KR20210053912A - 항-pd-1/vegfa 이기능성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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아케소 바이오파마, 인크.
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Abstract

본 발명은 종양 치료 및 분자 면역학 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 항 -VEGFA/PD-1 이기능 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 항-VEGFA/PD-1 이기능 항체는 VEGFA를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 및 PD-1을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함한다. 본 발명의 이기 능성 항체는 VEGFA 및 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, 유기체에서 VEGFA 및 PD-1의 면역 억제를 특이적으로 완화시킬 수 있으며, 종양에 의한 혈관 신생을 억제할 수 있어 적용 가능성이 좋다.

Description

항-PD-1/VEGFA 이기능성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도
본 발명은 종양 치료 및 면역 생물학 분야, 특히, 항-PD-1/VEGFA 이기능성 (Bifunctional) 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-인간 PD-1/인간 VEGFA 이기능성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
종양, 특히 악성 종양 (malignant tumor)은 오늘날 세계에서 건강을 위협하는 심각한 질병이며, 다양한 질병 중에서 두 번째의 주요 사망 원인이다. 최근 몇 년 동안, 악성 종양의 발명률이 눈에 띄게 증가하고 있다. 악성 종양은 낮은 치료 반응, 높은 비율의 전이율 및 낮은 예후가 특징이다. 현재 임상적으로 채택된 기존의 치료법 (예컨대, 방사선 요법, 화학 요법, 외과적 치료 등)은 통증을 완화하고 생존 기간을 연장하지만, 이러한 방법은 큰 한계를 갖고 있으며, 그리고 그 효능을 더욱 향상시키기는 어렵다.
종양 성장에는 혈관이 없는 느린 성장 단계부터 혈관이 있는 급속한 증식 단계까지 두 가지 구별되는 단계가 있다. 혈관 신생은 종양이 혈관 전환 단계를 완료하기에 충분한 영양을 얻을 수 있게 하며, 만약 혈관 신생이 없으면 원발 종양이 1 내지 2 mm를 넘지 않게 되어 전이를 실현할 수 없다.
혈관 내피 성장 인자 (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)는 내피 세포의 분열과 증식을 촉진하고, 새로운 혈관 형성을 촉진하며 혈관 투과성을 향상시킬 수 있는 성장 인자이며, 혈관 내피 성장 인자는 세포 표면의 혈관 내피 성장 인자 수용체에 결합하여 티로신 키나아제 (tyrosine kinase) 신호 전달 경로를 활성화하는 역할을 한다. 종양 조직에서, 종양 세포, 및 종양에 침입한 대식세포 및 비만 세포는 높은 수준의 VEGF를 분비할 수 있고, 파라크린 (paracrine) 형태의 종양 혈관 내피 세포를 자극할 수 있고, 내피 세포의 증식과 이동을 촉진할 수 있고, 혈관 신생 유도를 할 수 있고, 종양의 지속적인 성장 촉진을 할 수 있고, 혈관 투과성을 개선할 수 있고, 주변 조직에 섬유 침착을 일으킬 수 있으며, 그리고 단핵 세포 (mononuclear cells), 섬유 아세포 (fibroblast) 및 내피 세포의 침윤을 촉진하여 종양 간질 (tumor stroma) 형성 및 종양 세포의 새로운 혈관으로의 진입을 촉진하고, 종양 전이를 촉진할 수 있다. 따라서, 종양 혈관 신생을 억제하는 것은 현재 가장 유망한 종양 치료법 중 하나로 간주된다. VEGF 제품군에서는 VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD 및 PIGF가 포함된다. 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFRs)는 VEGFR1 (Flt1 이라고도 함), VEGFR2 (KDR 또는 Flk1이라고도 함), VEGFR3 (Flt4 이라고도 함) 및 Neuropilin-1 (NRP-1)이 포함된다. 처음 세 개의 수용체는 구조가 유사하며, 티로신 키나제 (tyrosine kinase) 수퍼 패밀리에 속하고, 그리고 막외 영역, 막 횡단 세그먼트 및 막 내 영역으로 구성되며, 여기서 막외 영역은 면역 글로불린 유사 도메인으로 구성되고, 막 내 영역은 티로신 키나제 영역으로 구성된다. VEGFR1 및 VEGFR2는 주로 혈관 내피 세포의 표면에 위치하고, VEGFR3은 주로 림프 내피 세포의 표면에 위치한다.
VEGF 계열의 분자는 이러한 수용체에 대해 서로 다른 친화성을 가지고 있다. VEGFA는 주로 VEGFR1, VEGFR2 및 NRP-1과 함께 작용한다. VEGFR1은 가장 초기에 발견된 수용체이며 정상적인 생리적 조건에서는 VEGFR2 보다 VEGFA에 대하여 더 높은 친화성을 갖지만, VEGFR2보다 세포 내 세그먼트에서 더 낮은 티로시나제 활성을 갖는다 (Ma Li, J. Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24 (5): 146-148 (2016)).
VEGFR2는 혈관 신생 및 혈관 엔지니어링의 주요 조절자이며, VEGFR1 보다 훨씬 높은 티로신 키나제 활성을 가지고 있다. VEGFR2는, 리간드 VEGFA에 결합한 후, 혈관 내피세포의 증식, 분화 등을 매개하고, 뿐만 아니라 혈관의 형성과정과 혈관의 투과성도 매개한다 (Roskoski R Jr. et al., Crit Rev Oncol Hematol, 62(3): 179-213 (2007)). VEGFA는 VEGFR2에 결합한 후, 하류 PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK 신호 전달 경로를 통해 세포 내 관련 단백질 유전자의 전사 발현을 매개하며, 따라서 혈관 내피 세포의 증식을 촉진한다 (Takahashi T et al., Oncogene, 18(13): 2221-2230 (1999)).
VEGFR3은 티로신 키나제 패밀리 구성 중 하나이며, 주로 배야 혈관 내피 세포 및 성인 림프 내피 세포를 발현하며, VEGFC 및 VEGFD는 VEGFR3에 결합하여 림프 내피 세포의 증식 및 이동을 자극하고 림프 혈관의 신생을 촉진한다; NRP-1은 비-티로신 키나제 트랜스멤브레인 프로테인 (non-tyrosine kinase transmembrane protein)으로 독립적으로 생물학적 신호를 전달할 수 없으며, VEGF 티로신 키나제 수용체와 복합체를 형성한 후에만 신호 전달을 매개할 수 있다 (Ma Li, Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24(5): 146-148 (2016)).
VEGFA와 VEGFR2는 주로 혈관 신생 조절에 관여하며, VEGFA와 VEGFR2의 결합 전 후에, 업스트림 및 다운스트림 경로에서 수많은 중간 신호의 캐스케이드 반응이 형성되며, 그리고 마지막으로 내피 세포의 증식, 생존, 이동, 투과성 증가, 말초 조직으로의 침투 등에 의해 생리적 기능이 변화한다 (Dong Hongchao et al., Sep. 2014, Journal of Modern Oncology, 22(9): 2231-3).
현재, 인간 VEGF, 특히 VEGFA를 표적으로 하는 여러 인간화 단일 클론 항체가 있으며, 예컨대 비소 세포 폐암, 신 세포 암, 자궁 경부암, 전이성 대장 암 등 다양한 종양 치료를 위해 미국 식품 의약국 (FDA)에서 2004년에 승인받은 베바시주맙 (bevacizumab)등이 있다.
CD279로도 알려진 프로그램 된 세포 사멸 수용체-1 (Programmed cell Death receptor-1, PD-1)은 I 형 막 횡단 당 단백질 막 표면 수용체이며, CD28 면역 글로불린 수퍼 패밀리에 속하며 일반적으로 T 세포, B 세포 및 골수 세포에서 발현된다. PD-1은 PD-L1과 PD-L2의 두 가지 천연 리간드가 있다. PD-L1 및 PD-L2는 모두 수퍼 패밀리에 속하며 비 조혈 세포 및 다양한 종양세포를 포함한 다양한 세포의 막 표면에서 구성적으로 또는 유도적으로 발현된다. PD-L1은 주로 T 세포, B 세포, DC 및 미세혈관 내피 세포와 다양한 종양세포에서 발현되는 반면, PD-L2는 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포에서만 발현된다. PD-1과 그의 리간드 사이의 상호 작용은 림프의 활성화, T 세포의 증식, IL-2 및 IFN-γ와 같은 사이토카인의 분비를 억제할 수 있다.
여러 연구에 따르면 종양 미세 환경은 종양 세포가 면역 세포에 의해 손상되지 않도록 보호할 수 있으며, 종양 미세 환경에 침투한 림프구에서 PD-1의 발현이 상향 조절되며, 다양한 원발성 종양 조직은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 결장암 및 신경 교종과 같은 면역 조직화학적 분석에서 PD-L1이 양성이다. 한편, 종양에서 PD-L1의 발현은 암 환자의 예후 불량과 유의한 상관 관계가 있다. PD-1과 그 리간드 사이의 상호 작용을 차단하면 종양 특이적 T 세포 면역을 촉진하고 종양 세포이 면역 제거 효율을 향상시킬 수 있다. 많은 임상 실험은 PD-1 또는 PD-L1을 표적으로 하는 항체가 CD8+ T세포의 종양 조직으로의 침투를 촉진할 수 있으며, IL-2, IFN-γ, 그랜자임 B (granzyme B) 및 퍼포린 (perforin)과 같은 항 종양 면역 이펙터 인자를 상향 조절하여 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
또한, 항-PD-1 항체는 바이러스성 만성 감염의 치료에도 사용될 수 있다. 바이러스 성 만성 감염은 종종 바이러스 특이적 이펙터 T 세포 (virus-specific effector T cell)의 기능 상실과 그 수의 감소를 동반한다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용은 PD-1 항체를 주입함으로써 차단될 수 있으며, 이로써 바이러스성 만성 감염에서 효과기 T 세포의 고갈을 효과적으로 억제할 수 있다.
PD-1 항체의 광범위한 항 종양 전망과 놀라운 효능으로 인해 PD-1 경로를 표적으로 하는 항체가 다양한 종양 치료에 돌파구를 가져올 것이라는 것은 업계에서 널리 인정되고 있다: 비소 세포 폐암 (non-small cell lung cancer), 신 세포 암 (renal cell carcinoma), 난소 암 (ovarian cancer) 및 흑색 종 (melanoma) 치료 용(Homet M. B., Parisi G., et al., 흑색 종에서 항-PD-1 요법 (Anti-PD-1 therapy in melanoma). Semin Oncol. 2015 Jun; 42(3): 466-473), 및 림프종 및 빈혈 (Held SA, Heine A, et al., 만성 골수성 백혈병 CML의 면역 요법의 발전 (Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML). Curr 암 약물 표적 (Curr Cancer Drug Targets) 2013 Sep; 13(7): 768-74).
이중 특이성 항체 (bispecific antibody)로도 알려진, 이기능성 항체 (bifunctional antibody)는 두 개의 서로 다른 항원을 동시에 표적으로 삼는 특정 약제이며, 면역 선택 정제에 의해 생산될 수 있다. 또한, 이중 특이적 항체는 유전 공학 (genetic engineering)에 의해 생산될 수 있으며, 이는 결합 부위의 최적화, 합성 형태 고려 및 수율과 같은 측면에서 상응하는 유연성으로 인해 특정의 이점을 갖는다. 현재, 이중 특이적 항체는 45개 이상의 형태로 존재하는 것으로 확인되었다 (Muller D, Kontermann RE. 암 면역 요법을 위한 이중 특이적 항체 (bispecific antibodies for cancer immunotherapy): current perspectives. BioDrugs 2010; 24: 89-98). 다수의 이중 특이적 항체가 IgG-ScFv 형태, 즉 Morrison 형태로 개발되었고 (Coloma M. J., Morrison S. L. 새로운 4가 이중 특이적 항체의 설계 및 생산 (Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies). Nat Biotechnol., 1997; 15: 159-163), 이는 자연적으로 존재하는 IgG형태와의 유사성 및 항체 공학, 발현 및 정제의 이점 때문에 이중 특이적 항체의 이상적인 형태 중 하나로 확인되었다 (Miller B. R., Demarest S. J., et al., 이중 특이성 및 다가 항체 개발을 위한 scFv의 안정성 공학 (Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies). Protein Eng Des Sel 2010; 23: 549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. 여러 종양 유전자 경로를 표적으로 하는 항체 치료제의 합리적인 엔지니어링 (Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways). MAbs 2011; 3: 299-309).
현재 PD-1과 VEGF (예를 들어, VEGFA)를 모두 표적으로 하는 이기능성 항체 약제의 개발이 필요하다.
심도있는 연구와 창의적인 노력을 통하여 시판중인 VEGFA 단일 클론 항체 아바스틴 (VEGFA monoclonal antibody Avastin, bevacizumab) 및 그 이전에 획득한 14C12H1L1 (중국 특허 공개번호 CN106977602A)을 기반으로, 본 발명자들은 VEGFA 및 PD-1에 동시에 결합할 수 있고, VEGFA의 VEGFR2 및 PD-1에 동시에 결합할 수 있는 VP101이라는 인간화 이기능성 항체를 획득하였다.
본 발명자들은 놀랍게도 VP101이 다음과 같은 가능성이 있음을 확인하였다:
인간 면역 세포 표면의 PD-1에 효과적으로 결합하여 PD-L1과 PD-1이 매개하는 면역 억제를 완화하고, 인간 면역 세포에 의한 IFN-γ와 IL-2 분비를 촉진;
VEGFA에 의한 혈관 내피 세포의 증식을 효과적으로 억제하여 종양에 의한 혈관 신생을 억제;
및/또는
간암, 폐암, 흑색 종, 신 종양, 난소 암 및 림프종과 같은 악성 종양의 예방 및 치료를 위한 의약품 제조에 사용될 가능성이 있다.
본 발명의 일 측면은 다음을 포함하는 이중 특이적 (bispecific) 항체에 관한 것이다:
VEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor A)를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 (functional region), 및 PD-1 (Programmed cell Death receptor-1)을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역;
바람직하게는,
제1 단백질 기능 영역은 항-VEGFA 또는 이의 항원 결합 단편이며, 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region), 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 경쇄 가변 영역 (light chain variable region)이며; 및
제2 단백질 기능 영역은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역임.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로,
상기,
항-VEGFA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편 (complementarity determining region fragment), 단일 사슬 항체 (single chain antibody), 인간화 항체 (humanized antibody), 키메라 항체 (chimeric antibody) 및 디아바디 (diabody)에서 선택되며;
및/또는,
항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단일 사슬 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디에서 선택되는 것이다.
본 발명의 일 양태는 IgG-scFv 형태 (IgG-scFv form)를 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린 (immunoglobulin), 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 면역글로불린의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 면역글로불린의 경쇄 가변 영역이며; 및 제2 단백질 기능 영역은 단일 사슬 항체, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 영역이며;
또는,
제1 단백질 기능 영역은 단일 사슬 항체, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 단일 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LDCR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역이며; 및 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린, 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 면역글로불린의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역인 것이다.
본 발명의 특정 일 양태에서 다음을 포함하는 이중 특이적 (bispecific) 항체에 관한 것이다:
VEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor A)를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 (functional region), 및 PD-1 (Programmed cell Death receptor-1)을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역;
상기,
제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린, 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 면역글로불린의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 경쇄 가변 영역이며; 및
제2 단백질 기능 영역은 단일 사슬 항체, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역이며;
또는,
제1 단백질 기능 영역은 단일 사슬 항체, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역; 및
제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린, 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 경쇄 가변 영역이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기,
면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시되며, 및 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7에 제시되며; 및 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되며, 및 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 11번에 제시되며,
또는,
단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되며, 및 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시되며; 및 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시되며, 및 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7에 제시되는 것이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기,
면역글로불린은 인간 항체와 같은 뮤린 (murine) 이외의 종으로부터 유래된 비-CDR 영역을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기,
면역글로불린은 인간 항체에서 유래된 불변 영역을 포함하며;
바람직하게는, 면역글로불린의 불면 영역은 인간 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역에서 선택된다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기,
면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 인간 Ig 감마-1 사슬 C 영역 또는 인간 Ig 감마-4 사슬이며, 이의 경쇄 불변 영역은 인간 Ig 카파 사슬 C 영역이다.
본 발명의 일 양태는 인간화 된 면역글로불린의 불변 영역에 관한 것이다. 예를 들어, 각 중쇄 불변 영역은 Ig 감마-1 사슬 C 영역이고, ACCESSION: P01857이고, 각 경쇄 불변 영역은 Ig 카파 사슬 C 영역, ACCESSION: P01834이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역은 직접 또는 링커 단편을 통해 연결되며;
바람직하게는, 링커 단편은 (GGGGS)m이고, 상기 m은 1,2,3,4,5, 또는 6과 같은 양의 정수이고, 및 GGGGS (서열번호 14)는 링커의 구성 단위이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역의 숫자는 각각 독립적으로 1,2 또는 그 이상이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 1 면역글로불린 및 2 단일 사슬 항체가 존재하며, 바람직하게는 2개의 동일한 단일 사슬 항체가 존재한다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 면역글로불린은 IgG, IgD, IgE, 또는 IgM, 바람직하게는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 단일 사슬 항체는 면역글로불린의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 면역글로불린은 2개의 중쇄를 가지고 있기 때문에, 2개의 단일 사슬 항체 분자가 하나의 면역글로불린 분자에 연결되어 있다. 바람직하게는, 2개의 단일 사슬 항체 분자는 동일하다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 두 단일 사슬 항체가 존재하고, 및 각각 단일 사슬 항체의 1개의 말단은 면역글로불린의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일 양태는 하나의 단일 사슬 항체의 VH와 VL 사이에 존재하는 이황화 결합에 관한 것이다. 항체의 VH와 VL 사이에 이황화 결합을 도입하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, US 5,747,654; Rajagopal et al., Prot. Engin. 10(1997)1453-1459; Reiter et al., Nat. Biotechnol. 14(1996)1239-1245; Reiter et al., Protein Engineering 8(1995)1323-1331; Webber et al., Molecular Immunology 32(1995)249-258; Reiter et al., Immunity 2(1995)281-287; Reiter et al., JBC 269(1994)18327-18331; Reiter et al., Inter. J. of Cancer 58(1994)142-149; or Reiter et al., Cancer Res. 54(1994)2714-2718은 본 발명에 참고로 포함된다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 이중 특이적 항체는 10-5M 미만의 KD로 VEGFA 단백질 및 / 또는 PD-1 단백질에 결합하고, 예컨대, 10-6M 미만, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 이하, 바람직하게는, KD는 포르테바이오 분자 상호 작용 기기 (Fortebio molecular interaction instrument)에 의해 측정된다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 이중 특이적 항체에 관한 것으로, 상기,
이중 특이적 항체는 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 0.15 nM 미만 또는 0.14 nM 미만의 EC50으로 VEGFA 단백질에 결학하고; 바람직하게는, EC50이 간접 ELISA에 의해 검출되며;
및/또는,
이중 특이적 항체가 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 0.17 nM 미만, 0.16 nM 미만 또는 0.15 nM 미만의 EC50으로 PD-1 단백질에 결합하며; 바람직하게는, EC50이 간접 ELISA에 의해 검출된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에 따른 이중 특이적 항체를 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 (vector)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하거나 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell)에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에 있어서 하기 단계를 포함하는 이중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로,
본 발명의 숙주 세포를 적합한 조건에서 배양하고, 세포 배양물로부터 이중 특이적 항체를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 이중 특이적 항체 및 접합된 모이어티 (conjugated moiety)를 포함하는 접합체 (conjugate)에 관한 것으로,
상기 이중 특이적 항체는 본 발명의 일 양태에 있어서 이중 특이적 항체이며, 및 접합된 모이어티는 검출 가능한 표지이며, 바람직하게는, 접합된 모이어티는 방사성 동위 원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소인 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에 있어서 이중 특이적 항체를 포함하거나 본 발명의 접합체를 포함하는 키트에 관한 것으로;
바람직하게는, 키트는 이중 특이적 항체에 결합할 수 있는 제2 항체를 추가로 포함하고;
선택적으로는, 제2 항체는 방사성 동위 원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소와 같은 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에 있어서 샘플에서 VEGFA 및/또는 PD-1의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 키트를 제조하는 이중 특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에 있어서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 접합체, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 정제 (tablet), 환약 (pill), 현탁액 (suspension), 에멀젼 (emulsion), 용액 (solution), 겔 (gel), 캡슐 (capsule), 분말 (powder), 과립 (granule), 엘릭서 (elixir), 트로키 (troche), 좌약 (suppository), 주사제 (injection)(주사액, 주사용 멸균 분말, 주사용 농축액 포함), 흡입제 (inhalant) 및 스프레이와 같은 제약 분야에서 알려진 임의의 투여 형태로 제형화 될 수 있다. 바람직한 투여 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 용도에 따라 달라진다. 본 발명의 약제 학적 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정되어야 한다. 하나의 바람직한 투여 형태는 주사이다. 이러한 주사는 멸균 주사 용액 일 수 있다. 예를 들어, 멸균 주사 용액은 다음 방법으로 제조할 수 있다: 필요한 양의 본 발명에 있어서 이중 특이적 항체를 적절한 용매에 첨가하고, 선택적으로 다른 원하는 성분 (pH 조절제, 계면활성제, 보조제, 이온 강도 향상제, 등장제, 방부제, 희석제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.)을 동시에 첨가한 후 여과 및 살균한다. 또한, 멸균주사용액은 편리한 보관 및 사용을 위해 멸균 동결 건조 분말 (예를 들어, 진공 건조 또는 동결 건조)로 준비할 수 있다. 이러한 멸균 동결 건조 분말은 사용 전에 적합한 운반체 (예를 들어, 멸균 발열원이 없는 물)에 분산될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 이중 특이적 항체는 투여의 용이성을 위해 약제학적 조성물에 단위 용량 형태로 존재할 수 있다. 일 양태에서, 단위 용량은 적어도 1 mg, 적어도 5 mg, 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 20 mg, 적어도 25 mg, 적어도 30 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg, 또는 적어도 100 mg이다. 약제학적 조성물이 액체 (예를 들어, 주사)투여 형태인 경우, 이는 본 발명에 있어서 이중 특이적 항체를 적어도 0.1 mg/mL, 예컨대, 적어도 0.25 mg/mL, 적어도 0.5 mg/mL, 적어도 1 mg/mL, 적어도 2.5 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 8 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 75 mg/mL 또는 적어도 100 mg/mL 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 이중 특이적 항체 또는 약제학적 조성물은 경구, 협측, 설하, 안구, 국소, 비경구, 직장, 척수강 내, 갑골 내, 사타구니, 방광 내, 국소 (예 : 분말, 연고 또는 방울) 또는 비강 경로를 포함한 당 업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 하지만, 많은 치료 용도의 경우, 바람직한 투여 경로/방식은 비경구 (예를 들어, 정맥 주사, 피하 주사, 복강 주사 및 근육 주사)이다. 당업자는 투여 경로 및/또는 모드가 의도된 목적에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 바람직한 일 양태에서, 본 발명에 있어서 이중 특이적 항체 또는 약제학적 조성물은 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
본 발명에 있어서 제공된 이중 특이적 항체 또는 약제학적 조성물은 단독으로 또는 조합하여 사용되거나, 추가 약제학적 활성제 (pharmaceutically active agents)(예를 들어, 종양 화학 요법 약물)와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 추가의 약제학적 활성제는 본 발명에 있어서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 전, 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 투여 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 달성하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 이는 단일 투여 일 수 있거나, 일정 기간에 걸친 다중 투여 일 수 있거나, 치료의 응급 정도에 비례하여 용량을 감소 또는 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 접합체의 악성 종양을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 용도에 관한 것으로, 바람직하게는, 상기 악성 종양은 결장암 (colon cancer), 직장암 (rectal cancer), 비소 (non-small) 세포 폐암과 같은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 신경 아교종 (glioma), 흑색종 (melanoma), 신장 종양 (renal tumor), 전립선 암 (prostate cancer), 방광암 (bladder cancer), 위장암 (gastrointestinal cancer), 유방암 (breast cancer), 뇌암 (brain cancer) 및 백혈병 (leukemia)으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 접합체의 용도에 관한 것이다:
(1)
샘플에서 VEGFA의 수준을 검출하기 위한 약제 (medicament) 또는 제제 (agent),
VEGFA와 VEGFR2의 결합을 차단하는 약제 또는 제제,
VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절하기 위한 약제 또는 제제,
혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화하기 위한 약제 또는 제제,
혈관 내피 세포 증식을 억제하기 위한 약제 또는 제제, 또는
종양 혈관 신생을 차단하는 약제 또는 제제;
및/또는
(2)
PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하기위한 약제 또는 제제,
PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절하기위한 약제 또는 제제,
유기체에서 PD-1의 면역 억제를 완화하기 윈한 약제 또는 제제,
T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진하기위한 약제 또는 제제,
T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진하기위한 약제 또는 제제.
본 발명의 일 구체예에서, 사용은 비치료적 및/또는 비진단적이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 접합체의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하는 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro) 방법에 관한 것으로서, 방법은 다음과 같이 선택된다:
(1)
샘플에서 VEGFA 수준을 검출하는 방법,
VEGFA와 VEGFR2의 결합을 차단하는 방법,
VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법,
혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화하는 방법,
혈관 내피 세포 증식 억제 방법, 또는
종양 혈관 신생을 차단하는 방법;
및/또는
(2)
PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하기위한 약제 또는 제제,
PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절하기위한 약제 또는 제제,
유기체에서 PD-1의 면역 억제를 완화하기 윈한 약제 또는 제제,
T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진하기위한 약제 또는 제제,
또는
T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진하기위한 약제 또는 제제.
본 발명의 일 구체예에서, 시험관내 방법은 비치료적 및/또는 비진단적이다.
본 발명에 있어서 실험관내 실험방법은, 항-VEGFA 항체 및 항-VEGFA/PD-1 이기능성 항체는 둘 다 HUVEC 세포 증식을 억제할 수 있으며, 및 항-PD-1 항체 및 항체-VEGFA/PD-1 이기능성 항체는 둘 다 IFN-γ 및/또는 IL-2의 분비를 촉진하고 면역 반응을 활성화 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 일 양태에 있어서 이중 특이적 항체 또는 본 발명의 접합체의 유효량을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 악성 종양의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것으로서, 바람직하게는, 상기 악성 종양은 결장암, 직장암, 비소 세포 폐암과 같은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 신경 아교종, 흑색종, 신장 종양, 전립선 암, 방광암, 위장암, 유방암, 뇌암 및 백혈병으로부터 선택되는 것이다.
본 발명에 있어서 이중 특이적 항체의 치료적 또는 예방적 유효량의 전형적인 비-제한적 범위는 0.02 내지 50 mg/kg, 예컨대, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 25 mg/kg, 또는 1 내지 10 mg/kg이다. 복용량은 치료할 증상의 유형과 중증도에 따라 다를 수 있다. 또한, 당업자는 임의의 특정 환자에 대해 특정 투여 요법이 환자의 필요 및 의사의 전문적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정될 수 있음을 인식할 것이다; 본 발명에 있어서 제공된 용량 범위는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 약제학적 조성물의 용도 또는 범위를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서 대상체는 인간과 같은 포유 동물일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따른 악성 종양의 예방 및/또는 치료 용도를 위해 이중 특이적 항체 또는 접합체가 제공되며, 바람직하게는, 상기 악성 종양은 결장암, 직장암, 비소 세포 폐암과 같은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 신경 아교종, 흑색종, 신장 종양, 전립선 암, 방광암, 위장암, 유방암, 뇌암 및 백혈병으로부터 선택된다.
다음을 사용하기 위한 본 발명의 일 양태에 따른 이중 특이적 항체 또는 접합체가 제공된다:
(1)
샘플에서 VEGFA 수준 감지,
VEGFA와 VEGFR2의 결합 차단,
VEGFA의 활성 또는 수준을 하향-조절,
혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극 완화,
혈관 내피 세포 증식 억제, 또는
종양 혈관 신생 차단;
및/또는
(2)
PD-1의 PD-L1에 대한 결합 차단,
PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절,
유기체에서 PD-1의 면역 억제 완화,
T 림프구에서 IFN-γ 분비 촉진, 또는
T 림프구에서 IL-2 분비 촉진.
항체 약물, 특히 단일 클론 항체는 다양한 질병의 치료에 좋은 효능을 달성하였다. 이러한 치료용 항체를 획득하기 위한 전통적인 실험방법은 항원으로 동물을 면역시키고 면역화 된 동물에서 항원을 표적으로 하는 항체를 획득하거나, 친화성 성숙에 의해 항원에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 항체를 개선하는 것이다.
경쇄와 중쇄의 가변 영역은 항원의 결합을 결정한다; 각 사슬의 가변 영역은 상보성 결정 영역 (Complementarity Determining Regions, CDRs)이라는 세 개의 초 가변 영역 (hypervariable regions)이 포함된다 (중쇄 (H Chain)의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 (L Chain)의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 이는 Kabat et al.에 의해 명명되었다 ((중쇄 (H Chain)의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 (L Chain)의 CDR은 Kabat에 의해 명명 된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다 등등) CDRs of the heavy chain (H Chain) comprise HCDR1, HCDR2, and HCDR3, and CDRs of the light chain (L Chain) comprise LCDR1, LCDR2, and LCDR3, which are named by Kabat et al., Bethesda M.d., (면역학적 관련된 단백질 서열 )Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication (1-3) 1991: 91-3242 참조).
바람직하게는, CDR은 IMGT 넘버링 시스템 (IMGT numbering system)에 의해 정의될 수도 있다, Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. "IMGT / 3Dstructure-DB 및 IMGT / DomainGapAlign : 면역 글로불린 또는 항체, T 세포 수용체, MHC, IgSF 및 MhcSF를 위한 데이터 베이스 및 도구"("IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF.") Nucleic acids research 38.suppl_1 (2009): D301-D307 참조.
하기 (1) 내지 (13)의 모노클로날 항체 서열의 CDR 영역의 아미노산 서열은 당업자에게 잘 알려진 기술적 수단, 예를 들어 VBASE2 데이터 베이스 및 IMGT 정의에 따라 분석하였으며, 그 결과는 다음과 같다:
(1) 베바시주맙 (Bevacizumab)
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 5에 기재되어 있고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 기재되어 있다.
중쇄 가변 영역의 3 개 CDR 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다:
HCDR1: GYTFTNYG (서열번호 15)
HCDR2: INTYTGEP (서열번호 16)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (서열번호 17)
경쇄 가변 영역의 3 개 CDR 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다:
LCDR1: QDISNY (서열번호 18)
LCDR2: FTS (서열번호 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (서열번호 20)
(2) 14C12H1L1
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 9에 기재되어 있고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 11에 기재되어 있다.
중쇄 가변 영역의 3 개 CDR 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다:
HCDR1: GFAFSSYD (서열번호 21)
HCDR2: ISGGGRYT (서열번호 22)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (서열번호 23)
경쇄 가변 영역의 3 개 CDR 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다:
LCDR1: QDINTY (서열번호 24)
LCDR2: RAN (서열번호 25)
LCDR3: LQYDEFPLT (서열번호 26)
(3) VP101
중쇄의 9개 CDR 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다.
HCDR1: GYTFTNYG (서열번호 15)
HCDR2: INTYTGEP (서열번호 16)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (서열번호 17)
HCDR4: GFAFSSYD (서열번호 21)
HCDR5: ISGGGRYT (서열번호 22)
HCDR6: ANRYGEAWFAY (서열번호 23)
HCDR7: QDINTY (서열번호 24)
HCDR8: RAN (서열번호 25)
HCDR9: LQYDEFPLT (서열번호 26)
경쇄 가변 영역의 3개 CDR 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다:
LCDR1: QDISNY (서열번호 18)
LCDR2: FTS (서열번호 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (서열번호 20)
본 발명에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 여기에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험실 운영은 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 절차이다. 한편, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위한 관련 용어에 대한 정의 및 설명은 하기와 같다.
본 발명에 있어서, VEGFA 단백질 (Genbank 서열번호 NP_001165097.1)의 아미노산 서열을 언급할 때, VEGFA 단백질의 전체 길이가 포함되며, VEGFA의 융합 단백질뿐만 아니라 예컨대, 마우스 또는 인간 IgG (mFc 또는 hFc)의 Fc 단백질 단편에 융합된 단편이 포함된다. 하지만, 당업자는 VEGFA 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이가 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 자연적으로 생성되거나 인위적으로 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명에서 용어 "VEGFA 단백질"은 천연 또는 인공 변이체를 포함하여 이러한 모든 서열을 포함해야 한다. 또한, VEGFA 단백질의 서열 단편을 설명할 때 천연 또는 인공 변이체에 해당 서열 단편도 포함된다. 본 발명의 일 구체예에서, VEGFA 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1의 밑줄이 그어진 부분으로 나타난다 (마지막 6 개의 His 없이 총 302 개의 아미노산).
본 발명에 있어서, VEGFR2 단백질의 아미노산 서열 (KDR, GenBank 서열번호 NP_002244라고도 함)을 언급할 때, 그것은 VEGFR2 단백질의 전체 길이, 또는 VEGFR2의 세포 외 단편 VEGFR2-ECD, 또는 VEGFR2-ECD를 포함하는 단편을 포함하고,그리고 그것은 또한 VEGFR2-ECD의 융합 단백질, 예를 들어 마우스 또는 인간 IgG의 Fc 단백질 단편 (mFc 또는 hFc)에 융합된 단편을 포함한다. 하지만, 당업자는 VEGFR2 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이 (대체, 삭제 및 / 또는 추가를 포함하되 이에 국한되지 않음)가 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 자연적으로 생성되거나 인위적으로 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명에 있어서, 용어 "VEGFR2 단백질"은 천연 또는 인공 변이를 포함하여 이러한 모든 서열을 포함하여야 한다. 또한, VEGFR2 단백질의 서열 단편을 설명할 때 천연 또는 인공 변이체에 해당 서열 단편도 포함된다. 본 발명의 한 구체예에서, VEGFR2의 세포 외 단편 VEGFR2-ECD의 아미노산 서열은 서열번호 4 (766 아미노산)의 물결 모양 밑줄로 표시된 부분으로 표시된다.
본 발명에 있어서, 달리 명시되지 않는 한, VEGFR은 VEGFR1 및/또는 VEGFR2이고; 이의 특정 단백질 서열은 종래 기술에 공지된 서열이며, 기존 문헌 또는 GenBank에 개시된 서열을 참조할 수 있다. 예를 들어, VEGFR1 (VEGFR1, NCBI 유전자ID: 2321); VEGFR2 (VEGFR2, NCBI 유전자 ID: 3791).
본 발명에 있어서, PD-1 단백질 (프로그래밍 된 세포 사멸 단백질 1, NCBI GenBank : NM_005018)의 아미노산 서열을 언급할 때, PD-1 단백질의 전체 길이, 또는 PD-1의 세포 외 단편 PD-1ECD 또는 PD-1ECD를 포함하는 단편을 포함하고, 그리고 그것은 또한 그것은 또한 PD-1ECD의 융합 단백질, 예컨대 마우스 또는 인간 IgG의 Fc 단백질 단편 (mFc 또는 hFc)에 융합된 단편을 포함한다. 하지만, 당업자는 PD-1 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 변이 (대체, 삭제 및 / 또는 추가를 포함하되 이에 제한되지 않음)가 생물학적 기능에 영향을 주지 않고 자연적으로 생성되거나 인위적으로 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명에서 용어 "PD-1 단백질"은 천연 또는 인공 변이를 포함하여 이러한 모든 서열을 포함해야한다. 또한, PD-1 단백질의 서열 단편을 설명할 때 천연 또는 인공 변이체에 해당 서열 단편도 포함된다.
본 발명에 있어서 용어 EC50은 최대 효과의 50 %에 대한 농도, 즉 최대 효과의 50 %를 유발할 수 있는 농도를 의미한다.
본 발명에 있어서 용어 “항체”는 일반적으로 2 쌍의 폴리펩티드 사슬 (각 쌍은 하나의 “경쇄”(L) 사슬 및 하나의 "중"(H) 사슬을 갖는)으로 구성된 면역 글로불린 분자를 지칭한다. 일반적인 의미에서 중쇄는 항체에서 더 큰 분자량을 가진 폴리펩티드 사슬로 해석될 수 있고, 경쇄는 항체에서 더 작은 분자량을 가진 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 경쇄는 κ및 λ경쇄로 분류된다. 중쇄는 일반적으로 μ, δ,γ,α 또는 ε으로 분류되며 항체의 이소 형은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄에서 가변 영역 및 불변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산의 “J”영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 3 개 이상의 아미노산의 “D”영역을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH)과 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL)과 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포)와 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)의 결합을 포함하여 면역 글로불린이 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 매우 가변적인 영역 (CDR (Complementarity Determining Region)이라고 함)으로 더 세분화될 수 있으며, 그 사이에는 프레임 워크 영역 (FR)이라고하는 보수적 영역이 분포되어 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복실 말단까지 다음 순서로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역 (VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 할당은 면역학적 관심 단백질의 Kabat 서열 (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)) 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196(1987): 901-917; Chothia et al. Nature 342(1989): 878-883 또는 IMGT 번호 체계의 정의, Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas 및 Marie-Paule Lefranc 참조를 기반으로 할 수 있다. “IMGT / 3Dstructure-DB 및 IMGT / DomainGapAlign: 면역 글로불린 또는 항체, T 세포 수용체, MHC, IgSF 및 MhcSF를 위한 데이터베이스 및 도구” 핵산 연구 38.suppl_1 (2009) : D301-D307. 특히, 중쇄는 또한 6 개, 9 개 또는 12 개와 같은 3 개 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서 이중 특이적 항체에서 중쇄는 IgG 항체의 중쇄의 C-말단이 다른 항체에 연결된 ScFv 일 수 있으며, 이 경우 중쇄는 9개의 CDR을 포함한다. 용어 “항체”는 항체를 생산하는 특정 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 특히 재조합 항체, 모노클로날 항체 및 폴리 클로날 항체를 포함한다. 항체는 항체 IgG (예를 들어, 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM과 같은 상이한 이소타입 (Isotype)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "항원 결합 단편"은, 또한 "항원 결합 부분"으로도 알려져 있으며, 전장 항체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 전장 항체가 결합하는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고, 및/또는 항원에 대한 특이적 결합을 위해 전장 (full-length) 항체와 경쟁한다. 일반적으로 Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989))는 모든 목적을 위해 그 전체가 본 발명에 참조로 포함된다. 항체의 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F (ab') 2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일 결합 항체 단편 (예를 들어, scFv), 키메라 항체, 디아바디 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "Fv 단편"은 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다 (Ward et al., Nature 341 (1989) : 544 546); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 그리고 용어 "F (ab ') 2 단편"은 힌지 영역에서 이황화가교에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
일부 경우에, 항체의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체 (예를 들어, scFv)로서 VL 및 VH 도메인이 쌍을 이루어 단일 폴리펩티드 사슬을 생성할 수 있는 링커를 통해 1가 분자를 형성한다 (예를 들어, Bird et al., Science 242 (1988) : 423426 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) : 5879 5883 참조). 이러한 scFv 분자는 일반적인 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH- 링커-VL-COOH (NH2-VL-linker-VH-COOH 또는 NH2-VH-linker-VL-COOH). 선행 기술에서 적절한 링커는 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다. 예를 들어, 아미노산 서열 (GGGGS)4를 갖는 링커를 사용할 수 있으며, 그 변이체도 사용할 수 있다 (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) : 6444-6448). 본 발명에 유용한 다른 링커는 Alfthan et al., Protein Eng. 8 (1995): 725-731, Choi et al., Eur. J. Immunol. 31 (2001): 94-106, Hu et al., Cancer Res. 56 (1996): 3055-3061, Kipriyanov et al., J. Mol. Biol. 293 (1999): 41-56, and Roovers et al., Cancer Immunol. (2001)에 의해 설명된다.
일부 경우에, 항체의 항원 결합 단편은 디아바디이고, 즉, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리 펩타이드 사슬에서 발현되는 2가 항체이다. 하지만, 사용된 링커가 너무 짧아 동일한 사슬에 있는 두 도메인의 쌍을 허용하기 때문에 도메인이 다른 사슬에 있는 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 되며 두 개의 항원 결합 부위가 생성된다 (참조, e.g., Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993):6444-6448, and Poljak RJ et al., Structure 2 (1994):1121-1123).
항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, 상기 언급된 항체 단편)은 당업자에게 공지된 통상적인 기술 (예를 들어, 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 절단)을 사용하여 주어진 항체로부터 수득 될 수 있으며, 항체의 항원 결합 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 특이성에 대해 스크리닝 된다.
본 발명에 있어서, 문맥에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 용어 "항체"를 언급할 때는, 이는 온전한 항체뿐 만 아니라 항체의 항원 결합 단편도 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "mAb" 및 "모노클로날 항체"는 고도로 상동성인 항체 그룹으로부터 유래된 항체 또는 이의 단편을 지칭하며, 예를 들어, 자발적으로 발생할 수 있는 자연 돌연변이를 제외하고는, 동일한 항체 분자 그룹에서 유래한다. 단일클론항체는 항원의 단일 에피토프에 대해 높은 특이성을 가지고 있다. 모노클로날 (monoclonal) 항체에 비해 폴리클로날 (polyclonal) 항체는 일반적으로 항원상의 상이한 에피토프를 일반적으로 인식하는 적어도 2 개 이상의 상이한 항체를 포함한다. 단일 클론 항체는 일반적으로 Kohler 등이 처음 보고한 하이브리도마 기술 (Nature, 256:495, 1975)로 얻을 수 있으며, 재조합 DNA 기술로도 얻을 수 있다 (예를 들어, U.S. Patent 4,816,567를 참조).
본 발명에 있어서, 용어 "키메라 항체 (chimeric antibody)" 경쇄 또는/ 및 중쇄의 일부가 항체 (특정 종에서 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속할 수 있음)로부터 유래된 항체를 지칭하고, 경쇄 또는/및 중쇄의 다른 부분은 다른 항체 (동일하거나 다른 종에서 유래될 수 있거나 동일하거나 상이한 항체 부류 또는 하위 부류에 속할 수 있음)로부터 유래된다. 하지만 어쨌든, 그것은 표적 항원에 대한 결합 활성을 유지한다 (Cabilly 등의 U.S. Patent 4,816,567; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) : 6851-6855).
본 발명에 있어서, 용어 "인간화 항체 (Humanized antibody)"는 인간 면역글로불린 (수용체 항체)의 CDR 영역의 전부 또는 일부가 비인간 항체 (공여자 항체)의 CDR영역으로 대체될 때 수득되는 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 여기서 공여자는 항체는 예상되는 특이성, 친화성 또는 반응성을 갖는 비-인간 (예를 들어, 마우스 , 래트 또는 토끼) 항체 일 수 있다. 또한, 수용체 항체의 프레임 워크 영역 (FR)에 있는 일부 아미노산 잔기는 해당 비인간 항체의 아미노산 잔기로 대체될 수 있거나 또는 다른 항체의 아미노산 잔기에 의해 항체의 성능을 추가로 개선하거나 최적화할 수 있다. 인간화 항체에 대한 자세한 내용은, 예를 들어, Jones등의 Nature, 321 (1986): 522-525; Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 (1992): 593-596, and Clark, Immunol. Today 21 (2000): 397-402을 참조한다.
본 발명에 있어서, 용어 "에피토프 (epitope)"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 부위를 의미한다. "에피토프"는 또한 당 업계에서 "항원 결정 인자"로 불린다. 에피토프 또는 항원 결정자는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며 일반적으로 특정 3차원 구조적 특성 및 특정 전하 특성을 가지고 있다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 고유 한 공간 형태로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 이상의 연속 또는 비 연속 아미노산을 포함하며, "선형 (linear)" 또는 "구조적 (conformational)"이어야 한다. 예를 들어, 분자 생물학 방법의 에피토프 매핑 프로토콜 (Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology), Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)을 참조한다. 선형 에피토프에서 단백질과 상호 작용 분자 (예를 들어, 항체) 사이의 모든 상호 작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 형태적 에피포트에서, 상호 작용부위는 서로 분리된 단백질 아미노산 잔기에 걸쳐 존재한다.
본 발명에 있어서, 용어 "분리된"은 자연 상태로부터 인위적인 수단에 의해 얻어진 것을 의미한다. 특정 "분리된" 물질 또는 구성 요소가 자연에 나타나면 자연 환경에서 변화가 발생하거나 자연 환경에서 분리되거나 둘 다일 수 있다. 예를 들어, 어떤 분리되지 않은 특정 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 특정 살아있는 동물에 자연적으로 존재하고, 그러한 자연 상태로부터 분리된 고순도의 동일한 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 분리된 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드라고한다. "분리 된"이라는 용어는 물질의 활성에 영향을 주지 않는 인공 또는 합성 물질 또는 기타 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 "벡터"는 폴리 뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리 뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 벡터를 발현 벡터 (expression vector)라고 한다. 벡터는 변형 (transformation), 변환 (transduction) 또는 벡터에 의해 운반되는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 형질 감염 (transfection)으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려진 것으로 다음을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 플라스미드 (plasmids); 파지 미드 (phagemids); 코스 미드 (cosmids); 효모 인공 염색체 (yeast artificial chromosome, YAC), 세균 인공 염색체 (bacterial artificial chromosome, BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체 (P1-derived artificial chromosome, PAC)와 같은 인공 염색체; 람다 파지 (lambda phages) 또는 M13 파지 (M13 phages)와 같은 파지 및 동물 바이러스. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스에는 레트로 바이러스 (retroviruses) (렌티 바이러스 (lentiviruses) 포함), 아데노 바이러스 (adenoviruses), 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated viruses), 헤르페스 바이러스 (herpes viruses) (예 : 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus)), 폭스 바이러스 (poxviruses), 배큘로 바이러스 (baculoviruses), 유두종 바이러스 (papillomaviruses) 및 파포 바 바이러스 (papovaviruses) (예를 들어, SV40). 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 발현을 제어하는 다양한 요소를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 벡터는 복제 개시 부위를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "숙주세포"는 벡포가 도입될 수 있는 세포를 의미하고, E. coli 또는 bacillus subtilis와 같은 원핵 세포, 효모 세포 또는 아스페르 길루스와 같은 곰팡이 세포, S2 초파리 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포, 또는 섬유 아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 "특이적으로 결합하는"은 항체와 표적 항원 사이의 반응과 같은 두 분자 사이의 비 무작위 결합 반응을 의미한다. 본 발명의 일 양태는, 항원에 특이 적으로 결합하는 항체 (또는 항원에 특이적인 항체)는 항체가 친화도 (KD)가 약 10-5 M, 예를 들어, 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 항원에 결합한다는 것을 의미한다. 본 발명의 일 양태에서, 용어 "표적"은 특이적 결합을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호 작용에 대한 해리 평형 상수를 나타내며, 이는 항체와 항원 사이의 결합 친 화성을 설명하는 데 사용된다. 평형 해리 상수가 작을수록 항체-항원 결합이 더 타이트 해지고 항체와 항원 사이의 친 화성이 높아진다. 일반적으로, 항체는 약 10-5 M 미만, 예를 들어 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 해리 평형 상수 (KD)로 SPR (Surface Plasmon Resonance)을 사용하는 BIACORE 기기에서 결정된 대로 항원에 결합한다.
본 발명에 있어서, 용어 "모노클로날 항체 (monoclonal antibody)" 및 "mAb"는 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있으며; 용어 "폴리클로날 항체 (polyclonal antibody)"는 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있으며; 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 아미노산은 일반적으로 당업계에 공지된 단일 문자 및 3-문자 약어 (abbreviations)로 표시된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제 (pharmaceutically acceptable excipient)"는 당해 분야에 널리 공지된 대상체 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 비히클을 지칭하며 (예를 들어, Remington의 제약 과학 (Remington's Pharmaceutical Sciences). Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) 참조) 및 pH 조절제, 계면 활성제, 보조제 및 이온 강도 향상제를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, pH 조절제는 포스페이트 완충액을 포함하나 이에 제한되는지는 않으며; 계면 활성제는 양이온성, 음이온성 또는 Tween-80과 같은 비이온성 계면활성제; 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 "보조제 (ajuvant)"는 항원에 대한 유기체의 면역 반응을 향상시키거나 항원과 함께 유기체로 전달되거나 유기체로 미리 전달될 때 면역 반응의 유형을 변경할 수 있는 비특이적 면역 증강제를 의미한다. 알루미늄 보조제 (예를 들어, 수산화 알루미늄), Freund 보조제 (예를 들어, 완전 Freund 보조제 및 불완전 Freund 보조제), 코리네박테리엄 파범 (corynebacterium parvum), 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide), 사이토카인 등을 포함하는 다양한 보조제가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Freund의 보조제는 동물 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 보조제이다. 수산화 알루미늄 보조제는 임상 시험에서 더 많이 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 얻거나 적어도 부분적으로 얻는데 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 예방적 유효량 (예를 들어, PD-1이 PD-L1에 결합하거나 VEGF의 과발현과 관련된 질환, 예컨대, 종양)은 질병의 발명을 예방, 중지 또는 질병의 발병 지연 (예를 들어, PD-L1에 대한 PD-L1 결합 또는 종양과 같은 VEGF의 과발현과 관련된 질병)하기에 충분한 양이다; 치료적 유효량은 질병을 앓고 있는 환자에서 질병 및 그 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 중지하기에 충분한 양이다. 의심할 여지없이 이러한 유효량을 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료용으로 효과적인 양은 치료할 질병의 중증도, 환자의 면역체계의 전반적인 상태, 나이, 체중, 성별과 같은 환자의 일반적인 상태, 약물투여방식 및 동시에 투여되는 기타 치료 등에 따라 달라진다.
본 발명의 장점:
이중 특이적 항체 VP101은 VEGFA에 특이적으로 결합하고 VEGFA와 VEGFR2의 결합을 효과적으로 차단할 수 있으며, 유기체에서 VEGFA의 면역 억제 및 혈관 신생에 대한 VEGFA의 촉진 효과를 특이적으로 완화시킬 수 있다; VP101은 PD-1에 특이 적으로 결합하고 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 효과적으로 차단할 수 있으며 유기체에서 PD-1의 면역 억제를 특이적으로 완화하고 면역 반응을 활성화할 수 있다.
본 발명은 종양 치료 및 분자 면역학 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 항 -VEGFA/PD-1 이기능 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 항-VEGFA/PD-1 이기능 항체는 VEGFA를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 및 PD-1을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함한다. 본 발명의 이기 능성 항체는 VEGFA 및 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, 유기체에서 VEGFA 및 PD-1의 면역 억제를 특이적으로 완화시킬 수 있으며, 종양에 의한 혈관 신생을 억제할 수 있어 적용 가능성이 좋다.
도 1은 이기능성 항체 (bifunctional antibody)VP101의 SDS-PAGE 검출 결과를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로 4 개 레인의 샘플과 각각의 로딩량은 다음과 같다: 비-환원 단백질 전기 영동 로딩 버퍼 (electrophoresis loading buffer)의 항체, 1 μg; 감소된 단백질 전기 영동 로딩 버퍼의 항체, 1 μg; 마커, 5μL; BSA, 1 μg.
도 2는 항체 VP101과 PD-1의 결합에 대한 동역학적 (kinetic) 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 3은 항체 BsAbB7과 PD-1의 결합에 대한 동역학적 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 4는 항체 BsAbB8과 PD-1의 결합에 대한 동역학적 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 5는 항체 14C12H1L1과 PD-1의 결합에 대한 동역학적 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 6은 항체 니볼루맙 (nivolumab)과 PD-1의 결합에 대한 동역학적 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 7은 항체 VP101과 VEGF의 결합에 대한 동 역학적 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 8은 항체 BsAbB7과 VEGF의 결합에 대한 동 역학적 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 9는 항체 BsAbB8과 VEGF의 결합에 대한 운동 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 10은 항체 베바시주맙 (bevacizumab)과 VEGF의 결합에 대한 운동 특성 파라미터의 검출 결과를 보여준다.
도 11은 간접 ELISA (indirect ELISA)에 의해 검출된 VEGFA에 대한 항체 VP101의 결합 활성을 보여준다.
도 12는 간접 ELISA에 의해 검출된 VEGFA-his에 대한 항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8 및 베바시주맙의 각각의 결합 활성을 보여준다.
도 13은 간접 ELISA에 의해 검출된 PD-1에 대한 항체 VP101의 결합 활성을 보여준다.
도 14는 간접 ELISA에 의해 검출된 PD-1에 대한 항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 및 니볼루맙의 각각의 결합 활성을 보여준다.
도 15는 경쟁 ELISA (competitive ELISA)에 의해 검출된 VEGFA에 대한 결합에 대해 VEGFR2와 경쟁하는 항체 VP101의 활성을 보여준다.
도 16은 경쟁 ELISA에 의해 검출된 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1과 경쟁하는 항체 VP101의 활성을 보여준다.
도 17은 FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 세포 표면 단백질 PD-1에 대한 항체 14C12H1L1 및 VP101의 결합 EC50을 보여준다.
도 18은 FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 세포 표면 단백질 PD-1에 대한 항체 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 결합 EC50을 보여준다.
도 19는 FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 세포 표면 단백질 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1과 경쟁하는 항체 VP101 및 14C12H1L1의 활성을 보여준다.
도 20은 FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 세포 표면 단백질 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1과 경쟁하는 항체 14C12H1L1, VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L 및 니볼루맙의 활성을 보여준다.
도 21은 NFAT 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 VEGF를 차단하는데 있어서 항체 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 중화 생물 활성 (neutralization bioactivity)을 보여준다.
도 22는 HUVEC 세포 증식에 대한 베바시주맙 및 VP101의 효과를 보여준다.
도 23은 DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 IFN-γ의 분비에 대한 VP101의 효과를 보여준다.
도 24는 DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 IFN-γ의 분비에 대한 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 효과를 보여준다.
도 25는 DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 IL-2의 분비에 대한 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 효과를 보여준다.
도 26은 ELISA에 의해 검출된 PBMC 및 Raji-PD-L1 세포의 혼합 배양에 의해 유도된 사이토카인 IL-2의 분비에 대한 항체 14C12H1L1 및 VP101의 효과를 보여준다.
도 27은 ELISA에 의해 검출된 PBMC 및 Raji-PD-L1 세포의 혼합 배양에 의해 유도된 사이토카인 IFN-γ의 분비에 대한 항체 14C12H1L1 및 VP101의 효과를 보여준다.
도 28은 ELISA에 의해 검출된 PBMC 및 Raji-PD-L1 세포의 혼합 배양에 의해 유도된 사이토카인 IFN-γ의 분비에 대한 항체 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 효과를 보여준다.
도 29는 ELISA에 의해 검출된 PBMC 및 Raji-PD-L1 세포의 혼합 배양에 의해 유도된 사이토카인 IL-2의 분비에 대한 항체 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 효과를 보여준다.
도 30은 다양한 농도에서 VP101에 의한 종양 성장 억제를 보여준다.
도 31은 마우스의 체중에 대한 상이한 농도에서의 VP101의 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 일 양태는 실시예를 통해 상세히 설명된다. 당업자는 하기 실시예가 본 발명을 설명하기 위해서만 사용된다는 것을 이해할 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 기술 또는 조건에 대한 구체적인 설명이 없는 경우는 해당 분야의 문헌 (예를 들어, Guide to Molecular Cloning Experiments, authored by J. Sambrook et al., and translated by Huang Peitang et al., third edition, Science Press, 참조)에 기술된 기술, 조건 또는 제품 설명서에 따라 수행되었다. 사용된 시약 또는 기기는 제조업체가 지정되지 않은 경우 모두 시판중인 기존 제품이다.
본 발명에 따른 일 실시예에서, 동일한 표적에 대한 시판 항체 베바시주맙 (bevacizumab, 상품명 Avastin®)은 대조 항체로 Roche에서 구입하거나 제조예 (preparation example) 4에 따라 제조하였다.
본 발명에 따른 일 실시예에서, 동일한 표적에 대한 시판 항체 니볼루맙 (nivolumab, 상표명 Opdivo®)은 대조군 항체로서 BMS에서 구입하였다.
본 발명에 따른 일 실시예에서, 대조항체 BsAbB7 및 BsAbB8의 아미노산 서열은 중국 특허공개 CN105175545A에서 각각 BsAbB7 및 BsAbB8의 아미노산 서열과 동일하였다.
제조예 1. 융합 단백질 PD-1-mFc, PD-1-hFc 및 PD-L1-hFc의 제조
융합 단백질인 PD-1-mFc, PD-1-hFc 및 PD-L1-hFc의 제조 및 SDS-PAGE 전기 영동 검출은 중국 특허공개 CN106632674A의 제조예 1을 완전히 참조하여 수행된다.
본 제조예에서 융합 단백질인 PD-1-mFc, PD-1-hFc 및 PC-L1-hFc의 아미노산 서열 및 코딩 뉴클레오티드 서열은 중국 특허공개 CN106632674A의 제조예 1의 각각 PD-1-mFc, PD-1-hFc 및 PDL-1-hFc과 동일하다.
따라서, 융합 단백질 PD-1-mFc, PD-1-hFc 및 PD-L1-hFc가 수득 되었다.
제조예 2. 융합 단백질 VEGFA-His의 발현 및 정제
1. 플라스미드 VEGFA-His의 구축
PCR 증폭은 VEGFA 인간 cDNA (Origene에서 구입)를 주형으로 사용하고 hVEGFA-His 단편은 일반 DNA 산물 정제 키트를 사용하여 정제 및 분리되었다. 분리된 hVEGFA-His 단편과 발현 벡터 pcDNA3.1을 XbaI & HindIII-HF로 효소 분해하고, 겔 추출에 의해 표적 유전자 단편을 분리하고 T4 리가제에 의해 선형 발현 벡터와 결찰 시켰다. 그런 다음 모든 결찰 산물을 DH5a 화학적으로 적합한 세포로 형질 전환하고 아가 (Agar) 플레이트에 Amp로 코팅하였다. 콜로니 PCR 식별을 위해 잘 분리된 단일 콜로니를 선택하고, PCR 양성 클론을 배양을 위해 LB 배양 배지에 접종하고, 박테리아 용액을 취하여 시퀀싱 검증을 위해 Guangzhou Invitrogen Biotechnology로 보냈다. 시퀀싱 결과의 정렬은 양성 정찰기의 삽입 순서가 완전히 정확함을 보여주었다.
2. 융합 단백질 VEGFA-His의 발현 및 정제
재조합 플라스미드 VEGFA-his를 리포펙타민 (lipofectamine) 형질 감염 키트 (Invitrogen에서 구매)의 설명서에 따라 7일 동안 293F 세포 (Invitrogen에서 구매)에 형질 감염시킨 후, 배양액을 고속 원심 분리, 상층액 농축 및 바인딩 완충액 A (Binding Buffer A)로 완충액을 교환한 후 HisTrap 컬럼에 로딩하고 일루션 완충액 A (Elution Buffer A)로 단백질을 선형 용출 시켰다. 1차 순수 샘플은 HiTrap Desalting 컬럼을 사용하여 바인딩 완충액 B (Binding Buffer B)로 완충액을 교환한 후 HiTrap Q 컬럼에 로드하고, 일루션 완충액 B (Elution Buffer B)로 단백질을 선형으로 용출하고, 표적 샘플을 분리하고 버퍼를 PBS로 교환하였다. 정제된 샘플은 SDS-PAGE 전기 영동 검출을 위해 감소된 단백질 전기 영동 로딩 버퍼에 첨가되었다.
따라서 융합 단백질 VEGFA-His를 얻었다.
VEGFA-His의 아미노산 서열은 다음과 같다 (171 aa):
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRRHHHHHH（서열번호 1）
상기, 밑줄이 그어진 부분은 VEGFA의 아미노산 서열이다.
VEGFA-His (513bp)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
GCACCCATGGCCGAGGGCGGCGGCCAGAACCACCACGAGGTGGTGAAGTTCATGGACGTGTACCAGAGAAGCTACTGCCACCCCATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCCGACGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCCAGCTGCGTGCCCCTGATGAGATGCGGCGGCTGCTGCAACGACGAGGGCCTGGAGTGCGTGCCCACCGAGGAGAGCAACATCACCATGCAGATCATGAGAATCAAGCCCCACCAGGGCCAGCACATCGGCGAGATGAGCTTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGTGCAGACCCAAGAAGGACAGAGCCAGACAGGAGAACCCCTGCGGCCCCTGCAGCGAGAGAAGAAAGCACCTGTTCGTGCAGGACCCCCAGACCTGCAAGTGCAGCTGCAAGAACACCGACAGCAGATGCAAGGCCAGACAGCTGGAGCTGAACGAGAGAACCTGCAGATGCGACAAGCCCAGAAGACATCATCACCATCACCAC（서열번호 2）
제조예 3. 융합 단백질 VEGFR2-hFc의 발현 및 정제
1. 유전자 VEGFR2-hFc의 합성:
유전자 VEGFR2의 세포 외 단편 VEGFR2 ECD (혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2), NCBI GenBank: NP_002244)에 해당하는 아미노산을 TEV 및 인간 IgG의 Fc 단백질 단편 (hFc) (서열 번호 3)과 각각 융합시켰다. Genscript는 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)을 합성하도록 맡겼다.
VEGFR2, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2, NCBI GenBank NP_002244;
hFc: Ig 감마-1 사슬 C 영역, 어세션 (accession) : P01857, 106-330;
융합 단백질 VEGFR2-hFc의 아미노산 서열: (998 aa)
MQSKVLLAVALWLCVETRAASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKANTTLQITCRGQRDLDWLWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKKGFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKSLISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECANEPSQAVSVTNPYPCEEWRSVEDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTRGPEITLQPDMQPTEQESVSLWCTADRSTFENLTWYKLGPQPLPIHVGELPTPVCKNLDTLWKLNATMFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCLAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPTITGNLENQTTSIGESIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDEGLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIEGAQEKTNLESRENLYFQGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（서열번호 3）
상기, 물결 모양 밑줄 부분은 VEGFR2의 ECD 부분, 프레임 부분은 TEV 효소 분해 부위, 실선 밑줄 부분은 hFc 부분이다.
융합 단백질 VEGFR2-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (2997 bp)
ATGCAGAGCAAGGTGCTGCTGGCCGTCGCCCTGTGGCTCTGCGTGGAGACCCGGGCCGCCTCTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTCTCTTGATCTGCCCAGGCTCAGCATACAAAAAGACATACTTACAATTAAGGCTAATACAACTCTTCAAATTACTTGCAGGGGACAGAGGGACTTGGACTGGCTTTGGCCCAATAATCAGAGTGGCAGTGAGCAAAGGGTGGAGGTGACTGAGTGCAGCGATGGCCTCTTCTGTAAGACACTCACAATTCCAAAAGTGATCGGAAATGACACTGGAGCCTACAAGTGCTTCTACCGGGAAACTGACTTGGCCTCGGTCATTTATGTCTATGTTCAAGATTACAGATCTCCATTTATTGCTTCTGTTAGTGACCAACATGGAGTCGTGTACATTACTGAGAACAAAAACAAAACTGTGGTGATTCCATGTCTCGGGTCCATTTCAAATCTCAACGTGTCACTTTGTGCAAGATACCCAGAAAAGAGATTTGTTCCTGATGGTAACAGAATTTCCTGGGACAGCAAGAAGGGCTTTACTATTCCCAGCTACATGATCAGCTATGCTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCAAAAATTAATGATGAAAGTTACCAGTCTATTATGTACATAGTTGTCGTTGTAGGGTATAGGATTTATGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAACCTTTTGTTGCTTTTGGAAGTGGCATGGAATCTCTGGTGGAAGCCACGGTGGGGGAGCGTGTCAGAATCCCTGCGAAGTACCTTGGTTACCCACCCCCAGAAATAAAATGGTATAAAAATGGAATACCCCTTGAGTCCAATCACACAATTAAAGCGGGGCATGTACTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAAGAGACACAGGAAATTACACTGTCATCCTTACCAATCCCATTTCAAAGGAGAAGCAGAGCCATGTGGTCTCTCTGGTTGTGTATGTCCCACCCCAGATTGGTGAGAAATCTCTAATCTCTCCTGTGGATTCCTACCAGTACGGCACCACTCAAACGCTGACATGTACGGTCTATGCCATTCCTCCCCCGCATCACATCCACTGGTATTGGCAGTTGGAGGAAGAGTGCGCCAACGAGCCCAGCCAAGCTGTCTCAGTGACAAACCCATACCCTTGTGAAGAATGGAGAAGTGTGGAGGACTTCCAGGGAGGAAATAAAATTGAAGTTAATAAAAATCAATTTGCTCTAATTGAAGGAAAAAACAAAACTGTAAGTACCCTTGTTATCCAAGCGGCAAATGTGTCAGCTTTGTACAAATGTGAAGCGGTCAACAAAGTCGGGAGAGGAGAGAGGGTGATCTCCTTCCACGTGACCAGGGGTCCTGAAATTACTTTGCAACCTGACATGCAGCCCACTGAGCAGGAGAGCGTGTCTTTGTGGTGCACTGCAGACAGATCTACGTTTGAGAACCTCACATGGTACAAGCTTGGCCCACAGCCTCTGCCAATCCATGTGGGAGAGTTGCCCACACCTGTTTGCAAGAACTTGGATACTCTTTGGAAATTGAATGCCACCATGTTCTCTAATAGCACAAATGACATTTTGATCATGGAGCTTAAGAATGCATCCTTGCAGGACCAAGGAGACTATGTCTGCCTTGCTCAAGACAGGAAGACCAAGAAAAGACATTGCGTGGTCAGGCAGCTCACAGTCCTAGAGCGTGTGGCACCCACGATCACAGGAAACCTGGAGAATCAGACGACAAGTATTGGGGAAAGCATCGAAGTCTCATGCACGGCATCTGGGAATCCCCCTCCACAGATCATGTGGTTTAAAGATAATGAGACCCTTGTAGAAGACTCAGGCATTGTATTGAAGGATGGGAACCGGAACCTCACTATCCGCAGAGTGAGGAAGGAGGACGAAGGCCTCTACACCTGCCAGGCATGCAGTGTTCTTGGCTGTGCAAAAGTGGAGGCATTTTTCATAATAGAAGGTGCCCAGGAAAAGACGAACTTGGAATCTAGAGAAAACCTGTATTTTCAGGGCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGA （서열번호 4）
상기, 물결모양 밑줄 부분은 VEGFR2의 ECD 부분이고, 프레임 부분은 TEV 효소 분해 부위이고, 밑줄 부분은 hFC 부분이다.
2. 플라스미드 pUC57simple-VEGFR2-hFc의 구축:
Genscript에서 합성된 VEGFR2-hFc 코딩 유전자는 발현 벡터 pUC57simple (Genscript 제공)에 클로닝 되었으며, pUC57simple-VEGFR2-hFc 플라스미드를 얻었다.
3. 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc의 구축:
플라스미드 pUC57simple-VEGFR2-hFc는 효소 분해되었으며 (Xba I 및 BamH I), 및 전기 영동에 의해 분리된 융합 유전자 단편 VEGFR2-hFc는 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen에서 구입)과 연결하여 컴페턴트 (competent) E.coli 세포 DH5a (TIANGEN에서 구입)으로 형질 전환된 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc로 제공되었다; 형질 감염 및 배양은 매뉴얼에 따라 수행되었다. 양성 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc 콜로니를 스크리닝하고, E. coli는 통상적 인 방법에 따라 증폭되었고, 그런 다음 키트 (Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd., DP103-03에서 구입)를 사용하여 키트 설명서에 따라 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc를 추출하였다.
4. 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc를 293F 세포로 형질 감염
재조합 플라스미드 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc를 리포펙타민 (lipofectamin) 형질 감염 키트 (Invitrogen에서 구입)에 따라 293F 세포 (Invitrogen에서 구입)로 형질 감염시켰다.
5. VEGFR2-hFc 단백질의 SDS-PAGE 전기 영동 검출
재조합 플라스미드 pcDNA3.1-VEGFR2-hFc를 293F 세포에 7일 동안 형질 감염 시킨 후, 배양 배지를 고속 원심 분리, 미세 다공성 막 진공 여과 및 Mabselect SuRe 컬럼에서 정제하여 VEGFR2-hFc 융합 단백질 샘플을 얻었으며, 샘플의 일부를 SDS-PAGE 전기 영동 검출을 위해 감소된 단백질 전기 영동 로딩 버퍼에 첨가하였다.
따라서 융합 단백질 VEGFR2-hFc를 얻었다.
제조예 4. 항-VEGFA 항체 베바시주맙 (Bevacizumab)의 제조
중국 특허공개 CN1259962A는 시판되는 VEGFA 모노클로날 항체 아바스틴 (베바시주맙)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 지칭한다. Genscript는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 맡겼다.
베바시주맙의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (123 aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS（서열번호 5）
베바시주맙의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (369 bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGC（서열번호 6）
베바시주맙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (107 aa)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK（서열번호 7）
베바시주맙의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (321bp)
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAG（서열번호 8）
중쇄 불변 영역은 모두 Ig 감마-1 사슬 C 영역, 어세션 (Accession): P01857;
경쇄 불변 영역은 모두 Ig 카파 사슬 C 영역, 어세션 : P01834이였다.
베바시주맙의 중쇄 cDNA와 경쇄 cDNA를 벡터 pcDNA3.1에 클로닝하여 항체 베바 시주 맙의 재조합 발현 플라스미드를 얻었다. 재조합 플라스미드를 293F 세포로 형질 감염시켰다. 293F 세포 배양 배지를 정제한 다음 검출하였다.
이에 따라 항-VEGFA 단일 클론 항체 아바스틴 (Avastin, 베바시주맙)을 얻었다.
제조예 5. 항 -PD-1 인간화 항체 14C12H1L1의 제조 및 검출
제조는 중국 특허 공개 CN106977602A에 기재된 실시예 3 내지 4에 따라 수행되었다.
인간화 항체 14C12H1L1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 그리고 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 중국 특허공개 CN106977602A의 실시예 3 내지 4에 기재된 것과 동일하고, 또한 다음과 같이 본원에 제공된다:
인간화 항체 14C12H1L1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (118 aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS（서열번호 9）
인간화 항체 14C12H1L1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: (354 bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT (서열번호 10)
인간화 항체 14C12H1L1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열: (107 aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK（서열번호 11）
인간화 항체 14C12H1L1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 : (321bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG（서열번호 12）
이에 따라 항 PD-1 인간화 항체 14C12H1L1을 얻었다.
제조예 6. hIgG의 제조 및 식별
Human Anti-Hen Egg Lysozyme IgG (anti-HEL, 예를 들어, human IgG, 약칭 hIgG)의 서열은 "친화성 성숙은 항-단백질 항체의 Fv 도메인의 안정성과 가소성을 증가시킵니다"라는 제목의 Acierno et al.에 의해 발표된 연구에서 Fab F10.6.6 서열의 가변 영역 서열에서 파생된다 (Acierno et al., J Mol Biol. 2007; 374(1): 130-46). 준비 방법은 다음과 같다:
Nanjing Genscript Biology에 인간 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄 (완전한 서열 또는 가변 영역) 유전자에 대한 아미노산의 코돈 최적화 및 유전자 합성을 수행하도록 맡겼으며, "분자 복제 실험 가이드 (제3판)"에 소개 된 표준 기술을 참조 및 PCR, 효소 분해, DNA 겔 추출, 결찰 변환, 콜로니 PCR 또는 효소 분해 식별과 같은 표준 분자 복제 기술을 사용하여 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 포유 동물 발현 시스템의 항체 중쇄 발현 벡터 및 항체 경쇄 발현 벡터에 서브 클로닝되었고, 그리고 재조합 발현 벡터의 중쇄 및 경쇄 유전자를 추가로 시퀀싱하여 분석 하였다. 서열이 정확한 것으로 확인된 후, 내독소가 없는 발현 플라스미드를 대규모로 준비하고, 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 재조합 항체의 발현을 위해 일시적으로 HEK293 세포에 공동 형질 감염 시켰다. 배양 7 일 후, 세포 배양 배지를 수집하고 rProtein A 컬럼 (GE)을 사용하여 친화성 정제하고 생성된 항체 샘플의 품질을 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 표준 분석 기술을 사용하여 결정하였다.
hIgG를 수득하여 하기 실시예 8 내지 9에서 사용하였다.
실시예 1. 이기능성 항체 VP101의 중쇄 및 경쇄의 서열 설계, 제조 및 검출
1. 시퀀스 디자인
본 발명의 이기능성 항체 VP101의 구조는 Morrison 형태 (IgG-scFv)이고, 예를 들어, IgG 항체의 두 중쇄의 C- 말단은 각각 다른 항체의 scFv 단편에 연결되며, 중쇄 및 경쇄의 주요 조성 설계는 하기 표 1과 같다.
VP101의 중쇄 및 경쇄 구성 설계
Bifunctional antibody No. Heavy chain Light chain
IgG part Linker fragment scFv part
VP101 Bevacizumab-H Linker1 14C12H1V-Linker1-14C12L1V Bevacizumab-L
상기 표 1에서:
(1) 우측 하단 모서리에 "V"가 표시된 것은 상응하는 중쇄의 가변 영역 또는 상응하는 경쇄의 가변 영역을 의미한다. "V"표지가 없는 경우, 상응하는 중쇄 또는 경쇄는 불변 영역을 포함하는 전체 길이이다. 이들 가변 영역의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 제조예에 기재된 상응하는 서열을 참조한다.
(2) 링커 1의 아미노산 서열은 GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS (서열번호 13)이다.
2. 항체 VP101의 발현 및 정제
VP101의 중쇄 cDNA 서열 및 경쇄 cDNA 서열을 각각 벡터 pUC57simple (Genscript 제공)에 클로닝하여 플라스미드 pUC57simple-VP101H 및 pUC57simple-VP101L을 각각 얻었다.
플라스미드 pUC57simple-VP101H 및 pUC57simple-VP101L은 효소로 분해되었으며 (HindIII&EcoRI), 및 전기 영동으로 분리된 중쇄 및 경쇄를 벡터 pcDNA3.1에 서브 클로닝하고, 재조합 플라스미드를 추출하여 293F 세포를 공동 형질 감염시켰다. 세포 배양 7일 후, 배양 배지를 고속으로 원심 분리하고 상층액을 농축하여 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼에 적재하였다. 단백질은 일루션 (Elution) Buffer로 한 단계 더 용출되었고, 표적 샘플 항체 VP101은 분리되고 완충액은 PBS로 교환되었다.
3. 항체 VP101 검출
정제된 샘플을 감소된 단백질 전기 영동 로딩 버퍼와 비 환원 단백질 전기 영동 로딩 버퍼 모두에 추가하고, 그리고 나서 SDS-PAGE 전기 영동 검출을 위해 끓였다. VP101의 전기 영동도는 도 1에 나타내었다. 환원 단백질 샘플의 표적 단백질은 75 kD 및 25 kD이고, 비환원 단백질 샘플 (단일항체)의 표적 단백질은 200 kD이다.
달리 명시하지 않는 한, 본 실시예의 방법으로 하기 실험에 사용된 인간화 항체 VP101을 제조하였다.
실시예 2. 인간화 항체 VP101의 운동 매개 변수의 검출
1. 인간화 항체 VP101과 PD-1-mFc의 결합 운동 매개 변수의 검출
샘플 희석 완충액은 PBS (0.02 % Tween-20, 0.1 % BSA, pH7.4)였다. 5 μg / mL 항체는 고정 높이가 약 0.4 nM 인 AHC 센서에 고정되었다. 센서는 60초 동안 버퍼에서 평형을 이루었으며, 120초 동안 0.62 내지 50 nM (3배 구배 희석) 농도로 PD-1-mFc에 결합된 센서에 항체를 고정하고, 그런 다음 항원과 항체를 300초 동안 완충액에서 해리하였다. 데이터는 친화성 상수를 얻기 위해 1: 1 모델 피팅으로 분석되었다. 데이터 수집 소프트웨어는 Fortebio Data Acquisition 7.0이고 데이터 분석 소프트웨어는 Fortebio Data Analysis 7.0이었다. 항체 VP101, BsAbB8, 14C12H1L1 및 대조군 항체 니볼루맙의 PD-1-mFc에 대한 결합의 동역학적 파라미터는 표 2에 나타내었으며, 동역학적 특성 파라미터의 검출 결과는 도 2, 3, 4, 5, 및 6에 각각 나타내었다.
인간화 항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 및 대조군 항체 니볼루맙의 PD-1-mFc에 대한 결합의 동역학적 파라미터
Sample ID KD (M) Kon (1/Ms) S E (kon) Kdis (1/s) S E (kdis) Rmax (nm)
VP101 1.68E-10 3.22E+05 1.44E+04 5.40E-05 3.16E-05 0.14-0.28
BsAbB7 1.62E-10 3.27E+05 2.60E+04 5.30E-05 6.24E-05 0.01-0.11
BsAbB8 4.06E-10 3.39E+05 2.04E+04 1.37E-04 4.61E-05 0.01-0.13
14C12H1L1 1.64E-10 4.55E+05 1.61E+04 7.47E-05 2.98E-05 0.24-0.28
Nivolumab 2.32E-10 5.85E+05 2.03E+04 1.36E-04 3.47E-05 0.02-0.14
KD는 친화성 상수이며; kon은 항원과 항체의 결합률이며; kdis는 항원과 항체의 해리율이다; KD = kdis/kon.
결과는 항체 VP101 및 BsAbB7이 PD-1-mFc에 대한 친화성 측면에서 동등하다는 것을 보여주며; PD-1-mFc에 대한 VP101의 친화성 상수는 BsAbB8 보다 상당히 작으며, 이는 VP101이 더 나은 결합 활성을 갖는 것을 나타내며; VP101 및 PD-1-mFc에 대한 해리 속도 상수는 BsAbB8 및 14C12H1L1 보다 유의하게 작았으며, 이는 VP101이 14C12H1L1 및 BsAbB8 보다 느린 해리속도로 항원에 더 안정적으로 결합하는 것을 나타낸다.
2. 인간화 항체 VP101과 VEGF-His의 결합에 대한 운동 매개 변수의 검출
샘플 희석 완충액은 PBS (0.02 % Tween-20, 0.1 % BSA, pH7.4)였다. 1 μg / mL VEGF-His를 HIS1K 센서에 20 초 동안 고정시키고, 그 다음 센서는 60초 동안 버퍼에서 평형을 이루고, 센서에 고정된 VEGF는 120 초 동안 12.34-1000 nM (3 배 구배 희석) 농도로 항체에 결합하고, 그 다음 항원과 항체를 300초 동안 완충액에서 해리하였다. 데이터는 친화성 상수를 얻기 위해 1: 1 모델 피팅으로 분석되었다. 데이터 수집 소프트웨어는 Fortebio Data Acquisition 7.0이고 데이터 분석 소프트웨어는 Fortebio Data Analysis 7.0이었다.
항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8 및 대조 항체 베바시주맙과 VEGF-His의 결합에 대한 운동 파라미터는 표 3에 나타내었으며, 동역학적 특성 파라미터의 검출 결과는 도 7, 8, 9 및 10에 각각 나타내었다.
항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8 및 대조 항체 베바시주맙과 VEGF-His의 결합에 대한 운동 파라미터
Sample ID KD (M) Kon (1/Ms) S E (kon) Kdis (1/s) S E (kdis) Rmax (nm)
VP101 5.21E-10 1.55E+05 9.67E+03 8.05E-05 4.66E-05 0.39-0.60
BsAbB7 5.14E-10 1.57E+05 9.67E+03 8.05E-05 4.83E-05 0.36-0.53
BsAbB8 6.33E-10 1.71E+05 1.07E+04 1.08E-04 4.64E-05 0.39-0.56
Bevacizumab 7.24E-10 1.23E+05 7.09E+03 8.90E-05 4.53E-05 0.29-0.41
결과는 항체 VP101과 BsAbB7이 항원에 대한 친 화성 측면에서 동등하고, VP101의 친 화성 상수가 BsAbB8 및 대조군 항체 베바시주맙보다 현저히 작다는 것을 보여주어 VP101이 더 나은 결합 활성을 가지고 있음을 나타낸다; VEGF-His에 대한 VP101의 해리 속도 상수는 BsAbB8의 해리 속도 상수보다 훨씬 작으며, 이는 VP101이 BsAbB8보다 더 느린 해리 속도로 항원에 더 안정적으로 결합 함을 나타낸다.
실시예 3. ELISA에 의한 항원에 대한 항체 VP101의 결합 활성 검출
1. 간접 ELISA에 의한 항원 VEGFA-his에 대한 항체 VP101의 결합 활성 검출
방법은 다음과 같이 특정된다:
마이크로 플레이트를 VEGFA-His로 코팅하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 세척 후 마이크로 플레이트를 1 % BSA로 2 시간 동안 차단 (block) 하였다. 세척 후, 마이크로 플레이트에 구배 희석된 항체를 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양하였다. 세척 후, 마이크로 플레이트에 효소 표지 된 염소 항-인간 IgG 2 차 항체 작업 용액을 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 세척 후, 마이크로플레이트에 TMB 발색 용액을 첨가하여 빛이 없는 상태에서 5 분간 발색 시킨 후 정지 용액을 첨가하여 발색 반응을 종결시켰다. 그런 다음 마이크로 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에 즉시 넣고 마이크로 플레이트에 있는 각 웰의 OD 값을 450nm에서 판독하였다. SoftMax Pro 6.2.1을 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다.
항원 VEGFA-His에 대한 항체 VP101의 결합 검출 결과를 도 11에 나타내었다. 각 투여량의 흡광도는 표 4에 나타내었다. 항체의 결합 EC50은 횡좌표로 항체 농도를, 세로 좌표로 흡광도 값을 사용하여 커브 피팅으로 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
VEGFA-his (간접 ELISA)에 대한 이기능성 항체의 결합
Antibody concentration (μg/mL) Coating: VEGFA-His (1 μg/mL)
VP101 Bevacizumab
1.0000 3.045 2.943 2.798 2.974
0.3333 3.037 2.861 2.816 2.993
0.1111 2.901 2.689 2.653 2.700
0.0370 2.597 2.460 2.445 2.555
0.0123 2.013 1.914 1.998 2.074
0.0041 1.115 1.086 1.446 1.363
0.0014 0.524 0.496 0.640 0.729
0.0000 0.099 0.091 0.094 0.083
Secondary antibody Goat anti-human IgG (H+L), HRP (1:5000)
EC50(nM) 0.036 0.035
결과는 항체 VP101은 단백질에 효율적으로 결합할 수 있으며 결합효율이 용량에 따라 다르다는 것을 보여주며, 두 항체는 인간 VEGFA에 대한 결합 활성 측면에서 동등하다.
2. 간접 ELISA에 의한 항원 VEGFA-His에 대한 항체 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 각각의 결합 활성의 검출
방법은 다음과 같이 특정된다:
마이크로 플레이트를 VEGFA-His로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후 마이크로 플레이트를 1 % BSA (PBS에 용해)로 2 시간 동안 차단하였다. 세척 후, 마이크로 플레이트에 구배 희석된 항체를 첨가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양하였다. 세척 후, 마이크로플레이트에 양 고추냉이 과산화 효소 표지 염소 항-인간 IgG Fc (horseradish peroxidase-labeled goat anti-human IgG Fc, Jackson, 109-035-098) 워킹 용액 (working solution)을 첨가하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 세척 후, 마이크로플레이트에 TMB (Neogen, 308177)를 첨가하여 빛이 없는 상태에서 5분간 발색 한 후 정지 용액을 첨가하여 발색 반응을 종결시켰다. 그런 다음 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 판독기에 즉시 넣고 마이크로플레이트에 있는 각 웰의 OD 값을 450 nm에서 판독하였다. SoftMax Pro 6.2.1을 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다.
항체 VP101과 항원 VEGFA-His의 결합 결과를 도 12에 나타내었다. 각 투여 량에서의 흡광도 강도는 표 5에 나타내었다. 항체의 결합 EC50은 횡좌표로 항체 농도를, 세로 좌표로 흡광도 값을 사용하여 커브 피팅에 의해 계산되었으며, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
VP101, BsAbB7, BsAbB8 및 베바시주맙의 VEGFA-His에 대한 각각의 결합 활성 (간접 ELISA)
Antibody concentration (μg/mL) Antibody coating: VEGFA-His 1 μg/mL
VP101 BsAbB7 BsAbB8 Bevacizumab
1.000 3.112 3.090 3.074 3.081 3.070 3.093 3.137 3.138
0.333 3.026 2.961 2.954 2.941 2.946 2.968 3.075 3.086
0.111 2.802 2.684 2.575 2.621 2.631 2.618 2.965 2.999
0.037 1.972 1.876 1.656 1.668 1.756 1.709 2.504 2.503
0.012 0.994 0.915 0.754 0.764 0.809 0.814 1.476 1.454
0.004 0.436 0.391 0.317 0.332 0.347 0.339 0.711 0.700
0.001 0.197 0.177 0.151 0.155 0.159 0.155 0.318 0.311
0 0.083 0.063 0.086 0.076 0.095 0.072 0.066 0.064
Secondary antibody Horseradish peroxidase-labeled goat anti-human IgG Fc, HRP (1:5000)
EC50(nM) 0.130 0.171 0.159 0.092
결과는 항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8 및 베바시주맙이 모두 VEGF 단백질에 효율적으로 결합할 수 있고 이들의 결합 효율은 용량 의존적이며 항체 VP101은 BsAbB7 및 BsAbB8보다 인간 VEGF에 대한 결합 활성이 더 높다는 것을 보여준다.
3. 간접 ELISA에 의한 항원 PD-1에 대한 항체 VP101의 결합 활성 검출
방법은 다음과 같이 특정된다:
마이크로 플레이트를 인간 PD-1-mFc로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 1 % BSA로 블로킹 한 후, 마이크로 플레이트에 항체를 넣고 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트를 세척하고 두드려 건조시킨 후 HRP 표지 된 염소 항-인간 IgG (H + L) 2 차 항체 (Jackson, 109-035-088)를 첨가하고, 마이크로 플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트를 세척하고 두드려 건조시킨 후 TMB (Neogen, 308177)를 첨가하여 5 분 동안 발색 한 후, 정지 용액을 첨가하여 발색을 종료하였다. 그런 다음 마이크로 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에 즉시 넣고 마이크로 플레이트에있는 각 웰의 OD 값을 450nm에서 판독하였다. SoftMax Pro 6.2.1을 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다.
항원 PD-1에 대한 항체 VP1-1의 결합 검출 결과를 도 13에 나타내었다. 각 투여량에서의 흡광도 강도는 표 6에 나타내었다. 결합된 항체 VP101의 정량 분석을 통해 곡선 시뮬레이션을 수행하여 항체의 결합 효율 EC50을 구하였으며, 이는 하기 표 6과 같다.
PD-1에 대한 이기능 항체의 결합 (간접 ELISA)
Antibody dilution gradient Antibody coating: PD-1-mFc 0.5 μg/mL
VP101 Nivolumab 14C12H1L1
0.333μg/ml 3.109 3.063 3.137 3.130 3.298 3.278
1:3 3.016 2.926 3.139 3.140 3.245 3.352
1:9 2.461 2.513 2.802 2.758 3.104 3.155
1:27 1.638 1.675 1.949 1.810 2.352 2.549
1:81 0.787 0.791 0.933 0.990 1.382 1.421
1:243 0.301 0.656 0.348 0.375 0.612 0.596
1:729 0.136 0.145 0.159 0.162 0.253 0.247
0 0.068 0.056 0.053 0.053 0.053 0.053
EC50(nM) 0.06 0.061 0.037
결과는 항체 VP101이 PD-1 단백질에 효율적으로 결합할 수 있고 결합 효율이 용량 의존적이라는 것을 보여준다.
4. 간접 ELISA에 의한 항원 PD-1에 대한 항체 VP101, BsAbB7의 각각의 결합 활성 검출
방법은 다음과 같이 특정된다:
마이크로 플레이트를 인간 PD-1-mFc로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 1 % BSA로 블로킹 한 후 마이크로 플레이트에 항체를 넣고 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트를 세척하고 두드려 건조시킨 후 양 고추 냉이 과산화 효소 표지 염소 항-인간 IgG Fc (Jackson, 109-035-098)를 첨가하고 마이크로 플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트를 세척하고 두드려 건조시킨 후 TMB (Neogen, 308177)를 첨가하여 5 분 동안 발색 한 후 정지 용액을 첨가하여 발색을 종료하였다. 그런 다음 마이크로 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에 즉시 넣고 마이크로 플레이트에있는 각 웰의 OD 값을 450nm에서 판독하였다. SoftMax Pro 6.2.1을 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다.
항원 PD-1에 대한 항체 VP101의 결합 검출 결과를 도 14에 나타내었다. 각 투여량에서의 흡광도 강도는 표 7에 나타내었다. 결합된 항체 VP101의 정량 분석을 통해 곡선 시뮬레이션을 수행하여 항체의 결합 효율 EC50을 얻었으며, 이는 하기 표 7과 같다.
PD-1에 대한 항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 및 니볼루맙의 각각의 결합 활성 (간접 ELISA)
Antibody concentration (μg/mL) Antigen coating: PD-1-mFc 0.5 μg/mL
VP101 BsAbB7 BsAbB8 14C12 H1L1 Nivolumab
0.333 2.717 2.709 2.732 2.755 2.716 2.715 2.947 2.966 2.823 2.824
0.111 2.507 2.381 2.318 2.321 2.377 2.409 2.923 2.967 2.747 2.758
0.037 1.709 1.616 1.491 1.457 1.522 1.549 2.656 2.694 2.208 2.293
0.012 0.916 0.822 0.732 0.711 0.797 0.775 2.049 2.060 1.348 1.389
0.004 0.413 0.394 0.333 0.321 0.368 0.351 1.139 1.132 0.629 0.638
0.001 0.195 0.191 0.167 0.174 0.181 0.174 0.552 0.541 0.295 0.295
0.000 0.140 0.123 0.110 0.103 0.117 0.118 0.254 0.248 0.152 0.157
0.000 0.099 0.095 0.089 0.074 0.100 0.081 0.083 0.075 0.078 0.084
Secondary antibody Horseradish peroxidase-labeled goat anti-human IgG Fc, HRP (1:5000)
EC50(nM) 0.146 0.199 0.173 0.045 0.095
결과는 항체 VP101이 PD-1 단백질에 효율적으로 결합할 수 있음을 보여주며 이의 결합 효율은 용량 의존적이며 항체 VP101은 BsAbB7 및 BsAbB8 보다 인간 PD-1에 대한 결합 활성이 높다.
5. 경쟁 ELISA에 의한 항원 VEGFA에 대한 결합에 대해 VEGFR2와 경쟁하는 항체 VP101의 활성 검출
방법은 구체적으로 다음과 같다:
마이크로 플레이트를 VEGF-His로 코팅하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 세척 후 마이크로 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 1 % BSA로 차단하였다. 세척 후, 마이크로 플레이트에 구배 희석된 항체와 인간 VEGFR2 ECD-mFc-bio (최종 농도: 0.02 μg/mL)를 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 세척 후 마이크로 플레이트에 HRP 표지 스트렙타비딘 SA-HRP (1: 4000) 워킹 (working) 용액을 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 세척 후, 마이크로 플레이트에 TMB 발색 용액을 첨가하여 빛이 없는 상태에서 5 분간 발색 시킨 후 정지 용액을 첨가하여 발색 반응을 종결시켰다. 그런 다음 마이크로 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에 즉시 넣고 마이크로 플레이트에 있는 각 웰의 OD 값을 450 nm에서 판독하였다. SoftMax Pro 6.2.1을 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다.
검출 결과를 도 15에 나타내었다. 각 투여량에서의 흡광도 강도를 표 8에 나타내었다. 결합된 항체의 흡광도 강도를 정량적으로 분석하여, 곡선 시뮬레이션을 수행하여 항체의 결합 효율 EC50을 제공하였다 (표 8).
경쟁 ELISA에 의한 항원 VEGFA-His에 대한 결합에 대해 VEGFR2-mFc와 경쟁하는 항체 검출
Coating: VEGF-His (2 μg/mL)
Antibody concentration (μg/mL) VP101 Bevacizumab
10.000 0.133 0.133 0.103 0.104
3.333 0.161 0.149 0.114 0.109
1.111 0.624 0.563 0.374 0.351
0.370 1.055 1.051 0.905 0.982
0.123 1.059 1.075 0.964 1.049
0.041 1.137 1.068 1.062 1.141
0.014 1.106 1.138 1.010 1.169
0.000 1.155 1.131 1.173 1.153
Receptor VEGFR2 ECD-mFc-bio, 0.02μg/ml
Secondary antibody SA-HRP（1:4000)
EC50 (nM) 5.324 5.086
결과는 항체 VP101은 항원 VEGFA에 효과적으로 결합할 수 있으며 VEGFR2와 VEGFA의 결합을 억제할 수 있으며, VEGFR2의 VEGFA에 대한 결합을 억제하는 효율성은 의존적임을 나타낸다.
6. 경쟁 ELISA에 의한 항원 PD-1에 대한 결합에 대해 PD-L1과 경쟁하는 항체 VP101의 검출
방법은 구체적으로 다음과 같다:
마이크로 플레이트를 PD-1-hFc로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 마이크로 플레이트를 1 % BSA로 2시간 동안 차단한 후, 상이한 농도의 항체를 각각 10 분 동안 PD-L1-hFc와 혼합하였다 (희석 농도는 표 10 참조). 37 ℃에서 30 분 동안 배양한 후, 마이크로 플레이트를 세척하고 두드려 건조시켰다. 그런 다음 효소 표지 된 2 차 항체를 추가하고 마이크로 플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트를 세척하고 두드려 건조시킨 후 TMB를 첨가하여 5 분 동안 발색시킨 다음 정지 용액을 첨가하여 발색을 종결시켰다. 그런 다음 마이크로 플레이트를 마이크로 플레이트 판독기에 즉시 넣고 마이크로 플레이트에 있는 각 웰의 OD 값을 450 nm에서 판독하였다 (표 10 참조). SoftMax Pro 6.2.1을 사용하여 데이터를 분석하고 처리하였다.
검출 결과는 도 16에 나타내었다. 각 투여량에서의 흡광도는 표 9에 나타내었다. 결합된 항체 VP101의 정량 분석에 의해 곡선 시뮬레이션을 수행하여 항체의 결합 효율 EC50을 제공하였다 (표 9).
경쟁 ELISA에 의해 PD-1에 결합하기 위해 PD-L1과 경쟁하는 이기능 항체의 검출
Antibody dilution gradient Antigen coating: PD-1-hFc 0.5 μg/mL
VP101 Nivolumab 14C12H1L1
5μg/ml 0.096 0.063 0.058 0.058 0.062 0.063
1:3 0.064 0.077 0.059 0.059 0.061 0.064
1:9 0.166 0.160 0.061 0.062 0.066 0.071
1:27 0.867 0.848 0.284 0.335 0.262 0.193
1:81 1.217 1.149 0.973 1.007 0.968 0.882
1:243 1.196 1.949 1.139 1.144 1.122 1.051
1:729 1.183 1.250 1.127 1.185 1.052 1.059
0 1.153 1.276 0.960 1.071 1.027 1.024
Receptor PD-L1-mFc 0.3μg/ml
Secondary antibody Goat anti-mouse IgG (H+L), HRP conjugated (1:5000)
EC50(nM) 1.216 0.842 0.745
결과는 항체 VP101이 항원 PD-1에 효과적으로 결합하고 리간드 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 억제할 수 있으며, PD-L1의 PD-1에 대한 결합 억제 효율은 용량 의존적이라는 것을 나타낸다.
실시예 4. 항체 VP101과 세포막 표면 항원의 결합
먼저 PD-1 항원을 발현하는 293T 세포를 구축한 후 세포막 표면 항원에 대한 항체의 특이적인 결합능을 유세포 분석법으로 분석 및 검증하였다.
1. PD-1 항원을 발현하는 293T 세포의 구축
PD-1의 벡터 pLenti6.3-PD-1 (벡터 pLenti6.3은 Invitrogen에서 구입함)을 293T 세포에 형질 감염시키고, 스크리닝을 통해 PD-1을 안정적으로 발현하는 클론 군 293T-PD-1 세포를 얻었다.
2. 세포 표면 항원에 대한 항체의 결합 탐지
이전 단계에서 얻은 293T-PD-1 발현 항원은 기존의 판 크레아틴 분해법에의해 판 크레아틴으로 분해하였으며, 각 수집 관의 세포 수는 2 Х 105개로 하였다. PBSA (1 % BSA)로 구배 희석된 농도의 항체 희석 용액을 각각 얼음에서 293T-PD-1 세포와 함께 2 시간 동안 배양하고, 그런 다음 각 튜브에 100 μL의 FITC 염소 항-인간 IgG (1: 500)를 첨가하고 얼음에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음 PBS를 세척에 사용하고 300 μL의 PBSA를 사용하여 세포를 재현 탁하고 형광 신호 (MFI)를 유세포 분석기에서 FITC 채널로 검출하였다.
결과는 도 17에 나타내었다. 각 농도에서의 MFI 값은 표 10에 나타내었다. 결합된 14C12H1L1 항체의 형광 정량 분석 및 곡선 맞춤에 의해 VP101 항체의 결합 EC50은 3.5 nM으로 계산되었다.
FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 표면 항원에 대한 VP101의 결합의 형광 강도 분석
Antibody (nM) 0.14 0.41 1.23 3.70 11.11 33.33 100 EC50
Bevacizumab 3.2 2.2 2.0 2.3 2.7 3.8 5.7 -
Nivolumab 33.3 74.9 171.9 357.9 481.9 498.3 478.4 2.1
14C12H1L1 48.1 99.7 201.5 409.0 600.2 655.4 670.8 2.9
VP101 30.8 61.8 135.7 286.9 487.7 534.0 528.6 3.5
결과는 VP101 항체가 293T-PD-1 숙주 세포 표면의 PD-1 항원에 효과적으로 결합할 수 있음을 보여주고, 이의 결합 효율은 용량 의존적이며, 그리고 베바시주맙은 293T-PD-1에 대한 결합 활성이 없으며, 이는 293T-PD-1에 대한 VP101의 결합이 특이적임을 나타낸다.
3. 항체 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 세포 표면 항원에 대한 결합은 본 실시 예의 2단계에서 설명된 실험 절차를 참조하여 검출하였다.
결과는 도 18에 나타내었으며, 각 농도에서의 MFI 값은 표 11에 나타내었다. 결합된 항체의 형광 정량 분석 및 곡선 맞춤에 의해, 니볼루맙, 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 결합 EC50 값은 각각 7.853 nM, 3.607 nM, 7.896 nM, 9.943 nM 및 10.610 nM 인 것으로 계산되었다.
FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 표면 항원에 대한 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 결합 형광 강도 분석
Antibody
(nM)		 0.014 0.14 0.41 1.23 3.7 11 30 100 EC50(nM)
Bevacizumab 1.89 1.90 2.20 1.92 2.04 2.48 2.80 2.43 -
Nivolumab 3.91 15.30 34.69 94.04 234.34 533.63 640.15 804.69 7.853
14C12H1L1 7.40 29.55 69.16 175.54 422.53 868.45 831.27 813.58 3.607
VP101 3.47 16.16 38.75 93.08 216.76 509.23 810.37 783.58 7.896
BsAbB7 3.85 14.86 37.45 83.78 202.40 465.10 837.61 846.80 9.943
BsAbB8 4.41 16.77 36.86 89.89 210.40 457.91 804.43 863.35 10.610
결과는 VP101 항체가 293T-PD1의 막 표면 PD-1에 용량 의존적으로 결합할 수 있음을 보여준다. 베바시주맙은 293T-PD-1에 대한 결합 활성이 없으며, 이는 VP101과 293T-PD-1의 결합이 특이적임을 나타낸다.
실시예 5. 항체 VP101의 세포막 표면 항원에 대한 경쟁적 결합
1. 세포막 표면 항원인 PD-1에 대한 결합을 위해 PD-L1과 경쟁하는 VP101의 EC50을 검출하기 위해 경쟁 유세포 분석법을 채택했으며, 그 방법은 다음과 같이 특정된다:
293T-PD-1 세포를 통상적인 방법으로 분해하여 각각 300,000 개의 세포로 여러 개의 샘플로 분할한 후 원심 분리 및 세척을 실시하였다. 그런 다음 각 튜브에 100 μL의 해당 구배 희석된 항체를 첨가하고 얼음에서 30 분 동안 배양하였다; 100 μL의 PD-L1-mFc를 각 튜브에 첨가하고 혼합물을 잘 혼합하여 최종 농도가 20 nM이되도록 한 다음 얼음에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음 500 μL의 1 % PBSA를 첨가하고, 혼합물을 5 분 동안 5600 rpm에서 원심 분리하여 상청액을 제거하였다. 1 : 500의 비율로 희석된 100 μL의 FITC 코트 항 마우스 항체를 각 튜브에 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합한 후 빛이 없는 상태에서 40 분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 그런 다음 혼합물을 원심 분리하고 세척하고 재현탁한 다음 테스트를 위해 로딩 튜브로 옮겼다.
결과는 도 19에 나타내었고, 각 농도에서의 MFI 값은 표 12에 나타내었다. 형광 정량 분석 및 곡선 맞춤에 의해 항체 VP101 및 14C12H1L1의 결합 EC50 값은 각각 8.33 nM 및 4.37 nM 인 것으로 계산되었다.
FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 표면 항원에 대한 결합 경쟁에서 14C12H1L1 및 VP101의 형광 강도 분석
Antibody (nM) 0.05 0.14 0.41 1.23 3.70 11.11 33.33 100.00 EC50 R2
14C12H1L1 288.17 287.29 277.09 237.22 177.80 12.04 10.32 9.87 4.37 0.988
VP101 272.66 264.39 279.11 272.26 239.18 99.29 17.05 14.91 8.33 0.999
결과는 VP101 항체가 293T-PD-1 숙주 세포 표면에서 PDL-1과 PD-1의 결합을 용량 의존적으로 효과적으로 차단할 수 있음을 보여준다.
2. 세포막 표면 항원인 PD-1에 대한 결합을 위해 PD-L1과 경쟁하는 VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 및 니볼루맙의 EC50 값은 경쟁 유동 세포 측정법을 사용하고이 실시 예의 1 단계에서 설명된 실험 절차를 참조하여 검출되었다.
결과는 도 20에 나타내었고, 각 농도에서의 MFI 값은 표 13에 나타내었다. 형광 정량 분석 및 곡선 맞춤에 의해 항체 VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 및 니볼루맙의 경쟁 결합 EC50 값은 각각 15.04 nM, 22.25 nM, 19.25 nM, 9.21 nM 및 9.72 nM 인 것으로 계산되었다.
FACS에 의해 검출된 293T-PD-1 표면 항원에 대한 결합 경쟁에서 VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 및 니볼루맙의 형광 강도 분석
Antibody (nM) 0.14 0.41 1.23 3.7 11.11 33.33 100 300 EC50 R2
VP101 1441.94 1380.62 1368.15 1288.34 982.69 112.90 8.49 8.21 15.04 0.9971
BsAbB7 1412.62 1377.27 1339.60 1341.27 1094.35 417.70 9.23 9.18 22.25 0.9985
BsAbB8 1578.36 1521.50 1427.20 1429.85 1137.74 359.69 9.73 9.68 19.25 0.9962
14C12H1L1 1384.08 1551.05 1462.85 1296.64 580.45 12.93 13.37 14.99 9.21 0.9950
Nivolumab 1539.58 1552.37 1483.84 1300.81 713.56 70.92 60.77 56.92 9.72 0.9969
결과는 항체 14C12H1L1의 활성이 PD-1을 표적으로 하는 시판 항체 니볼루맙의 활성과 동등하고, 이기능 항체 VP101의 활성보다 우수하다는 것을 보여준다. 항체 VP101의 활성은 BsAbB7 및 BsAbB8 보다 우수하다.
실시예 6. NFAT 신호 경로를 활성화 하기위한 VEGF 차단에서 항체 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 중화 생물 활성 검출
1. 293T-NFAT-(opv) KDR (C7) 세포의 구축
KDR (VEGFR2) vector pCDH-KDRFL(OPV)-GFP-Puro (Vector pCDH-GFP-Puro is purchased from Youbio) 및 NFAT 벡터 pNFAT-luc-hygro (벡터 pGL4-luc2P-hygro는 Promega에서 구입)를 293T 세포로 형질 감염 시켰으며, KDR을 안정적으로 발현하는 클론 군 293T-NFAT-(opv) KDR (C7) 세포 및 NFAT 루시퍼라제 리포터 유전자는 스크리닝을 통해 얻었다.
2. 293T-NFAT- (opv) KDR (C7) 세포를 수집하고 5 분 동안 원심 분리하여 상청액을 제거하였다; DMEM + 10 % FBS 배지를 사용하여 세포를 재현 탁하고, 세포 수를 세고 세포 생존율을 검출하였다; 그 다음 세포 농도를 적절한 범위로 조정하고 50000 세포/50 μL 세포 현탁액을 검은색 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다;
해당 항체 (최종 농도 300, 100, 10, 2, 0.2, 0.02, 0.002 nM) 및 VEGF (최종 농도 30ng / mL)를 실험 설계에 따라 희석하였으며 그리고 VEGF를 표적으로하는 항체는 세포에 첨가되기 전에 실온에서 1 시간 동안 VEGF와 함께 사전 배양하였다. 블랭크 및 아이소 타입 대조군 (각 웰의 최종 부피는 100μL 임)을 설계하고 이산화탄소 배양기에서 37 ℃, 5 % CO2에서 4 시간 동안 배양하였다; 50μL의 Luciferase Assay System을 각 웰에 첨가하고 RLU (Relative Fluorescence Unit)를 5 분 이내에 다중 라벨 마이크로 플레이트 테스터로 검출하였다.
실험 결과는 도 21에 나타내었고, 각 항체의 EC50 값은 표 14에 나타내었다.
리포터 분석에 의한 NFAT 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 VEGF 차단에서 항체 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8의 중화 생물 활성 검출
Sample VP101 BsAbB7 BsAbB8 Bevacizumab
EC50(nM) 1.2400 1.2170 1.7280 0.7730
결과는 VP101의 EC50이 1.240 nM이며, BsAbB7의 EC50은 1.217 nM, BsAbB8의 EC50은 1.728 nM, 베바 시주 맙의 EC50은 0.773 nM이고, 실험 결과는 VEGF를 차단하여 NFAT 신호 전달 경로를 활성화시키는 VP101 및 BsAbB7의 활성이 BsAbB8보다 우수하다는 것을 보여준다.
실시예 7. VEGFA로 유도된 HUVEC 세포 증식을 억제하는 VP101 항체 실험
성장 상태가 좋은 HUVEC 세포 (Allcell에서 구입)를 세포 농도를 1.5x104/ mL로 조정한 후 200μL/well로 96 웰 플레이트에 접종하고, 그 다음 37 ℃, 5 % CO2에서 24 시간 동안 배양기에서 배양하였다. 그 다음 세포가 잘 부착되어 있음을 확인한 후 배양액을 버렸다. 2 % FBS를 포함하는 1640을 사용하여 제조된 20 nM VEGFA를 200 μL/well로 96-well plate에 첨가하고, 다른 농도의 항체를 첨가한 후 72 시간 동안 배양하였다. 72 시간 후 배양 배지를 버리고 MTT를 첨가하였다. 4 시간 후 MTT를 버리고 DMSO를 추가한 다음 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 OD 값을 측정하였다.
결과는 도 5에 나타내었다. 결과는 인간화 항체 VP101과 베바시주맙이 둘 다 VEGFA에 의해 유도된 HUVEC 세포 증식을 용량 의존적으로 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주며, VEGFA로 유도된 HUVEC 세포 증식을 억제하는 VP101의 약리학 적 활성은 동일한 용량에서 베바시주맙보다 더 높다.
실시예 8. 혼합 림프구 반응에서 사이토 카인 IFN-γ 및 IL-2 분비 촉진
1. DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 VP101, 14C12H1L1 및 니볼루맙에 의한 IFN-γ 분비 촉진
PBMC는 Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)에 의해 분리되었고 IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/mL) 및 GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/mL)에 6 일 동안 유도되었고, 이어서 TNF-α (Peprotech 300-01A, 200 U/mL)를 추가로 3일 동안 유도하여 성숙한 DC세포를 얻었다.
공동 배양 당일, 다른 기증자의 말초 혈액에서 신선한 PBMC를 분리하고, 그리고 수득 된 성숙 DC 세포를 1: 10의 비율로 다른 공여자의 새로 분리된 PBMC와 혼합하고, 한편, 다른 농도의 항체 (대조군으로서 hIgG)를 첨가하였다. 5 내지 6 일 동안 공동 배양한 후, 세포 상청액을 수집하고 ELISA 키트 (Dakewe에서 구입)를 사용하여 IFN-γ 함량에 대해 분석하였다.
DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 IFN-γ의 분비에 대한 VP101의 효과는 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, VP101은 용량 의존적으로 IFN-γ의 분비를 효과적으로 촉진할 수 있다. 또한, 30 nM 및 300 nM의 용량에서 VP101은 동등한 14C12H1L1보다 IFN-γ의 분비를 촉진하는 데 더 큰 활성을 가지고 있으며, 30 nM의 용량 수준에서는, 동등한 니볼루맙보다 IFN-γ의 분비를 촉진하는 데 더 큰 활성을 갖는다.
2. DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8b에 의한 IL-2 및 IFN-γ의 분비 촉진
본 실시예의 1단계는 실험 방법으로 참조 되었으며, 즉, PBMC는 Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)에 의해 분리되었고 IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/mL) 및 GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/mL)에 6 일 동안 유도되었고, 그 다음 TNF-α (Peprotech 300-01A, 200 U/mL)를 추가로 3 일 동안 유도하여 성숙한 DC 세포를 획득하였다.
공동 배양 당일, 다른 기증자의 말초 혈액에서 신선한 PBMC를 분리하고, 수득 된 성숙 DC 세포를 1:10의 비율로 다른 공여자의 새로 분리된 PBMC와 혼합하고,한편, 상이한 농도의 항체 (대조군으로서 hIgG)를 첨가하였다; 5 내지 6 일 동안 공동 배양한 후, 세포 상청액을 수집하고 ELISA 키트 (Dakewe에서 구입)를 사용하여 IL-2 및 IFN-γ 함량에 대하여 분석하였다.
DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 IFN-γ의 분비에 대한 VP101의 효과를 도 24에 나타내었다. 도 24에 나타낸 바와 같이, VP101은 용량 의존적인 방식으로 IFN-γ의 분비를 효과적으로 촉진할 수 있다. IFN-γ의 분비를 촉진하는 VP101의 약리학적 활성은 BsAbB7 및 BsAbB8의 약리학적 활성보다 훨씬 우수하다.
DC 및 PBMC 세포의 혼합 배양 시스템에서 IL-2의 분비에 대한 VP101의 효과는 도 25에 나타내었다. 도 25에 나타낸 바와 같이, VP101은 용량 의존적으로 IL-2의 분비를 효과적으로 촉진할 수 있으며, IL-2의 분비를 촉진하는 VP101의 약리학 적 활성은 BsAbB7 및 BsAbB8보다 우수하다.
3. PBMC 및 Raji-PD-L1 세포의 혼합 배양 시스템에서 VP101, 14C12H1L1 및 니볼루맙에 의한 IL-2 및 IFN-γ의 분비 촉진
PD-L1은 렌티 바이러스 (lentivirus) 감염을 통해 Raji 세포에 안정적으로 형질 감염되었으며, 투여 및 스크리닝 후 PD-L1을 안정적으로 발현하는 Raji-PD-L1 세포를 얻었다; SEB에 의한 2 일의 자극 후, PBMC를 미토마이신 (mitomycin) C 처리된 Raji-PD-L1과 함께 배양하였다.
결과는 도 26 및 27에 나타내었다. 결과는 VP101이 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 효과적으로 촉진할 수 있음을 보여주며, 300 nM의 용량 수준에서 IL-2의 분비를 촉진하는 VP101의 활성은 동등한 14C12H1L1 및 니볼루맙의 활성보다 현저히 우수하다.
연구하고자 하는 이소 형 (isotype) 대조군 항체는 Human Anti-Hen Lysozyme (anti-HEL, 즉, hIgG로 약칭하는 인간 IgG)이고, 상기 제조예 6에 나타낸 바와 같이 제조하였다.
4. PBMC 및 Raji-PD-L1 세포의 혼합 배양 시스템에서 VP101, BsAbB7 및 BsAbB8에 의한 IL-2 및 IFN-γ의 분비 촉진은 본 실시예의 3 단계에서 설명된 실험 방법을 참조하여 연구되었다.
IFN-γ 분비 결과는 도 28에 나타내었다. 결과는 VP101이 용량 의존적 방식으로 IFN- γ의 분비를 효과적으로 촉진할 수 있음을 보여준다. 동시에, VP101은 동일한 용량에서 BsAbB7보다 현저히 우수하며, VP101의 약리학 적 활성은 3nM 및 30nM의 용량 수준에서 BsAbB8보다 현저히 우수하다.
IL-2 분비 결과를 도 29에 나타내었다. 그 결과 VP101이 용량 의존적으로 IL-2 분비를 효과적으로 촉진할 수 있음을 나타낸다. 동시에 VP101의 약리 활성은 3 nM 및 300 nM의 용량에서 BsAbB7의 약리 활성보다 현저히 우수하며, VP101은 동일한 용량에서 BsAbB8과 동일하다.
실시예 9. VP101에 의한 생체 내 종양 성장 억제 실험
VP101의 생체 내 종양 억제 활성을 검출하기 위해 U87MG 세포 (ATCC에서 구입 한 인간 신경 교종 세포)를 먼저 5 내지 7 주령 암컷 Scid Beige 마우스 (Vital River에서 구입)에 피하로 접종하였고, 모델링 및 특정 투여 방식은 표 15에 나타내었다. 투여 후 각 종양 군의 길이와 폭을 측정하고 종양 부피를 계산하였다.
U87MG 종양 이종이식 (xenograft) Scid Beige 마우스 모델을 VP101로 치료하는 투여 요법
Grouping n Tumor xenograft Condition of administration
Isotype control
40 mg/kg		 7 U-87MG, 5 million cells/mouse
subcutaneously		 Isotype control antibody, hIgG,
40 mg/kg, injected intravenously on days 0, 7 and 13
Bevacizumab 30mg/kg 8 Bevacizumab 30 mg/kg,
injected intravenously on days 0, 7 and 13
VP101
40mg/kg		 7 VP101 40 mg/kg,
injected intravenously on days 0, 7 and 13
VP101
4mg/kg		 7 VP101 4 mg/kg,
injected intravenously on days 0, 7 and 13
결과를 도 30에 나타내었다. 그 결과는 이소형 대조군 항체 hIgG (제조 예 6과 제조 방법이 동일)와 비교하여, 베바 시주 맙과 VP101은 서로 다른 용량으로 마우스 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며, 고용량 VP101은 종양 억제에 있어 저용량 VP101보다 우수하다.
또한, 도 31에 나타낸 바와 같이, VP101은 종양 보유 마우스의 체중에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 내용은 개시된 실시예의 완전하고 명확한 설명을 제공하였지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자에게는 이러한 설명의 안내에 따라 본 발명에 대한 수정 및 대체가 가능하며, 이러한 수정 및 대체는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 특허 청구 범위 및 그와 동등한 것에 의해 제공된다.
<110> AKESO BIOPHARMA, INC <120> ANTI-PD-1/VEGFA BIFUNCTIONAL ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF AND USE THEREOF <130> PI210009CN <150> CN 201811002548.4 <151> 2018-08-30 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of VEGFA-His <400> 1 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe 115 120 125 Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser 130 135 140 Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys 145 150 155 160 Asp Lys Pro Arg Arg His His His His His His 165 170 <210> 2 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of VEGFA-His <400> 2 gcacccatgg ccgagggcgg cggccagaac caccacgagg tggtgaagtt catggacgtg 60 taccagagaa gctactgcca ccccatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtacccc 120 gacgagatcg agtacatctt caagcccagc tgcgtgcccc tgatgagatg cggcggctgc 180 tgcaacgacg agggcctgga gtgcgtgccc accgaggaga gcaacatcac catgcagatc 240 atgagaatca agccccacca gggccagcac atcggcgaga tgagcttcct gcagcacaac 300 aagtgcgagt gcagacccaa gaaggacaga gccagacagg agaacccctg cggcccctgc 360 agcgagagaa gaaagcacct gttcgtgcag gacccccaga cctgcaagtg cagctgcaag 420 aacaccgaca gcagatgcaa ggccagacag ctggagctga acgagagaac ctgcagatgc 480 gacaagccca gaagacatca tcaccatcac cac 513 <210> 3 <211> 998 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of Fusion protein VEGFR2- hFc <400> 3 Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro 20 25 30 Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60 Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser 65 70 75 80 Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn 85 90 95 Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser 100 105 110 Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser 115 120 125 Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140 Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser 145 150 155 160 Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg 165 170 175 Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile 180 185 190 Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser 195 200 205 Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr 210 215 220 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 225 230 235 240 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 245 250 255 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 260 265 270 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 290 295 300 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met 325 330 335 Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala 340 345 350 Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 365 Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr 370 375 380 Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu 385 390 395 400 Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val 405 410 415 Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val 420 425 430 Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr 435 440 445 Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu 450 455 460 Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr 465 470 475 480 Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys 485 490 495 Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys 500 505 510 Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr 515 520 525 Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser 530 535 540 Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln 545 550 555 560 Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser 565 570 575 Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro 580 585 590 Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr 595 600 605 Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile 610 615 620 Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr 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cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 180 tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240 gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300 tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360 tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420 aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480 ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540 agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600 gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 660 tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 720 aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 780 gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 840 tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 900 gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca 960 tttgtcaggg tccatgaaaa accttttgtt gcttttggaa gtggcatgga atctctggtg 1020 gaagccacgg tgggggagcg tgtcagaatc cctgcgaagt accttggtta cccaccccca 1080 gaaataaaat ggtataaaaa tggaataccc cttgagtcca atcacacaat taaagcgggg 1140 catgtactga cgattatgga agtgagtgaa agagacacag gaaattacac tgtcatcctt 1200 accaatccca tttcaaagga gaagcagagc catgtggtct ctctggttgt gtatgtccca 1260 ccccagattg gtgagaaatc tctaatctct cctgtggatt cctaccagta cggcaccact 1320 caaacgctga catgtacggt ctatgccatt cctcccccgc atcacatcca ctggtattgg 1380 cagttggagg aagagtgcgc caacgagccc agccaagctg tctcagtgac aaacccatac 1440 ccttgtgaag aatggagaag tgtggaggac ttccagggag gaaataaaat tgaagttaat 1500 aaaaatcaat ttgctctaat tgaaggaaaa aacaaaactg taagtaccct tgttatccaa 1560 gcggcaaatg tgtcagcttt gtacaaatgt gaagcggtca acaaagtcgg gagaggagag 1620 agggtgatct ccttccacgt gaccaggggt cctgaaatta ctttgcaacc tgacatgcag 1680 cccactgagc aggagagcgt gtctttgtgg tgcactgcag acagatctac gtttgagaac 1740 ctcacatggt acaagcttgg cccacagcct ctgccaatcc atgtgggaga gttgcccaca 1800 cctgtttgca agaacttgga tactctttgg aaattgaatg ccaccatgtt ctctaatagc 1860 acaaatgaca ttttgatcat ggagcttaag aatgcatcct tgcaggacca aggagactat 1920 gtctgccttg ctcaagacag gaagaccaag aaaagacatt gcgtggtcag gcagctcaca 1980 gtcctagagc gtgtggcacc cacgatcaca ggaaacctgg agaatcagac gacaagtatt 2040 ggggaaagca tcgaagtctc atgcacggca tctgggaatc cccctccaca gatcatgtgg 2100 tttaaagata atgagaccct tgtagaagac tcaggcattg tattgaagga tgggaaccgg 2160 aacctcacta tccgcagagt gaggaaggag gacgaaggcc tctacacctg ccaggcatgc 2220 agtgttcttg gctgtgcaaa agtggaggca tttttcataa tagaaggtgc ccaggaaaag 2280 acgaacttgg aatctagaga aaacctgtat tttcagggca ctcacacatg cccaccgtgc 2340 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2400 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2460 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2520 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2580 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2640 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2700 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2760 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2820 aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2880 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2940 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctcccgg gaaatga 2997 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of Bevacizumab heavy chain variable region <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Bevacizumab heavy chain variable region <400> 6 gaggtgcagc tggtcgagtc cggggggggg ctggtgcagc caggcgggtc tctgaggctg 60 agttgcgccg cttcagggta caccttcaca aactatggaa tgaattgggt gcgccaggca 120 ccaggaaagg gactggagtg ggtcggctgg atcaacactt acaccgggga acctacctat 180 gcagccgact ttaagcggcg gttcaccttc agcctggata caagcaaatc cactgcctac 240 ctgcagatga acagcctgcg agctgaggac accgcagtct actattgtgc taaatatccc 300 cactactatg ggagcagcca ttggtatttt gacgtgtggg ggcaggggac tctggtgaca 360 gtgagcagc 369 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of Bevacizumab light chain variable region <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Bevacizumab light chain variable region <400> 8 gatattcaga tgactcagag cccctcctcc ctgtccgcct ctgtgggcga cagggtcacc 60 atcacatgca gtgcttcaca ggatatttcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ccaaggtgct gatctacttc actagctccc tgcactcagg agtgccaagc 180 cggttcagcg gatccggatc tggaaccgac tttactctga ccatttctag tctgcagcct 240 gaggatttcg ctacatacta ttgccagcag tattctaccg tgccatggac atttggccag 300 gggactaaag tcgagatcaa g 321 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of humanized antibody 14C12H1L1 heavy chain variable region <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of humanized antibody 14C12H1L1 heavy chain variable region <400> 10 gaagtgcagc tggtcgagtc tgggggaggg ctggtgcagc ccggcgggtc actgcgactg 60 agctgcgcag cttccggatt cgcctttagc tcctacgaca tgtcctgggt gcgacaggca 120 ccaggaaagg gactggattg ggtcgctact atctcaggag gcgggagata cacctactat 180 cctgacagcg tcaagggccg gttcacaatc tctagagata acagtaagaa caatctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgcactgt actattgtgc caaccgctac 300 ggggaagcat ggtttgccta ttgggggcag ggaaccctgg tgacagtctc tagt 354 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of humanized antibody 14C12H1L1 light chain variable region <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of humanized antibody 14C12H1L1 light chain variable region <400> 12 gacattcaga tgactcagag cccctcctcc atgtccgcct ctgtgggcga cagggtcacc 60 ttcacatgcc gcgctagtca ggatatcaac acctacctga gctggtttca gcagaagcca 120 gggaaaagcc ccaagacact gatctaccgg gctaatagac tggtgtctgg agtcccaagt 180 cggttcagtg gctcagggag cggacaggac tacactctga ccatcagctc cctgcagcct 240 gaggacatgg caacctacta ttgcctgcag tatgatgagt tcccactgac ctttggcgcc 300 gggacaaaac tggagctgaa g 321 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence of Linker 1 <400> 13 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker fragment <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of Antibody Bevacizumab <400> 15 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of Antibody Bevacizumab <400> 16 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of Antibody Bevacizumab <400> 17 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of Antibody Bevacizumab <400> 18 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 19 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of Antibody Bevacizumab <400> 19 Phe Thr Ser 1 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of Antibody Bevacizumab <400> 20 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of Antibody 14C12H1L1 <400> 21 Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of Antibody 14C12H1L1 <400> 22 Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr 1 5 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of Antibody 14C12H1L1 <400> 23 Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of Antibody 14C12H1L1 <400> 24 Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 1 5 <210> 25 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of Antibody 14C12H1L1 <400> 25 Arg Ala Asn 1 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of Antibody 14C12H1L1 <400> 26 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5

Claims (26)

  1. 다음을 포함하는 이중 특이적 (bispecific) 항체:
    VEGFA (Vascular Endothelial Growth Factor A)를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 (functional region), 및 PD-1 (Programmed cell Death receptor-1)을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역;
    상기:
    제1 단백질 기능 영역은 항-VEGFA 또는 이의 항원 결합 단편이며, 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region), 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-VEGFA 항체의 경쇄 가변 영역 (light chain variable region)이며; 및
    제2 단백질 기능 영역은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-VEGFA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편 (complementarity determining region fragment), 단일 사슬 항체 (single chain antibody), 인간화 항체 (humanized antibody), 키메라 항체 (chimeric antibody) 및 디아바디 (diabody)에서 선택되며;
    및/또는,
    항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역 단편, 단일 사슬 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디에서 선택되는 것인, 이중 특이적 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 단백질 기능 영역은 면역글로불린 (immunoglobulin), 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 면역글로불린의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 면역글로불린의 경쇄 가변 영역이며; 및 제2 단백질 기능 영역은 단일 사슬 항체, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 영역이며;
    또는,
    제1 단백질 기능 영역은 단일 사슬 항체, 각각 서열번호 21 내지 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 단일 항체의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 24 내지 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LDCR3을 포함하는 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역이며; 및 제2 단백질 기능 영역은 면역글로불린, 각각 서열번호 15 내지 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하는 면역글로불린의 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 18 내지 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역인 것인, 이중 특이적 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시되며, 및 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7에 제시되며; 및 단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되며, 및 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시되며;
    또는,
    단일 사슬 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되며, 및 단일 사슬 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시되며; 및 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시되며, 및 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7에 제시되는 것인, 이중 특이적 항체.
  5. 제3항 또는 4항에 있어서, 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM인 것인; 바람직하게는, 면역글로불린은 IgG인 것인, 이중 특이적 항체.
  6. 제3항 또는 4항에 있어서, 상기 두 단일 사슬 항체가 존재하고, 및 각각 단일 사슬 항체의 1개의 말단은 면역글로불린의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단 또는 N-말단에 연결된 것인, 이중 특이적 항체.
  7. 제3항 또는 4항에 있어서, 상기 면역글로불린은 인간 항체와 같은 뮤린 (murine) 이외의 종으로부터 유래된 비-CDR 영역을 포함하는 것인, 이중 특이적 항체.
  8. 제3항 또는 4항에 있어서, 상기 면역글로불린은 인간 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함하며; 바람직하게는, 면역글로불린의 불면 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 불변 영역에서 선택된 것인, 이중 특이적 항체.
  9. 제3항 또는 4항에 있어서, 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 인간 Ig 감마-1 사슬 C 영역 또는 인간 Ig 감마-4 사슬 C 영역이며, 이의 경쇄 불변 영역은 인간 Ig 카파 사슬 C 영역인 것인, 이중 특이적 항체.
  10. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단백질 기능 영역은 직접 또는 링커 단편을 통해 연결되며;
    바람직하게는, 링커 단편은 (GGGGS)m이고, 상기 m은 1,2,3,4,5 또는 6과 같은 양의 정수인 것인, 이중 특이적 항체.
  11. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단백질 기능 영역의 숫자는 각각 독립적으로 1, 2 또는 그 이상인 것인, 이중 특이적 항체.
  12. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 이중 특이적 항체는 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 0.15 nM 미만 또는 0.14 nM 미만의 EC50으로 VEGFA 단백질에 결합하고; 바람직하게는, EC50이 간접 ELISA에 의해 검출되며;
    및/또는,
    이중 특이적 항체가 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.2 nM 미만, 0.17 nM 미만, 0.16 nM 미만 또는 0.15 nM 미만의 EC50으로 PD-1 단백질에 결합하며; 바람직하게는, EC50이 간접 ELISA에 의해 검출된 것인, 이중 특이적 항체.
  13. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체를 코딩하는, 분리된 핵산 분자 (isolated nucleic acid molecule).
  14. 제13항에 있어서, 상기 분리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터 (vector).
  15. 제13항에 있어서 분리된 핵산 분자 또는 제14항에 있어서 벡터를 포함하는, 숙주세포 (host cell).
  16. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 이중 특이적 항체를 제조하는 방법:
    제15항에 있어서 숙주세포를 적합한 조건에서 배양하고, 세포 배양물로부터 이중 특이적 항체를 분리하는 단계.
  17. 이중 특이적 항체 및 접합된 모이어티 (conjugated moiety)를 포함하는 접합체 (conjugate)에 있어서,
    상기 이중 특이적 항체는 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체이며, 및 접합된 모이어티는 검출 가능한 표지이며; 바람직하게는, 접합된 모이어티는 방사성 동위 원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소인 것인, 접합체.
  18. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체를 포함하는 키트;
    바람직하게는, 상기 키트는 이중 특이적 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체를 추가로 포함하고;
    선택적으로는, 제2 항체는 방사성 동위 원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소와 같은 검출 가능한 표지를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  19. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 샘플에서 VEGFA 및/또는 PD-1의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 키트를 제조하는 이중 특이적 항체의 용도.
  20. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체의 악성 종양을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 용도에 있어서, 바람직하게는 상기 악성 종양은 결장암 (colon cancer), 직장암 (rectal cancer), 비소 (non-small) 세포 폐암과 같은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 신경 아교종 (glioma), 흑색종 (melanoma), 신장 종양 (renal tumor), 전립선 암 (prostate cancer), 방광암 (bladder cancer), 위장암 (gastrointestinal cancer), 유방암 (breast cancer), 뇌암 (brain cancer) 및 백혈병 (leukemia)으로부터 선택되는 것인, 용도.
  22. 제1 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체를 제조하기 위한 용도:
    (1)
    샘플에서 VEGFA의 수준을 검출하기 위한 약제 (medicament) 또는 제제 (agent),
    VEGFA와 VEGFR2의 결합을 차단하는 약제 또는 제제,
    VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절하기 위한 약제 또는 제제,
    혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화하기 위한 약제 또는 제제,
    혈관 내피 세포 증식을 억제하기 위한 약제 또는 제제, 또는
    종양 혈관 신생을 차단하는 약제 또는 제제;
    및/또는
    (2)
    PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하기위한 약제 또는 제제,
    PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절하기위한 약제 또는 제제,
    유기체에서 PD-1의 면역 억제를 완화하기 윈한 약제 또는 제제,
    T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진하기위한 약제 또는 제제,
    또는
    T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진하기위한 약제 또는 제제.
  23. 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro) 방법으로서, 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하며, 상기 방법은 다음과 같이 선택된다:
    (1)
    샘플에서 VEGFA 수준을 검출하는 방법,
    VEGFA와 VEGFR2의 결합을 차단하는 방법,
    VEGFA의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법,
    혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극을 완화하는 방법,
    혈관 내피 세포 증식 억제 방법, 또는
    종양 혈관 신생을 차단하는 방법;
    및/또는
    (2)
    PD-1과 PD-L1의 결합을 차단하는 방법,
    PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절하는 방법,
    유기체에서 PD-1의 면역 억제 (immunosuppression)를 완화하는 방법,
    T 림프구에서 IFN-γ 분비를 촉진하는 방법, 또는
    T 림프구에서 IL-2 분비를 촉진하는 방법.
  24. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체의 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 종양의 예방 및/또는 치료 방법에 있어서, 바람직하게는 상기 악성 종양은 결장암, 직장암, 비소 세포 폐암과 같은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 신경 아교종, 흑색종, 신장 종양, 전립선 암, 방광암, 위장암, 유방암, 뇌암 및 백혈병으로부터 선택되는 것인, 방법.
  25. 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체를 악성 종양의 예방 및/또는 치료 용도에 있어서, 바람직하게는 상기 악성 종양은 결장암, 직장암, 비소 세포 폐암과 같은 폐암, 간암, 난소암, 피부암, 신경 아교종, 흑색종, 신장 종양, 전립선 암, 방광암, 위장암, 유방암, 뇌암 및 백혈병으로부터 선택되는 것인, 용도.
  26. 다음을 사용하기 위한 제1 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서 이중 특이적 항체 또는 제17항에 있어서 접합체:
    (1)
    샘플에서 VEGFA 수준 감지,
    VEGFA와 VEGFR2의 결합 차단,
    VEGFA의 활성 또는 수준을 하향-조절,
    혈관 내피 세포 증식에 대한 VEGFA의 자극 완화,
    혈관 내피 세포 증식 억제, 또는
    종양 혈관 신생 차단;
    및/또는
    (2)
    PD-1의 PD-L1에 대한 결합 차단,
    PD-1의 활성 또는 수준을 하향 조절,
    유기체에서 PD-1의 면역 억제 완화,
    T 림프구에서 IFN-γ 분비 촉진, 또는
    T 림프구에서 IL-2 분비 촉진.
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