与该重链和/或该轻链的C-末端连接的聚-天冬氨酸(聚-D)肽。
在一个实施方案中，相较于具有相同重链和轻链但缺少该一个或多个聚-D肽的抗体，该抗体或其抗原结合片段表现出对骨的定位的至少2倍增加。
在一个实施方案中，该一个或多个聚-D肽通过化学缀合与该抗体或其抗原结合片段连接。在另一实施方案中，该一个或多个聚-D肽连接在该重链的铰链区处。在一个另外的实施方案中，该一个或多个聚-D肽与该轻链的N-末端或C-末端连接。在一个另外的实施方案中，该一个或多个聚-D肽通过一个或多个间隔/接头(例如，聚乙二醇(PEG)间隔和肽接头)与该抗体或其抗原结合片段连接。
在一个实施方案中，一个或多个聚-D肽与该重链的氨基酸序列整合，和/或一个或多个聚-D肽与该轻链的氨基酸序列整合。与氨基酸序列“整合”的聚-D肽包括在同一多肽链中。例如，该整合的聚-D肽可以从与该重或轻链序列同一RNA链翻译，该RNA可以从重组DNA质粒编码。在一个实施方案中，一个或多个聚-D肽与该重链的N-末端整合，和/或一个或多个聚-D肽与该重链的C-末端整合。两个或更多个聚-D肽可以由零个、一个或多个其他氨基酸残基分开串联地连接至该重链的N-末端或C-末端。在一个另外的实施方案中，一个或多个聚-D肽与该轻链的N-末端整合，和/或一个或多个聚-D肽与该轻链的C-末端整合。例如，两个或更多个聚-D肽可以由零个、一个或多个其他氨基酸残基(即，非天冬氨酸氨基酸)或肽接头分开串联地连接至该轻链的N-末端或C-末端。在一个实施方案中，一个聚-D肽与该重链的C-末端整合。在另一个实施方案中，一个聚-D肽与该重链的C-末端整合，且一个聚-D肽与该重链的N-末端整合。
在一个实施方案中，该轻链不包含聚-D肽。在另一实施方案中，该重链不包含聚-D肽。
在一个实施方案中，该一个或多个聚-D肽各自独立地包含2-30个天冬氨酸残基。例如，聚-D肽可包括2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或16、或17、或18、或19、或20、或21、或22、或23、或24、或25、或26、或27、或28、或29、或30个天冬氨酸残基。在另一实施方案中，该一个或多个聚-D肽各自独立地包含6、7、8、9、10或11个天冬氨酸残基。在另一实施方案中，该一个或多个聚-D肽各自包含10个天冬氨酸残基；此类肽在本文中被称为“D10”(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，该抗体或片段可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或多于12个聚-D肽。
在另一实施方案中，该抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE、或IgD中的任一种。在另一实施方案中，该抗体是IgG1或IgG4同种型。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段特异性结合TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3中的一种或多种，诸如人TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3中的一种或多种。
在一个实施方案中，预期抗体片段具有一个或多个聚-天冬氨酸(聚-D)肽。预期的是相较于相同的但缺少该一个或多个聚-D肽的抗体片段，该抗体片段将会表现出对骨定位的至少2倍增加。该抗体片段可以是，例如，下列中的任一种或下列的组合：Fab、F(ab’)2、单一特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab3、单价IgG、scFv、双特异性双抗体、三特异性三链抗体、scFv-sc、微抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG或VhH。在一个实施方案中，该抗体片段结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种，诸如人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。本文的抗体或抗体片段可以是全人的、人源化的或嵌合的。
在第二方面中，本公开提供一种产生靶向骨的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括下列的步骤：提供抗体重链，提供抗体轻链，提供一个或多个附接至该重链的聚-D肽和/或一个或多个附接至该轻链的聚-D肽，且使该重链和该轻链结合，以产生靶向骨的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，该一个或多个附接至该重链的聚-D肽和/或该一个或多个附接至该轻链的聚-D肽通过化学缀合被附接。在另一实施方案中，该一个或多个附接至该重链的聚-D肽和/或该一个或多个附接至该轻链的聚-D肽通过重组(recombination)被附接。
在第三方面中，本公开提供靶向骨的抗TGFβ抗体，其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:2、3、4和5中的任一个中所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQID NO:6、7、8、11和12中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:6时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ IDNO:2。
在第四方面中，本公开提供靶向骨的抗TGFβ抗体，其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16和17中的任一个中所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:15、18、19、20、21和22中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13。
在第五方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F6)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第六方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F16)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第七方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F11)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第八方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F17)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第九方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F12)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第十方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F7)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第十一方面中，本公开提供以下人IgG4抗体(例如，mAb2 F2)：其包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在一个实施方案中，该抗体特异性结合TGFβ1。
在第十二方面中，本公开提供靶向骨的抗TGFβ抗体，其包含重链和轻链，该重链包含由(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的密码子的)SEQ ID NO:23、24、25、和26中的任一个中所示的核酸序列编码的氨基酸序列，该轻链包含由SEQ ID NO:27、28、29、30、31、和32中的任一个中所示的核酸序列编码的氨基酸序列，条件是当该轻链氨基酸序列由SEQ ID NO:27中所示的核酸序列编码时，该重链氨基酸序列不由(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的密码子的)SEQ ID NO:23中所示的核酸序列编码。
在第十三方面中，本公开提供以下人IgG4抗体：其包含重链和轻链，该重链包含由(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的密码子的)SEQ ID NO:25中所示的核酸序列编码的氨基酸序列，该轻链包含由SEQ ID NO:27中所示的核酸序列编码的氨基酸序列。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。
在第十四方面中，本公开提供以下人IgG4抗体：其包含重链和轻链，该重链包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的密码子的)SEQ ID NO:26中所示的核酸序列编码的氨基酸序列，该轻链包含由SEQ ID NO:27中所示的核酸序列编码的氨基酸序列。该抗体特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。
在第十五方面中，本公开提供一种用于治疗个体骨质流失的方法，其包括向该个体施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗体或其抗原结合片段，和检测下列中的至少一种：TGFβ水平的降低、TGFβ活性的降低，骨质流失的降低，骨质流失速率的降低，骨密度的增加，骨强度的增加，和IL-11水平的降低。
在一个实施方案中，该个体是人。在另一个实施方案中，该抗TGFβ抗体或抗体片段特异性结合TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，该抗TGFβ抗体包含重链、轻链和一个或多个聚-天冬氨酸(聚-D)肽。相较于具有相同重链和轻链但缺少该一个或多个聚-D肽的抗体，该抗体表现出对骨定位的至少2倍增加。在一个实施方案中，该抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE和IgD中的任一种。在另一实施方案中，该抗体是IgG1或IgG4同种型。在一个实施方案中，该个体具有慢性肾病和/或骨疾病，包括癌症向骨的转移。该骨疾病可以是成骨不全症或骨质疏松症。在一个实施方案中，该有效量的靶向骨的抗TGFβ抗体或抗体片段皮下、静脉内或肌内施用。
在第十六方面中，本公开提供药物组合物，其包含本发明的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。例如，该抗体可包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQID NO:2、3、4、和5中的任一个中所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:6、7、8、11、和12中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:6时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:2。在另一实施方案中，该抗体可包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:15、18、19、29、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13。
在第十七方面中，本公开提供分离的核酸分子，其包含编码靶向骨的抗TGFβ抗体的重链、轻链、或二者的核酸序列，其中该抗TGFβ抗体的重链包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列，且该抗TGFβ抗体的轻链包含SEQ ID NO:15、18、19、20、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13。
在第十八方面中，本公开提供表达载体，其包含编码靶向骨的抗TGFβ抗体的重链、轻链、或二者的核酸序列，其中该抗TGFβ抗体的重链包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列；且该抗TGFβ抗体的轻链包含SEQ ID NO:15、18、19、20、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13。
在第十九方面中，本公开提供宿主细胞，其包含一种或多种表达载体，所述表达载体包含编码靶向骨的抗TGFβ抗体的核酸序列，其中该抗TGFβ抗体的重链包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:15、18、19、29、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物细胞或原核细胞。在另一个实施方案中，该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)细胞。
在第二十方面中，本公开提供一种产生靶向骨的抗TGFβ抗体或其抗原结合片段的方法。该方法包括在允许产生该抗体或其抗原结合片段的条件下，使宿主细胞生长。该宿主细胞包含(i)编码包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列的重链的核酸序列；和(ii)编码包含SEQ ID NO:15、18、19、29、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链的核酸序列，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ IDNO:13。在一个实施方案中，该方法进一步包括将该抗体或其抗原结合片段配制成包含可接受的载体的药物组合物。
在第二十一方面中，本公开提供药物组合物，其包含靶向骨的抗TGFβ抗体。该靶向骨的抗TGFβ抗体包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:2、3、4、和5中的任一个中所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:6、7、8、11、和12中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:6时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:2，或该靶向骨的抗TGFβ抗体包含包含(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列的重链；和包含SEQ ID NO:15、18、19、29、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是(具有或不具有重链C-末端赖氨酸的)SEQ ID NO:13。在一个实施方案中，将该药物组合物配制成液体药物产品。在另一个实施方案中，将该药物组合物配制成冻干药物产品。
在第二十二方面中，本公开提供靶向骨的抗TGFβ抗体。该抗体的重链包含：包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HCDR3。该抗体的轻链包含：包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LCDR3。而且，该抗体进一步在该重链的N末端、该重链的C末端、该轻链的N末端和该轻链的C末端中的一处或多处包含D10多肽。
在第二十三方面中，本公开提供靶向骨的抗TGFβ抗体，其中该抗体的重链包含SEQID NO:39中的重链互补决定区(CDR)1-3和SEQ ID NO:40中的轻链CDR1-3，其中该抗体进一步在该重链的N末端、该重链的C末端、该轻链的N末端和该轻链的C末端中的一处或多处包含D10多肽。在一些实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变域(VH或HCVD)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变域(VL或LCVD)。
在第二十四方面中，本公开提供多核苷酸序列，其编码：靶向骨的抗TGFβ抗体，其中该抗体的重链包含包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HCDR3，该抗体的轻链包含包含SEQID NO:36的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的LCDR3，且该抗体进一步在该重链的N末端、该重链的C末端、该轻链的N末端和该轻链的C末端中的一处或多处包含D10多肽；或靶向骨的抗TGFβ抗体，其中该抗体的重链包含SEQ ID NO:39中的重链互补决定区(CDR)1-3和SEQ ID NO:40中的轻链CDR1-3，其中该抗体进一步在该重链的N末端、该重链的C末端、该轻链的N末端和该轻链的C末端中的一处或多处包含D10多肽。
在第二十五方面中，本公开提供本发明的靶向骨的抗体(诸如靶向骨的抗TGFβ抗体或抗原结合片段)供在本文所述的治疗方法中使用。
在第二十六方面中，本公开提供本发明的靶向骨的抗体(诸如靶向骨的抗TGFβ抗体或抗原结合片段)用于制备用于本文所述的治疗方法的药物的用途。
以下进一步描述了本文预期的特定实施方案。从本发明的以下详细描述以及所附权利要求将会更全面地理解本发明的上述和其他特征和优点。应注意，权利要求的范围由其中的叙述限定，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论限定的。
附图简述
图1描绘了与抗TGFβ(α-TGFβ)抗体化学缀合的D10肽。
图2描绘了使具有接头(肽接头)和马来酰亚胺功能团的肽化合缀合至鼠IgG1抗体上的还原的铰链区二硫化物的过程。
图3A描绘了D10肽-接头与抗TGFβ鼠IgG1(mAb1)的化学缀合物的还原性SDS-PAGE凝胶。上方条带代表重链，下方条带代表轻链。
图3B描绘了实施例1的化学缀合反应中的肽与抗体比例(PAR)值与肽-马来酰亚胺:mAb比例的对比，其显示随着肽的数目增加，PAR线性增加，直至8mol:mol。
图4A-4G描绘了TGFβ1和D10肽与曲妥珠单抗或或抗TGFβ抗体mAb1的化学缀合物的1:1摩尔混合物的尺寸排阻色谱分析。图4A描绘了D10肽与mAb1的化学缀合物的SEC峰图。图4B描绘了mAb1-D10化学缀合物和TGFβ1的1:1摩尔混合物的SEC谱图。图4C描绘了未经修饰的mAb1的SEC谱图。图4D描绘了mAb1和TGFβ1的1:1摩尔混合物的SEC谱图。图4E描绘了/>的SEC谱图。图4F描绘了D10肽与/>的化学缀合物的SEC谱图。图4G描绘了以1:1比例与TGFβ1混合的D10与/>的化学缀合物的SEC谱图。
图5A描绘了mAb1和D10-mAb1缀合物的羟磷灰石色谱分析的A280踪迹(x-轴＝时间，y-轴＝吸光度(归一化的))。
图5B描绘了来自流穿液(FT)和峰4的级分的SDS-PAGE凝胶。
图6A描绘了随着肽数目的增加，化学缀合物的羟磷灰石色谱分析。显示了每个缀合物的洗脱液在280nm处吸光度(x-轴＝分钟，y-轴＝吸光度(归一化的))。
图6B描绘了结合的分析物的级分(上曲线，圆圈，左侧刻度)和保留时间(下曲线，三角形，右侧刻度)，作为如通过SDS-PAGE测定的缀合的肽的数目的函数。
图7描绘了与未经修饰的mAb1相比，用具有对照缀合物(PAR＝0)和具有平均4或9个肽的缀合物的A549细胞进行的体外TGFβ中和测定。
图8A描绘了1mg/kg(1mpk)的荧光团标记的mAb1和含有大约个4.5肽的化学缀合物的时间依赖性生物分布。小鼠成像的时间在每个图示中指示。在每个图片中，左侧小鼠接受mAb1，且右侧小鼠接受化学缀合物。已经将图像强度调整至显示分布差异。
图8B描绘了在图8A中显示的图像中的对应于股骨远端的感兴趣的区域中和对应于心脏的感兴趣的区域中发现的荧光比例。圆圈对应于mAb1抗体且正方形对应于与mAb1缀合的D10肽(D10mAb1)。
图9A概略地描绘了D10肽在IgG亚型抗体上的可能位置，用于产生一系列mAb1融合变体抗体，其通过使用重组方法将D10肽附接到重链和/或轻链末端而获得。D10肽的添加位点由圆圈表示，肽接头序列的使用由波浪线表示(较长的波浪线表示比较短的波浪线更长的接头)。
图9B描绘了通过肽的布置衍生的一系列融合变体抗体(融合变体)，如图9A中所示。生成具有附接位置和肽数目的多种组合的重组融合变体。为清楚起见，每个图下方的较小数字描绘了本文中提及的每种重组融合变体的身份。如本文所述，融合变体用后跟预期的变体编号的“融合”或“F”表示。例如，“融合1”和“F1”二者是指具有不含D10肽的抗体“1”构型的抗体。较长的波浪线表示比较短的波浪线更长的接头。
图10描绘了在还原性(上凝胶)或非还原性(下凝胶)条件下指定的纯化的重组mAb1融合变体的SDS-PAGE。
图11描绘了如差示扫描荧光测定法(DSF)测定的重组mAb1融合变体的热稳定性。通过染料荧光的增加来检测在每个温度下向部分变性形式的转变。计算荧光随温度增加的斜率(-d(RFU)/dT)，并相对于样品的温度的关系将其显示。变性速率在曲线的最小值处最大，该曲线的最小值代表热转变的中点(Tm)。作为参考，示意性地显示了每种重组mAb1融合变体的结构。
图12A和12B描绘了图9B中示意性显示的8种重组mAb1融合变体的中和TGFβ，其体现在体外引发A549细胞产生IL-11方面。
图13描绘了重组mAb1融合变体和mAb1化学缀合物对羟磷灰石的亲和力，如通过柱色谱分析法在陶瓷羟磷灰石柱上测定的。
图14描绘了选择的荧光团标记的重组mAb1融合变体和mAb1化学缀合物在CD-1小鼠中的生物分布，这是通过在施用后多个时间进行活体成像获得的。
图15描绘了施用至CD-1小鼠后定位至脊柱的荧光标记的抗体、重组mAb1融合变体和mAb1化学缀合物的量。在3周的时间内通过IVIS仪器测量荧光。显示了ROI内的最大荧光的对数。
图16描绘了施用了实施例13和图15中所述的研究中的重组mAb1融合变体mAb1F6、mAb1 F16和mAb1 F17和mAb1化学缀合物(“缀合物”)后10天和21天的经切除的脊柱和股骨的荧光图像。
图17A和17B描绘了实施例15所述的24和96小时后的10μL血清，和经切除的脊柱的腰椎部分、末梢(小梁)股骨、肾脏和心脏中的mAb2 F1和mAb2 F6的荧光水平。
图18A显示经由mAb1-D10(mAb1 F6)的骨靶向在单剂量施用后深深地影响血清PK。如通过ELISA测量的，mAb1 F6表现出与mAb1相比13至14倍更低的血清暴露(AUC)、更快的血清清除和更短的血清半衰期(t1/2)。数据表示为平均值±SD：如通过方差分析(AVOVA)、Dunnet’s多重比较检验测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05)。mAb1是鼠源化抑制性抗TGFβ单克隆抗体，mAb1 F6是具有附接至mAb1的重链的C-末端的天冬氨酸多肽D10的重组鼠源化抑制性抗TGFβ单克隆抗体。用于成像的AUC/骨归一化至1.0。每种mAb1 F6和mAb1的剂量为5mg/kg。
图18B显示了如通过光学成像测量的，相较于mAb1，mAb1 F6表现出22倍更高的骨中暴露(AUC)。数据表示为平均值±SD：如通过AVOVA、Dunnet’s多重比较检验测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05)。每种mAb1 F6和mAb1的剂量为1mg/kg。
图19阐明了多剂量峰-谷PK曲线。(经由mAb1 F6)的骨靶向深深影响多剂量峰-谷血清PK。在给药后24和48小时以及第一剂量和剂量23之后，mAb1 F6表现出比mAb1更低的血清浓度。mAb1 F6的倍数差异在24小时时降低了3至4.5倍，在48小时时降低了6至9倍。mAb1F6的积累看起来也比mAb1少。数据表示为平均值±SD：如通过为未配对t检验测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05)。经由质谱分析法测量血清浓度。
图20显示靶向骨的(mAb1 F6)和mAb1在G610C(OI)小鼠中以剂量响应方式增加BV/TV(％)。观察到，相较于对照抗体13C4(小鼠IgG1抗体)处理的G610C小鼠，以1和5mg/kg的两种处理的BV/TV(％)的显著变化。相较于WT背景品系(WT 13C4)，用13C4处理的G610C小鼠(13C4)表现出BV/TV的显著降低。数据表示为平均值±SD：如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05；相较于WT 13C4，13C4#p≤0.05。BV/TV(％)经由μCT成像测量。
图21显示靶向骨的(mAb1 F6)和mAb1在G610C(OI)小鼠中以剂量响应方式增加最大失效力(maximum force to failure)。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，1和5mg/kg的mAb1 F6和仅5mg/kg的mAb1的最大失效力的显著变化。相较于WT背景品系，用抗体对照(13C4)处理的G610C小鼠表现出最大失效力的显著降低。数据表示为平均值±SD：如通过单因素ANOVA测量的，观察到的统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05；相较于WT 13C4，13C4#p≤0.05 13C4)。最大失效力经由生物力学压缩试验测量。
图22显示在G610C小鼠中mAb1和mAb1 F6对BV/TV的影响。将抗体以5mg/kg以多个频率(每周3次、每周1次、每2周1次或每4周1次)给药，持续12周。抗体13C4用作对照。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05；相较于WT 13C4，13C4#p≤0.05)。BV/TV经由μCT成像测量。
图23显示mAb1和mAb1 F6在G610C小鼠中对最大失效力的影响。将抗体以5mg/kg以多个频率(每周3次、每周1次、每2周1次或每4周1次)给药，持续12周。抗体13C4用作对照。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于13C4，mAb1或mAb1 F6*p≤0.05)。最大失效力经由生物力学压缩试验测量。
图24显示mAb1和mAb1 F6在G610C小鼠中对BV/TV(％)和抗体的平均血清水平的影响。抗体以5mg/kg每2周1次或每周1次给药，持续12周。抗体13C4用作对照。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于13C4，mAb1或mAb1 F6*p≤0.05；相对于WT 13C4，13C4#p≤0.05)。BV/TV(％)经由μCT成像测量。
图25显示mAb1和mAb1 F16在G610C小鼠中对BV/TV(％)的影响。抗体以5mg/kg每周3次给药，持续8周。抗体13C4用作对照。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于13C4，mAb1或mAb1 F16*p≤0.05；相较于WT 13C4，13C4#p≤0.05)。BV/TV(％)经由μCT成像测量。
图26显示mAb1和mAb1 F11在野生型小鼠中对BV/TV(％)的影响。抗体以5mg/kg每周3次给药，持续9周。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于13C4，mAb1或mAb1 F11*p≤0.05)。BV/TV(％)经由μCT成像测量。
图27显示接受单个腹膜内剂量的媒介物或荧光标记的mAb1或mAb1 F6后的野生型小鼠的腰椎中的总辐射效率。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1，mAb1 F6*p≤0.05)。
图28显示接受单个腹膜内剂量的媒介物或荧光标记的mAb1或mAb1 F6后的野生型小鼠的心脏中的总辐射效率。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1F6，mAb1*p≤0.05)。
图29显示接受单个腹膜内剂量的媒介物或荧光标记的mAb1或mAb1 F6后的野生型小鼠的肝脏中的总辐射效率。如通过单因素ANOVA测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1F6，mAb1*p≤0.05)。
图30显示接受单个腹膜内剂量的媒介物或荧光标记的mAb1或mAb1 F6后的野生型小鼠的肠中的总辐射效率。
图31显示接受单个腹膜内剂量的荧光标记的mAb2或mAb2D10后24小时或96小时的野生型小鼠的指示组织中的总辐射效率。如通过t检验测量的，观察到统计显著性(相较于mAb1 F6，mAb1*p≤0.05)。
图32显示接受单个腹膜内剂量的荧光标记的mAb2或mAb2 D10后24小时或96小时的野生型小鼠中的腰椎/血清总辐射效率比例。
图33显示接受单个腹膜内剂量的荧光标记的mAb2或mAb2 D10后24小时或96小时的野生型小鼠中的股骨/血清总辐射效率比例。如通过t检验测量的，观察到统计显著性(相较于mAb2，mAb2 D10*p≤0.05)。
发明详述
本发明提供抗体和其抗原结合片段，其与一个或多个靶向骨的聚-D肽连接，使得该抗体和片段优选地归巢至有此需要的患者中的骨。此类抗体或片段的靶向骨的特征允许该抗体和片段特异性靶向骨组织并降低该患者对于该抗体或片段的全身性暴露，从而增强该药物的功效同时将非想要的严重副作用降到最低。
如本文所用，术语“聚-D肽”是指具有多个天冬氨酸(aspartic acid)或天冬氨酸(aspartate)或“D”氨基酸诸如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、或更多个天冬氨酸氨基酸(残基)的肽序列。在一个实施方案中，聚-D肽可包含约2至约30个，或约3至约15个，或约4至约12个，或约5至约10个，或约6至约8个，或约7至约9个，或约8至约10个，或约9至约11个，或约12至约14个天冬氨酸残基。在一个实施方案中，聚-D肽仅包含天冬氨酸残基。在另一个实施方案中，聚-D肽可包含一个或多个其他氨基酸或相似化合物。如本文所用，术语“D10”是指10个天冬氨酸氨基酸的连续序列，如SEQ ID NO:1所示。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或多于12聚-D肽。
该聚-D肽可经由重组技术或化学缀合与感兴趣的抗体或抗原结合片段连接。如本文所用，术语“融合变体”或“变体”是指装配的抗体构建体(参见图9B)，其包括并入聚-D肽(诸如D10序列)或在其他方面与聚-D肽(诸如D10序列)相关联的重链或轻链或抗体片段或子部分中的至少一种。例如，聚-D肽可通过重组技术(例如，在该技术中聚-D肽序列与该重链、轻链、或抗体片段或子部分的氨基酸序列整合)、化学缀合或二者与融合变体中的抗体链连接。
如本文所用，术语“化学缀合物”是指装配的抗体，其包括重链或轻链或抗体片段或子部分中的至少一种，其中该重链或轻链或抗体片段或子部分通过与例如该重链、轻链、抗体片段、或子部分的氨基酸序列中存在的半胱氨酸残基的化学反应与一个或多个聚-D肽连接。可用于缀合的示例性半胱氨酸残基是重链铰链区中的半胱氨酸。适于缀合的半胱氨酸残基或其他残基还可通过诱变引入抗体链中。在缀合中，聚-D肽和抗体组成之间可使用间隔/接头(诸如肽接头)或化学部分(例如，马来酰亚胺官能团和聚乙二醇(PEG))。用于使期望的部分与抗体化学缀合的方法在本领域中是公知的。参见，例如，Behrens和Liu，mAbs6:1,46-53(2014)。
如本文所用，术语“整合”是指经由重组技术使聚-D肽与抗体链整合，使得该聚-D肽与该抗体链从同一RNA转录物转录且与该抗体链存在于同一多肽序列中。在此类情况中，在具有或不具有任何肽接头或氨基酸间隔的情况下，该聚-D肽可以在该抗体链的任一端或两端与该抗体链连接，或在不影响该抗体链的正确折叠、抗体分子的装配、或抗体与其抗原的结合的情况下，将该聚-D肽内部整合到该抗体链。
本发明的靶向骨的抗体的示例性形式在图9B中显示(形式F2-F20)。该靶向骨的肽(由圆圈表示)可附接至或融合至(例如，与其整合)该抗体的重链和/或轻链的任一端或两端。在一些实施方案中，该靶向骨的肽不通过轻链的N-端附接至轻链。该附接或融合可以是直接连接(即，无间隔或接头)，或通过间隔或接头(由波浪线表示；例如，肽接头)。这些形式的具体实例在下列的表1和7中显示。
本文中可使用任何合适的间隔或接头以通过例如重组技术或化学缀合将靶向骨的肽附接至感兴趣的抗体。例如，可使用具有1个、2个、3个、或更多个重复的G4S肽(SEQ IDNO:9)的肽接头。也可使用其他合适的肽接头。参见，例如，Chen等，Adv Drug Deliv Rev 65(10):1357-1369(2013)。
示例性靶向骨的抗体及其抗原结合片段
本发明公开了具有一个或多个与其附接的聚-D(聚-天冬氨酸或聚-Asp)肽(例如，D10序列)的抗体和抗原结合片段。这些经修饰的抗体和片段已经改善了对骨定位。在一个特定的实施方案中，如本文所述，这些抗体是抗TGFβ抗体。尽管不希望受理论束缚，但人们认为使用一个或多个聚-D肽而有效地将抗TGFβ抗体靶向至骨，可以为具有以与TGFβ相关联的病理生理骨退化为特征的疾病的个体提供新的疗法。
然而，虽然本文中的许多实施方案和实施例在使用α-TGFβ抗体和D10序列的背景下表达，但是可以预期适于治疗异常骨病况或骨疾病的其他抗体或蛋白可用如本文所述的靶向骨的部分修饰。例如，用于治疗骨质流失、刺激骨生长或靶向骨中的异常细胞(例如，癌细胞)的治疗性抗体可与如本文所述的一个或多个靶向骨的肽连接。该治疗性抗体可结合涉及骨形成或维持的蛋白或肽。进一步地，可以使用其他骨定位肽或靶向骨的肽。
如本文所用，术语“α-TGFβ抗体”和“抗TGFβ抗体”可互换地使用，且是指对TGFβ1、TGFβ2、和/或TGFβ3特异的抗体或其抗原结合片段。例如，α-TGFβ抗体或其抗原结合片段的至少一个抗原结合位点(或互补位)结合在人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3上发现的表位。
在一个实施方案中，预期的α-TGFβ抗体-D10构建体可通过化学缀合创建。例如，化学缀合可通过本领域已知的方法进行，诸如美国专利号7,763,712、4,671,958、和4,867,973中所公开的方法，其中每个专利通过提述并入。在另一实施例中，肽或其他接头可用于使D10肽附接至抗体(参见图1和2)。在进一步的实施方案中，抗体的铰链区处的巯基的还原(例如，铰链区半胱氨酸残基)允许使用PEG间隔进行聚-D肽的化学缀合。相似地，预期的抗体和抗体片段的其他半胱氨酸残基(其对该抗体和片段是天然的或通过诱变引入的)可以与聚-D肽化学缀合。图2中示例性说明了与D10肽化学缀合的α-TGFβ抗体的一个此类预期装配方案。
在另一实施方案中，预期的α-TGFβ抗体-D10构建体可通过重组表达创建，其中将该D10序列添加至该α-TGFβ抗体的重链和/或轻链的氨基酸序列。例如，编码该重和/或轻链的氨基酸序列的核酸序列可经修饰以编码D10序列，该D10序列将会在该α-TGFβ抗体的重和/或轻链的N-末端处、C-末端处、或在N-末端和C-末端两处表达。相似地，可将一个或多个D10序列添加至在铰链区处或附近的抗体重链的氨基酸序列和/或抗体轻链的氨基酸序列内。可以将携带D10的重和/或轻链的每个核酸序列并入表达载体中且随后转染至能够使该核酸序列表达和翻译成相应氨基酸序列的宿主细胞。而且，该宿主细胞能够通过使每个重链和轻链与其互补序列结合来使表达氨基酸序列装配成功能蛋白以形成α-TGFβ抗体-D10构建体。图9A和9B中说明了预期的重组α-TGFβ抗体-D10融合变体的实例。
尽管本文中讨论了聚-D肽，但也可使用其他相似肽来使抗体、其他蛋白、或肽能够靶向骨。例如，天冬氨酸重复序列可具有比D10序列更多或更少的残基，诸如约2个、或约4个、或约6个、或约8个、或约12个、或约14个或约16个，或约18个、或约20个、或约30个、或6个、7个、8个、9个、10个或11个残基等。进一步地，具有相似化学性质的其他天然氨基酸(诸如谷氨酸)或非天然氨基酸和/或其他化学等同的化合物也可替代天冬氨酸或与天冬氨酸组合使用。
在一个实施方案中，预期的是相较于不具有一个或多个聚-D肽的相同抗体，具有一个或多个与其附接的聚-D肽的抗体将会表现出对骨定位的至少约2倍、或约3倍、或约5倍、或约10倍、或约20倍增加。
此外，尽管本文中描述了α-TGFβ抗体，但是结合涉及骨形成或骨维持的其他蛋白的任何抗体可根据需要经相似地修饰以使该抗体靶向骨。本文预期的抗体或其抗原结合片段可来自任何物种或代表组合来自不同物种的重链和轻链的杂交抗体，且可对任何期望的表位有特异性。此外，本文可使用的抗体不受同种型限制，且可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE、或IgD中的任一种。也可使用抗体片段。例如，可使D10序列或其他靶向骨的化合物附接至Fab和/或Fc片段或任何其他抗体片段以取得本文所述的期望的结果。进一步地，可使D10序列附接至scFv片段和其他相似的融合蛋白。在另一实施方案中，可使D10序列附接至具有S228P核心铰链突变的抗体(根据EU编号系统编号；或者是根据Kabat系统的S241P；参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed.,United States Government Printing Office,165–492(1987)；和Silva等Jour.Biol.Chem.290:5462-5469(2015))。
在进一步的实施方案中，本文预期的抗体和/或其他蛋白可以与额外的分子缀合。例如，本文预期的抗体或其他蛋白可以与化学标签缀合，该化学标签当其注射进或以其他方式引入至受试者中时允许示踪抗体/蛋白。例如，放射标记、荧光化合物等可附接至抗体/蛋白以帮助其体内示踪。进一步地，本文预期的抗体和/或其他蛋白还可与具有治疗作用的额外化合物(诸如小分子、药物、抗肿瘤药剂、生长激素、维生素等)缀合，使得该抗体和/或其他蛋白可作为一个或多个此类化合物的载体。
在一些实施方案中，该靶向骨的抗TGFβ抗体包含包含SEQ ID NO:2、3、4、和5中的任一个中所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:6、7、8、11、和12中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:6时，该重链氨基酸序列不是SEQ ID NO:2。示例性抗体是mAb1 F3、mAb1 F4、mAb1 F5、mAb1 F6、mAb1 F8、mAb1 F9、mAb1 F10、mAb1 F11、mAb1 F13、mAb1 F14、mAb1 F15、mAb1 F16、mAb1 F18、mAb1F19和mAb1F20(表1)。
在其他实施方案中，该靶向骨的抗TGFβ抗体包含包含SEQ ID NO:13、14、16、和17中的任一个中所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:15、18、19、20、21、和22中的任一个中所示的氨基酸序列的轻链，条件是当该轻链氨基酸序列是SEQ ID NO:15时，该重链氨基酸序列不是SEQ ID NO:13。示例性抗体是mAb2 F3、mAb2 F4、mAb2 F5、mAb2 F6、mAb2F8、mAb2F9、mAb2 F10、mAb2 F11、mAb2 F13、mAb2 F14、mAb2 F15、mAb2 F16、mAb2 F18、mAb2F19和mAb2 F20(表7)。
在一些实施方案中，本发明的抗体(诸如该抗TGFβ抗体)在重链中不具有C-末端赖氨酸。该C-末端赖氨酸在制造期间或通过重组技术(即，该重链的编码序列不包含C-末端赖氨酸的密码子)被去除。因此，在本发明内预期的是包含不具有C-末端赖氨酸的SEQ ID NO:2或13的重链氨基酸序列的抗体。聚-D肽可附接至具有或不具有C-末端赖氨酸的重链的C-末端。
治疗方法
在一个特定的实施方案中，治疗与TGFβ相关联的骨质流失的个体诸如人患者的方法包括施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗体至该个体。该方法可进一步包括测量或检测TGFβ水平或活性的降低、骨质流失或骨质流失速率的降低、骨密度的增加，和/或骨强度的增加的步骤。
如本文所用，“有效量”是指当被施用至有需要的个体时改善该个体的健康的治疗剂(诸如α-TGFβ抗体或抗体片段)的量，该善该个体的健康诸如，例如，通过降低与骨相关联的TGFβ水平或活性、降低骨质流失或骨质流失速率，增加骨密度和/或增加骨强度改善该个体的健康。
如本文所用，术语“个体”是指动物。个体的实例包括，不限于，人、家养的动物、家庭宠物、和其他动物。个体的进一步实例包括具有与TGFβ相关联的骨疾病的动物。
在另一实施方案中，预期含有一种或多种靶向骨的抗TGFβ抗体(诸如化学缀合物或重组融合变体)的包括水性液体药物产品配制剂和冻干药物产品配制剂在内的药物抗体配制剂或组合物。可以如美国专利申请公开号US 2014/0286933 A9中所述的或如本领域已知的其他方式配制包含靶向骨的抗TGFβ抗体和/或抗体片段的药物组合物，该专利申请通过提述并入本文。
在一个特定的实施方案中，用于治疗骨疾病的方法包括施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗体至具有骨疾病的个体，该骨疾病诸如与慢性肾病相关联的骨疾病、转移至骨的癌症、或异常代谢病况。在其他特定的实施方案中，用于治疗成骨不全的方法包括施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗体至具有成骨不全的个体。在又一特定的实施方案中，用于治疗骨质疏松的方法包括施用有效量的靶向骨的抗TGFβ抗体至具有骨质疏松的个体。
在一些实施方案中，在本发明的治疗方法中使用的靶向骨的抗体和其他成分可以在试剂盒或制品中提供。
制造抗体的方法
本发明的抗体或片段可通过本领域充分建立的方法制造。编码该抗体的重和轻链的DNA序列可插入至表达载体中，使得该基因可操作地连接至必需的表达控制序列，诸如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒(诸如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。抗体轻链编码序列和抗体重链编码序列可插入至分开的载体中，且可操作地连接至相同的或不同的表达控制序列(例如，启动子)。在一个实施方案中，两种编码序列被插入至同一表达载体中，且可操作地连接至同一表达控制序列(例如，常用启动子)，连接至分开的相同的表达控制序列(例如，启动子)，或连接至不同表达控制序列(例如，启动子)。抗体编码序列可通过标准方法(例如，连接抗体基因片段上的互补限制性位点与载体上的互补限制性位点，或如果不存在限制性位点则是平末端连接)被插入至表达载体中。
除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列的实例包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，诸如启动子和/或增强子，其衍生自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(诸如CMV启动子/增强子)、猴肾病毒40(SV40)(诸如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤和强哺乳动物启动子诸如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。
除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可携带额外的序列，诸如调控该载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起始位点)和选择性标记基因。例如，该选择性标记基因赋予已引入了该载体的宿主细胞对药物(诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择性标记基因可包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(供在具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)、和谷氨酸合成酶基因。
将编码本发明的抗体的表达载体导入宿主细胞用于表达。在适于表达该抗体的条件下培养该宿主细胞，然后收集并分离该抗体。宿主细胞包括哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，包括可从美国模式培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生细胞系。这些细胞系包括，尤其是，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293 Freestyle细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、A549细胞，和许多其他细胞系。细胞系可基于其表达水平进行选择。可使用的其他细胞系是昆虫细胞系，诸如Sf9或Sf21细胞。
进一步地，可使用许多已知的技术增强抗体的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于增强在某些条件下的表达的常用方法。
用于宿主细胞的组织培养基可包括，或不含，来自动物的成分(ADC)，诸如牛血清白蛋白。在一些实施方案中，对于人安全性，优选无ADC的培养基。可使用补料分批方法、连续灌注方法、或适于宿主细胞和期望产率的任何其他方法进行组织培养。
药物组合物
本发明的抗体可经配制以获得合适的储存稳定性。例如，可使用药学上可接受的赋形剂将该抗体经冻干或储存或重构以供使用。对于组合疗法，两种或更多种治疗剂诸如抗体可共配制，例如，在单个组合物中混合并提供。
术语“赋形剂”或“载体”可在本文中用于描述除本发明的化合物外的任何成分。赋形剂的选择在很大程度上取决于下列因素，诸如施用的特定方式、赋形剂对溶解性和稳定性的作用、和剂型的性质。“药学上可接受的赋形剂”包括生理上相容的任何或所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在一些方面中，等渗剂，例如，糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠将会包含在组合物中。药学上可接受的物质的额外的实例是润湿剂或少量的辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其可增强抗体的保质期或有效性。
本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量，或作为多份单个单位剂量成批制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的分散量。该活性成分的量通常等于被施用至受试者的活性成分的剂量或此类剂量的适宜部分，诸如，例如，此类剂量的二分之一或三分之一。
本发明的药物组合物通常适于胃肠外施用。如本文所用，药物组合物的“胃肠外施用”包括以物理破坏受试者的组织并通过组织中的破口施用药物组合物为特征的任何途径的施用，因此该特征通常导致直接施用至血流、至肌肉、或至内部器官中。因此，胃肠外施用包括，但不限于，通过注射药物组合物施用该组合物、通过手术切口应用该组合物、通过穿透组织的非手术伤口应用该组合物等。特别地，预期胃肠外施用包括，但不限于，皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、瘤内、和滑膜内注射或输注；和肾透析输注技术。还预期局部灌注。优选的实施方案可包括静脉内和皮下途径。
药物组合物的适于胃肠外施用的配制剂通常包含与药学上可接受的载体组合的活性成分，诸如无菌水或无菌等渗盐水。此类配制剂可以以适于推注施用或连续施用的形式进行制备、包装或销售。可注射的配制剂以单位剂型(诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中)进行制备、包装或销售。用于胃肠外施用的配制剂包括，但不限于，混悬液、溶液、油中或水性媒介物中的乳剂、糊剂等。此类配制剂可进一步包含一种或多种额外的成分，该成分包括，但不限于，混悬剂、稳定剂、或分散剂。在用于胃肠外施用的配制剂的一个实施方案中，该活性成分以干燥形式提供(即，粉末或颗粒)用于在胃肠外施用重构的组合物之前与合适的媒介物(例如，无菌无热源水)重构。胃肠外配制剂还包括水性溶液，其可含有赋形剂诸如盐、碳水合物和缓冲剂(例如，pH为3至9)，但是，对于一些应用，它们可以更适合地配制成无菌非水性溶液或配制成干燥形式以连同合适的媒介物(诸如无菌、无热源水)一起使用。示例性胃肠外施用形式包括溶液或混悬液的无菌水性溶液，例如，丙二醇水溶液或右旋糖水溶液。如果需要的话，此类剂型可适合地被缓冲。其他有用的可胃肠外施用的配制剂包括包含微晶形式或脂质体制剂的活性成分的配制剂。用于胃肠外施用的配制剂可配制成速释或缓释。缓释配制剂包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控释放。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可以以40、20、或15mg/kg或更少(诸如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1mg/kg)施用。在一些进一步的实施方案中，该剂量可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、或0.5mg/kg。给药频率可以是，例如，每日、每两天、三天、四天或五天、每周一次、每两周一次或每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每十二个月一次，或根据需要。该抗体可通过静脉内(例如，在0.5-8小时内静脉内输注)、皮下、肌内或适用于该病况和该药物配制剂的任何其他施用途径施用。
示例性实施方案
以下描述了本发明的进一步特定的实施方案。
1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含重链、轻链、和一个或多个与(i)该重链,(ii)与该轻链的C-末端，或(iii)(i)和(ii)二者连接的聚-天冬氨酸(聚-D)肽。
2.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其中该一个或多个聚-D肽通过化学缀合与该抗体或抗原结合片段连接。
3.实施方案2的抗体或抗原结合片段，其中该一个或多个聚-D肽在铰链区与该重链缀合。
4.实施方案2或3的抗体或抗原结合片段，其中该一个或多个聚-D肽通过聚乙二醇(PEG)间隔与该抗体或抗原结合片段缀合。
5.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其包含与该重链或该轻链的氨基酸序列整合的聚-D肽。
6.实施方案5的抗体或抗原结合片段，其包含与该重链的N-末端整合的聚-D肽。
7.实施方案5的抗体或抗原结合片段，其包含与该重链的C-末端整合的聚-D肽。
8.实施方案5的抗体或抗原结合片段，其包含与该重链的N-末端整合的第一聚-D肽和与该重链的C-末端整合的第二聚-D肽。
9.实施方案5-8中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含与该轻链的C-末端整合的聚-D肽。
10.实施方案5-9中任一项的抗体或抗原结合片段，其中该一个或多个聚-D肽经由肽接头与该重链或轻链融合。
11.实施方案10的抗体或抗原结合片段，其中该肽接头包含1-3个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:9)。
12.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其中该一个或多个聚-D肽各自独立地包含2至30个天冬氨酸残基。
13.实施方案12的抗体或抗原结合片段，其中该一个或多个聚-D肽各自包含10个天冬氨酸残基(SEQ ID NO:1)。
14.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是IgG。
15.实施方案15的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是IgG1或IgG4。
16.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段特异性结合TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3中的一种或多种。
17.实施方案16的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含SEQ ID NO:13中的重链互补决定区(CDR)1-3和SEQ ID NO:15中的轻链CDR1-3。
18.实施方案17的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含对应于SED ID NO:13的残基1-120的重链可变域(VH)氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:15的残基1-108的轻链可变域(VL)氨基酸序列。
19.实施方案17或18的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含人IgG4恒定区，该人IgG4恒定区在位置228处(EU编号)具有脯氨酸。
20.实施方案19的抗体或抗原结合片段，其中该抗体的重链包含具有或不具有重链C末端赖氨酸的SEQ ID NO:13的氨基酸序列，且该抗体的轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
21.实施方案17的抗体，其中该重链包含具有或不具有重链C末端赖氨酸的SEQ IDNO:13、具有或不具有紧接C末端D10序列之前的赖氨酸的SEQ ID NO:14、具有或不具有重链C末端赖氨酸的SEQ ID NO:16、或具有或不具有紧接C末端D10序列之前的赖氨酸的SEQ IDNO:17的氨基酸序列，且该轻链包含SEQ ID NO:15、19、21或22的氨基酸序列。
22.实施方案16的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是小鼠抗体1D11，该抗体具有具有或不具有C末端赖氨酸的SEQ ID NO:2的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:6的轻链氨基酸序列。
23.一种IgG4抗体，其结合人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，其中该抗体的重链包含(具有或不具有紧接C末端D10序列之前的赖氨酸的)SEQ ID NO:14的氨基酸序列，且轻链包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
24.一种IgG4抗体，其结合人TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3，其中该抗体的重链包含(具有或不具有紧接C末端D10序列之前的赖氨酸的)SEQ ID NO:17的氨基酸序列，且轻链包含SEQID NO:15的氨基酸序列。
25.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其中相较于具有相同重链和轻链但缺少该一个或多个聚-D肽的抗体，该抗体或抗原结合片段表现出对骨的定位的至少2倍增加。
26.一种药物组合物，其包含前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
27.一种用于治疗具有骨病况的个体的方法，该治疗受益于TGFβ的抑制，该方法包括向该个体施用有效量的实施方案16-25中任一项的抗TGFβ抗体或抗原结合片段。
28.实施方案27的方法，进一步包括检测以下中的至少一个：(1)TGFβ水平的降低，(2)TGFβ活性的降低，(3)骨质流失的降低，(4)骨质流失的速率的降低，(5)骨密度的增加，(6)骨强度的增加，和(7)IL-11水平的降低。
29.实施方案16-25中任一项的抗体或抗原结合片段共在治疗具有骨病况的个体中使用，该治疗受益于TGFβ的抑制。
30.实施方案16-25中任一项的抗体或抗原结合片段用于制备用于治疗具有骨病况的个体的药物的用途，该治疗受益于TGFβ的抑制。
31.实施方案27的方法，实施方案29的抗体或抗原结合片段供使用，或实施方案30的用途，其中该个体是人。
32.实施方案31的方法、抗体或抗原结合片段供使用、或用途，其中该人具有成骨不全。
33.实施方案31的方法、抗体或抗原结合片段供使用、或用途，其中该人具有骨质流失或骨质疏松。
34.实施方案31的方法、抗体或抗原结合片段供使用、或用途，其中该人具有慢性肾病。
35.实施方案31的方法、抗体或抗原结合片段供使用、或用途，其中该人是具有骨转移的癌症患者。
36.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案1-25中任一项的抗体或抗原结合片段的重链、轻链、或二者的核苷酸序列。
37.一种表达载体，其包含实施方案36的分离的核酸分子。
38.一种宿主细胞，其包含实施方案37的表达载体。
39.实施方案38的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。
40.一种产生实施方案1-25中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括：
提供包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的宿主细胞，该第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别编码该抗体或抗原结合片段的重链和轻链，
在允许产生该抗体或抗原结合片段的条件下使该宿主细胞生长，和
回收该抗体或抗原结合片段。
41.实施方案40的方法，其中该第一核苷酸序列包含(具有或不具有重链C末端赖氨酸密码子的)SEQ ID NO:23、24、25、或26，且该第二核苷酸序列包含SEQ ID NO:27、29、31、或32。
42.一种产生的靶向骨的抗体或抗原结合片段的方法，其包括：
提供抗体或其抗原结合片段和一个或多个聚-D肽，和
通过化学缀合使聚-D肽通过共价键附接至该抗体。
43.实施方案40-42中任一项的方法，其进一步包括将该抗体或抗原结合片段配制为包含药学上可接受的载体的药物组合物。
44.一种产生靶向骨的药物组合物的方法，其包括：
提供实施方案1-25中任一项的抗体或抗原结合片段，和
使该抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体混合。
将在以下实施例中进一步描述本发明，以下实施例并不限制权利要求书中记载的本发明的范围。
实施例
下列实施例示例性说明本发明的具体实施方案及其多种用途。它们仅出于解释目的而提出，不应视为对本发明的限制。
TGFβ抗体
第一抗TGFβ抗体，本文中被称为mAb1，是对人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3特异(“泛特异”)的小鼠IgG1单克隆抗体，且可从R&D系统(克隆#1D11，Minneapolis，MN)获得。该mAb1抗体在实施例中用作模板。
实施例中使用的第二个抗TGFβ抗体，本文中被称为mAb2，是具有铰链突变S228P(EU编号)的人抗TGFβIgG4抗体。该mAb2抗体与通过提述并入的美国专利号9,090,685中公开的抗体相似。当未经糖基化时，抗体mAb2的估计分子量为144KD。其重链和轻链氨基酸序列分别是SEQ ID NO:13和15。这两个序列如下显示。可变域用斜体表示，且在本文中被称为重链可变域(HCVD，SEQ ID NO:39)和轻链可变域(LCVD，SEQ ID NO:40)。CDR在框中显示且称为重链互补决定区1(HCDR1，SEQ ID NO:33)；HCDR2(SEQ ID NO:34)；和HCDR3(SEQ IDNO:35)，和轻链互补决定区1(LCDR1，SEQ ID NO:36)；LCDR2(SEQ ID NO:37)；和LCDR3(SEQID NO:38)。该重链的恒定域中的糖基化位点以粗体表示(N297)。
如本文所述，可以使用结合涉及骨形成或骨维持的蛋白的其他抗体、抗体片段、蛋白质或肽。
实施例1：D10肽与mAb1α-TGFβ抗体的化学缀合物的制备
α-TGFβ抗体mAb1的D10肽化学缀合物以图2中描述的方式制备。通过在Ultra 50kDa MWCO离心过滤器(EMD Millipore)上的三轮超滤，将mAb1(2.0mg)交换到脱气的硼酸盐缓冲液(25mM氯化钠、1mM DTPA、20mM硼酸钠pH 8.0)中。然后，用12mol:mol二硫苏糖醇(DTT)每mAb在37℃还原铰链区二硫化物2小时。在4mL/>超滤器上用脱气的硼酸盐缓冲液使产物脱盐。等分试样(1nmol，150μg)在25℃与增加量的(1-15mol:mol)的D10-马来酰亚胺肽(Ac-D10-C2-PEG12-C6-马来酰亚胺，其中PEG12由确定长度的含有12个环氧乙烷基的PEG组成)反应。1.5小时后，通过加入12当量的N-乙基马来酰亚胺，然后孵育1.5小时来封闭剩余未反应的巯基。产物通过超滤来脱盐。图3A描绘了0.5μg的每种产物在4-12％NuPAGE凝胶上用SimplyBlueTM(Thermo Scientific)染色并通过/>近红外扫描仪(LiCor)成像的SDS-PAGE。使用AlphaView软件(ProteinSimple Corp.)和测定的肽与抗体比例(PAR)整合泳道荧光图谱。假设每条重链或轻链的迁移率的小变化代表单个D10肽的添加，这与重链的5个可鉴定的条带的最大值和轻链的1个可鉴定的条带的最大值一致，且匹配每条链的铰链区的半胱氨酸的数目。重链和轻链上肽的平均数量分别由每个小带的相对丰度乘以其指定肽数量的乘积之和计算。PAR由重链和轻链的肽数量之和乘以2计算，因为每条链在整个IgG中出现两次。PAR值与化学缀合反应中的肽-马来酰亚胺:mAb比例的关系在图3B中描绘，其显示随着缀合的肽的数目增加，PAR线性增加，直至8mol:mol。
实施例2：mAb1-D10化学缀合物与TGF-β1的结合
在此实施例中，一组不同PAR的化学缀合物以与实施例1中所述相同的方式制备，不同之处为DTT的比例在8-10mol:mol之间变化，且马来酰亚胺-肽:mAb为3或15mol:mol。作为对照，人IgG1化学缀合物通过以下制备：在氩气下在37℃用3mol:mol三羟甲基氨基甲烷(2-羧基乙基膦)(TCEP)还原其铰链二硫化物2小时，随后在25℃与15mol:mol马来酰亚胺-肽反应过夜，且通过使用超滤脱盐而纯化。
为了评定其结合TGF-β1的能力，该化学缀合物以1:1摩尔比例与TGF-β1混合，随后在pH 7.2的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的Superdex 200(G.E.Healthcare)上进行尺寸排阻色谱。如图4A中显示的，仅mAb1-D10化学缀合物产生一些早于未经修饰的mAb1的异构峰洗脱，这可能是由于缀合的肽产生的电荷作用。添加TGF-β1至该缀合物产生比mAb1或mAb1-D10化学缀合物更早的洗脱峰，这指示更高分子量复合物的形成(图4B)。相似地，添加TGF-β1至未经修饰的mAb1抗体产生向更早的保留时间的移动(图4C、4D)。相反地，尽管D10与的化学缀合导致单独该抗体的保留时间与mAb1缀合物一样发生移动(图4E、4F)，但添加TGF-β1(1mol:mol)至/>-D10缀合物未能产生其洗脱时间或明显MW的变化(图4F、4G)，这指示与缀合物的结合不是作为缀合的结果而发生的。
实施例3：mAb1-D10化学缀合物与羟磷灰石的肽依赖性结合
在此实施方案中，D10与mAb1的化学缀合物(诸如图2中所示的)通过以下制备：在37℃在pH 8的25mM NaCl、1mM DTPA、20mM硼酸钠中用12当量DTT还原铰链区二硫化物2小时，随后与2mol:mol 2,2’-二硫二吡啶(Sigma)反应以将一部分游离巯基返回为二硫化物。随后与实施例1中所述的D10-马来酰亚胺肽反应。通过超滤纯化最终产物。在旋转柱上将一部分(25μg)交换到pH 7.4的5mM磷酸钠中，且在100μL柱的II型陶瓷羟磷灰石(CHT)(BioRad)上进行色谱法分析，且以0.5mL/分钟的流速用pH 7.4 5-500mM磷酸钠的梯度洗脱。未经修饰的mAb1用作对照。A280柱谱图在图5A中描绘。mAb1显示仅微量结合该柱，而约一半的该缀合物被结合并在约0.2M磷酸盐被洗脱。浓缩级分并通过SDS-PAGE分析(图5B)。未结合的(流穿液或“FT”)级分显示大部分未经修饰的mAb，而主峰4含有缀合物，通过SDS-PAGE评估该缀合物的PAR为6。
实施例4：一系列肽加载对结合羟磷灰石的影响
在此实施例中，实施例1中所述的一系列具有不同数目的肽的D10肽化学缀合物如实施例3中所述的在II型CHT上进行色谱分析。在图6A中显示了A280谱图和结合的缀合物的级分图和峰值保留时间。如图6B中所见，结合到柱上的缀合物的量增加直至PAR 3.8，趋于平稳，且随着更大数目的肽开始降低。相反地，随着肽的数目增加直至9，缀合物与树脂的保留时间(指示相互作用的强度)增加。
实施例5:D10肽与mAb1的化学缀合对mAb1在体外中和TGF-β1的效能的影响
在此实施例中，如实施例1中所述制备一组三种mAb1-D10缀合物(诸如图2中所示)。通过在缀合期间去掉D10-马来酰亚胺肽制备对照缀合物。通过SDS-PAGE分析，诸如图3中描绘的，这三种缀合物的肽加载(PAR)经测定为0、5或9。然后，这些缀合物使TGF-β1失活的能力通过与TGF-β1共孵育1小时来测定。然后，将生长培养基中的系列稀释应用于表达人TGF-β1受体的人A549细胞，随后过夜孵育。然后，通过IL-11的释放到生长培养基中(其通过对IL-11特异的ELISA测定法检测)来测定对活性TGF-β1的细胞应答。在图7中描绘了该三种缀合物和mAb1对照的IL-11应答。在所有情况中，IL-11释放的半数最大抑制(EC50)发生在0.1nM抗体附近。两种缀合物(PAR＝5和PAR＝9)和缺乏肽的模拟缀合物(PAR＝0)显示出比mAb1稍好的抑制。缀合的肽的数目对EC50无影响。
实施例6：缀合的D10肽对施用至小鼠的mAb1的生物分布的影响
D10-mAb1化学缀合物以与实施例1中所述相似的方式制备，诸如图2中所示的。将mAb1(19.6mg)交换至脱气的硼酸钠中，在37℃与10.6当量(1.06μmol)DTT反应1.5小时，随后在没有缓冲液交换的情况下在氩气下在25℃与6当量D10肽(Ac-D10-C2-PEG12-C6-马来酰亚胺)反应1.5小时。通过加入12当量N-乙基马来酰亚胺然后在25℃孵育30分钟，封闭未缀合的游离巯基。通过超滤纯化最终产物。使用SDS-PAGE测定肽与抗体的比率(PAR～4.8)。轻链显示痕量的对应于添加单个肽至轻链半胱氨酸残基的条带。
该缀合物和mAb1抗体对照分别地用750(Thermo Fisher)使用如制造商描述的条件标记。将荧光测试品施用至SKH-1无毛小鼠，该小鼠在施用后立即(0.3-1小时)，和施用后4小时和1、2、3、4、7、8和9天用IVIS仪器(Perkin Elmer)进行成像。图8A中描绘了用1mg/kg标记的mAb1和缀合物注射的小鼠的图像。标记的mAb1的荧光在全身中是均匀分布的，且此模式在9天内保持不变但强度降低。相反地，1天后，mAb1-D10缀合物在背侧中线、四肢和尾部处或附近浓缩，但在体内其他地方几乎检测不到。与图8A的图像一致，相较于对照，mAb1-D10缀合物的在图8A的图像中测量的远端股骨荧光与心脏荧光的比率在24小时内显著升高(P<0.05)，且在整个168小时内保持显著升高(参见图8B)。此分布在9天内保持不变，仅有微小的强度变化。
实施例7：重组鼠抗TGFβ-D10抗体融合变体的制备
如以下所述制备如图9A和9B中描绘的一组重组抗TGFβ-D10肽融合变体。
重链和轻链表达载体构建体
生成一组用于表达在多个位点处具有D10肽的mAb1重链和轻链的质粒。此外，还生成用于不具有D10肽的野生型mAb1重链和轻链的两种质粒。所有密码子优化的序列经合成生成(GeneArt)，侧翼是出于克隆目的在框架中(in-frame)设计的合适的限制性酶切位点。使用ApaLI/HindIII限制酶和随后的连接，将编码具有或不具有C-末端D10肽的小鼠IgG1恒定区和mAb1野生型完整轻链的三个基因片段克隆至空的附加型哺乳动物表达载体pFF(该载体是Durocher等,(2002,Nucl.Acids Res.30(2):E9)描述的pTT载体的类似物)以产生“mIgG1_CH123_pFF”、“mIgG1_CH123D10_pFF”和“mAb1_VLCL_pFF”。使用用于重链的ApaLI/EagI和用于轻链的ApaLI/MfeI，将编码具有或不具有N-末端D10肽的可变区的基因片段克隆至该载体。使用MfeI/HindIII将编码小鼠Igκ轻链的恒定区的具有C-末端D10和不同长度的G4S(SEQ ID NO:9)间隔的基因片段克隆至“mAb1_VLCL_pFF”中，以代替野生型恒定区。通过DNA测序(ACGT，Inc.)确认每个构建体的预期正确的DNA序列。
融合变体装配和表达
通过选择重链和轻链载体每个中的一种进行共转染来产生融合变体，以便产生如表1中所述的融合变体和无肽对照。“PAR”(肽与抗体比例)反映了预期附加到最终表达的抗体的重链和轻链二者上的肽的总数目。融合变体ID“mAb1 F1”代表“野生型”(“wt”)构建体，其与不具有修饰的mAb1序列基本相同。“HC”指示mAb1的重链，“LC”指示mAb1的轻链，“D10”指示D10肽(SEQ ID NO:1)，且“G4S”指示由在一些构建体中并入的由gly-gly-gly-gly-ser(SEQ ID NO:9)组成的间隔序列。
表1.mAb1与D10的重组融合变体
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为了评定期望的重组融合变体的表达能力，通过使用制造商描述的条件共转染至Expi293FTM细胞(Life Technologies)中来评估表1的16种变体。4天后，通过条件培养基的SDS-PAGE来测定表达。所有变体均以估计在10-30μg/mL之间的水平表达。在5天后和7天后，观察到略高的水平，但表达水平取决于变体。WT(mAb1 F1)、HC-D10:LC-D10(mAb1 F8)、和HC-D10:LC-G4S-D10(mAb1 F9)显示特别高的表达，而D10-HC:D10-LC(mAb1 F12)表达弱。
大规模表达
所有20种重组mAb1-D10融合变体在Expi293-F中以30mL规模表达。在第6天收获条件培养基(CM)，且通过非还原性SDS-PAGE评定表达水平。相较于初始评定，观察到稍高水平的表达(30-150μg/ml)，但相对表达水平与较小规模转染一致。
实施例8：重组mAb1-D10融合变体的特征描述
表达水平和TGF-β1结合
使用QK384评定重组mAb1-D10融合变体表达水平的定量和重组mAb1-D10融合变体结合TGF-β1的能力。将用于鼠IgG的/>生物传感器浸入用样品稀释液(PBS，pH7.4含有0.01％BSA和0.02％吐温20)1:10稀释的条件培养基中或2倍连续稀释的范围为1.25至100μg/mL的纯化mAb1标准品。收集结合数据2分钟，同时以500rpm摇动样品。使用初始结合率的4-参数拟合以及与从标准品获得的滴度的比较，计算滴度。然后，结合之后，用稀释液洗涤生物传感器1分钟以去除任何培养基并重建基线，然后以1000rpm浸入至含有40nM TGF-β1的孔中持续3分钟。然后通过以1000rpm将传感器转移至稀释液持续3分钟进行解离步骤。如表2所见，培养基中融合变体的浓度范围为11至178μg/mL(“Octet Conc.”)且通常匹配通过SDS-PAGE(“表达水平”)观察到的趋势。此外，所有融合变体能够结合TGF-β1，这表明在指示的任何位置处的D10肽的存在并不严重影响抗原的结合。
小鼠FcRn结合
使用Octet QK384评定重组mAb1-D10融合变体与小鼠FcRn的结合。所有步骤均以1000rpm进行。通过抗鼠IgG Fv生物传感器接触经稀释以达到10μg/mL的抗体浓度的条件培养基5分钟。然后，将生物传感器浸入PBSP pH 6.0(50mM磷酸钠pH 6.0，150mM氯化钠，0.005％表面活性剂P20)中以建立基线。然后，将生物传感器转移至含有在PBSP pH 6.0中稀释至1μM的可溶性小鼠FcRn的孔中持续3分钟，随后在含有PBSP pH 6.0的孔中解离3分钟。如表2中表明的，所有变体均结合小鼠FcRn。
蛋白G结合
使用Octet QK384评定重组mAb1-D10融合变体与蛋白G的结合。将蛋白G生物传感器浸入至含有在样品稀释液中稀释至10μg/mL抗体的条件培养基的孔中，并在1000rpm下跟踪信号3分钟。如表2中指示的，所有的变体均结合蛋白G。
表2 mAb1-D10融合变体的特征描述
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SDS-PAGE
纯化的WT构建体和重组融合变体mAb1 F2、mAb1 F6、mAb1 F7、mAb1 F11、mAb1F12、mAb1 F16和mAb1 F17在还原和非还原条件下4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Novex，Life Sciences)上进行分析并用考马斯亮蓝染色。由成像仪收集的可见光图像在图10中描绘。观察到重和/或轻链的迁移率的小幅降低，这与每条链上的D10肽的预期的存在和数目匹配。未检测到杂质和共价聚集体。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)测定的热稳定性
通过使用橙(Thermo Scientific)作为报告染料的差示扫描荧光测定法测定一些重组mAb1-D10融合变体的热稳定性，这些融合变体代表D10肽在重和轻链上的末端处的所有可能的组合。通常认为蛋白质在较高温度下的稳定性可预测其在典型储存条件下的稳定性，因此可用于评定它们是否适于制造和用作治疗剂。可以使用染料评估热稳定性，所述染料在结合由于蛋白质结构的打开而暴露的疏水区域时在实时PCR仪器上表现出荧光增加(Lo等，2004，Anal.Biochem.332(1):153-9)。在CFX96实时PCR检测系统上升高温度的同时，跟踪含有1:1000稀释的/>橙的样品(10μL的0.5mg/ml蛋白)的荧光。使用CFX管理器3.0(Bio-Rad Laboratories)分析数据。图11描绘了几种变体的荧光随温度的变化率。通常使用变化率而不是绝对荧光，以分出染料与蛋白质结构中不受结构转变影响的部分的结合。负位移反映荧光变化率的增加，最小值代表向未折叠的状态过渡的中点(“Tm”)。测试的几种变体(mAb1 F6、mAb1 F11、mAb1 F16)显示出与未修饰的抗体对照(“WT”＝mAb1 F1)无法区分的Tm图。其他两种变体(mAb1 F2和mAb1 F7)显示出主要转变的Tm的显著降低。两种变体(mAb1 F12和mAb1 F17)显示最低的Tm值。值得注意的是，在轻链的N-末端处含有D10肽的所有四种重组mAb1-D10融合变体显示出Tm的显著降低，这表明将肽置于mAb1抗体上的此位置处使其结构不稳定。相反地，将D10肽置于重链的任一末端上与Tm的任何变化不相关。如图11中所示观察到的几种融合变体的主要转变的Tm值列于表3中。
表3表达的重组融合变体的差示扫描荧光测定
A参见表2；BmAb1 F1是mAb1的重组形式。
实施例9：重组mAb1-D10融合变体在体外中和TGF-β1的效能
通过响应于添加至培养基的TGF-β1，在体外A549肿瘤细胞分泌IL-11的抑制，来测定重组mAb1-D10融合变体中和TGF-β1活性的效能。如实施例3中所述，进行该过程。基于其对蛋白G的亲和力(作为易于纯化的指标)来选择来自实施例7的几种代表性融合变体。8种变体(mAb1 F1、mAb1 F2、mAb1 F6、mAb1 F7、mAb1 F11、mAb1 F12、mAb1 F16和mAb1 F17)的TGF-β1抑制概况在图12A和12B中描述。所有融合蛋白显示出与mAb1对照相似的EC50。
实施例10：重组融合变体与TGF-β1的结合
还使用表面等离子共振(SPR)如通过检测的定量评定实施例7的重组mAb1-D10融合变体与TGF-β1的结合。含有纯化的变体的样品经过具有胺偶联的TGF-β1(amine-coupled TGF-β1)的传感器芯片，以测定平衡常数，KD。挑选靶固定化水平小于100个响应单位的(RU)的TGF-β1，以最小化由于结合芯片上的邻近TGF-β1分子产生的亲合力影响的可能性。通过芯片表面的NHS/EDC活化后但在用乙醇胺猝灭之前响应单位的变化，来确定固定化水平。将融合变体、WT融合变体F1、和mAb1对照在HBS-EP缓冲液中稀释至30、10、3、1和0.37nM，且以30μL/分钟经过TGF-β1芯片持续3分钟，随后在相同缓冲液中解离5分钟。在运行之间，通过在芯片上经过两次30秒的以75μL/分钟的流速的40mM HCl注射，而再生芯片表面，以除去任何结合的抗体。如表4中所示的，所有融合变体和WT构建体(F1)的平衡常数(KD)均在mAb1对照的2.4倍以内。出乎意料的是，由融合变体引发的最大信号(RU)随肽的数目的增加而降低，其中变体F17(D10-HC-D10/D10-LC，PAR＝6)显示最低信号。这与实施例9中描述的A549细胞效能测定相反，实施例9显示所有测试的融合变体在中和TGF-β1方面与mAb1或WT构建体相当或与相比更有效。此下降的可能解释可反映芯片基质(羧甲基葡聚糖)和带负电的D10肽之间的静电排斥。
表4通过Biacore分析获得的mAb1-D10融合变体结合TGF-β1的平衡常数
A参见表2
实施例11：重组mAb1-D10融合变体与羟磷灰石的结合
还测试了来自实施例7的重组mAb1-D10融合变体与如实施例3中所述的陶瓷羟磷灰石(CHT)柱的结合以评定它们结合骨矿物结构的潜能。将重组mAb1-D10融合变体(5mM磷酸钠pH 7.4中每种25μg)应用于100μL羟磷灰石柱(II型CHT，BioRad)，并使用0.005至0.5M磷酸钠pH 7.4的梯度洗脱。通过A280追踪对从柱洗脱的流动相中的蛋白质。在每组运行的开始和结束时运行标准品(通常是mAb1-D10化学缀合物)，以确保柱效能的一致性。图13描述每个运行的A280谱图。保留时间(RT)和结合的级分在下表5中显示。除了一种重组融合变体之外的所有变体结合量差不多，但显示出亲和力的差异，如它们的保留时间反映的。保留时间的等级次序与PAR没有很好的相关性，这表明肽位置对结合具有显著影响。特别地，在变体F7(PAR4)中观察到最强结合(最高RT)，而变体F17(PAR6)显示稍较弱的结合。一种变体(F6，PAR2)显示出比大多数PAR4变体较弱的结合，但显著优于其他PAR2变体(F2和F11)。仅在轻链的N-末端具有肽的一种变体(F2)仅显示弱结合，如其RT和结合的级分(23％)所反映的。mAb1-D10化学缀合物(“CC”；PAR～4)产生两个峰，84％在比所有PAR4融合变体更早的RT洗脱。
表5 mAb1-D10重组融合变体和化学缀合物的羟磷灰石结合
实施例12：重组融合变体在小鼠中的生物分布
在尾静脉注射到CD-1小鼠中后测定选择的亚组的重组mAb1-D10融合变体(F6、F16和F17)和如实施例6中所述产生的mAb1-D10化学缀合物的生物分布。基于下列的几种因素选择重组变体，该因素包括表达和纯化产率、TGF-β1结合亲和力，基于细胞的效能、和与羟磷灰石的结合。这些变体包括含有两个、四个或六个D10肽的实例，以评定靶向是否概括与羟磷灰石的结合或其是否为肽数目的函数。蛋白在HEK293细胞中表达且在蛋白A上纯化。在体外和体内详细表征了三种重组mAb1融合变体。在这些变体中，D10肽经重组添加至仅重链的C末端(mAb1 F6)，重链的N-和C-末端两端(mAb1 F16)，或重链的N-和C-末端和轻链的C-末端(mAb1 F17)。The mAb1 F6、F16和F17重组变体的肽与抗体比例(PAR)分别为2、4和6。mAb1-D10肽化学缀合物(～4.8PAR)，其在实施例6的研究中显示靶向骨，被选为阳性对照。
通过以近似5:1的染料:蛋白摩尔比与在50mM硼酸钠pH 8.65中的800-4xPEG NHS酯(Thermo Scientific)反应，来标记重组融合变体和化学缀合物。通过调整染料:蛋白比例使标记的程度(DOL)维持在20％(～1.2mol:mol)之内。然后，将标记的蛋白以1mg/kg通过尾静脉注射施用至CD-1小鼠。在施用后24、48、168和504小时(3周)，随后在IVIS小型动物近红外成像仪(Perkin Elmer)对麻醉的动物成像。在240和504小时从来自每组的动物回收股骨和脊柱，以验证向骨的递送。
如图14中的背部视图中所示，所有mAb1-D10融合变体和化学缀合物集中在脊柱附近的背中线处，且在此处保持3周(504小时)，尽管在测试品的信号强度之间观察到显著差异。感兴趣区域(ROI)用于定量，其包括肩部和骨盆之间的脊柱部分，如图14中所示。计算对于DOL归一化的ROI内的最大辐射效率，并如图15所示绘制。重组融合变体F6，其在每个重链C-末端上具有D10肽，在研究的整个过程(3周)中在所有构建体的脊柱处显示最高水平。48小时后，ROI内的信号强度的等级次序是变体F6>变体F16>变体F17≈化学缀合物，且此次序在整个研究过程中保持不变(图15)。在表6中显示ROI内最大辐射效率随时间的曲线下面积(AUC)减去使用软件(Pharsight)计算的背景自发荧光(来自仅媒介物的对照动物)。与mAb1对照相比，骨暴露(AUC)增加8至22倍，且含D10的构建体之间存在适度差异(最高达2.5倍)。相较于mAb1，变体F6显示出最高的增加(21.8倍，p<0.05)。使用计算的组织半衰期类似地显示，相较于mAb1，变体F6在骨中额半衰期增加>10倍(p<0.05)。
在240和504小时后，分离来自每个群组中的代表性动物的脊柱和股骨，与周围组织分离并成像(图16)。这些样品的相对荧光强度与活体动物中观察到的背部图像信号一致，这指示它们反映了重组融合变体和化学缀合物在骨上存在。这些样品的相对荧光强度与活体动物中观察到的背部图像信号一致，表明它们反映了骨上的重组融合变体和化学缀合物的存在。
表6来自荧光AUC数据的椎骨暴露
实施例13：重组人抗TGFβ-D10抗体融合变体的制备
以如实施例7中所述相同的方式生成用于制备mAb2的表达载体，该mAb2在重链上携带C-末端D10序列(具有铰链突变S228P的人抗TGFβIgG4抗体)(即，mAb2HC-D10/mAb2wtLC(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15)，其具有如变体F6中的相应构型(参见图9B)，且在下文中被称为mAb2 F6；参见表7)。Expi293F细胞用小量制备DNA转染，且6天后，收获条件培养基(60mL)，在HiTrap蛋白A(G.E.Healthcare)上纯化产物蛋白。
表7 mAb2与D10的重组融合变体
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实施例14：人抗TGFβ-D10抗体融合蛋白在小鼠中的生物分布
重组mAb2变体F6(mAb2 F6)和mAb2对照抗体用647(ThermoScientific)标记，且以1mg/kg的剂量腹膜内施用至C57BL/6小鼠。24小时和96小时后，将一些小鼠处死，且切除脊椎和股骨，并在IVIS仪器上成像。对处死时获得的血清样品(10μL)平行成像。股骨远端(小梁)ROI和腰椎柱的平均总辐射效率显示在图17A和17B中。相对强度列于表8中。这些结果显示，由于将D10重组添加至mAb2，96小时后血清和股骨中的抗体量大幅增加，血清中的抗体量显著减少。
表8 C57BL/6中人抗TGFβ-D10融合蛋白的小鼠中相对骨暴露
实施例15：鼠抗TGFβ-D10抗体融合蛋白在小鼠中的单剂量血清和骨药代动力学
在此实施例中，在小鼠中测量鼠抗TGFβ-D10抗体融合蛋白的药代动力学。
单剂量的mAb1或重组mAb1 F6(参见表2)腹膜内施用至G610C小鼠(成骨不全动物模型；每个时间点n＝12)，并在给药后4小时或2、7、15、22和43天收集血液样品。利用针对检测和定量相关抗体的血清浓度优化的ELISA。
对于骨成像，单剂量的荧光团标记的mAb1、重组mAb1 F6或多种其他D10替换物静脉内施用至裸CD-1小鼠(每个时间点n＝3)，且在给药后4小时或1、2、4、7、10和21天进行体外光学成像。生成小鼠脊柱的荧光图像，该图像允许骨中的mAb1和mAb1 F6之间的相对测试品比较(未显示)。
血清和骨中的药代动力学谱图可分别见于图18A和18B，且所得药代动力学参数在下面的表9中。
该结果证明了单剂量后血清和骨中的mAb1和mAb1F6之间的药代动力学的基本对比。相较于mAb1，mAb1 F6显示出血清中的13倍更少的AUC(暴露)，22倍更高的骨中暴露。此外，相对于mAb1，mAb1 F6显示出在血清中14倍更短的t1/2和相称的13倍更快的清除。最后，对于骨，相对于mAb1，mAb1 F6表现出11倍更长的t1/2和相称的17倍更慢的清除。在其中从安全的角度来看可能不期望TGFβ的外周(血清)抑制，而骨中的较高暴露可以增强功效的临床领域中，这些属性对于人形式的mAb1-D10可能是有利的。
表9单剂量PK参数
*相较于mAb1，p<0.05；#对于mAb1归一化至1.0的AUC
实施例16：鼠抗TGFβ-D10抗体融合蛋白在小鼠中的多剂量峰谷血清药代动力学
在此实施例中，在成骨不全的动物模型中进行多剂量峰谷药代动力学研究。
mAb1和mAb1 F6(参见表2)以0.3mg/kg和1mg/kg的浓度腹膜内给药至G610C小鼠(n＝10)，每周3次持续8周(24个总剂量)，且在剂量1和23(在研究的开始和结束)后，在给药后24和48小时收集血液样品。仅显示1mg/kg剂量的结果(参见图19)。利用针对检测和定量相关抗体的血清浓度优化的质谱测定法。
结果在下表10中量化。该结果证明了剂量1和23后血清中的mAb1和mAb1F6之间的药代动力学的基本对比。在剂量1和23两者的给药后24小时和48小时时，相较于mAb1，观察到mAb1 F6的血清浓度显著更低。此外，在剂量1和23时，相较于mAb1，mAb1 F6的给药后24和48小时之间的斜率更陡峭，这表明mAb1 F6以比mAb1更快的速率离开血清(体循环)，这可能是由于其对骨(羟磷灰石)的高亲和力。最后，mAb1 F6和mAb1二者似乎从剂量1至23在血清中积累，但相较于mAb1，mAb1 F6似乎以降低的浓度积累(从剂量1至23，mAb1 F6：2.5至3.5倍积累，mAb1：4至5.5倍积累)。在其中从安全角度来看可能不期望抑制TGFβ的外周(血清)的临床领域中，这些属性对于人形式的mAb1 F6可能是有利的。
表10 mAb1给药研究结果
*相较于mAb1，p≤0.05
实施例17：用mAb1和mAb1 F6在腰椎骨中进行多剂量功效研究
在此实施例中，在成骨不全的动物模型中进行多剂量功效研究，以测定靶向骨的mAb1(mAb1 F6)与非靶向骨的mAb1对骨密度和强度的有效性。
mAb1和mAb1F6以0.3、1和5mg/kg腹膜内给药至G610C小鼠，每周3次，持续8周。在最终剂量后，对小鼠进行尸体剖检并通过μCT对第6腰椎骨成像，以测定骨体积/总体积(BV/TV)，并进行生物力学测试以确定最大失效力(骨强度)。
结果在图20和21中显示。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，在1和5mg/kg时对于两种处理的BV/TV(％)的显著变化。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，1和5mg/kg的mAb1 F6和仅1mg/kg的mAb1的最大失效力的显著变化。相较于WT背景品系，用抗体对照(13C4)处理的G610C小鼠表现出BV/TV和最大失效力的显著降低。这些结果表明，在每周3次给药的方案中，两种处理均在G610C小鼠中诱导BV/TV和最大失效力的相似的剂量相关变化。确实存在mAb1 F6对骨强度的增强的功效的趋势，因为5mg/kg小鼠的一半群体显示出比用1mg/kg或5mg/kg mAb1处理的小鼠大幅更高的最大失效力值(40牛顿或更高)。
实施例18：mAb1和mAb1 F6在腰椎骨中的给药频率研究
在此实施例中，在成骨不全的动物模型中进行给药频率研究，以确定mAb1 F6的实现靶向骨的抗体的最佳效力的适当给药频率。
mAb1和mAb1 F6以5mg/kg以多种频率(每周3次、每周1次、每2周1次或每4周1次)腹膜内给药至G610C小鼠，持续12周。在研究开始和结束时采集药代动力学(PK)血清样品以确定mAb1和mAb1 F6二者的峰值和谷值。在最终剂量后，对小鼠进行尸体剖检并通过μCT对第6腰椎骨成像以测定骨体积/总体积(BV/TV)，并进行生物力学测试以确定最大失效力(骨强度)。
结果显示在图22、23和24中。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，以每周3次、每周1次、每2周1次和每4周1次的mAb1的BV/TV(％)的显著变化。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，以每周3次和每周1次的mAb1 F6的BV/TV(％)的显著变化。以每2周1次和每4周1次给药频率时，相较于的mAb1 F6处理，mAb1处理表现出显著更高的BV/TV。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，以每周3次、每周1次和每2周1次的mAb1的最大失效力的显著变化。观察到，相较于13C4处理的G610C小鼠，以每周3次和每周1次的mAb1 F6对最大失效力的显著变化。相较于WT背景品系，用对照抗体(13C4)处理的G610C小鼠表现出BV/TV的显著降低和较低的最大失效力的趋势。
这些结果证明，mAb1和mAb1 F6二者在G610C小鼠中均可诱导BV/TV和最大失效力的相似的最大作用。相较于mAb1 F6，mAb1似乎在功效持久性方面具有优势，维持当每4周给药一次时的BV/TV和每2周给药一次时的最大失效力的显著功效。然而，以等同有效的给药方案(mAb1每2周一次；mAb1 F6每周一次)的PK血清样品平均值分别产生对于mAb1约38μg/mL和对于mAb1 F6 8μg/mL。这表明mAb 1 F6的血清暴露可能较少，这可以为OI患者提供安全性优势。
实施例19：mAb1 F16在腰椎骨中的给药频率研究
在此实施例中，在成骨不全的动物模型中进行给药频率研究，以确定mAb1 F16的实现其对骨密度的最佳影响的适当给药频率。
mAb1和mAb1 F16以5mg/kg腹膜内给药至G610C小鼠，每周3次，持续8周。在最终剂量后，对小鼠进行尸体剖检并通过μCT对第6腰椎骨成像以测定骨体积/总体积(BV/TV)。
结果显示在图25中。相较于13C4处理的G610C小鼠，观察到5mg/kg的mAb1和mAbF16二者的BV/TV(％)的显著变化。相较于WT背景品系，用对照抗体(13C4)处理的G610C小鼠表现出BV/TV的显著降低。这些结果证明，mAb1和mAb F16在G610C小鼠中在此给药方案下诱导BV/TV的相似的剂量相关变化。
实施例20：mAb1 F11在骨中的给药频率研究
在此实施例中，在野生型小鼠中进行给药频率研究，以确定mAb1 F11的实现其对骨密度的最佳影响的适当给药频率。
mAb1和mAb1 F11以5mg/kg腹膜内给药至野生型小鼠中，每周3次持续11周。在研究的生命部分期间，采集了几个体内μCT时间点。仅显示给药后9周时的骨体积/总体积(BV/TV％)的数据。
结果显示在图26中。观察到，相较于13C4处理的野生型小鼠，5mg/kg的mAb1和mAb1F11两种处理的BV/TV(％)的显著变化。这些结果证明，mAb1和mAb1 F11二者在野生型小鼠中在此给药方案时诱导BV/TV的相似的剂量相关变化。
实施例21：小鼠和人靶向骨的抗TGFβ抗体mAb1 F6和mAb2 F6在小鼠中的生物分布
在此实施例中，进行研究以比较荧光标记的mAb1、mAb1 F6、mAb2和mAb2D10(与mAb2的重链C-末端缀合的D10；mAb2F6)在野生型小鼠中的生物分布。向小鼠施用单个腹膜内剂量的每种测试品和媒介物，在不同时间点对该小鼠进行安乐死以进行组织收集。在用mAb1和mAb1 F6给药后1、4、10、20、43和98天收集腰椎、心脏、肝脏、肠和其他组织(数据未显示)。在给药mAb2和mAb2D10后24和96小时也对组织进行取样。
结果显示在图27-33中。图27-30显示来自给药后1-98天时给药mAb1、mAb1 F6或媒介物的小鼠的组织中的总辐射效率(TRE)。与mAb1相比，腰椎表现出mAb1 F6的强持续存在，在每个时间点具有显著更高的总辐射效率(TRE)。在心脏和肝脏中，mAb1 F6相对于mAb1表现出低得多的TRE。最后，在肠中，媒介物和测试品之间未发现显著差异。
这些结果证明，mAb1 F6的特征在于高骨亲和力，其相反地导致在其他组织(例如，心脏和肝脏)中的较低暴露。该结果还指示靶向骨中TGF-β抑制位点同时限制全身性TGF-β抑制并减少不良副作用的安全性优势。在肠中相对于媒介物缺少任何TRE，表明荧光团将其标记保持在各自抗体上。先前的数据已经显示，如果荧光团不将其标记保持在抗体上，其将会在肠中检测到。
图31-33显示来自给药mAb2或mAb2D10的小鼠的组织中的TRE。图31证明，相较于mAb2，mAb2D10的骨亲和力更高。引人注目的是，相较于mAb2，对于mAb2D10的股骨中观察到高TRE。在腰椎中观察到相同的总体趋势。相较于在给药mAb2的小鼠的腰椎/血清和股骨/血清比例，在给药mAb2D10的小鼠中的腰椎/血清和股骨/血清比例也强力地支持了mAb2D10的靶向骨的能力(图32和33)。
已经详细描述了本发明并参考其具体实施方案，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明范围的情况下，可以进行修改和变化。更具体地，尽管本发明的一些方面在本文中经鉴定是特别有利的，但是预期本发明不必受限于本发明的这些特定方面。在一些实施方案中，本文公开的值可以替代地从公开的值变化±10、20、或30％，且仍在预期发明的范围内。
除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下描述示例性方法和材料，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物和其他参考文献都通过提述以其整体并入。如果发生冲突，本说明书，包括定义将会控制。尽管本文引用了许多文献，但此引用并不构成承认任何这些文献构成本领域公知常识的一部分。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学，分析化学，合成有机化学，医药化学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的命名法和技术是本领域熟知且常用的命名法和技术。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。在整个说明书和实施方案中，词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或诸如变体“具有(has，having)”或“包含(comprises，comprising)”将被理解为暗示包括所述整体或整体组，但不排除任何其他整体或整体组。此外，除非上下文另有明确规定，单数形式“一(a、an)”和“该(the)”包括复数指示物。例如，提及“一个抗体”意指一个或多个抗体。
出于描述和定义本发明的目的，应注意，术语“基本上”在本文中用于代表可归因于任何定量比较，值，度量或其他表示的固有不确定度。术语“基本上”在本文中也用于代表定量表示可以与所述参考变化的程度，而不会导致所讨论主题的基本功能的变化。
如本文所用，术语“约”是指给定量的±10％，但是无论何时所讨论的量是指不可分割的物体，例如氨基酸或将失去其同一性的其他物体被再分，那么“约”指的是不可分割物体的±1。例如，约2％的水是指1.8％至2.2％的水，而约6个氨基酸残基是指5-7个氨基酸残基。
如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述彼此组合或互斥的多个组成。例如，“x，y和/或z”可以单独表示“x”，单独表示“y”，单独表示“z”，表示“x，y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)，”或“x或y或z”。
本说明书中提及的序列提供于下表11以及序列表中。
表11序列
/>
/>
/>
/>
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/>
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/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 建新公司
<120> 靶向骨的抗体
<130> 022548.WO012
<140>
<141>
<150> 62/448,763
<151> 2017-01-20
<160> 40
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 1
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 2
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Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
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Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
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Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
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<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多肽"
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Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
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Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
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Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp
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Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe
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Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
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Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
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Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
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Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
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Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro
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多肽"
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn
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Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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多肽"
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn
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Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
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多肽"
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Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gln Val Gln Leu Val Gln
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Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
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Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn Val Ile Ser Trp Val Arg
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Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Val Ile Pro Ile
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Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
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Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gln Val Gln Leu Val Gln
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Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多肽"
<400> 20
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Thr Val Leu Thr Gln
1 5 10 15
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
35 40 45
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser
50 55 60
Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
130 135 140
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
145 150 155 160
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
165 170 175
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
180 185 190
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
195 200 205
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
210 215 220
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
225 230 235
<210> 21
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多肽"
<400> 21
Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Asp Asp
210 215 220
Asp Asp Asp Asp Asp Asp
225 230
<210> 22
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多肽"
<400> 22
Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
225 230 235
<210> 23
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 23
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcagt agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac 180
gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccactag tacaacttac 240
atggagttga gcagcctgag gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcacactt 300
ggtctcgtcc tggatgctat ggactactgg ggtcagggta cgttagtgac ggtctcgagt 360
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tcgacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctggggaa atga 1344
<210> 24
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 24
gacgacgatg atgacgatga cgacgacgat caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag 60
gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcagt 120
agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg 180
gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt 240
accgcggacg aatccactag tacaacttac atggagttga gcagcctgag gtctgaggac 300
acggccgtgt attactgtgc gagcacactt ggtctcgtcc tggatgctat ggactactgg 360
ggtcagggta cgttagtgac ggtctcgagt gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc 420
ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag 480
gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540
cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600
gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc 660
aacaccaagg tcgacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 720
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 780
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 840
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1020
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1080
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1260
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctggggaa atga 1374
<210> 25
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 25
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcagt agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac 180
gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccactag tacaacttac 240
atggagttga gcagcctgag gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcacactt 300
ggtctcgtcc tggatgctat ggactactgg ggtcagggta cgttagtgac ggtctcgagt 360
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tcgacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctggggaa agacgacgat gatgacgatg acgacgacga ttga 1374
<210> 26
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 26
gacgacgatg atgacgatga cgacgacgat caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag 60
gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cttctggata caccttcagt 120
agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg 180
gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt 240
accgcggacg aatccactag tacaacttac atggagttga gcagcctgag gtctgaggac 300
acggccgtgt attactgtgc gagcacactt ggtctcgtcc tggatgctat ggactactgg 360
ggtcagggta cgttagtgac ggtctcgagt gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc 420
ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag 480
gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540
cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600
gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc 660
aacaccaagg tcgacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 720
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 780
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 840
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 960
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1020
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1080
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1140
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1200
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1260
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1320
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctggggaa agacgacgat 1380
gatgacgatg acgacgacga ttga 1404
<210> 27
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 27
gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120
cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc gacttcactc tcaccatcag ccgactggag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtatgctg actcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648
<210> 28
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 28
gacgacgatg atgacgatga cgacgacgat gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc 60
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc 120
agcagctact tagcctggta tcagcagaaa cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat 180
ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc 240
gacttcactc tcaccatcag ccgactggag cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag 300
cagtatgctg actcaccgat caccttcggc caagggacac gactggagat taaacgtacg 360
gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 420
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 480
gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 540
gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 600
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 660
aacaggggag agtgttag 678
<210> 29
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 29
gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120
cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc gacttcactc tcaccatcag ccgactggag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtatgctg actcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtgacga cgatgatgac 660
gatgacgacg acgattag 678
<210> 30
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 30
gacgacgatg atgacgatga cgacgacgat gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc 60
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc 120
agcagctact tagcctggta tcagcagaaa cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat 180
ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc 240
gacttcactc tcaccatcag ccgactggag cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag 300
cagtatgctg actcaccgat caccttcggc caagggacac gactggagat taaacgtacg 360
gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 420
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 480
gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 540
gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 600
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 660
aacaggggag agtgtgacga cgatgatgac gatgacgacg acgattag 708
<210> 31
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 31
gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120
cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc gacttcactc tcaccatcag ccgactggag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtatgctg actcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtggcgg aggcggcagc 660
gacgacgatg atgacgatga cgacgacgat tag 693
<210> 32
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多核苷酸"
<400> 32
gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120
cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc gacttcactc tcaccatcag ccgactggag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtatgctg actcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtggcgg aggcggcagc 660
ggcggaggcg gcagcgacga cgatgatgac gatgacgacg acgattag 708
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 33
Ser Asn Val Ile Ser
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 34
Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 35
Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 37
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
肽"
<400> 38
Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr
1 5
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多肽"
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成
多肽"
<400> 40
Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (18)

1.一种结合TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3中的一种或多种的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中一个或多个聚-天冬氨酸(聚-D)肽与所述重链在其N-末端和C-末端中之一或两者整合连接和/或与所述轻链的C-末端整合连接，
其中所述一个或多个聚-D肽各包含SEQ ID NO:1，并且
其中所述抗体或其抗原结合片段包含
分别为SEQ ID NO:33、34和35的重链互补决定区(CDR)1-3，和分别为SEQ ID NO:36、37和38的轻链CDR1-3；或
SEQ ID NO:2中的重链可变域和SEQ ID NO:6中的轻链可变域。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含(i)与所述重链的N-末端整合的聚-D肽，(ii)与所述重链的C-末端整合的聚-D肽，或(iii)(i)和(ii)二者。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含与所述轻链的C-末端整合的聚-D肽。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个聚-D肽经由肽接头与所述重链或轻链融合。
5.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG。
6.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含对应于SED IDNO:13的残基1-120的重链可变域(VH)氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:15的残基1-108的轻链可变域(VL)氨基酸序列。
7.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人IgG4重链恒定区，所述人IgG4重链恒定区在根据EU编号的位置228处具有脯氨酸。
8.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列，且所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含SEQ ID NO:13、14、16或17的氨基酸序列，且所述轻链包含SEQ ID NO:15、19、21或22的氨基酸序列。
10.一种IgG4抗体，其结合人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO:14或17的氨基酸序列，且轻链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
12.权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于制备用于治疗具有骨病况的人的药物的用途，该治疗受益于TGFβ的抑制，其中所述人具有成骨不全、骨质流失或骨质疏松、慢性肾病或具有骨转移的癌症。
13.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的核苷酸序列。
14.一种表达载体，其包含权利要求13所述的分离的核酸分子。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求14所述的表达载体。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
17.一种产生权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
提供包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的宿主细胞，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别编码所述抗体或抗原结合片段的重链和轻链，在允许产生所述抗体或抗原结合片段的条件下使所述宿主细胞生长，和
回收所述抗体或抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含SEQ ID NO:23、24、25、或26，且所述第二核苷酸序列包含SEQ ID NO:27、29、31、或32。
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