JP2023550673A

JP2023550673A - ヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用

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Publication number: JP2023550673A
Application number: JP2022578626A
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Inventors: 程▲漢▼兵
Original assignee: 深▲セン▼市▲邁▼加瑞生物技▲術▼有限公司
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2041-06-25
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Abstract

本発明は生物技術分野に関し、特にヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体に関し、前記二重特異性抗体が少なくとも第１タンパク質鎖と第２タンパク質鎖とを含み、前記第１タンパク質鎖は第１タンパク機能領域の部分または全部の構造、および／または、第２タンパク機能領域の部分または全部の構造を含み、前記第１タンパク質機能領域はＣＤ４を標的とし、前記第２タンパク質機能領域はＴＧＦβ１を標的とし、最適化された抗ＣＤ４／抗ＴＧＦβ１の二重機能性抗体は、高い親和性、親和力および特異性を持ってヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを効率的に中和することができる。具体的には、最適化された抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－β１の二重機能性抗体は、ＩｇＧ－（Ｌ）－ＳｃＦｖ形態を代表として、より高い中和効果でヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナル伝達経路を抑制し、かつ、より低い薬物濃度で同じがん阻害効果を実現することができ、治療の理想的な候補物となる。

Description

本発明は、生物技術分野に関し、特にヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用に関する。

腫瘍、特に悪性腫瘍は、人類の健康に深刻な危害を及ぼす疾患であり、各種疾患による死亡の中では第２位を占めている。近年、環境汚染が年々深刻化し、人々の生活上のストレスが大きくなり、悪性腫瘍の発病率は年々上昇傾向にある。また、悪性腫瘍の治療効果が悪く、特に後期転移率が高く、予後がよくないものである。現在、臨床で採用されている通常の治療法、例えば放射線治療、化学療法、標的治療または手術治療はある程度病状を緩和し、生存時間を延長したが、これらの方法にはまだ大きな限界があり、治療効果だけでなく、多くの悪性腫瘍患者は依然として有効な治療方法がない現状である、例えば膵癌など。

ＴＧＦ－βは、１９８１年に初めて鑑別された（Ｒｏｂｅｒｔら、ＰＮＡＳ、７８：５３３９－５３４３．（１９８１））。トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）は、最初に正常線維芽細胞を足場非依存的な細胞に変換することから命名された多機能サイトカインである。

ＴＧＦ－βファミリーのメンバーとして、一般的にＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２とＴＧＦ－β３がある。そのうち、ヒトＴＧＦ－βとマウスＴＧＦ－βの保守性が非常に高い：ヒトＴＧＦ－β１とマウスＴＧＦ－β１との違いは１つのアミノ酸のみであり、ヒトＴＧＦ－β２とマウスＴＧＦ－β２との違いは３つのアミノ酸のみであり、ヒトＴＧＦ－β３とマウスＴＧＦ－β３とが同じである。

生物学的活性を有するＴＧＦ－βは、一般的には二量体の形で存在し、細胞表面のＴＧＦ－β ＴｙｐｅＩＩ受容体（ＴＧＦ－βＲＩＩ）と結合すると、隣接するＴＧＦ－β ｔｙｐｅＩ受容体（ＴＧＦ－βＲＩ）と結合し、共に六量体を形成する。その後、ＴＧＦ－βの結合により、ＴＧＦ－βＲＩＩセリン／トレオニンキナーゼが活性化される。このとき、ＴＧＦ－βＲＩＩはＴＧＦ－βＭＲＩ上の重要なセリンの一部をリン酸化させ、さらにそのセリン／トレオニンキナーゼを活性化する。このリン酸化過程は、下流に向かって進み、隣接するｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ）をリン酸化させ、主にＳＭＡＤ２、３、９などが含まれる（通常、Ｒ－ＳＭＡＤはＳＡＲＡタンパク質によって細胞膜の内部に固定される）。リン酸化されたＲ－ＳＭＡＤは細胞質遊離のＣｏ－ＳＭＡＤ（例えばＳＭＡＤ４）に対して極めて高い親和力を持つので、Ｒ－ＳＡＭＤ－Ｃｏ－ＳＭＤポリマーを形成する。これが細胞核に入り、転写因子とともにＤＮＡに結合し、下流遺伝子の発現を開始する（Ｓｐｏｒｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：５３２（１９８６））。

しかしながら、ＴＧＦ－βは、細胞表面の受容体に直接作用することができない。通常、受容体と結合する遊離状態のＴＧＦ－βがわずかであり、ほとんどのＴＧＦ－βは、ｌａｔｅｎｃｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｅｐｔｉｄｅ（ＬＡＰ）と結合しており、活性がないものである。ＴＧＦ－βは４つの形態があり、ＴＧＦ－β－ＬＡＰポリマーが腫瘍微小環境中のプロテアーゼ（腫瘍細胞から分泌）によって切り取られて遊離状態になった場合にのみＴＧＦ－βを活性化することができる。ＴＧＦ－βおよびその役割の一般的な総説について、対応する文献（ＪｏａｎＭａｓｓａｇｕｅ，ＴＧＦ－β ｉｎＣａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ，１３４（２）：２１５－２３０（２００８））を参照されたい。

ＴＧＦ－βは重要なサイトカインである。ＴＧＦ－βシグナル経路は細胞の成長、分化およびアポトーシスを制御することができ、細胞が正常な機能を維持するために不可欠なものである。しかし、ＴＧＦ－βは腫瘍の微小環境を制御でき、発がん性がある。悪性腫瘍細胞はＴＧＦ－βタンパク質を大量に分泌する、それががん細胞の成長と拡散を加速させる一方で、がん細胞を免疫系からの攻撃を回避させることができる。

ＴＧＦ－βは、腫瘍の発生、進展に二重役割を果たす。最初の研究では、ＴＧＦ－βは造血細胞と上皮細胞との増殖を阻害し、アポトーシスを促進することができると発見した。その後の実験では、ＴＧＦ－βは複数種の上皮性腫瘍細胞（例えば胃癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌および前立腺癌）の体外増殖に対して負の制御作用を発揮し、そのシグナル伝達経路中のいかなるタンパク質の突然変異が腫瘍細胞に選択的成長優位を持たせ、腫瘍の発生を招くことを証明した。この増殖阻害特性により、ＴＧＦ－βは、最も潜在的ながん治療薬の標的とされていた。しかし、研究が進むにつれて、ＴＧＦ－βは、腫瘍進展期には腫瘍侵襲と転移を促進することができると判明した。そのため、ＴＧＦ－βは、腫瘍の発生、進展の中で「両刃の剣」であるとある学者が指摘した（兪清翔、トランスフォーミング増殖因子－βと腫瘍転移との研究進展、世界華人消化雑誌、１４（２５）：２５３８－２５４１（２０１６））。

ＴＧＦ－βによる腫瘍成長への影響は腫瘍細胞への直接作用だけでなく、ＴＧＦ－βはがん細胞に対する免疫系の殺傷力を抑制することもできる。ＴＧＦ－βは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導し、エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｃｅｌｌ）に抑制作用を与えることができる。また、ＴＧＦ－βは、ヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）に直接作用し、それらの免疫活性を抑制することができる（ＥｄｕａｒｄＢａｔｔｌｅ
＆ＪｏａｎＭａｓｓａｇｕｅ，ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ－β ＳｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＩｍｍｕｎｉｔｙａｎｄＣａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５０（４）：９２４－９４０（２０１９））。

ＴＧＦ－βが腫瘍成長における作用に基づいて、ＴＧＦ－βシグナル経路を抑制する多くの抗体や小分子化合物を開発したが、ここ２０年以上経っても、ＴＧＦ－βを標的とした臨床的有効な薬物がなかなか開発されなかった。ＴＧＦ－β経路を標的とした化学低分子阻害剤自体には大きな毒性があり、例えば、一部のＴＧＦ－βＲＩ化学低分子阻害剤は、心臓に毒性が強い。ＴＧＦ－β活性を中和する抗体分子は、化学低分子に比べて細胞内に浸透しにくいため、安全性に大きな利点があるが、臨床的有効性が示されていない。

ＣＡＴ１９２はヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であり、主にＴＧＦ－β１の活性を中和するものであり、ＴＧＦ－β２とＴＧＦ－β３に対しては中和能力がない。これは最初、米国ケンブリッジ抗体会社（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡＴ）がァージディスプレイ技術を利用して分離して得られた抗体である。２０００年、ＣＡＴ社は米Ｇｅｎｚｙｍｅ社と連携契約を締結し、ＴＧＦ－β抗体を共同開発した。２００４年、ＣＡＴとＧｅｎｚｙｍｅ社は共同で、ＣＡＴ１９２は強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）のＩ／ＩＩ期臨床試験において、各用量の使用上安全であるが、有効性が示されていないと発表した。臨床有効性試験に失敗されたので、Ｇｅｎｚｙｍｅ社がＣＡＴ１９２を放棄し、ＴＧＦ－βを中和する抗体であるｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂの開発を開始した。現在、ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂは悪性腫瘍の治療の臨床的有効性の面で依然として進展が遅い。

ＴＧＦ－β経路制御の多様性と複雑性は、ＴＧＦ－β経路阻害剤の薬物開発に失敗した主因であると考えられる。ＴＧＦ－βの腫瘍細胞に対する二重作用、そして腫瘍細胞自体の異質性により、ＴＧＦ－βを阻害しても腫瘍の成長にはあまり効果がないと思われる。一方、ＴＧＦ－βは免疫細胞に対しても阻害的役割を果たし、腫瘍細胞が免疫系の監視から逃れるのを助ける。ＴＧＦ－βを阻害する薬物は、ＴＧＦ－βの免疫細胞に対する阻害的役割をある程度解除して腫瘍を抑制することができるが、その効果は、大量の抗腫瘍薬によって希釈される可能性がある。

遺伝子工学的方法によってＴＧＦ－β１抗体を改造し、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）上のＴＧＦ－βシグナル経路を特異的に抑制し、それによりＴＧＦ－βの免疫細胞に対する阻害的役割を解除し、抗腫瘍効果を発揮させる。
二重機能性抗体は、二重特異性抗体（ＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、免疫選別精製により生成できる同時に２つの異なる抗原を標的とする特異性抗体である。また、遺伝子工学により得ることもできる。遺伝子工学は結合部位で最適化され、合成形態の考慮および生産量などの面で対応する柔軟性と優位性がある。現在、その存在形態は４５種類を超えることが証明されている。現在開発されている複数の二重特異性抗体はＩｇＧ－ＳｃＦｖ形態、すなわちＭｏｒｒｉｓｏｎモデルであり、天然に存在するような当該ＩｇＧ形態により、抗体工学、発現、精製における優位性は、二重機能性抗体の理想的な存在形態であることが証明されている。

Ｒｏｂｅｒｔｅｔ．ａｌ．、ＰＮＡＳ、７８：５３３９－５３４３．（１９８１）Ｓｐｏｒｎｅｔ．ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：５３２（１９８６）ＪｏａｎＭａｓｓａｇｕｅ，ＴＧＦ－β ｉｎＣａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ，１３４（２）：２１５－２３０（２００８）兪清翔、トランスフォーミング増殖因子－βと腫瘍転移との研究進展、世界華人消化雑誌、１４（２５）：２５３８－２５４１（２０１６）ＥｄｕａｒｄＢａｔｔｌｅ＆ＪｏａｎＭａｓｓａｇｕｅ，ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ－β ＳｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＩｍｍｕｎｉｔｙａｎｄＣａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５０（４）：９２４－９４０（２０１９）

上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明者は、過去ＴＧＦ－β抗体の臨床上の失敗経験をまとめ、抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体を設計し、ＴＧＦ－β１を中和する抗体をヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）に特異的に標的化し、従来のＴＧＦ－β１抗体では実現できない抗腫瘍機能を実現した。

本発明の目的は、従来技術に存在する課題を解決するために、ヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用を提供することである。遺伝子工学技術により、ＴＧＦ－β１を中和する抗体と免疫細胞を標的とする抗体を二重機能性抗体に統合し、免疫細胞上のＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する。このような二重機能性抗体はＴＧＦ－βの免疫細胞の機能への阻害的役割を十分に解除し、その抗がん機能をより最大化することができる。

上記の目的およびその他の関連目的を実現するために、本発明は二重特異性抗体を提供し、前記二重特異性抗体は、少なくとも第１タンパク質鎖と第２タンパク質鎖とを含み、
前記第１タンパク質鎖は、第１タンパク質機能領域の一部または全部の構造、および／または、第２タンパク質機能領域の一部または全部の構造を含み、
前記第１タンパク質機能領域はＣＤ４を標的とし、前記第１タンパク質機能領域は抗ＣＤ４の抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
前記第２タンパク質機能領域はＴＧＦβ１を標的とし、前記第２タンパク質機能領域は抗ＴＧＦβ１の抗体またはその抗原結合フラグメントである。

本発明の第２の態様は、前記二重特異性抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。

本発明の第３の態様は、前記単離された核酸分子を含むベクターを提供する。

本発明の第４の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は前記単離された核酸分子を含むか、前記ベクターを含む。

本発明の第５の態様は、前記二重特異性抗体の発現に適した条件下で、前記宿主細胞を培養し、および細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収する手順を含む、前記二重特異性抗体の製造方法を提供する。

本発明の第６の態様は、二重特異性抗体および複合剤を含み、前記二重特異性抗体は前記二重特異性抗体であり、前記複合剤は検出可能なマーカである。好ましくは、複合剤は、小分子化合物、蛍光物質、発光物質、有色物質または酵素である。

本発明の第７の態様は、治療有効量の前記二重特異性抗体、宿主細胞または複合体を含む薬物組成物を提供する。選択的に、前記薬物組成物は、薬学的に許容される添加剤も含む。

本発明の第８の態様は、前記二重特異性抗体または複合体の、疾病を予防および／または治療するための薬物の製造における使用を提供する。前記疾病または病状は、がん、免疫介在疾患、線維化疾病、ウイルス感染性疾病、神経退行性疾病、骨再形成、腎症疾病、およびそれらの組み合わせから選択される。

本発明の第９の態様は、前記二重特異性抗体又は複合体の、悪性腫瘍を予防および／又は治療するための薬物の製造における使用を提供する。好ましくは、前記悪性腫瘍は、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、脳癌、肝臓癌、黒色腫および白血病のうちの１種または複数種から選択される。

上記のように、本発明のヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用は、以下の有益な効果を有する。

本発明の二重特異性抗体は、異なる二重特異性抗体組み合わせ形態および対応する親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）、中和効果、および抗腫瘍効果を有する。本発明に記載されたＴＧＦ－β１を高親和性、親和力および特異的に結合して中和する二機能性抗体は、より低い血清濃度でヘルパーＴ細胞のＴＧＦ－βシグナルを効率的に結合して中和し、より高い腫瘍抑制効果を得ることができる。

本発明の二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１０３、ＣＴ１０４、ＣＴ１０５、ＣＴ１０６、ＣＴ１０７、ＣＴ１０８、ＣＴ１０９、ＣＴ１１０、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２はＣＤ４によく特異的に結合することができ、ＴＧＦ－β１と結合することもでき、ＴＧＦ－β１とＴＧＦ－βＲＩＩとの結合を効果的に遮断し、ＴＧＦ－βのヘルパーＴ細胞に対する免疫抑制を特異的に解除することができる。

そのうち、ＣＴ１０２は、ヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－β１シグナルの活性化への阻害効果が最も強く、そのＩＣ５０値は２ｐＭに達し、その次はＣＴ１０１で、ＩＣ５０値は１５ｐＭに達する。

本発明のＣＴ１０２は、ＴＧＦ－β１の活性を中和する最も強い二重特異性抗体形態であり、ＩｇＧ－（Ｌ）－ＳｃＦｖという形態の抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－βＩ二重機能性抗体のＩＣ_５０はｐＭレベルに達することができ、他の形態の二重特異性抗体の１０倍ないし１００倍以上である。

ＭＣ３８結腸癌移植腫瘍モデルにより、本発明者は、非常に低い投与濃度でも、このＩｇＧ－（Ｌ）－ＳｃＦｖ形態の抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１０２は最適な抗がん効果を達成することができると発見した。

ＣＴ１０２は次の役割を果たすことができる。

ヒトヘルパーＴ細胞表面のＣＤ４分子を効果的に結合し、ＴＧＦ－βのヘルパーＴ細胞への免疫抑制を解除する。

ヘルパーＴ細胞を効果的に活性化させ、それによって一連の免疫細胞を活性化させ、腫瘍の成長を阻害する。

肝癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、腎癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、胃癌、結腸癌、直腸癌などの悪性腫瘍を予防・治療するための薬物の製造に用いる可能性が期待される。

本発明の二重特異性抗体ＣＴ１０１は、ＣＤ４に特異的に結合し、ヘルパーＴ細胞に特異的に結合することができる。同時に、ＣＴ１０１はＴＧＦβ１と結合し、ＴＧＦβ１とＴＧＦβＲＩＩとの結合を効果的に遮断し、さらにＴＧＦβのヘルパーＴ細胞への免疫抑制を特異的に解除することができる。

図１は、二重機能性抗体ＣＴ１０２のＩｇＧ－（Ｌ）－ＳｃＦｖ形態の構造を概略的に示す図である。図２は、二重機能性抗体の抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－β１の各種特異性抗体の組み合わせ形態の構造を概略的に示す図である。図３は、二価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１０１および一価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１１０、ＣＴ１１１、およびＣＴ１１２のＨＥＫ２９３細胞ＴＧＦ－βシグナル経路への阻害的役割を示す図である。図４は、二価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１０１および一価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１１０、ＣＴ１１１、およびＣＴ１１２のヒトＣＤ４分子を安定発現するＨＥＫ２９３細胞ＴＧＦ－βシグナル経路への阻害的役割を示す図である。図５は、各種二価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体のヒトＣＤ４分子を安定発現するＨＥＫ２９３細胞ＴＧＦ－βシグナル経路への阻害的役割を示す図である。図６は、二価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２および一価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１１１、ＴＣ１１２がＣＤ４と結合する場合の動特性パラメータ試験結果を示す図である。図７は、二価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２および一価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１１１、ＴＣ１１２がＴＧＦ－β１と結合する場合の動特性パラメータ試験結果を示す図である。図８は、二価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２および一価抗ＴＧＦ－β１二重機能性抗体ＣＴ１１１、ＴＣ１１２がＣＤ４とＴＧＦ－β１と結合する場合の概略図である。図９は、ＣＴ１０１、ＴＣ１０２、ＴＧＦ－β１抗体および対照抗体の構造を示す概略図である。図１０は、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによって検出されたＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＴＧＦ－β１抗体と対照抗体のヒト化ＣＤ４マウス体内でのＣＤ４Ｔ細胞との結合状態を示す図である。図１１は、二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２の単用量２００μｇ尾静脈注射後の半減期を確認するための薬物動態試験の結果を示す図である。図１２は、二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２の単用量２０μｇ尾静脈注射後の半減期を確認するための薬物動態試験の結果を示す図である。図１３は、ＭＣ３８結腸癌移植腫瘍に対する単用量２００μｇ（合計４用量、５日／回）の抗体治療の抑制効果を示す。治療抗体として、対照抗体、ＴＧＦ－β１抗体および二重機能性抗体ＣＴ１０１とＣＴ１０２がある。図１４は、ＭＣ３８結腸癌移植腫瘍に対する単用量２０μｇ（合計４用量、５日／回）の抗体治療の抑制効果を示す。治療抗体として、対照抗体、ＴＧＦ－β１抗体および二重機能性抗体ＣＴ１０１とＣＴ１０２がある。図１５は、ＥＭＴ－６乳癌移植腫瘍に対する異なる抗体治療の抑制効果を示す。治療抗体として、対照ＩｇＧ、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＣＤ８／抗ＴＧＦβ二機能性抗体、抗ＣＤ６４／抗ＴＧＦβ二重機能性抗体および抗ＣＤ４／抗ＴＧＦβ二重機能性抗体がある。図１６は、二重機能性抗体ＣＴ１０１のＩｇＧ－ＳｃＦｖ形態（Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデル）の構造を示す概略図である。図１７は、二重機能性抗体ＣＴ１０１のＩｇＧ－ＳｃＦｖ形態（Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデル）のアミノ酸配列を示す。そのうち、下線部分のアミノ酸は、抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲ領域である。図１８は、二重機能性抗体ＣＴ１０１（ＩｇＧ－ＳｃＦｖ形態）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ試験結果を示す。左図は還元型タンパク質電気泳動結果であり、右図は非還元型タンパク質電気泳動結果である。図１９は、二重機能性抗体ＣＴ１０１（ＩｇＧ－ＳｃＦｖ形態）がモレキュラーシーブを流れる場合の高速液体クロマトグラフィーである。図２０は、二重機能性抗体ＣＴ１０１がＣＤ４と結合する場合の動特性パラメータ試験結果を示す図である。図２１は、二重機能性抗体ＣＴ１０１がＴＧＦβ１と結合する場合の動特性パラメータ試験結果を示す図である。図２２は、間接ＥＬＩＳＡ法によって測定した二重機能性抗体ＣＴ１０１、抗ＴＧＦβ１抗体ＣＡＴ１９２がＴＧＦβ１タンパク質と結合する定数ＥＣ５０を示す図である。図２３は、間接ＥＬＩＳＡ法によって測定した二重機能性抗体ＣＴ１０１、抗ＣＤ４抗体ＩｂａｌｉｚｕｍａｂがＣＤ４タンパク質と結合する定数ＥＣ５０を示す図である。図２４は、競合ＥＬＩＳＡ法によって測定した二重機能性抗体ＣＴ１０１、抗ＴＧＦβ１抗体ＣＡＴ１９２がＴＧＦβＲＩＩと競合してＴＧＦβ１と結合する活性を示す図である。図２５は、ＦＡＣＳフローサイトメトリーによって測定された二重機能性抗体ＣＴ１０１、抗ＣＤ４抗体ＩｂａｌｉｚｕｍａｂがＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞表面のＣＤ４タンパク質と結合する定数ＥＣ５０を示す図である。図２６は、二重機能性抗体ＣＴ１０１と抗ＴＧＦβ１抗体ＣＡＴ１９２のＨＥＫ２９３細胞ＴＧＦβシグナル経路への阻害的役割を示す図である。図２７は、二重機能性抗体ＣＴ１０１と抗ＴＧＦβ１抗体ＣＡＴ１９２のヒトＣＤ４分子を安定発現するＨＥＫ２９３細胞ＴＧＦβシグナル経路への阻害的役割を示す図である。図２８は、ＭＣ３８結腸癌移植腫瘍に対する異なる抗体治療の抑制効果を示す。治療抗体として、対照ＩｇＧ、抗ＴＧＦβ１抗体ＣＡＴ１９２、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ結合ＣＡＴ１９２および二重機能性抗体ＣＴ１０１がある。

以下、特定の実施例を用いて本発明の実施形態を説明する。当業者は、本明細書に記載されている内容から、本発明の他の利点および効果を簡単に理解することができる。本発明はさらに異なる具体的な実施形態によって実施または応用することができ、本明細書の詳細内容はまた、異なる観点と応用に基づいて、本発明の精神から逸脱することなく様々な修正または変更を行うことができる。

本発明の具体的な実施形態をさらに説明する前に、本発明の保護範囲は以下の特定の具体的な実施形態に限定するものではないと理解されたい。また、本発明の実施例で使用される用語は、本発明の保護範囲を限定するものではなく、特定の具体的な実施形態を記述するために使用されることも理解されたい。本発明の明細書および特許請求の範囲において、特に明記されていない限り、単数形「１つ」、「１」および「これ」には複数形が含まれる。

実施例が数値範囲を示す場合、本発明に別途の説明がない限り、各数値範囲の２つの端点および２つの端点間のいずれかの数値を選択して使用することができると理解されたい。実施例で使用される具体的な方法、設備、材料に加えて、当業者は、従来技術への理解および本発明の内容に基づき、本発明の実施例で述べた方法、設備、材料と類似又は同等の従来技術のいずれかの方法、設備および材料を用いて本発明を実現することができる。

本発明の一実施例の二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体は少なくとも第１タンパク質鎖と第２タンパク質鎖とを含み、
前記第１タンパク質鎖は、第１タンパク質機能領域の一部または全部の構造、および／または、第２タンパク質機能領域の一部または全部の構造を含む。

前記第１タンパク質機能領域はＣＤ４を標的とし、前記第１タンパク質機能領域は抗ＣＤ４の抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
前記第２タンパク質機能領域はＴＧＦβ１を標的とし、前記第２タンパク質機能領域は抗ＴＧＦβ１の抗体またはその抗原結合フラグメントである。

前記抗ＣＤ４の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、可変重鎖相補決定領域１（ＨＣＤＲ１）と、可変重鎖相補決定領域２（ＨＣＤＲ２）と、可変重鎖相補決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含む。前記抗ＣＤ４の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、可変軽鎖相補決定領域１（ＬＣＤＲ１）と、可変軽鎖相補決定領域２（ＬＣＤＲ２）と、可変軽鎖相補決定領域３（ＬＣＤＲ３）とを含む。

前記第１タンパク質機能領域の重鎖可変領域（ＶＨ）はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：５３～ＳＥＱＩＤＮＯ：５５で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：５６～ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ３を含み、
前記抗ＴＧＦβ１の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、可変軽鎖相補決定領域１（ＬＣＤＲ１）と、可変軽鎖相補決定領域２（ＬＣＤＲ２）と、可変軽鎖相補決定領域３（ＬＣＤＲ３）とを含み、
前記抗ＴＧＦβ１の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、可変重鎖相補決定領域１（ＨＣＤＲ１）と、可変重鎖相補決定領域２（ＨＣＤＲ２）と、可変重鎖相補決定領域３（ＨＣＤＲ３）とを含み、
前記第２タンパク質機能領域の重鎖可変領域（ＶＨ）はＳＥＱＩＤＮＯ：５９で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１～ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のいずれか１つまたは複数で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３とを含み、その軽鎖可変領域（ＶＬ）はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：６５～ＳＥＱＩＤＮＯ：６７で示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ３を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記抗ＣＤ４の抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補決定領域フラグメント、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体または二抗体から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記抗ＴＧＦβ１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補決定領域フラグメント、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体または二抗体から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記第１タンパク質機能領域は免疫グロブリン（ＩｇＧ）であり、その重鎖可変領域（ＶＨ）はＳＥＱＩＤＮＯ：１に示すＶＨドメインアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域（ＶＬ）はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるＶＬドメインアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記第２タンパク質機能領域は一本鎖抗体またはＦａｂであり、その重鎖可変領域（ＶＨ）はＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のいずれかで示されるＶＨアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域（ＶＬ）はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるＶＬアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第１タンパク質機能領域の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７６で示され、前記第１タンパク質機能領域の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７８で示され、
および、前記第２タンパク質機能領域は一本鎖抗体またはＦａｂであり、前記第２タンパク質機能領域の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤ
ＮＯ：８０で示され、前記第２タンパク質機能領域の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：８２で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、その存在形態はＩｇＧ－ＳｃＦｖ／Ｆａｂ形態に限らず、他の二重特異性抗体の存在形態であってもよい。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記第１タンパク質機能領域および第２タンパク質機能領域は、独立して1つ、２つまたは２つ以上である。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域とが直接連結するか、連結フラグメントを介して連結する。好ましくは、前記連結フラグメントは（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、例えば、１、２、３、４、５または６の正の整数である。具体的には、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：７で示される連結フラグメントであってもよい。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記免疫グロブリンの定常領域はヒト抗体由来である。好ましくは、前記免疫グロブリンの定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１タンパク質鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、次の式を有し、
軽鎖可変領域－軽鎖定常領域－（連結フラグメント）ｍ－重鎖可変領域－（連結フラグメント）ｎ－軽鎖可変領域、
前記第２タンパク質鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、次の式を有し、
重鎖可変領域－重鎖定常領域－ヒンジ－Ｆｃ領域、
好ましくは、前記連結フラグメントはＧＧＧＧＳであり、ｍは０または正の整数、ｎは０または正の整数である。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１タンパク質鎖の軽鎖可変領域－軽鎖定常領域と第２タンパク質鎖の重鎖可変領域－重鎖定常領域が互いに結合してタンパク鎖群を形成し、２本のタンパク質鎖群は二量体を形成する。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１タンパク質鎖のＮ末端の軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列を含み、前記第１タンパク質鎖の重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、前記第１タンパク質鎖のＣ末端の軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２タンパク質鎖の重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖はＳＥＱＩＤＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２タンパク質鎖はＳＥＱＩＤＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１４で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１７で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１８で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１９で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２０で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２１で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２２で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２３で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２４で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖と第４タンパク質鎖とを含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２５で示され、前記第４タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２６で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２７で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２８で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖と第４タンパク質鎖とを含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示され、前記第４タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖を含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３４で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３５で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖を含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３６で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３７で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３８で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖を含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３９で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４０で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４１で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖を含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４２で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４３で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４４で示され、前記二重特異性抗体はさらに、第３タンパク質鎖と第４タンパク質鎖とを含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４５で示され、前記第４タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４６で示される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記抗体は、ヒトＣＤ４およびＴＧＦ－β１分子を選択的に結合することができる。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、
前記免疫グロブリンの定常領域はヒト抗体由来であり、
好ましくは、前記免疫グロブリンの定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、
前記免疫グロブリンの重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎまたはヒトＩｇＧ４ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎであり、かつ、その軽鎖定常領域はヒトＩｇｋａｐｐａｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎである。

本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンの定常領域はヒト化されており、例えば、重鎖定常領域はすべてＩｇＧ４ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１、軽鎖定常領域はすべてＩｇｋａｐｐａｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４を採用する。

本発明のいくつかの実施形態において、前記軽鎖定常領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記重鎖定常領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記Ｆｅ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域とが直接連結するか、または連結フラグメントを介して連結する。

好ましくは、前記連結フラグメントは（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、例えば１、２、３、４、５または６の正の整数である。ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）はＬｉｎｋｅｒの構成要素である。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記第１タンパク質機能領域および第２タンパク質機能領域は、独立して１つ、２つまたは２以上である。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記免疫グロブリンは１つであり、前記一本鎖抗体は２つであり、好ましくは２つの同じ一本鎖抗体である。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり、好ましくは、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記一本鎖抗体は免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結される。免疫グロブリンには２つの重鎖があるため、１つの免疫グロブリン分子には２つの一本鎖抗体分子が連結される。好ましくは、２つの一本鎖抗体分子が同じである。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記一本鎖抗体は２本であり、各一本鎖抗体の一端はそれぞれ免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端またはＮ末端に連結される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記一本鎖抗体のＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合が存在する。抗体のＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を導入する方法は当技術分野で熟知であり、例えば、米国特許出願ＵＳ５７４７６５４、Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．１０（１９９７）１４５３－１４５９、Ｒｅｉｔｅｒら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４（１９９６）１２３９－１２４５、Ｗｅｂｂｅｒら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３２（１９９５）２４９－２５８、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２（１９９５）２８１－２８７、Ｒｅｉｔｅｒら、ＪＢＣ２６９（１９９４）１８３２７－１８３３１、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ｏｆＣａｎｃｅｒ５８（１９９４）１４２－１４９、または、Ｒｅｉｔｅｒら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４（１９９４）２７１４－２７１８、それが引用によって本明細書に組み込まれる。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、そのうち、前記二重特異性抗体は１０^－９Ｍ未満またはそれより小さいＫｄでＣＤ４タンパク質および／またはＴＧＦ－β１タンパク質と結合し、好ましくは、前記Ｋｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ分子間相互作用解析装置によって測定される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記抗体は、ＴＧＦ－β１レポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性測定においてヒトＴＧＦ－β１に対する５ｎＭ未満のＩＣ_５０を有する。

本発明のいくつかの実施形態において、前記二重特異性抗体では、前記抗体は、ＴＧＦ－β１レポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性測定においてヒトＴＧＦ－β１に対する５ｐＭ未満のＩＣ_５０を有する。

本発明の別の態様は、本発明のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸分子に関する。

本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクターに関する。

本発明はまた、本発明の単離された核酸分子、または本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。

本発明のもう１つの態様は、本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の方法に関し、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収するステップを含む。

本発明のもう１つの態様は、二重特異性抗体および複合剤を含む複合体に関し、そのうち、前記二重特異性抗体は本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、前記複合剤は検出可能なマーカであり、好ましくは、前記複合剤は、小分子化合物、蛍光物質、発光物質、有色物質または酵素である。

本発明のもう１つの態様は、本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むか、本発明の複合体を含む薬物組成物であり、選択的に、薬学的に許容される添加剤も含む。

本発明の二重特異性抗体または本発明の薬物組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、溶液、ゲル剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、錠剤、座薬、注射剤（注射液、注射用無菌粉末と注射用濃溶液を含む）、吸入剤、噴霧剤などの薬学分野で知られている任意の剤形に製剤することができる。好ましい剤形は、意図された投与方法および治療使用に依存する。本発明の薬物組成物は無菌であり、製造および貯蔵条件下で安定であるべきである。好ましい剤形は注射剤である。このような注射剤は、無菌注射溶液であってもよい。例えば、以下の方法により無菌注射溶液を調製することができる。適切な溶媒に必要な量の本発明の二重特異性抗体を加え、必要に応じて、他の所望の成分（ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、防腐剤、希釈剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない）を同時に加え、その後に濾過して除菌する。さらに、保存および使用を容易にするために、無菌注射溶液を無菌凍結乾燥粉末として（例えば、真空乾燥または凍結乾燥）調製することができる。このような無菌凍結乾燥粉末は、使用前に適切なベクター、例えば無菌無熱原水中に分散させることができる。さらに、本発明の二重特異性抗体は、投与を容易にするために、単位用量形態で薬物組成物中に存在することができる。特定の実施形態では、前記単位用量は、少なくとも１ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇである。前記薬物組成物が液体（例えば、注射剤）剤形である場合、少なくとも濃度０．１ｍｇ／ｍｌの本発明の二重特異性抗体、例えば少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの本発明の二重特異性抗体を含むことができる。

本発明の二重特異性抗体または薬物組成物は、当技術分野で周知する任意の適切な方法によって投与することができ、経口、口腔、舌下、眼球、局所、胃腸外、直腸、葉鞘内、シスターン内、鼠径溝、膀胱内、局所（例えば、粉剤、軟膏または滴下剤）、または鼻腔を含むが、これらに限定されない。しかし、多くの治療使用に対して、胃腸外投与（例えば、静脈注射、皮下注射、腹膜内注射、筋肉内注射）のほうが好ましい投与経路／方法である。当業者は、投与経路および／または方法が意図された目的に応じて変化することを理解されたい。好ましい実施形態において、本発明の二重特異性抗体または薬物組成物は静脈注入または注射によって投与される。

本発明が提供する二重特異性抗体または薬物組成物は、単独でまたは併用することができ、また、別の薬学的活性剤（腫瘍化学療法薬など）と併用することもできる。この薬学的活性剤は、本発明の二重特異性抗体または本発明の薬物組成物の投与前、同時、または投与後に投与することができる。

本発明において、最適な目的反応（例えば、治療または予防反応）を得るために投与計画を調整することができる。例えば、単回投与するか、一定期間に複数回投与するか、治療状況の緊急度に応じて用量を減少または増加することができる。

本発明のもう１つの態様は、本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体の、疾病を予防および／又は治療するための薬物の製造における使用に関し、前記疾病又は病状は、がん、免疫介在疾患、線維化疾病、ウイルス感染性疾病、神経退行性疾病、骨再形成、腎症疾病、およびそれらの組み合わせから選択される。

本発明のもう１つの態様は、本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または本発明の複合体の、悪性腫瘍を予防および／または治療するための薬物の製造における使用に関し、好ましくは、前記悪性腫瘍は、結腸癌、直腸癌、肺癌、例えば非小細胞性肺癌、肝臓癌、卵巣癌、皮膚癌、膠腫、黒色腫、腎腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、膀胱癌、胃腸癌、乳癌、脳癌、白血病から選択される。

本発明のもう１つの態様は、悪性腫瘍の予防及び／又は治療方法に関し、被験者に有効量の本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又は本発明の複合体を投与するステップを含み、好ましくは、前記腫瘍は、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、皮膚癌、膠質腫、黒色腫、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、胃腸癌、乳癌、脳癌と白血病から選択される。

本発明の二重特異性抗体の治療または予防有効量の典型的な非限界範囲は０．０２－５０ｍｇ／ｋｇであり、例えば０．１－５０ｍｇ／ｋｇ、０．１－２５ｍｇ／ｋｇ、または１－１０ｍｇ／ｋｇである。この用量は、治療する症状のタイプおよび重症度に応じて変化することができることに留意すべきである。また、いずれの特定の患者に対しても、特定の投与計画は患者のニーズと医師の専門的評価に基づいて時間に応じて調整すべきであることは、当業者が理解できる。本明細書で提示される用量範囲は、例示して説明するためのものにすぎず、本発明の薬物組成物の使用または範囲を限定するものではない。

本発明において、げっ歯類、例えばマウス、または霊長類、例えばヒト、カニクイザルを被験者として利用することができる。

本発明のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又は複合体であって、悪性腫瘍の予防及び／又は治療に使用される。好ましくは、前記腫瘍は、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、黒色腫、腎癌、膵臓癌、皮膚癌、膠腫、前立腺癌、膀胱癌、胃腸癌、乳癌、脳癌、白血病から選択される。

抗体治療薬、特にモノクローナル抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）は、様々な疾患の治療において良好な治療効果を得ている。これらの治療用抗体を取得する従来の実験方法には、抗原免疫動物を用い、免疫動物体内で抗原を標的とする抗体を取得するか、親和性成熟の方法によって抗原との親和性が低い抗体を高める方法がある。しかし、これらの方法はかなり時間と気力を必要とし、ほとんどの場合にも、抗原上の特定のエピトープに対応できない。

軽鎖と重鎖の可変領域が抗原の結合を決定する。各鎖の可変領域は３つの高可変領域を含み、相補決定領域（ＣＤＲ）（重鎖（Ｈ）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、それがＫａｂａｔらによって命名される。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（１９９１），第１－３卷，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
９１－３２４２，ＢｅｔｈｅｓｄａＭｄ）を参照。

以下の（１）－（１３）項におけるモノクローナル抗体配列のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を、当業者が熟知している技術的手段、例えばＶＢＡＳＥ２データベースを用いて分析した結果は次の通りである。

（１）二重機能性抗体抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－β１の第１タンパク質機能領域：
重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示され、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示される。

その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は次の通りである。

ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
ＨＣＤＲ２：ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）
ＨＣＤＲ３：ＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）

その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は次の通りである。

ＬＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）
ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＹＳＹＲＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）

（２）二重機能性抗体抗ＣＤ４／抗ＴＧＦ－β１の第２タンパク質機能領域：
重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、およびＳＥＱＩＤＮＯ：５で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示される。

ＨＣＤＲ１：ＳＹＧＭＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
ＨＣＤＲ２：ＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）
ＨＣＤＲ３：ＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）又はＴＧＥＹＳＧＹＤＴＳＧＶＥＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）又はＴＧＦＹＳＧＹＤＴＰＡＳＰＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）
ＨＣＤＲ３共有配列：ＴＧＸ_１ＹＳＧＹＤＴＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）

そのうち、Ｘ１は任意のアミノ酸（好ましいはＥ又はＦ）であってもよい。

ＬＣＤＲ１：ＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）
ＬＣＤＲ２：ＧＴＳＴＬＱＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）
ＬＣＤＲ３：ＬＱＤＳＮＹＰＬＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）

本発明において、別途の説明がない限り、本明細書で使用される科学的および技術的名詞は、当業者に一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で用いた細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学実験室の操作手順はすべて対応する分野で広く使用されている通常の手順である。同時に、本発明をよりよく理解するために、以下に関連用語の定義と説明を記載する。

本明細書で記載されているＴＧＦ－β１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＮＰ＿０００６５１．３）のアミノ酸配列は、ＴＧＦ－β１タンパク質の全長を含む。しかしながら、ＴＧＦ－β１タンパク質のアミノ酸配列において、その生物学的機能に影響を与えることなく、突然変異または変異（置換、欠失、および／または添加を含むがこれらに限定されない）を自然発生または人工的に導入することができることは、当業者が理解できる。したがって、本発明において、「ＴＧＦ－β１タンパク質」という用語は、天然または人工の変異体を含むすべてのそのような配列を含むべきである。本発明の一実施形態において、ＴＧＦ－β１タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：５１の下線部分で示される。

本明細書で使用されているＣＤ４タンパク質（ｃｌｕｓｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ４，ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸配列は、ＣＤ４タンパク質の全長を含み、ＣＤ４の細胞外フラグメント、可溶性ＣＤ４分子（ｓｏｌｕｂｌｅＣＤ４、ｓＣＤ４）も含む。しかしながら、ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列において、その生物学的機能に影響を与えることなく、突然変異または変異（置換、欠失、および／または添加を含むがこれらに限定されない）を自然発生または人工的に導入することができることは、当業者が理解できる。したがって、本発明において、「ＣＤ４タンパク質」という用語は、天然または人工の変異体を含むすべてのそのような配列を含むべきである。本発明の一実施形態において、ＣＤ４細胞外フラグメントｓＣＤ４のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９の下線部分で示される。

本明細書で使用されているＥＣ_５０という用語は、半数効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒ５０％ｏｆｍａｘｉｍａｌｅｆｆｅｃｔ）を指し、５０％の効果を示す濃度である。

本明細書で使用されているＩＣ_５０という用語は、半数阻害濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒ５０％ｏｆｍａｘｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、５０％の効果を示す濃度である。

本明細書で使用されている「抗体」という用語は、一般に２対のポリペプチド鎖（１対につき１本の「軽」（Ｌ）鎖と１本の「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。一般的に、重鎖は抗体中の分子量が大きいポリペプチド鎖、軽鎖は抗体中の分子量が小さいポリペプチド鎖であると理解できる。軽鎖はκとλ軽鎖、重鎖は通常、μ、δ、γ、αまたはεに分けられ、また、同種抗体をそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結され、重鎖はまた、約３又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は３つの構造ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２和ＣＨ３）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つの構造ドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）と補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）との結合を含み、免疫グロブリンと宿主組織または因子を仲介することができる。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保守的なフレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が点在する高い変性を有する領域（相補決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分化することもできる。各ＶＨとＶＬは次の順序で、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４がアミノ末端からカルボキシル末端にかけて配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖の可変領域（ＶＨとＶＬ）はそれぞれ抗体結合部位を形成する。アミノ酸の各領域または構造ドメインへの分配は、ＫａｂａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８－８８３の定義に準拠する。特に、重鎖はまた、６、９、または１２など、３つ以上のＣＤＲを含むことができる。例えば、本発明の二重機能性抗体において、重鎖はＩｇＧ抗体の重鎖のＣ端が別の抗体を連結するＳｃＦｖであってもよく、この場合、重鎖は９つのＣＤＲを含む。「抗体」という用語は、任意の特定の抗体生成方法によって制限されない。例えば、それは、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なる同種抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であってもよい。

本明細書で使用されている「抗原結合フラグメント」という用語は、「抗原結合フラグメント」という用語は、全長抗体のフラグメントを含むポリペプチドを指し、それが全長抗体に結合された同じ抗原を特異的に結合する能力を保持し、および／または全長抗体と競合して抗原を特異的に結合し、「抗原結合部分」とも呼ばれる。一般的に、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，第２版、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照し、これは引用によって本明細書に組み込まれ、すべての目的に用いる。抗体の抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術または完全抗体の酵素触媒または化学的破断によって生成することができる。場合によっては、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂと、Ｆａｂ'と、Ｆ（ａｂ'）２と、Ｆｄと、Ｆｖと、ｄＡｂと相補決定領域（ＣＤＲ）フラグメントと、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体と、二重機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）とを含み、ポリペプチドに特異的抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含む。

本明細書で使用されている「Ｆｄフラグメント」という用語は、「Ｆｄフラグメント」という用語は、ＶＨおよびＣＨ１構造ドメインからなる抗体フラグメント、「Ｆｖフラグメント」という用語は、抗体のシングルアームＶＬおよびＶＨ構造ドメインからなる抗体フラグメント、「ｄＡｂフラグメント」という用語は、ＶＨ構造ドメインからなる抗体フラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６（１９８９））、「Ｆａｂフラグメント」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１構造ドメインからなる抗体フラグメント、用語「Ｆ（ａｂ'）２フラグメント」は、ヒンジ領域上のジスルフィドブリッジを介して接続された２つのＦａｂフラグメントを含む抗体フラグメントを意味する。

場合によっては、抗体の抗原結合フラグメントは一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、そのうち、ＶＬ及びＶＨ構造ドメインが単一ポリペプチド鎖として生成可能なリンカー対により一価分子を形成する（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照。）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般的な構造を有することができる。好適な従来技術のリンカーは、繰り返しＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_４を有するリンカーを用いてもよいが、その変異体（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８）を用いてもよい。本発明で使用できる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５），ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．８：７２５－７３１，Ｃｈｏｉら（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４－１０６、Ｈｕら（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６とＲｏｏｖｅｒｓら（２００１），ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．に記述する。

場合によっては、抗体の抗原結合フラグメントは、二重抗体、すなわち２価抗体であり、そのうち、ＶＨおよびＶＬ構造ドメインは単一のポリペプチド鎖上で発現される。しかし、短いリンカーを使用することで同じ鎖の２つの構造ドメイン間のペアができないので、構造ドメインと別の鎖の相補構造ドメインとのペアを強制し、さらに２つの抗原結合部位を生成する（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒＰ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：６４４４－６４４８（１９９３），とＰｏｌｊａｋＲ．Ｊ．ら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１－１１２３（１９９４）を参照）。

抗体の抗原結合フラグメント（例えば、上述の抗体フラグメント）は、当業者に知られている従来技術（例えば、組換えＤＮＡ技術又は酵素触媒又は化学的破断法）を用いて所定の抗体から得られ、かつ、完全抗体に用いるのと同じ方法で抗原結合フラグメントを特異的にスクリーニングすることができる。

本明細書では、文脈で明示されない限り、「抗体」という用語が言及される場合、それは完全抗体だけでなく、抗体の抗原結合フラグメントも含む。

本明細書で使用されるように、「単クローン抗体」および「モノクローナル抗体」は、高相同性抗体分子集団からの１つの抗体または抗体のフラグメント、すなわち自発的に出現する可能性のある自然突然変異を除き、全く同じ抗体分子の集団を指す。単クローン抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高い特異性を持っている。単クローン抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高い特異性を持っている。モノクローナル抗体に対するポリクローナル抗体は通常、２つ以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は通常、抗原上の異なるエピトープを識別する。モノクローナル抗体は通常、Ｋｏｈｌｅｒなどが最初に報告したハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）によって得られる、また、組換えＤＮＡ技術によっても得られる（ＵＳ４，８１６，５６７を参照）。

本明細書で使用されるように、「キメラ抗体」という用語は、軽鎖または／および重鎖の一部が１つの抗体（特定の種に由来するか、特定の抗体類またはサブクラスに属する）に由来し、軽鎖または／および重鎖の別の一部が別の抗体（同じまたは異なる種に由来するか、同じまたは異なる抗体類またはサブクラスに属する）に由来する抗体を指すが、いずれにしても、標的抗原への結合活性は保持する（Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。

本明細書で使用されるように、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト由来免疫グロブリン（受容体抗体）の全部または一部ＣＤＲが非ヒト由来抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域に置換されて得られる抗体または抗体フラグメントを指し、そのうち、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または反応性を有する非ヒト由来（例えば、マウス、ラット、ウサギ）抗体であり得る。さらに、受容体抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸残基も、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換されてもよく、または他の抗体のアミノ酸残基に置換されて、抗体の性能をさらに改善または最適化することができる。ヒト化抗体の詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ
ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）；およびＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３９７－４０２（２０００）を参照することができる。

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗原上で免疫グロブリンまたは抗体に特異的に結合される部位を指す。「エピトープ」は、当技術分野では「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は通常、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖など、分子の化学活性表面基から構成され、通常、特定の三次元構造特徴および特定の電荷特徴を有する。例えば、エピトープは一般に、独特の空間立体配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の連続または非連続アミノ酸を含み、「線形」または「立体配座」であってもよい。例えば、ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅｄ．（１９９６）を参照。線形エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば抗体）との間のすべての相互作用点は、タンパク質の一級アミノ酸配列に沿って線形に存在する。立体配座エピトープにおいて、相互作用点は、互いに分離されたタンパク質アミノ酸残基を跨って存在する。

本明細書で使用されている「単離的」または「単離され」という用語は、天然状態から人工的に得られたものを指す。自然界に「単離」された物質や成分が存在する場合は、その自然環境が変化したか、自然環境から単離されたか、その両方も発生した可能性がある。例えば、ある生体動物の体内には単離されていないポリヌクレオチドやポリペプチドが自然に存在し、この自然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドやポリペプチドは単離されたものと呼ばれる。「単離的」または「単離され」という用語は、人工または合成物質が混在しているか、物質活性に影響を与えない他の不純物が存在しているかもしれない。

本明細書で使用されている「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸運搬具を指す。ベクターが挿入されたポリヌクレオチドでコードされたタンパク質を発現させることができる場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入し、それにより、運ぶ遺伝物質要素を宿主細胞中で発現させることができる。ベクターは当業者に公知であり、プラスミド、バクテリオファージ、コスプラスミド、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージおよび動物ウイルスなどのファージを含むがこれらに限定されない。ベクターとして有用な動物ウイルスには、逆転写酵素ウイルス（スローウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ニキビウイルス、ロッド様ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス（ＳＶ４０など）を含むがこれらに限定されない。１つのベクターには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない複数種の発現制御要素を含むことができる。また、ベクターは、複製開始部位を含むこともできる。

本明細書で使用されている「宿主細胞」という用語は、大腸菌や枯草菌などの原核細胞、酵母細胞や麹菌などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９などの昆虫細胞、またはフィブリン細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ
２９３細胞、またはヒト細胞などの動物細胞を含むが、これらに限定されないベクター導入に使用される細胞を指す。

本明細書で使用されている「特異的に結合」という用語は、抗体とそれが標的とする抗原との反応など、２分子間の非ランダムな結合反応。一部の実施形態では、ある抗原に特異的に結合する抗体（またはある抗原に特異性を持つ抗体）は、約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍまたは１０^－１０Ｍ未満またはそれより低い親和力（Ｋｄ）で該抗原を結合する抗体を指す。本発明のいくつかの実施形態において、「標的」という用語は特異的に結合するという意味である。

本明細書で使用されている「Ｋｄ」という用語は、抗体と抗原との結合親和力を記述するために使用される特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合が緊密になり、抗体と抗原間の親和力が高くなる。一般に、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ装置において表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）で測定されるように、抗体は、約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍまたは１０^－１０Ｍ未満またはそれより低い解離平衡定数（Ｋｄ）で抗原を結合する、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ解析装置において表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて測定する。

本明細書で使用されている「モノクローナル抗体」と「単クローン抗体」という用語は同じ意味を有し、相互に交換して使用することができる。「ポリクローナル抗体」と「多クローン抗体」は同じ意味を有し、相互に交換して使用することができる。また、本発明において、アミノ酸は通常、当技術分野で公知の単文字と三文字の略語で表される。例えば、グリシンはＧまたはＧｌｙ、アラニンはＡまたはＡｌａで表される。

本明細書で使用されている「薬学的に許容される添加剤」という用語は、薬理学的および／または生理学的に被験者および活性成分と適合するベクターおよび／または賦形剤を指し、当技術分野で公知する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．ＥｄｉｔｅｄｂｙＧｅｎｎａｒｏＡＲ，１９ｔｈｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が挙げられるがこれらに限定されない。そのうち、ｐＨ調整剤としては、リン酸塩緩衝液、界面活性剤としては、カチオン性、アニオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０、イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用されている「アジュバント」という用語は、抗原と共にまたは予め生体に送達されたときに生体の抗原に対する免疫応答を増強したり、免疫応答タイプを変化させたりすることができる非特異性免疫増強剤を指す。アジュバントとして、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（例えば、完全型フロイントアジュバント及び不完全型フロイントアジュバント）、短桿菌、リポ多糖、サイトカインなどが挙げられるが、これらに限定されない。フロイントアジュバントは現在の動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは臨床実験で多く使用されている。

本明細書で使用されている「有効量」という用語は、所望の効果を得るまたは少なくとも部分的に得るのに十分な量を意味する。疾患の治療に有効な量とは、患者の疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量を意味する。このような有効量の測定は、当業者にとって実行可能である。例えば、治療使用に有効な量は、治療する疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的な状況、例えば年齢、体重及び性別、薬物の投与方法、及び同時に投与される他の治療などに依存する。

＜調製例１：組換えタンパク質ＣＤ４－Ｈｉｓの発現と精製＞
１．ｐＣＭＶ－ＣＤ４－Ｈｉｓプラスミドの構築
ＣＤ４ｈｕｍａｎｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｗｉｚ社合成）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ＣＤ４－Ｈｉｓフラグメントを通常のＤＮＡ産物精製キットで精製回収する。回収後のＣＤ４－Ｈｉｓフラグメントと発現ベクターｐＣＭＶをＮｈｅＩとＸｂａＩ酵素を用いて切断し、標的遺伝子フラグメントと線形発現ベクターをゲル抽出し、Ｔ４リガーゼで連結し、ＤＨ５α化学感受性細胞に対してすべての連結生成物の形質転換を実施した後、Ａｍｐを有するＡｇａｒプレートに塗布し、よく分離された単コロニーを選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲ鑑定結果が陽性であるクローンをＬＢ培地に接種して培養し、菌液を採取して広州英俊公司に送ってシーケンシングを行った。シーケンシング結果を比較すると、陽性組換え挿入配列が完全に正しいことを示した。

２．組換えタンパク質ＣＤ４－Ｈｉｓの発現と精製
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＣＤ４－ｈｉｓをトランスフェクションした５日後、培養液に対して高速遠心分離及び上清濃縮を行い、Ｂｉｎｄｉｎｇ
ＢｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に置き換え、ＨｉｓＴｒａｐカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ＭＩｍｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）でタンパク質を線形溶出し、最初の精製試料をＨｉＴｒａｐＤｅｓａｌｔｉｎｇカラムでＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に置き換え、ＨｉＴｒａｐＱカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ９．０）を用いてタンパク質を線形溶出し、標的試料を回収し、ＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

融合タンパク質ＣＤ４－Ｈｉｓを得る。

ＣＤ４－Ｈｉｓのアミノ酸配列は次のとおりである（３７１ａａ）：
ＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫＩＬＧＮＱＧＳＦＬＴＫＧＰＳＫＬＮＤＲＡＤＳＲＲＳＬＷＤＱＧＮＦＰＬＩＩＫＮＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴＬＴＬＥＳＰＰＧＳＳＰＳＶＱＣＲＳＰＲＧＫＮＩＱＧＧＫＴＬＳＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱＫＫＶＥＦＫＩＤＩＶＶＬＡＦＱＫＡＳＳＩＶＹＫＫＥＧＥＱＶＥＦＳＦＰＬＡＦＴＶＥＫＬＴＧＳＧＥＬＷＷＱＡＥＲＡＳＳＳＫＳＷＩＴＦＤＬＫＮＫＥＶＳＶＫＲＶＴＱＤＰＫＬＱＭＧＫＫＬＰＬＨＬＴＬＰＱＡＬＰＱＹＡＧＳＧＮＬＴＬＡＬＥＡＫＴＧＫＬＨＱＥＶＮＬＶＶＭＲＡＴＱＬＱＫＮＬＴＣＥＶＷＧＰＴＳＰＫＬＭＬＳＬＫＬＥＮＫＥＡＫＶＳＫＲＥＫＡＶＷＶＬＮＰＥＡＧＭＷＱＣＬＬＳＤＳＧＱＶＬＬＥＳＮＩＫＶＬＰＴＷＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）

組換えＣＤ４－Ｈｉｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５０で示される。

＜調製例２：組換えＴＧＦ－β１の調製＞
１．ｐＣＭＶ－ＴＧＦ－β１－Ｈｉｓプラスミドの構築
ＴＧＦ－β１ｈｕｍａｎｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｗｉｚ社合成）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ＴＧＦ－β１－Ｈｉｓフラグメントを通常のＤＮＡ産物精製キットで精製回収する。回収されたＴＧＦ－β１－Ｈｉｓフラグメントと発現ベクターｐＣＭＶをＮｈｅＩとＸｂａＩ酵素を用いて切断し、標的遺伝子フラグメントと線形発現ベクターをゲル抽出し、Ｔ４リガーゼで連結し、ＤＨ５α化学感受性細胞にすべての連結生成物の形質転換を実施した後、Ａｍｐを有するＡｇａｒプレートに塗布し、よく分離された単コロニーを選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲ鑑定結果が陽性であるクローンをＬＢ培地に接種して培養し、菌液を採取して広州英俊公司に送ってシーケンシングを行った。シーケンシング結果を比較すると、陽性組換え挿入配列が完全に正しいことを示した。

２．融合タンパク質ＴＧＦ－β１－Ｈｉｓの発現と精製
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＣＤ４－ｈｉｓをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をしてＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に置き換え、ＨｉｓＴｒａｐカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ＭＩｍｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）でタンパク質を線形溶出し、最初の精製試料をＨｉＴｒａｐＤｅｓａｌｔｉｎｇカラムでＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に置き換え、ＨｉＴｒａｐ
Ｑカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ９．０）を用いてタンパク質を線形溶出し、標的試料を回収し、ＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

融合タンパク質ＴＧＦ－β１－Ｈｉｓを得る。

ＴＧＦ－β１－Ｈｉｓのアミノ酸配列は次のとおりである（１１８ａａ）：
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）

組換えＴＧＦ－β１－Ｈｉｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５２で示される。

＜調製例３：ＴＧＦ－β１抗体（ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４）の調製＞
ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ由来）を（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーを介して連結してＳｃＦｖ形態を構成し、そして、ヒンジを介してＦｃ定常領域と連結し、ＳｃＦｖ－ＩｇＧを構成する。Ｆｃ定常領域はＩｇｇａｍｍａ－４ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１を採用する。抗ＴＧＦ－β１抗体をコードするヌクレオチド配列は上海生工によって合成される。

ＴＧＦ－β１をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＴＧＦ－β１抗体の組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をして１ｘＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．０）
に置き換え、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．７）でタンパク質をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に溶出し、標的試料を回収してＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

ＴＧＦ－β１抗体（ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４）を得る。

ＴＧＦ－β１抗体をコードするアミノ酸配列：（４７５ｂｐ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＳＧＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）

＜調製例４：対照抗体（ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４）の調製＞
対照抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーを介して連結してＳｃＦｖ形態を構成し、そして、ヒンジを介してＦｃ定常領域と連結し、ＳｃＦｖ－ＩｇＧを構成する。Ｆｃ定常領域はＩｇｇａｍｍａ－４ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１を採用する。対照抗体のヌクレオチド配列は上海生工によって合成される。

対照抗体をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、対照抗体の組換え発現プラスミドを得る。

対照抗体をコードするアミノ酸配列：（４７５ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＳＧＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）

対照抗体（ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４）を得る。

＜調製例５：二重機能性抗体ＣＴ１０１の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０１の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーを介して抗ＴＧＦ－β１
ＳｃＦｖに連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖からなり、最終的に２つのタンパク質鎖がＩｇＧ－（Ｈ）－ＳｃＦｖ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０１をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０１抗体の組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をして１ｘＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．０）に置き換え、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．７）でタンパク質をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に溶出し、標的試料を回収してＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

二重機能性抗体ＣＴ１０１の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）

二重機能性抗体ＣＴ１０１の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（７０９ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）

二重機能性抗体ＣＴ１０１を得る。

＜調製例６：二重機能性抗体ＣＴ１０２の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０２の第１タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーを介して抗ＴＧＦ－β１ＳｃＦｖに連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖からなり、最終的に２つのタンパク質鎖がＩｇＧ－（Ｌ）－ＳｃＦｖ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０２をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０２抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１０２の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４７９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）

二重機能性抗体ＣＴ１０２の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４４９ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）

二重機能性抗体ＣＴ１０２を得る。

＜調製例７：二重機能性抗体ＣＴ１０３の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０３の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーを介して抗ＴＧＦ－β１ＳｃＦｖに連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖からなり、最終的に２つのタンパク質鎖がＳｃＦｖ－（Ｈ）－ＩｇＧ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０３をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０３抗体の組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をして１ｘＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．０）に置き換え、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｇカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．７）でタンパク質をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に溶出し、標的試料を回収してＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

二重機能性抗体ＣＴ１０３の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）

二重機能性抗体ＣＴ１０３の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（７０９ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）

二重機能性抗体ＣＴ１０３を得る。

＜調製例８：二重機能性抗体ＣＴ１０４の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０４の第１タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーを介してＴＧＦ－β１ＳｃＦｖに連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖からなり、最終的に２つのタンパク質鎖がＳｃＦｖ－（Ｌ）－ＩｇＧ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０４をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０４抗体の組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をして１ｘＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（２０
ｍＭＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．０）に置き換え、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ
２．７）でタンパク質をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に溶出し、標的試料を回収してＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

二重機能性抗体ＣＴ１０４の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４７９ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）

二重機能性抗体ＣＴ１０４の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４４９ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）

二重機能性抗体ＣＴ１０４を得る。

＜調製例９：二重機能性抗体ＣＴ１０５の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０５の第１タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_１リンカーを介してＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域に連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域とＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖からなり、最終的に２つのタンパク質鎖がＤＶＤ－ＩｇＧ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０５をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０５抗体の組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をして１ｘＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．０）に置き換え、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．７）でタンパク質をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｂｕｆｆｅｒ（１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に溶出し、標的試料を回収してＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

二重機能性抗体ＣＴ１０５の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（３３１ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）

二重機能性抗体ＣＴ１０５の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４４９ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）

二重機能性抗体ＣＴ１０５を得る。

＜調製例１０：二重機能性抗体ＣＴ１０６の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０６の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖からなり（Ｆｃ領域にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４０９ＡＫｎｏｂ突然変異を導入）、その第３タンパク質鎖は、直列接続された抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖定常領域の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）、およびＦｃ定常領域ＩｇＧ４（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｆ４０５Ｋ／Ｙ４０７ＶＨｏｌｅ突然変異を導入）から構成され、その第４タンパク質鎖は、抗ＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨからｃｒｏｓｓｍａｂ形態で構成され、最終的に４つのタンパク質鎖がｓＦａｂ－ＩｇＧ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０６をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０６抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１０６の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）

二重機能性抗体ＣＴ１０６の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４４９ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＡＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）

二重機能性抗体ＣＴ１０６の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（６９８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＧＳＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ
ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＧＳＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＫＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）

二重機能性抗体ＣＴ１０６の第４タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１０ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）

二重機能性抗体ＣＴ１０６を得る。

＜調製例１１：二重機能性抗体ＣＴ１０７の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０７の第１タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨ１からｃｒｏｓｓｍａｂ形態で構成され、その第２タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖定常領域の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）、およびＦｃ定常領域ＩｇＧ４（Ｆｃ領域にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４０９Ａ
Ｋｎｏｂ突然変異を導入）から構成され、その第３タンパク質鎖は、Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ重鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨ１の組み合わせ、抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖定常領域の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）、およびＦｃ定常領域ＩｇＧ４（Ｆｃ領域にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｆ４０５Ｋ／Ｙ４０７ＶＨｏｌｅ突然変異を導入）から構成され、その第４タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖から構成され、最終的に４つのタンパク質鎖がＦａｂ－ＩｇＧ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０７をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０７抗体の組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をして１ｘＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＮａ_３ＰＯ_４、ｐＨ７．０）に置き換え、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ２．７）でタンパク質をＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（１
ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に溶出し、標的試料を回収してＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

二重機能性抗体ＣＴ１０７の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１０ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）

二重機能性抗体ＣＴ１０７の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４６０ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＧＳＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ
ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＡＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）

二重機能性抗体ＣＴ１０７の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（６８７ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＧＳＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＫＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）

二重機能性抗体ＣＴ１０７の第４タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）

二重機能性抗体ＣＴ１０７を得る。

＜調製例１２：二重機能性抗体ＣＴ１０８の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０８の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨ１からｃｒｏｓｓｍａｂ形態で構成され、その第３タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨ１の組み合わせ、抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖定常領域の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）、およびＦｃ定常領域ＩｇＧ４から構成され、最終的に３つのタンパク質鎖がＦａｂ－ＩｇＧ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０８をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０８抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１０８の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）

二重機能性抗体ＣＴ１０８の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１０ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）

二重機能性抗体ＣＴ１０８の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（６８７ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＧＳＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）

二重機能性抗体ＣＴ１０８を得る。

＜調製例１３：二重機能性抗体ＣＴ１０９の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１０９の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨ１からｃｒｏｓｓｍａｂ形態で構成され、その第３タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖、および抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖定常領域の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）から構成され、最終的に３つのタンパク質鎖がＩｇＧ－Ｆａｂ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１０９をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１０９抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１０９の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）

二重機能性抗体ＣＴ１０９の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１０ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）

二重機能性抗体ＣＴ１０９の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（６９６ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ
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二重機能性抗体ＣＴ１０９を得る。

＜調製例１４：二重機能性抗体ＣＴ１１０の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１１０の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_１リンカーを介して抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域に連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖（Ｆｃ領域にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４０９Ａ
Ｋｎｏｂ突然変異を導入）から構成され、その第３タンパク質鎖は（ＧＧＧＧＳ）_１リンカーを介して抗ＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域に連結したＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖（Ｆｃ領域にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｆ４０５Ｋ／Ｙ４０７ＶＨｏｌｅ突然変異を導入）から構成され、最終的に３つのタンパク質鎖がＩｇＧ－Ｆｖ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１１０をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１１０抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１１０の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）

二重機能性抗体ＣＴ１１０の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（５７７ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＡＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）

二重機能性抗体ＣＴ１１０の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（５６１ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＫＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）

二重機能性抗体ＣＴ１１０を得る。

＜調製例１５：二重機能性抗体ＴＣ１１１の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１１１の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖（Ｆｃ領域にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４０９Ａ
Ｋｎｏｂ突然変異を導入）からなり、その第３タンパク質鎖はヒンジを介してＦｃ定常領域ＩｇＧ４（Ｆｃ領域にＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｆ４０５Ｋ／Ｙ４０７ＶＨｏｌｅ突然変異を導入）に連結した抗ＴＧＦ－β１
ＳｃＦｖからなり、最終的に３つのタンパク質鎖がＦａｂ－Ｆｃ－ＳｃＦｖ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１１１をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１１１抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１１１の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）

二重機能性抗体ＣＴ１１１の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４４９ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＡＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）

二重機能性抗体ＣＴ１１１の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４７１ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＫＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）

二重機能性抗体ＣＴ１１１を得る。

＜調製例１６：二重機能性抗体ＣＴ１１２の調製＞
二重機能性抗体ＣＴ１１２の第１タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの軽鎖からなり、その第２タンパク質鎖はＩｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖（Ｆｃ領域にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４０９Ａ
Ｋｎｏｂ突然変異を導入）からなり、その第３タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の重鎖可変領域と軽鎖定常領域の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）、およびＦｃ定常領域ＩｇＧ４（Ｆｃ領域にＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４０９Ａ
Ｋｎｏｂ突然変異を導入）から構成され、その第４タンパク質鎖は抗ＴＧＦ－β１抗体の軽鎖可変領域と重鎖定常領域ＣＨ１の組み合わせ（ｃｒｏｓｓｍａｂ形態）から構成され、最終的に４つのタンパク質鎖がＩｇＧＣｒｏｓｓｍａｂ形態を構成する。

二重機能性抗体ＣＴ１１２をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶベクターにクローニングし、ＣＴ１１２抗体の組換え発現プラスミドを得る。

二重機能性抗体ＣＴ１１２の第１タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１９ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）

二重機能性抗体ＣＴ１１２の第２タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４４９ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＡＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）

二重機能性抗体ＣＴ１１２の第３タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（４６０ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＧＧＳＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ
ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＫＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）

二重機能性抗体ＣＴ１１２の第４タンパク質鎖をコードするアミノ酸配列：（２１０ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）

二重機能性抗体ＣＴ１１２を得る。

＜調製例１７：組換えＴＧＦβ１の調製＞
１．ｐＣＭＶ－ＴＧＦβ１－Ｈｉｓプラスミドの構築ＴＧＦβ１ｈｕｍａｎｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｗｉｚ社合成）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ＴＧＦβ１－Ｈｉｓフラグメントを通常のＤＮＡ産物精製キットで精製回収する。回収後のＴＧＦβ１－Ｈｉｓフラグメントと発現ベクターｐＣＭＶをＮｈｅＩとＸｂａＩ酵素を用いて切断し、標的遺伝子フラグメントと線形発現ベクターをゲル抽出し、Ｔ４リガーゼで連結し、ＤＨ５α化学感受性細胞にすべての連結生成物の形質転換を実施した後、Ａｍｐを有するＡｇａｒプレートに塗布し、よく分離された単コロニーを選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲ鑑定結果が陽性であるクローンをＬＢ培地に接種して培養し、菌液を採取して広州英俊公司に送ってシーケンシングを行った。シーケンシング結果を比較すると、陽性組換え挿入配列が完全に正しいことを示した。

２．融合タンパク質ＴＧＦβ１－Ｈｉｓの発現と精製
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＴＧＦβ１－ｈｉｓをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をしてＢｉｎｄｉｎｇ
ＢｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に置き換え、ＨｉｓＴｒａｐカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ＭＩｍｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）でタンパク質を線形溶出し、最初の精製試料をＨｉＴｒａｐＤｅｓａｌｔｉｎｇカラムでＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に置き換え、ＨｉＴｒａｐＱカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ９．０）を用いてタンパク質を線形溶出し、標的試料を回収し、ＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

融合タンパク質ＴＧＦβ１－Ｈｉｓを得る。

ＴＧＦβ１－Ｈｉｓのアミノ酸配列は次のとおりである（１１８ａａ）：
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）

そのうち、下線部分はＴＧＦβ１のアミノ酸配列である。

ＴＧＦβ１－Ｈｉｓをコードする核酸配列
ＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）

＜調製例１８：組換えタンパク質ＣＤ４－Ｈｉｓの発現と精製＞
１．ｐＣＭＶ－ＣＤ４－Ｈｉｓプラスミドの構築
ＣＤ４ｈｕｍａｎｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｗｉｚ社合成）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ＣＤ４－Ｈｉｓフラグメントを通常のＤＮＡ産物精製キットで精製回収する。回収後のＣＤ４－Ｈｉｓフラグメントと発現ベクターｐＣＭＶをＮｈｅＩとＸｂａＩ酵素を用いて切断し、目的の遺伝子フラグメントと線形発現ベクターをゲル抽出し、Ｔ４リガーゼで連結し、ＤＨ５α化学感受性細胞にすべての連結生成物の形質転換を実施した後、Ａｍｐを有するＡｇａｒプレートに塗布し、よく分離された単コロニーを選択してＰＣＲ鑑定を行い、ＰＣＲ鑑定結果が陽性であるクローンをＬＢ培地に接種して培養し、菌液を採取して広州英俊公司に送ってシーケンシングを行った。シーケンシング結果を比較すると、陽性組換え挿入配列が完全に正しいことを示した。

２．組換えタンパク質ＣＤ４－Ｈｉｓの発現と精製
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＣＤ４－ｈｉｓをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をしてＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に置き換え、ＨｉｓＴｒａｐカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ＭＩｍｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）でタンパク質を線形溶出し、最初の精製試料をＨｉＴｒａｐＤｅｓａｌｔｉｎｇカラムでＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に置き換え、ＨｉＴｒａｐＱカラムに試料を添加し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＢ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ９．０）を用いてタンパク質を線形溶出し、標的試料を回収し、ＰＢＳ溶液に交換する。精製後の試料に還元型タンパク質電気泳動のローディングバッファーを加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

融合タンパク質ＣＤ４－Ｈｉｓを得る。

ＣＤ４－Ｈｉｓのアミノ酸配列は次のとおりである（３７１ａａ）：
ＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫＩＬＧＮＱＧＳＦＬＴＫＧＰＳＫＬＮＤＲＡＤＳＲＲＳＬＷＤＱＧＮＦＰＬＩＩＫＮＬＫＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴＬＴＬＥＳＰＰＧＳＳＰＳＶＱＣＲＳＰＲＧＫＮＩＱＧＧＫＴＬＳＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱＫＫＶＥＦＫＩＤＩＶＶＬＡＦＱＫＡＳＳＩＶＹＫＫＥＧＥＱＶＥＦＳＦＰＬＡＦＴＶＥＫＬＴＧＳＧＥＬＷＷＱＡＥＲＡＳＳＳＫＳＷＩＴＦＤＬＫＮＫＥＶＳＶＫＲＶＴＱＤＰＫＬＱＭＧＫＫＬＰＬＨＬＴＬＰＱＡＬＰＱＹＡＧＳＧＮＬＴＬＡＬＥＡＫＴＧＫＬＨＱＥＶＮＬＶＶＭＲＡＴＱＬＱＫＮＬＴＣＥＶＷＧＰＴＳＰＫＬＭＬＳＬＫＬＥＮＫＥＡＫＶＳＫＲＥＫＡＶＷＶＬＮＰＥＡＧＭＷＱＣＬＬＳＤＳＧＱＶＬＬＥＳＮＩＫＶＬＰＴＷＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）

そのうち、下線部分はＣＤ４のアミノ酸配列である。

ＣＤ４－Ｈｉｓをコードする核酸配列
ＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＧＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＣＧＧＡＴＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＡＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴＣＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＣＴＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）

＜調製例１９：融合タンパク質ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃの発現と精製＞
１．遺伝子ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃの合成
遺伝子ＴＧＦβＲＩＩ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＢｅｔａＲｅｃｅｐｔｏｒＩＩ，ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００１０２００１８．１）の細胞外フラグメントＴＧＦβＲＩＩ－ＥＣＤに対応するアミノ酸は、それぞれＴｈｒｏｍｂｉｎ酵素切断部位及びヒトＩｇＧのＦｃタンパク質フラグメント（ｈＦｃ）と融合設計を行い（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）、金唯智会社に対応するコード化核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）の合成を依頼した。

ＴＧＦβＲＩＩ：ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＢｅｔａＲｅｃｅｐｔｏｒＩＩ，ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００１０２００１８．１；
ｈＦｃ：Ｉｇｇａｍｍａ－１ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７，１０６－３３０；
融合タンパク質ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃのアミノ酸配列：（３７０ａａ）
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＶＰＲＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）

そのうち、二重下線を付けたのはＴＧＦβＲＩＩのＥＣＤ部分、波線を付けたのはＴｈｒｏｍｂｉｎ酵素切断部位、単一下線を付けたのはｈＦｃ部分である。

融合タンパクＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃをコードする核酸配列：（１１１０ｂＰ）
ＡＣＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣＧＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＣＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＴＴＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）

２．ｐＣＭＶ－ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃプラスミドの構築
金唯智会社が合成したＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃコード遺伝子をｐＣＭＶ（当社所有）発現ベクターにクローニングし、ｐＣＭＶ－ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃプラスミドを得る。

３．ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃをトランスフェクションする
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入）に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃをトランスフェクションする。

４．ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に組換えプラスミドｐＣＭＶ－ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃをトランスフェクションした５日後、培養液を高速遠心分離、微孔ろ過膜による真空ろ過およびＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇカラムの精製によりＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃ融合タンパク質試料を取得し、一部の試料を取って還元型タンパク質電気泳動ローディングバッファーに加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。

融合タンパク質ＴＧＦβＲＩＩ－ｈＦｃを得る。

＜調製例２０：抗ＣＤ４の抗体Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂの調製＞
市販されているＣＤ４単クローン抗体Ｔｒｏｇａｒｚｏ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、米国特許公開第ＵＳ００５８７１７３２号を参照する。重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、金斯瑞会社に合成を依頼した。

Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１２２ａａ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）

Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ重鎖可変領域をコードする核酸配列：（３６６ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）

Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１１２ａａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）

Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ軽鎖可変領域をコードする核酸配列：（３３６ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）

重鎖定常領域はＩｇｇａｍｍａ－４ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８６１を採用し、軽鎖定常領域はＩｇｋａｐｐａｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４を採用する。

Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂの重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡをそれぞれｐＣＭＶベクターにクローニングし、抗体Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂの組換え発現プラスミドを得る。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に組換え発現プラスミドをトランスフェクションする。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞培養液を精製して測定する。

抗ＣＤ４単クローン抗体Ｔｒｏｇａｒｚｏ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）を得る。

＜調製例２１：抗ＴＧＦβ１の抗体ＣＡＴ１９２の調製と試験＞
抗体ＣＡＴ１９２重鎖可変領域のアミノ酸配列：（１２３ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）

抗体ＣＡＴ１９２重鎖可変領域の核酸配列：（３６９ｂｐ）
ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８１）

抗体ＣＡＴ１９２軽鎖可変領域のアミノ酸配列：（１０７ａａ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２）

抗体ＣＡＴ１９２軽鎖可変領域の核酸配列：（３２１ｂｐ）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＣＣＡＡＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８３）

抗ＴＧＦβ１の抗体ＣＡＴ１９２を得る。

＜実施例１：２価二重抗体ＣＴ１０１と１価二重抗体ＣＴ１１０、ＣＴ１１１、ＣＴ１１２のＴＧＦ－β１が誘導するＨＥＫ２９３細胞のＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル活性化への抑制効果の比較＞
ＨＥＫ２９３細胞を１×１０^５／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄプロモーター活性ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＳＭＡＤ－Ｌｕｃおよびレニラルシフェラーゼの内部参照プラスミドｐＲＬ－ＴＫをトランスフェクションする。トランスフェクション２４時間後、濃度が異なるＣＴ１０１、ＣＴ１１０、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２抗体を加えて１２時間培養し続ける。１２時間後、培地を捨て、１ウェル当たりの細胞に対して１００μＬの１ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を使用して分解する。７０μＬ分解液を取ってＥＬＩＳＡプレートに入れ、基質１溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＡｎとして読み取る。さらに基質２溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＢｎとして読み取る。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。Ａｎ／Ｂｎの比はＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化倍数である。

結果を図３に示す。その結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１１０、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２のいずれもＴＧＦ－β１が誘導するＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制することができ、用量依存関係を呈している。また、同じ用量下で、ＴＧＦ－β１が誘導するＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を抑制するＣＴ１０１の薬理的活性はＣＴ１１０、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２よりやや優れており、そのＩＣ_５０はそれぞれ２５０、７５０、８００および１０００ｐＭである。

＜実施例２：２価二重抗体ＣＴ１０１と１価二重抗体ＣＴ１１０、ＣＴ１１１、ＣＴ１１２のＴＧＦ－β１が誘導するＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞のＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル活性化への抑制効果の比較＞
ＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞を１×１０^５／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄプロモーター活性ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＳＭＡＤ－Ｌｕｃおよびレニラルシフェラーゼの内部参照プラスミドｐＲＬ－ＴＫをトランスフェクションする。トランスフェクション２４時間後、濃度が異なるＣＴ１０１、ＣＴ１１０、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２抗体を加えて１２時間培養し続ける。１２時間後、培地を捨て、１ウェル当たりの細胞に対して１００μＬの１ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を使用して分解する。７０μＬ分解液を取ってＥＬＩＳＡプレートに入れ、基質１溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＡｎとして読み取る。さらに基質２溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＢｎとして読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ
Ｐｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。Ａｎ／Ｂｎの比はＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化倍数である。

結果を図４に示す。その結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１のみがＴＧＦ－β１が誘導するＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制することができ、用量依存関係を呈している。一方、一価二重抗ＣＴ１１０、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２は、０．１～１０００ｐＭの濃度範囲に用量依存的にＴＧＦ－β１の活性を部分的に抑制することができ、１０００ｐＭ濃度以上になると、ＴＧＦ－β１活性への抑制が用量依存的に増強する。ＴＧＦ－β１が誘導するＨＥＫ９３－ＣＤ４細胞のＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制するＣＴ１０１のＩＣ_５０値は１５ｐＭである。

＜実施例３：二重抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１０３、ＣＴ１０４、ＣＴ１０５、ＣＴ１０６、ＣＴ１０７、ＣＴ１０８およびＣＴ１０９のＴＧＦ－β１が誘導するＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞のＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル活性化への抑制効果の比較＞
ＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞を１×１０^５／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄプロモーター活性ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＳＭＡＤ－Ｌｕｃおよびレニラルシフェラーゼの内部参照プラスミドｐＲＬ－ＴＫをトランスフェクションする。トランスフェクション２４時間後、濃度が異なるＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１０３、ＣＴ１０４、ＣＴ１０５、ＣＴ１０６、ＣＴ１０７、ＣＴ１０８およびＣＴ１０９抗体を加えて１２時間培養し続けた。１２時間後、培地を捨て、１ウェル当たりの細胞に対して１００μＬの１ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を使用して分解する。７０μＬ分解液を取ってＥＬＩＳＡプレートに入れ、基質１溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＡｎとして読み取る。さらに基質２溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＢｎとして読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ
Ｐｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。Ａｎ／Ｂｎの比はＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化倍数である。

結果を図５に示す。その結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１０３、ＣＴ１０４、ＣＴ１０５、ＣＴ１０６、ＣＴ１０７、ＣＴ１０８およびＣＴ１０９のいずれもＴＧＦ－β１が誘導するＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制することができ、用量依存関係を呈している。また、同じ用量下で、ＴＧＦ－β１が誘導するＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を抑制するＣＴ１０２の薬理的活性は他の抗体よりもはるかに優れており、そのＩＣ_５０は２ｐＭである。ＴＧＦ－β１が誘導するＴＧＦ－β／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制する他の二重抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０３、ＣＴ１０４、ＣＴ１０５、ＣＴ１０６、ＣＴ１０７、ＣＴ１０８およびＣＴ１０９のＩＣ_５０はそれぞれ１５ｐＭ、２５００ｐＭ、２４００ｐＭ、２５００ｐＭ、３００ｐＭ、２６００ｐＭ、２７００ｐＭおよび５０ｐＭである。

＜実施例４：抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２の動力学パラメータ測定＞
１．二重機能性抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２がＣＤ４と結合する場合の動力学パラメータ測定
Ｂｉａｃｏｒｅ分子間相互作用解析装置を用いて抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２とヒトＣＤ４の親和力定数を測定する。ＨＢＳ－ＥＰを緩衝液とし、Ｂｉｃａｏｒｅ標準アミンカップリング法でヒトＣＤ４をＣＭ５チップの表面に固定化する。抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２がヒトＣＤ４と結合し、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２の濃度は２５０ｎＭ、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、結合時間は１２０ｓ、解離時間は８８０ｓである。チップは１０ｍＭグリシンであり、ｐＨ２．７で再生し、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、時間は１２０ｓである。１：１モデルでデータのフィッティング解析を行い、親和力定数を得る。データの収集はＢｉａｃｏｒｅＣｏｎｔｒｏｌ２．０ソフトウェアを用い、データの解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０ソフトウェアを用いる。抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２がヒトＣＤ４と結合する場合の動力学パラメータを表１に示し、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２がヒトＣＤ４と結合する場合の動特性パラメータの測定結果をそれぞれ図６に示す。

結果からわかるように、２価抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２は抗原ＣＤ４と比較的高い親和力を有し、その親和力は、１価抗体ＣＴ１１１、抗体ＣＴ１１２よりやや優れる。

２．抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２がＴＧＦ－β１と結合する場合の動力学パラメータ測定
Ｂｉａｃｏｒｅ分子間相互作用解析装置を用いて抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２とＴＧＦ－β１の親和力定数を測定する。ＨＢＳ－ＥＰを緩衝液とし、Ｂｉｃａｏｒｅ標準アミンカップリング法でヒトＴＧＦ－β１をＣＭ５チップの表面に固定化する。抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２がヒトＴＧＦ－β１と結合し、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１及びＣＴ１１２の濃度は２５０ｎＭ、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、結合時間は１２０ｓ、解離時間は８８０ｓである。チップは１０ｍＭグリシンであり、ｐＨ２．７で再生し、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、時間は１２０ｓ。１：１モデルでデータのフィッティング解析を行い、親和力定数を得る。データの収集はＢｉａｃｏｒｅＣｏｎｔｒｏｌ２．０ソフトウェアを用い、データの解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０ソフトウェアを用いる。抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２がヒトＴＧＦ－β１と結合する場合の動力学パラメータを表２に示し、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＣＴ１１１およびＣＴ１１２がヒトＴＧＦ－β１と結合する場合の動特性パラメータの測定結果をそれぞれ図７に示す。

結果からわかるように、２価抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２のいずれも抗原ＴＧＦ－β１と比較的高い親和力を有し、その親和力は、１価抗体ＣＴ１１１、ＣＴ１１２よりやや優れている。

＜実施例５：ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＴＧＦ－β１抗体および対照抗体のヒト化ＣＤ４マウスヘルパーＴ細胞への結合＞
ヒト化ＣＤ４マウスは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞上でヒトＣＤ４分子を特異的に発現し、フローサイトメトリー分析法を用いて体内でのＣＤ４ヘルパーＴ細胞に対する抗体の特異的結合能力を検証する。

２００μｇのＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＴＧＦ－β１抗体及び対照抗体をヒト化ＣＤ４マウスに尾静脈注射した。４時間後、マウスを安楽殺処分し、マウスのリンパ節を取り出し、ホモジナイザで粉砕した後、組織の破片を濾過し、細胞を収集して氷の上に置いて抗体混合液と３０分インキュベートする。抗体混合液は、ＦＩＴＣ標識ラット抗マウスＣＤ４５ＩｇＧ（１：４００）、ＡＰＣ標識ラット抗マウスＴＣＲβ ＩｇＧ（１：２００）、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識ラット抗マウスＣＤ４ＩｇＧ（１：２００）、ＰＥ－Ｃｙ７標識ラット抗マウスＣＤ８ＩｇＧ（１：２００）、ＰＥ標識ヒツジ抗ヒトＦｃＩｇＧ（１：４００）であり、１ｘＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％アジドナトリウム）で希釈する。ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ再懸濁細胞を２００μＬ加え、フローサイトメータ上で蛍光信号（ＭＦＩ，ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を検出する。

その結果を図１０に示す、抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２のいずれもＣＤ４分子と結合することによりヘルパーＴ細胞に効果的に付着することができるため、ヘルパーＴ細胞上のＴＧＦ－βシグナル経路の活性化を特異的に抑制することができる。一方、ＴＧＦ－β１抗体および対照抗体はＣＤ４分子と結合できないため、ヘルパーＴ細胞に付着することはできない。

＜実施例６：高用量静脈注射の場合のヒト化ＣＤ４マウスにおけるＣＴ１０１、ＣＴ１０２の薬物代謝＞
ヒト化ＣＤ４マウスの体内におけるＣＴ１０１およびＣＴ１０２の高用量尾静脈注射下の薬物代謝を測定するために、尾静脈を介して２００μｇのＣＴ１０１またはＣＴ１０２抗体を８～１０週齢のヒト化ＣＤ４マウスに注射し、血液を採取して抗体の血清濃度を測定し、かつ２４時間間隔で血液を採取して抗体の血清濃度を測定する。

ＥＬＩＳＡ法で血清中の抗体ＣＴ１０１、ＣＴ１０２の濃度を測定する方法は、具体的には以下のとおりである。

ＣＤ４－ＨｉｓでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、３７℃で３時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡで１時間密封する。プレートを洗浄した後、希釈した血清を加え、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、酵素標識のロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体希釈剤を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液を加え、光を避けて５ｍｉｎ発色し、停止液を加えて発色反応を停止させる。直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、４５０ｎｍ光波長を選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルのＯＤ数値を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。

抗体ＣＴ１０１とＣＴ１０２を高用量で静脈注射した場合の薬物代謝結果を図１１に示す。抗体注射後時間を横軸とし、血清濃度を縦軸として曲線フィッティングを行い、抗体ＣＴ１０１およびＣＴ１０２の半減期ｔ_１／２はいずれも６０時間であると算出した。

＜実施例７：低用量静脈注射の場合のヒト化ＣＤ４マウスの体内におけるＣＴ１０１、ＣＴ１０２の薬物代謝＞
ヒト化ＣＤ４マウスの体内におけるＣＴ１０１およびＣＴ１０２の低用量尾静脈注射下の薬物代謝を測定するために、尾静脈を介して２０μｇのＣＴ１０１またはＣＴ１０２抗体を８～１０週齢ヒト化ＣＤ４マウスに注射し、血液を採取して抗体の血清濃度を測定し、２４時間間隔で血液を採取して抗体の血清濃度を測定する。

抗体ＣＴ１０１とＣＴ１０２を低用量で静脈注射した場合の薬物代謝結果を図１２に示す。抗体注射後時間を横軸とし、血清濃度を縦軸として曲線フィッティングを行い、抗体ＣＴ１０１およびＣＴ１０２の半減期ｔ_１／２はそれぞれ３０、３２時間であると算出した。

＜実施例８：高用量抗体治療による体内腫瘍成長の抑制試験＞
高用量ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＴＧＦ－β１抗体及び対照抗体の体内腫瘍抑制活性を測定するため、まずＭＣ３８結腸癌細胞を用いて、８～１０週齢の雌性ヒト化ＣＤ４マウス皮下に接種する。その後５日に１回投与し、毎回尾静脈に２００μｇ注射し、合計４回投与する。投与後に各群の腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積を算出する。

その結果を図１３に示す。試験結果からわかるように、高用量の場合、対照抗体とＴＧＦ－β１抗体と比較して、ＣＴ１０１、ＣＴ１０２はいずれもマウス腫瘍の成長に対して抑制効果があり、両者の腫瘍抑制効果は同等である。

＜実施例９：低用量抗体治療による体内腫瘍成長の抑制試験＞
低用量ＣＴ１０１、ＣＴ１０２、ＴＧＦ－β１抗体及び対照抗体の体内腫瘍抑制活性を測定するため、まずＭＣ３８結腸癌細胞を用いて、８～１０週齢の雌性ヒト化ＣＤ４マウス皮下に接種する。その後５日に１回投与し、毎回尾静脈に２０μｇ注射し、合計４回投与する。投与後に各群の腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積を算出する。

その結果を図１４に示す。試験結果からわかるように、低用量の場合、対照抗体とＴＧＦ－β１抗体と比較して、ＣＴ１０１、ＣＴ１０２はいずれもマウス腫瘍の成長に対して抑制効果があるが、ＣＴ１０２の腫瘍抑制効果は、ＣＴ１０１より優れている。

＜実施例９：異なる二重機能性抗体による体内腫瘍成長抑制試験＞
異なる二重機能性抗体および対照抗体の体内腫瘍抑制活性を測定するため、まずＥＭＴ－６乳癌細胞を用いて、６－８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下に接種する。その後、５日に１回投与し、毎回尾静脈に５０μｇ注射し、合計５回投与する。投与後に各群の腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積を算出する。

結果を図１５に示す。試験結果からわかるように、対照抗体ＩｇＧおよび抗ＴＧＦβ（クローン１Ｄ１１）抗体と比較して、抗ＣＤ４／抗ＴＧＦβはマウス腫瘍に対して最も強い抑制効果があり、その次は抗ＣＤ６４／抗ＴＧＦβであり、抗ＣＤ８／抗ＴＧＦβはＴＧＦβ抗体と比較して、明らかな効果はない。

＜実施例２：二重機能性抗体ＣＴ１０１の重鎖及び軽鎖の配列設計、調製及び測定＞
１．配列設計
本発明の二重機能性抗体ＣＴ１０１の構造パターンは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎパターン（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）に属し、すなわち、１つのＩｇＧ抗体の２つの重鎖のＣ端に別の抗体のｓｃＦｖフラグメントを連結し、その重鎖と軽鎖の主要な組成設計及び配列情報を図１６と図１７に示す。

２．抗体ＣＴ１０１の発現と精製
ＣＴ１０１の重鎖ｃＤＮＡ配列と軽鎖のｃＤＮＡ配列をそれぞれｐＣＭＶベクターにクローニングし、組換えプラスミドを抽出してトランスフェクションＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。細胞を５日培養した後、培養液を高速遠心分離、上清濃縮をしてＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇカラムに試料を添加し、Ｅｌｕｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒを用いてタンパク質を一歩で溶出し、標的試料抗体ＣＴ１０１を回収し、ＰＢＳ溶液に交換する。

２．抗体ＣＴ１０１の測定
精製後の抗体ＣＴ１０１をそれぞれ還元型タンパク質電気泳動ローディングバッファーと非還元型タンパク質電気泳動ローディングバッファーに加え、煮沸後にＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動試験を行う。ＣＴ１０１の電気泳動図は図１８に示すように、還元型タンパク質試料の標的タンパク質は７５ｋＤと２５ｋＤにあり、非還元型タンパク質試料（単一抗体）の標的タンパク質は２００ｋＤにある。

３．抗体ＣＴ１０１の高速液体クロマトグラフィー分析
精製後の抗体ＣＴ１０１をＡＫＴＡ精製装置上のＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００１０／３００ＧＬカラム（通用会社）に流し、ＰＢＳ溶液を用いてシステムを０．５ｍＬ／分で流す。抗体ＣＴ１０１の高速液体クロマトグラフィーは図１９に示すように、ＣＴ１０１は主に単量体の形で存在し（９０％）、また、１０％は多量体の形で存在する。

以下の試験で用いたヒト化抗体ＣＴ１０１は、特に説明していない限り、本実施例の方法を参照して調製する。

＜実施例１０：抗体ＣＴ１０１の動力学パラメータ測定＞
１．二重機能性抗体ＣＴ１０１がＣＤ４と結合する場合の動力学パラメータ測定
Ｂｉａｃｏｒｅ分子間相互作用解析装置を用いて抗体ＣＴ１０１とヒトＣＤ４の親和力定数を測定する。ＨＢＳ－ＥＰを緩衝液とし、Ｂｉｃａｏｒｅ標準アミンカップリング法でヒトＣＤ４をＣＭ５チップの表面に固定化する。抗体ＣＴ１０１がヒトＣＤ４と結合し、抗体ＣＴ１０１の濃度は８－２５０ｎＭ（２倍希釈）、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、結合時間は１２０ｓ、解離時間は８８０ｓである。チップは１０ｍＭグリシンであり、ｐＨ２．７で再生し、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、時間は１２０ｓである。１：１モデルでデータのフィッティング解析を行い、親和力定数を得る。データの収集はＢｉａｃｏｒｅＣｏｎｔｒｏｌ２．０ソフトウェアを用い、データの解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０ソフトウェアを用いる。抗体ＣＴ１０１、ＩｂａｌｉｚｕｍａｂがヒトＣＤ４と結合する場合の動力学パラメータを表３に示し、抗体ＣＴ１０１がヒトＣＤ４と結合する場合の動特性パラメータの測定結果をそれぞれ図２０に示す。

結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１は抗原と比較的高い親和力を有し、その親和力は、対照抗体Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂよりやや優れる。

２．二重機能性抗体ＣＴ１０１がＴＧＦβ１と結合する場合の動力学パラメータ測定
Ｂｉａｃｏｒｅ分子間相互作用解析装置を用いて抗体ＣＴ１０１とＴＧＦβ１の親和力定数を測定する。ＨＢＳ－ＥＰを緩衝液とし、Ｂｉｃａｏｒｅ標準アミンカップリング法でヒトＴＧＦ－β１をＣＭ５チップの表面に固定化する。抗体ＣＴ１０１がヒトＴＧＦ－β１と結合し、抗体ＣＴ１０１の濃度は８－２５０ｎＭ（２倍希釈）、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、結合時間は１２０ｓ、解離時間は８８０ｓである。チップは１０ｍＭグリシンであり、ｐＨ２．７で再生し、流速は３０μｌ／ｍｉｎ、時間は１２０ｓである。１：１モデルでデータのフィッティング解析を行い、親和力定数を得る。データの収集はＢｉａｃｏｒｅＣｏｎｔｒｏｌ２．０ソフトウェアを用い、データの解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０ソフトウェアを用いる。抗体ＣＴ１０１、ＣＡＴ１９２がヒトＴＧＦβ１と結合する場合の動力学パラメータを表４に示し、抗体ＣＴ１０１がヒトＴＧＦβ１と結合する場合の動特性パラメータの測定結果をそれぞれ図２１に示す。

結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１、ＣＡＴ１９２のいずれも抗原ＴＧＦβ１と比較的高い親和力を有する。

＜実施例１１：ＥＬＩＳＡ法による抗体ＣＴ１０１と抗原との結合活性の測定＞
１．間接ＥＬＩＳＡ法による抗体ＣＴ１０１、ＣＡＴ１９２と抗原ＴＧＦβ１－Ηｉｓとの結合活性の測定
その測定方法は具体的には以下の通りである。

ＴＧＦβ１－ＨｉｓでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、３７℃で３時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡで１時間密封する。プレートを洗浄した後、連続希釈した抗体を加え、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、酵素標識のロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体希釈剤を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液を加え、光を避けて５ｍｉｎ発色し、停止液を加えて発色反応を停止させる。直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、４５０ｎｍ光波長を選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルのＯＤ数値を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ
Ｐｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。

抗体ＣＴ１０１と抗原ＴＧＦβ１－Ηｉｓとの結合の測定結果を図２２に示す。抗体濃度を横座標、吸光度値を縦座標として曲線フィッティングを行い、抗体の結合ＥＣ_５０を算出する。その結果を表５に示す。

結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１とＣＡＴ１９２のいずれもＴＧＦβ１タンパク質と効果的に結合でき、かつ結合効率は用量依存関係を呈している。

２．間接ＥＬＩＳＡ法による抗体ＣＴ１０１、ｉｂａｌｉｚｕｍａｂとＣＤ４との結合活性の測定
その方法は具体的には以下の通りである：
ＣＤ４－ＨｉｓでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、３７℃で３時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡで１時間密封する。プレートを洗浄した後、連続希釈した抗体を加え、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、酵素標識のロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体希釈剤を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液を加え、光を避けて５ｍｉｎ発色し、停止液を加えて発色反応を停止させる。直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、４５０ｎｍ光波長を選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルのＯＤ数値を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。

抗体ＣＴ１０１と抗原ＣＤ４との結合の測定結果を図２３に示す。抗体濃度を横座標、吸光度値を縦座標として曲線フィッティングを行い、抗体の結合ＥＣ_５０を算出する。その結果を表６に示す。

結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１とｉｂａｌｉｚｕｍａｂのいずれもＣＤ４タンパク質と効果的に結合でき、結合数量は用量依存関係を呈している。

３．競合ＥＬＩＳＡ法による抗体ＣＴ１０１、ＣＡ１９２はＴＧＦＢＲＩＩと競合して抗原ＴＧＦβ１と結合する活性の測定
その方法は具体的には以下の通りである。

ＴＧＦβ１－ＨｉｓでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、３７℃で３時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡで１時間密封する。プレートを洗浄した後、連続希釈した抗体とヒトＴＧＦβＲＩＩ－ＥＣＤ－Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンＳＡ－ＨＲＰ（１：２０００）希釈剤を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液を加え、光を避けて５ｍｉｎ発色し、停止液を加えて発色反応を停止させる。直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、４５０ｎｍ光波長を選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルのＯＤ数値を読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ
Ｐｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。

測定結果を図２４に示す。結合した抗体ＣＴ１０１に対して吸光強度の定量分析を行い、抗体の結合効率を曲線でシミュレーションして結合ＥＣ_５０を得る（表７）。

結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１とＣＡＴ１９２のいずれもＴＧＦβ１と効果的に結合でき、ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との結合を抑制し、ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との結合を抑制する抗体の効率は用量依存関係を呈している。

＜実施例１２：抗体ＣＴ１０１の細胞膜表面抗原ＣＤ４に対する結合＞
まずヒトＣＤ４抗原を発現するＨＥＫ２９３を構築し、その後、フローサイトメトリー分析を用いて細胞膜表面抗原ＣＤ４に対する抗体の特異的結合能力を検証する。

１．ヒトＣＤ４抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞の構築
スローウイルスベクターｐＨＡＧＥ－ＣＤ４－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰおよびヘルパープラスミドｐＳＰＡＸ２、ｐＭＤ２．ＧをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、４８時間後、上清を収集し、０．４５μｍのろ過膜を使用してろ過した後、新たなＨＥＫ２９３細胞に感染させる。感染４８時間後、フローサイトメータでＥＧＦＰを検出し、ＣＤ４を安定的に発現するクローン集団ＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞を選別する。

２．抗体ＣＴ１０１の細胞膜表面抗原に対する結合の測定
上記の手順で得られたＣＤ４抗原を発現するＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞を通常の膵酵素消化法を用いて消化し、各収集管内の細胞数を２×１０^５にし、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）を用いて抗体濃度の連続希釈液を調製し、氷上でＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞と３０分間インキュベートし、各管にＦＩＴＣ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（１：２００）を１００μＬ加え、氷上で３０分インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ再懸濁細胞を２００μＬ加え、フローサイトメータでＦＩＴＣチャネルを用いて蛍光信号（ＭＦＩ，ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を検出する。

結果を図２５に示す。結合したＣＴ１０１抗体とＩｂａｌｉｚｕｍａｂに対して蛍光定量分析と曲線フィッティングを行い、ＣＴ１０１抗体とｉｂａｌｉｚｕｍａｂの結合ＥＣ_５０を算出して表８に示す。

その結果からわかるように、ＣＴ１０１抗体はＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞表面のＣＤ４抗原を効果的に結合することができ、その結合効率は用量依存関係を呈し、ＩｂａｌｉｚｕｍａｂのＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞表面のＣＤ４抗原に対する結合活性はＣＴ１０１と類似し、二重機能抗体ＣＴ１０１の抗ＣＤ４機能は抗体改質による影響を受けていないことが示された。

＜実施例１３：ＣＴ１０１抗体のＴＧＦβ１が誘導するＨＥＫ２９３細胞のＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化への抑制＞
ＨＥＫ２９３細胞を１×１０^５／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＴＧＦβ／Ｓｍａｄプロモーター活性ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＳＭＡＤ－Ｌｕｃおよびレニラルシフェラーゼの内部参照プラスミドｐＲＬ－ＴＫをトランスフェクションする。トランスフェクション２４時間後、濃度が異なるＣＴ１０１抗体とＣＡＴ１９２抗体を加えて１２時間培養し続ける。１２時間後、培地を捨て、１ウェル当たりの細胞に対して１００μＬ１ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を使用して分解する。７０μＬ分解液を取ってＥＬＩＳＡプレートに入れ、基質１溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＡｎとして読み取る。さらに基質２溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＢｎとして読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ
Ｐｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。Ａｎ／Ｂｎの比はＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化倍数である。

結果を図２６に示す。その結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１、ＣＡＴ１９２のいずれもＴＧＦβ１が誘導するＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制することができ、かつ用量依存関係を呈している。同じ用量下で、ＴＧＦβ１が誘導するＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制するＣＴ１０１の薬理的活性はＣＡＴ１９２と類似しており、そのＩＣ_５０は、いずれも約２５０ｐＭである。

＜実施例１４：ＣＴ１０１抗体のＴＧＦβ１が誘導するＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞のＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化への抑制＞
ＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞を１×１０^５／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートに５００μＬ／ウェルずつ接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＴＧＦβ／Ｓｍａｄプロモーター活性ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＳＭＡＤ－Ｌｕｃおよびレニラルシフェラーゼの内部参照プラスミドｐＲＬ－ＴＫをトランスフェクションする。トランスフェクション２４時間後、濃度が異なるＣＴ１０１抗体とＣＡＴ１９２抗体を加えて１２時間培養し続ける。１２時間後、培地を捨て、１ウェル当たりの細胞に対して１００μＬの１ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を使用して分解する。７０μＬの分解液を取ってＥＬＩＳＡプレートに入れ、基質１溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＡｎとして読み取る。さらに基質２溶液を３０μＬ加え、直ちにＥＬＩＳＡプレートをマイクロプレートリーダに入れ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを選択してＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの数値をＢｎとして読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ
Ｐｒｏソフトウェアを用いてデータを解析処理する。Ａｎ／Ｂｎの比はＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化倍数である。

結果を図２７に示す。その結果からわかるように、抗体ＣＴ１０１、ＣＡＴ１９２のいずれもＴＧＦβ１が誘導するＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制することができ、かつ用量依存関係を呈している。同じ用量下で、ＴＧＦβ１が誘導するＨＥＫ２９３－ＣＤ４細胞のＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル経路の活性化を効果的に抑制するＣＴ１０１の薬理的活性はＣＡＴ１９２よりはるかに優れており、そのＩＣ_５０は、それぞれ１５ｐＭと２５０ｐＭである。

＜実施例１５：ＣＴ１０１による体内腫瘍成長の抑制試験＞
抗体ＣＴ１０１の体内腫瘍抑制活性を測定するため、まずＭＣ３８結腸癌細胞を用いて、６～８週齢の雌性ヒト化ＣＤ４トランスジェニックマウス皮下に接種する。その後５日に１回投与し、毎回尾静脈に５０μｇ注射し、合計４回投与する。投与後に各群の腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積を算出する。

結果を図２８に示す。結果からわかるように、同種対照抗体ＩｇＧ、ＣＡＴ１９２、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（抗ＰＤＬ１抗体）、またはａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ結合ＣＡＴ１９２と比較して、ＣＴ１０１はマウス腫瘍に対してより強い抑制効果があることが示された。

本発明に係る配列は以下の通りである
第１タンパク質機能領域ＶＨドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

第１タンパク質機能領域ＶＬドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ

第２タンパク質機能領域ＶＨドメイン１型（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

第２タンパク質機能領域ＶＨドメイン２型（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＳＧＶＥＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

第２タンパク質機能領域ＶＨドメイン３型（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＦＹＳＧＹＤＴＰＡＳＰＤＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

第２タンパク質機能領域ＶＬドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ

連結フラグメント（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

連結フラグメント構成要素（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）
ＧＧＧＧＳ

ヒトＩｇＧ４ κ軽鎖ＣＬドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
ＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

ヒトＩｇＧ４ＣＨ１ドメイン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ

ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（Ｓ２２８Ｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）
ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰ

ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）
ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

二重機能性抗体ＣＴ１０１の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

二重機能性抗体ＣＴ１０１の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ

二重機能性抗体ＣＴ１０２の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫ

二重機能性抗体ＣＴ１０２の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

二重機能性抗体ＣＴ１０３の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

二重機能性抗体ＣＴ１０３の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

二重機能性抗体ＣＴ１０４の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

二重機能性抗体ＣＴ１０４の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤ
ＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

二重機能性抗体ＣＴ１０５の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

二重機能性抗体ＣＴ１０５の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）
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二重機能性抗体ＣＴ１０６の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）
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二重機能性抗体ＣＴ１０６の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）
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二重機能性抗体ＣＴ１０６の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
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二重機能性抗体ＣＴ１０６の第４タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）
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二重機能性抗体ＣＴ１０７の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）
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二重機能性抗体ＣＴ１０７の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）
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二重機能性抗体ＣＴ１０７の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）
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二重機能性抗体ＣＴ１０７の第４タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

二重機能性抗体ＣＴ１０８の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

二重機能性抗体ＣＴ１０８の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）
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二重機能性抗体ＣＴ１０８の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）
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二重機能性抗体ＣＴ１０９の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）
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二重機能性抗体ＣＴ１０９の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）
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二重機能性抗体ＣＴ１０９の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）
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二重機能性抗体ＣＴ１１０の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）
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二重機能性抗体ＣＴ１１０の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）
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二重機能性抗体ＣＴ１１０の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）
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二重機能性抗体ＣＴ１１１の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）
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二重機能性抗体ＣＴ１１１の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）
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二重機能性抗体ＣＴ１１１の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）
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二重機能性抗体ＣＴ１１２の第１タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
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二重機能性抗体ＣＴ１１２の第２タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）
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二重機能性抗体ＣＴ１１２の第３タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）
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二重機能性抗体ＣＴ１１２の第４タンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）
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ＴＧＦ－β１抗体（ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４）のタンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）
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ＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

対照抗体（ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４）のタンパク質鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱ
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組換えＣＤ４－Ｈｉｓのタンパク質配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
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組換えＣＤ４－Ｈｉｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）
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ＴＧＦ－β１－Ｈｉｓタンパク質配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳＨＨＨＨＨＨ

組換えＴＧＦ－β１－Ｈｉｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）
ＧＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ

第１タンパク質機能領域ＨＣＤＲ１：（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
ＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨ

第１タンパク質機能領域ＨＣＤＲ２：（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）
ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧ

第１タンパク質機能領域ＨＣＤＲ３：（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）
ＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡ

第１タンパク質機能領域ＬＣＤＲ１：（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡ

第１タンパク質機能領域ＬＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＥＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）
ＷＡＳＴＲＥＳ

第１タンパク質機能領域ＬＣＤＲ３：（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）
ＱＱＹＹＳＹＲＴ

第２タンパク質機能領域ＨＣＤＲ１：（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
ＳＹＧＭＨ

第２タンパク質機能領域ＨＣＤＲ２：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）
ＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧ

第２タンパク質機能領域ＨＣＤＲ３（１型）：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）
ＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳ

第２タンパク質機能領域ＨＣＤＲ３（２型）：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）
ＴＧＥＹＳＧＹＤＴＳＧＶＥＬ

第２タンパク質機能領域ＨＣＤＲ３（３型）：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）
ＴＧＦＹＳＧＹＤＴＰＡＳＰＤ

第２タンパク質機能領域ＨＣＤＲ３共有配列：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）
ＴＧＸ_１ＹＳＧＹＤＴＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６

第２タンパク質機能領域ＬＣＤＲ１：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）
ＲＳＳＱＧＩＧＤＤＬＧ

第２タンパク質機能領域ＬＣＤＲ２：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）
ＧＴＳＴＬＱＳ

第２タンパク質機能領域ＬＣＤＲ３：（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）
ＬＱＤＳＮＹＰＬＴ

ＴＧＦ－β１抗体をコードするアミノ酸配列：（４７５ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＥＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＩＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＧＥＹＳＧＹＤＴＤＰＱＹＳＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＩＬＬＩＹＧＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＬＥＩＫＳＧＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）

本発明の内容は、記載された特定の実施形態について完全かつ明確に説明しているが、これに限定されるものではない。当業者は、これらの記述の指導下で本発明を修正し、置き換えることができ、これらの修正と置換は本発明の保護範囲内に含まれる。本発明のすべての範囲は、添付の特許請求の範囲およびその任意の同等物によって決められる。

Claims

二重特異性抗体であって、少なくとも第１タンパク質鎖と第２タンパク質鎖とを含み、
前記第１タンパク質鎖は、第１タンパク質機能領域の一部または全部の構造、および／または、第２タンパク質機能領域の一部または全部の構造を含み、
前記第１タンパク質機能領域はＣＤ４を標的とし、前記第１タンパク質機能領域は抗ＣＤ４の抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
前記第２タンパク質機能領域はＴＧＦβ１を標的とし、前記第２タンパク質機能領域は抗ＴＧＦβ１の抗体またはその抗原結合フラグメントであることを特徴とする二重特異性抗体。
前記第１タンパク質機能領域の重鎖可変領域はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：５３－ＳＥＱＩＤＮＯ：５５で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ３を含み、前記第１タンパク質機能領域の軽鎖可変領域はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：５６－ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ３を含み、
前記第２タンパク質機能領域の重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：５９で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０で示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１－ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３とを含み、前記第２タンパク質機能領域の軽鎖可変領域はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：６５－ＳＥＱＩＤＮＯ：６７で示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
前記抗ＣＤ４の抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補決定領域フラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は二重抗体から選択され、
および／または、前記抗ＴＧＦβ１の抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補決定領域フラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は二重抗体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第１タンパク質機能領域の重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第１タンパク質機能領域の軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含み、
前記第２タンパク質機能領域は一本鎖抗体またはＦａｂであり、前記第２タンパク質機能領域の重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のいずれかで示されるアミノ酸配列を含み、前記第２タンパク質機能領域の軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第１タンパク質機能領域の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７６で示され、前記第１タンパク質機能領域の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７８で示され、
前記第２タンパク質機能領域は一本鎖抗体またはＦａｂであり、前記第２タンパク質機能領域の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：８０で示され、前記第２タンパク質機能領域の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：８２で示されることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体はＩｇＧ－ＳｃＦｖ／Ｆａｂ形態で存在し、または他の二重特異性抗体の形態で存在することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質機能領域および第２タンパク質機能領域は、独立して１つ、２つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質機能領域と第２タンパク質機能領域とが直接連結するか、連結フラグメントを介して連結し、
好ましくは、前記連結フラグメントは（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、例えば、１、２、３、４、５または６の正の整数であることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記免疫グロブリンの定常領域はヒト抗体由来であり、
好ましくは、前記免疫グロブリンの定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常領域から選択されることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
軽鎖可変領域－軽鎖定常領域－（連結フラグメント）ｍ－重鎖可変領域－（連結フラグメント）ｎ－軽鎖可変領域という式を有し、
前記第２タンパク質鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
重鎖可変領域－重鎖定常領域－ヒンジ－Ｆｃ領域という式を有し、
好ましくは、前記連結フラグメントはＧＧＧＧＳであり、ｍは０または正の整数、ｎは０または正の整数であることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質鎖の軽鎖可変領域－軽鎖定常領域と前記第２タンパク質鎖の重鎖可変領域－重鎖定常領域は互いに結合してタンパク質鎖群を形成し、２本のタンパク質鎖群は二量体を形成することを特徴とする請求項１０に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質鎖のＮ末端の軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列を含み、前記第１タンパク質鎖の重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のいずれか１つまたは複数で示されるアミノ酸配列を含み、前記第１タンパク質鎖のＣ末端の軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を含み、
かつ、前記第２タンパク質鎖の重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載の二重特異性抗体。
前記第１タンパク質鎖はＳＥＱＩＤＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列を含み、
かつ、前記第２タンパク質鎖はＳＥＱＩＤＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０から請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
ａ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１４で示され、
ｂ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１７で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１８で示され、
ｃ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１９で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２０で示され、
ｄ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２１で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２２で示され、
ｅ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２３で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２４で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖と第４タンパク質鎖とをさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２５で示され、前記第４タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２６で示され、
ｆ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２７で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２８で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖と第４タンパク質鎖とをさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示され、前記第４タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示され、
ｇ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖をさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示され、
ｈ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３４で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３５で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖をさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３６で示され、
ｉ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３７で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３８で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖をさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３９で示され、
ｊ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４０で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４１で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖をさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４２で示され、
ｋ．前記第１タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４３で示され、前記第２タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４４で示され、前記二重特異性抗体は、第３タンパク質鎖と第４タンパク質鎖とをさらに含み、前記第３タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４５で示され、前記第４タンパク質鎖のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４６で示され、
のうちのいずれか１つをさらに含むことを特徴とする請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記抗体は、ヒトＣＤ４およびＴＧＦ－β１分子を選択的に結合することができることを特徴とする請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記抗体は１０^－９Ｍ未満またはそれより小さいＫｄでＣＤ４タンパク質および／またはＴＧＦ－β１タンパク質を結合し、好ましくは、前記Ｋｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ分子間相互作用解析装置によって測定されることを特徴とする請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記抗体は、ＴＧＦ－β１レポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性測定においてヒトＴＧＦ－β１に対する５ｎＭ未満のＩＣ_５０を有することを特徴とする請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
前記抗体は、ＴＧＦ－β１レポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性測定においてヒトＴＧＦ－β１に対する５ｐＭ未満のＩＣ_５０を有することを特徴とする請求項１７に記載の二重特異性抗体。
請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の抗体タンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
請求項１９に記載の単離された核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
請求項１９に記載の単離された核酸分子、または請求項２０に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
請求項２１に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収するステップを含むことを特徴とする請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の製造方法。
二重特異性抗体および複合剤を含む複合体であって、前記二重特異性抗体は請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、前記複合剤は検出可能なマーカであり、好ましくは、前記複合剤は、小分子化合物、蛍光物質、発光物質、有色物質または酵素であることを特徴とする複合体。
請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むか、請求項２３に記載の複合体を含み、選択的に、薬学的に許容される添加剤も含む薬物組成物。
請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又は請求項２３に記載の複合体の、がん、免疫介在疾患、線維化疾病、ウイルス感染性疾病、神経退行性疾病、骨再形成、腎症疾病、およびそれらの組み合わせから選択される疾病を予防および／又は治療するための薬物の製造における使用。
請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項２３に記載の複合体の、好ましくは、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、脳癌、肝臓癌、黒色腫および白血病のうちの１種または複数種から選択される悪性腫瘍を予防および／または治療するための薬物の製造における使用。