CN109790218B - 抗tim-3抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合T细胞免疫球蛋白结构域和粘液素结构域3(Tim‑3)的抗体。抗Tim‑3抗体可用于治疗、预防或诊断免疫疾病、癌性疾病、感染性疾病或可通过Tim‑3介导的功能调节的其他病理病症。

Description

抗TIM-3抗体及其用途
本申请要求于2016年8月26日提交的国际申请No.PCT/CN2016/096924的优先权，其通过引用全部并入本申请。
技术领域
本申请公开的是特异性结合T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(Tim-3)的抗体。
背景技术
T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(Tim-3，HAVCR2或CD366)是33KD I型跨膜糖蛋白，其是包含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的家族的成员，在促进慢性病毒感染和肿瘤逃避免疫监视的T细胞耗竭中起重要作用(Monney et al.,2002 Nature 415:536-541；Sanchez-Fueyo A,et al.,2003 Nat Immunol.4:1093-101；Sabatos CA,et al.,2003Nat Immunol.4:1102-10；Anderson et al.,2006 Curr Opin Immunol.18:665-669)。编码Tim-3的基因和cDNA在小鼠和人中被克隆和表征(Monney et al.,2002 Nature 415:536-541；McIntire et al.,2001 Nat.Immunol.2:1109-1116)。成熟的人Tim-3含有280个氨基酸残基(NCBI登录号:NP_116171.3)。其胞外域(extracellular domain)由氨基酸残基1-181组成，跨膜结构域和胞质C-末端尾部包含残基182-280。没有已知的抑制性信号传导基序，诸如在胞质结构域中发现的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)和酪氨酸转换基序(switch motif)(ITSM)。
Tim-3最初在Th1细胞中被鉴定出来。随后的研究显示除了T细胞之外，Tim-3还在其他类型的免疫细胞，诸如NK细胞、巨噬细胞、DC和肥大细胞中表达(Hastings et al.,2009 Eur J Immunol 39:2492-2501；Anderson et al.,2007 Science 318:1141-1143；Phong BL,et al.,2015 J Exp Med.pii:jem.20150388)。Tim-3很少在其他人体组织中表达。在T细胞中，Tim-3表达通过TCR/CD3活化而被正调控(Hastings et al.,2009 Eur JImmunol 39:2492-2501)。此外，普通的γ链细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15和IL-21)也以PI-3激酶依赖性方式增加Tim-3表达(Mujib S,et al.,2012 J Immunol.188:3745-56)。肿瘤微环境(TME)中的T细胞通常与其他“检查点”抑制性免疫受体诸如PD-1、Lag-3和Tigit共表达Tim-3(Fourcade J,et al.,2010 J Exp Med.207:2175-86；Gros A,et al.,2014 JClin Invest.124:2246-59)。
迄今为止，已经报道了几种Tim-3配体(Tim-3L)，其包括半乳糖凝集素-9和磷脂酰丝氨酸(PtdSer)，被认为是两种主要的Tim-3配体(Anderson AC,2012Curr OpinImmunol.24:213-6)。Tim-3L与Tim-3受体的结合诱导抑制T细胞活化的细胞内信号传导，从而导致细胞增殖、IL-2和IFN-γ分泌减少(Dekruyff et al.,2010 J.Immunol.184:1918-1930；Zhu et al.,2005 Nat.Immunol.6:1245-1252)。T细胞中Tim-3信号传导的详细机制仍然剩下大部分未知。一些研究显示，Tim-3可被募集到免疫突触并在与TCR相互作用时隔离Src激酶Lck，由此抑制其信号传导，特别是NFAT信号传导途径(Tomkowicz B,et al.,2015PLoS One 10:e0140694；Clayton KL,et al.,2014 J.Immunol.192:782-91)。
在癌症和病毒感染中，Tim-3信号传导的活化促进免疫细胞功能障碍，导致癌症生长物(outgrowth)或扩大的病毒感染。在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、巨噬细胞和肿瘤细胞中Tim-3表达的上调已经在许多类型的癌症诸如肺癌(Zhuang X,et al.,Am J ClinPathol 2012 137:978-985)、肝癌(Li H,et al.,Hepatology 2012 56:1342-1351)、胃癌(Jiang et al.,PLoS One 2013 8:e81799)、肾癌(Komohara et al.,Cancer ImmunolRes.2015 3:999-1000)、乳腺癌(Heon EK,et al.,2015 Biochem Biophys ResCommun.464:360-6)、结肠癌(Xu et al.,Oncotarget 2015)、黑素细胞癌(Gros A,et al.,2014 J Clin Invest.2014 124:2246-2259)和子宫颈癌(Cao et al.,PLoS One 2013 8:e53834)中报道。这些癌症中Tim-3表达的增加与患者生存预后不良的结果相关。Tim-3信号的上调不但在对癌症的免疫耐受中起重要作用，而且对慢性病毒感染也起作用。在HIV和HCV感染期间，T细胞上Tim-3的表达显著高于健康人，并且与病毒载量和疾病进展呈正相关(Jones RB,et al.,2008 J Exp Med.205:2763-79；Sakhdari A,et al.,2012 PLoS One7:e40146；Golden-Mason L,et al.,2009J Virol.83:9122-30；2012 Moorman JP,et al.,J Immunol.189:755-66)。此外，阻断Tim-3受体单独或与PD-1/PD-L1阻断联合可在体外和体内拯救功能性“耗尽”的T细胞(Dietze KK,et al.,2013 PLoS Pathog 9:e1003798；Golden-Mason L,et al.,2009 J Virol.83:9122-30)。因此，通过治疗剂调节Tim-3信号传导可能使免疫细胞例如T细胞、NK细胞和巨噬细胞
Figure GDA0001977724640000031
免于耐受，诱导有效的免疫响应以根除肿瘤或慢性病毒感染。
已经报道了一些抗体可在与其在细胞表面上的靶标结合时被内化(Hurwitz E,etal.,1995,Proc Natl Acad Sci USA 92:3353-7；Poul MA,et al.,2000,J Mol Biol.301:1149-61；Fischer E,et al.,2012,Clin Cancer Res.18:6208-18)。抗体诱导的受体胞吞作用导致细胞表面受体的下调和受体依赖性信号传导的抑制(Liu L,et al.,2014,ClinCancer Res.20:6059-70)。由于抗体内化会降低受体的表面表达，通常需要对受体的抗体进行持久的内化。
因此，需要对Tim-3受体具有高亲和力和特异性的抗Tim-3抗体，并且优选进一步具有Tim-3受体的持久内化。
发明内容
本申请公开的是以高亲和力和特异性结合Tim-3的抗体分子。具体而言，本申请公开的抗Tim-3抗体提供了Tim-3受体持续或持久的内化。还提供的是编码抗体分子的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于制备抗体分子的方法。也提供了包含抗体分子的药物组合物。本申请公开的抗Tim-3抗体分子可单独使用或与其他药剂或治疗形式组合使用，以治疗、预防和/或诊断与由Tim-3介导的细胞内信号传导的免疫细胞抑制相关的疾病，例如，免疫病症、癌症、感染性疾病、克罗恩病、脓毒病、全身炎症反应综合征(SIRS)和肾小球肾炎。因此，本申请公开了使用抗Tim-3抗体分子治疗上述各种病症或疾病的组合物和方法，并且还提供了抗Tim-3抗体分子在制备用于治疗上述各种病症或疾病的药物中的用途。
在某些方面，本申请提供了能够结合人Tim-3的抗Tim-3抗体，其包括至少1个、2个、3个、4个、5个或6个互补决定区(CDR)，其包含SEQ ID NO 3-8或26-27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个或3个来自重链可变区(VH)的CDR，所述重链可变区包含SEQ ID NO 3-5或26的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个或3个来自轻链可变区(VL)的CDR，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 6-8或27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个、3个、4个、5个或6个来自重链和轻链可变区的CDR，所述重链和轻链可变区包含SEQ ID NO 3-8或26-27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括6个来自重链和轻链可变区的CDR，所述重链和轻链可变区包含SEQ ID NO 3-8或26-27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含1个、2个或3个选自SEQ ID NO 3、4、5或26的CDR氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和/或
(b)轻链可变区(VL)，其包含1个、2个或3个选自SEQ ID NO 6、7、8或27的CDR氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 4的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO8的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 26的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO8的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；
(c)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 4的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO27的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；或
(d)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 26的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO27的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 4的VH-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 8的VL-CDR3氨基酸序列；或
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 26的VH-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 27的VL-CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是人源化抗体分子。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是人源化单克隆抗体(mAb)分子。
在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO 9、17、28或40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO 9、17或28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO 11、19、30或36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(c)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(d)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(e)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(f)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(g)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(h)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(i)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(j)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(k)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(l)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(m)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(n)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(o)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；或
(p)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(c)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(d)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(e)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(f)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(g)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(h)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(i)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(j)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(k)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；或
(l)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(d)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(e)包含SEQ ID NO 40的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(d)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含所述抗体包含与SEQ ID NO 13、22或32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含与SEQ ID NO 15、24、34或38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(b)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(c)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(d)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(e)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(f)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(g)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(h)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(i)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(j)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(k)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或
(l)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列的轻链；
(c)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列的轻链；或
(d)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含以下的一种或多种：
(a)在SEQ ID NO 24的1位具有天冬氨酸到谷氨酸突变的轻链；
(b)在SEQ ID NO 24的4位具有亮氨酸到甲硫氨酸突变的轻链；
(c)在SEQ ID NO 24的62位具有缬氨酸到异亮氨酸突变的轻链；
(d)在SEQ ID NO 24的74位具有天冬氨酸到谷氨酸突变的轻链；
(e)在SEQ ID NO 24的96位具有甲硫氨酸到亮氨酸突变的轻链；
(f)在SEQ ID NO 22的59位具有苯丙氨酸到酪氨酸突变的重链；
(g)在SEQ ID NO 22的60位具有脯氨酸到缬氨酸突变的重链；
(h)在SEQ ID NO 22的77位具有丝氨酸到苏氨酸突变的重链；或
(i)在SEQ ID NO 22的78位具有半胱氨酸到亮氨酸突变的重链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(ScFv)。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，和κ或λ型的轻链恒定区或其变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含变体人IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO21的氨基酸序列，和人κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是分离的或重组体。
在某些方面，本申请提供了组合物，例如，药物组合物，其包含本申请所述的抗体分子的至少一种，和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包括抗Tim-3抗体和一种或多种其他药剂的组合，例如，治疗剂或其他抗体分子。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体与标记或治疗剂缀合。
在某些方面，本申请还提供了刺激受试者的免疫响应的方法。所述方法包括向受试者单独施用或与一种或多种药剂或操作组合施用本申请所述的抗体(例如，治疗有效量的抗Tim-3抗体分子)。
在某些方面，本申请还提供了治疗(例如，一种或多种降低、抑制或延迟进展)受试者的癌症或肿瘤的方法。所述方法包括，向受试者单独施用或与一种或多种药剂或操作组合施用本申请所述的抗体(例如，治疗有效量的抗Tim-3抗体分子)。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体与化学疗法、靶向疗法、溶瘤药物、细胞毒剂、基于免疫的疗法、细胞因子、外科手术、放射操作、协同刺激分子的活化剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法组合施用。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体与选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR的免疫检查点分子的抑制剂组合施用。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体与抗PD-1 mAb 317-4B6(也称为Hu317-4B6,317-4B6/IgG4mt10，在美国专利No.8,735,553中描述)组合施用。
在某些实施方案中，癌症包括，但不限于，肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、头颈癌或癌症的转移病灶。
在另外的方面，本申请提供了治疗感染性疾病的方法，其包括向受试者单独施用或与一种或多种药剂或操作组合施用治疗有效量的本申请所述的抗Tim-3抗体。在一些实施方案中，感染性疾病是选自HIV感染和HCV感染的慢性病毒感染性疾病。
在一些方面，本申请还提供了抗Tim-3抗体分子在制备用于治疗本申请所述的各种病症或疾病的药物中的用途。
本申请所述的抗Tim-3抗体分子显示一套特别的效应物功能和物理化学特性，其可抑制免疫细胞中Tim-3介导的细胞信号传导，重新活化免疫细胞并增强免疫力。并且，具有修饰重链恒定区的全长人IgG1形式的mAb在效应物功能方面具有一套独特的特征。抗Tim-3 mAb也被人源化，与人抗体分子具有高度相似性。此外，抗Tim-3抗体可与抗PD-1抗体协同作用，在体外活化T细胞，减少肿瘤生长。因此，本申请公开的抗Tim-3抗体在治疗癌症、病毒感染和理论上与免疫耐受或“耗尽”相关的其他人类疾病中可具有治疗效用。
附图说明
图1显示Tim-3-mIgG2a(顶部)和Tim-3-huIgG1(底部)的示意图，其中L是接头，N是N末端，C是C末端。
图2A-2B显示抗Tim-3抗体的系统发生树(phylogenetic tree)。图2A显示抗Tim-3抗体重链可变(Vh)区的系统发生树；图2B显示抗Tim-3抗体轻链可变(Vl)区的系统发生树。使用DNASTAR`s Megalign软件比对总共23个Tim-3 Vh和20个Vκ序列。在系统发生树中展现出序列同源性。
图3显示在ELISA中hu425-2E-1和hu425-2F-1的Tim-3结合亲和力与hu425-1-1的Tim-3结合亲和力的比较。
图4显示在ELISA中mAbs 1G5和Ab2000与hu425-2-3b一起的Tim-3结合亲和力。
图5显示通过抗Tim-3抗体hu425-2-3b抑制Tim-3介导的吞噬作用。
图6显示在原代人PBMC中通过包括ch425和hu425-1-1的抗Tim-3抗体活化IFN-γ分泌。
图7显示通过抗Tim-3抗体hu425-2-3b活化CMV特异性人T细胞。
图8A-8B显示抗Tim-3抗体hu425-2-3b促进NK细胞介导的细胞毒性。
图9显示抗Tim-3抗体hu425-2-3b降低Tim-3受体的表面表达。
图10显示抗Tim-3抗体(hu425-2-3b、Ab1和Ab2)的Tim-3受体的内化。
图11显示抗Tim-3抗体hu425-2-3b单独或与抗PD-1抗体hu317-4B6组合增强MLR中的IFN-γ分泌。
图12A-12B显示抗Tim-3抗体hu425-2-3b未诱导ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。
图13显示抗Tim-3抗体ch425、抗PD-1抗体hu317-4B6及其组合在人A431同种异体的异种移植物模型(allogeneic xenograft model)中的抗肿瘤作用。
具体实施方式
定义
示例性保守氨基酸取代取代
Figure GDA0001977724640000131
Figure GDA0001977724640000141
除非在本文件中另有具体定义，否则本申请所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
除非上下文另有明确规定，否则如本申请包括所附权利要求所使用的单词的单数形式，诸如“一”、“一个”和“该”，包括它们相应的复数引用。
除非上下文另有明确规定，否则术语“或”用来指术语“和/或”，并可与术语“和/或”互换使用。
除非上下文另有需要，否则在整个说明书以及随后的权利要求中，单词“包含(comprise)”和变体诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为意味着包含所述的氨基酸序列、DNA序列、步骤或其组，但是不排除任何其他氨基酸序列、DNA序列、步骤。当在本申请中使用时，术语“包含(comprising)”可使用术语“含有”、“包括”或有时使用“具有”代替。
术语“Tim-3”包括各种哺乳动物同种型，例如，人Tim-3、人Tim-3的物种同系物和包含Tim-3中至少一个表位的类似物。并且，Tim-3，例如人Tim-3的氨基酸序列和编码该序列的核苷酸序列是本领域中已知的。
本申请中的术语“施用(administration)”、“给药(administering)”、“处理(treating)”和“治疗(treatment)”，当用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物体液时，指外源药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物体液接触。细胞的处理包括使试剂与细胞接触，以及使试剂与体液接触，其中体液与细胞接触。术语“施用(administration)”和“治疗(treatment)”也指通过试剂、诊断、结合化合物或另一种细胞进行例如细胞的体外和活体外治疗。本申请中的术语“受试者”包括任何有机体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、犬、猫、兔)，并且最优选人。
抗体或抗体分子
本申请公开的是以高亲和力和特异性结合Tim-3的抗体分子。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个、3个、4个、5个或6个互补决定区(CDR)，其包含SEQ ID NO 3-8或26-27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个或3个来自重链可变区(VH)的CDR，所述重链可变区包含SEQ ID NO 3-5或26的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个或3个来自轻链可变区(VL)的CDR，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 6-8或27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括至少1个、2个、3个、4个、5个或6个来自重链和轻链可变区的CDR，所述重链和轻链可变区包含SEQ ID NO 3-8或26-27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包括6个来自重链和轻链可变区的CDR，所述重链和轻链可变区包含SEQ ID NO 3-8或26-27的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含1个、2个或3个选自SEQ ID NO 3、4、5或26的CDR氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和/或
(b)轻链可变区(VL)，其包含1个、2个或3个选自SEQ ID NO 6、7、8或27的CDR氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 4的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO8的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 26的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO8的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；
(c)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 4的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO27的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；或
(d)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 26的VH-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体和SEQ ID NO27的VL-CDR3氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 4的VH-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 8的VL-CDR3氨基酸序列；或
(b)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO 3的VH-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 26的VH-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 5的VH-CDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO 6的VL-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO 7的VL-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO 27的VL-CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是人源化抗体分子。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是人源化单克隆抗体(mAb)。
在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO 9、17、28或40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO 9、17或28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含与SEQ ID NO 11、19、30或36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(c)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(d)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(e)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(f)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(g)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(h)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(i)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(j)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(k)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(m)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(n)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(o)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；或
(q)与SEQ ID NO 40的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(c)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(d)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(e)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(f)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(g)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(h)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(i)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(j)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(k)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；或
(l)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(d)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(e)包含SEQ ID NO 40的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(d)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含所述抗体包含与SEQ ID NO 13、22或32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含与SEQ ID NO 15、24、34或38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(b)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(c)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(d)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(e)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(f)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(g)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(h)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(i)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(j)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(k)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或
(l)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列的轻链；
(c)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列的轻链；或
(d)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含以下的一种或多种：
(a)在SEQ ID NO 24的1位具有天冬氨酸到谷氨酸突变的轻链；
(b)在SEQ ID NO 24的4位具有亮氨酸到甲硫氨酸突变的轻链；
(c)在SEQ ID NO 24的62位具有缬氨酸到异亮氨酸突变的轻链；
(d)在SEQ ID NO 24的74位具有天冬氨酸到谷氨酸突变的轻链；
(e)在SEQ ID NO 24的96位具有甲硫氨酸到亮氨酸突变的轻链；
(f)在SEQ ID NO 22的59位具有苯丙氨酸到酪氨酸突变的重链；
(g)在SEQ ID NO 22的60位具有脯氨酸到缬氨酸突变的重链；
(h)在SEQ ID NO 22的77位具有丝氨酸到苏氨酸突变的重链；或
(i)在SEQ ID NO 22的78位具有半胱氨酸到亮氨酸突变的重链。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(ScFv)。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区或其变体，和κ或λ型的轻链恒定区或其变体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的变体重链恒定区，其中变体重链恒定区提供了减少或消除的效应物功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含人IgG1的重链恒定区或其变体。在更优选的实施方案中，抗Tim-3抗体包含人IgG1的变体重链恒定区，其包含一种或多种选自下组的突变：E233P、L234A、L235A、L236Δ和P329A。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含变体人IgG1重链恒定区，其包含SEQ ID NO 21的氨基酸序列，和人κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体是分离的或重组体。
在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含至少一个抗原结合位点，或至少一个可变区。在一些实施方案中，抗Tim-3抗体包含来自本申请所述的抗体的抗原结合片段。
本申请中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖抗体(包括全长单克隆抗体)和抗体片段，只要它们识别抗原，例如Tim-3、PD-1。抗体通常是单特异性的，但是也可描述为自特异性的(idiospecific)、异特异性的(heterospecific)或多特异性的(polyspecific)。抗体分子通过特异性结合位点结合抗原上的特异性抗原决定簇或表位。
本申请中的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”指基本上同源的抗体的群体，即除了可能少量存在的自然发生的突变之外，包含在氨基酸序列相同的群体中的抗体分子。与之相比，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量在它们的可变结构域，特别是它们的通常对不同表位具有特异性的互补决定区(CDR)中具有不同氨基酸序列的不同抗体。修饰语“单克隆”表示抗体获自基本上同源的抗体群体的特点，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体(mAb)可通过本领域技术人员已知的方法获得。参见，例如Kohler Get al.,Nature 1975 256:495-497；美国专利申请No.4,376,110；Ausubel FM et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992；Harlow E et al.,ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL,Cold spring Harbor Laboratory 1988；和Colligan JE et al.,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993。本申请公开的mAb可以是包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA的任何免疫球蛋白种类及其任何亚类。产生mAb的杂交瘤可在体外或在体内培养。高mAb效价可在体内生产中获得，其中将来自单个杂交瘤的细胞腹膜内注射至小鼠，诸如原始-始发态(pristine-primed)Balb/c小鼠，产生含有高浓度所需mAb的腹水。同种型IgM或IgG的mAb可使用本领域技术人员已知的柱色谱法从这样的腹水或从培养上清液中纯化。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包含两个相同多肽链对，每对具有一条“轻链”(大约25kDa)和一条“重链”(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的具有大约100至110个或更多个氨基酸的可变区。重链的碳末端部分可定义为主要负责效应物功能的恒定区。通常，人轻链被分为κ和λ轻链。此外，人重链通常被分为α、δ、ε、γ或μ，并且分别将抗体的同种型定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。
每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中以外，两个结合位点通常相同。
通常，重链和轻链两者的可变结构域包含三个高变区，也称为“互补决定区(CDR)”，其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常通过框架区对齐，从而能够结合特定表位。通常，从N末端到C末端，重链和轻链可变结构域两者均包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。通常，根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.；5<m>ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,et al.,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia,et al,(1987)J Mol.Biol.196:901-917 or Chothia,et al,(1989)Nature 342:878-883的定义，将氨基酸分配至每个结构域。
术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”(即,轻链可变结构域的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3和重链可变结构域的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3)的氨基酸残基。参见，Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(通过序列定义抗体的CDR区)；也可参见Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基指除了高变区残基之外在本申请中被定义为CDR残基的那些可变结构域残基。
除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如，保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括，但不限于，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如，单链Fv(ScFv)；纳米抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
特异性结合特定靶蛋白的抗体被描述为特异性结合特定靶蛋白。这意味着与其他蛋白相比，抗体显示出优先结合该靶标，但是这种特异性不需要绝对结合特异性。例如，在不产生不良结果诸如假阳性的情况下，如果其结合是样品中靶蛋白存在的决定性因素，则抗体被认为对于其预期靶标是“特异性的”。用于本发明的抗体或其结合片段，将以比非靶蛋白的亲和力大至少两倍，优选至少10倍，更优选至少20倍，并且最优选至少100倍的亲和力结合靶蛋白。据说，本申请中的抗体特异性结合包含给定的氨基酸序列，例如成熟人Tim-3分子的氨基酸序列的多肽，如果其结合包含此序列的多肽但是不结合缺乏此序列的蛋白质。
本申请中的术语“人抗体”指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。人抗体如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则可含有鼠型碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
术语“人源化抗体”指含有来自非人(例如鼠类)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这种抗体含有极少源自非人免疫球蛋白的序列。通常，人源化抗体将包含至少一个，通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变区环(hypervariableloop)与非人免疫球蛋白的高变区环对应，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还将可选地包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的恒定区。必要时，将前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加至抗体克隆名称以区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体。虽然为了增加亲和性、增加人源化抗体的稳定性或由于其他原因可包括某些氨基酸取代，但是啮齿动物抗体的人源化形式通常将包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列。
本申请中的术语“癌症”或“肿瘤”指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征在于未受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于，肺癌(其包括小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、肾上腺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、膀胱癌、骨癌、脑癌、子宫内膜癌、头颈癌、淋巴瘤、卵巢癌、皮肤癌、甲状腺癌或癌症的转移病灶。
除非另有说明，否则术语“CDR”指免疫球蛋白可变区中的互补决定区，其使用Kabat编号系统定义。
药物组合物和试剂盒
在一些方面，本申请提供了组合物，例如，药学上可接受的组合物，其包含本申请所述的抗Tim-3抗体，与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制。本申请使用的术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
本申请中的组合物可以是各种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和输注溶液)、分散体或混悬液、脂质体和栓剂。适合的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。典型适合的组合物是可注射或输注溶液的形式。一个适合的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施方案中，抗体通过静脉输注或注射施用。在某些实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射施用。
本申请使用的术语“治疗有效量”指当向受试者施用用于治疗疾病，或者至少一种疾病或病症的临床症状时，足以进行对疾病、病症或症状的这种治疗的抗体的量。“治疗有效量”可随着抗体，疾病、病症和/或疾病或病症的症状，疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重性，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。任何给定情况中适当的量对本领域技术人员可以是显而易见的或可通过常规实验确定。在联合治疗的情况下，“治疗有效量”指有效治疗疾病、病症或状况的组合对象的总量。
“受试者”是哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类，例如人(例如，本申请所述的具有病症或处于具有病症的风险的患者)。
实施例
实施例1：抗Tim-3单克隆抗体的产生
基于传统杂交瘤技术(de StGroth and Sheidegger,1980,J Immunol Methods35:1；Mechetner,2007,Methods Mol Biol 378:1)产生许多鼠抗Tim-3单克隆抗体(mAb)。选择酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光活化细胞分选(FACS)测定中具有高结合活性的mAb进一步表征。
免疫和结合测定的Tim-3重组蛋白
基于GenBank序列(登录号：AF450242.1)合成编码全长人Tim-3(SEQ ID NO.1)的cDNA。将由Tim-3(SEQ ID NO.2)的氨基酸(AA)1-202组成的胞外域(ECD)的编码区PCR扩增，并克隆至基于pcDNA3.1的表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，其C末端融合至小鼠IgG2a(GenBank登录号:CAC20702)的Fc区或融合至人IgG1重链(UniProtKB/Swiss-Prot登录号:P01857)的Fc区，分别产生两种重组融合蛋白表达质粒Tim-3-mIgG2a和Tim-3-huIgG1。Tim-3融合蛋白的示意图示于图1。为了重组融合蛋白产生，Tim-3-mIgG2a和Tim-3-huIgG1质粒被瞬间转染至基于HEK293的哺乳动物细胞表达系统(内部开发)并在装备有旋转振荡器的CO2恒温箱中培养5-7天。收集含有重组蛋白的上清液并通过离心澄清。使用Protein G Sepharose Fast Flow柱(Cat.No.:17061805,GE Life Sciences)纯化Tim-3-mIgG2a和Tim-3-huIgG1。Tim-3-mIgG2a和Tim-3-huIgG1蛋白质用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析并以小等分试样储存在-80℃冰箱中。
稳定的表达细胞系
为了建立表达全长人Tim-3(huTim-3)或猴Tim-3(mkTim-3,该基因可从ZYAGE获得,Cat.No.:KD-702)的稳定细胞系，将Tim-3基因克隆至逆转录病毒载体pFB-Neo(Cat.No.:217561,Agilent,USA)。根据先前的方案(Zhang T,et al.,2005,Blood 106:1544-51)产生双嗜逆转录病毒载体(Dual-trophic retroviral vector)。将含有huTim-3和mkTim-3的载体分别转导至HuT78和NK92MI细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)，以产生细胞系HuT78/huTim-3和NK92MI/mkTim-3。通过在含有10％FBS和G418的完全RPMI1640培养基中培养和FACS结合测定来选择高表达细胞系。
免疫、杂交瘤融合和克隆
使用100μl含有10μg Tim-3-mIgG2a和水溶性助剂(Cat.No.:KX0210041,KangBiQuan,Beijing,China)的抗原溶液腹膜内(i.p.)免疫8-12周龄Balb/c小鼠(HFKBIOSCIENCE CO.,LTD,Beijing,China)。三周后重复该操作。第二次免疫后两周，通过ELISA和FACS评价小鼠血清的Tim-3结合。血清筛选后10天，使用50μg Tim-3-mIgG2a腹膜内增强具有最高抗Tim-3抗体血清效价的小鼠。增强后3天，分离脾脏淋巴细胞，并使用标准技术(Colligan JE,et al.,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,1993)将其融合至鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(ATCC)。
通过ELISA和FACS评估抗体的Tim-3结合亲和力
首先通过如Methods in Molecular Biology(2007)378:33-52所述的ELISA筛选杂交瘤克隆的上清液并进行一些修改。简言之，将Tim-3-huIgG1蛋白包被在96孔平板中。使用HRP连接的抗小鼠IgG抗体(Cat.No.:7076S,Cell Signaling Technology,USA)和底物(Cat.No.:00-4201-56,eBioscience,USA)进行显影(development)，并且在450nm波长的吸收信号使用酶标仪(SpectraMax Paradigm,Molecular Devices,USA)测量。ELISA阳性克隆使用上述HuT78/huTim-3或NK92mi/mkTim-3细胞通过FACS进一步验证。Tim-3表达细胞(105个细胞/孔)与ELISA阳性杂交瘤上清液一起温育，接着与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Cat.No.:A0473,Beyotime Biotechnology,China)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyte 8HT,Merck-Millipore,USA)定量细胞荧光。
来自在ELISA和FACS筛选两者中显示阳性信号的杂交瘤的条件培养基经过功能测定，在基于人免疫细胞的测定(见下节)中识别具有良好功能活性的抗体。具有所需功能活性的抗体被进一步亚克隆和表征。
杂交瘤的亚克隆和杂交瘤对无血清或低血清培养基的适应
主要通过ELISA、FACS和功能测定(在实施例7和8中描述)筛选后，阳性杂交瘤克隆通过有限稀释进行亚克隆。通过功能测定验证的顶部抗体亚克隆适应于在具有3％FBS的CDM4MAb培养基(Cat.No.:SH30801.02,Hyclone,USA)中生长。
单克隆抗体的表达和纯化
将杂交瘤细胞在CDM4MAb培养基(Cat.No.:SH30801.02,Hyclone)中培养，并且在37℃在CO2恒温箱中温育5至7天。通过离心收集条件培养基，并且在纯化前经过0.22μm膜过滤。按照制造商的指南，将含有鼠抗体的上清液施加并结合到蛋白A柱(Cat.No.:17127901,GE Life Sciences)上。将蛋白A-亲和纯化抗体用PBS透析或使用HiLoad 16/60Superdex200柱(Cat.No.:17531801,GE Life Sciences)进一步纯化以除去聚集体。蛋白质浓度通过测量在280nm的吸光度确定。将最终抗体制剂以等分试样储存在-80℃冰箱中。
实施例2.Tim-3抗体的克隆和序列分析
收获鼠杂交瘤细胞以基于制造商的方案使用Ultrapure RNA试剂盒(Cat.No.:74104,QIAGEN,Germany)制备总RNA。第一股cDNA使用来自Invitrogen(Cat.No.:18080-051)的cDNA合成试剂盒合成，鼠mAb的Vh和Vk基因的PCR扩增使用PCR试剂盒(Cat.No.:CW0686,CWBio,Beijing,China)进行。基于先前报道的序列(Brocks et al.,2001 Mol Med7:461)合成用于重链可变区(Vh)和κ轻链可变区(Vk)的抗体cDNA克隆的寡聚引物。然后将PCR产物亚克隆至pEASY-Blunt克隆载体(Cat.No.:CB101-02,TransGen,China)并测序。从DNA测序结果中推断Vh和Vk区的氨基酸序列。
鼠mAb通过比较序列同源性分析，并基于序列相似性分组(图2)。互补决定区(CDR)基于Kabat(Wu and Kabat,1970,J.Exp.Med.132:211-250)和IMGT(Lefranc,1999,NucleicAcids Research 27:209-212)系统通过序列标注并通过基于互联网的序列分析(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html)来定义。代表性顶部克隆mu425(Vh和Vk)的氨基酸序列列于下表1(SEQ ID NO.9和11)。mu425的CDR序列列于下表2(SEQ IDNO 3-8)。
表1.mu425 VH和VK区的氨基酸序列
Figure GDA0001977724640000291
表2.mu425 VH和VK区的CDR序列(氨基酸)
Figure GDA0001977724640000292
Figure GDA0001977724640000301
实施例3.通过SPR进行纯化鼠抗Tim-3抗体的亲和力测定
在ELISA和FACS中具有高结合活性，以及在基于细胞的测定(实施例7和8所述)中具有强大功能活性的Tim-3抗体通过SPR测定使用BIAcoreTM T-200(GE Life Sciences)来表征它们的结合动力学。简言之，将抗人IgG抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(Cat.No.:BR100530,GE Life Sciences)上。使人带Fc标签的Tim-3 IgV结构域流过芯片表面并且被抗人IgG抗体捕获。然后使连续稀释的纯化的鼠抗体流过芯片表面，并且分析表面等离子体共振信号的变化以通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA EvaluationSoftware,GE Life Sciences)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以koff/kon的比率计算平衡解离常数(KD)。包括mu425、mu44、mu225和mu411的顶部mAb的结合亲和力概况示于表3。
表3.通过SPR比较杂交瘤抗体结合亲和力
Figure GDA0001977724640000302
实施例4.鼠抗人Tim-3 mAb mu425的人源化
mAb人源化和工程改造
为了mu425的人源化，通过爆破IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)网站的人免疫球蛋白基因数据库搜索与mu425可变区的cDNA序列具有高度同源性的人种系IgG基因的序列。选择存在于高频率的人抗体库(human antibody repertoires)(Glanville,2009,PNAS106:20216-20221)并且与mu425高度同源的人IGVH和IGVK基因作为人源化的模板。在人源化之前，将mu425重链和轻链可变区分别融合至称为人IgG1mf(SEQ ID NO.21)的经修饰人IgG1恒定区和人κ恒定区。IgG1mf(SEQ ID NO:21)是IgG1突变体，其与野生型人IgG1比较含有突变E233P、L234A、L235A、L236Δ和P329A(基于EU系统的氨基酸编码)的组合。
人源化通过CDR移植(Methods in Molecular Biology,Vol 248:AntibodyEngineering,Methods and Protocols,Humana Press)进行，并且人源化抗体(hu425s)以人IgG1形式工程改造。在人源化的初始循环中，从鼠到人框架区的氨基酸残基的突变通过模拟3D结构来指导，并且用于保持CDR的典范结构(canonical structure)的结构重要性的鼠框架残基被保留在人源化抗体425,hu425-1-1(在SEQ ID NO.22和24中设定重链和轻链的氨基酸序列)的第一版本中。具体地，将mu425 Vk的CDR移植到保留(在SEQ ID NO.19中设定轻链可变结构域的氨基酸序列)4个鼠框架残基(D1、L4、V62和D74)的人种系可变基因IGVK3-15的框架中。将mu425 Vh的CDR移植到保留(在SEQ ID NO.17中设定重链可变结构域的氨基酸序列)1个鼠框架(C78)残基的人种系可变基因IGVH3-7的框架中。
使用内部开发的表达载体以人全长抗体形式构建Hu425-1-1，所述表达载体分别含有称为IgG1mf(SEQ ID NO.21)的人IgG1变体的恒定区和κ链，具有容易适应的亚克隆位点。hu425-1-1抗体的表达和制备通过将上述两个构建体共转染到293G细胞中并通过使用蛋白A柱(Cat.No.:17543802,GE Life Sciences)的纯化来实现。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL，并且以等分试样储存在-80℃冰箱中。
基于hu425-1-1模板，我们制备了许多将Vk框架区中保留的鼠残基转化成相应的人种系残基的单突变，其中包括Vk的D1E，L4M，V62I和D74E。所得hu425-1-2a(D1E)、hu425-1-2b(L4M)、hu425-1-2c(V62I)和hu425-1-2d(D74E)均具有与hu425-1-1相似的结合和功能活性。为了进一步改善重链的人源化水平，我们还将保留的残基C78和来自鼠序列的H-CDR2(Kabat的定义)的C末端部分改为相应的人种系残基。3种人源化抗体的规格是hu425-2A-1(Vh的F59Y)、hu425-2B-1(Vh的P60V)和hu425-2C-1(Vh的C78L)。所有人源化突变使用在特定位置含有突变的引物和定点突变试剂盒(Cat.No.FM111-02,TransGen,Beijing,China)制备。所需突变通过序列分析验证。这些hu425变体抗体在前述结合和功能测定中测试。与hu425-1-1相比，hu425-2B-1具有显著降低的结合亲和力和功能性(未显示数据)，而hu425人源化变体的其余版本具有与hu425-1-1相似的结合和功能活性。
Hu425抗体通过在CDR和框架区中引入突变来进一步工程改造，以改善人类治疗用途的分子生化和生物物理性质。考虑因素包括氨基酸组成、热稳定性(Tm)、表面疏水性和等电点(pIs)，同时保持功能活性。
总之，两种精心设计的人源化单克隆抗体的版本，hu425-2-2(在SEQ ID NO.28和30中设定重链和轻链可变区的氨基酸序列)和hu425-2-3b(在SEQ ID NO.28和36中设定重链和轻链可变区的氨基酸序列)源于上述突变过程，并且被详细表征。hu425-2-2和hu425-2-3b两者均包含H-CDR2(SEQ ID NO:26)和L-CDR3(SEQ ID NO:27)的突变。重链/轻链可变区的氨基酸序列和hu425-2-2和hu425-2-3b的6个CDR列于下表4和表5。结果显示hu425-2-3b和hu425-2-2两者在结合亲和力和功能活性，诸如抑制Tim-3介导的下游信号传导方面非常相似。
表4.hu425-2-2和hu425-2-3b的VH和VK区的氨基酸序列
Figure GDA0001977724640000321
表5.hu425-2-2和hu425-2-3b的VH和VK区的CDR序列(氨基酸)
Figure GDA0001977724640000331
对于亲和力测定，来自hu425 mAb系列的Fab使用Pierce Fab制备试剂盒(Cat.No.44985,ThermoFisher Scientific)制备，并且用于基于表面等离子共振(SPR)技术的亲和力-测定。抗Tim-3 Fab抗体的SPR测定结合概况的结果汇总于表6。hu425-2-2和hu425-2-3b的Fab具有非常相似的结合概况，平均解离常数分别为0.419nM和0.361nM，其与hu425-1-1的平均解离常数接近。
表6.通过SPR比较hu425Fab结合亲和力
Figure GDA0001977724640000332
*ch425由融合至人IgG1mf/小鼠κ恒定区的mu425可变结构域组成(在SEQ IDNO.13和15中设定重链和轻链的氨基酸序列)
**NA:不可用。
还证实了上面显示的所有人源化抗体在来自健康供体的原代人免疫细胞上的功能活性。
实施例5.通过SPR进行抗Tim-3抗体的亲和力比较
Hu425-2-3b和两种已知的Tim-3抗体，Ab1(包含SEQ ID NO:40的重链可变区和SEQID NO:41的轻链可变区)和Ab2(包含SEQ ID NO:42的重链可变区和SEQ ID NO:43的轻链可变区)，以带有S228P突变的人IgG4形式产生，并且通过使用BIAcoreTM T-200(GE LifeSciences)的SPR测定表征它们的结合动力学。
简言之，将抗人Fab抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(Cat.:BR100530,GELife Sciences)上。使抗Tim-3流过芯片表面并且被抗人Fab抗体捕获。然后使连续稀释(0.12nM至30nM)的Tim-3-his流过芯片表面，并且分析表面等离子共振信号的变化以通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA Evaluation Software,GE Life Sciences)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以koff/kon的比率计算平衡解离常数(KD)。Hu425-2-3b、Ab1和Ab2展现出相当的结合亲和力。抗体，具体地hu425-2-3b以与纳摩尔KD剂量相关方式特异性结合Tim-3。
表7.通过SPR比较抗Tim-3的结合亲和力
抗Tim-3 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
Hu425-2-3b 5.28E+05 7.78E-04 1.47E-09
Ab1 4.44E+05 1.20E-04 2.71E-10
Ab2 6.27E+05 0.0122 1.94E-08
实施例6.mu425/hu425 CDR对Tim-3结合的贡献
在人源化过程中，产生来自hu425-1-1的具有氨基酸突变的几个变体。如图3所示，两种这样的突变变体几乎完全消除了与Tim-3的结合，但是在重链的CDR3中各自仅具有中性(化学相似的)氨基酸取代，D102E(mAb称为hu425-2E-1)和G103A(称为hu425-2F-1)。那些发现支持了mu425人源化抗体中重链的CDR3对Tim-3结合功能具有显著贡献的观点。
另一方面，mu425/hu425轻链的CDR1和CDR2与小鼠种系基因IGKV3-1相同。还发现几个鼠抗体在它们的轻链可变区中含有相同的鼠种系CDR1和CDR2序列，例如Ab2000(美国专利No.7,989,597)和mAb 1G5(美国专利No.7,563,874)。我们研究了这些抗体是否还可结合Tim-3。为此，Ab2000和1G5以人IgG1mf形式产生，并且通过ELISA对Tim-3-mIg结合进行评价。如图4所示，与hu425-2-3b相比，Ab2000或1G5均不能产生任何Tim-3结合信号。因此，鼠种系基因IGKV3-1的CDR1和CDR2对Tim-3结合不充分。
为了进一步评价CDR对Tim-3结合的贡献，通过抗体hu425-2-3b和抗体Ab1彼此交换重链和轻链产生两种杂交抗体。hu425-2-3b和Ab1两者是源于小鼠的抗Tim-3，并且它们与小鼠种系IGKV3-1中的那些共用相同的L-CDR1和L-CDR2。共表达hu425-2-3b的重链和Ab1的轻链以产生杂交抗体425 HC/Ab1 LC，而杂交抗体Ab1 HC/425 LC通过共表达Ab1的重链和hu425-2-3b的轻链来制备。杂交抗体的结合活性通过生物膜干涉(BioLayerInterferometry)(ForteBio Octet)来分析。杂交抗体通过蛋白A吸头捕获，然后浸入Tim-3-his溶液用于BLI结合信号分析。观察到Ab1 HC/425 LC保留Tim-3结合能力，而捕获的425HC/Ab1 LC未能产生显著的结合信号。这表明hu425-2-3b的LC-CDR3是其与Tim3结合所需的，而其L-CDR1和L-CDR2对结合Tim3是不充分的，或可能不是结合Tim3所需的。
实施例7.通过抗Tim-3抗体阻断Tim-3介导的吞噬作用
已经显示出Tim-3经其IgV结构域结合磷酯酰丝氨酸(PtdSer)，并介导凋亡细胞的吞噬作用(DeKruyff et al.,J.Immunol,2010,184:1918-1930；Nakayama et al.,Blood,2009,113:3821-3830)。PtdSer是磷脂，其被限制在正常哺乳动物细胞中质膜的内叶，但是暴露在凋亡细胞的外表面上。PtdSer通过阻碍免疫响应参与肿瘤微环境的免疫抑制(Fadoket al.,J Clin Invest,1998,101:890-898；Frey et al.,Semin Immunopathol.,2011,33:497-516)。抗Tim-3抗体的体内施用导致凋亡细胞的清除减少，增加局部炎症并破坏免疫耐受，这表明PtdSer-Tim-3轴参与体内免疫抑制(Chabtini et al.,J.Immunol 190:88-96,2013；Nakayama et al.,Blood 113:3821-30,2009)。
为了确定抗Tim-3抗体是否能阻断Tim-3介导的吞噬作用，基于细胞的测定使用传感器和功能性读数细胞系THP-1/Tim-3，即使用全长Tim-3基因稳定转染的THP-1(ATCC,人单核细胞细胞系)来建立。在该测定中，通过使用2％乙醇过夜处理而诱导HuT78(ATCC)经受有限的凋亡，接着根据制造商的说明使用CFSE染料(Invitrogen,1μM)标记。然后，THP-1/Tim-3细胞与CFSE标记的凋亡HuT78细胞在抗Tim-3人源化抗体的存在下共同培养6小时。Tim-3介导的吞噬作用被确定为CFSE+THP-1/Tim-3与总THP-1/Tim-3细胞(门控CD3-群体)的百分比。如图5所示，hu425-2-3b剂量依赖性地抑制THP-1/Tim-3细胞对凋亡HuT78细胞的吞噬作用。
实施例8.通过与T细胞接合物表达肿瘤细胞共培养的原代人PBMC中的抗Tim-3抗体活化IFN-γ分泌
据报道，Tim-3和PD-1两者都是在活化的T细胞中表达的抑制性受体，其可能起到诱导T细胞耗竭的作用(Anderson AC.et al.,2016,Immunity 44:989-1004)。来自癌症患者的Tim-3+CD4和CD8 T细胞实际上比Tim-3-T细胞分泌更少的Th1细胞因子IFN-γ(AraiY.et al.,2012,Yonago Acta medica 55:1-9；Xu B,et al.,2015,Oncotarget 6:20592-603)。
我们已经在人PBMC中使用抗CD3 mAb OKT3活化的T细胞探索了Tim-3和抗Tim-3抗体的功能。外周血单核细胞(PBMC)使用Histopaque-1077(Cat.No.:10771,Sigma)用密度梯度离心方案从健康供体中分离。测定前的三天，PBMC使用40ng/mL抗CD3 mAb OKT3(Cat.No.:16-0037,eBioscience,USA)刺激以扩增用作效应物细胞的CD3+ T细胞。基于美国专利No.8,735,553所述的方法，称为A549/OS8的靶细胞是使用T细胞接合物(engager)(OS8)稳定转染的肺癌细胞系A549(ATCC)。OS8在N末端结构域含有抗人CD3 mAb OKT3的scFv，其直接与TCR/CD3复合物作用并活化T细胞。效应物细胞PBMC与丝裂霉素C短暂处理的A549/OS8靶细胞共同培养以模拟在TCR/CD3复合物接合时活化的T细胞对肿瘤细胞的响应。测定在96孔平底板中存在或缺乏抗Tim-3抗体下进行。在共同培养15-18小时后，培养上清液通过使用Ready-Set-Go！ELISA试剂盒(Cat.No.:88-7316,eBiosciences)的ELISA来测定IFN-γ水平。如图6所示，当A549/OS8靶细胞与效应物细胞共同培养时，抗Tim-3抗体(ch425和hu425-1-1)诱导效应物细胞中增加的IFN-γ分泌。
实施例9.通过抗Tim-3抗体活化CMV特异性人T细胞
Tim-3抗体的功能活性使用天然来源的识别人CMV PP65肽(NLVPMVATV,495-503,HLA-A2.1-限制性的)(Boeckh M,Boeckh M and Geballe AP,2011,J Clin Invest.121:1673-80)的T细胞进一步评估。简言之，来自健康供体的PBMC首先通过使用抗HLA-A2 mAb的FACS筛选。然后在含有10％FBS的完全RPMI中，使用PP65肽(>98％纯度，由GL Biochem，Shanghai合成)模拟HLA-A2+PBMC一周。
靶细胞系A549/A2.1通过HLA-A2.1的稳定转染来建立。在丝裂霉素-c(100μg/ml)处理和pp65肽(5μg/ml)脉冲30分钟后，在存在或缺乏抗Tim-3抗体或对照下，A549/A2.1细胞(104)与96孔板中的相等数量的pp65敏化PBMC共同培养过夜。培养上清液中的IFN-γ通过ELISA确定。所有条件一式三份进行。如图7所示，hu425-2-3b促进pp65特异性T细胞将IFN-γ分泌到细胞培养上清液中。
实施例10.抗Tim-3抗体增强NK细胞介导的细胞毒性
已知Tim-3以相对高的水平在自然杀伤(NK)细胞上组成性表达(Ndhlovu LC,etal.,2012,Blood 119:3734-43；da Silva IP,et al.,2014,Cancer Immunol Res.2:410-22)。在黑素瘤中，发现在NK细胞上的较高Tim-3表达与晚期肿瘤阶段和预后差相关。此外，NK细胞功能似乎受Tim-3活性影响(da Silva IP,et al.,2014,Cancer Immunol Res.2:410-22)。
为了证实人源化抗Tim-3抗体是否能够促进NK介导的细胞毒性，原代NK细胞根据制造商的说明使用来自Miltenyi Biotec(德国)的NK细胞分离试剂盒从健康供体的PBMC中分离。在使用人IL-2(1000U/ml)刺激一天后，NK细胞与K562细胞在37℃在抗Tim-3抗体、布雷菲德菌素A(brefeldin A)和抗CD107a-APC(eBioscience)的存在下共同培养5小时。CD3-CD56+NK细胞上的CD107a表达通过流式细胞仪定量。结果显示抗Tim-3抗体hu425-2-3b增加了通过平均荧光强度(MFI)和细胞数的百分比测量的CD107a表达(图8)。
实施例11.抗Tim-3抗体降低Tim-3受体的表面表达
为了解决包括hu425-2-3b的Tim-3内化的可能性，首先在完全RPMI1640培养基中，将来自健康供体的NK细胞与hu425-2-3b(10μg/mL)在37℃或4℃温育1小时。Tim-3受体的表面表达通过使用非竞争性Tim-3 Ab mu420(内部产生的)染色，接着使用山羊抗小鼠IgG-APC(Biolegend)染色来确定。如图9所示，与阴性对照经人IgG处理的细胞相比，hu425-2-3b在37℃引起Tim-3表面表达的显著降低。降低可能是由于抗Tim-3抗体诱导的受体内化，因为它在短时间内表现出明显的温度依赖。结果明显表现出hu4-25-2-3b诱导的Tim-3受体的下调，可能归因于Tim-3的内化。通过诱导Tim-3内化，预期hu425-2-3b将降低Tim-3与其多种配体(诸如半乳凝集素-9和PtdSer)的相互作用。
实施例12.抗Tim-3抗体展现增加的内化率
为了进一步研究抗体的内化，在不同时间点(1、3、5和18小时)使用Tim-3表达NK细胞系(NK92MI/huTim-3)确定抗Tim-3抗体诱导的内化。简言之，将抗Tim-3抗体(10μg/ml)，其包括hu425-2-3b、Ab1和Ab2，在37℃或4℃与NK92MI/huTim-3(5x104)一起温育18小时。Tim-3受体的表面表达通过使用山羊抗人IgG-FITC染色来确定。内化的％被计算为在37°的Tim-3表面表达与在4℃的表达水平相比的降低(％)。如图10所示，在更短温育(1-5小时)过程中，hu425-2-3b诱导与Ab1和Ab2相当的Tim-3内化水平。在温育18小时后，确实表现出比Ab1和Ab2两者都显著持久的内化，这表明hu425-2-3b对Tim-3内化的持久活性。
实施例13.人源化抗Tim-3 mAb单独和与PD-1 mAb组合刺激免疫细胞
已经报道了免疫抑制性受体PD-1和Tim-3在患有晚期肿瘤和慢性病毒传染的患者中的“功能失调”肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞中上调(Fourcade J,et al.,2010,J ExpMed.207:2175-86；Thommen DS,et al.,2015,Cancer Immunol Res.3:1344-55；Jin HT,etal.,2010,Proc Natl Acad Sci USA.107:14733-8)。同时阻断PD-1和Tim-3受体两者可扩大疫苗诱导的NY-ESO-1特异性CD8+ T细胞(Fourcade J.,et al.,2014,Cancer Res.74:1045-55)。建立常规T细胞响应测定，混合淋巴细胞反应(MLR)以通过抗Tim-3和抗PD-1抗体表征潜在的共刺激效应。简言之，“刺激物(stimulator)PBMC”使用丝裂霉素c(100μg/ml,Sigma)预处理，并且与不同供体的“响应物(responder)PBMC”以1:1的比例在具有10％AB血清(Sigma)和抗Tim-3和/或抗PD-1 mAb 317-4B6(也称为hu317-4B6、317-4B6/IgG4mt10,述于美国专利申请No.8,735,553)的完全RPMI1640培养基中共同培养。反应在96孔平底板中进行4天，每个条件一式三份数据点设置。细胞培养上清液中的IFN-γ分泌作为读数进行分析。
结果显示hu425-2-3b剂量依赖性地显著增强MLR中的IFN-γ产生。hu425-2-3b与317-4B6(50ng/ml)的组合导致IFN-γ产生的增加高于单独的hu425-2-3b或抗PD-1抗体，这表明抗Tim-3 mAb与抗PD-1 mAb的共同刺激作用(图11)。
丝裂霉素C预处理的“刺激物PBMC”与“响应物PBMC”在96孔平底板中在抗Tim-3mAb、hu425-2-3b或hu425-2-3b加抗PD-1 Ab hu317-4b6(50ng/ml)的存在下共同培养4天。上清液中的IFN-γ通过ELISA确定。所有条件一式三份进行，结果以平均值+SD显示。
实施例14.Hu425-2-3b没有ADCC和CDC效应物功能
hu425-2-3b诱导ADCC和CDC的能力使用下述体外测定来确定。IgG1mf(SEQ ID NO:21)是含有突变E233P、L234A、L235A、L236Δ和P329A(基于EU系统的氨基酸编号)的组合的IgG1突变体。设计这些突变以消除Fc与所有FcγR以及C1q的结合。
ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)
设置经典的ADCC测定以确定hu425-2-3b是否能诱导ADCC。测定效应物细胞系NK92MI/CD16V细胞通过共转导含有CD16V158(V158等位基因)和FcRγcDNA的表达质粒从NK92MI细胞(ATCC)产生。Tim-3表达T细胞系HuT78/Tim-3用作靶细胞。效应物细胞(4x104)在hu425-2-3b或对照抗体、阳性对照抗MHC-I A,B,C(Biolegend)或阴性对照人IgG的存在下与相等数量的靶细胞共培养5小时。细胞毒性通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega,Madison,WI)来确定。特异性裂解通过以下等式确定。
Figure GDA0001977724640000391
结果证实hu425-2-3b与阴性对照具有相同ADCC基础水平，而抗MHC-I A,B,C以剂量依赖性方式诱导ADCC(图12A)。
CDC(补体依赖性细胞毒性)
使用预活化的人PBMC和来自健康供体的新鲜自体血清确定hu425-2-3b是否会引发CDC。通过Celltiter glo测定试剂盒(Promega,Beijing,China)确定CDC的细胞裂解。简言之，将来自健康供体的PBMC用PHA(10μg/ml,Sigma)预活化3天，然后在37℃在RPMI1640加自体血清(15％)和hu425-2-3b或对照抗体(0.04-30μg/mL)中温浴过夜。由CDC引起的细胞死亡是通过反应结束后的细胞裂解后从活细胞释放的ATP的减少来测定的。抗MHC-I A,B,C用作阳性对照。使用96孔荧光计(PHERA Star FS,BMG LABTECH)进行荧光读数，并且如下从相对荧光单位(RFU)读数计算CDC活性：％CDC活性＝[(RFU测试-RFU背景)/(总细胞裂解的RFU-RFU背景)]×100。实验结果表明，使用从两个不同供体分离的PBMC，hu425-2-3b不具有可检测的CDC。与之相比，阳性对照抗体抗MHC-I诱导显著的CDC活性(图12B)。
结果显示，hu425-2-3b消除ADCC和CDC效应物功能，同时保持最佳物理化学性质。
实施例15.抗Tim-3抗体与抗PD-1抗体组合抑制小鼠异种移植癌症模型中的肿瘤生长
通过异种移植癌症模型与抗PD-1抗体组合评价Tim-3抗体的潜在抗癌活性，其中免疫受损小鼠移植有人癌细胞和同种异体PBMC。简言之，NOD/SCID小鼠在肿瘤接种前用环磷酰胺(150mg/kg)预处理2天。从健康志愿者的外周血中分离人PBMC，与基质胶中的A431表皮样癌细胞(Cat.No.CRL-1555,ATCC)混合，并将其皮下注射到动物中。从第0天开始，将动物随机分成4组，每组5-10只小鼠。小鼠每周一次(QW)经腹膜内(i.p.)注射媒介物(PBS)、5mg/kg抗Tim-3 mAb嵌合体425(ch425)、抗PD-1抗体317-4B6(1mg/kg)或组合疗法(5mg/kgch425+1mg/k 317-4B6)治疗4周。每周两次记录小鼠的肿瘤大小，在研究期间每天监测小鼠的临床毒性指征。使用公式：[D×(d2)]/2计算肿瘤体积，其中D表示肿瘤的长直径，d表示短直径。所有动物研究均按照Beigene动物护理和使用程序进行。
如图13所示，以5mg/kg的剂量单独用ch425治疗对肿瘤生长几乎没有影响或没有影响。317-4B6在1mg/kg的剂量显示肿瘤生长延迟趋势，而无统计学显著性(P>0.05)。然而，ch425和317-4B6的组合治疗显示显著的协同效应，相对于媒介物治疗组抑制肿瘤生长超过60％。
结果表明，ch425与317-4B6的组合疗法可激活人免疫细胞以抑制小鼠体内癌症模型中的肿瘤生长，这与实施例11中所述的体外数据一致。
序列表
<110> 百济神州有限公司
张彤
<120> 抗Tim-3抗体及其用途
<130> BGB110
<160> 43
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
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Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
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Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
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Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
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Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
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Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
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Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
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<213> 小鼠
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gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat ctgctacctg 240
caaatgaaca gtctgaggtc tgacgacacg gccatgtatt actgtgcaag aggccgggag 300
gccgacggag gctactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
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Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Met
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<213> 小鼠
<400> 12
gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagagccacc 60
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cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtatgaa ggttcctctc 300
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<210> 13
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<223> ch425重链pro
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Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Phe Pro Asp Ser Val Lys
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35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Phe Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Cys Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Glu Ala Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1 VH DNA
<400> 18
gaagtgcagc tggtcgaatc aggggggggg ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60
tcctgcgccg cttctggctt cacctttagc agatacgcca tgtcctgggt gcggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggccgct atcagctccg gcggctccct gtacttcccc 180
gattccgtga agggccggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag ctgctatctg 240
cagatgaact ctctgagggc cgaggataca gccgtgtact attgcgctcg gggcagagaa 300
gcagatggcg gctacttcga ctattggggc cagggcaccc tggtgacagt gtctagc 357
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1 VK pro
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Met
85 90 95
Lys Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1 VK DNA
<400> 20
gacatcgtcc tgactcagtc ccctgccact ctgtcagtga gcccaggaga gcgagctacc 60
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cagcagaagc cagggcaggc tcccaggctg ctgatctatg ccgcttctaa cgtggagagt 180
ggcgtcccag cacgcttcag tggctcaggg agcggaacag actttaccct gacaattagc 240
tccctgcaga gtgaagattt cgccgtgtac tattgccagc agagcatgaa ggtccccctg 300
acatttggcg ggggaactaa ggtggagatc aaa 333
<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1mf pro
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1重链pro
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Phe Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Cys Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Glu Ala Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1重链DNA
<400> 23
gaagtgcagc tggtcgaatc aggggggggg ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60
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gattccgtga agggccggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag ctgctatctg 240
cagatgaact ctctgagggc cgaggataca gccgtgtact attgcgctcg gggcagagaa 300
gcagatggcg gctacttcga ctattggggc cagggcaccc tggtgacagt gtctagcgct 360
agcaccaaag gccccagcgt gtttcctctg gctccatcct ctaaatccac ctctggcggc 420
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaggat tacttcccag agcccgtgac agtgtcttgg 480
aacagcggcg ccctgacctc cggcgtgcac acatttcctg ctgtgctgca gagctccggc 540
ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgaccgtg ccatcctcta gcctgggcac ccagacatat 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaat acaaaggtgg ataagaaggt ggagccaaag 660
tcctgtgaca agacccacac atgcccccct tgtcctgctc caccagctgc aggaccaagc 720
gtgttcctgt ttccacccaa gcccaaggat accctgatga tctctcggac cccagaggtg 780
acatgcgtgg tggtggatgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtatgtg 840
gacggcgtgg aggtgcacaa tgctaagacc aagcccaggg aggagcagta caactccacc 900
tatagagtgg tgtctgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaggagtat 960
aagtgcaagg tgtccaataa ggccctggcc gctcctatcg agaagaccat ctctaaggcc 1020
aagggccagc ccagagagcc tcaggtgtac acactgcctc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tgtctctgac atgtctggtc aagggcttct atccctctga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatggcca gcctgagaac aattacaaga ccacaccccc tgtgctggat 1200
tccgacggct ctttctttct gtatagcaag ctgaccgtgg acaagtcccg gtggcagcag 1260
ggcaacgtgt tcagctgttc cgtgatgcac gaagctctgc ataatcacta tactcagaaa 1320
tccctgtcac tgtcacctgg taaatga 1347
<210> 24
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1轻链pro
<400> 24
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
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Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Met
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Lys Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-1-1轻链DNA
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gacatcgtcc tgactcagtc ccctgccact ctgtcagtga gcccaggaga gcgagctacc 60
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<400> 26
Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2 LCDR3
<400> 27
Gln Gln Ser Leu Lys Val Pro Leu Thr
1 5
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2 VH pro
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Glu Ala Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2 VH DNA
<400> 29
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gattccgtga agggccggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac actgtatctg 240
cagatgaact ctctgagggc cgaggataca gccgtgtact attgcgctcg gggcagagaa 300
gcagatggcg gctacttcga ctattggggc cagggcaccc tggtgacagt gtctagc 357
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2 VK pro
<400> 30
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
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Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Ile Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu
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Lys Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2 VK DNA
<400> 31
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<210> 32
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2重链pro
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 33
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> hu425-2-2重链DNA
<400> 33
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tcctgcgccg cttctggctt cacctttagc agatacgcca tgtcctgggt gcggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggccgct atcagctccg gcggctccct gtactatccc 180
gattccgtga agggccggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac actgtatctg 240
cagatgaact ctctgagggc cgaggataca gccgtgtact attgcgctcg gggcagagaa 300
gcagatggcg gctacttcga ctattggggc cagggcaccc tggtgacagt gtctagcgct 360
agcaccaaag gccccagcgt gtttcctctg gctccatcct ctaaatccac ctctggcggc 420
acagccgctc tgggctgtct ggtgaaggat tacttcccag agcccgtgac agtgtcttgg 480
aacagcggcg ccctgacctc cggcgtgcac acatttcctg ctgtgctgca gagctccggc 540
ctgtacagcc tgtctagcgt ggtgaccgtg ccatcctcta gcctgggcac ccagacatat 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaat acaaaggtgg ataagaaggt ggagccaaag 660
tcctgtgaca agacccacac atgcccccct tgtcctgctc caccagctgc aggaccaagc 720
gtgttcctgt ttccacccaa gcccaaggat accctgatga tctctcggac cccagaggtg 780
acatgcgtgg tggtggatgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtatgtg 840
gacggcgtgg aggtgcacaa tgctaagacc aagcccaggg aggagcagta caactccacc 900
tatagagtgg tgtctgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaggagtat 960
aagtgcaagg tgtccaataa ggccctggcc gctcctatcg agaagaccat ctctaaggcc 1020
aagggccagc ccagagagcc tcaggtgtac acactgcctc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tgtctctgac atgtctggtc aagggcttct atccctctga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatggcca gcctgagaac aattacaaga ccacaccccc tgtgctggat 1200
tccgacggct ctttctttct gtatagcaag ctgaccgtgg acaagtcccg gtggcagcag 1260
ggcaacgtgt tcagctgttc cgtgatgcac gaagctctgc ataatcacta tactcagaaa 1320
tccctgtcac tgtcacctgg taaatga 1347
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<212> PRT
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
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210 215
<210> 35
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-2轻链DNA
<400> 35
gagatcgtca tgactcagtc ccctgccact ctgtcagtga gcccaggaga gcgagctacc 60
ctgtcctgca gagcatccga gtctgtcgaa tactatggca cctctctgat gcagtggtac 120
cagcagaagc cagggcaggc tcccaggctg ctgatctatg ccgcttctaa cgtggagagt 180
ggcatcccag cacgcttcag tggctcaggg agcggaacag agtttaccct gacaattagc 240
tccctgcaga gtgaagattt cgccgtgtac tattgccagc agagcctgaa ggtccccctg 300
acatttggcg ggggaactaa ggtggagatc aaacgaacag tggcagcccc ttccgtcttc 360
atttttcccc cttctgacga acagctgaaa tcaggaactg ctagcgtggt ctgtctgctg 420
aacaatttct accccagaga ggccaaggtg cagtggaaag tcgataacgc tctgcagtcc 480
ggcaattctc aggagagtgt gaccgaacag gactcaaagg atagcacata ttccctgtct 540
agtactctga ccctgagcaa agcagactac gagaagcaca aagtgtatgc ctgtgaagtc 600
acacaccagg ggctgagttc accagtcacc aagagtttca acagagggga atgctaa 657
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-3b VK pro
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Lys Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-3b VK DNA
<400> 37
gagatcgtcc tgactcagtc ccctgccact ctgtcagtga gcccaggaga gcgagctacc 60
ctgtcctgca gagcatccga gtctgtcgaa tactatggca cctctctgat gcagtggtac 120
cagcagaagc cagggcaggc tcccaggctg ctgatctatg ccgcttctaa cgtggagagt 180
ggcatcccag cacgcttcag tggctcaggg agcggaacag agtttaccct gacaattagc 240
tccctgcaga gtgaagattt cgccgtgtac tattgccagc agagcctgaa ggtccccctg 300
acatttggcg ggggaactaa ggtggagatc aaa 333
<210> 38
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-3b轻链pro
<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Lys Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 39
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu425-2-3b轻链DNA
<400> 39
gagatcgtcc tgactcagtc ccctgccact ctgtcagtga gcccaggaga gcgagctacc 60
ctgtcctgca gagcatccga gtctgtcgaa tactatggca cctctctgat gcagtggtac 120
cagcagaagc cagggcaggc tcccaggctg ctgatctatg ccgcttctaa cgtggagagt 180
ggcatcccag cacgcttcag tggctcaggg agcggaacag agtttaccct gacaattagc 240
tccctgcaga gtgaagattt cgccgtgtac tattgccagc agagcctgaa ggtccccctg 300
acatttggcg ggggaactaa ggtggagatc aaacgaacag tggcagcccc ttccgtcttc 360
atttttcccc cttctgacga acagctgaaa tcaggaactg ctagcgtggt ctgtctgctg 420
aacaatttct accccagaga ggccaaggtg cagtggaaag tcgataacgc tctgcagtcc 480
ggcaattctc aggagagtgt gaccgaacag gactcaaagg atagcacata ttccctgtct 540
agtactctga ccctgagcaa agcagactac gagaagcaca aagtgtatgc ctgtgaagtc 600
acacaccagg ggctgagttc accagtcacc aagagtttca acagagggga atgctaa 657
<210> 40
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Ala Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 41
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Asp Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp
35 40 45
Val Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Gln Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala
<210> 43
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105

Claims (27)

1.一种能够结合人Tim-3的抗体，其包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示的VH-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示的VH-CDR3；和轻链可变区(VL)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的VL-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示的VL-CDR3；
(b)重链可变区(VH)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示的VH-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 26所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示的VH-CDR3；和轻链可变区(VL)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的VL-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示的VL-CDR3；
(c)重链可变区(VH)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示的VH-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示的VH-CDR2和氨基酸序列SEQ ID NO 5所示的VH-CDR3；和轻链可变区(VL)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的VL-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示的VL-CDR2氨基酸序和氨基酸序列如SEQ ID NO 27所示的VL-CDR3；或
(d)重链可变区(VH)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示的VH-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 26所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示的VH-CDR3；和轻链可变区(VL)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的VL-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 27所示的VL-CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示的VH-CDR1氨基酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示的VH-CDR3；和轻链可变区(VL)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的VL-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO7所述的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示的VL-CDR3；或
(b)重链可变区(VH)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示的VH-CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO 26所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示的VH-CDR3；和轻链可变区(VL)，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的VL-CDR1氨基酸序列，氨基酸序列如SEQ IDNO 7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO 27所示的VL-CDR3。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化抗体分子。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(c)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(d)与SEQ ID NO 9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(e)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(f)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(g)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(h)与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(i)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(j)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 19的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；
(k)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 30的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；或
(l)与SEQ ID NO 28的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和与SEQ ID NO 36的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(d)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(e)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(f)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(g)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(h)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(i)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(j)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(k)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(l)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(d)包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO 36的氨基酸序列的轻链可变结构域。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(b)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(c)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(d)与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(e)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(f)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(g)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(h)与SEQ ID NO 22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(i)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 15的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(j)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 24的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；
(k)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 34的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或
(l)与SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO 38的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
8.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列的轻链；
(c)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列的轻链；
(d)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的轻链；
(e)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的轻链；
(f)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列的轻链；
(g)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列的轻链；
(h)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的轻链；
(i)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的轻链；
(j)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列的轻链；
(k)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列的轻链；或
(l)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的轻链。
9.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 15的氨基酸序列的轻链；
(b)包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 24的氨基酸序列的轻链；
(c)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 34的氨基酸序列的轻链；或
(d)包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列的轻链。
10.权利要求1-9中任一项的抗体，其中所述抗体包含以下的一种或多种：
(a)在SEQ ID NO 24的1位具有天冬氨酸到谷氨酸突变的轻链；
(b)在SEQ ID NO 24的4位具有亮氨酸到甲硫氨酸突变的轻链；
(c)在SEQ ID NO 24的62位具有缬氨酸到异亮氨酸突变的轻链；
(d)在SEQ ID NO 24的74位具有天冬氨酸到谷氨酸突变的轻链；
(e)在SEQ ID NO 24的96位具有甲硫氨酸到亮氨酸突变的轻链；
(f)在SEQ ID NO 22的59位具有苯丙氨酸到酪氨酸突变的重链；
(g)在SEQ ID NO 22的60位具有脯氨酸到缬氨酸突变的重链；
(h)在SEQ ID NO 22的77位具有丝氨酸到苏氨酸突变的重链；或
(i)在SEQ ID NO 22的78位具有半胱氨酸到亮氨酸突变的重链。
11.权利要求1的抗体，其中所述抗体是Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(ScFv)。
12.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，和κ或λ型的轻链恒定区或其变体。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体包含亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的变体重链恒定区，其中所述变体重链恒定区提供减少或消除的效应物功能。
14.权利要求13的抗体，其中所述效应物功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性ADCC或补体依赖性细胞毒性CDC。
15.权利要求14的抗体，其中所述抗体包含人IgG1的重链恒定区或其变体。
16.权利要求15的抗体，其中所述变体人IgG1的重链恒定区包含一种或多种选自下组的突变：E233P、L234A、L235A、L236Δ和P329A。
17.权利要求16的抗体，其中所述变体人IgG1重链恒定区包含SEQ ID NO 21的氨基酸序列，和人κ轻链恒定区。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的抗体，和药学上可接受的赋形剂。
19.权利要求1-17的抗体在制备用于刺激有此需要的受试者的免疫响应的药物中的用途。
20.权利要求1-17的抗体在制备用于治疗有此需要的受试者的癌症或肿瘤的药物中的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述癌症选自肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、头颈癌或癌症的转移病灶。
22.权利要求20的用途，其中所述抗体与第二治疗剂或操作组合施用，其中所述第二治疗剂或操作选自化学疗法、靶向疗法、溶瘤药物、细胞毒剂、基于免疫的疗法、细胞因子、外科手术、放射操作、协同刺激分子的活化剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗或细胞免疫疗法。
23.权利要求20的用途，其中所述抗体与选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR的免疫检查点分子的抑制剂组合施用。
24.权利要求20的用途，其中所述抗体与抗PD-1mAb 317-4B6或317-4B6/IgG4mt10组合施用。
25.权利要求1-17的抗体在制备用于治疗有此需要的受试者的感染性疾病的药物中的用途。
26.权利要求25的用途，其中所述感染性疾病是选自HIV感染和HCV感染的慢性病毒感染。
27.权利要求1-17中任一项的抗Tim-3抗体分子在制备用于治疗癌症、肿瘤或感染性疾病的药物中的用途。
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