JP2024023186A - 抗ｐｄ－１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】腫瘍治療および分子免疫学の分野に関し、詳しくは、抗ＶＥＧＦＡ／抗ＰＤ－１二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用を提供する。【解決手段】抗ＶＥＧＦＡ／抗ＰＤ－１二官能性抗体は、ＶＥＧＦＡを標的とする第１のタンパク質機能領域と、ＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能領域を含む。本発明の二官能性抗体は、ＶＥＧＦＡおよびＰＤ－１に特異的に結合し、生体におけるＶＥＧＦＡおよびＰＤ－１の免疫抑制を特異的に軽減し、腫瘍誘導性血管新生を抑制することができ、それによって良好な適用の可能性を有する。【選択図】図２３

Description

本発明は、腫瘍治療および免疫生物学の分野に関し、詳しくは抗ＰＤ－１／抗ＶＥＧＦＡ二官能性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、その医薬組成物およびその使用に関する。詳しくは、本発明は、抗ヒトＰＤ－１／抗ヒトＶＥＧＦＡ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。

背景
腫瘍、特に悪性腫瘍は、今日の世の中では健康を脅かす重篤な疾患であり、各種疾患の中で死亡の第２の主要原因である。近年、その発病率は著しく増加している。悪性腫瘍は、治療反応性が悪く、後期の転移率が高く、予後が不良であることが特徴である。現在臨床的に採用されている従来の治療方法（例えば、放射線療法、化学療法および外科治療など）は、疼痛を大幅に緩和し、生存時間を延ばすが、それらの方法には大きな制限があり、さらにそれらの効果を向上させるのは困難である。

腫瘍増殖の２つの異なる段階、すなわち、血管が関与しない緩慢な成長段階から血管が関与する急速な増殖段階がある。血管新生によって、血管切り替え段階を完了するのに十分な栄養を腫瘍は獲得することができ、血管新生が生じない場合、原発腫瘍は１～２ｍｍ未満になり、したがって、転移は起こり得ない。

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞の分裂および増殖を促進し、新しい血管の形成を促進し、血管透過性を改良することができる増殖因子であり、またこれは、細胞表面上の血管内皮細胞増殖因子受容体に結合し、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化によって役割を果たす。腫瘍組織において、腫瘍細胞、ならびに腫瘍へ侵入するマクロファージおよびマスト細胞は高レベルのＶＥＧＦを分泌し、パラクリン様式で腫瘍血管内皮細胞を刺激し、内皮細胞の増殖および移動を促進し、血管新生を誘導し、腫瘍の連続的な増殖を促進し、血管透過性を強化し、周囲組織内の線維素沈着を引き起こし、単核細胞、繊維芽細胞および内皮細胞の浸潤を促進し、これは腫瘍ストロマの形成と腫瘍細胞の新たな血管への侵入を容易にし、また腫瘍転移を促進することができる。したがって、腫瘍血管新生を抑制することが、現在最も有望な腫瘍治療方法の１つであると考えられる。ＶＥＧＦファミリーには、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤおよびＰＩＧＦが含まれる。血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）には、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲまたはＦｌｋ１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４としても知られている）、およびニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）が含まれる。最初の３つの受容体は構造において類似しており、チロシンキナーゼスーパーファミリーに属し、膜外領域、膜貫通セグメントおよび膜内領域から構成されており、膜外領域は免疫グロブリン様ドメインから構成され、膜内領域はチロシンキナーゼ領域である。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、主として血管内皮細胞の表面に位置しており、ＶＥＧＦＲ３は、主としてリンパ内皮細胞の表面に位置している。

ＶＥＧＦファミリーの分子は、これらの受容体に対して異なる親和性を有する。ＶＥＧＦＡは、主に、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＮＲＰ－１と共に作用する。ＶＥＧＦＲ１は、最も初期に発見された受容体であり、通常の生理学的条件下でＶＥＧＦＲ２よりもｐＶＥＧＦＡに対して高い親和性を有しているが、細胞内セグメント内のチロシナーゼ活性はＶＥＧＦＲ２より低い（Ｍａ Ｌｉ、Ｊ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｒｔｈ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、２４巻（５号）：１４６～１４８頁（２０１６））。

ＶＥＧＦＲ２は血管新生および血管工学の主要な制御因子であり、ＶＥＧＦＲ１よりもはるかに高いチロシンキナーゼ活性を有する。ＶＥＧＦＲ２は、リガンドＶＥＧＦＡに結合した後、血管内皮細胞の増殖、分化など、ならびに血管の形成プロセスおよび血管の浸透性を媒介する（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ Ｒ Ｊｒ．ら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ、６２巻（３号）：１７９～２１３頁（２００７））。ＶＥＧＦＡは、ＶＥＧＦＲ２に結合した後、下流のＰＬＣ－γ－ＰＫＣ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＭＡＰＫシグナル経路を介して細胞内の関連タンパク質遺伝子の転写発現を媒介し、それにより血管内皮細胞の増殖を促進する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８巻（１３号）：２２２１～２２３０頁（１９９９））。

ＶＥＧＦＲ３はチロシンキナーゼファミリーメンバーのうちの１つであり、主に胚血管内皮細胞および成体リンパ内皮細胞を発現し、またＶＥＧＦＣおよびＶＥＧＦＤはＶＥＧＦＲ３に結合してリンパ内皮細胞の増殖および移動を刺激し、リンパ管の新生を促進する；ＮＲＰ－１は非チロシンキナーゼ膜貫通型タンパク質であり、生体シグナルを独立して伝達することはできず、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体と複合体を形成した後でのみ、シグナル伝達を媒介することができる（Ｍａ Ｌｉ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｒｔｈ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、２４巻（５号）：１４６～１４８頁（２０１６））。

ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＲ２は、主に、ＶＥＧＦＡがＶＥＧＦＲ２に結合する前後の血管新生の調節に関与しており、上流および下流の経路での多数の中間シグナルのカスケード反応が形成され、最後に、生理機能が、内皮細胞の増殖、生存、移動、浸透性増加および末梢組織への浸潤などで変化する（Ｄｏｎｇ Ｈｏｎｇｃｈａｏら、２０１４年９月、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２２巻（９号）：２２３１～３）。

現在、ヒトＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦＡ、例えばベバシズマブを標的とするいくつかのヒト化モノクローナル抗体があり、ベバシズマブは、２００４年に連続して様々な腫瘍、例えば、非小細胞肺がん、腎細胞がん、子宮頸がんおよび転移性結腸直腸がんなどの治療用として米国食品医薬品局によって承認されている。

ＣＤ２７９としても知られている、プログラム細胞死受容体－１（ＰＤ－１）は、Ｉ型膜貫通糖タンパク質膜表面受容体であり、ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、一般に、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞において発現される。ＰＤ－１には、２つの天然リガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２がある。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は両方ともＢ７スーパーファミリーに属しており、非造血細胞および様々な腫瘍細胞を含む、様々な細胞の膜表面で構成的または誘導的に発現される。ＰＤ－Ｌ１は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣおよび微小血管内皮細胞、ならびに様々な腫瘍細胞で発現されるが、ＰＤ－Ｌ２は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞およびマクロファージでのみ発現される。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用は、リンパの活性化、Ｔ細胞の増殖、ならびにサイトカイン、例えばＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌を抑制することができる。

多くの研究から、腫瘍微細環境は腫瘍細胞を免疫細胞による損傷から保護することができること、腫瘍微細環境に浸潤したリンパ球におけるＰＤ－１の発現がアップレギュレートされること、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、結腸がんおよび神経膠腫などの様々な原発腫瘍組織が免疫組織化学分析においてＰＤ－Ｌ１陽性であることが明らかになっている。それと同時に、腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、がん患者の予後不良と有意に関連している。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用の遮断は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を促進し、腫瘍細胞の免疫除去効率を増強し得る。多数の臨床試験からは、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体がＣＤ８^＋ Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進し、抗腫瘍免疫エフェクター因子、例えばＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢおよびパーフォリンなどをアップレギュレートし、それによって腫瘍の増殖を効果的に抑制することができることが明らかである。

さらに、抗ＰＤ－１抗体はまた、ウイルス慢性感染症の治療においても使用することができる。ウイルス慢性感染症は、多くの場合、ウイルス特異的エフェクターＴ細胞の機能の喪失とその数の減少を伴っている。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用はＰＤ－１抗体を注射することにより遮断され、それによって、ウイルス慢性感染症におけるエフェクターＴ細胞の枯渇を有効に抑制することができる。

ＰＤ－１抗体の広範囲の抗腫瘍に関する可能性と驚くべき効果により、ＰＤ－１経路を標的とする抗体が様々な腫瘍の治療で：非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がんおよび黒色腫の治療において（Ｈｏｍｅｔ Ｍ． Ｂ．， Ｐａｒｉｓｉ Ｇ．ら、Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１５年６月；４２巻（３号）：４６６～４７３頁）、ならびにリンパ腫および貧血において（Ｈｅｌｄ ＳＡ， Ｈｅｉｎｅ Ａら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＣＭＬ． Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１３年９月；１３巻（７号）：７６８～７４頁）、飛躍的進歩をもたらすことが業界において広く容認されている。

二重特異性抗体としても知られている二官能性抗体は、２つの異なる抗原を同時に標的とする特定の医薬であり、免疫選択精製によって製造することができる。さらに、二重特異性抗体はまた、遺伝子工学によっても製造することができ、それは結合部位の最適化、合成の型の検討および収量などの面における対応の柔軟性から特定の利点を有する。現在、二重特異性抗体は、４５種を超えて存在することが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ Ｄ，
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１０；２４巻：８９～９８頁）。多くの二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ＳｃＦｖ型、すなわちＭｏｒｒｉｓｏｎ型で開発されており（Ｃｏｌｏｍａ Ｍ． Ｊ．， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ． Ｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９７；１５巻：１５９～１６３頁）、天然に存在するＩｇＧ型とのその類似性と、抗体の操作、発現および精製における利点から、二重特異性抗体の理想の型のうちの１つであることが実証されている（Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ． Ｒ．， Ｄｅｍａｒｅｓｔ Ｓ． Ｊ．ら、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｃＦｖｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０１０；２３巻：５４９～５７頁；
Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｊ， Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ Ａ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． ＭＡｂｓ ２０１１；３巻：２９９～３０９頁）。

現在、ＰＤ－１とＶＥＧＦ（例えばＶＥＧＦＡ）の両方を標的とする二官能性抗体医薬を開発することが必要とされている。

概要
徹底的な調査と創意的取り組みによって、また市販のＶＥＧＦＡモノクローナル抗体アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（ベバシズマブ）および以前に得た１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（中国公開特許公報第ＣＮ１０６９７７６０２Ａ号を参照）に基づいて、本発明者らは、ＶＰ１０１と命名したヒト化二官能性抗体を得たが、この抗体は、ＶＥＧＦＡとＰＤ－１に同時結合することが可能であり、ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合とＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断することができる。

本発明者らは、驚いたことに、ＶＰ１０１が、
ヒト免疫細胞の表面上のＰＤ－１に有効に結合することと、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１によって媒介される免疫抑制を取り除くことと、ヒト免疫細胞によるＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の分泌を促進すること；
血管内皮細胞のＶＥＧＦＡ誘導性増殖を有効に抑制し、それにより、腫瘍誘導性血管新生を抑制すること；ならびに／あるいは、
悪性腫瘍、例えば、肝臓がん、肺がん、黒色腫、腎腫瘍、卵巣がんおよびリンパ腫などを予防および治療するための医薬の調製に使用される可能性を有すること
が可能であることを見出した。

本発明を以下に詳述する。

本発明の一態様は、
ＶＥＧＦＡを標的とする第１のタンパク質機能領域と、
ＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能領域
を含む、二重特異性抗体であって；
好ましくは、
第１のタンパク質機能領域が、抗ＶＥＧＦＡ抗体またはその抗原結合断片、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む抗ＶＥＧＦＡ抗体の重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記抗ＶＥＧＦＡ抗体の軽鎖可変領域であり；
第２のタンパク質機能領域が、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域、配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域である、
二重特異性抗体に関する。

本発明のいくつかの実施形態では、抗ＶＥＧＦＡ抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびダイアボディから選択され；
ならびに／あるいは、
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびダイアボディから選択される、
二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ型である。

本発明のいくつかの実施形態では、第１のタンパク質機能領域は、免疫グロブリン、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの軽鎖可変領域であり；第２のタンパク質機能領域は、一本鎖抗体、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の重鎖可変領域、および配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の軽鎖可変領域であり；
または、
第１のタンパク質機能領域は、一本鎖抗体、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の重鎖可変領域、および配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の軽鎖可変領域であり；第２のタンパク質機能領域は、免疫グロブリン、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの軽鎖可変領域である。

本発明の特定の実施形態では、ＶＥＧＦＡを標的とする第１のタンパク質機能領域と、ＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能領域を含む、二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能領域が、免疫グロブリン、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの軽鎖可変領域であり；第２のタンパク質機能領域が、一本鎖抗体、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の重鎖可変領域、および配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の軽鎖可変領域であり；
または、
第１のタンパク質機能領域が、一本鎖抗体、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の重鎖可変領域、および配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む一本鎖抗体の軽鎖可変領域であり；第２のタンパク質機能領域が、免疫グロブリン、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリンの軽鎖可変領域である、
二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に記載されており；一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；
または、
一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており、一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており、免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に記載されている、
二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、
免疫グロブリンがマウス以外の種に由来した、例えばヒト抗体に由来した非ＣＤＲ領域を含む、二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、
免疫グロブリンがヒト抗体に由来した定常領域を含み；
好ましくは、免疫グロブリンの定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域から選択される、
二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、
免疫グロブリンの重鎖定常領域がヒトＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域またはヒトＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域であり、その軽鎖定常領域がヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域である、
二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫グロブリンの定常領域はヒト化されている。例えば、各重鎖定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であり、各軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である。

本発明のいくつかの実施形態では、
第１のタンパク質機能領域および第２のタンパク質機能領域が、直接的に、またはリンカー断片によって連結され；
好ましくは、リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、式中、ｍが正の整数、例えば１、２、３、４、５、または６であり、ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）がリンカーの構成単位である、
二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、第１のタンパク質機能領域および第２のタンパク質機能領域の数が、それぞれ独立して、１、２またはそれ以上である、二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、１つの免疫グロブリンおよび２つの一本鎖抗体が存在し、好ましくは２つの同一の一本鎖抗体が存在する、二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり、好ましくはＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、一本鎖抗体が免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている、二重特異性抗体が提供される。免疫グロブリンは２つの重鎖を有するので、２つの一本鎖抗体分子は１つの免疫グロブリン分子に連結される。好ましくは、２つの一本鎖抗体分子は同一である。

本発明のいくつかの実施形態では、２つの一本鎖抗体が存在し、それぞれの一本鎖抗体の１つの末端が免疫グロブリンの２つの重鎖のうちの１つのＣ末端またはＮ末端に連結されている、二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、一本鎖抗体のＶ_ＨとＶ_Ｌの間に存在する。抗体のＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合を導入する方法は、当技術分野においては周知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７４７，６５４号；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｉｎ．１０巻（１９９７）１４５３～１４５９頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻（１９９６）１２３９～１２４５頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８巻（１９９５）１３２３～１３３１頁；Ｗｅｂｂｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２巻（１９９５）２４９～２５８頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２巻（１９９５）２８１～２８７頁；Ｒｅｉｔｅｒら、ＪＢＣ ２６９巻（１９９４）１８３２７～１８３３１頁；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｎｔｅｒ． Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５８巻（１９９４）１４２～１４９頁；またはＲｅｉｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４巻（１９９４）２７１４～２７１８頁を参照されたい。

本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体が１０^－５Ｍ未満、例えば１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍまたは１０^－１０Ｍ以下または未満のＫ_ＤでＶＥＧＦＡタンパク質および／またはＰＤ－１タンパク質に結合し；好ましくは、Ｋ_ＤがＦｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用装置によって測定される、二重特異性抗体が提供される。

本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体が１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１５ｎＭ未満、または０．１４ｎＭ未満のＥＣ_５０でＶＥＧＦＡタンパク質に結合し；好ましくは、ＥＣ_５０が間接的ＥＬＩＳＡによって検出され；
および／または、
二重特異性抗体が１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１７ｎＭ未満、０．１６ｎＭ未満または０．１５ｎＭ未満のＥＣ_５０でＰＤ－１タンパク質に結合し；好ましくは、ＥＣ_５０が間接的ＥＬＩＳＡによって検出される、
二重特異性抗体が提供される。

本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸分子に関する。

本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクターに関する。

本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むか、または本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。

本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件で培養することと、二重特異性抗体を細胞培養物から単離することを含む、方法に関する。

本発明の別の態様は、二重特異性抗体と複合部分を含む複合体であって、二重特異性抗体が本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体であり、複合部分が検出可能な標識であり；好ましくは、複合部分が放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素である、複合体に関する。

本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体を含むか、または本発明の複合体を含むキットであって；
好ましくは、キットが、二重特異性抗体に特異的に結合することが可能な二次抗体をさらに含み；任意選択で、二次抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、キットに関する。

本発明の別の態様は、サンプル中のＶＥＧＦＡおよび／またはＰＤ－１の存在またはレベルを検出するためのキットの調製における、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体の使用に関する。

本発明の別の態様は、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体を含むか、または本発明の複合体を含む、医薬組成物に関し；任意選択で、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物は、製薬の分野において公知の任意の剤形、例えば、錠剤、丸剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、ゲル、カプセル、粉末、顆粒、エリキシル、トローチ、坐薬、注射剤（注射溶液、注射用滅菌粉末および注射用濃縮溶液を含む）、吸入剤、ならびに噴霧剤などに製剤化することができる。好ましい剤形は、投与および治療用途の意図した様式によって決まる。本発明の医薬組成物は、製造条件および保存条件下で無菌であり安定化するものとする。好ましい剤形の１つは、注射剤である。そのような注射剤は、無菌注射溶液であり得る。例えば、無菌注射溶液は、以下の方法によって調製することができる：本発明の必要量の二重特異性抗体が適切な溶媒に加えられ、任意選択で、他の所望する成分（限定するものではないが、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、保存剤、希釈剤、またはそれら任意の組合せを含む）が同時に加えられ、続いて濾過および滅菌される。さらに、滅菌注射溶液は、便利な保存および使用のために、無菌凍結乾燥粉末剤（例えば真空乾燥または凍結乾燥による）として調製することができる。そのような無菌凍結乾燥粉末剤は、使用前に、適切な担体（例えば、無菌発熱性物質除去蒸留水）に分散させることができる。

さらに、本発明の二重特異性抗体は、投与を容易にするために、単位用量剤形の医薬組成物中に存在させることができる。いくつかの実施形態では、単位用量は、少なくとも１ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇである。医薬組成物が液体（例えば注射）剤形である場合、それは本発明の二重特異性抗体を少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍＬなどの濃度で含むことができる。

本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は、限定するものではないが、経口経路、口腔経路、舌下経路、眼内経路、局所経路、非経口経路、直腸経路、髄腔内経路、嚢内経路、鼠蹊部経路、膀胱内経路、局所経路（例えば粉末剤、軟膏もしくは点滴剤）、または経鼻経路を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって投与され得る。しかし、多くの治療用途においては、投与の好ましい経路／形式は、非経口である（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射および筋肉内注射）。投与の経路および／または形式が意図した目的に応じて変わるということは、当業者には認識されよう。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は、静脈点滴または注射によって投与される。

本明細書で提供された二重特異性抗体または医薬組成物は、単独でもしくは組合せて使用することができるか、または追加の薬学的に有効な薬剤（例えば腫瘍化学療法剤）と組み合わせて使用することができる。そのような追加の薬学的に有効な薬剤は、本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物の投与前に、その投与と同時に、あるいはその投与後に投与することができる。

本発明では、投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を達成するように調節され得る。例えば、それは単回投与であってもよく、ある期間にわたっての複数回投与であってもよく、また、治療の緊急程度に伴って用量を比例して低減または増加させることを特徴とし得る。

本発明の別の態様は、悪性腫瘍を予防および／または治療するための医薬の調製における本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体の使用であって、好ましくは、悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、例えば非小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍および白血病から選択される、使用に関する。

本発明の別の態様は、
（１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルを検出するための医薬もしくは薬剤、
ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減するための医薬もしくは薬剤、
血管内皮細胞増殖を抑制するための医薬もしくは薬剤、または、
腫瘍血管新生を遮断するための医薬もしくは薬剤；
ならびに／あるいは、
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減するための医薬もしくは薬剤、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための医薬もしくは薬剤、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進するための医薬もしくは薬剤
の調製における、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体の使用に関する。

本発明の一実施形態では、使用は、非治療的および／または非診断的である。

本発明の別の態様は、有効量の本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体を細胞に投与することを含むｉｎ ｖｉｖｏでの方法またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
（１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルを検出する方法、
ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断する方法、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートする方法、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減する方法、
血管内皮細胞増殖を抑制する方法、または、
腫瘍血管新生を遮断する方法；
ならびに／あるいは、
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断する方法、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートする方法、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減する方法、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進する方法、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進する方法
から選択される、方法に関する。

本発明の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、非治療的および／または非診断的である。

本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、抗ＶＥＧＦＡ抗体および抗ＶＥＧＦＡ／抗ＰＤ－１二官能性抗体は両方とも、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制することができ、抗ＰＤ－１抗体および抗ＶＥＧＦＡ／抗ＰＤ－１二官能性抗体は両方とも、ＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－２の分泌を促進し、免疫反応を活性化することができる。

本発明の別の態様は、有効量の本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体を必要とする対象に投与することを含む、悪性腫瘍を予防および／または治療する方法であって、好ましくは、悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、例えば非小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍および白血病から選択される、方法に関する。

本発明の二重特異性抗体の治療有効量または予防有効量の非限定的な典型的範囲は、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２５ｍｇ／ｋｇまたは１～１０ｍｇ／ｋｇである。用量は、治療しようとする病状のタイプおよび重症度に応じて変わり得ることに留意されたい。さらに、任意の特定の患者に関して、特定の投与レジメンが患者の必要性および医師の専門的判断によって経時的に調節され；本明細書で示した用量範囲が単なる説明目的のためであり、本発明の医薬組成物の使用および範囲を限定するものではないことは、当業者には理解されよう。

本発明では、対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。

悪性腫瘍の予防および／または治療において使用するための本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または複合体であって、好ましくは、悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、例えば非小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍および白血病から選択される、二重特異性抗体または複合体が提供される。

（１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルの検出、
ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合の遮断、
ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激の軽減、
血管内皮細胞増殖の抑制、または、
腫瘍血管新生の遮断；
ならびに／あるいは、
（２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合の遮断、
ＰＤ－１の活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
生体におけるＰＤ－１の免疫抑制の軽減、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌の促進、または、
Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌の促進
において使用するための、本発明のいずれかの実施形態に記載の二重特異性抗体または複合体が提供される。

抗体薬剤、特にモノクローナル抗体は、各種疾患の治療において良好な効果を達成した。これらの治療用抗体を取得するための従来の実験方法は、動物を抗原で免疫にすること、免疫動物において抗原を標的とする抗体を得ること、または抗原に対して親和性の低いそれらの抗体を親和性成熟によって改良することである。

軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原の結合を決定する；それぞれの鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含む（重鎖（Ｈ鎖）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ鎖）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、なお、これらはＫａｂａｔらによって命名されており、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ （１～３巻）１９９１：９１～３２４２頁を参照されたい）。

好ましくは、ＣＤＲはまたＩＭＧＴ番号方式によっても規定することができ、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋａａｓ，およびＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ． 「ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ
ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ．」 Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８巻．補遺１（２００９）：Ｄ３０１～Ｄ３０７頁を参照されたい。

下記の（１）～（１３）のモノクローナル抗体配列のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、当業者に周知の技術的手段によって、例えばＶＢＡＳＥ２データベースによって、またＩＭＧＴ規定に従って分析されたが、それらの結果は以下のとおりである：
（１）ベバシズマブ
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５に記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に記載されている。

その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
HCDR1: GYTFTNYG（配列番号１５）
HCDR2: INTYTGEP（配列番号１６）
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV（配列番号１７）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
LCDR1: QDISNY（配列番号１８）
LCDR2: FTS（配列番号１９）
LCDR3: QQYSTVPWT（配列番号２０）
（２）１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１１に記載されている。

その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
HCDR1:GFAFSSYD（配列番号２１）
HCDR2: ISGGGRYT（配列番号２２）
HCDR3: ANRYGEAWFAY（配列番号２３）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
LCDR1: QDINTY（配列番号２４）
LCDR2: RAN（配列番号２５）
LCDR3: LQYDEFPLT（配列番号２６）
（３）ＶＰ１０１
その重鎖の９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
HCDR1: GYTFTNYG（配列番号１５）
HCDR2: INTYTGEP（配列番号１６）
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV（配列番号１７）
HCDR4:GFAFSSYD（配列番号２１）
HCDR5: ISGGGRYT（配列番号２２）
HCDR6: ANRYGEAWFAY（配列番号２３）
HCDR7: QDINTY（配列番号２４）
HCDR8: RAN（配列番号２５）
HCDR9: LQYDEFPLT（配列番号２６）
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：LCDR1: QDISNY（配列番号１８）
LCDR2: FTS（配列番号１９）
LCDR3: QQYSTVPWT（配列番号２０）
本発明では、別段の規定のない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学の実験室での操作は、対応する分野で広く使用されている日常的な方法である。それと同時に、本発明をより理解するために、関連用語の規定および説明を以下で提供する。

本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿００１１６５０９７．１）のアミノ酸配列に言及する場合には、これは完全長のＶＥＧＦＡタンパク質、ならびにＶＥＧＦＡの融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合された断片を含む。しかし、ＶＥＧＦＡタンパク質のアミノ酸配列で、変異または変種（限定するものではないが、置換、欠失および／または付加を含む）が、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然で生成され得るか、または人工的に導入され得ることは当業者には理解されよう。したがって、本発明では、用語「ＶＥＧＦＡタンパク質」とは、それらの天然バリアントまたは人工バリアントを含む、すべてのそのような配列を含んでいるものとする。さらに、ＶＥＧＦＡタンパク質の配列断片を記載する場合、これはまたその天然バリアントまたは人工バリアントの対応する配列断片も含む。本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦＡタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１の下線部分として示されている（最後の６個のＨｉｓがない、合計で３０２アミノ酸）。

本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦＲ２タンパク質（ＫＤＲとしても知られている、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿００２２４４）のアミノ酸配列に言及する場合には、これは完全長のＶＥＧＦＲ２タンパク質、またはＶＥＧＦＲ２の細胞外断片ＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤ、またはＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤを含む断片を含み、またさらに、これはＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合された断片を含む。しかし、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸配列で、変異または変種（限定するものではないが、置換、欠失および／または付加を含む）が、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然で生成され得るか、または人工的に導入され得ることは当業者には理解されよう。したがって、本発明では、用語「ＶＥＧＦＲ２タンパク質」とは、それらの天然バリアントまたは人工バリアントを含む、すべてのそのような配列を含んでいるものとする。さらに、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の配列断片を記載する場合、これはまたその天然バリアントまたは人工バリアントの対応する配列断片も含む。本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２の細胞外断片ＶＥＧＦＲ２－ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号４の波状下線部分として示されている（７６６アミノ酸）。

本発明では、別段の明示のない限り、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２である；その特定のタンパク質配列は先行技術において公知の配列であり、既存の文献またはＧｅｎＢａｎｋで開示されている配列を参照することができる。例えば、ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦＲ１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３２１）；ＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦＲ２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７９１）。

本明細書で使用される場合、ＰＤ－１タンパク質（プログラム細胞死タンパク質１、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００５０１８）のアミノ酸配列に言及する場合には、これは完全長のＰＤ－１タンパク質、またはＰＤ－１の細胞外断片ＰＤ－１ＥＣＤ、またはＰＤ－１ＥＣＤを含む断片を含み、これはまた、ＰＤ－１ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）に融合された断片も含む。しかし、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列で、変異または変種（限定するものではないが、置換、欠失および／または付加を含む）が、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、天然で生成され得るか、または人工的に導入され得ることは当業者には理解されよう。したがって、本発明では、用語「ＰＤ－１タンパク質」とは、それらの天然バリアントまたは人工バリアントを含む、すべてのそのような配列を含んでいるものとする。さらに、ＰＤ－１タンパク質の配列断片を記載する場合、これはまたその天然バリアントまたは人工バリアントの対応する配列断片も含む。

本明細書で使用される場合、用語のＥＣ_５０とは、最大効果の５０％に対する濃度、すなわち、最大効果の５０％を引き起こす濃度を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、一般に２対のポリペプチド鎖（各対は「軽」（Ｌ）鎖および「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を意味する。一般的な意味において、重鎖は、抗体中のより大きな分子量を有するポリペプチド鎖として解釈することができ、軽鎖は、抗体中のより小さな分子量を有するポリペプチド鎖を意味する。軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして一般に分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして規定される。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣ_Ｌからなる。抗体の定常領域は、古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）への免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）の結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介し得る。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域の間に分散される、高度可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）へとさらに細分化され得る。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシル末端へ配置されている３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）は、抗体結合部位をそれぞれ形成する。領域またはドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻（１９８７）：９０１～９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻（１９８９）：８７８～８８３頁、あるいはＩＭＧＴ番号方式の規定、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋａａｓ，およびＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ． 「ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ．」 Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８巻 補遺＿１（２００９）：Ｄ３０１～Ｄ３０７頁を参照、に基づき得る。特に、重鎖はまた、３個よりも多くの、例えば６、９、または１２個のＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体では、重鎖は、別の抗体に連結されたＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端を有するＳｃＦｖであってもよく、またこの場合、重鎖は９個のＣＤＲを含む。用語「抗体」は、抗体を産生するためのいずれかの特定の方法によって限定されるものではない。例えば、抗体は、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクロナール抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えば、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」としても知られている、用語「抗原結合断片」とは、完全長抗体が結合するのと同じ抗原に特異的に結合し、および／または抗原への特異的結合について完全長抗体と競合する能力を維持する、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを意味している。全体的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ， Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたく、またこれはすべての目的に対して参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト抗体の酵素的切断または化学的切断によって生成することができる。いくつかの場合には、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体断片（例えばｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドに特異的抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。

本明細書で使用される場合、用語「Ｆｄ断片」とは、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体断片を意味し；用語「Ｆｖ断片」とは、抗体の単一アームのＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインからなる抗体断片を意味し；用語「ｄＡｂ断片」は、Ｖ_Ｈドメインからなる抗体断片を意味し（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻（１９８９）：５４４～５４６頁）；用語「Ｆａｂ断片」とは、Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_ＬドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体断片を意味し；用語「Ｆ（ａｂ’）_２断片」とは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を意味する。

いくつかの場合においては、抗体の抗原結合断片は、Ｖ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインが対形成され、単一ポリペプチド鎖の生成を可能にするリンカーを介して１価分子を形成されている、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻（１９８８）：４２３～４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻（１９８８）：５８７９～５８８３頁を参照）。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２－Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－Ｖ_Ｈ－リンカー－Ｖ_Ｌ－ＣＯＯＨを有し得る。先行技術における適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_４を有するリンカーを使用することができ、また、そのバリアントも使用することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻（１９９３）：６４４４～６４４８頁）。本発明において有用である他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８巻（１９９５）：７２５～７３１頁、Ｃｈｏｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１巻（２００１）：９４～１０６頁、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６巻（１９９６）：３０５５～３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３巻（１９９９）：４１～５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）によって開示されている。

いくつかの場合においては、抗体の抗原結合断片は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインが単一ポリペプチド鎖で発現される、ダイアボディ、すなわち二価抗体である。しかし、使用されるリンカーが短すぎるので同じ鎖の２つのドメインは対形成することができず、そのため、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成することとなり、２つの抗原結合部位が生成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻（１９９３）：６４４４～６４４８頁、およびＰｏｌｊａｋ ＲＪら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２巻（１９９４）：１１２１～１１２３頁を参照）。

抗体の抗原結合断片（例えば、上記で言及した抗体断片）は、当業者に公知の従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的切断）を使用することにより、所定の抗体から得ることができ、抗体の抗原結合断片は、インタクト抗体の場合と同じように特異性についてスクリーニングすることができる。

本明細書で使用される場合、文脈において明らかに規定されない限り、用語「抗体」に言及する場合には、それはインタクト抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。

本明細書で使用される場合、用語の「ｍＡｂ」および「モノクローナル抗体」とは、自然発生的に起こり得る自然突然変異を除き、高度に同種な抗体の群に由来する、すなわち同一の抗体分子の群に由来する抗体またはその断片を意味する。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高い特異性を有する。ポリクロナール抗体は、モノクローナル抗体に対して、一般に抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を一般に含む。モノクローナル抗体は、一般に、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、２５６号：４９５頁、１９７５）によって最初に報告されたハイブリドーマ技術によって得ることができ、また組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、軽鎖および／または重鎖の一部が（特定の種に由来し得るか、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）抗体に由来し、軽鎖および／または重鎖の別の部分が（同一のもしくは異なる種に由来し得るか、同一のもしくは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）別の抗体に由来する、抗体を意味する。しかしいずれの場合にも、これは、標的抗原に対する結合活性を保持する（Ｃａｂｉｌｌｙらに対する米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１号（１９８４）：６８５１～６８５５頁）。

本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域の全てまたは一部が、非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域と置き換えられる場合に得られた抗体または抗体断片であって、そのドナー抗体が、予期した特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラットまたはウサギ）抗体であり得る、抗体または抗体断片を意味する。さらに、受容体抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基はまた、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基と置き換えることができるか、または抗体の性能をさらに改善もしくは最適化する他の抗体のアミノ酸残基と置き換えることができる。ヒト化抗体についてのさらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻（１９８６）：５２２～５２５頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３～３２９頁（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、２巻（１９９２）：５９３～５９６頁、およびＣｌａｒｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２１巻（２０００）：３９７～４０２頁を参照されたい。

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特に結合する抗原上の部位を意味する。「エピトープ」はまた、当技術分野において「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は、一般に、分子の化学的に活性のある表面基、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖などからなり、通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは、一般に、特有の空間的立体構造に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含んでおり、これは「直鎖状」または「立体構造的」であり得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照されたい。直鎖エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば抗体）との間の全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に存在する。立体構造的なエピトープにおいては、相互作用部位は、相互に隔てられているタンパク質アミノ酸残基にわたって存在する。

本明細書で使用される場合、用語の「単離された」とは、自然状態から人工的手段によって得られたことを意味する。ある特定の「単離された」物質または成分が天然に生じる場合、その自然環境に変化が生じるということ、または自然環境から単離されたということ、またはその両方であり得る。例えば、ある特定の単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある特定の生存動物において存在しており、そのような自然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと呼ばれる。用語の「単離された」は、その物質の活性に影響を及ぼさない、人工物質もしくは合成物質、または他の不純物の存在を除外しない。

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸ビヒクルを意味する。挿入されたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質をベクターが発現させることができる場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターによって保有された遺伝物質エレメントを宿主細胞において発現することができるように、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞へ導入することができる。ベクターは当業者に周知であり、限定するものではないが、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスなどが含まれる。ベクターとして使用することができる動物ウイルスは、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウィルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）を含む。ベクターは、限定するものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含む、発現を調節する様々なエレメントを含有することができる。さらに、ベクターは複製開始部位を含んでいてもよい。

本明細書に使用される場合、用語「宿主細胞」とは、ベクターが導入され得る細胞を意味し、限定するものではないが、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、真菌細胞、例えば酵母細胞もしくはアスペルギルス属（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、昆虫細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９、または動物細胞、例えば繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒト細胞が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語の「特異的に結合する」とは、２つの分子間の非無作為の結合反応、例えば、抗体とそれが標的とする抗原との間の反応を意味する。いくつかの実施形態では、抗原（または抗原に特異的な抗体）に特異的に結合する抗体とは、抗体が約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合することを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、用語「標的」とは、特異的結合を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「Ｋ_Ｄ」とは、特異的抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を意味し、これは抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合は強く、抗体と抗原との間の親和性は高い。一般に、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＢＩＡＣＯＲＥ装置で決定した場合、抗体は、約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ以下の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合する。

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」は同じ意味を有しており、交換可能に使用することができる；用語「ポリクロナール抗体」および「ＰｃＡｂ」は同じ意味を有しており、交換可能に使用することができる；用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は同じ意味を有しており、交換可能に使用することができる。さらに、本発明においては、アミノ酸は、一般に、当技術分野で公知の１文字および３文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａによって表すことができる。

本明細書で使用される場合、用語の「薬学的に許容される賦形剤」とは、対象および活性成分と薬理学的におよび／または生理学的に適合性のある担体および／またはビヒクルを意味し、それは当技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版
Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照）、限定するものではないが、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバントおよびイオン強度促進剤が含まれる。例えば、ｐＨ調節剤は、限定するものではないが、リン酸塩緩衝液を含み；界面活性剤は、限定するものではないが、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤または非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０を含み；イオン強度促進剤は、限定するものではないが、塩化ナトリウムを含む。

本明細書で使用される場合、用語「アジュバント」とは、非特異的免疫促進剤を意味し、これは抗原への生体の免疫応答を促進することができるか、または抗原と一緒に生体に送達されるか、事前に生体に送達される場合に、免疫応答のタイプを変化させることができる。限定するものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖類、サイトカインなどを含む、様々なアジュバントがある。フロイントアジュバントは、動物実験において最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験において多用されている。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、所望の効果を得るか、または少なくとも部分的に得るのに十分な量を意味する。例えば、予防的有効量（例えば、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合またはＶＥＧＦの過剰発現に関連した疾患、例えば腫瘍に対する）は、その疾患（例えば、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合またはＶＥＧＦの過剰発現に関連した疾患、例えば腫瘍）の発症を予防、抑止または遅延するのに十分な量であり；治療有効量とは、その病気に罹患している患者の疾患およびその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量である。そのような有効量を決定することは、疑いもなく当業者の範囲内である。例えば、治療使用における有効量は、治療しようとする疾患の重症度、患者の免疫系の全体的な状態、患者の一般的状態、例えば年齢、体重および性別、薬剤投与形式、ならびに同時に行われる他の治療などによって決まる。

二重特異性抗体ＶＰ１０１は、良好にＶＥＧＦＡに特異的に結合し、ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を有効に遮断し、生体におけるＶＥＧＦＡの免疫抑制および血管新生に対するＶＥＧＦＡの促進効果を特異的に軽減することができる；ＶＰ１０１は、良好にＰＤ－１に特異的に結合し、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を有効に遮断し、生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を特異的に軽減し、免疫応答を活性化することができる。

図１は、二官能性抗体ＶＰ１０１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出の結果を示す。左から右への４つのレーンのサンプルとそれぞれのローディング量は次のとおりである：非還元性タンパク質電気泳動用ローディングバッファー中の抗体、１μｇ；還元性タンパク質電気泳動用ローディングバッファー中の抗体、１μｇ；マーカー、５μＬ；ＢＳＡ、１μｇ。 図２は、抗体ＶＰ１０１のＰＤ－１への結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図３は、抗体ＢｓＡｂＢ７のＰＤ－１への結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図４は、抗体ＢｓＡｂＢ８のＰＤ－１への結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図５は、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＤ－１への結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図６は、抗体ニボルマブのＰＤ－１への結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図７は、抗体ＶＰ１０１のＶＥＧＦへの結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図８は、抗体ＢｓＡｂＢ７のＶＥＧＦへの結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図９は、抗体ＢｓＡｂＢ８のＶＥＧＦへの結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図１０は、抗体ベバシズマブのＶＥＧＦへの結合に関するキネティック特性パラメーターの検出結果を示す。 図１１は、間接ＥＬＩＳＡによって検出された、抗体ＶＰ１０１のＶＥＧＦＡへの結合活性を示す。 図１２は、間接ＥＬＩＳＡによって検出された、抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８およびベバシズマブのＶＥＧＦＡ－ｈｉｓへのそれぞれの結合活性を示す。 図１３は、間接ＥＬＩＳＡによって検出された、抗体ＶＰ１０１のＰＤ－１への結合活性を示す。 図１４は、間接ＥＬＩＳＡによって検出された、抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびニボルマブのＰＤ－１へのそれぞれの結合活性を示す。 図１５は、競合ＥＬＩＳＡによって検出された、ＶＥＧＦＡへの結合に対するＶＥＧＦＲ２との競合における抗体ＶＰ１０１の活性を示す。 図１６は、競合ＥＬＩＳＡによって検出された、ＰＤ－１への結合に対するＰＤ－Ｌ１との競合における抗体ＶＰ１０１の活性を示す。 図１７は、ＦＡＣＳによって検出された、２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞表面タンパク質ＰＤ－１への抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびＶＰ１０１の結合ＥＣ_５０を示す。 図１８は、ＦＡＣＳによって検出された、２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞表面タンパク質ＰＤ－１への抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の結合ＥＣ_５０を示す。 図１９は、ＦＡＣＳによって検出された、２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞表面タンパク質ＰＤ－１への結合に対するＰＤ－Ｌ１との競合における抗体ＶＰ１０１および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性を示す。 図２０は、ＦＡＣＳによって検出された、２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞表面タンパク質ＰＤ－１への結合に対するＰＤ－Ｌ１との競合における抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌおよびニボルマブの活性を示す。 図２１は、ＮＦＡＴシグナル経路を活性化するためのＶＥＧＦのブロッキングにおける抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の中和生物活性を示す。 図２２は、ＨＵＶＥＣ細胞増殖に対するベバシズマブおよびＶＰ１０１の効果を示す。 図２３は、ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＩＦＮ－γの分泌に対するＶＰ１０１の効果を示す。 図２４は、ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＩＦＮ－γの分泌に対するＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の効果を示す。 図２５は、ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＩＬ－２の分泌に対するＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の効果を示す。 図２６は、ＥＬＩＳＡによって検出された、ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞の混合培養によって誘導されたサイトカインＩＬ－２の分泌に対する抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびＶＰ１０１の効果を示す。 図２７は、ＥＬＩＳＡによって検出された、ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞の混合培養によって誘導されたサイトカインＩＦＮ－γの分泌に対する抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびＶＰ１０１の効果を示す。 図２８は、ＥＬＩＳＡによって検出された、ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞の混合培養によって誘導されたサイトカインＩＦＮ－γの分泌に対する抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の効果を示す。 図２９は、ＥＬＩＳＡによって検出された、ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞の混合培養によって誘導されたサイトカインＩＬ－２の分泌に対する抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の効果を示す。 図３０は、異なる濃度のＶＰ１０１による腫瘍増殖の抑制を示す。 図３１は、マウスの体重に対する異なる濃度のＶＰ１０１の効果を示す。

詳細な説明
本発明の実施形態を、実施例を参照して以下で詳細に説明する。以下の実施例が本発明を例示するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されないことは、当業者には理解されよう。技術または条件の明確な説明のない場合は、当技術分野の文献に開示されている技術または条件に従って（例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、およびＨｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇら訳、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓを参照）または製品マニュアルに従って実施した。使用した試薬または機器は、それらの製造業者が明示されていない場合、すべて市販されている従来の製品である。

本発明の以下の実施例において、同一標的用の市販抗体ベバシズマブ（商品名アバスチン（登録商標））は、対照抗体としてＲｏｃｈｅから購入したか、または調製実施例４に従って調製した。

本発明の以下の実施例において、同一標的用の市販抗体ニボルマブ（商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、対照抗体としてＢＭＳから購入した。本発明の以下の実施例において、対照抗体ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８のアミノ酸配列は、中国公開特許公報第ＣＮ１０５１７５５４５Ａ号のＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８のアミノ酸配列とそれぞれ同一であった。

調製実施例１：融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃおよびＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃの調製
融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃおよびＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃの調製と、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出は、中国公開特許公報第ＣＮ１０６６３２６７４Ａ号の調製実施例１を十分に参照することにより実施する。

この調製実施例の融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃおよびＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃのアミノ酸配列およびコードヌクレオチド配列は、中国公開特許公報第ＣＮ１０６６３２６７４Ａ号の調製実施例１のＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃおよびＰＤＬ－１－ｈＦｃのものとそれぞれ同じである。

融合タンパク質ＰＤ－１－ｍＦｃ、ＰＤ－１－ｈＦｃおよびＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃはこのようにして得た。

調製実施例２：融合タンパク質ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓの発現および精製
１．プラスミドＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓの構築
ＰＣＲ増幅は鋳型としてＶＥＧＦＡヒトｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅから購入）を使用して実施し、ｈＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓ断片は、通常のＤＮＡ産物精製キットを使用して精製および単離した。単離したｈＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓ断片および発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１は、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦで酵素的に消化し、標的遺伝子断片はゲル抽出によって単離し、Ｔ４リガーゼによって直鎖状発現ベクターと連結させた。次いで、全ての連結産物をＤＨ５ａ化学的コンピテント細胞に形質転換させ、Ａｍｐを含む寒天平板上にコーティングした。十分に分離された単一コロニーをコロニーＰＣＲ同定用に選択し、ＰＣＲ陽性のクローンを培養用のＬＢ培養培地に播種し、細菌溶液を取得し、配列決定を検証するためにＧｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに送った。配列決定結果のアラインメントからは、陽性リコン（ｒｅｃｏｎ）の挿入配列が完全に正確であったことが示された。

２． 融合タンパク質ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓの発現および精製
組換えプラスミドＶＥＧＦＡ－ｈｉｓを、リポフェクタミントランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）のマニュアルに従って、７日間２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にトランスフェクトした後、培養培地を高速遠心分離にかけ、上清を濃縮し、結合用バッファーＡにバッファー交換し、次いで、ＨｉｓＴｒａｐカラムにロードし、溶出バッファーＡを用いてタンパク質を直線的に溶出させた。一次精製サンプルをＨｉＴｒａｐ脱塩カラムの結合用バッファーＢにバッファー交換し、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラムにロードし、タンパク質を溶出バッファーＢで直線的に溶出させ、標的サンプルを単離し、ＰＢＳにバッファー交換した。精製したサンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出用の還元性タンパク質電気泳動ローディングバッファーに加えた。

融合タンパク質ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓをこのようにして得た。
ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓのアミノ酸配列は、以下のとおりである（１７１ａａ）：
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRRHHHHHH（配列番号１）
ここで、下線部分はＶＥＧＦＡのアミノ酸配列である。

ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓをコードするヌクレオチド配列（５１３ｂｐ）
GCACCCATGGCCGAGGGCGGCGGCCAGAACCACCACGAGGTGGTGAAGTTCATGGACGTGTACCAGAGAAGCTACTGCCACCCCATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCCGACGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCCAGCTGCGTGCCCCTGATGAGATGCGGCGGCTGCTGCAACGACGAGGGCCTGGAGTGCGTGCCCACCGAGGAGAGCAACATCACCATGCAGATCATGAGAATCAAGCCCCACCAGGGCCAGCACATCGGCGAGATGAGCTTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGTGCAGACCCAAGAAGGACAGAGCCAGACAGGAGAACCCCTGCGGCCCCTGCAGCGAGAGAAGAAAGCACCTGTTCGTGCAGGACCCCCAGACCTGCAAGTGCAGCTGCAAGAACACCGACAGCAGATGCAAGGCCAGACAGCTGGAGCTGAACGAGAGAACCTGCAGATGCGACAAGCCCAGAAGACATCATCACCATCACCAC（配列番号２）
調製実施例３：融合タンパク質ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃの発現および精製 １．遺伝子ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃの合成：
遺伝子ＶＥＧＦＲ２（血管内皮細胞増殖因子受容体２、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００２２４４）の細胞外断片ＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤに対応するアミノ酸を、ＴＥＶおよびヒトＩｇＧ（ｈＦｃ）のＦｃタンパク質断片とそれぞれ融合させた（配列番号３）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに対応するコードヌクレオチド配列の合成を委託した（配列番号４）。

ＶＥＧＦＲ２、血管内皮細胞増殖因子受容体２、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２２４４；
ｈＦｃ：Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８５７，１０６－３３０；
融合タンパク質ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃのアミノ酸配列：（９９８ａａ）

ここで、波状下線部分はＶＥＧＦＲ２のＥＣＤ部分であり、枠付きの部分はＴＥＶ酵素消化部位であり、実線部分はｈＦｃ部分である。

融合タンパク質ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列：（２９９７ｂｐ）

ここで、波状下線部分はＶＥＧＦＲ２のＥＣＤ部分であり、枠付きの部分はＴＥＶ酵素消化部位であり、実線部分はｈＦｃ部分である。

２．プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃの構築：
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成されたＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃコード遺伝子を発現ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより提供）にクローニングし、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃプラスミドを得た。

３．組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃの構築： プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃを酵素消化し（Ｘｂａ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ）、電気泳動によって単離された融合遺伝子断片ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）と連結させ、ｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃを得て、これをコンピテント大腸菌細胞ＤＨ５ａ（ＴＩＡＮＧＥＮから購入）にトランスフェクトした；トランスフェクションおよび培養は、マニュアルに従って実施した。陽性ｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃコロニーをスクリーニングし、大腸菌を従来の方法に従って増幅させ、次いで、キット（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、ＤＰ１０３－０３）を使用し、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃをキットのマニュアルに従って抽出した。

４．組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃの２９３Ｆ細胞へのトランスフェクション
組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃを、リポフェクタミントランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）により、２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にトランスフェクトした。

５．ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出
７日間組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃを２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした後、培養培地を高速遠心分離、微細孔膜減圧濾過、およびＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム精製にかけ、ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃ融合タンパク質サンプルを得て、サンプルの一部を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出用の還元性タンパク質電気泳動ローディングバッファーへ加えた。

融合タンパク質ＶＥＧＦＲ２－ｈＦｃをこのようにして得た。

調製実施例４：抗ＶＥＧＦＡ抗体ベバシズマブの調製
中国公開特許公報第ＣＮ１２５９９６２Ａ号には、市販のＶＥＧＦＡモノクローナル抗体アバスチン（ベバシズマブ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が言及されている。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の合成を委託した。

ベバシズマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１２３ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS（配列番号５）
ベバシズマブの重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３６９ｂｐ）
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAGGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGGAACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCAAATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGGGGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGC（配列番号６）
ベバシズマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１０７ａａ）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK（配列番号７）
ベバシズマブの軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCTAGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCATGGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAG（配列番号８） 重鎖定常領域は、全てＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であった；軽鎖定常領域は、全てＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４であった。

ベバシズマブの重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡをベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、抗体ベバシズマブの組換え発現プラスミドを得た。組換えプラスミドを２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。２９３Ｆ細胞の培養培地を精製し、次いで検出した。

抗ＶＥＧＦＡモノクローナル抗体アバスチン（ベバシズマブ）をこのようにして得た。

調製実施例５：抗ＰＤ－１ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の調製および検出
この調製は、中国公開特許公報第ＣＮ１０６９７７６０２Ａ号に開示されている実施例３～４に従って実施した。

ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列もまた、中国公開特許公報第ＣＮ１０６９７７６０２Ａ号の実施例３～４に開示されているものと同じであり、本明細書においても以下に提供する：
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１１８ａａ）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号９）
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT（配列番号１０）
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１０７ａａ）
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK（配列番号１１）
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG（配列番号１２）
抗ＰＤ－１ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、このようにして得た。

調製実施例６：ｈＩｇＧの調製および同定
ヒト抗ニワトリ卵白リゾチームＩｇＧの配列（抗ＨＥＬ、すなわちｈＩｇＧと略称されるヒトＩｇＧ）は、Ａｃｉｅｒｎｏらによって公表された研究、標題「Ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ａｃｉｅｒｎｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００７；３７４巻（１号）：１３０～４６頁）のＦａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列に由来する。調製方法は以下のとおりである：
Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｌｏｇｙに、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖（完全配列または可変領域）遺伝子に対して、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ （第３版）」に導入された標準技術を参照することにより、また標準の分子クローニング技術、例えば、ＰＣＲ、酵素消化、ＤＮＡゲル抽出、ライゲーション形質転換、コロニーＰＣＲまたは酵素消化同定を使用することにより、アミノ酸のコドン最適化および遺伝子合成を実施するために委託し、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を、それぞれ、哺乳動物発現系の抗体重鎖発現ベクターおよび抗体軽鎖発現ベクターにサブクローニングし、それらの組換え発現ベクターの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子をさらに配列決定し、分析した。配列が正確であることを確認した後、エンドトキシンを含まない発現プラスミドをラージスケールで調製し、組換え抗体を発現させるＨＥＫ２９３細胞に重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを一過的にコトランスフェクトした。７日間培養した後、細胞培養培地を回収し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ）を使用してアフィニティ精製し、得られた抗体サンプルの品質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ標準分析技術を使用して決定した。

ｈＩｇＧをこのようにして得て、下記の実施例８～９で使用した。

実施例１：二官能性抗体ＶＰ１０１の重鎖および軽鎖の配列設計、調製および検出
１．配列設計
本発明の二官能性抗体ＶＰ１０１の構造は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ型（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）であり、すなわち、ＩｇＧ抗体の２つの重鎖のＣ末端がそれぞれ別の抗体のｓｃＦｖ断片に結合されており、重鎖および軽鎖の主な構成設計は下記の表１に示した通りである。

上記の表１において：
（１）右下方の角に表示された「Ｖ」を有するものは、対応する重鎖の可変領域または対応する軽鎖の可変領域を意味する。「Ｖ」表示のないものについては、対応する重鎖または軽鎖は、定常領域を含む完全長である。上記の調製例で説明した対応する配列は、これらの可変領域または完全長のアミノ酸配列と、それらをコードするヌクレオチド配列について言及されている。
（２）リンカー１のアミノ酸配列は、GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS（配列番号１３）である。

２．抗体ＶＰ１０１の発現および精製
ＶＰ１０１の重鎖ｃＤＮＡ配列および軽鎖ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより提供）にクローニングし、それぞれ、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１ＨおよびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１Ｌを得た。

プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１ＨおよびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＶＰ１０１Ｌを酵素消化し（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ）、電気泳動によって単離した重鎖および軽鎖をベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。７日間細胞培養した後、培養培地を高速の遠心分離にかけ、上清を濃縮し、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムにロードした。溶出バッファーを用いてタンパク質を１ステップでさらに溶出させ、標的サンプル抗体ＶＰ１０１を単離し、ＰＢＳにバッファー交換した。

２．抗体ＶＰ１０１の検出
精製したサンプルを、還元性タンパク質電気泳動ローディングバッファーおよび非還元性タンパク質電気泳動ローディングバッファーの両方に加え、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出のためにボイルした。ＶＰ１０１の電気泳動図を図１に示す。還元性タンパク質サンプルの標的タンパク質は７５ｋＤおよび２５ｋＤにあり、非還元性タンパク質サンプル（単一抗体）の標的タンパク質は２００ｋＤにある。

別段の定めがない限り、以下の実験において使用したヒト化抗体ＶＰ１０１は、この実施例の方法によって調製した。

実施例２：ヒト化抗体ＶＰ１０１のキネティックパラメーターの検出
１．ヒト化抗体ＶＰ１０１のＰＤ－１－ｍＦｃへの結合に関するキネティックパラメーターの検出
サンプル希釈バッファーは、ＰＢＳ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）であった。５μｇ／ｍＬの抗体を、約０．４ｎＭの固定高さでＡＨＣセンサーに固定化した。このセンサーを６０秒間バッファー中で平衡化し、センサーに固定化した抗体を１２０秒間０．６２～５０ｎＭ（３倍勾配希釈）の濃度でＰＤ－１－ｍＦｃに結合させ、次いで、抗原と抗体を３００秒間バッファー中で解離させた。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。データ収集ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０であった。抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および対照抗体ニボルマブのＰＤ－１－ｍＦｃへの結合に関するキネティックパラメーターを表２に示し、キネティック特性パラメーターの検出結果を図２、図３、図４、図５および図６にそれぞれ示す。

Ｋ_Ｄは親和定数である；ｋｏｎは抗原と抗体の結合速度である；ｋｄｉｓは抗原と抗体の解離速度である；Ｋ_Ｄ＝ｋｄｉｓ／ｋｏｎ。

これらの結果からは、抗体ＶＰ１０１と抗体ＢｓＡｂＢ７がＰＤ－１－ｍＦｃへの親和性の点から同等であること；ＰＤ－１－ｍＦｃに対するＶＰ１０１の親和定数はＢｓＡｂＢ８よりも有意に小さく、ＶＰ１０１がより良好な結合活性を有することを示唆していること；ＶＰ１０１とＰＤ－１－ｍＦｃに関する一定の解離速度はＢｓＡｂＢ８および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１よりも有意に小さく、ＶＰ１０１が抗原により安定して結合しており、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびＢｓＡｂＢ８よりも解離速度が遅いことを示唆していることが明らかである。

２．ヒト化抗体ＶＰ１０１のＶＥＧＦ－Ｈｉｓへの結合に関するキネティックパラメーターの検出
サンプル希釈バッファーはＰＢＳ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）であった。１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ－Ｈｉｓを２０秒間ＨＩＳ１Ｋセンサーに固定化し、次いで、このセンサーを６０秒間バッファー中で平衡化し、センサーに固定化したＶＥＧＦを１２０秒間１２．３４～１０００ｎＭ（３倍勾配希釈）の濃度で抗体に結合させ、次いで、抗原と抗体を３００秒間バッファー中で解離させた。データを１：１モデルでフィッティングすることにより分析し、親和定数を得た。データ収集ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０であった。

抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８および対照抗体ベバシズマブのＶＥＧＦ－Ｈｉｓへの結合に関するキネティックパラメーターを表３に示し、キネティック特性パラメーターの検出結果を図７、図８、図９および図１０にそれぞれ示す。

これらの結果から、抗体ＶＰ１０１と抗体ＢｓＡｂＢ７が抗原への親和性の点から同等であり、ＶＰ１０１の親和定数がＢｓＡｂＢ８および対照抗体ベバシズマブよりも有意に小さく、ＶＰ１０１がより良好な結合活性を有していることを示唆していること；ＶＥＧＦ－Ｈｉｓに対するＶＰ１０１の解離速度定数がＢｓＡｂＢ８よりも有意に小さく、ＶＰ１０１が抗原により安定して結合しており、ＢｓＡｂＢ８よりも解離速度が遅いことを示唆していることが明らかである。

実施例３：ＥＬＩＳＡによる、抗体ＶＰ１０１の抗原への結合活性の検出
１．間接ＥＬＩＳＡによる、抗体ＶＰ１０１の抗原ＶＥＧＦＡ－ｈｉｓへの結合活性の検出
その方法を以下のとおり明示する：
マイクロプレートをＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓでコーティングし、２時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、マイクロプレートを２時間、１％ ＢＳＡでブロッキングした。洗浄後、マイクロプレートに勾配的に希釈した抗体を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。洗浄後、マイクロプレートに、酵素標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体希釈標準溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、マイクロプレートに、光の非存在下で５分間、発色用のＴＭＢ発色溶液を加え、次いで、停止液を加え、発色反応を停止させた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに直ちに入れ、マイクロプレートの各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで記録した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１を用いてデータを分析し、プロセシングした。

抗体ＶＰ１０１の抗原ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓへの結合についての検出結果を図１１に示す。各用量での吸光度を表４に示す。抗体の結合ＥＣ_５０は、横座標としての抗体濃度と、縦座標としての吸光度を利用してカーブフィッティングにより算出し、結果を下記の表４に示す。

この結果から、抗体ＶＰ１０１がＶＥＧＦＡタンパク質に効率的に結合することができ、その結合効率が用量依存的であり、２つの抗体がヒトＶＥＧＦＡへの結合活性の点から同等であることが明らかである。

２．間接ＥＬＩＳＡによる、抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の抗原ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓへのそれぞれの結合活性の検出
その方法を以下のとおり明示する：
マイクロプレートをＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、マイクロプレートを、２時間、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳに溶解したもの）でブロッキングした。洗浄後、マイクロプレートに勾配的希釈した抗体を加え、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、マイクロプレートに、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０９８）希釈標準溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、マイクロプレートに、光の非存在下で５分間、発色用のＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を加え、次いで、停止液を加えて発色反応を停止させた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに直ちに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで記録した。ＳｏｆｔＭａｘプロ６．２．１を使用してデータを分析し、プロセシングした。

抗体ＶＰ１０１の抗原ＶＥＧＦＡ－Ｈｉｓへの結合の結果を図１２に示す。各用量の吸光度を表５に示す。抗体の結合ＥＣ_５０は、横座標としての抗体濃度と、縦座標としての吸光度値を利用して、カーブフィッティングにより算出し、結果を下記の表５に示す。

これらの結果から、抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８およびベバシズマブはすべて、ＶＥＧＦタンパク質に効率的に結合することができ、それらの結合効率は用量依存的であり、抗体ＶＰ１０１は、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８よりもヒトＶＥＧＦへの高結合活性を有することが明らかである。

３．間接ＥＬＩＳＡによる、抗体ＶＰ１０１の抗原ＰＤ－１への結合活性の検出
その方法を以下のとおり明示する：
マイクロプレートをヒトＰＤ－１－ｍＦｃでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。２時間３７℃で、１％ ＢＳＡによりブロッキングした後、マイクロプレートに抗体を加え、次いで、３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロプレートを洗浄し、軽く叩いて乾燥させた後、ＨＲＰ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）を加え、マイクロプレートを３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロプレートを洗浄し、軽く叩いて乾燥させた後、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を発色のために５分間加え、次いで、停止液を加えて発色現象を停止させた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに直ちに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで記録した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ
６．２．１を使用してデータを分析し、プロセシングした。

抗体ＶＰ１０１の抗原ＰＤ－１への結合の検出結果を図１３に示す。各用量の吸光度を表６に示す。結合抗体ＶＰ１０１の定量分析によって、曲線シミュレーションを実施し、抗体の結合効率ＥＣ_５０を得て、それを下記の表６に示す。

この結果から、抗体ＶＰ１０１がＰＤ－１タンパク質に効率的に結合することができ、その結合効率が用量依存的であることが明らかである。

４．間接ＥＬＩＳＡによる、抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の抗原ＰＤ－１へのそれぞれの結合活性の検出
その方法を以下のとおり明示する：
マイクロプレートをヒトＰＤ－１－ｍＦｃでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。２時間３７℃で１％ ＢＳＡによりブロッキングした後、マイクロプレートに抗体を加え、次いで、３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロプレートを洗浄し、軽く叩いて乾燥させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０９８）を加え、マイクロプレートを３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロプレートを洗浄し、軽く叩いて乾燥させた後、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を５分間発色のために加え、次いで、停止液を加えて、発色現象を停止させた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに直ちに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで記録した。ＳｏｆｔＭａｘプロ６．２．１を使用してデータを分析し、プロセシングした。

抗体ＶＰ１０１の抗原ＰＤ－１への結合の検出結果を図１４に示す。各用量の吸光度を表７に示す。結合抗体ＶＰ１０１の定量分析によって、曲線シミュレーションを実施して抗体の結合効率ＥＣ_５０を得て、これを下記の表７に示す。

この結果から、抗体ＶＰ１０１がＰＤ－１タンパク質に効率的に結合することができ、その結合効率が用量依存的であり、抗体ＶＰ１０１がＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８よりもヒトＰＤ－１に高結合活性を有することが明らかである。

５．競合ＥＬＩＳＡによる、抗原ＶＥＧＦＡへの結合に対するＶＥＧＦＲ２との競合における抗体ＶＰ１０１の活性の検出
その方法は、詳しくは以下のとおりである：
マイクロプレートをＶＥＧＦ－Ｈｉｓでコーティングし、２時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、マイクロプレートを３７℃で１時間、１％ ＢＳＡでブロッキングした。洗浄後、マイクロプレートに、勾配的に希釈した抗体およびヒトＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ－ｍＦｃ－ｂｉｏ（最終濃度：０．０２μｇ／ｍＬ）を加え、２時間室温でインキュベートした。洗浄後、マイクロプレートに、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンＳＡ－ＨＲＰ（１：４０００）希釈標準溶液を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。洗浄後、マイクロプレートを、光の非存在下で５分間発色のためのＴＭＢ発色溶液を加え、次いで、停止液を加え、発色反応を停止させた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに直ちに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで記録した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１を使用してデータを分析し、プロセシングした。

検出結果を図１５に示す。各用量の吸光度を表８に示す。結合抗体の吸光度の定量分析によって、曲線シミュレーションを実施して、抗体の結合効率ＥＣ_５０を得た（表８）。

この結果から、抗体ＶＰ１０１が抗原ＶＥＧＦＡに有効に結合することができ、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦＡへの結合を抑制し、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦＡへの結合の抑制におけるその効率が用量依存的であることが明らかである。

６．競合ＥＬＩＳＡによる、抗原ＰＤ－１への結合に対するＰＤ－Ｌ１との競合における抗体ＶＰ１０１の検出
その方法は、詳しくは以下のとおりである：
マイクロプレートをＰＤ－１－ｈＦｃでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートを２時間１％ ＢＳＡでブロッキングした後、異なる濃度の抗体をそれぞれ１０分間ＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃと混合した（希釈濃度については表１０を参照）。３０分間３７℃でインキュベーションした後、マイクロプレートを洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。次いで、酵素標識した二次抗体を加え、マイクロプレートを３０分間３７℃でインキュベートした。マイクロプレートを洗浄し、軽く叩いて乾燥させた後、ＴＭＢを５分間発色のために加え、次いで、停止液を加えて、発色現象を停止させた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに直ちに入れ、マイクロプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで記録した（表１０を参照）。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１を使用してデータを分析し、プロセシングした。

検出結果を図１６に示す。各用量の吸光度を表９に示す。結合抗体ＶＰ１０１の定量分析によって、曲線シミュレーションを実施し、抗体の結合効率ＥＣ_５０を得た（表９）。

この結果からは、抗体ＶＰ１０１が抗原ＰＤ－１に有効に結合することができ、リガンドＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を抑制し、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合の抑制におけるその効率は用量依存的であることが明らかである。

実施例４：抗体ＶＰ１０１の細胞膜表面抗原への結合
最初に、ＰＤ－１抗原を発現する２９３Ｔ細胞を構築し、次いで、抗体の細胞膜表面抗原に対する特異的結合能力をフローサイトメトリーによって分析し、確認した。

１．ＰＤ－１抗原を発現する２９３Ｔ細胞の構築
ＰＤ－１のベクターｐＬｅｎｔｉ６．３－ＰＤ－１（ベクターｐＬｅｎｔｉ６．３はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＰＤ－１を安定して発現するクローン群２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞をスクリーニングによって得た。

２．抗体の細胞表面抗原への結合の検出
前ステップで得られた、抗原を発現する２９３Ｔ－ＰＤ－１を、従来のパンクレアチン消化法によってパンクレアチンで消化し、それぞれのコレクションチューブ中の細胞数が２×１０^５となるようにした。ＰＢＳＡ（１％ ＢＳＡ）で勾配的に希釈した濃度を有する抗体希釈溶液を、それぞれ、２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞と氷上で２時間インキュベートし、次いで、それぞれのチューブにＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５００）１００μＬを加え、１時間氷上でインキュベートした。次いで、ＰＢＳを洗浄に使用し、３００μＬのＰＢＳＡを使用して細胞を再懸濁し、蛍光シグナル（ＭＦＩ）をフローサイトメーターのＦＩＴＣチャネルで検出した。

結果を図１７に示し、各濃度のＭＦＩ値を表１０に示す。結合１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体の蛍光定量化分析およびカーブフィッティングによって、ＶＰ１０１抗体の結合ＥＣ_５０は３．５ｎＭであると算出された。

この結果からは、ＶＰ１０１抗体が２９３Ｔ－ＰＤ－１宿主細胞表面上のＰＤ－１抗原に有効に結合することができ、その結合効率が用量依存的であり、ベバシズマブが２９３Ｔ－ＰＤ－１に対する結合活性を有しておらず、ＶＰ１０１の２９３Ｔ－ＰＤ－１への結合が特異的であることを示唆していることが明らかである。

３．抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の細胞表面抗原への結合は、本実施例のステップ２で説明した実験手順を参照することによって検出した。

結果を図１８に示し、各濃度のＭＦＩ値を表１１に示す。結合抗体の蛍光定量化分析およびカーブフィッティングによって、ニボルマブ、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の結合性ＥＣ_５０値が、それぞれ、７．８５３ｎＭ、３．６０７ｎＭ、７．８９６ｎＭ、９．９４３ｎＭおよび１０．６１０ｎＭであると算出された。

この結果からは、ＶＰ１０１抗体が用量依存的様式で２９３Ｔ－ＰＤ１の膜表面ＰＤ－１に結合することができることが明らかである。ベバシズマブは２９３Ｔ－ＰＤ－１に対して結合活性を有しておらず、ＶＰ１０１の２９３Ｔ－ＰＤ－１への結合が特異的であることを示唆している。

実施例５：抗体ＶＰ１０１の細胞膜表面抗原への競合的結合
１．競合的フローサイトメトリー法を、細胞膜表面抗原ＰＤ－１への結合に対するＰＤ－Ｌ１との競合におけるＶＰ１０１のＥＣ_５０を検出するために採用し、この方法を以下のとおり明示する：
２９３Ｔ－ＰＤ－１細胞を従来の方法で消化し、それぞれについて３００，０００個の細胞を含むいくつかのサンプルに分け、次いで、それらを遠心分離および洗浄に供した。次いで、それぞれのチューブに、対応する勾配的に希釈した抗体１００μＬを加え、氷上で３０分間インキュベートした；次いで、１００μＬのＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃをそれぞれのチューブに加え、２０ｎＭの最終濃度に達するようにその混合物を十分に混合し、次いで、氷上で１時間インキュベートした。次いで、５００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、その混合物を５分間５６００ｒｐｍの遠心分離にかけ、上清を除去した。その後、１：５００の比で希釈したＦＩＴＣコート抗マウス抗体１００μＬをそれぞれのチューブに加え、その混合物を十分に混合した後、光の非存在下で４０分間氷上にてインキュベートした。次いで、その混合物を遠心分離にかけ、洗浄し、再懸濁し、その後、試験用のローディングチューブに移した。

結果を図１９に示し、各濃度のＭＦＩ値を表１２に示す。蛍光定量化分析およびカーブフィッティングによって、抗体ＶＰ１０１および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の結合ＥＣ_５０値は、それぞれ、８．３３ｎＭおよび４．３７ｎＭであると算出された。

この結果から、ＶＰ１０１抗体は、用量依存的様式で、２９３Ｔ－ＰＤ－１宿主細胞の表面上のＰＤ－１へのＰＤＬ－１の結合を有効に遮断することができることが明らかである。

２．細胞膜表面抗原ＰＤ－１への結合に対するＰＤ－Ｌ１との競合におけるＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびニボルマブのＥＣ_５０値を、競合的フローサイトメトリーを使用することにより、またこの実施例のステップ１で説明した実験手順を参照することにより検出した。

結果を図２０に示し、各濃度のＭＦＩ値を表１３に示す。蛍光定量化分析およびカーブフィッティングによって、抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７、ＢｓＡｂＢ８、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびニボルマブの競合的結合ＥＣ５０値が、それぞれ、１５．０４ｎＭ、２２．２５ｎＭ、１９．２５ｎＭ、９．２１ｎＭおよび９．７２ｎＭであると算出された。

この結果から、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の活性が、ＰＤ－１を標的とする市販抗体ニボルマブの活性と同等であり、また二官能性抗体ＶＰ１０１の活性より優れていることが明らかである。抗体ＶＰ１０１の活性は、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の活性よりも優れている。

実施例６：ＮＦＡＴシグナル経路を活性化するためのＶＥＧＦブロッキングにおける抗体ＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８の中和生物活性の検出
１．２９３Ｔ－ＮＦＡＴ－（ｏｐｖ）ＫＤＲ（Ｃ７）細胞の構築
ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）ベクターｐＣＤＨ－ＫＤＲＦＬ（ＯＰＶ）－ＧＦＰ－Ｐｕｒｏ（ベクターｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ＰｕｒｏはＹｏｕｂｉｏから購入）およびＮＦＡＴベクターｐＮＦＡＴ－ｌｕｃ－ｈｙｇｒｏ（ベクターｐＧＬ４－ｌｕｃ２Ｐ－ｈｙｇｒｏはＰｒｏｍｅｇａから購入）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＫＤＲおよびＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現するクローン群の２９３Ｔ－ＮＦＡＴ－（ｏｐｖ）ＫＤＲ（Ｃ７）細胞をスクリーニングによって得た。

２．２９３Ｔ－ＮＦＡＴ－（ｏｐｖ）ＫＤＲ（Ｃ７）細胞を回収し、５分間遠心分離にかけ、上清を除去した；ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ培地を使用して細胞を再懸濁し、細胞数をカウントし、細胞の生存率を検出した；次いで、細胞濃度を適正範囲にあるように調節し、５００００細胞／５０μＬの細胞懸濁液をブラック９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加えた；
対応する抗体（最終濃度は３００、１００、１０、２、０．２、０．０２、０．００２ｎＭ）およびＶＥＧＦ（最終濃度は３０ｎｇ／ｍＬ）を実験計画に従って希釈し、ＶＥＧＦを標的とする抗体を、室温で１時間、ＶＥＧＦとプレインキュベートした後、細胞に加えた。ブランクおよびアイソタイプの対照（それぞれのウェルの最終容量は１００μＬ）を設計し、５％ ＣＯ_２で４時間、３７℃の二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートした；５０μＬのルシフェラーゼアッセイ系をそれぞれのウェルに加え、相対的蛍光ユニット（ＲＬＵ）を５分以内に多重標識マイクロプレート試験装置によって検出した。

実験結果を図２１に示し、各抗体に対するＥＣ_５０値を表１４に示す。

この結果から、ＶＰ１０１のＥＣ_５０は１．２４０ｎＭであり、ＢｓＡｂＢ７のＥＣ_５０は１．２１７ｎＭであり、ＢｓＡｂＢ８のＥＣ_５０は１．７２８ｎＭであり、ベバシズマブのＥＣ_５０は０．７７３ｎＭであることが明らかであり、また実験結果から、ＮＦＡＴシグナル経路を活性化するためのＶＥＧＦのブロッキングにおけるＶＰ１０１およびＢｓＡｂＢ７の活性がＢｓＡｂＢ８より良好であることが明らかである。

実施例７：ＶＥＧＦＡ誘導されたＨＵＶＥＣ細胞増殖を抑制するＶＰ１０１抗体の実験
良好な増殖状態のＨＵＶＥＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌから購入）を、細胞濃度が１．５×１０^４／ｍＬとなるように調整した後、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、次いで、インキュベーター内で、２４時間３７℃、５％ ＣＯ_２濃度でインキュベートした。次いで、細胞がウェルに付着したことを確認した後、培養培地を廃棄した。その後、１６４０を含む２％ ＦＢＳを使用することにより調製した２０ｎＭのＶＥＧＦＡを、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、異なる濃度の抗体を添加した後、７２時間インキュベートした。７２時間後、培養培地を廃棄し、ＭＴＴを加えた。４時間後、ＭＴＴを廃棄し、ＤＭＳＯを加えた後、マイクロプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍでＯＤ値を測定した。

結果を図２２に示した。この結果から、ヒト化抗体ＶＰ１０１およびベバシズマブは両方とも、用量依存的様式でＶＥＧＦＡ誘導されたＨＵＶＥＣ細胞増殖を有効に抑制することができ、ＶＥＧＦＡ誘導されたＨＵＶＥＣ細胞増殖の抑制におけるＶＰ１０１の薬理活性は、同じ用量のベバシズマブより高いことが明らかである。

実施例８：混合リンパ球反応におけるサイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の分泌の促進
１．ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＶＰ１０１、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびニボルマブのＩＦＮ－γ分泌の促進
ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単離し、６日間誘導するためにＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２００－０４、１０００Ｕ／ｍＬ）およびＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３００－０３、１０００Ｕ／ｍＬ）に加え、次いで、ＴＮＦ－α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３００－０１Ａ、２００Ｕ／ｍＬ）を、３日間誘導するためにさらに加え、成熟ＤＣ細胞を得た。

共培養の日に、新鮮なＰＢＭＣを別のドナーの末梢血から単離し、得られた成熟ＤＣ細胞を、別のドナーの新鮮な単離ＰＢＭＣと１：１０の比で混合し、それと同時に、異なる濃度の抗体（対照としてｈＩｇＧ）を加えた。５～６日間共培養した後、細胞上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅから購入）を使用して、ＩＦＮ－γ含有量についてアッセイした。

ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＩＦＮ－γ分泌に対するＶＰ１０１の効果を図２３に示す。図２３から分かるように、ＶＰ１０１は、用量依存的様式でＩＦＮ－γ分泌を効果的に促進することができる。さらに、３０ｎＭおよび３００ｎＭの用量では、ＶＰ１０１は、同じ１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１よりＩＦＮ－γ分泌の促進においてより大きな活性を有しており、３０ｎＭの用量レベルでは、同じニボルマブよりＩＦＮ－γ分泌の促進においてより大きな活性を有している。

２．ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８ｂによるＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌の促進
この実施例のステップ１を実験方法について参照し、すなわち、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単離し、６日間誘導するためにＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２００－０４、１０００Ｕ／ｍＬ）およびＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３００－０３、１０００Ｕ／ｍＬ）に加え、次いで、ＴＮＦ－α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３００－０１Ａ、２００Ｕ／ｍＬ）を３日間誘導するためにさらに加え、成熟ＤＣ細胞を得た。

共培養の日に、新鮮なＰＢＭＣを別のドナーの末梢血から単離し、得られた成熟ＤＣ細胞を、別のドナーの新鮮な単離ＰＢＭＣと１：１０の比で混合し、それと同時に、異なる濃度の抗体（対照としてｈＩｇＧ）を加えた；５～６日間共培養した後、細胞上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅから購入）を使用して、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ含有量についてアッセイした。

ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＩＦＮ－γ分泌に対するＶＰ１０１の効果を図２４に示す。図２４から分かるように、ＶＰ１０１は、用量依存的様式でＩＦＮ－γ分泌を効果的に促進することができる。ＩＦＮ－γの分泌促進におけるＶＰ１０１の薬理活性は、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８よりも有意に良好である。

ＤＣ細胞およびＰＢＭＣ細胞の混合培養系におけるＩＬ－２分泌に対するＶＰ１０１の効果を図２５に示す。図２５から分かるように、ＶＰ１０１は、用量依存様式でＩＬ－２の分泌を効果的に促進することができ、ＩＬ－２の分泌促進におけるＶＰ１０１の薬理活性は、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８よりも良好である。

３．ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞の混合培養系におけるＶＰ１０１、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびニボルマブによるＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌促進
ＰＤ－Ｌ１を、レンチウイルス感染を介してＲａｊｉ細胞に安定的にトランスフェクトし、ＰＤ－Ｌ１を安定して発現するＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞が投与およびスクリーニングの後に得られた；ＰＢＭＣを、ＳＥＢによる２日間の刺激の後に、マイトマイシンＣ処理したＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１と共に培養した。

結果を図２６および図２７に示す。この結果から、ＶＰ１０１は、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌を効果的に促進することができ、３００ｎＭの用量レベルでは、ＩＬ－２の分泌促進におけるＶＰ１０１の活性が等量の１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１およびニボルマブの活性よりも有意に良好であることが明らかである。

検討したアイソタイプの対照抗体は、ヒト抗ニワトリリゾチーム（抗ＨＥＬ、すなわちヒトＩｇＧ、ｈＩｇＧと略記）であり、これは上記の調製実施例６で説明しているようにして調製した。

４．ＰＢＭＣ細胞およびＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞の混合培養系におけるＶＰ１０１、ＢｓＡｂＢ７およびＢｓＡｂＢ８によるＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌促進は、この実施例のステップ３で説明した実験方法を参照することにより検討した。

ＩＦＮ－γの分泌の結果を図２８に示す。結果からは、ＶＰ１０１が用量依存的様式でＩＦＮ－γの分泌を効果的に促進することができることが明らかである。同時に、ＶＰ１０１は、同じ用量のＢｓＡｂＢ７よりも有意に良好であり、一方、ＶＰ１０１の薬理活性は、３ｎＭおよび３０ｎＭの用量レベルでＢｓＡｂＢ８の薬理活性よりも有意に良好である。

ＩＬ－２の分泌の結果を図２９に示す。結果からは、ＶＰ１０１が用量依存的様式でＩＬ－２の分泌を効果的に促進することができることが明らかである。同時に、ＶＰ１０１の薬理活性は、３ｎＭおよび３００ｎＭの用量でＢｓＡｂＢ７の薬理活性よりも有意に良好であり、一方、ＶＰ１０１は同じ用量のＢｓＡｂＢ８と同等である。

実施例９：ＶＰ１０１によるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖の抑制実験
ＶＰ１０１のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍抑制活性を検出するために、Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣから購入したヒト神経膠腫細胞）を、５～７週齢のメスＳｃｉｄ Ｂｅｉｇｅマウス（Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒから購入）にまず皮下播種し、投与のモデリングおよび特定様式を表１５に示した。投与後、腫瘍の各群の長さおよび幅を測定し、腫瘍体積を算出した。

結果を図３０に示す。この結果から、アイソタイプ対照抗体ｈＩｇＧ（調製方法は調製実施例６の方法と同じ）と比較して、異なる用量のベバシズマブおよびＶＰ１０１がマウス腫瘍の増殖を効果的に抑制することができ、高用量のＶＰ１０１が低用量のＶＰ１０１よりも腫瘍の抑制においてより良好であることが明らかである。

さらに、図３１から明らかなように、ＶＰ１０１は、腫瘍担持マウスの体重に影響を及ぼさない。

本発明の内容はその開示した実施形態の完全で明瞭な説明を提供しているが、それはそれらに限定されない。当業者にとって、本発明への改変および置き換えはこれらの説明のガイダンスにより可能であり、またそのような改変および置き換えは本発明の範囲内に含まれる。本発明の完全な範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の等価物により提供される。

Claims (26)

1. ＶＥＧＦＡを標的とする第１のタンパク質機能領域と、
   ＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能領域
   を含む二重特異性抗体であって；
   前記第１のタンパク質機能領域が、抗ＶＥＧＦＡ抗体またはその抗原結合断片、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記抗ＶＥＧＦＡ抗体の重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記抗ＶＥＧＦＡ抗体の軽鎖可変領域であり；
   前記第２のタンパク質機能領域が、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域、配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域である、
   二重特異性抗体。
2. 前記抗ＶＥＧＦＡ抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびダイアボディから選択され；
   ならびに／あるいは、
   前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体およびダイアボディから選択される、
   請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. 前記第１のタンパク質機能領域が、免疫グロブリン、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記免疫グロブリンの重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域であり；前記第２のタンパク質機能領域が、一本鎖抗体、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記一本鎖抗体の重鎖可変領域、および配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域であり；
   または、
   前記第１のタンパク質機能領域が、一本鎖抗体、配列番号２１～２３にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記一本鎖抗体の重鎖可変領域、および配列番号２４～２６にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域であり；前記第２のタンパク質機能領域が、免疫グロブリン、配列番号１５～１７にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含む前記免疫グロブリンの重鎖可変領域、および配列番号１８～２０にそれぞれ記載されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む前記免疫グロブリンの軽鎖可変領域である、
   請求項１に記載の二重特異性抗体。
4. 前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７に記載されており；前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；
   または、 前記一本鎖抗体の前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号９に記載されており、前記一本鎖抗体の前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号１１に記載されており；前記免疫グロブリンの前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号５に記載されており、前記免疫グロブリンの前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号７に記載されている、
   請求項３に記載の二重特異性抗体。
5. 前記免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり；好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
6. ２つの一本鎖抗体が存在しており、それぞれの一本鎖抗体の１つの末端が、前記免疫グロブリンの前記２つの重鎖のうちの１つのＣ末端またはＮ末端に連結されている、請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
7. 前記免疫グロブリンが、マウス以外の種に由来した、例えばヒト抗体に由来した非ＣＤＲ領域を含む、請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
8. 前記免疫グロブリンがヒト抗体に由来した定常領域を含み；
   好ましくは、前記免疫グロブリンの前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域から選択される、
   請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
9. 前記免疫グロブリンの前記重鎖定常領域がヒトＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域またはヒトＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域であり、その軽鎖定常領域がヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域である、
   請求項３または４に記載の二重特異性抗体。
10. 前記第１のタンパク質機能領域および前記第２のタンパク質機能領域が、直接的に、またはリンカー断片によって連結され；
    好ましくは、前記リンカー断片が（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、式中、ｍが正の整数、例えば１、２、３、４、５、または６である、
    請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
11. 前記第１のタンパク質機能領域および前記第２のタンパク質機能領域の数が、それぞれ独立して、１、２またはそれ以上である、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
12. 前記二重特異性抗体が１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１５ｎＭ未満、または０．１４ｎＭ未満のＥＣ_５０でＶＥＧＦＡタンパク質に結合し；好ましくは、前記ＥＣ_５０が間接的ＥＬＩＳＡによって検出され；
    および／または、
    前記二重特異性抗体が１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１７ｎＭ未満、０．１６ｎＭ未満または０．１５ｎＭ未満のＥＣ_５０でＰＤ－１タンパク質に結合し；好ましくは、前記ＥＣ_５０が間接的ＥＬＩＳＡによって検出される、
    請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。
14. 請求項１３に記載の前記単離された核酸分子を含む、ベクター。
15. 請求項１３に記載の前記単離された核酸分子または請求項１４に記載の前記ベクターを含む、宿主細胞。
16. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１５に記載の前記宿主細胞を適切な条件で培養することと、前記二重特異性抗体を前記細胞培養物から単離することを含む、方法。
17. 二重特異性抗体と複合部分を含む複合体であって、前記二重特異性抗体が請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体であり、前記複合部分が検出可能な標識であり；好ましくは、前記複合部分が放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素である、複合体。
18. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または請求項１７に記載の前記複合体を含む、キットであって；
    好ましくは、前記キットが、前記二重特異性抗体に特異的に結合することが可能な二次抗体をさらに含み；任意選択で、前記二次抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質または酵素をさらに含む、キット。
19. サンプル中のＶＥＧＦＡおよび／またはＰＤ－１の存在またはレベルを検出するためのキットの調製における、請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体の使用。
20. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または請求項１７に記載の前記複合体を含み、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
21. 悪性腫瘍を予防および／または治療するための医薬の調製における請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または請求項１７に記載の前記複合体の使用であって、好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、例えば非小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍および白血病から選択される、使用。
22. （１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルを検出するための医薬もしくは薬剤、
    ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
    ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
    血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減するための医薬もしくは薬剤、
    血管内皮細胞増殖を抑制するための医薬もしくは薬剤、または、
    腫瘍血管新生を遮断するための医薬もしくは薬剤；
    ならびに／あるいは、
    （２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断するための医薬もしくは薬剤、
    ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートするための医薬もしくは薬剤、
    生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減するための医薬もしくは薬剤、
    Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進するための医薬もしくは薬剤、または、
    Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進するための医薬もしくは薬剤
    の調製における、請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体、または請求項１７に記載の前記複合体の使用。
23. 有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体または請求項１７に記載の前記複合体を細胞に投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでの方法またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    （１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルを検出する方法、
    ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断する方法、 ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルをダウンレギュレートする方法、
    血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激を軽減する方法、
    血管内皮細胞増殖を抑制する方法、または、
    腫瘍血管新生を遮断する方法；
    ならびに／あるいは、
    （２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断する方法、
    ＰＤ－１の活性もしくはレベルをダウンレギュレートする方法、
    生体におけるＰＤ－１の免疫抑制を軽減する方法、
    Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌を促進する方法、または、
    Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌を促進する方法、
    から選択される、方法。
24. 有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体または請求項１７に記載の前記複合体を必要とする対象に投与することを含む、悪性腫瘍を予防および／または治療する方法であって、好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、例えば非小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍および白血病から選択される、方法。
25. 悪性腫瘍の予防および／または治療において使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体または請求項１７に記載の前記複合体であって、好ましくは、前記悪性腫瘍が結腸がん、直腸がん、肺がん、例えば非小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、皮膚がん、神経膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍および白血病から選択される、二重特異性抗体または複合体。
26. （１）サンプル中のＶＥＧＦＡのレベルの検出、
    ＶＥＧＦＡのＶＥＧＦＲ２への結合の遮断、
    ＶＥＧＦＡの活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
    血管内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦＡの刺激の軽減、
    血管内皮細胞増殖の抑制、または、
    腫瘍血管新生の遮断；
    ならびに／あるいは、
    （２）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合の遮断、
    ＰＤ－１の活性もしくはレベルのダウンレギュレート、
    生体におけるＰＤ－１の免疫抑制の軽減、
    Ｔリンパ球におけるＩＦＮ－γ分泌の促進、または、
    Ｔリンパ球におけるＩＬ－２分泌の促進
    において使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記二重特異性抗体または請求項１７に記載の前記複合体。