CN111989341A - Tim-3结合抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与人类TIM‑3特异性结合的分离的单克隆抗体。还提供了编码所述抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及用于表达所述抗体的方法。本发明进一步提供了包含所述抗体的免疫缀合物、双特异性分子和药物组合物，以及使用本发明的抗TIM‑3抗体的诊断和治疗方法。

Description

TIM-3结合抗体及其用途
技术领域
本发明一般涉及一种分离的单克隆抗体，特别是一种与TIM-3特异性结合并具有良好的治疗特性的人类单克隆抗体。还提供了编码所述抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及用于表达所述抗体的方法。本发明进一步提供了包含所述抗体的免疫缀合物、双特异性分子和药物组合物，以及使用本发明的抗TIM-3抗体的诊断和治疗方法。
背景技术
治疗性抗体是制药工业增长最快的部分之一，尤其是针对某些疾病相关的细胞蛋白的单克隆抗体。
一种此类靶蛋白是T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3，也被称为TIM-3，这是一种由人中HAVCR2基因编码的蛋白质。TIM-3是一个免疫检查点并且作为细胞表面受体在产生IFNγ的CD4+T辅助细胞1(Th1)和CD8+T细胞毒性1(Tc1)细胞、Th17细胞、调节性T细胞以及先天性免疫细胞(树突状细胞、NK细胞和单核细胞)上表达(Monney L等,(2002)Nature.415(6871):536–41；Hastings WD等,(2009)European Journal of Immunology.39(9):2492–501；GaoX等,(2012)PLOS One.7(2):e30676；Gleason MK等,(2012)Blood.119(13):3064-72)。发现了TIM-3的若干种配体，包括半乳凝素9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1。在这些之中，半乳凝素9和Ptdser是主要活化TIM-3的配体，并且配体啮合限制了CD4+Th1和CD8+Tc1细胞应答的持续时间和幅度(Sabatos CA等,(2003)Nat Immunol 4:1102–10；Sabatos-Peyton CA等,(2018)ONCOIMMUNOLOGY 7(2):e1385690)
使用抗体阻断TIM-3用于癌症治疗的临床前研究显示，在肿瘤部位的抗原特异性T细胞的活化增强，并且肿瘤生长受到破坏。此外，双抗TIM-3/抗PD-1抗体治疗治愈了大多数已建立对单一抗体治疗有极大抗性的肿瘤的小鼠(Ngiow SF等,(2011)Cancer Res71:3540–51)。
尽管治疗效果有前景，但迄今为止仅开发了少数抗TIM-3抗体。一种此类抗体是Novartis的MBG-453，如US2015218274A1所描述的ABTIM3的人源化抗体，其已被证明可阻断TIM-3-PtdSer相互作用并且目前处于I期试验。另一种抗TIM-3抗体描述于WO2017/079115中，其抑制TIM-3与泌乳激素9(galectin-9)的结合。
发明内容
本发明提供了一种分离的单克隆抗体，例如人类的、小鼠的、嵌合的或人源化的单克隆抗体，其与TIM-3结合并且与现有的抗TIM-3抗体例如ABTIM3相比，具有相当的或更好的药物特性。
在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如人类抗体)或其抗原结合部分，其具有包含CDR1区、CDR2区和CDR3区的重链可变区，其中所述CDR1区、所述CDR2区和所述CDR3区包含与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)分别地为SEQ ID NO:1、5和9；(2)分别地为SEQ ID NO:2、6和9；(3)分别地为SEQ ID NO:3、7和10；或(4)分别地为SEQ ID NO:4、8和11，其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体(例如，人类抗体)或其抗原结合部分包含含有与SEQ ID NO:24、25、26或27具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。这些氨基酸序列可分别由SEQ ID NO:37、38、39和40中列出的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分包含含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的轻链可变区，其中所述CDR1区、所述CDR2区和所述CDR3区包含与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)分别地为SEQ ID NO:12、17和21；(2)分别地为SEQ ID NO:13、17和21；(3)分别地为SEQ ID NO:14、17和21；(4)分别地为SEQ ID NO:14、18和21；(5)分别地为SEQ ID NO:15、19和22；或(6)分别地为SEQ ID NO:16、20和23；其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体(例如，人类抗体)或其抗原结合部分包含含有与SEQ ID NO:28、29(X1＝N、X2＝S；或X1＝Y、X2＝S；X1＝Y、X2＝N)、30或31具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。这些氨基酸序列可分别由SEQ ID NO:41、42、43、44、45和46中列出的核苷酸序列编码。
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含均含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区和所述轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区包含与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)分别地为SEQ ID NO:1、5、9、12、17和21；(2)分别地为SEQ ID NO:2、6、9、13、17和21；(3)分别地为SEQ ID NO:2、6、9、14、17和21；(4)分别地为SEQ ID NO:2、6、9、14、18和21；(5)分别地为SEQ ID NO:3、7、10、15、19和22；或(6)分别地为SEQ ID NO:4、8、11、16、20和23；其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区包含与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)分别地为SEQ ID NO:24和28；(2)分别地为SEQ IDNO:25和29(X1＝N、X2＝S；或X1＝Y、X2＝S；X1＝Y、X2＝N)；(3)分别地为SEQ ID NO:26和30；或(4)分别地为SEQ ID NO:27和31，其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。
在一个实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链包含重链可变区和重链恒定区，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:32或33具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，而所述轻链恒定区包含与SEQ ID NO:34、35或36具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且所述重链可变区和所述轻链可变区包含如上所描述的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。氨基酸序列SEQ ID NO:32、33、34和36可分别由SEQ ID NO:47、48、49和50中列出的核苷酸序列编码。重链恒定区经过特殊设计使得抗TIM3抗体不诱导在表达TIM3的细胞上的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。例如，人类IgG1重链可包含用于消除ADCC或CDC功能的L234A、L235A、D265A和/或P329A突变。
本发明的抗体可以是全长抗体，例如，IgG1、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。在其它实施方案中，本发明的抗体可以是单链抗体或由抗体片段例如Fab或Fab′2片段组成。
本发明的抗体或其抗原结合部分以约2.05×10-9M或更小的KD与人类TIM-3结合、抑制TIM-3与半乳凝素9、ptdser或其它配体的结合、不与TIM-1或TIM-4交叉反应、诱导在细胞膜上的TIM3内在化、诱导人类T细胞释放IL-2和/或IFNγ、不诱导在表达TIM3的细胞上的ADCC或CDC，和/或增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。本发明的抗体或其抗原结合部分与现有技术的抗TIM3抗体例如ABTIM3相比具有相当的(如果不是更好的话)结合和/或阻断活性。
本发明还提供了一种免疫缀合物，其包含连接到治疗剂例如细胞毒素的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明还提供了一种包含本发明的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，其连接到具有不同于所述抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分(例如，第二抗体)。在另一个方面，本发明的抗体或其抗原结合部分可以制备成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒结合使用。
还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫缀合物、双特异性分子或CAR以及药学上可接受的载体的组合物。
本发明还涵盖了编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。还提供了一种使用包含表达载体的宿主细胞来制备抗TIM3抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中增强免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，至少一种另外的免疫刺激抗体可以与本发明的抗体或其抗原结合部分一起施用，例如抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体和/或抗CTLA-4抗体，使得受试者中的免疫应答(例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答)增强。在一个实施方案中，所述另外的免疫刺激抗体为抗PD-1抗体。在另一个实施方案中，所述另外的免疫刺激剂为抗LAG-3抗体。在又一个实施方案中，所述另外的免疫刺激剂为抗CTLA-4抗体。在又一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如，IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如，抗CD137和/或抗GITR抗体)一起施用。所述抗体可以是例如，小鼠的、人类的、嵌合的或人源化的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。所述癌症可以是实体肿瘤或非实体肿瘤，包括但不限于B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、结肠腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌和鼻咽癌。在一些实施方案中，所述方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、CAR-T细胞或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。在一些实施方案中，至少一种另外的抗癌抗体可以与本发明的抗体或其抗原结合部分一起施用，例如抗VISTA抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体和/或抗CTLA-4抗体。在又一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如，IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如，抗CD137和/或抗GITR抗体)一起施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与化学治疗剂一起施用，所述化学治疗剂可以是细胞毒性剂，例如表柔比星(epirubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本发明的抗体可以是例如，小鼠的、人类的、嵌合的或人源化的抗体。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面，本发明提供了用于前述方法的本发明的抗TIM-3抗体和组合物，或用于制造用于前述方法(例如，用于治疗)的药物。
本发明的其它特征和优点通过以下不应解释为限制性的详细描述和实施例将显而易见。本申请通篇引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公布的专利申请的内容均明确地以引用的方式并入本文。
附图说明
图1示出了抗TIM-3抗体TIM3-6.12(左图)、TIM3-6、TIM3-4G7和TIM3-11(右图)与人类TIM-3的结合活性。
图2示出了本发明的抗TIM-3抗体对人类TIM-3-半乳凝素9相互作用的阻断活性。
图3示出了本发明的抗TIM-3抗体与在CHO-K1-TIM3细胞上表达的TIM-3的结合活性。
图4示出了由用SEB处理、之后用本发明的抗TIM-3抗体处理的PBMC释放的IL-2。
图5示出了本发明的抗TIM-3抗体对TIM-3-磷脂酰丝氨酸相互作用的阻断活性。
图6示出了CHOK1-TIM3细胞对本发明的抗TIM-3抗体的内在化。
图7示出了本发明的抗TIM3抗体不与C1q结合。
图8示出了本发明的抗TIM3抗体不诱导在CHOK1-TIM3细胞上的ADCC。
图9示出了本发明的抗TIM3抗体不诱导在CHOK1-TIM3细胞上的CDC。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
术语“TIM-3”指的是T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3。术语“TIM-3”包含变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，特异性针对人类TIM-3蛋白的抗体可与来自除人类以外物种的TIM-3蛋白发生交叉反应。在其它实施方案中，特异性针对人类TIM-3蛋白的抗体可以是完全特异性针对人类TIM-3蛋白的，并且表现与其它物种或其它类型没有交叉反应，或者其可以与来自某些其它物种但不是所有其它物种的TIM-3发生交叉反应(例如，与猴TIM-3但不与小鼠TIM-3发生交叉反应)。
术语“人类TIM-3”指的是TIM-3的人类序列，例如具有Genbank登录号NP_116171的人类TIM-3的完整氨基酸序列。
术语“免疫应答”指的是例如淋巴细胞、抗原提呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用引起对入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下，对正常人类细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体内消除。
如本文所提到的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。完整抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每一条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每一条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(在本文中缩写为CL)。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH区和VL区可以进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区与被称为框架区(FR)的更保守的区域交替。每一个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指的是抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如TIM-3蛋白)特异性结合的能力。已经证实的是，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；和(vii)纳米抗体，即含有单一可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得它们能够被制成单一蛋白质链，其中所述VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这些单链抗体也意图被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选片段。
如本文所用的“分离的抗体”意图指的是基本上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合TIM-3蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除TIM-3蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人类TIM-3蛋白的分离的抗体可以对其它抗原，如来自其它物种的TIM-3蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
如本文所用的术语“人类抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区这两者都源自于人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么所述恒定区也源自于人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可以包括并非由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机诱变或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”不意图包括其中源自于另一种哺乳动物物种种系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上的抗体。
如本文所用的术语“小鼠抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区这两者都源自于小鼠种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么所述恒定区也源自于小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的小鼠抗体可以包括并非由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机诱变或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“小鼠抗体”不意图包括其中源自于另一种哺乳动物物种种系的CDR序列已经被移植到小鼠框架序列上的抗体。
术语“嵌合抗体”指的是通过将来自非人类来源的遗传物质与来自人类的遗传物质组合而制备成的抗体。或者更一般地，嵌合抗体是具有来自某一物种的遗传物质与来自另一物种的遗传物质的抗体。
如本文所用的术语“人源化抗体”指的是来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加与人类天然产生的抗体变体的相似性。
术语“人类单克隆抗体”指的是具有可变区的显示出单一结合特异性的抗体，其中框架区和CDR区这两者都源自于人类种系免疫球蛋白序列。
术语“同种型”指的是由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“抗体衍生物”指的是抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种药剂或抗体的缀合物。
如本文所用，“与人类TIM-3特异性结合”的抗体意图指的是与人类TIM-3蛋白(并且可能是来自一个或多个非人类物种的TIM-3蛋白)结合但基本上不结合非TIM-3蛋白的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”即5x10-9 M或更小的KD与人类TIM-3蛋白结合。
如本文所用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞意指不与所述蛋白质或细胞结合或不以高亲和力与所述蛋白质或细胞结合，即以1×10-6M或更大，更优选地1×10-5M或更大，更优选地1×10-4M或更大，更优选地1×10-3M或更大，甚至更优选地1×10-2M或更大的KD与所述蛋白质或细胞结合。
如本文所用的术语“K缔合”或“Ka”意图指的是特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用的术语“K解离”或“Kd”意图指的是特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的术语“KD”意图指的是解离常数，其是由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得的并且被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域中公认的方法来确定。用于确定抗体的KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，优选地使用生物传感器系统，如BiacoreTM系统。
术语IgG抗体的“高亲和力”指的是对靶抗原具有1×10-6M或更小，更优选地5×10-8M或更小，甚至更优选地1×10-8M或更小，甚至更优选地5×10-9M或更小并且甚至更优选地1×10-9M或更小的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可以不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指的是具有10-6M或更小，更优选地10-7M或更小，甚至更优选地10-8M或更小的KD的抗体。
术语“IC50”也被称为半数最大抑制浓度，指的是相对于不存在抗体，将特异性生物学功能或生化功能抑制50％的抗体浓度。
术语“EC50”也被称为半数最大有效浓度，指的是在指定的暴露时间之后诱导基线与最大值之间的一半响应的抗体浓度。
如本文所用的术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指的是细胞介导的免疫防御的机制，由此免疫系统的效应细胞主动裂解其膜表面抗原已被抗体结合的靶细胞，例如肿瘤细胞。本发明的抗体不诱导在表达TIM3的细胞上的ADCC从而保护免疫细胞。
术语“补体依赖性细胞毒素”或“CDC”一般指的是IgG和IgM抗体的效应功能，当所述抗体与表面抗原结合时触发经典补体途径，诱导膜攻击复合物的形成和靶细胞裂解。本发明的抗体不诱导在表达TIM3的细胞上的CDC从而保护免疫细胞。
术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，尽管哺乳动物是优选的，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。
在以下小节中更详细地描述本发明的各个方面。
具有有利的功能特性的抗TIM-3抗体
本发明的抗体与人类TIM-3特异性结合。本发明的抗体优选地以5x10-9 M或更小的KD，更优选地以2.5x10-9 M或更小的KD与人类TIM-3蛋白结合。
本发明的抗体抑制TIM-3与半乳凝素9、ptdser或其它配体的结合。本发明的抗体不与TIM-1或TIM-4交叉反应。本发明的抗体诱导细胞膜上的TIM3内在化。本发明的抗体诱导人类T细胞释放IL-2和/或IFNγ，并且增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。本发明的抗体不诱导在表达TIM3的细胞上的ADCC或CDC从而保护免疫细胞。
本发明的抗体的结合活性与现有技术的抗TIM3抗体例如ABTIM3相当(如果不是更好的话)。在一个实施方案中，本发明的抗体可以比ABTIM3低得多的浓度抑制TIM-3与半乳凝素9的结合。
本发明的优选抗体为完全人类单克隆抗体。
单克隆抗TIM-3抗体
本发明的优选抗体是结构和化学特征如下文和以下实施例中所描述的单克隆抗体。抗TIM-3抗体的VH氨基酸序列在SEQ ID NO:24、25、26或27中列出。抗TIM-3抗体的VL氨基酸序列在SEQ ID NO:28、29、30或31中示出。抗体的重/轻链可变区的氨基酸序列ID号总结于下表1中，一些克隆共享相同的VH或CDR序列。重链恒定区经过特殊设计使得抗TIM3抗体不诱导在表达TIM3的细胞上的ADCC或CDC。重链恒定区可具有SEQ ID NO:32或33中列出的氨基酸序列，而轻链恒定区可具有SEQ ID NO:34、35或36中列出的氨基酸序列。
表1中的CDR区已由Kabat编号系统确定。然而，在本领域中公知的是，CDR区也可基于重链/轻链可变区序列，通过其它系统例如Chothia、CCG和IMGT系统/方法来确定。
TIM3-6.10、TIM3-6.11和TIM3-6.12在轻链可变区相差一个或两个氨基酸残基，导致其与人类TIM-3的亲和力略有不同。所述三种抗体与TIM3-6中的K相比在第106个氨基酸位置还具有Q。此类氨基酸修饰使这些抗体在压力下更稳定。
表1.抗TIM-3抗体的氨基酸序列
Figure BDA0002717549520000131
Figure BDA0002717549520000141
与人类TIM-3结合的其它抗TIM-3抗体的VH和VL序列(或CDR序列)可以与本发明的抗TIM-3抗体的VH和VL序列(或CDR序列)“混合并匹配”。优选地，当VH和VL链(或此类链内的CDR)混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构上类似的VH序列替代。同样，优选地来自特定VH/VL配对的VL序列被结构上类似的VL序列替代。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含上表1所列的氨基酸序列的重链可变区；以及
(b)包含上表1所列的氨基酸序列的轻链可变区，或另一种抗TIM-3抗体的VL，其中所述抗体与人类TIM-3特异性结合。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)上表1所列的重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区；以及
(b)上表1所列的轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区，或另一种抗TIM-3抗体的CDR，其中所述抗体与人类TIM-3特异性结合。
在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含抗TIM-3抗体的重链可变CDR2区，其组合了与人类TIM-3结合的其它抗体的CDR，例如来自不同抗TIM-3抗体的重链可变区的CDR1和/或CDR3，和/或来自其轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3。
此外，在本领域中公知的是，独立于CDR1结构域和/或CDR2结构域，CDR3结构域单独可以决定抗体对同源抗原的结合特异性，并且可以基于共同的CDR3序列可预测地产生具有相同的结合特异性的多种抗体。参见例如Klimka等,British J.of Cancer 83(2):252-260(2000)；Beiboer等,J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Rader等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)；Barbas等,J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)；Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529-2533(1995)；Ditzel等,J.Immunol.157:739-749(1996)；Berezov等,BIAjournal 8:Scientific Review 8(2001)；Igarashi等,J.Biochem(东京)117:452-7(1995)；Bourgeois等,J.Virol 72:807-10(1998)；Levi等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4374-8(1993)；Polymenis和Stoller,J.Immunol.152:5218-5329(1994)；以及Xu和Davis,Immunity 13:37-45(2000)。还参见美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一篇在此以引用的方式整体并入本文。
因此，在另一个实施方案中，本发明的抗体包含抗TIM-3抗体的重链可变区的CDR2和至少抗TIM-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的CDR3，或另一种抗TIM-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的CDR3，其中所述抗体能够与人类TIM-3特异性结合。这些抗体优选地(a)竞争与TIM-3的结合；(b)保留功能特性；(c)与相同的表位结合；和/或(d)具有与本发明的抗TIM-3抗体类似的结合亲和力。在又一个实施方案中，抗体还可包含抗TIM-3抗体的轻链可变区的CDR2或另一种抗TIM-3抗体的轻链可变区的CDR2，其中所述抗体能够与人类TIM-3特异性结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体可包含抗TIM-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的CDR1或另一种抗TIM-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的CDR1，其中所述抗体能够与人类TIM-3特异性结合。
保守修饰
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的重链可变区序列和/或轻链可变区序列，它们与本发明的抗TIM-3抗体不同之处在于一个或多个保守修饰。在本领域中应当了解的是，可以进行某些保守序列修饰，所述修饰不去除抗原结合。参见例如Brummell等(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley和O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等(1998)Int.Immunol.10:341-6；以及Beers等(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
因此，在一个实施方案中，抗体包含含有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的重链可变区和/或含有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1序列包含上表1所列的序列和/或其保守修饰；和/或
(b)重链可变区CDR2序列包含上表1所列的序列和/或其保守修饰；和/或
(c)重链可变区CDR3序列包含上表1所列的序列和/或其保守修饰；和/或
(d)轻链可变区CDR1序列和/或CDR2序列和/或CDR3序列包含上表1所列的序列和/或其保守修饰；并且
(e)所述抗体与人类TIM-3特异性结合。
如本文所用的术语“保守序列修饰”意图指的是不会显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同一侧链家族的其它氨基酸残基置换并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能(即上述功能)。
工程化和修饰的抗体
可以使用具有本发明的抗TIM-3抗体的VH序列/VL序列中的一个或多个的抗体作为起始材料来对修饰的抗体进行工程化以制备本发明的抗体。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来对抗体进行工程化。另外地或可选地，可以通过修饰一个或多个恒定区内的残基来对抗体进行工程化，例如以改变抗体的一种或多种效应功能。
在某些实施方案中，可以使用CDR移植来对抗体的可变区进行工程化。抗体主要通过位于六个重链互补决定区和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因，在单个抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR之外的序列更具多样性。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建表达载体来表达模拟特异性的天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自所述特异性的天然存在的抗体的CDR序列(参见例如Riechmann等(1998)Nature 332:323-327；Jones等(1986)Nature 321:522-525；Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含含有如上所描述的本发明的序列的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含含有如上所描述的本发明的序列的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列。尽管这些抗体包含本发明的单克隆抗体的VH和VL的CDR序列，但是它们可以包含不同的框架序列。
这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献中获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人类种系序列数据库(可在互联网上在www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase处获得)，以及Kabat等(1991)(上文所引用)；Tomlinson等(1992),J.Mol.Biol.227:776-798；以及Cox等(1994),Eur.J.Immunol.24:827-836中找到，这些文献中的每一篇的内容明确地以引用的方式并入本文。作为另一个实例，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在基因库数据库中找到。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可以所附的基因库登录号：1-69(NG__0010109、NT__024637和BC070333)、3-33(NG__0010109和NT__024637)和3-7(NG__0010109和NT__024637)获得。作为另一个实例，在HCo12 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可以所附的基因库登录号：1-69(NG__0010109、NT__024637和BC070333)、5-51(NG__0010109和NT__024637)、4-34(NG__0010109和NT__024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)获得。
使用本领域技术人员公知的被称作Gapped BLAST的序列相似性搜索方法之一，将抗体蛋白质序列与编译的蛋白质序列数据库进行比较(Altschul等(1997)(同上))。
用于本发明的抗体中的优选的框架序列是与本发明的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些框架序列。VH CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列可以被移植到具有与作为框架序列的来源的种系免疫球蛋白基因中存在的序列相同的序列的框架区上，或CDR序列可以被移植到与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，有益的是，使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1区、CDR2区和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善所关注的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变并且可以在如本文所述和实施例中所提供的体外或体内测定中评价对抗体结合或所关注的其它功能特性的影响。优选的是，引入保守修饰(如本领域已知)。所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选地是取代。此外，通常改变CDR区内不超过1个、2个、3个、4个或5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗LAG-3单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)包含本发明的或与本发明相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR1区；(b)包含本发明的或与本发明相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR2区；(c)包含本发明的或与本发明相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；(d)包含本发明的或与本发明相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；(e)包含本发明的或与本发明相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；以及(f)包含本发明的或与本发明相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
本发明的工程化的抗体包括其中已经对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，例如以改善抗体的特性的那些抗体。通常，进行这样的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体地，已经经历了体细胞突变的抗体可以含有与作为所述抗体的来源的种系序列不同的框架残基。这样的残基可以通过将抗体框架序列与作为抗体的来源的种系序列进行比较来鉴定。
另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也被称为“去免疫化”并且更详细地描述于美国专利公布号20030153043中。
除了在框架区或CDR区内进行修饰之外或作为在框架区或CDR区内进行修饰的替代方案，可以对本发明的抗体进行工程化以在Fc区内包括修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如可以将一个或多个化学部分连接到所述抗体上)，或对其进行修饰以改变它的糖基化，从而再次改变所述抗体的一种或多种功能特性。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰以使得铰链区中半胱氨酸残基的数量改变，例如增加或减少。这种方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中以使得相对于天然Fc铰链结构域SpA结合，所述抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法更详细地描述于美国专利号6,165,745中。
在又一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其引起一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点处的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
本公开考虑的对本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体进行聚乙二醇化以例如延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体进行聚乙二醇化，通常在其中使一个或多个PEG基团连接到抗体或抗体片段上的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选的是，经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用的术语“聚乙二醇”意图涵盖已经用于衍生化其它蛋白质的PEG的形式中的任一种，如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
抗体物理特性
本发明的抗体可以通过它们的各种物理特性来表征，以检测和/或区分其不同的类别。
例如，抗体可以在轻链可变区或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。这样的糖基化位点由于改变的抗原结合而可能导致抗体的免疫原性增加或抗体的pK改变(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem41:673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol172:5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology12:43R-56R；Parekh等(1985)Nature 316:452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。在一些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗TIM-3抗体。这可以通过选择在可变区中不含所述糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变来实现。
在一个优选的实施方案中，所述抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能在N-G或D-G序列上发生并且引起异天冬氨酸残基的产生，这将弯结引入到多肽链中并且降低了它的稳定性(异天冬氨酸作用)。
每一种抗体将具有独特的等电点(pI)，其一般落入6至9.5的pH值范围内。IgG1抗体的pI值通常落入7-9.5的pH值范围内并且IgG4抗体的pI值通常落入6-8的pH值范围内。据推测，具有在正常范围之外的pI值的抗体在体内条件下可能具有一些解折叠和不稳定性。因此，优选具有含有落入正常范围内的pI值的抗TIM-3抗体。这可以通过选择具有在正常范围内的pI值的抗体或通过使带电荷的表面残基突变来实现。
编码本发明的抗体的核酸分子
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。所述核酸可以全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术纯化去除其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“变成基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或可以不含内含子序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如如下文进一步描述，从携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从所述基因文库中回收编码这样的抗体的核酸。
本发明的优选的核酸分子包括编码TIM-3单克隆抗体的VH和VL或CDR序列的核酸分子。一旦获得了编码VH区段和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如以将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，将编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质，如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段可操作地连接。如本文中所用的术语“可操作地连接”意图意指将两个DNA片段连接以使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子可操作地连接来将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作地连接。
可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接来将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增来获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段可操作地连接，以使得VH序列和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中VL区和VH区由柔性接头连接(参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。
本发明的单克隆抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可以使用Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术产生。用于产生单克隆抗体的其它实施方案包括B淋巴细胞的病毒或致癌转化和噬菌体展示技术。嵌合抗体或人源化抗体也是本领域公知的。参见例如美国专利号4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，这些文献的内容具体地以引用的方式整体并入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人类单克隆抗体。针对人类TIM-3的这样的人类单克隆抗体可以使用携带一部分人类免疫系统而不携带小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为HuMAb MouseTM和KMMouseTM的小鼠，并且在本文中统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb MouseTM(MedarexTM公司)含有编码未重排的人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，所述小鼠表现出降低的小鼠IgM或κ表达，并且响应于免疫接种，引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人类IgGκ单克隆抗体(Lonberg等(1994)(同上)；在Lonberg(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology(《实验药理学手册》),113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93；以及Harding和Lonberg(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546中综述)。HuMAb MouseTM的制备和使用以及这样的小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor等(1992)Nucleic Acids Research20:6287-6295；Chen等(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics4:117-123；Chen等(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor等(1994)International Immunology 6:579-591；以及Fishwild等(1996)NatureBiotechnology 14:845-851中，所有这些文献的内容在此具体地以引用的方式整体并入本文。还参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429；和5,545,807；PCT公布号WO 92/03918；WO 93/12227；WO 94/25585；WO97/13852；WO 98/24884；WO 99/45962和WO 01/14424，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。
在另一个实施方案中，本发明的人类抗体可以使用在转基因和转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠产生。这种小鼠在本文中被称为“KM MouseTM”，并且详细描述于PCT公布WO 02/43478中。还包含内源性FcγRIIB受体基因的纯合破坏的这种小鼠的修饰形式也在PCT公布WO 02/43478中描述并且在本文中被称为“KM/FCGR2D小鼠”。此外，可以使用带有HCo7或HCo12重链转基因或这两者的小鼠。
另外的转基因动物实施方案包括Xenomouse(Abgenix公司，美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963)。另外的实施方案包括“TC小鼠”(Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727)和携带人类重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20:889-894；PCT公布WO 02/092812)。这些专利和出版物的内容具体地以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的人类单克隆抗体是使用噬菌体展示方法筛选人类免疫球蛋白基因的文库来制备的。参见例如美国专利号5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908；5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；和6,593,081，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。
本发明的人类单克隆抗体也可以使用SCID小鼠来制备，已经在所述SCID小鼠中重建了人类免疫细胞以使得在免疫接种后可以产生人类抗体应答。参见例如美国专利号5,476,996和5,698,767，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。
在另一个实施方案中，使用噬菌体展示来制备人类抗TIM-3抗体，其中所述噬菌体包含编码在先前接受TIM-3免疫接种的转基因动物中产生的抗体的核酸。在一个优选的实施方案中，所述转基因动物是HuMab、KM或Kirin小鼠。参见例如美国专利号6,794,132，该文献的内容以引用的方式整体并入本文。
人类Ig小鼠的免疫接种
在本发明的一个实施方案中，用TIM-3抗原的纯化或富集制剂、重组TIM-3蛋白或表达TIM-3蛋白的细胞对人类Ig小鼠进行免疫接种。参见例如Lonberg等(1994)(同上)；Fishwild等(1996)(同上)；PCT公布WO 98/24884或WO 01/14424，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。在一个优选的实施方案中，用5μg-50μg的LAG-3蛋白对6周-16周大的小鼠进行免疫接种。可选地，使用与非LAG-3多肽融合的LAG-3的一部分。
在一个实施方案中，用于完全弗氏佐剂(Freund's adjuvant)中的TIM-3抗原对转基因小鼠进行腹膜内(IP)或静脉内(IV)免疫接种，继而用于不完全弗氏佐剂中的抗原进行后续的IP或IV免疫接种。在其它实施方案中，使用除弗氏佐剂以外的佐剂或不存在佐剂的全细胞。可以通过ELISA筛选血浆并且可以使用来自具有足够滴度的抗TIM-3人类免疫球蛋白的小鼠的细胞进行融合。
产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生会产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自接受免疫接种的小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞并且使其与适当的永生化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞系融合。可以针对抗原特异性抗体的产生来筛选所得的杂交瘤。杂交瘤的产生是本领域公知的。参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》),纽约的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications,New York)。
产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生
本发明的抗体也可以使用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。在一个实施方案中，将通过标准的分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一种或多种表达载体中以使得所述基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在本文中，术语“可操作地连接”意图意指将抗体基因连接到载体中以使得所述载体内的转录和翻译控制序列发挥它们的预期的调控抗体基因的转录和翻译的功能。
术语“调控序列”意图包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这样的调控序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology(《基因表达技术》)：Methods in Enzymology(酶学方法)185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,Calif.)(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括引导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，如源自于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。可选地，可以使用非病毒调控序列，如泛素启动子或β-球蛋白启动子。更进一步，调控元件由来自不同来源的序列构成，如SRα启动子系统，所述SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子和1型人类T细胞白血病病毒的长末端重复序列的序列(Takebe等(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。
可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同的或单独的表达载体中。在优选的实施方案中，使用可变区以通过将它们插入已经编码所期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得VH区段与所述载体内的一个或多个CH区段可操作地连接并且VL区段与所述载体内的CL区段可操作地连接来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外地或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中以使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择其中已经引入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因向其中已经引入了载体的宿主细胞赋予对药物，如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在甲氨蝶呤选择/扩增的情况下用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖通常用于将外源性DNA引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞中，并且最优选地在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，这是因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR选择标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别是，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中所公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将所述宿主细胞培养足以允许所述抗体在所述宿主细胞中表达或更优选地，将所述抗体分泌到其中生长了所述宿主细胞的培养基中的时间段来产生所述抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
免疫缀合物
本发明的抗体可以与治疗剂缀合以形成免疫缀合物，如抗体-药物缀合物(ADC)。合适的治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地经由可切割的接头，如肽基、二硫化物或腙接头缀合。更优选的是，所述接头是肽基接头，如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如以下文献中所述来制备：美国专利号7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公布WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公布20060024317；20060004081；和20060247295，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。
双特异性分子
在另一个方面，本公开的特征在于双特异性分子，所述双特异性分子包含与至少一种其它功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体)连接的本发明的一种或多种抗体，以产生与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。因此，如本文所用的“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
在一个实施方案中，除了抗Fc结合特异性和抗TIM-3结合特异性之外，双特异性分子还具有第三特异性。所述第三特异性可以针对抗增强因子(EF)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合，从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，抗增强因子可以结合细胞毒性T细胞(例如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)或其它免疫细胞，从而引起针对靶细胞的免疫应答增加。
双特异性分子可以具有许多不同的形式和尺寸。在尺寸谱的一端处，双特异性分子保留了传统的抗体形式，不同的是，它不具有具相同特异性的两个结合臂，而是具有各自具有不同特异性的两个结合臂。在另一个极端处是由通过肽链连接的两个单链抗体片段(scFv's)组成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中等尺寸的双特异性分子包括通过肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其它形式的双特异性分子可以通过遗传工程化、体细胞杂交或化学方法来制备。参见例如Kufer等(上文引用)；Cao和Suresh,Bioconjugate Chemistry,9(6),635-644(1998)；和van Spriel等,Immunology Today,21(8),391-397(2000)以及其中引用的参考文献。
药物组合物
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的一种或多种抗体。所述组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物也可以在与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗的组合疗法中施用，以使抗TIM-3抗体增强针对疫苗的免疫应答。
所述药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂和其组合。合适的赋形剂的选择和使用在Gennaro编著，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药学科学与实践》)，第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中教导，其公开内容以引用的方式并入本文。
优选的是，所述药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物可以被包被在材料中以保护它防止酸和可能使它失活的其它自然条件的作用。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可选地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部施用。
药物组合物可以呈无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以被配制成微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定施用方式而变化，并且一般将是产生治疗作用的组合物的量。一般，在百分之一百中，与药学上可接受的载体组合，该量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的活性成分的范围内。
调整给药方案以提供最佳的所期望的响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间推移施用几次分次剂量或可以按比例减少或增加剂量，如由治疗情况的紧急程度所指示。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式指的是适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每一个单位含有被计算以与所需的药物载体联合产生所期望的治疗作用的预定量的活性化合物。可选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要不太频繁的施用。
对于抗体的施用，剂量在每公斤宿主体重约0.0001mg至100mg，并且更通常每公斤宿主体重0.01mg至5mg的范围内。例如，剂量可以是每公斤体重0.3mg、每公斤体重1mg、每公斤体重3mg、每公斤体重5mg或每公斤体重10mg或在1mg/kg-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每3个月至6个月施用一次。本发明的抗TIM-3抗体的优选的给药方案包括每公斤体重1mg或每公斤体重3mg，经由静脉内施用，其中使用以下给药时间表之一给予所述抗体：(i)每四周一次，持续六次剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)以每公斤体重3mg施用一次，继而以每公斤体重1mg每三周施用一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1μg/mL-1000μg/mL的血浆抗体浓度，并且在一些方法中，达到约25μg/mL-300μg/mL的血浆抗体浓度。
“治疗有效剂量”的本发明的抗TIM-3抗体优选地引起疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加或预防由于疾病困扰引起的障碍或残疾。例如，对于治疗携带肿瘤的受试者，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将肿瘤生长抑制至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，并且还更优选地至少约80％。治疗有效量的治疗性化合物可以在受试者中减小肿瘤尺寸或以其它方式改善症状，所述受试者通常是人类或可以是另外的哺乳动物。
所述药物组合物可以是受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微封装的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems(《持续和受控释放药物递送系统》),J.R.Robinson编著,纽约的Marcel Dekker公司(Marcel Dekker,Inc.,New York),1978。
治疗组合物可以经由医疗装置施用，如(1)无针皮下注射装置(例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微型输注泵(美国专利号4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，可以配制本发明的人类单克隆抗体以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗性抗体穿过血脑屏障，可以将它们在脂质体中配制，所述脂质体可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180；Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090；Keinanen和Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；以及Killion和Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体(组合物、双特异性分子和免疫缀合物)具有许多体外和体内效用，包括例如通过阻断TIM-3来增强免疫应答。这样的抗体可以在体外或离体向培养中的细胞施用，或例如在体内向人类受试者施用，以在多种情况下增强免疫力。因此，在一个方面，本发明提供了一种在受试者中调节免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，以使得调节所述受试者中的免疫应答。优选的是，增强、刺激或上调所述应答。
优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法特别适用于治疗患有可以通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)来治疗的病症的人类患者。在一个特定的实施方案中，所述方法特别适用于体内治疗癌症。为了实现抗原特异性免疫力增强，可以将抗TIM-3抗体与所关注的抗原一起施用或所述抗原可能已经存在于待治疗的受试者(例如携带肿瘤或携带病毒的受试者)体内。当将针对TIM-3的抗体与另一种药剂一起施用时，这两者可以按任何一种顺序或同时施用。
鉴于本发明的抗TIM-3抗体抑制TIM-3与半乳凝素9或Ptdser分子的结合并活化抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的能力，本发明还提供了使用所述抗体增强或上调抗原特异性T细胞应答的体外方法和体内方法。例如，本发明提供了增强抗原特异性T细胞应答的方法，所述方法包括使所述T细胞与本发明的抗体接触，使得抗原特异性T细胞应答增强或上调。
本发明还提供了用于在受试者中刺激免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，从而刺激所述受试者中的免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)。在一个优选的实施方案中，所述受试者是携带肿瘤的受试者并且刺激了针对所述肿瘤的免疫应答。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是携带病毒的受试者并且刺激了针对所述病毒的免疫应答。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，从而在所述受试者中抑制所述肿瘤的生长。在又一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，从而在所述受试者中治疗所述病毒感染。
本发明的这些和其它方法更详细地论述于下文中。
癌症
抗体对TIM-3的阻断可以增强患者对癌细胞的免疫应答。在一个方面，本发明涉及使用抗TIM-3抗体在体内治疗受试者，从而抑制癌性肿瘤的生长。抗TIM-3抗体可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。可选地，抗TIM-3抗体可以与其它免疫原性剂、标准癌症治疗或其它抗体结合使用，如下文所述。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分。优选的是，所述抗体是嵌合的、人的或人源化的抗TIM-3抗体。
可以使用本发明的抗体抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫治疗有响应的癌症。
组合治疗
在另一个方面，本发明提供了组合治疗方法，其中将本发明的抗TIM-3抗体(或其抗原结合部分)与有效刺激免疫应答的一种或多种另外的抗体共同施用，从而进一步增强、刺激或上调受试者中的免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗TIM-3抗体和一种或多种另外的免疫刺激抗体，如抗LAG-3抗体、抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体，从而在所述受试者中刺激免疫应答，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用抗TIM-3抗体和另一种抗体，例如抗LAG-3抗体、抗PD-1抗体和/或CTLA-4抗体。
在某些实施方案中，本文所讨论的治疗性抗体的组合可以作为在药学上可接受的载体中的单一组合物同时施用，或者作为在药学上可接受的载体中包含每种抗体的单独的组合物同时施用。
任选地，抗TIM-3和一种或多种另外的抗体(例如抗CTLA-4抗体和/或抗LAG-3抗体和/或抗PD-1抗体)的组合可以进一步与免疫原性剂组合，如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和被编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He等(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。组合的TIM-3和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断可以进一步与疫苗接种方案组合，如上文关于使用抗TIM-3抗体的单一治疗详细论述的疫苗接种方案中的任一种。
组合的TIM-3和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断也可以进一步与标准癌症治疗组合。例如，组合的TIM-3和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断可以与化疗方案有效组合。在这些情况下，有可能减少与本公开的组合一起施用的其它化疗试剂的剂量(Mokyr等(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。这样的组合的实例是抗TIM-3和抗CTLA-4抗体和/或抗LAG-3抗体和/或抗PD-1抗体的组合进一步与氨烯咪胺组合用于治疗黑色素瘤。另一个实例是抗TIM-3和抗CTLA-4抗体和/或抗LAG-3抗体和/或抗PD-1抗体的组合进一步与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。TIM-3和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断与化疗的组合使用的科学依据是，作为大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果的细胞死亡应当引起抗原提呈途径中肿瘤抗原的水平升高。可以通过细胞死亡与组合的TIM-3和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断产生协同效应的其它组合治疗包括放疗、手术或激素剥夺。这些方案中的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与组合的TIM-3和CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断组合。抑制血管生成会引起肿瘤细胞死亡，这可以是向宿主抗原提呈途径中供给的肿瘤抗原的来源。
通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应当被解释为构成进一步的限制。在整个本申请中所引用的所有附图和所有参考文献、基因库(Genbank)序列、专利和公开的专利申请的内容明确地以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1噬菌体淘选、筛选和亲和力成熟
噬菌体文库
抗体单链噬菌体展示文库通过克隆轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的组库来产生。重链和轻链组库通过主要从外周收集的人类淋巴细胞的PCR扩增来产生。将VL组库与VH组库混合并用重叠引物进行PCR。抗体的最终形式是具有通过柔性接头肽(GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:51))连接的VH片段和VL片段的单链Fv(scFv)。
针对人类TIM3的噬菌体文库淘选
展示特异性scFv片段的噬菌体颗粒的选择在Immuno 96MicroWellTM板(Nunc，Denmark)上进行。首先，将磷酸盐缓冲盐液(PBS)中的50μg/ml TIM3重组蛋白(AcroBiosystems，目录#TM3-H5229)在4℃下包被在板上过夜。用PBS(2％MPBS)中的2％(w/v)奶粉封闭之后，加入含有约1011个噬菌体颗粒的文库并将板在室温(RT；25-28℃)下孵育2小时。通过用含0.1％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤10-20次，然后用PBS洗涤10-20次来消除未结合的噬菌体。通过与50μl的1μg/μl胰蛋白酶一起孵育10分钟，继而与50μl的50mM盐酸甘氨酸(pH 2.0)一起孵育(在10分钟之后立即用50μl的200mM Na2HPO4(pH 7.5)中和)来洗脱结合的噬菌体。进行了四轮淘选。
噬菌体筛选
从第三轮和第四轮淘选输出中，挑选噬菌体并测试其与人类TIM3的结合，将人类TIM3(AcroBiosystems，目录#TM3-H5229)以0.1μg/mL包被在96孔板上，将单一克隆噬菌体加入板中，洗去未结合的噬菌体，并通过抗M13二抗(Abcam，目录#ab50370)检测结合。
对ELISA阳性克隆进行测序，从中鉴定出10个独特的序列，包括克隆TIM3-6、TIM3-4G7和TIM3-11。抗TIM3抗体TIM3-6、TIM3-4G7和TIM3-11的重/轻链可变区的氨基酸序列ID号总结于表1中。
亲和力成熟
为了提高TIM3-6的结合亲和力，构建了VH和VL的两个噬菌体文库用于淘选。4轮淘选后，通过ELISA筛选测试变体与人类TIM3(AcroBiosystems，目录#TM3-H5229)的阳性结合。阳性变体的解离速率等级由Octet Red 96(Fortebio)确定。挑选出解离速率提高的克隆，并将其转化为全长IgG用于分析。抗TIM3抗体TIM3-6.10、TIM3-6.11和TIM3-6.12的氨基酸序列ID号总结于表1中。
将编码抗TIM3抗体的重链和轻链的核苷酸序列插入表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。根据制造商的说明，使用ExpiCHOTM表达系统(ThermoFisher)将载体共转染到CHO-S细胞中。将转染的细胞在ExpiCHOTM表达培养基中培养12天，然后收获培养上清液并送去用蛋白A亲和色谱法(GE Healthcare)进行纯化。
实施例2理化分析
在尺寸排阻色谱法中测试抗体TIM3-6。特别是，使用100mM磷酸钠+100mM Na2SO4、pH 7.0作为运行缓冲液将20μg样品注射在TSK G3000SWXL柱上。运行时间为30分钟。所有测量均在Agilent1220HPLC上进行。使用OpenLAB软件分析数据。
在SEC中抗体TIM3-6的主峰在95％以上，这表明经纯化抗体的纯度和完整性高。
实施例3抗TIM-3抗体与人类TIM-3特异性结合
ELISA测定用于测定抗体与重组人类TIM-3的相对结合活性。
通过在4℃下孵育过夜，将碳酸盐缓冲液(pH 9.6、1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠溶于1L水中)中的人类TIM-3蛋白(Acrobiosystems，目录#TM3-H5229)固定在96孔板上。然后将板用PBS中的1％BSA在37℃下封闭一小时。封闭后，将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。将结合缓冲液(含有0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)中的连续稀释的抗TIM-3抗体TIM3-6.12、TIM3-6、TIM3-11和TIM3-4G7、人类IgG对照(其根据US20190016800A1制备，具有SEQ ID NO:52中列出的氨基酸序列)和ABTIM3类似物(用作参考抗体，根据US2015/0218274A1制备，具有SEQ ID NO:53和54中列出的重链和轻链的氨基酸序列)分别与固定化的蛋白质在37℃下一起孵育一小时。结合后，将板用PBST洗涤3次，与结合缓冲液中稀释1/15,000的过氧化物酶标记的驴抗人类IgG(Jackson Immuno Research)在37℃下一起孵育一小时，再次洗涤，用TMB显影并用1M H2SO4终止。
测定在450nm-620nm处的吸光度。与人类TIM-3结合的克隆的EC50和代表性结合曲线如图1所示。
结果表明抗TIM3抗体与人类TIM-3特异性结合，其中抗体TIM3-6.12的结合活性与ABTIM3类似物的结合活性相当。
实施例4抗TIM-3抗体的亲和力
通过使用
Figure BDA0002717549520000391
T200系统(Biacore，GE Healthcare)的表面等离子体共振来测量抗TIM-3抗体与人类TIM-3(Acrobiosystems，目录#TM3-H5229)的动力学结合活性。
通过胺偶联化学将约6800RU的抗人类IgG(Fc)抗体(GE目录#BR-1008-39)固定在CM5传感器芯片上。将抗体(TIM3-6.10、TIM3-6.11、TIM3-6.12)注射在固定化的山羊抗人类IgG抗体的表面上。使用HBS-EP+缓冲液作为运行缓冲液。将范围从1.56nM到50nM的不同浓度的人类TIM-3蛋白注射到抗体表面上。在每次注射周期后，使用3M氯化镁溶液注射来再生CM5芯片表面。背景减除结合传感图用于分析缔合率Ka和解离率Kd，以及平衡解离常数KD。使用Biacore T200评估软件，将所得数据集与1:1的朗缪尔(Langmuir)结合模型拟合。
下表2总结了抗TIM-3抗体对重组人类TIM-3的亲和力。
表2.抗TIM-3抗体对重组人类TIM-3的亲和力
抗体# Ka(M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>) Kd(S<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
TIM3-6.10 2.02E+05 4.15E-04 2.05E-09
TIM3-6.11 2.30E+05 3.44E-04 1.50E-09
TIM3-6.12 2.23E+05 3.70E-04 1.66E-09
结果显示所述三种抗体对重组人类TIM-3具有类似的亲和力，其中抗体TIM3-6.11具有最高的亲和力。
实施例5抗TIM-3抗体不与人类TIM-1交叉反应
ELISA测定用于测定抗体与人类TIM-1的相对结合活性。
通过在4℃下孵育过夜，将人类TIM-1(Sino biological，目录#11051-HNCH)固定在96孔板上。将非特异性结合位点用PBS中的1％BSA在37℃下封闭一小时。封闭后，将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。在结合缓冲液(含有0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)中制备连续稀释的抗TIM-3抗体TIM3-6、ABTIM3类似物和人类IgG对照，并在37℃下将其与固定化的蛋白质一起孵育一小时。结合后，将板用PBST洗涤3次，与结合缓冲液中稀释1/15,000的过氧化物酶标记的驴抗人类IgG(Jackson Immuno Research)在37℃下一起孵育一小时，再次洗涤，用TMB显影并用1M H2SO4终止。
测定在450nm-620nm处的吸光度。结果表明TIM3-6不与人类TIM-1交叉反应。
实施例6抗TIM-3抗体不与人类TIM-4交叉反应
ELISA测定用于测定抗TIM-3抗体与人类TIM-4的相对结合活性。
通过在4℃下孵育过夜，将人类TIM-4(Sino biological，目录#12161-H08H)固定在96孔板上。将非特异性结合位点用PBS中的1％BSA在37℃下封闭一小时。封闭后，将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤三次。在结合缓冲液(含有0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)中制备连续稀释的抗TIM-3抗体TIM3-6、ABTIM3类似物和人类IgG对照，并在37℃下将其与固定化的蛋白质一起孵育一小时。结合后，将板用PBST洗涤3次，与结合缓冲液中稀释1/15,000的过氧化物酶标记的驴抗人类IgG(Jackson Immuno Research)在37℃下一起孵育一小时，再次洗涤，用TMB显影并用1M H2SO4终止。
测定在450nm-620nm处的吸光度。结果表明TIM3-6不与人类TIM-4交叉反应。
实施例7抗TIM-3抗体阻断半乳凝素9与TIM-3的相互作用
为了评估抗TIM-3抗体对人类TIM-3/半乳凝素9相互作用的抑制作用，使用可商购获得的试剂盒(Cisbio，目录#63ADK000CTLPEB)进行HTRF阻断测定，其中Eu3+穴状化合物标记的TIM3与Tag-Gal9反应。
为了在此测定中测试抗体，将连续稀释的抗TIM-3抗体TIM3-6、TIM3-11、TIM3-4G7、F38-2E2(ebioscience，目录#16-3109-85)、ABTIM3类似物和人类IgG对照分别加入Tim3-EuK蛋白/Tag-Gal9蛋白混合物中。将所得混合物在室温下孵育1小时，然后读取荧光发射。阻断半乳凝素9与TIM-3相互作用的IC50值和代表性曲线如图2所示。
结果表明抗TIM3抗体TIM3-6、TIM3-11和TIM3-4G7以比ABTIM3类似物和F38-2E2更低的IC50值阻断半乳凝素9与TIM-3之间的相互作用，这表明其阻断活性更好。抗体TIM3-6具有最佳的阻断活性。
实施例8抗TIM-3抗体与CHO-K1-TIM3表达的细胞表面TIM-3结合
测试抗TIM-3抗体与在CHO-K1细胞上稳定表达的人类TIM-3的结合能力。将中国仓鼠卵巢上皮细胞CHO-K1细胞系(ATCC，目录#CCL-61)维持在37℃下具有5％CO2的湿润恒温箱中的含有10％FBS的F-12K培养基中。将聚乙烯亚胺(MW25K，23966-2，Polyscience)稀释至1mg/mL，并加入到含有TIM3 cDNA(NP_116171.3)的pcDNA3.1载体中，并与其在37℃下一起孵育10分钟。将混合物加入到细胞培养物中并与其一起孵育3小时用于DNA转染。
将抗TIM3抗体在含有0.5％BSA的PBS缓冲液中连续稀释。将抗体加入到CHO-K1-TIM3细胞中并与其在4℃下一起孵育30分钟。将细胞沉淀(3分钟，600×g)，使用含有0.5％BSA的PBS缓冲液洗涤一次并重新沉淀。然后，将细胞与以1:100稀释的PE缀合的AffiniPure山羊抗人类IgG(Fcγ片段特异性)(Jackson ImmunoResearch目录#109-116-098)在4℃下一起孵育30分钟。如上所描述将细胞洗涤两次，重悬于PBS缓冲液中。然后将细胞送至BDAccuri C5流式细胞仪(BD Bioscience)用于结合活性分析。计算EC50值。抗体与TIM3结合的代表性曲线如图3所示。
结果表明TIM3-6.12与在CHO-K1细胞上稳定表达的人类TIM-3特异性结合，并且其结合活性与ABTIM3类似物的结合活性相当。
实施例9抗TIM-3抗体诱导人类T细胞释放IL-2
使用超抗原SEB刺激的人类PBMC培养物来评估抗TIM3抗体对原代T细胞的功能活性。
将来自健康供体的人类PBMC用SEB(Toxin Technology,目录#BT202)刺激48小时。将连续稀释的抗体TIM3-6.12、F38-2E2(ebioscience，目录#16-3109-85)和人类IgG对照分别加入到PBMC培养物中并与其一起孵育3天。然后，使用人类IL-2DuoSet ELISA试剂盒(R&D，目录#DY202)测量上清液中的IL-2水平。
如图4所示，抗体TIM3-6.12以30μg/mL的浓度诱导T细胞释放IL-2。
实施例10抗TIM3抗体阻断TIM-3与磷酯酰丝氨酸的相互作用磷脂酰丝氨酸-TIM-3相互作用的阻断测定如下进行。
简而言之，将Jurkat T细胞(CBTCCCAS，克隆E6-1)与1μg/mL抗人类CD95(Fas)抗体(Clone EOS9.1，Biogems，目录#08011-25-500)一起孵育16小时。当诱导Jurkat T细胞经历凋亡时，磷脂酰丝氨酸翻转到TIM-3可能与之结合的细胞的细胞外表面。
将25μl(40μg/ml)的人类TIM3-mFc蛋白(氨基酸序列在SEQ ID NO:55中列出)与膜联蛋白V结合缓冲液(Biolegend目录422201)中的25μl连续稀释的抗体(起始于1μg/mL)混合，并与其在室温(RT)下一起孵育20分钟。然后，将混合物加入到50μl结合缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中的2×105Jurkat T细胞中。在4℃下孵育40分钟后，将细胞沉淀(3分钟，600×g)，用含有0.5％BSA的结合缓冲液洗涤一次并重新沉淀。然后将以1:100稀释的PE缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)(Fcγ片段特异性)(JacksonImmunoResearch，目录#115-115-164)加入到细胞中，并用BD Accuri C5流式细胞仪分析细胞。
如图5所示，抗TIM3抗体TIM3-6.12阻断TIM3-磷脂酰丝氨酸的相互作用，其IC50值与ABTIM3类似物类似。
实施例11CHOK1-TIM3细胞对抗TIM3抗体的内在化
将抗TIM3抗体首先用pHAb胺反应性染料(Promega，G9845)根据制造商的说明进行标记，所述胺反应性染料是一种在pH值小于7.0时发荧光的pH敏感染料。
将实施例8中产生的CHOK1-TIM3在含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养。收集处于对数期的细胞、加入50μl的20μg/ml染料标记的抗体，并在37℃下孵育2小时、6小时或24小时。然后，将细胞送去用BD Accuri C5流式细胞仪进行分析。
如图6所示，检测到荧光信号，这表示抗TIM-3抗体TIM3-6.12可能已内在化到细胞内的内体(pH 6.0-6.5)和溶酶体(pH 4.5-5.5)中。
实施例12抗TIM-3抗体不与C1q结合
C1q结合是补体依赖性细胞毒性(CDC)的第一步。为了测试抗体与C1q的结合活性，进行ELISA结合测定。
简而言之，将96孔聚苯乙烯ELISA板用PBS中浓度范围为0.94-60μg/mL的抗体TIM3-6.12、利妥昔单抗类似物(用作阳性对照，根据US5736137制备，具有SEQ ID NO:56和57作为重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列)、人类IgG对照进行包被。在4℃下孵育过夜后，将板用PBST洗涤三次，然后用200μl含有1％BSA的PBS在37℃下封闭一小时。将板用PBST洗涤三次，然后加入在含有0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS中稀释的0.05μg/孔的C1q(Calbiochem，目录#204876)。在37℃下孵育一小时后，将板用PBST洗涤三次并将50μL的抗C1q抗体-HRP(1:400，abcam，目录#ab46191)加入到每个孔中。将板在室温下孵育一小时，然后用PBST洗涤三次。然后，将100μL的HRP的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB：Thermo目录#34028)加入到每个孔中，并且将板在室温下孵育20分钟。将反应用1M H2SO4终止并使用酶标仪在450nM下测量吸光度。
如图7所示，抗体TIM3-6.12不与C1q结合。
实施例12抗TIM3抗体不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
在CHO-K1-TIM3细胞上进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定。将实施例8中产生的CHO-K1-TIM3细胞以每孔10,000个细胞的密度接种，并与测定缓冲液(无酚红MEM培养基+1％FBS)中的100nM或10nM的抗TIM3抗体一起预孵育30分钟。加入来自健康供体的PBMC效应细胞以引发E/T比为10:1、25:1或50:1的ADCC效应。将Raji(CBTCCCAS，目录#TCHu 44)上的利妥昔单抗类似物的ADCC效应用作内部对照以保证测定质量。在37℃、5％CO2恒温箱中孵育24小时后，收集细胞上清液用于使用细胞毒性LDH测定试剂盒(Dojindo，目录#CK12)测量释放的LDH。在F50(Tecan)上读取OD490nm处的吸光度。根据下面的公式计算细胞裂解的百分比，
细胞裂解％＝100×(OD样品-OD靶细胞加效应细胞)/(OD最大释放-OD最小释放)。通过Graphpad Prism分析数据。
如图8所示，抗TIM3抗体TIM3-6.12在CHO-K1-Tim3细胞上不具有ADCC活性。
实施例13抗TIM3抗体不诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)
在CHO-K1-TIM3细胞上进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定。将实施例8中产生的CHO-K1-TIM3细胞以每孔5,000个细胞的密度接种，并与测定缓冲液(无酚红MEM培养基+1％FBS)中的100nM或10nM的抗体一起预孵育30分钟。然后将浓度为10vol％、20vol％和50vol％的来自健康供体的血浆加入到板中以引发CDC效应。在37℃、5％CO2恒温箱中孵育4小时后，将Cell-Titer Glo试剂(Promega，目录#G7572)加入到细胞中并在F200(Tecan)上读取RLU数据。根据下面的公式计算细胞裂解的百分比，
细胞裂解％＝100×(1-(RLU样品)/(RLU细胞+NHP))，其中NHP代表正常人类血浆。
通过Graphpad Prism分析的数据显示抗TIM3抗体TIM3-6.12在CHO-K1-Tim3细胞上不具有CDC活性。
实施例14抗TIM3抗体在大鼠中的药代动力学
评估了TIM3-6.12在大鼠中的药代动力学特征。在研究中，将TIM3-6.12以10mg/kg的剂量静脉内注射到大鼠中。在0小时与360小时(0-15天)之间的各个时间点获取血液样品。将所有样品均处理为血浆，在-70℃至-86℃下冷冻储存直至分析。通过ELISA测定血清中存在的TIM3-6.12的浓度。
表3显示了如上所测定的药代动力学特性。
表3.TIM3-6.12的药代动力学特性的总结
Figure BDA0002717549520000461
AUClast(从t＝0到时间t时的最终可测量血浆药物浓度的血浆水平时间曲线下的面积)，AUCINF_obs(浓度-时间曲线0-∞下的面积)，Vz_obs(分布体积)，Cl_obs(清除率)。
本申请中的序列总结如下。
Figure BDA0002717549520000471
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Claims (12)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的重链可变区，其中所述CDR1区、所述CDR2区和所述CDR3区包含以下氨基酸序列：
(1)分别地为SEQ ID NO:2、6和9；
(2)分别地为SEQ ID NO:1、5和9；
(3)分别地为SEQ ID NO:3、7和10；或
(4)分别地为SEQ ID NO:4、8和11；
其中所述抗体或其抗原结合片段与TIM-3结合。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含含有与SEQ ID NO:25、24、26或27具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含含有CDR1区、CDR2区和CDR3区的轻链可变区，其中所述CDR1区、所述CDR2区和所述CDR3区包含以下氨基酸序列：
(1)分别地为SEQ ID NO:14、18和21；
(2)分别地为SEQ ID NO:12、17和21；
(3)分别地为SEQ ID NO:13、17和21；
(4)分别地为SEQ ID NO:14、17和21；
(5)分别地为SEQ ID NO:15、19和22；或
(6)分别地为SEQ ID NO:16、20和23。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含含有与SEQ ID NO:29、28、30或31具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区，其中在SEQ ID NO:29中X1＝Y且X2＝N；或X1＝N且X2＝S；或X1＝Y且X2＝S。
5.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区包含与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)分别地为SEQ ID NO:25和29，其中在SEQ ID NO:29中X1＝Y且X2＝N；或X1＝N且X2＝S；或X1＝Y且X2＝S；(2)分别地为SEQ ID NO:24和28；(3)分别地为SEQ ID NO:26和30；或(4)分别地为SEQ ID NO:27和31。
6.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含具有与SEQ IDNO:33或32具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链恒定区，和/或具有与SEQ ID NO:35、34或36具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其(a)与人类TIM3结合；(b)不与TIM-1结合；(c)不与TIM-4结合；(d)抑制TIM-3与半乳凝素-9的结合；(e)抑制TIM-3与磷脂酰丝氨酸的结合；(f)诱导T细胞释放IL-2；(g)不诱导在表达TIM3的细胞上的ADCC；和/或(h)不诱导在表达TIM3的细胞上的CDC。
8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其是人类的、小鼠的、嵌合的或人源化的抗体。
9.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其还包含抗肿瘤剂。
11.一种抑制受试者中的肿瘤生长的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求9所述的药物组合物。
12.一种增强受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求9所述的药物组合物。
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