CN117396182A - 抗cea和抗cd137多特异性抗体及其使用方法 - Google Patents

抗cea和抗cd137多特异性抗体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117396182A
CN117396182A CN202280036536.1A CN202280036536A CN117396182A CN 117396182 A CN117396182 A CN 117396182A CN 202280036536 A CN202280036536 A CN 202280036536A CN 117396182 A CN117396182 A CN 117396182A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
variable region
chain variable
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280036536.1A
Other languages
English (en)
Inventor
曲亮
张彤
李卓
陈欣
朱琳
王鹏皓
周晓穗
谢圆圆
李�杰
孙建
宋兢
李学慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beigene Ltd
Original Assignee
Beigene Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beigene Ltd filed Critical Beigene Ltd
Publication of CN117396182A publication Critical patent/CN117396182A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

披露了结合人CEA和CD137的多特异性抗体及其抗原结合片段、包含所述抗体的药物组合物、以及该多特异性抗体或该组合物用于治疗的用途。

Description

抗CEA和抗CD137多特异性抗体及其使用方法
技术领域
本文披露了结合人CEA和人CD137的多特异性抗体或其抗原结合片段、包含所述抗体的组合物，以及用于治疗癌症的方法。
背景技术
癌胚抗原(CEA，也称为CEACAM5或CD66e)是一种糖蛋白，其分子量为约70-100kDa，取决于所存在的糖基化的量。Gold等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志],121,439(1965)首先报道了与人腺癌中的癌症特异性抗原相关的CEA的存在。CEA通常在多种腺上皮组织(诸如胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道)中表达，在这些腺上皮组织中它似乎位于细胞的顶端表面(Hammarstrom,S.Semin.Cancer Biol.[癌症生物学研讨会]9,67-81(1999))。例如，发现它存在于结肠的柱状上皮细胞和杯状细胞中(Fraengsmyr等人,Tumor Biol.[肿瘤生物学]20:277-292(1999))。在由这些组织类型产生的肿瘤中，CEA表达从顶端膜到细胞表面增加，并且一旦从细胞表面除去，就会进入血流(Hammarstrom,S.Semin.Cancer Biol.[癌症生物学研讨会]9,67-81；(1999)，还参见Fraengsmyr等人,Tumor Biol.[肿瘤生物学]20:277-292(1999))。在许多类型的癌症中观察到CEA过表达，这些癌症包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌和甲状腺癌。因此，在癌症的预后和治疗中，CEA已经用作诊断性肿瘤标志物以确定癌症患者血液中的CEA水平升高(Chevinsky,A.H.(1991)Semin.Surg.Oncol.[外科肿瘤学研讨会]7,162-166；Shively,J.E.等人,(1985)Crit.Rev.Oncol.Hematol.[肿瘤学/血液学评论]2,355-399)。
CEA已被认为是用于靶向疗法的有用的肿瘤相关抗原(Kuroki M等人,(2002)Anticancer Res[抗癌研究]22:4255-64)。一种方法是产生展示抗CEA scFv的逆转录病毒构建体，并将一氧化氮合酶(iNOS)基因递送至表达CEA的癌细胞。(Kuroki M.等人,(2000)Anticancer Res.[抗癌研究]20(6A):4067-71)。另一种方法是将放射性同位素与抗CEA抗体连接，并证明放射特异性针对表达CEA的肿瘤(Wilkinson等人,PNAS USA[美国国家科学院院刊]98,10256-60(2001)；Goldenberg等人,Am.J.Gastroenterol.[美国胃肠病学杂志],86:1392-1403(1991)；Olafsen T.等人,Protein Engineering,Design&Selection[蛋白质工程设计与选择],17,21-27,(2004)；Meyer等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]15:4484-4492(2009)；Sharkey等人,J.Nucl.Med.[核医学杂志]46:620-633(2005))。放射性同位素方法已扩展到抗CEA抗体药物缀合物(ADC)。例如，Shinmi等人报道了一种与单甲基澳瑞他汀E(MMAE)缀合的抗CEA抗体(Shinmi等人,Cancer Med.[癌症医学]6(4):798-808(2017))。
然而，抗CEA抗体的问题之一是交叉反应性。CEA与其他CEACAM家族成员高度同源，例如，人CEA与CEACAM6显示出84％同源性，与CEACAM8显示出77％同源性，与CEACAM1显示出73％同一性。本披露提供了对CEA特异的抗CEA抗体。
CD137(也称为TNFRSF9/41BB)是属于TNFRSF家族的共刺激分子。它是通过对由伴刀豆球蛋白A刺激的小鼠辅助细胞和细胞毒性细胞的T细胞因子筛选发现的，并在1989年被鉴定为在抗原引发的T细胞上表达但在静息T细胞上不表达的诱导型基因(Kwon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.[美国国家科学院学报]1989；86:1963-1967)。CD137是属于TNFRSF的共刺激分子。它是在80年代后期对由伴刀豆球蛋白A刺激的小鼠辅助细胞和细胞毒性细胞进行T细胞因子筛选期间发现的。此外，已知它在树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)(Vinay等人,Mol.Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2012；11:1062-1070)、活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤T细胞(NKT)和肥大细胞(Kwon等人,1989同上；Vinay D.,Int.J.Hematol.[国际血液学杂志]2006；83:23-28)中表达。
结合CD137的CRD I的抗CD137抗体乌瑞鲁单抗(Urelumab)(BMS-663513)和结合CD137的CRD III和IV的乌托鲁单抗(Utomilumab)(PF-05082566)因它们激活细胞毒性T细胞并增加干扰素γ(IFN-γ)的产生的能力而显示出作为癌症治疗剂的潜力。这些抗体使肿瘤消退的潜在机制是对免疫细胞对癌细胞的反应的影响。抗CD137抗体刺激并激活效应T淋巴细胞(例如，刺激CD8 T淋巴细胞产生INFγ)、NKT和APC(例如，巨噬细胞)。
乌瑞鲁单抗在临床前实验和早期临床研究中显示出有希望的结果(Sznol等人,Clin.Oncol.[临床肿瘤学]2008；26(增刊15))。然而，在后来的研究中，乌瑞鲁单抗表现出肝毒性，导致抗体的开发暂停，直到2012年2月(Segal等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2017；23:1929-1936)。肝毒性主要是由于肿瘤和基质细胞分泌的S100A4蛋白，并且将乌瑞鲁单抗的剂量限制为每名患者每3周8mg或0.1mg/kg的研究已经恢复了对该抗体的兴趣(Segal等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2017；23:1929-1936)。
与乌瑞鲁单抗相反，乌托鲁单抗显示出更好的安全性，并且初步研究显示没有肝毒性或其他剂量限制因素(Segal等人,J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]2014；32(增刊15))。乌托鲁单抗作为单一疗法的I期试验的报告结果表明具有良好的安全性(Segal等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2018；24:1816-1823)。推测这两种抗体之间的差异是由于它们在CD137受体上的结合位点不同。
鉴于这两个靶标的独特生物学特性，将免疫细胞募集至表达CEA的癌症的抗CEAxCD137多特异性抗体将可用于治疗癌症。
发明内容
本披露涉及多特异性抗CEAxCD137抗体及其抗原结合片段。本披露涵盖以下实施例。
一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:88的氨基酸596至674处特异性结合人CEA的第一抗原结合结构域和特异性结合人CD137的第二抗原结合结构域。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该第一抗原结合结构域不结合其他CEACAM家族成员。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1(轻链互补决定区1)、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3；或
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2、(c)SEQ ID NO:43的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ IDNO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(iii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:48至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:49至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该第一抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:31的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)；或
(iii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(VL)。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；或
(iv)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2、(c)SEQ ID NO:57的HCDR3。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(iii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(iv)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:70至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(v)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:84、86、75、70或60中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该第二抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:84的重链可变区(VH)；
(ii)包含SEQ ID NO:86的重链可变区(VH)；
(iii)包含SEQ ID NO:75的重链可变区(VH)；
(iv)包含SEQ ID NO:70的重链可变区(VH)；或
(v)包含SEQ ID NO:60的重链可变区(VH)。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中：
(i)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ IDNO:81的HCDR3；以及
(ii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2、(c)SEQ IDNO:67的HCDR3；
(iii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ IDNO:67的HCDR3；或
(iv)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2、(c)SEQ IDNO:57的HCDR3。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中：
(i)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:84的重链可变区(VH)；
(ii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:86的重链可变区(VH)；
(iii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:75的重链可变区(VH)；
(iv)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:70的重链可变区(VH)；或
(v)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:60的重链可变区(VH)。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
该多特异性抗体，其中该多特异性抗体是双特异性抗体。
该双特异性抗体，其中该双特异性抗体含有SEQ ID NO:317至SEQ ID NO 358的接头。
该双特异性抗体，其中该接头是SEQ ID NO:324。
该双特异性抗体，其中该接头是SEQ ID NO:329。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-146(SEQ ID NO:313和SEQ ID NO:179)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-189(SEQ ID NO:255和SEQ ID NO:179)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-718(SEQ ID NO:295和SEQ ID NO:179)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-740(SEQ ID NO:297和SEQ ID NO:179)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-942(SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301和SEQ ID NO:303)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-755(SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301和SEQ ID NO:305)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-562(SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:179)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-375(SEQ ID NO:309和SEQ ID NO:179)。
该双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-244(SEQ ID NO:311和SEQ ID NO:179)。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或是低岩藻糖基化的。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该Fc结构域是具有降低的效应子功能的IgG1。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该Fc结构域是IgG4。
该多特异性抗体或抗原结合片段，其中该IgG4具有S228P取代(根据EU编号系统)。
一种包含多特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
该药物组合物，其进一步包含组氨酸/组氨酸HCl、海藻糖二水合物和聚山梨醇酯20。
一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的该多特异性抗体或抗原结合片段。
该方法，其中该癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
该方法，其中该结肠癌是结肠直肠癌。
该方法，其中该胃癌与血清中的高CEA水平相关。
该方法，其中该肺癌与血清中的高CEA水平相关。
该方法，其中该非小细胞肺癌与血清中的高CEA水平相关。
该治疗方法，其中该多特异性抗体以5mg-1200mg的范围施用。
该方法，其中该多特异性抗体以5mg-1200mg的范围施用，每周一次。
该方法，其中该多特异性抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。
该方法，其中该治疗剂是紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、卡铂、托泊替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。
该方法，其中该治疗剂是紫杉醇药剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。
该方法，其中该治疗剂是抗PD1或抗PDL1抗体。
该方法，其中该抗PD1抗体是替雷利珠单抗(Tislelizumab)。
一种分离的核酸，其编码该多特异性抗体或抗原结合片段。
一种载体，其包含该核酸。
一种宿主细胞，其包含该核酸或载体。
一种用于产生多特异性抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养宿主细胞以及从培养物中回收该抗体或抗原结合片段。
在一个实施例中，该多特异性抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，该一个或多个互补决定区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:81。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含一个或多个互补决定区(HCDR)的重链可变区，该一个或多个互补决定区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81，和/或(b)包含一个或多个互补决定区(LCDR)的轻链可变区，该一个或多个互补决定区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:40。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个互补决定区(HCDR)的重链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:9、SEQID NO:26、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HCDR3，和/或(b)包含三个互补决定区(LCDR)的轻链可变区，这三个互补决定区是包含SEQID NO:10、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ IDNO:11、SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:23、SEQID NO:40的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个互补决定区(HCDR)的重链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQID NO:66的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HCDR3；或包含SEQID NO:65的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的HCDR2，以及包含SEQID NO:67的氨基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的HCDR2，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:81的HCDR3，和/或(b)包含三个互补决定区(LCDR)的轻链可变区，这三个互补决定区是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ IDNO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3。
在又一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2和(c)SEQ ID NO:43的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3。
在又一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ IDNO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2和(c)SEQ ID NO:67的HCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ IDNO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2和(c)SEQ ID NO:67的HCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ IDNO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2和(c)SEQ ID NO:57的HCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2、(c)SEQ ID NO:43的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；或
(iv)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2、(c)SEQ ID NO:57的HCDR3。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；或
(iv)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2、(c)SEQ ID NO:57的HCDR3。
在一个实施例中，本披露的抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:86的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:86中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:49中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本披露的多特异性抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:86的氨基酸序列或在SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:31、SEQID NO:48、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:86的氨基酸序列中包含一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列；和/或(b)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:49的氨基酸序列或在SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:49的氨基酸序列中包含一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸取代的氨基酸序列。在另一个实施例中，这些氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:84的VH；
(ii)包含SEQ ID NO:86的VH；
(iii)包含SEQ ID NO:75的VH；
(iv)包含SEQ ID NO:70的VH；或
(v)包含SEQ ID NO:60的VH。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:31的VH和包含SEQ ID NO:32的VL；以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:84的VH；
(ii)包含SEQ ID NO:86的VH；
(iii)包含SEQ ID NO:75的VH；
(iv)包含SEQ ID NO:70的VH；或
(v)包含SEQ ID NO:60的VH。
在另一个实施例中，该多特异性抗体或抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:48的VH和包含SEQ ID NO:49的VL，以及第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:84的VH；
(ii)包含SEQ ID NO:86的VH；
(iii)包含SEQ ID NO:75的VH；
(iv)包含SEQ ID NO:70的VH；或
(v)包含SEQ ID NO:60的VH。
在一个实施例中，本披露的多特异性抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在更特定的实施例中，本披露的抗体包含野生型人IgG1(也称为人IgG1wt或huIgG1)或IgG2的Fc结构域。在另一个实施例中，本披露的抗体包含具有S228P和/或R409K取代(根据EU编号系统)的人IgG4的Fc结构域。
在一个实施例中，本披露的多特异性抗体以1×10-6M至1×10-10M的结合亲和力(KD)结合CEA。在另一个实施例中，本披露的抗体以约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M或约1×10-10M的结合亲和力(KD)结合CEA。
在另一个实施例中，本披露的抗人CEA多特异性抗体显示对食蟹猴CEA的跨物种结合活性。
在一个实施例中，本披露的抗体具有强的Fc介导的效应子功能。抗体介导对表达CEA的靶细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本披露涉及分离的核酸，这些分离的核酸包含编码多特异性抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施例中，分离的核酸包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:85或SEQ IDNO:87的VH核苷酸序列或与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:87具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本披露的抗体或抗原结合片段的VH区。替代性地或另外地，分离的核酸包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:34、或SEQ ID NO:51的VL核苷酸序列或与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:34、或SEQ ID NO:51具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本披露的抗体或抗原结合片段的VL区。
在另一方面，本披露涉及包含CEAxCD137多特异性抗体或其抗原结合片段和任选地药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在又一方面，本披露涉及治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的CEAxCD137多特异性抗体或其抗原结合片段或CEAxCD137多特异性抗体药物组合物。在另一个实施例中，待由该抗体或抗原结合片段治疗的疾病是癌症。
本披露涉及CEAxCD137多特异性抗体或其抗原结合片段或CEAxCD137多特异性抗体药物组合物用于治疗疾病诸如癌症的用途。
附图说明
图1示出了脱落CEA(sCEA)、嵌合CEA(CHIM)、CEACAM6和CEA变体(CEA-v)的示意图。在CEA中，标记了结构域N、A1、B1、A2、B2、A3、B3和GPI接头(GPI)；在CEACAM6中，标记了结构域N'、A'和B'。
图2A-B描绘了抗CEA结构域B3抗体VH(图2A)和VL(图2B)区的系统发生树。使用DNASTAR的MegalignTM软件对候选抗CEA抗体的VH和VL序列进行比对。序列同源性在系统发生树中显示。
图3A示出了通过表面等离子共振(SPR)对嵌合构建体(CHIM)上的纯化的鼠抗CEA抗体BGA13的亲和力测定。图3B描绘了通过抗原ELISA分析的BGA13的结合概况。
图4A-B示出了可溶性CEA(sCEA)对CEA抗体与MKN45细胞的结合的影响。图4A示出了在可溶性CEA(sCEA)存在或不存在下结构域B3抗体的结合概况；图4B是图4A的抗体结合概况，示出为直方图。
图5A-B示出了产生用于人源化BGA13抗体轻链CDR(LCDR)区(图5A)和重链CDR(HCDR)区(图5B)的亲和力成熟的抗体文库的随机化位点。
图6示出了四轮选择后BGA13轻链CDR区的氨基酸改变。
图7示出了通过流式细胞术测定的亲和力成熟的人源化BGA13变体与LOVO细胞的结合。
图8是通过流式细胞术测定的优化的人源化BGA113变体与MKN45细胞的结合。
图9A和图9B表明通过流式细胞术(图9A)和抗原ELISA(图9B)所发现，抗体BGA113K与各种CEACAM家族成员没有脱靶结合。
图10示出了在各种浓度的可溶性CEA存在下，可溶性CEA对BGA113K与CEA表达细胞MKN45细胞结合的影响。
图11表明抗体BGA113在体外通过ADCC杀伤细胞。
图12描绘了当用BGA113抗体治疗时鼠癌症模型的肿瘤体积减小。
图13A是从每个子文库鉴定的人抗huCD137 VH结构域抗体的总结。图13B是来自每个子文库的人抗huCD137 VH结构域抗体的图解系统发生树。使用DNASTAR的MegalignTM软件对候选抗huCD137 VH结构域抗体的VH序列进行比对。序列同源性在系统发生树中显示。
图14A示出了人Fc融合VH抗体形式(VH-Fc)的示意图。VH结构域抗体在惰性Fc(无FcγR结合)的N末端与其间的GS4接头融合。图14B示出了使用含有VH-Fc蛋白的上清液的代表性筛选结果，并且图14C示出了其中一个克隆BGA-4712已被证明能够以剂量依赖性方式刺激Hut78/huCD137细胞中的IL-2产生。
图15A至图15B是代表性抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712的结合概况。图15A描绘了通过流式细胞术测定人抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712结合。图15B示出了通过huCD137配体(人CD137配体-ECD-mIgG2a融合蛋白)相互作用对人抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712的阻断。通过流式细胞术测定纯化的人抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712与表达CD137的Hut78/huCD137细胞(Hut78/huCD137)的结合。
图16A-D是CEAxCD137多特异性抗体形式的示意图。
图17A至图17B是通过流式细胞术对CEAxCD137多特异性抗体的细胞结合的比较。图17A示出了与表达CEA的细胞CT26/CEA的结合。图17B示出了与表达CD137的细胞Hut78/huCD137的结合。
图18A至图18B证明A-CD137/CEA在CEA+肿瘤细胞存在下刺激PBMC产生IFN-γ。图18A示出了CEAxCD137多特异性抗体A-CEA/CD137之一诱导CD137表达细胞系Hut78/huCD137产生Il-2。图18B示出了CEAxCD137多特异性抗体A-CEA/CD137之一以剂量依赖性方式诱导人外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ。
图19示出了四轮选择后BGA-4712-M3的CDR区序列。
图20是通过流式细胞术对抗huCD137 VH结构域Ab BGA-5623的结合测定，证明在亲和力成熟后与CD137的结合得到改善。
图21通过ELISA证明BGA-5623不与其他TNF受体家族成员脱靶结合。
图22A至图22B示出了人抗huCD137 VH结构域抗体BGA-5623的表位作图。图22A是基于细胞的结合测定中的代表性筛选结果。通过乌瑞鲁单抗类似物监测huCD137突变体的表达。图22B示出了纯化的huCD137突变体的BGA-5623结合。
图23A证明通过ELISA测定的CD137配体与人抗huCD137 VH结构域抗体BGA-5623竞争。图23B证明CD137 x CEA多特异性抗体BGA-5623可以在基于细胞的配体竞争测定中减少CD137/CD137配体相互作用。
图24示出了VH(BGA-5623)对于CD137与CD137L的部分竞争性结合。VH(BGA-5623)/CD137的晶体结构通过CD137与CD137L/CD137复合物(PDB：6MGP)重叠。CD137、CD137L和VH分别以黑色、白色和灰色着色。
图25示出了VH(BGA-5623)的CDR3在CD137结合后经历显著的构象变化。黑色的CD137结合VH(BGA-5623)与白色的apoVH(BGA-5623)重叠。
图26示出了VH(BGA-5623)/CD137复合物的结合表面上的原子相互作用。VH(BGA-5623)与CD137之间的结合界面识别BGA-5623(互补位残基)和CD137(表位残基)的某些关键残基。CD137的CRD1和2结构域示出为覆盖有白色透明表面的灰色底图。互补位残基以黑色着色。
图27是用于研究可能影响体外CD137活化的其他参数诸如模块比率的CEAxCD137多特异性抗体形式的示意图。
图28证明模块比率为2:4的双特异性抗体A-41A11-41A11可激活CD137，无论CEA+肿瘤细胞存在(28A)还是不存在(28B)。
图29是用于研究可能影响体外CD137活化的其他参数诸如Fc功能和模块取向的CEA x CD137多特异性抗体形式的示意图。
图30A证明所研究的CEAxCD137多特异性抗体在CEA+肿瘤细胞存在下仅刺激PBMC产生IFN-γ。图30B示出在不存在CEA+肿瘤细胞的情况下，CEAxCD137多特异性抗体不诱导IFN-γ。
图31证明在CEA+肿瘤细胞存在下，接头长度对体外CD137活化的影响极小。
图32A-D示出了形式A-BGA-5623(BE-189)(图32B)诱导对体内肿瘤生长的显著抑制，但A-IgG1-BGA-5623(BE-740)(图32C)则不，其中乌瑞鲁单抗用作对照(图32D)。
图33是设计的肿瘤靶向CEA x CD137多特异性抗体形式的示意图。
图34A至图34B示出了BE-146与huCEA(图34A)和huCD137-mIgG2a(图34B)的抗原结合ELISA。在该测定中测试了两批BE-146。
图35示出了通过FACS分析的BE-146与人CD137的结合。
图36示出了通过FACS分析的BE-146与人CEA的结合。
图37示出了通过FACS，BE-146没有脱靶结合。
图38A至图38C证明CEAx CD137多特异性抗体BE-146诱导来自人PBMC的IL-2和IFN-γ释放。图38A是在MKN45细胞存在下通过用BE-146和HEK293/OS8细胞共刺激huPBMC而活化CD137的示意图。图38B至图38C示出了BE-146可诱导来自人PBMC的IL-2(图38B)和IFN-γ(图38C)。测试了来自2个供体的PBMC。结果以两次重复的平均值±SD表示。
图39A-B证明CEAx CD137多特异性抗体BE-146诱导来自人T细胞的IL-2和IFN-γ释放。图39A示出了BE-146可诱导来自人PBMC的IL-2和IFN-γ(图39B)。测试了来自2个供体的PBMC。结果以两次重复的平均值±SD表示。
图40A至图40B证明CEA x CD137诱导的反应是CEA依赖性的。图40A示出BE-146可诱导来自PBMC的显著的IL-2和IFN-γ释放(图40B)，针对过表达CEA的HEK293细胞，但不针对没有CEA转导的HEK293细胞。测试了来自3个供体的PBMC。结果以两次重复的平均值±SD表示。
图41A至图41B示出了CEAxCD137诱导的反应没有被重组可溶性CEA显著阻断。结果示出BE-146诱导的来自PBMC的IL-2(图41A)和IFN-γ(图41B)释放未被50ng/ml或500ng/ml可溶性CEA显著阻断。测试了来自2个供体的PBMC。结果以两次重复的平均值±SD表示。
图42证明BE-146使用基于细胞的生物发光测定增强T细胞活化。
图43A至图43B示出BE-146增强针对MKN45(CEA高)(图43A)而非NCI-N87(CEA低)(图43B)的来自PBMC的IFN-γ和IL-2释放。
图44证明BE-146剂量依赖性地增强PBMC对MKN45细胞的细胞毒性。
图45示出BE-146和BGB-A317的组合促进来自PBMC的IFN-γ分泌。
图46A是BE-146的基于ELISA的FcγRs结合分析。图46B是基于ELISA的BE-146的C1q结合活性。
图47示出了BE-146对人源化CD137敲入小鼠MC38/hCEA同源模型中的肿瘤生长的影响。
图48示出了BE-146和Ch15mt对人源化CD137敲入小鼠CT26/hCEA同源模型中的肿瘤生长的影响。
图49示出了BE-146和Ch15mt对人源化CD137敲入小鼠B16 F10/hCEA同源模型中的肿瘤生长的影响。
图50示出了BE-146和Ch15mt对人源化CD137敲入小鼠B16 F10/hCEA同源模型中的动物存活率的影响。
图51示出BE-146在体内不具有肝毒性。高剂量的乌瑞鲁单抗类似物而不是BE-146诱导丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度显著增加，并增加肝中的炎性细胞浸润。
定义
除非在本文件的其他地方具体定义，否则本文所用的所有其他技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则如“一个”、“一种”和“该”的单数形式包括它们相应的复数指代。
除非上下文另外明确说明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
如本文所用的术语“抗癌剂”是指可用于治疗细胞增殖性障碍(如癌症)的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向性抗癌剂、和免疫治疗剂。
术语“癌胚抗原”或“CEA”是指大约70-100kDa的糖蛋白。CEA也称为CEACAM5或CD66e。人CEA的氨基酸序列(SEQ ID NO:88)也可在登录号P06731或NM_004363.2中找到。
术语“CD137”或“TNFRSF9”、“ILA”或“41BB”是指人CD137的氨基酸序列(SEQ IDNO:135)，其也可在登录号Q07011(TNR9_HUMAN)或U03397找到。CD137的核酸序列如SEQ IDNO:136所示。
如本文所用的术语“施用(administration/administering)”和“治疗(treating/treatment)”，当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，意指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”还意指通过试剂、诊断剂、结合化合物或另一种细胞进行的例如细胞的体外和离体处理。本文中的术语“受试者”包括任何生物，优选动物，更优选哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。在一方面，治疗任何疾病或障碍是指改善该疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指缓解或改善至少一个身体参数，包括患者可能无法辨别的那些。在又另一方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或两者上调节疾病或障碍。在又另一方面，“治疗(treat/treating/treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发作或发展或进展。
在本披露的上下文中，术语“受试者”是哺乳动物，例如，灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人(例如，患有本文所述的障碍或处于患上本文所述的障碍的风险中的患者)。
如本文所用的术语“亲和力”是指抗体与抗原之间相互作用的强度。在抗原内，抗体的可变区通过非共价力与抗原在许多位点相互作用。通常，相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，其可以非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应的抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL或Vκ)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个框架区(FR)构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
在一些实施例中，抗CEA抗体包含至少一个抗原结合位点，至少一个可变区。在一些实施例中，抗CEA抗体包含来自本文所述CEA抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，抗CEA抗体是分离的或重组的。
在一些实施例中，抗CD137抗体包含至少一个抗原结合位点，至少一个可变区。在一些实施例中，抗CD137抗体包含来自本文所述的CD137抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，抗CD137抗体是分离的或重组的。
本文中的术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指基本上同质的抗体的群体，即，除了可能少量存在的可能天然发生的突变外，该群体中包含的抗体分子在氨基酸序列上是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂典型地包括在其可变结构域中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，特别地其互补决定区(CDR)，它们通常对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法获得单克隆抗体(mAb)。参见，例如Kohler等人,Nature[自然]1975 256:495-497；美国专利号4,376,110；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[分子生物学现代方法]1992；Harlow等人,ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL[抗体：实验室手册],Cold spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室]1988；以及Colligan等人,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY[当代免疫学方案]1993。本文披露的抗体可以是任何免疫球蛋白类别(包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA)，及其任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。产生单克隆抗体的杂交瘤可以在体外或在体内培养。高效价的单克隆抗体可以在体内产生中获得，其中将来自单个杂交瘤的细胞腹膜内注射到小鼠中，例如原始引发的Balb/c小鼠，以产生含有高浓度所需抗体的腹水。可以使用本领域技术人员熟知的柱层析方法从这样的腹水，或从培养上清液中纯化同种型IgM或IgG的单克隆抗体。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可以定义为主要负责效应子功能的恒定区。典型地，人轻链被分类为κ和λ轻链。此外，人重链典型地分类为α、δ、ε、γ或μ，并且分别将抗体的同种型定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常在一级序列中是相同的。
典型地，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为“互补决定区(CDR)”，其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常由框架区对齐，使得能够结合特异性表位。一般而言，从N-末端到C-末端，轻链和重链可变结构域两者都包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(或FR4)。CDR和框架区的位置可以使用本领域熟知的多种定义确定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT(参见，例如Johnson等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997))、ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist[免疫学者],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA [美国国家科学院院刊],86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153(1991)；和Rees等人,在Sternberg M.J.E.(编),Protein Structure Prediction[蛋白质结构预测],Oxford University Press[牛津大学出版社],牛津,141-172(1996)中。例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(编号根据Kabat)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”(例如轻链可变结构域中的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及重链可变结构域中的HCDR1，HCDR2和HCDR3)的氨基酸残基。参见Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],第5版Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(通过序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基意指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
除非另外说明，否则“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，单链Fv(ScFv))；纳米抗体以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，抗体“特异性结合”靶蛋白，是指与其他蛋白相比，抗体表现出优先结合靶蛋白，但这种特异性不需要绝对的结合特异性。在描述抗原(例如蛋白质)与抗体或抗原结合抗体片段之间的相互作用的上下文中使用的抗体“特异性结合”或“选择性结合”是指决定抗原在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中(例如在生物样品、血液、血清、血浆或组织样品中)的存在的结合反应。因此，在某些指定的免疫测定条件下，抗体或其抗原结合片段与特定抗原特异性结合是背景水平的至少两倍，并且不以显著量与样品中存在的其他抗原特异性结合。在一方面，在指定的免疫测定条件下，抗体或其抗原结合片段与特定抗原的特异性结合是背景结合水平的至少十(10)倍，并且不以显著量与样品中存在的其他抗原特异性结合。
如本文所用的“抗原结合结构域”包含至少三个CDR并特异性结合表位。多特异性抗体(例如双特异性抗体)的“抗原结合结构域”包含特异性结合第一表位的第一抗原结合结构域和也包含特异性结合第二表位的至少三个CDR的第二抗原结合结构域。多特异性抗体可以是双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等，具有针对每个特定表位的抗原结合结构域。多特异性抗体可以是多价抗体(例如，双特异性四价抗体)，其包含多个抗原结合结构域，例如特异性结合第一表位的2、3、4或更多个抗原结合结构域和特异性结合第二表位的2、3、4或更多个抗原结合结构域。
本文中的术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可以含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”意指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。
术语“人源化”或“人源化抗体”意指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部，其高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。当有必要区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体时，将前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加到抗体克隆名称中。人源化形式的啮齿动物抗体会通常包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，但是可包括某些氨基酸取代以增加亲和力，增加人源化抗体的稳定性，除去翻译后修饰或出于其他原因。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或亚序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比，其与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高确定的氨基酸序列同一性。相应的人种系序列也可以指与所有其他评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或亚序列。相应的人种系序列可以仅是框架区，仅互补决定区，框架和互补决定区，可变区段(如上定义)，或包含可变区的序列或亚序列的其他组合。可以使用本文所述的方法确定序列同一性，例如使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自这样的人序列，例如人种系序列，或突变形式的人种系序列或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1，M-l)。平衡解离常数可以使用本领域任何已知的方法测量。本披露的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
本文中的术语“癌症”或“肿瘤”具有如本领域理解的最广泛的含义，并且是指哺乳动物中典型地以不受调控的细胞生长为特征的生理病症。在本披露的上下文中，癌症不限于某个类型或位置。
在本披露的上下文中，当提及氨基酸序列时，术语“保守取代”意指用新氨基酸取代原始氨基酸，该新氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能特性，例如其与CEA或CD137的结合亲和力。具体地，氨基酸的常见保守取代是本领域熟知的。
如本文所用的术语“杵臼(knob-into-hole)”技术是指氨基酸在体外或体内通过在它们相互作用的界面上将空间突起(杵)引入一个多肽并将穴袋或空腔(臼)引入另一个多肽从而引导将两条多肽配对在一起。例如，杵臼已经被引入了抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CHI界面、或VH/VL界面(参见例如US2011/0287009、US 2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人,1997,Protein Science[蛋白质科学]6:781-788)。在一些实施例中，杵臼确保了多特异性抗体制备期间两个不同重链正确配对在一起。例如，在其Fc区中具有杵臼氨基酸的多特异性抗体还可包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者进一步包含与相似或不同轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。杵臼技术还可在VH或VL区中使用，以确保正确配对。
如本文在“杵臼”技术的上下文中所用的术语“杵”是指向多肽在该多肽与另一多肽相互作用的界面处引入突起(杵)的氨基酸改变。在一些实施例中，另一多肽具有臼突变。
如本文在“杵臼”的上下文中所用的术语“臼”是指向多肽在该多肽与另一多肽相互作用的界面处引入穴袋或空腔(臼)的氨基酸改变。在一些实施例中，另一多肽具有杵突变。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)披露获得。此算法包括首先通过鉴定查询序列中短字长W鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同字长比对时，其匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值。这些初始邻域字命中作为开始搜索以找到包含它们的较长HSP的值。字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对得分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列，BLAST程序默认使用字长3，期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报]89:10915)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4并比较两条链。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报]90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可使用以下的算法来确定：E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17,(1988)，其已并入ALIGN程序(2.0版本)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，可以使用以下确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453(1970)的算法，其已并入GCG软件包中的GAP程序中，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，并且长度权重为1、2、3、4、5或6。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成的，天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。这样的类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
在核酸的上下文中，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。典型地，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，启动子或增强子序列如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要在物理上邻接或紧邻它们增强其转录的编码序列。
在一些方面，本披露提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所述的抗CEAxCD137多特异性抗体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
本文披露的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。合适的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的合适组合物是可注射或输注溶液的形式。一种合适的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施例中，该抗体通过静脉内输注或注射来施用。在某些实施例中，该抗体通过肌内或皮下注射来施用。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以影响该疾病、障碍或症状的治疗的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体，疾病，障碍，和/或疾病或障碍的症状，疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本披露中所述的治疗病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂。这种施用也涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所需剂量。此外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以顺序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
如本文所用，短语“与…组合”意指将抗CEAxCD137多特异性抗体在施用另外的治疗剂的同时、就在该施用前或就在该施用后施用于受试者。在某些实施例中，将抗CEAxCD137多特异性抗体作为与另外的治疗剂的共同配制品来施用。
具体实施方式
本披露提供了抗体、抗原结合片段和抗CEAxCD137多特异性抗体。此外，本披露提供了具有所需的药代动力学特征和其他期望的属性的抗体，并且因此可用于降低癌症的可能性或治疗癌症。本披露进一步提供了包含抗体的药物组合物以及制备和使用这样的药物组合物用于预防和治疗癌症和相关障碍的方法。
抗CEA抗体
本披露提供了特异性结合CEA的抗体或其抗原结合片段。本披露的抗体或抗原结合片段包括但不限于如下所述产生的抗体或其抗原结合片段。
本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:14、31或48的氨基酸序列(表1)的VH结构域。本披露还提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列的HCDR。在一方面，本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含(或替代性地，由其组成)具有表1中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个HCDR。
本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:15、32或49的氨基酸序列(表1)的VL结构域。本披露还提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表1中列出的LCDR中的任一个的氨基酸序列的LCDR。具体地，本披露提供了特异性结合CEA的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含(或替代性地，由其组成)具有表1中列出的LCDR中的任一个的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个LCDR。
本披露的其他抗体或其抗原结合片段包括已被改变，但在CDR区中与表1中披露的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的氨基酸。在一些方面，其包括氨基酸改变，其中当与表1中描述的序列中描绘的CDR区相比时，在CDR区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
本披露的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已被改变，但与表1中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的那些。在一些方面，其包括氨基酸序列的改变，其中当与表1中描述的序列中描绘的可变区相比时，在可变区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸，同时保持基本上相同的治疗活性。
本披露还提供了编码特异性结合CEA的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可以优化这样的核酸序列以在哺乳动物细胞中表达。
表1：氨基酸和核酸序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
本披露提供了结合人CEA的表位的抗体及其抗原结合片段。在某些方面，抗体和抗原结合片段可以结合CEA的相同表位。
本披露还提供了结合与表1中描述的抗CEA抗体相同的表位的抗体及其抗原结合片段。因此，其他抗体及其抗原结合片段可以基于它们在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计学显著的方式竞争性抑制其结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制本披露的抗体及其抗原结合片段结合CEA的能力证明测试抗体可与该抗体或其抗原结合片段竞争结合CEA。不受任何一种理论的束缚，这种抗体可以结合CEA上的与其竞争的抗体或其抗原结合片段相同或相关(例如，在结构上相似或在空间上邻近)的表位。在某些方面，结合CEA上的与本披露的抗体或其抗原结合片段相同的表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。这样的人或人源化单克隆抗体可以如本文所述制备和分离。
抗CD137抗体
表2：序列
/>
/>
/>
/>
本披露提供了特异性结合CD137的抗体或其抗原结合片段。本披露的抗体或抗原结合片段包括但不限于如下所述产生的抗体或其抗原结合片段。
本披露提供了特异性结合CD137的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:84或SEQ ID NO:86的氨基酸序列(表2)的VH结构域。本披露还提供了特异性结合CD137的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有表2中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列的HCDR。在一方面，本披露提供了特异性结合CD137的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含(或替代性地，由其组成)具有表2中列出的HCDR中的人任一个的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个HCDR。
本披露的其他抗体或其抗原结合片段包括已被改变，但在CDR区中与表2中披露的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的氨基酸。在一些方面，其包括氨基酸改变，其中当与表2中描述的序列中描绘的CDR区相比时，在CDR区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
本披露的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已被改变，但与表2中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％百分比同一性的那些。在一些方面，其包括氨基酸序列的改变，其中当与表2中描述的序列中描绘的可变区相比时，在可变区中改变不超过1、2、3、4或5个氨基酸，同时保持基本上相同的治疗活性。
本披露还提供了编码特异性结合CD137的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可以优化这样的核酸序列以在哺乳动物细胞中表达。
本披露提供了结合人CD137的表位的抗体及其抗原结合片段。在某些方面，抗体和抗原结合片段可以结合CD137的相同表位。
本披露还提供了结合与表2中描述的抗CD137抗体相同的表位的抗体及其抗原结合片段。因此，其他抗体及其抗原结合片段可以基于它们在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计学显著的方式竞争性抑制其结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制本披露的抗体及其抗原结合片段结合CD137的能力证明测试抗体可与该抗体或其抗原结合片段竞争结合CD137。不受任何一种理论的束缚，这种抗体可以结合CD137上的与其竞争的抗体或其抗原结合片段相同或相关(例如，在结构上相似或在空间上邻近)的表位。在某些方面，结合CD137上的与本披露的抗体或其抗原结合片段相同的表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。这样的人或人源化单克隆抗体可以如本文所述制备和分离。
抗CEAxCD137多特异性抗体
在一个实施例中，如本文所披露的抗CEA和抗CD137抗体可以掺入抗CEAxCD137多特异性抗体中。抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个抗原结合结构域，其中至少一个抗原结合结构域序列特异性结合作为第一表位的CEA，而第二抗原结合结构域序列特异性结合作为第二表位的CD137。在一个实施例中，多特异性抗体包含第三、第四或第五抗原结合结构域。在一个实施例中，多特异性抗体是双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。在每个实例中，多特异性抗体包含至少一个抗CEA抗原结合结构域和至少一个抗CD137抗原结合结构域。
在一个实施例中，多特异性抗体是双特异性抗体。如本文所用，双特异性抗体仅特异性结合两种抗原。双特异性抗体包含特异性结合CEA的第一抗原结合结构域和特异性结合CD137的第二抗原结合结构域。这包括双特异性抗体，其包含特异性结合作为第一表位的CEA的重链可变结构域和轻链可变结构域以及特异性结合作为第二表位的CD137的重链可变结构域。在另一个实施例中，双特异性抗体包含特异性结合CEA的抗体的抗原结合片段和特异性结合CD137的抗原结合片段。包含抗原结合片段的双特异性抗体、抗原结合片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv(ScFv)或scFv。
先前的实验(Coloma和Morrison Nature Biotech.[自然生物技术]15:159-163(1997))描述了四价双特异性抗体，其通过在lgG3抗丹磺酰基抗体的C末端(CH3-scFv)之后或铰链(铰链-scFv)之后融合编码单链抗丹磺酰基抗体Fv(scFv)的DNA进行工程化。本披露提供了具有至少两个抗原结合结构域的多价抗体(例如四价抗体)，其可通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达容易地产生。本文的多价抗体包含三至八个，但优选四个抗原结合结构域，其特异性结合至少两种抗原。
接头
还应理解，双特异性四价抗体的多肽链的结构域和/或区可被各种长度的接头区分开。在一些实施例中，抗原结合结构域通过接头区与彼此CL、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区分开。例如，VL1-CL-(接头)VH2-CH1这种接头区可以包含随机分类的氨基酸，或一组受限的氨基酸。这样的接头区可以是柔性的或刚性的(参见US2009/0155275)。
已经通过以下方式构建了多特异性抗体：使用或不使用柔性接头基因融合两种单链Fv(scFv)或Fab片段(Mallender等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]1994269:199-206；Mack等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.[美国国家科学院学报]199592:7021-5；Zapata等人,Protein Eng.[蛋白质工程]1995 8.1057-62)，经由二聚化装置诸如亮氨酸拉链(Kostelny等人,J.Immunol.[免疫学杂志]1992148:1547-53；de Kruif等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]1996 271:7630-4)和Ig C/CH1结构域(Muller等人,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]422:259-64)；通过双抗体(Holliger等人,(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.[美国国家科学院学报]1998 90:6444-8；Zhu等人,Bio/Technology(NY)[生物/技术(纽约)]199614:192-6)；Fab-scFv融合(Schoonjans等人,J.Immunol.[免疫学杂志]2000 165:7050-7)；以及微型抗体形式(Pack等人,Biochemistry[生物化学]1992.31:1579-84；Pack等人,Bio/Technology[生物/技术]199311:1271-7)。
本文披露的双特异性四价抗体在其一个或多个抗原结合结构域、CL结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域或Fc区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个氨基酸残基的接头区。在一些实施例中，氨基酸甘氨酸和丝氨酸包含接头区内的氨基酸。在另一个实施例中，接头可以是GS(SEQ ID NO:317)、GGS(SEQ ID NO:318)、GSG(SEQ ID NO:319)、SGG(SEQID NO:320)、GGG(SEQ ID NO:321)、GGGS(SEQ ID NO:322)、SGGG(SEQ ID NO:323)、GGGGS(SEQ ID NO:324)、GGGGSGS(SEQ ID NO:325)、GGGGSGS(SEQ ID NO:326)、GGGGSGGS(SEQ IDNO:327)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:328)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:329)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:330)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:331)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO:332)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:333)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:334)、SAKTTP(SEQ ID NO:335)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:336)、RADAAP(SEQ ID NO:337)、RADAAPTVS(SEQ ID NO:338)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:339)、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:340)、SAKTTP(SEQ ID NO:341)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:342)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQID NO:343)、ADAAP(SEQ ID NO:344)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:345)、TVAAP(SEQ ID NO:346)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:347)、QPKAAP(SEQ ID NO:348)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ IDNO:349)、AKTTPP(SEQ ID NO:350)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:351)、AKTTAP(SEQ ID NO:352)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:353)、ASTKGP(SEQ ID NO:354)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ IDNO:355)、GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO:356)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:357)和GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:358)或它们的任何组合(参见WO 2007/024715)。
二聚化特异性氨基酸
在一个实施例中，多价抗体包含至少一个二聚化特异性氨基酸改变。二聚化特异性氨基酸改变导致“突起到孔中”相互作用，并增加正确多价抗体的组装。二聚化特异性氨基酸可以在CH1结构域或CL结构域或其组合内。用于将CH1结构域与其他CH1结构域(CH1-CH1)和CL结构域与其他CL结构域(CL-CL)配对的二聚化特异性氨基酸至少可以在WO2014082179、WO 2015181805家族和WO 2017059551的披露内容中找到。二聚化特异性氨基酸也可以在Fc结构域内，并且可以与CH1或CL结构域内的二聚化特异性氨基酸组合。在一个实施例中，本披露提供了包含至少一个二聚化特异性氨基酸对的双特异性抗体。
对Fc区框架的进一步改变
在其他方面，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。此方法描述于例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一方面，可以用一个或多个不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法描述于例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
另一方面，改变一个或多个氨基酸残基从而改变抗体固定补体的能力。此方法描述于例如Bodmer等人的公开WO 94/29351中。在特定的方面，本披露的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被IgG1亚类和κ同种型的一个或多个同种异型氨基酸残基替代。同种异型氨基酸残基还包括但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区，如Jefferis等人,MAbs.[单克隆抗体]1:332-338(2009)所述。
在另一方面，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。此方法描述于例如Presta的公开WO 00/42072中。此外，已经绘制了在人IgG1上与FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276:6591-6604,2001)。
在另一方面，多特异性抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏或具有降低的糖基化)。例如，可以改变糖基化以增加抗体对“抗原”的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外地或替代性地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这样的改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化途径的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化途径的细胞已经在本领域中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Presta的公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180,1999)。
在另一方面，如果所需的ADCC降低，许多先前的报道显示人抗体亚类IgG4仅具有适度的ADCC并且几乎没有CDC效应子功能(Moore G L等人,2010MAbs[单克隆抗体],2:181-189)。然而，发现天然IgG4在应激条件下(如在酸性缓冲剂中或在升高的温度下)较不稳定(Angal,S.1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Dall'Acqua,W.等人,1998Biochemistry[生物化学],37:9266-9273；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。降低的ADCC可以通过将抗体可操作地连接至用降低FcγR结合或C1q结合活性的改变的组合工程化的IgG4 Fc，从而降低或消除ADCC和CDC效应子功能来实现。考虑到抗体作为生物药物的物理化学特性，IgG4的较不期望的固有特性之一是其两条重链在溶液中动态分离以形成半抗体，这导致通过称为“Fab臂交换”的过程在体内产生双特异性抗体(Vander Neut Kolfschoten M等人,2007Science[科学],317:1554-157)。228位(EU编号系统)丝氨酸突变为脯氨酸表现出对IgG4重链分离的抑制作用(Angal,S.1993Mol Immunol[分子免疫学],30:105-108；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。据报道，铰链区和γFc区中的一些氨基酸残基对抗体与Fcγ受体的相互作用具有影响(Chappel S M等人,1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院学报],88:9036-9040；Mukherjee,J.等人,1995FASEB J[美国实验生物学学会联合会杂志],9:115-119；Armour,K.L.等人,1999Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志],29:2613-2624；Clynes,R.A.等人,2000Nature Medicine[自然医学],6:443-446；Arnold J.N.,2007Annu Rev immunol[免疫学年鉴],25:21-50)。此外，在人群中一些罕见的IgG4同种型也可引起不同的物理化学特性(Brusco,A.等人,1998EurJ Immunogenet[欧洲免疫遗传学杂志],25:349-55；Aalberse等人,2002Immunol[免疫学],105:9-19)。为了产生具有低ADCC和CDC但具有良好稳定性的多特异性抗体，可以修饰人IgG4的铰链区和Fc区并引入许多改变。这些经修饰的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO:83-88，Li等人的美国专利号8,735,553中找到。
抗体产生
抗体及其抗原结合片段可通过本领域已知的任何方法产生，包括但不限于抗体四聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组产生获得。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本披露还提供了编码本文所述抗体的多核苷酸，例如编码包含本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:87组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:17、34或51组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本披露的多核苷酸可以编码抗CEAxCD137抗体的可变区序列。它们还可以编码抗体的可变区和恒定区。一些多核苷酸序列编码包含示例性抗CEAxCD137抗体的重链和轻链的可变区的多肽。
本披露还提供了用于产生抗CEAxCD137抗体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择取决于表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有可操作地连接至编码抗CEAxCD137抗体链或抗原结合片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些方面，除了在诱导条件的控制下，使用诱导型启动子来防止插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除启动子外，其他调节元件也可以是有效表达抗CEAxCD137抗体或抗原结合片段所需要或期望的。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；以及Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
用于携带并表达抗CEAxCD137抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本披露多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选地用操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达抗CEAxCD137抗体。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的抗CEAxCD137抗体。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常死亡或正常或异常永生化动物或人细胞。例如，已经开发了几种能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HEK 293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽一般在例如Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,NY,N.Y.[从基因到克隆，纽约VCH出版社，纽约市],1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学综述]89:49-68,1986)和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
双特异性抗体的产生
工程化异二聚体抗体Fc结构域的现行标准是杵臼(KiH)设计，其在核心CH3结构域界面引入突变。所得异二聚体具有降低的CH3熔融温度(69℃或更低)。然而，ZW异二聚体Fc设计具有81.5℃的热稳定性，这与野生型CH3结构域相当。
检测和诊断方法
本披露的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于检测CEA的方法。在一方面，抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中CEA的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织。在其他方面，这样的组织包括相对于其他组织以更高水平表达CEA的正常和/或癌性组织。
在一方面，本披露提供了检测生物样品中CEA的存在的方法。在某些方面，该方法包括在允许抗体与抗原结合的条件下，将生物样品与抗CEAxCD137抗体接触，并检测抗体与抗原之间是否形成复合物。生物样品可以包括但不限于尿液、组织、痰或血液样品。
还包括诊断与CEA表达相关的障碍的方法。在某些方面，该方法包括使测试细胞与抗CEAxCD137抗体接触；通过检测抗CEAxCD137抗体与CEA多肽的结合来测定测试细胞表达的CEA的表达水平(定量或定性)；以及将测试细胞的表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞相同组织来源的正常细胞或非CEA表达细胞)中的CEA表达水平进行比较，其中与对照细胞相比，测试细胞中较高水平的CEA表达表明存在与CEA表达相关的障碍。
治疗方法
本披露的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于治疗CEA相关障碍或疾病的方法。在一方面，CEA相关障碍或疾病是癌症。
在一方面，本披露提供了治疗癌症的方法。在某些方面，该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗CEAxCD137抗体或抗原结合片段。癌症可包括但不限于胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
本文披露的抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本披露的抗体或抗原结合片段可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。关于这点要考虑的因素包括治疗的特定障碍、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案、和医疗从业者已知的其他因素。抗体不需要但任选地与目前用于预防或治疗所研究的障碍的一种或多种药剂一起配制。这样的其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗体的量、障碍或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％-99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为预防或治疗疾病，本披露的抗体或抗原结合片段的合适的剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对抗体的应答、以及主治医生的判断。抗体适当地以一次或经一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至100mg/kg的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直到出现疾病症状的期望抑制。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的抗体)。施用初始较高负载剂量，随后施用一个或多个较低剂量。但是，其他给药方案可以是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测此疗法的进展。
组合疗法
在一方面，本披露的抗CEAxCD137抗体可与其他治疗剂组合使用。可以与本披露的抗CEAxCD137抗体一起使用的其他治疗剂包括：但不限于化疗剂(例如，紫杉醇或紫杉醇药剂；(例如)、多西他赛；卡铂；托泊替康；顺铂；伊立替康、多柔比星、来那度胺、5-氮杂胞苷、异环磷酰胺、奥沙利铂、培美曲塞二钠、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨、氟达拉滨、长春新碱、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如厄洛替尼)、多激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向剂(例如利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向剂(例如阿仑单抗)、泼尼松龙、达贝泊汀α、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如奥利默森钠)、极光激酶抑制剂(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、CD-19靶向剂(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、mTOR抑制剂(例如坦罗莫司、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)、EGEN-001、Polo样激酶1抑制剂(例如BI 672)。
本披露的抗CEAxCD137抗体可与其他治疗剂(例如免疫检查点抗体)组合使用。这样的免疫检查点抗体可包括抗PD1抗体。抗PD1抗体可包括但不限于替雷利珠单抗、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)或纳武利尤单抗(Nivolumab)。替雷利珠单抗披露于US 8,735,553中。帕博利珠单抗(以前称为MK-3475)披露于US 8,354,509和US 8,900,587中，并且是人源化lgG4-K免疫球蛋白，其靶向PD1受体并抑制PD1受体配体PD-L1和PD-L2的结合。帕博利珠单抗已被批准用于转移性黑色素瘤和转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的适应症，并且正在进行用于治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和难治性霍奇金淋巴瘤(cHL)的临床研究。纳武利尤单抗(如由百时美施贵宝公司(Bristol-Meyers Squibb)所披露的)是全人lgG4-K单克隆抗体。纳武利尤单抗(克隆5C4)披露于美国专利号US 8,008,449和WO 2006/121168中。纳武利尤单抗被批准用于治疗黑色素瘤、肺癌、肾癌、和霍奇金淋巴瘤。
用于与抗CEAxCD137抗体组合的其他免疫检查点抗体可包括抗TIGIT抗体。这样的抗TIGIT抗体可包括但不限于如WO 2019/129261中所披露的抗TIGIT抗体。
药物组合物和配制品
还提供了包含抗CEAxCD137抗体或其抗原结合片段或包含编码抗CEAxCD137抗体或抗原结合片段的序列的多核苷酸的组合物，包括药物配制品。在某些实施例中，组合物包含一种或多种抗CEAxCD137抗体或抗原结合片段，或包含编码一种或多种抗CEAxCD137抗体或抗原结合片段的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物还可包含合适的载剂，如本领域熟知的药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
通过将具有所需纯度的这种抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备本文所述的抗CEAxCD137抗体或抗原结合片段的药物配制品(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition[雷明顿药物科学第16版],Osol,A.编(1980))，呈冻干配制品或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对于接受者通常是无毒性的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(百特国际有限公司(Baxter International,Inc.))。在美国专利号US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
在一个实施例中，配制品由L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐一水合物、海藻糖和聚山梨醇酯20组成。在另一个实施例中，抗CEAxCD137抗体药物产品在用无菌注射用水配制后的浓度是由10mg/mL抗CEAxCD137抗体、20mM组氨酸/组氨酸HCl、240mM海藻糖二水合物和0.02％聚山梨醇酯20组成的等渗溶液，pH大约5.5。
示例性冻干抗体配制品描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体配制品包括美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些，后者的配制品包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有该抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。无菌性可以例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
实例
实例1：抗CEA单克隆抗体的产生
用于免疫和结合测定的CEA重组蛋白
为了发现在含有结构域B3(SEQ ID NO:88的氨基酸596-674，参见Beauchemin等人,Mol.Cell Bio.[分子细胞生物学],1987,7(9):3321-3330)的膜周围区域与人和猕猴CEA发生交叉反应但不与其他人CEACAM成员脱靶结合的针对CEA的新抗体，设计并表达了几种重组蛋白用于抗体筛选(参见表3)。
将全长人CEA(SEQ ID NO:88)、猕猴CEA(SEQ ID NO:89)和全长人CEACAM6(SEQ IDNO:90)的cDNA编码区根据GenBank序列排序。对于人CEA(登录号：NM_004363.2)，该基因可获自Sinobio，目录号HG11077-UT。对于猕猴CEA(登录号：NM_001047125)，该基因可获自Genscript，目录号OMb23865D。对于人CEACAM6(登录号：NM_002483.4)，该基因可获自Sinobio，目录号HG10823-UT。CEA融合蛋白的示意图如图1所示。据报道，人CEA的剪接变体与全长CEA在肿瘤上同时表达(Peng等人,PloS one[公共科学图书馆：综合],7,e36412-e36412(2012))，并且因此制备了变体(CEA-v)。为了产生此构建体，将由huCEA(SEQ ID NO:91)的氨基酸(AA)1-687组成的细胞外结构域(ECD)的编码区、猴CEA(SEQ ID NO:92)的氨基酸(AA)1-690的区域和CEACAM6(SEQ ID NO:93)的氨基酸(AA)1-320的区域进行PCR扩增。将CEA氨基酸(AA)1-78(SEQ ID NO:94)和CEA的氨基酸398-687(SEQ ID NO:95)的区域进行PCR扩增，然后通过重叠PCR缀合以制备CEA变体(CEA-v)(SEQ ID NO:96)。替代性地，将CEACAM6氨基酸(AA)1-273(SEQ ID NO:97)的区域和含有CEA氨基酸(AA)596-687的结构域B3(SEQ ID NO:98)的膜周围区域进行PCR扩增，然后通过重叠PCR缀合以制备嵌合构建体(CHIM)(SEQ ID NO:99)。然后将所有构建体克隆到基于pcDNA3.1的表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))中，其C末端分别与6xHis标签融合，从而产生五个重组融合蛋白表达质粒CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM。为了产生重组融合蛋白，将CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM质粒瞬时转染到基于HEK293的哺乳动物细胞表达系统(内部产生)中，并在装备有旋转振荡器的CO2培养箱中培养5-7天。收集含有重组蛋白的上清液并离心澄清。使用Ni-NTA琼脂糖(目录号R90115，英杰公司)纯化重组蛋白。将所有重组蛋白用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，并以小等分试样保存在-80℃冰箱中。
在细胞系中稳定表达
为了建立表达全长人CEA的稳定细胞系(登录号：NM_004363.2)，将表达CEA的cDNA克隆到逆转录病毒载体pFB-Neo(目录号217561，美国的安捷伦公司(Agilent,USA))中。根据先前的方案(Zhang等人,Blood.[血液]2005 106(5):1544-51)产生双嗜性逆转录病毒载体。将含有人CEA的病毒载体转导到L929(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA))和CT26细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)中，以产生人CEA表达细胞系。通过在含有10％FBS和G418的完全RPMI1640培养基中培养来选择高表达细胞系，然后通过FACS结合测定来验证。
免疫、杂交瘤融合和克隆
用500μl含有或不含水溶性佐剂(目录号KX0210041，中国北京的康碧泉公司(KangBiQuan,Beijing,China))的1×107个L929/huCEA细胞腹膜内(i.p.)免疫八至十二周龄Balb/c小鼠(中国北京的华阜康生物科技有限公司(HFK BIOSCIENCE CO.,LTD,Beijing,China))。两周后重复该过程以促进抗体产生。第三次免疫后两周，通过ELISA和FACS评估小鼠血清的可溶性CEA(sCEA)结合。使用标准技术(Colligan JE等人,CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY[免疫学实验手册],1993)分离脾细胞并与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)融合。
通过ELISA和FACS评估抗体的CEA结合活性
为了筛选结合人CEA但不结合CEACAM6或sCEA的抗体，筛选并反筛选结合CHIM但不结合sCEA、CEACAM6和CEA-v的抗体，以及结合CHIM、sCEA和CEA-v但不结合CEACAM6的抗体。杂交瘤克隆的上清液最初通过(Methods in Molecular Biology[分子生物学方法](2007)378:33-52)中所述的ELISA(略作修改)进行筛选。简而言之，将sCEA、CHIM、CEACAM6或CEA-v分别以3μg/ml的低浓度包被在96孔板中。使用HRP-连接的抗小鼠IgG抗体(目录号7076S，美国的细胞传导技术公司(Cell Signaling Technology,USA))和底物(目录号00-4201-56，美国的伊生物技术公司(eBioscience,USA))进行显色，并使用酶标仪(SpectraMaxParadigmTM，美国的分子设备公司(Molecular Devices,USA))测量450nm波长处的吸光度信号。使用L929/huCEA和/或MKN45细胞(ATCC)通过FACS进一步验证ELISA阳性克隆。MKN45细胞来源于人胃癌。将表达CEA的细胞(105个细胞/孔)与ELISA阳性杂交瘤上清液一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号A0473，中国的碧云天生物技术公司(Beyotime Biotechnology,China))结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。
对来自杂交瘤的在FACS筛选中表现出阳性信号并且与CHIM而不是CEACAM6和sCEA结合的条件培养基进行功能测定，以评估sCEA的存在对CEA抗体与CEA表达细胞的结合的影响(参见下面的实例)。对具有所需结合特异性和功能活性的抗体进一步亚克隆和表征。
杂交瘤亚克隆和对无血清或低血清培养基的适应
主要通过ELISA、FACS和功能测定进行初步筛选后，通过有限稀释亚克隆阳性杂交瘤克隆。通过功能测定而验证的靠前抗体亚克隆在含3％FBS的CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02，美国的海克隆公司(Hyclone,USA))中适应生长。
单克隆抗体的表达和纯化
将杂交瘤细胞在CDM4MAb培养基(目录号SH30801.02，海克隆公司)中培养，并在37℃下、在CO2培养箱中孵育5至7天。通过离心收集条件培养基并在纯化前通过0.22μm膜过滤。依照制造商的指导中的方案应用含有鼠抗体的上清液并结合到蛋白A柱(目录号17127901，通用生命科学公司(GE Life Sciences))。该程序通常产生纯度高于90％的抗体。将蛋白A亲和纯化的抗体用PBS透析或使用HiLoadTM16/60SuperdexTM200柱(目录号17531801，通用生命科学公司)进一步纯化以去除聚集物。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。将最终的抗体制剂以等分试样储存在-80℃冰箱中。
表3：氨基酸和核酸序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实例2.CEA抗体的克隆和序列分析
根据制造商的方案，使用Ultrapure RNA试剂盒(目录号74104，德国的凯杰公司(QIAGEN,Germany))收获鼠杂交瘤细胞以制备总RNA。使用来自英杰公司的cDNA合成试剂盒(目录号18080-051)合成第一条链cDNA，并使用PCR试剂盒(目录号CW0686，中国北京的康为世纪公司(CWBio,Beijing,China))进行鼠单克隆抗体的VH和VL基因的PCR扩增。基于先前报道的序列(Brocks等人,Mol Med.[分子医学]2001 7(7):461-9)合成用于重链可变区(VH)和κ轻链可变区(VL)的抗体cDNA克隆的寡核苷酸引物。然后将PCR产物亚克隆到pEASY-Blunt克隆载体(目录号CB101-02，中国的全式金公司(TransGen,China))中，并测序。从DNA测序结果确定VH和VL区的氨基酸序列。
单克隆抗体通过比较序列同源性来分析，并基于序列相似性分组(图2)。根据IMGT(Lefranc等人,1999Nucleic Acids Research[核酸研究]27:209-212)系统通过序列注释来定义互补决定区(CDR)。代表性克隆BGA13的氨基酸序列在表4中列出。
表4：氨基酸序列
实例3.纯化的鼠抗CEA抗体的结合概况测定
通过使用BIAcoreTM T-200(通用生命科学公司)的SPR测定，表征了具有CEA特异性结合(如通过ELISA和FACS显示的)以及没有可溶性CEA(sCEA)干扰的CEA抗体的结合动力学(图3A)。简言之，将抗鼠IgG抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100530，通用生命科学公司)上。使纯化的鼠抗体流过芯片表面并被抗鼠IgG抗体捕获。然后使纯化的CHIM、CEA-v、CEA或猴CEA重组蛋白的连续稀释液(6.0nM至2150nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。BGA13的结合亲和力概况在下表5中示出。
通过抗原ELISA检查BGA13的结合概况，观察到纯化的BGA13与huCEA和猴CEA的结合，这表明BGA13对可溶性huCEA和猴CEA是弱结合剂，或者可溶性CEA在固定时具有不同的构象(图3B)。对于该实验，将sCEA、CHIM、猴CEA、CEA-v和BSA以10μg/ml的高浓度在4℃下包被在96孔板中过夜。BGA13或对照抗体ab4451(目录号ab4451，美国的艾博抗公司(abcam,USA))以2μg/ml的浓度孵育1小时。使用HRP-连接的抗小鼠IgG抗体(目录号7076S，美国的细胞传导技术公司(Cell Signaling Technology,USA))和底物(目录号00-4201-56，美国的伊生物技术公司(eBioscience,USA))进行显色，并使用酶标仪(SpectraMax Paradigm，美国的分子设备公司(Molecular Devices,USA))测量450nm波长处的吸光度信号。
表5：通过SPR比较BGA13结合亲和力
实例4.重组可溶性CEA对BGA13与CEA表达细胞的结合的影响
通过流式细胞术评估可溶性CEA的存在对各种CEA抗体与CEA表达细胞的特异性结合的影响。简言之，在20μg/ml额外的重组可溶性CEA蛋白的存在下，将表达人CEA的细胞(105个细胞/孔)与2μg/ml纯化的CEA鼠单克隆抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(目录号A0473，中国的碧云天生物技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。如图4A和图4B所示，BGA13与CEA表达细胞的结合不受可溶性CEA存在的影响。
实例5.鼠抗人CEA抗体的人源化
mAb人源化和工程化
对于BGA13的人源化，通过在IMGT和NCBI的人免疫球蛋白基因数据库中进行序列比较，搜索人种系IgG基因中与BGA13可变区的cDNA序列具有高度同源性的序列。选择以高频率存在于人抗体库(Glanville等人，2009PNAS[美国国家科学院院刊]106:20216-20221)中并且与BGA13高度同源的人IGVH和IGVL基因作为人源化的模板。在人源化之前，将BGA13重链和轻链可变结构域分别与命名为人IgG1wt的野生型人IgG1恒定区(SEQ ID NO:123)和人κ恒定(CL)区(SEQ ID NO:124)融合。
表6：氨基酸序列
通过CDR移植进行人源化(Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第248卷:Antibody Engineering,Methods and Protocols[抗体工程、方法和方案],HumanaPress[胡马纳出版社])并将BGA13抗体以人IgG1形式工程化。在第一轮人源化中，框架区中从鼠到人氨基酸残基的突变由模拟的3D结构指导，并且在人源化抗体BGA13的第一版本BGA131中保留了对于维持CDR的规范结构具有结构重要性的鼠框架残基(重链和轻链的氨基酸序列在SEQ ID NO:125和126中示出)。
表7：氨基酸序列
具体地，将BGA13 VL的CDR移植到保留了2个鼠框架残基(N66和V68)的人种系可变基因IGVK1-27的框架中(轻链可变结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:128中示出)。将BGA13VH的CDR移植到保留了5个鼠框架(L39、I53、Y55、N66、S68)残基的人种系可变基因IGVH1-46的框架中(重链可变结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:127中示出)。
表8：氨基酸序列
使用内部开发的表达载体将BGA13-1构建为人全长抗体形式，这些表达载体含有野生型人IgG1的恒定区，具有容易适应的亚克隆位点。通过将上述两种构建体共转染到293G细胞中并使用蛋白A柱(目录号17543802，通用生命科学公司)纯化来实现BGA13-1抗体的表达和制备。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
使用BGA131，进行额外数量的单个或多个氨基酸改变，将VH和VL框架区中的人残基转化为相应的鼠种系残基，其分别包括VH中的V68A、R72A和V79A以及VL中的V43S。这产生BGA132(VH中的V68A、R72A)、BGA133(VH中的V79A)、BGA134(VH中的V68A、R72A、V79A)、BGA135(VL中的V43S)、BGA136(VH中的V68A、R72A和VL中的V43S)、BGA137(VH中的V79A、VL中的V43S)和BGA138(VH中的V68A、R72A、V79A和VL中的V43S)。所有含有修饰的抗体都具有与BGA131相似的结合活性，并且没有一种改变消除结合。
为了去除翻译后修饰(PTM)位点，通过基于BGA131序列在CDR和框架区中引入突变来进行进一步工程化，这些突变包括VH区中的N52T、N54Q、N59S、N102G、N104Q和S61A氨基酸改变。这产生BGA131A(N52T(VH))、BGA131B(N54Q(VH))、BGA131C(N59S(VH))、BGA131D(N102G(VH))、BGA131E(N104Q(VH))和BGA131F(N54Q、N59S、S61A(VH))，并且所有抗体都具有与BGA131相似的结合特异性，没有一种改变消除结合。在保持特异性的同时，还考虑了氨基酸组成和表达水平。使用在特定位置含有突变的引物和定点诱变试剂盒(目录号FM111-02，中国北京的全式金公司)进行所有人源化突变。通过序列分析验证所需的突变。与BGA13-1相比，BGA13-1F具有显著降低的结合亲和力，没有糖基化位点，但具有高表达水平(表9)。
表9：氨基酸序列
实例6.亲和力成熟文库的产生
通过标准分子生物学技术使用噬菌粒载体pCANTAB 5E(通用电气医疗集团(GEHealthcare))构建噬菌粒，该噬菌粒被设计成在M13噬菌体的表面上展示BGA13-1F Fab片段作为与基因-3次要外壳蛋白片段的N末端的融合体。在g3序列之前有一个琥珀终止密码子，以允许直接从噬菌粒克隆表达Fab片段。使用噬菌粒作为模板来构建含有108个独特成员的噬菌体展示文库。
构建两个文库(H-AM、L-AM)，分别随机化重链和轻链中的CDR位置。所有三个CDR在每个文库中随机化，但每个CDR在每个克隆中具有最多一个突变，HCDR3除外，其可具有两个同时突变。每个位置用编码任何氨基酸的NNK密码子(IUPAC编码)或琥珀终止密码子随机化。组合的重链和轻链文库设计具有5.0×106个独特全长克隆的潜在多样性，没有终止密码子或半胱氨酸密码子，并且预期分布分别为约0.02％、1.1％、17％和82％的克隆分别具有0、1、2和3个突变。由于HCDR3区域中的引物设计，预期一小部分重链克隆具有4个突变。作为第一步，使用pCANTAB 5E(作为模板)和含有随机化CDR3位置的引物扩增DNA片段(参见图5A和图5B)。然后将PCR产物凝胶纯化并与含有随机化CDR2位置的引物组装。用针对随机CDR1位置的引物重复该过程。然后通过重叠PCR将所得的重链或轻链的PCR产物与其相应的CH片段或CL片段组装。通过重叠PCR将片段进一步与没有突变的轻链或重链组装。然后将所得片段凝胶纯化，并在NcoI/NotI消化后与pCANTAB 5E连接。通过电穿孔将纯化的连接物转化到TG1细菌中。来自每个文库的48个克隆的测序证实了每个位置的随机化(数据未示出)，尽管由于取样深度有限，并非在每个位置都观察到所有的氨基酸突变。约52％和55％的轻链和重链文库具有全长随机克隆，足以覆盖设计的所有潜在多样性，即使在寡核苷酸合成和文库构建中存在适度的掺入偏差，也会产生108个独立克隆。
实例7.亲和力成熟的人源化BGA13变体的产生
文库选择和筛选
使用标准方案通过噬菌体展示进行亲和力成熟的人源化BGA13 Fab的产生(Silacci等人,(2005)Proteomics[蛋白质组学],5,2340-50；Zhao等人,(2014)PLoS One[公共科学图书馆：综合],9,e111339)。对于第一轮和第二轮选择，在免疫管(目录号470319，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))中对固定化的CHIM进行竞争选择。简言之，免疫管用1ml CHIM(5μg/ml的PBS溶液)在4℃下包被过夜。在各种浓度的BGA13-1F IgG(第1轮，1μg/ml；第2轮，5μg/ml)存在下，将所有亲和力成熟文库与包被的免疫管一起孵育1小时。对于第三轮和第四轮选择，使用L929/huCEA细胞(第3轮)或LOVO细胞(ATCC CCL-229)(第4轮)进行细胞淘选，其中HEK293细胞作为耗竭细胞。在四轮选择之后，挑选单个克隆并使用标准方案制备含有噬菌体的上清液。对ELISA阳性克隆测序，并分析突变位点。
CDR中的突变频率分析
在四轮选择之后，每个CDR中的突变频率相对较高，范围从HCDR3中的17％到LCDR2中的95％。关于重链，在H-AM文库中鉴定的大约一半克隆与亲本克隆相同。其他克隆在HCDR2中的Q54N处含有一个回复突变。
在分析轻链时，突变更加多样化。两个位点分别在LCDR1的几乎所有克隆中都发生了突变。轻链残基29和31分别在47.09％和35.29％的克隆中从Ile突变为Gln和从Gly突变为Gln。位置29不仅具有高频率的Gln突变，而且具有突变为酪氨酸的克隆子集。位置31不仅具有高频率的Gln突变，而且有约12.5％的机会突变为Leu。由于文库设计限制，没有发现位置29和31的突变彼此结合。然而，这两个位点中的每一个中的突变通常与其他CDR中的突变组合。关于LCDR2，只有A51在至少64.71％的克隆中发生突变，但没有任何明显的模式，其包括大的疏水和极性残基，诸如Tyr、Phe、Thr和Asn。关于LCDR3，两个位点在至少50％的克隆中发生了突变。轻链残基90和92分别在11.76％和47.06％的克隆中从His突变为Leu和从Tyr突变为Leu。图6示出了四轮选择后轻链CDR区的序列差异。
所选择的人源化BGA13变体的表达
进行了突变的组合。将来自所选噬菌体克隆的轻链可变区亚克隆到人κ轻链表达哺乳动物表达载体中。将轻链表达载体与表达BGA13-1F重链的哺乳动物表达载体以1:1的比例共转染到293G细胞中。通过蛋白A亲和色谱法(目录号17543802，通用生命科学公司)从培养上清液中纯化CEA抗体形式。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
亲和力成熟的人源化BGA13变体的表征
通过使用BIAcoreTMT-200(通用生命科学公司)的SPR测定(表10)和流式细胞术(图7)进行BGA13-1F和其他亲和力成熟克隆的亲和力比较。对于该实验，将抗人IgG(Fc)抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100839，通用生命科学公司)上。抗CEA抗体流过芯片表面并被抗人Fab抗体捕获。然后使CHIM的连续稀释液(1.37nM至333nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。对于流式细胞术，将表达CEA的细胞(105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的亲和力成熟抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号409320，美国的百进生化技术公司(BioLegend,USA))结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。BGA131F-ph-L(SEQ ID NO:131)和BGA131F-ph-M(SEQ ID NO:132)显示出对huCEA表面蛋白的亲和力提高(表11)。
表10：通过SPR比较结合亲和力
样品ID Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
1F-ph-E 3.4E+3 3.5E-3 1.0E-6 284
1F-ph-F 1.0E+2 1.2E-2 1.2E-4 4162
1F-ph-G 6.4E+1 2.6E-3 4.1E-5 3487
1F-ph-H 1.1E+2 2.8E-3 2.5E-5 1983
1F-ph-I 2.0E+2 2.2E-3 1.1E-5 2248
1F-ph-L 6.7E+3 3.0E-4 4.6E-8 184
1F-ph-M 2.5E+3 2.5E-4 9.9E-8 224
1F-ph-N 1.1E+3 1.0E-2 9.2E-6 1267
BGA13-1F 1.9E+3 1.5E-3 7.9E-7 367
表11：氨基酸序列
实例8.亲和力成熟的人源化BGA13变体的进一步工程化
通过在基于BGA131F-ph-M模板的CDR中引入突变进行了进一步的工程化，该模板包括VH中的W33Y、Q54N和S59N以及VL中的T51Y。这产生BGA1132A(W33Y(VH))、BGA1132B(Q54N(VH))、BGA1132C(S59N(VH))、BGA1131A(T51Y(VL))，它们都具有改进的与BGA-1131F的结合活性，其中改进最大的抗体最终产生具有(W33Y(VH)、T51Y(VL))改变的BGA113抗体(表12)，序列在表13中示出。
表12：通过SPR比较与CHIM的结合亲和力
样品ID Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
BGA1311F-ph-M 1.97E+04 2.48E-04 1.26E-08 97.2
1132A 1.99E+04 2.82E-04 1.42E-08 129.1
1132B 1.98E+04 3.80E-04 1.92E-08 71.1
1132C 1.84E+04 3.94E-04 2.15E-08 59.4
1131A 3.21E+04 4.63E-04 1.44E-08 92.9
113 3.15E+04 4.75E-04 1.51E-08 112.4
表13：BGA-113的氨基酸和核酸序列
实例9.BGA113的优化
为了进一步改善生物化学/生物物理学特性，通过在CDR和框架区中引入取代来优化BGA113(表14)。选择大的疏水残基并将其改变为极性残基，K13和Q53除外，它们是基于观察到的人VH种系之间的差异而选择的。考虑因素包括氨基酸组成、热稳定性(Tm)、表面疏水性和等电点(pI)，同时保持功能活性。如实例6所述，通过克隆到载体pCANTAB-5E中以Fab形式表达变体。然后通过ELISA和SPR分析筛选含有Fab的上清液的CEA结合。选择没有显著亲和力降低的变体并鉴定出可耐受取代的残基。证明轻链中的L92E，重链中的K13E、Q54E、Y57D/E和Y57K对亲和力的影响极小。因此，表达和纯化具有单个鉴定出的突变或组合的IgG形式的BGA113变体，如实例8中所述。进行SPR研究和FACS分析并总结在表14中。证实了特异性和表位没有由于引入的氨基酸取代而发生改变(数据未示出)。总之，结果表明这些单一或组合突变(重链中的K13E、Q54E、Y57D和Y57K，轻链中的L92E)对亲和力的影响极小，L92E除外，它略微降低了与CEA的结合亲和力。总之，Y57K改变优化了BGA113抗体的表达、CEA结合和亲和力，从而产生BGA113K(表1)。
表14：用于取代的残基的总结
表15：通过SPR对BGA113变体的亲和力测量的总结
实例10.抗CEA抗体BGA113K的结合概况
BGA113K和先前披露的CEA抗体(在U.S.2012/0251529中命名为抗体2F1)以人IgG1形式产生并使用BIAcoreTM T-200(通用生命科学公司)通过SPR测定表征它们的结合动力学。
为了获得该数据，将抗人IgG(Fc)抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100839，通用生命科学公司)上。BGA113K抗体流过芯片表面并被抗人Fab抗体捕获。然后使可溶性huCEA或cynoCEA(目录号：CE5-C52H5，北京百普赛斯生物科技股份有限公司(Acrobiosystem))的连续稀释液(1.37nM至2150nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。BGA113K和2F1对照抗体表现出不同的结合亲和力。BGA113K对人CEA具有非常高的亲和力，对cynoCEA也具有相当的亲和力，如下表16所示。
对于流式细胞术，将表达CEA的MKN45细胞(105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的亲和力成熟抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。如图8所示，BGA-113K以剂量反应方式与活细胞上的天然CEA特异性结合，EC50为2.92μg/ml。
表16：通过SPR比较抗CEA抗体的结合亲和力
实例11.脱靶特异性的评估
通过ELISA和流式细胞术评估BGA113K的脱靶特异性。对于流式细胞术，将CEACAM3(SEQ ID NO:101)、CEACAM7(SEQ ID NO:102)或CEACAM8(SEQ ID NO:103)瞬时转染到HEK293细胞(105个细胞/孔)中，然后与2μg/ml纯化的BGA113K一起孵育，随后与AlexaFluor-647标记的抗huIgG Fc抗体(目录号409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。对于抗原ELISA、CEACAM1(SEQ ID NO:100)(目录号10822-H08H，中国的义翘神州公司(Sino Biological,China))、CHIM(SEQ ID NO:99)、CEA(SEQ ID NO:91)或CEACAM6(SEQID NO:93)以10μg/ml的浓度在4℃下包被在96孔板中过夜。使用HRP-连接的抗人Fc(Fc特异性)IgG抗体(目录号A0170，美国的西格玛公司(Sigma,USA))和底物(目录号00-4201-56，美国的伊生物技术公司(eBioscience,USA))进行显色，并使用酶标仪(SpectraMaxParadigm，美国的分子设备公司(Molecular Devices,USA))测量450nm波长处的吸光度信号。如图9A和图9B所示，没有观察到与其他CEACAM家族成员的交叉反应性，因此BGA113K仅表现出对CEA的特异性(图9A-B中的CEACAM5)。
实例12.可溶性huCEA对BGA113K与CEA表达细胞的结合的影响
为了确定可溶性CEA(sCEA)是否对BGA113K的特异性结合有任何影响，将不同浓度(0、0.5、1、2μg/ml)的重组可溶性CEA与(0.01-100μg/ml)BGA113K预混合并孵育5分钟。然后将混合物与2×105个CEA表达细胞诸如MKN45细胞在4℃下孵育30分钟。将细胞用第二抗体抗huFc-APC(目录号409320，美国的百进生化技术公司)染色并通过流式细胞术分析。在2μg/ml重组sCEA存在下，BGA113K与CEA表达细胞的结合不受影响。该结果针对MKN45细胞显示(图10)，并表明BGA113K对CEA的膜结合形式的特异性。
实例13.BGA113诱导对CEA+肿瘤细胞的有效ADCC作用
为了确定野生型IgG1形式的BGA113是否可以诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，将表达CD16(V158)的NK92MI细胞(NK92MI/CD16V)用作效应细胞，并与表达CEA的小鼠结肠癌细胞(CT26-ATCC CRL-2638)共培养。在指定浓度(0.00005-5μg/ml)的BGA113存在下，以1:1的E:T比率进行共培养5小时，并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放确定细胞毒性。使用CytoToxTM96非放射性细胞毒性测定试剂盒(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))测量上清液中LDH的量，并根据制造商的说明计算特异性裂解的量。如图11所示，BGA113可在体外诱导ADCC，EC50为约6.7ng/ml。
实例14.BGA113的体内抗肿瘤功效
为了确定BGA113针对CEA+肿瘤细胞的体内功效，将NK92MI/CD16V细胞(5×106)与CT26/CEA细胞(106)混合并皮下注射到NCG小鼠中。在肿瘤注射当天开始，每周两次给予BGA113(0.12、0.62或3.1mg/kg)或媒介物对照(每组7只小鼠)。与媒介物相比，3.1mg/kg剂量的BGA113表现出少量的肿瘤抑制，尽管与媒介物对照的差异在统计学上不显著(P>0.05)(图12)。
实例15.重组蛋白和稳定细胞系的产生
用于噬菌体活动和结合测定的CD137重组蛋白
为了发现与人和猕猴CD137交叉结合但不与其他人TNF受体成员脱靶结合的针对CD137的VH结构域抗体，设计并表达了几种重组蛋白用于噬菌体淘选和筛选(参见表17)。将全长人CD137(SEQ ID NO:135)的cDNA编码区根据CD137GenBank序列(登录号：NM_001561.4，该基因可获自Sinobio，目录号：HG10041-M)排序。将人CD137配体(TNFSF9)(SEQID NO:145)根据(登录号：NM_003811.3，该基因可获自Sinobio，目录号：HG15693-G)排序。将猴(猕猴)CD137(SEQ ID NO:151)根据(登录号：NM_001266128.1，该基因可获自Genscript，目录号：OMb00270)排序。将全长人CD40(SEQ ID NO:157)根据(登录号：NM_001250.4，该基因可获自Sinobio，目录号：HG10774-M)排序。将OX40(SEQ ID NO:163)根据(登录号：NM_003327.2，该基因可获自Sinobio，目录号：HG10481-UT)排序。简言之，分别对由huCD137的氨基酸(AA)24-183(SEQ ID NO:137)组成的细胞外结构域(ECD)的编码区、由人CD137配体的AA 71-254(SEQ ID NO:147)组成的ECD的编码区、由cynoCD137的AA24-186(SEQ ID NO:153)组成的ECD的编码区和由人CD40的AA1-194(SEQ ID NO:159)组成的ECD的编码区进行了PCR扩增。对mIgG2aFc(SEQ ID NO:143)的编码区进行了PCR扩增，然后通过重叠PCR与人CD137、人CD137配体、猴CD137或人CD40的ECD缀合，以制备mIgG2a Fc融合蛋白。然后将PCR产物克隆到基于pcDNA3.1的表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中，产生五个重组mIgG2a Fc融合蛋白表达质粒：人CD137 ECD-mIgG2a、人CD137配体mIgG2a、cyno CD137 ECD-mIgG2a和人CD40 ECD-mIgG2a。替代性地，将由huCD137(SEQ IDNO:135)的AA24-183(SEQ ID NO:137)组成的ECD的编码区和由人OX40(SEQ ID NO:165)的AA1-216组成的ECD的编码区也克隆到基于pcDNA3.1的表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中，其C末端与6xHis标签融合，从而分别产生人CD137-his和人OX40-his。为了产生重组融合蛋白，将质粒瞬时转染到基于HEK293的哺乳动物细胞表达系统(内部开发)中，并在装备有旋转振荡器的CO2培养箱中培养5-7天。收集含有重组蛋白的上清液并离心澄清。使用蛋白A柱(目录号：17127901，通用生命科学公司)或Ni-NTA琼脂糖(目录号：R90115，英杰公司)纯化重组蛋白。将所有重组蛋白用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，并以小等分试样保存在-80℃冰箱中。
稳定表达细胞系
为了建立表达全长人CD137(huCD137)的稳定细胞系，将huCD137序列克隆到逆转录病毒载体pFB-Neo(目录号：217561，美国的安捷伦公司)中。根据先前的方案(Zhang等人,(2005)Blood[血液],106,1544-1551)产生双嗜性逆转录病毒载体。将含有huCD137的载体转导到Hut78细胞(ATCC，TIB-161)或NK92-mi细胞(ATCC，CRL-2408)中，以产生huCD137表达细胞系Hut78/huCD137或NK92-mi/huCD137。通过在含有10％FBS和G418的培养基中培养来选择表达huCD137的细胞系，然后通过FACS验证。
表17：重组CD137蛋白的序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实例16.抗huCD137 VH结构域抗体的产生
合成人VH抗体库的构建
合成文库基本上使用种系3-23(SEQ ID NO:169和170)构建。通过使用简并寡核苷酸的组合诱变进行重链CDR(HCDR)的随机化。如Meetei(Meetei等人,(1998)Anal.Biochem[分析生物化学],264,288-91；Meetei等人,(2002)Methods Mol Biol[分子生物学方法],182,95-102)所述，通过聚合酶链式反应经由多个位点特异性突变进行HCDR1和HCDR2区的随机化。对于CDR3区，合成了8至14(Kabat定义)的不同长度的简并寡核苷酸(英杰公司)，并通过剪接重叠延伸PCR引入了多样性。诱变步骤后的PCR产物由NcoI/NotI双重消化并连接到噬菌粒载体pCANTAB-5E中。然后将这些库转化到大肠杆菌TG1细菌中，并通过随机克隆的DNASanger测序验证(分析>96个克隆)。在使用KM13辅助噬菌体的拯救步骤之后，通过用PEG/NaCl直接从培养上清液中沉淀两次来纯化噬菌体。转化到大肠杆菌中后获得总大小为1.38×1011的文库。
表18：用于文库构建的种系
/>
噬菌体展示淘选和筛选
使用标准方案通过噬菌体展示进行噬菌体展示选择(Silacci等人,(2005)Proteomics[蛋白质组学],5,2340-50；Zhao等人,(2014)PLoS One[公共科学图书馆：综合],9,e111339)。简言之，在第1轮和第2轮中使用了在免疫管中的10μg/ml固定化人CD137ECD-mIgG2a(目录号470319，赛默飞世尔科技公司)。在第3轮和第4轮中使用Hut78/huCD137细胞进行选择。用补充有1％Tween 20(MPBST)的5％奶粉(w/v)的PBS溶液阻断免疫管1小时。用PBST(补充有0.05％Tween 20的PBS缓冲液)洗涤后，每个子文库的5×1012个(第1轮)或5×1011个(第2轮)噬菌体被MPBST中的人CD40 ECD-mIgG2a耗竭1小时，然后与抗原一起孵育1小时。对于第三轮和第四轮选择，使用Hut78/huCD137细胞(第3轮)和HEK293(ATCC，CRL-1573)细胞作为耗竭细胞进行细胞淘选。用PBST洗涤后，用100mM三乙胺(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体用于感染对数中期的大肠杆菌TG1细菌，并接种到补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE琼脂板上。在四轮选择之后，挑选单个克隆并使用标准方案制备含有噬菌体的上清液。噬菌体ELISA和FACS用于筛选抗huCD137 VH结构域抗体。
对于噬菌体ELISA，用抗原包被MaxisorpTM免疫板，并用5％奶粉(w/v)的PBS缓冲液阻断。将噬菌体上清液用MPBST阻断30分钟，然后添加到ELISA板的孔中1小时。用PBST洗涤后，使用HRP缀合的抗M13抗体(通用电气医疗集团)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(目录号：00-4201-56，美国的伊生物技术公司)检测结合的噬菌体。使用Hut78/huCD137细胞通过流式细胞术进一步验证ELISA阳性克隆。将表达CD137的细胞(105个细胞/孔)与ELISA阳性噬菌体上清液一起孵育，然后与Alexa Fluro-647标记的抗M13抗体(通用电气医疗集团)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。
挑选在FACS筛选中显示阳性信号并结合huCD137和cynoCD137但不结合huOX40和huCD40的克隆并对其进行测序。鉴定了93个阳性克隆的大约76个独特序列(图13A至图13B)。
Fc融合VH抗体的表达和纯化
通过比较序列同源性分析VH序列，并基于序列相似性分组。根据Kabat(Wu和Kabat(1970)J.Exp.Med.[实验医学杂志]132:211-250)和IMGT(Lefranc(1999)Nucleic AcidsResearch[核酸研究]27:209-212)系统通过序列注释和通过基于互联网的序列分析来定义互补决定区(CDR)。两个代表性靠前克隆BGA-7207和BGA-4712的氨基酸和DNA序列在下表19中列出。在通过SPR对结合曲线进行序列检查和分析之后，然后使用内部开发的表达载体将抗huCD137 VH结构域抗体构建为人Fc融合VH抗体形式(VH-Fc)。如图14A所示，VH结构域抗体在人Fc的N末端与其间的G4S(SEQ ID NO:324)接头融合。使用了人IgG1(SEQ ID NO:175)的Fc无效形式(没有与FcγR结合的惰性Fc)。通过转染到293G细胞中并通过使用蛋白A柱(目录号17543802，通用生命科学公司)纯化来实现Fc融合VH抗体的表达和制备。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
表19：两种所选择的抗huCD137 VH结构域抗体的氨基酸和DNA序列
/>
/>
/>
/>
/>
实例17.抗huCD137 VH结构域抗体的功能筛选
使用含有VH-Fc蛋白的上清液对所选择的具有强激动作用的抗huCD137 VH结构域抗体进行功能筛选。简言之，将96孔白色/透明底板(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))与3μg/ml抗hu CD3(英杰公司，目录号16-0037-85)以50μl/孔预孵育5分钟，然后用PBS缓冲液洗去。接下来，将Hut78/huCD137细胞以5×105个细胞/ml重新悬浮，并以50μl/孔(25,000孔/孔)直接铺板到预包被的板中。将含有各种VH-Fc蛋白的上清液与细胞混合。替代性地，对于具有Fc融合的纯化的VH结构域抗体，以25、5、1、0.2、0.04、0.008或0.0016μg/ml以50μl/孔一式两份添加纯化的VH-Fc蛋白制剂的剂量滴定。添加山羊抗hu IgG(H&L)聚苯乙烯颗粒(6.46μm)(目录号HUP-60-5，球体技术公司(Spherotech))作为交联剂。将测定板在37℃下孵育过夜，并在24小时后测量IL-2的浓度。将数据绘制为与仅含培养基的孔中的浓度相比的IL-2倍数增加。图14B示出了使用含有VH-Fc蛋白的上清液的代表性筛选结果，并且其中一个克隆BGA-4712已经显示能够以剂量依赖性方式刺激Hut78/huCD137细胞中的IL-2产生(图14C)。
实例18.纯化的抗huCD137 VH结构域抗体的表征
通过ELISA表征纯化的抗体
对于抗原ELISA，用抗原包被MaxisorpTM免疫板，并用3％BSA(w/v)的PBS缓冲液(阻断缓冲液)阻断。将单克隆VH结构域抗体用阻断缓冲液阻断30分钟，然后添加到ELISA板的孔中1小时。用PBST洗涤后，使用HRP缀合的抗人IgG抗体(西格玛公司，A0170)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(目录号：00-4201-56，美国的伊生物技术公司)检测结合的抗体。所有选择的克隆都显示与cynoCD137发生交叉反应，而不与人OX40 ECD和人CD40 ECD结合。
通过SPR分析表征纯化的抗体
通过使用BIAcoreTMT-200(通用生命科学公司)的SPR测定对抗huCD137 VH结构域抗体进行表征。简言之，将抗人IgG(Fc)抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号：BR100839，通用生命科学公司)上。抗huCD137结构域抗体流过芯片表面并被抗人IgG(Fc)抗体捕获。然后使人CD137 ECD-mIgG2a的连续稀释液(6.0nM至2150nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。
通过流式细胞术表征纯化的抗体
对于流式细胞术，将人CD137+表达细胞(105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的VH结构域抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号：409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。配体竞争也应用于基于流式细胞术的测定。简言之，在连续稀释的人CD137配体mIgG2a存在下，将Hut78/huCD137与Fc融合VH结构域抗体(VH-Fc)一起孵育，随后用Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号：409320，美国的百进生化技术公司)进行检测。
然后表征所选择的VH结构域抗体的亲和力、细胞结合和配体竞争。一个代表性靠前克隆BGA-4712的SPR研究、FACS分析和配体竞争结果在图15A至图15B中示出。
实例19.使用抗CD137 VH结构域抗体BGA-4712和抗CEA抗体构建CEAxCD137多特异性抗体
为了探索比单一抗体治疗更有效的基于CD137的作用机制(MOA)，已经构建并测试了多种利用抗huCD137 VH结构域抗体的多特异性形式。在此，已经采用多种形式来产生基于CD137的T细胞接合物(TCE)，其中第一抗原结合结构域针对肿瘤相关抗原(TAA)，而第二抗原结合结构域靶向CD137活化受体。例如，抗CEA抗体BGA-113的第一抗原结合结构域(SEQID NO:179和181)用于与抗huCD137VH结构域抗体BGA-4712的第二抗原结合结构域(SEQ IDNO:70)以如下所示的具体定义的形式配对(表20)。对于该构建体，使用惰性Fc(SEQ ID NO:175)。通过转染到293G细胞中并通过使用蛋白A柱(目录号17543802，通用生命科学公司)纯化来实现这些多特异性抗体的表达和制备。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-5mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
形式A(A-CD137/CEA)
形式A提供具有Fab×VH构型的对称IgG样多特异性分子。如图16A所示，抗huCD137VH结构域抗体BGA-4712与抗CEA抗体的Fc(CH3结构域)的c末端融合，在它们(SEQ ID NO:179和177)之间具有一个G4S接头(SEQ ID NO:324)。
形式B(B-CD137/CEA)
形式B也提供具有Fab×VH构型的对称IgG样多特异性分子。如图16B所示，抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712与抗CEA抗体的轻链(Cκ)的c末端融合，在它们(SEQ IDNO:181和183)之间具有一个G4S接头(SEQ ID NO:324)。
形式C(C-CD137/CEA)
形式C提供具有Fab×VH构型的对称VH抗体样多特异性分子。如图16C所示，抗CEA抗体的Fab区与抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712的VH的N末端融合，在它们(SEQ ID NO:179和185)之间具有一个G4S接头(SEQ ID NO:324)。
形式D(D-CD137/CEA)
形式D也提供具有Fab×VH构型的对称IgG样多特异性分子。如图16D所示，抗huCD137 VH结构域抗体BGA-4712与抗CEA抗体的重链(Vh)的N末端融合，在它们(SEQ IDNO:179和187)之间具有一个G4S接头(SEQ ID NO:324)。
各种CD137/CEA多特异性抗体的产率和生化特性总结在表21中。对于两种分子A-CD137/CEA和D-CD137/CEA，基于SEC-HPLC谱，单体都高于95％(表21)。通过基于流式细胞术的测定，证明了在形式A中抗CEA臂的亲和力降低非常小，而在形式D中抗CEA臂的亲和力显著降低(图17A)。还证明了在形式A中CD137臂的亲和力降低，而在形式D中对亲和力的影响很小或没有影响(图17D)。
表20：多种形式的CEAxCD137多特异性抗体的氨基酸和DNA序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
表21：产率和生化特性的总结
实例20.基于CD137的多特异性抗体A-CEAxCD137以CEA依赖性方式活化CD137
基于CD137的多特异性抗体在CD137表达细胞中诱导CD137活化
为了测试基于CD137的多特异性抗体诱导CD137+细胞对CEA+肿瘤细胞刺激的反应的能力，使用Hut78/huCD137测试CD137活化。根据先前描述的方案(Zhang等人,2005同上)，通过逆转录病毒转导到CT26(ATCC CRL-2638)中产生CEA表达CT26(CT26/CEA)细胞。在OKT3预包被的96孔板中，在CEAxCD137多特异性构建体的存在下，将Hut78/huCD137细胞与CT26/CEA或CT26(CEA阴性)细胞共培养过夜，并测量白介素-2(IL-2)作为Hut78/huCD137细胞中CD137活化的指示剂。如图18A所示，在CEA+CT26/CEA细胞存在下，A-CEAxCD137以剂量依赖性方式诱导Hut78/huCD137细胞分泌IL-2。在没有CEA+CT26/CEA细胞的情况下没有观察到IL-2的诱导。
基于CD137的多特异性抗体在人外周血单核细胞(PBMC)中诱导CD137活化
通过Ficoll(Histopaque-1077，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma-St.Louis MO))分离法从健康供体的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)。根据先前描述的方案(Zhang等人,2005同上)，通过逆转录病毒转导到HEK293(ATCC CRL-1573)中产生OS8表达HEK293(HEK293/OS8)细胞。为了确定CD137/CEA多特异性抗体是否可以在CEA+肿瘤细胞存在下活化T细胞，将PBMC(2×105个/孔)与HEK293/OS8和CT26/CEA细胞在CD137/CEA多特异性抗体存在下共培养48小时。通过测量PBMC中的IFN-γ来确定CD137/CEA多特异性抗体对CD137的活化。结果表明，在CEA表达细胞存在下，A-CD137/CEA可以在PBMC中诱导显著的CD137活化(图18B)。
实例21.工程化和亲和力成熟
工程化
对所选择的克隆BGA-4712进行了工程化，以改善生物化学和生物物理特性。考虑因素包括氨基酸组成、热稳定性(Tm)、表面疏水性、翻译后修饰(PTM)位点和等电点(pI)的去除，同时保持功能活性。取代主要在基于BGA-4712序列的HCDR和框架区中进行。取代包括氨基酸改变F28R、M29T、V35M、V37F或Y、G44E、L45R或G或Y，以及W47G或S或F或L或R或Y、D62E、S75A、N84S、W103R(Kabat定义)。如前所述，变体以Fc融合VH和A-CD137/CEA多特异性抗体形式表达。鉴定了没有显著亲和力降低的取代(表22)。进行了突变的组合。BGA-4712-M3和BGA-7556的序列披露于表23和表24中。
亲和力成熟
为了进一步探索潜在有效的基于CD137的作用机制(MOA)，我们旨在通过噬菌体展示产生具有改善的药物开发性的亲和力成熟的BGA-4712-M3变体。文库构建如前所述。简言之，通过标准分子生物学技术使用噬菌粒载体pCANTAB 5E(通用电气医疗集团)构建噬菌粒，该噬菌粒被设计成在M13噬菌体的表面上展示CH3-G4S(接头)-BGA-4712-M3(表25)作为与基因-3次要外壳蛋白片段的N末端的融合体。使用标准方案通过噬菌体展示进行亲和力成熟的BGA-4712变体的产生(Silacci等人,(2005)Proteomics[蛋白质组学],5,2340-50；Zhao等人,(2014)PLoS One[公共科学图书馆：综合],9,e111339)。使用噬菌粒作为模板来构建含有2.0×108个独特成员的噬菌体展示文库。所有三个CDR随机化，但每个CDR在每个克隆中具有最多一个突变，HCDR3除外，其可具有两个同时突变。每个位置用编码任何氨基酸的NNK密码子(IUPAC编码)或琥珀终止密码子随机化。
在四轮选择之后，每个HCDR中的突变频率相对较高。图19示出了四轮选择后HCDR区的序列。所有突变都被引入BGA-7556(SEQ ID NO:86)中以产生亲和力成熟的变体，BGA-3386除外，其突变被引入BGA-4712-M3(SEQ ID NO:75)中。所有变体均以单克隆抗体(VH-Fc)和它们相应的多特异性抗体形式A(A-CEAxCD137)表达。将纯化的抗体在PBS中浓缩至0.5-10mg/mL并以等分试样储存在-80℃冰箱中。
通过使用BIAcoreTMT-200(通用生命科学公司)的SPR测定和所述流式细胞术进行CD137亲和力成熟变体的亲和力比较。序列信息显示在表28中，抗huCD137抗体的SPR测定的结合概况的结果总结在表26和表27中。
表22：CD137结合亲和力的比较
表23：BGA-4712-M3的序列信息
/>
/>
/>
/>
表24：Fc融合VH和A-CEAxCD137多特异性抗体形式中BGA-7556的序列信息
/>
/>
/>
/>
/>
表25：序列信息
/>
/>
表26：亲和力成熟的BGA-4712变体作为Fc融合抗体的亲和力比较
表27：亲和力成熟的BGA-4712变体的亲和力比较
/>
表28：亲和力成熟的BGA-4712变体的序列信息
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实例22.抗CD137抗体BGA-5623的结合概况
BGA-5623由人IgG1 Fc融合体产生，并通过使用BIAcoreTMT-200(通用生命科学公司)的SPR测定表征其结合动力学。简言之，将抗人IgG(Fc)抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号：BR100839，通用生命科学公司)上。抗huCD137结构域抗体流过芯片表面并被抗人IgG(Fc)抗体捕获。然后使人CD137ECD-mIgG2a或cyno CD137 ECD-mIgG2a的连续稀释液(6.0nM至2150nM)流过芯片表面，并通过使用一对一Langmuir结合模型(BIA评估软件，通用生命科学公司)分析表面等离子共振信号的变化以计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。结果表明，BGA-5623对cynoCD137的亲和力高于对huCD137的亲和力，如下表29所示。为了评估抗huCD137 VH结构域抗体与活细胞上的天然huCD137的结合活性，转染Hut78细胞以过表达人CD137。将表达Hut78/huCD137的活细胞接种在96孔板中，并与连续稀释的抗huCD137 VH结构域抗体一起孵育。将山羊抗人IgG用作二抗来检测抗体与细胞表面的结合。与人天然CD137的剂量依赖性结合的EC50值通过用GraphPad PrismTM将剂量反应数据与四参数逻辑模型拟合来确定。如图20所示，BGA-5623以剂量反应方式与活细胞上的天然CD137特异性结合，EC50为2.97μg/ml。
通过ELISA评估BGA-5623的脱靶特异性。TNF受体家族成员诸如TNFRSF1A(CD120a)(目录号10872-H08H，中国的义翘神州公司)、TNFRSF1B(CD120b)(目录号10417-H08H1，中国的义翘神州公司)、TNFRSF4(OX40)(SEQ ID NO:167)、TNFRSF5(CD40)(SEQ ID NO:161)、TNFRSF7(CD27)(目录号10039-H08B1，中国的义翘神州公司)、TNFRSF9(CD137)(SEQ ID NO:135)和TNFRSF18(GITR)(目录号13643-H08H，中国的义翘神州公司)以10μg/ml的浓度在4℃下包被在96孔板中过夜。添加了与野生型IgG1 Fc(SEQ ID NO:283)融合的BGA-5623。如图21所示，没有观察到与其他TNF受体家族成员的结合。
表29：通过SPR确定的亲和力
表30：氨基酸和DNA序列
/>
/>
实例23.丙氨酸扫描对BGA-5623的表位作图
为了表征BGA-5623的结合表位，基于来自先前报道的CD137的晶体结构的信息(Bitra等人,(2018)J Biol Chem[生物化学杂志],293,9958-9969；Chin等人,(2018)Nat.Commun.[自然通讯]9,4679)，将人CD137的17个氨基酸残基单独突变为丙氨酸以产生17个单突变huCD137变体。
CD137突变体与野生型CD137一起在HEK293细胞(ATCC CRL-1573)中瞬时表达。通过流式细胞术分析它们被BGA-5623识别和结合。通过使用公开可获得的乌瑞鲁单抗序列在内部产生的乌瑞鲁单抗类似物(SEQ ID NO:287-290)用于同一测定以监测CD137突变体的表达。在该测定中，将人CD137或人CD137突变体表达细胞(105个细胞/孔)与2μg/ml纯化的BGA-5623-mutFc(Fc融合VH Ab)或乌托鲁单抗类似物一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号：409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。所有结果用野生型CD137结合信号的荧光读数平均值作为标准进行标准化。为了简化数据分析，如果特异性突变型CD137的抗体的FACS结合信号下降到或低于25％，则该位点的氨基酸被认为对于表位是关键的。如图22A所示，BGA-5623的表位在CD137的氨基酸F36、I44、P47、P49和S52处具有重要的结合残基。
为了进一步研究BGA-5623表位，表达并纯化具有单AA取代的人CD137 ECD突变体以准备用于ELISA。此外，通过使用可公开获得的乌托鲁单抗序列在内部产生乌托鲁单抗类似物抗体(SEQ ID NO:291-294)。通过直接ELISA，通过BGA-5623分析CD137突变体和野生型CD137的结合。简言之，将各50ng野生型或突变型CD137包被在ELISA板中。阻断后，向板中加入100μl浓度为2μg/ml的BGA-5623-mutFc、乌瑞鲁单抗类似物或乌托鲁单抗类似物抗体，并通过HRP-连接的二抗检测各抗体的结合信号。在使用野生型或突变型huCD137的ELISA结合测定中，氨基酸F36A、P47A和P49A显著削弱CD137与BGA-5623的结合(图22A至图22B)。在氨基酸F36A处的改变仅轻微降低了乌瑞鲁单抗或乌托鲁单抗类似物的结合，这表明F36A在CD137的构象完整性中起关键作用。相比之下，在氨基酸P47A或P49A处的改变均不破坏乌瑞鲁单抗或乌托鲁单抗类似物与CD137的结合，这表明BGA-5623、乌瑞鲁单抗类似物或乌托鲁单抗具有不同的表位。该数据表明，氨基酸F36A、P47A和P49A是抗体BGA-5623的表位中的关键残基。
表31：氨基酸和DNA序列
/>
/>
/>
/>
/>
实例24.配体竞争
人CD137结合其主要配体人CD137配体(CD137L)，亲和力较弱，Kd为约三位数M(Chin等人,(2018)Nat Commun[自然通讯]9,4679)。上述实例23中的表位作图结果显示CD137的氨基酸残基F36A、P47A和P49A是构成BGA-5623抗体的表位的一部分的关键氨基酸残基。此外，配体沿受体CRD-2的全长和CRD-3的A2基序结合CD137，并且受体与配体之间的界面主要由氢键和范德华相互作用介导(Bitra等人,(2018)J Biol Chem[生物化学杂志],293,9958-9969)。基于该数据，假设BGA-5623抗体可以阻断CD137/CD137配体相互作用。用人IgG4 Fc融合产生BGA-5623。对于CD137配体竞争ELISA，用人CD137 ECD-mIgG2a包被Maxisorp免疫板，并用3％BSA(w/v)的PBS缓冲液(阻断缓冲液)阻断。将VH结构域抗体BGA-5623用阻断缓冲液阻断30分钟，并在连续稀释的人CD137配体ECD-mIgG2a存在下添加到ELISA板的孔中1小时。用PBST洗涤后，使用HRP缀合的抗人IgG抗体(西格玛公司，A0170)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(目录号：00-4201-56，美国的伊生物技术公司)检测结合的抗体(图23A)。为了通过流式细胞术测定CD137配体竞争，在连续稀释的BGA-5623存在下，将CD137稳定转导的细胞系Hut78/huCD137与人CD137配体ECD-mIgG2a一起孵育，然后用山羊抗鼠IgG-APC检测(图23B)。如图23A-B所示，BGA-5623与CD137配体竞争并减少CD137/CD137配体相互作用。
实例25.结构性和功能性CD137表位作图
为了更好地理解抗CD137单结构域抗体臂如何能够高亲和力结合CD137，以及CD137/CD137L相互作用的强效激动剂，确定了与CD137复合的VH(BGA-5623)的晶体结构。
A.CD137和VH(BGA-5623)的表达、纯化和结晶
在HEK293G细胞中表达含有四个CRD(1-4；氨基酸24-162)的人CD137细胞外结构域，其携带有C121S、N138D和N149Q突变。将编码CD137的cDNA克隆到具有N末端分泌序列和C末端TEV切割位点随后是Fc标签的内部表达载体中。将含有分泌的CD137-Fc融合蛋白的培养上清液与Mab Select SureTM树脂(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare LifeSciences))在4℃下混合3小时。用含有20mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl的缓冲液洗涤蛋白质，然后用50mM乙酸(用5M NaOH将pH值调节至3.5)洗脱，最后用1/10CV 1.0M Tris-HCl pH 8.0中和。将洗脱的蛋白质与TEV蛋白酶(10:1摩尔比)混合，并在4℃下用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl)透析过夜。将混合物上样到Ni-NTA柱(凯杰公司(Qiagen))和Mab Select SureTM树脂上以除去TEV蛋白酶和Fc标签，然后使用HiLoad 16/600SuperdexTM75pg柱(GE医疗生命科学公司)在缓冲液(20mM Tris pH 8.0，100mM NaCl)中通过尺寸排阻色谱法进一步纯化流出物。
将编码VH(BGA-5623)的DNA序列克隆到具有N末端HIS-MBP标签随后是TEV蛋白酶位点的PET21a载体中。在OD600为0.6-1.0时，用1mM IPTG在18℃下诱导Shuffle T7中的蛋白质表达16h。通过以7,000g离心10分钟收获细胞。将细胞沉淀重新悬浮在裂解缓冲液(50mM Na3PO4 pH 7.0、300mM NaCl)中，并在冰上超声裂解。然后将裂解物在4℃下以48,000g离心30分钟。将上清液与Talon树脂混合并在4℃下分批处理3小时。用含有5mM咪唑的裂解缓冲液洗涤树脂，用含有另外100mM咪唑的裂解缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱液与TEV蛋白酶(10:1摩尔比)混合，并在4℃下用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl)透析过夜。将混合物上样到Talon柱上以除去TEV蛋白酶和HIS-MBP标签，然后使用HiLoad 16/600SuperdexTM75pg柱(GE医疗生命科学公司)在缓冲液(20mM Tris pH 8.0，100mM NaCl)中通过尺寸排阻色谱法进一步纯化流出物。
将纯化的CD137与过量的纯化的VH(BGA-5623)混合(1:1.5摩尔比)以产生CD137/VH(BGA-5623)复合物。然后使用HiLoad 16/600SuperdexTM75pg柱(GE医疗生命科学公司)在缓冲液(20mM Tris pH 8.0，100mM NaCl)中通过凝胶过滤进一步纯化复合物。CD137/VH(BGA-5623)复合物(10mg/ml)在0.6M Li2SO4、0.01M NiCl2、0.1M Tris pH 9.0中结晶。将用逐步5％D-(+)-蔗糖冷冻保护至最终20％浓度的晶体在液氮中快速冷冻。此外，将apoVH(BGA-5623)在1.2M(NH4)2SO4、0.1M柠檬酸pH 5.0中结晶。将晶体用7％甘油冷冻保护并在液氮中快速冷冻。在Spring-8同步加速器辐射设备(日本的兵库公司(Hyogo,Japan))的束线BL45XU处收集X射线衍射数据。
B.数据收集和结构解析
在Spring-8同步加速器辐射设备(日本的兵库公司)中配备ZOO(Hirata,K.等人,Acta Crystallogr D Struct Biol[晶体结构生物学学报],2019.75(Pt 2):138-150)自动数据收集系统的束线BL45XU处在100开尔文的低温冷却条件下收集X射线衍射数据。通过采用XDS(Kabsch W.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr[晶体生物学晶体学报],2010.66(Pt 2):125-32)的集成数据处理软件KAMO(Yamashita等人,Acta Crystallogr DStruct Biol[晶体结构生物学学报],2018.74(Pt 5):441-449)处理衍射图像。人CD137(PDB:6MGP)和VHH模型(PDB:4U3X)的结构用作检索模型。通过分子替换程序PHASER(McCoy等人,Phaser crystallographic software[Phaser结晶学软件].J Appl Crystallogr[应用结晶学杂志],2007.40(Pt 4):658-674)找到初始解。然后使用程序COOT(Emsley等人,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr[晶体生物学晶体学报],2004.60(Pt 12Pt 1):2126-32)手动迭代构建该模型并使用PHENIX(Adams等人,Acta Crystallogr D BiolCrystallogr[晶体生物学晶体学报],2010.66(Pt 2):213-21)进行细化。将最终模型细化为可接受的R和R自由值以及拉氏构象图(Ramachandran)统计(通过Molprobity计算)。数据处理和细化统计可以在表32中找到。
C.结合人CD137的VH(BGA-5623)的结构
与CD137复合的VH(BGA-5623)在I41空间群中结晶，一个复合物在不对称单元中，并衍射到结合人CD137的VH(BGA-5623)的结构显示VH(BGA-5623)与CD137L结合部分地空间连接(图24)。VH(BGA-5623)与CD137之间的埋入表面积为大约/>VH(BGA-5623)相互作用聚集在CD137CRD2结构域周围。这些相互作用主要由VH(BGA-5623)CDR2和CDR3介导，并与CD137更广泛地接触。VH(BGA-5623)CDR1不直接接触CD137，而CDR3在CD137结合时经历从非结构化环到β折叠的显著构象变化(图25)。VH(BGA-5623)CDR2 Leu52、Tyr58接触CD137残基Pro50、Asn51。VH(BGA-5623)CDR3残基Gly100A、Gly100B、Val100C、Thr100D、Phe100E接触CD137残基Phe36、Pro47、Pro49、Arg60、Cys62、Ile64。此外，FR2Leu45和Trp47接触CD137残基Pro47、Cys48、Pro49、Pro50，这些残基对CD137结合有显著贡献。VH(BGA-5623)使用氢键和疏水相互作用的组合与CD137相互作用。例如，FR2 Trp47与CD137残基Pro47、Cys48、Pro49和Pro50形成强疏水接触。CDR3残基Phe100E与CD137残基Phe36和Pro47形成疏水相互作用。FR2残基Trp47和CDR3残基Gly100A分别与CD137残基Pro47和Ile64形成一个氢键。CDR3残基Val100C与CD137残基Cys62形成两个氢键(图26)。
基于VH(BGA-5623)/CD137复合物的晶体结构，确定了与VH(BGA-5623)接触的CD137的残基(即，与VH结合的CD137的表位残基)和与CD137接触的VH(BGA-5623)的残基(即，与CD137接触的VH的互补位残基)。下表33示出了它们接触的CD137和VH(BGA-5623)的残基，如使用的接触距离严格性所评估的，其是范德华(非极性)相互作用力最高的点。这种晶体结构分析与先前的丙氨酸扫描分析一致，据发现，最影响BGA-5623结合的许多CD137残基与结构中的BGA-5623相互作用。
表32：数据收集和细化统计
/>
a括号中的值是最高分辨率壳层的值。
b根据细化期间留出的约5％的反射而计算
c r.m.s.d.，均方根偏差
表33：CD137的表位残基及其相应的VH(BGA-5623)的互补位残基
CD137 VH(BGA-5623)
Phe 36 Thr 100D
Phe 100E
Pro 47 Leu 45
Trp 47
Phe 100E
Cys 48 Trp 47
Pro 49 Trp 47
Val 100C
Thr 100D
Pro 50 Trp 47
Tyr 58
Asn 51 Leu 52
Arg 60 Thr 100D
Cys 62 Gly 100B
Val 100C
Ile 64 Gly 100A
VH(BGA-5623)残基按照Kabat命名法编号。
实例27.可能影响体外CD137活化的参数
已经证明，除了亲和力、受体密度和CD137中的表位位置以及分子形式之外，还有其他关键参数，诸如模块比率、模块取向、接头长度和Fc功能，其可以显著影响细胞因子释放(IL-2和IFN-γ)。因此，为了合理设计基于CD137的多特异性抗体，我们采用系统方法来探究这些参数如何影响CD137激动作用。这些多特异性抗体的表达和制备如所述进行。
首先，我们构建了具有不同模块比率诸如2:4、1:1和1:2的CEA/CD137多特异性抗体变体，即BE-718(A-BGA-5623-BGA-5623)(SEQ ID NO:295和179)、BE-942(ZW 1+1)(SEQID NO:299,301和303)(其为1+1构型的BGA-5623)和BE-755(ZW1+2)(SEQ ID NO:299、301和305)(其为1+2构型的BGA-5623)(图27)。对于具有“ZW”名称的抗体构建体，惰性Fc用于这些多特异性抗体，并使用Zymeworks的AzymetricTM平台组装Fab×VH构型，其中ZW1突变(链A：T350V/L351Y/F405A/Y407V；链B：T350V/T366L/K392L/T394W)被引入重链的CH3结构域中以允许有效的异二聚体形成(Von Kreudenstein等人,(2013)Mabs[单克隆抗体]5(5):646-54)。对于代表模块比率为2:2的多特异性抗体的BE-189(A-BGA-5623)(SEQ ID NO:255和179)，我们能够研究模块比率如何影响细胞因子释放。如上文实例20中所述，将高CEA表达细胞系CT26/CEA与PBMC(2×105个/孔)和HEK293/OS8细胞(其可触发T细胞活化的第一信号)一起用于体外CD137活化测定。如表34和图28所示，模块比率为2:2的多特异性抗体被证明是有效的CD137激动剂，没有CD137内在活化，这表明BE-189(形式A-BGA-5623)以CEA依赖性方式活化CD137。相比之下，模块比率为2:4的多特异性抗体BE-718(A-BGA-5623-BGA-5623)显示即使在不存在CEA表达细胞的情况下也活化CD137。
接着，我们研究了模块取向和Fc功能如何影响CD137活化。在本实验中，我们构建了BE-740(A-IgG1-BGA-5623)(SEQ ID NO:297和179)，其与A-BGA-5623(BE-189)完全相同，只是用野生型IgG1 Fc替代惰性Fc。我们还分别构建了BE-562(E-muFc-BGA-5623)(SEQ IDNO:307和179)和BE-375(E-IgG1-BGA-5623)(SEQ ID NO:309和179)。如图29所示，这两种多特异性抗体与A-BGA-5623和A-IgG1-BGA-5623共享同一对抗CEA抗体和抗huCD137 VH结构域(CEA和BGA-5623)，但是方向相反。如实例20所述，使用基于PBMC的细胞因子释放测定来定量CD137活化的效力。基于体外结果，证明A-BGA-5623和A-IgG1-BGA-5623在CD137活化方面比E-muFc-BGA-5623和E-IgG1-BGA-5623更有效。此外，根据该实验，Fc功能似乎对CD137活化的影响极小(图30)。
然后，评估了连接Fc和VH结构域抗体的接头对CD137活化的影响。A-(G4S)3-BGA-5623(BE-244)(SEQ ID NO:311和179)通过用(G4S)3(SEQ ID NO:329)的15AA接头取代G4S而产生。同样，使用基于PBMC的细胞因子释放测定来比较效力。如图31和表34所示，接头长度对CD137活化的影响极小。
最后，选择了具有不同亲和力的两种BGA-4712变体(BGA-6468和BGA-9442)用于效力比较。SPR研究和FACS分析示出在表35中。对于流式细胞术，将人CD137+或人CEA+表达细胞(105个细胞/孔)与各种浓度的纯化的VH结构域抗体一起孵育，随后与Alexa Fluro-647标记的抗hu IgG Fc抗体(目录号：409320，美国的百进生化技术公司)结合。使用流式细胞仪(Guava easyCyteTM8HT，美国的默克密理博公司(Merck-Millipore,USA))定量细胞荧光。两种测试的多特异性抗体之间的CEA结合没有显著差异，而如预期的，通过流式细胞术观察到针对人CD137的不同结合亲和力。接下来，应用如上文实例20中所述的基于PBMC的细胞因子释放测定来评估这些具有不同亲和力的BGA-4712变体在多特异性抗体形式A-CD137/CEA中的效力。如表35所示，由这些变体诱导的CD137活化与CD137臂亲和力增加成正比。
表34.体外CD137活化的关键参数
表35.具有不同亲和力的多特异性抗体形式A-CD137xCEA中BGA-4712变体的比较
表36：CD137xCEA多特异性抗体的氨基酸和DNA序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实例28.单剂CEAxCD137多特异性抗体的体内功效
为了确定CEAxCD137多特异性抗体BE-189和BE-740针对CEA+肿瘤细胞的体内功效，将CT26/CEA细胞(1×106)皮下注射到BALB/c背景的人源化CD137小鼠中。从肿瘤注射当天开始，每周两次给予BE-189(3mg/kg)、BE-740(3mg/kg)、抗CEA Ab(SEQ ID NO:181和179)(3mg/kg)、乌瑞鲁单抗类似物(3mg/kg)或媒介物对照(每组6只小鼠)。与媒介物对照相比，BE-189(A-BGA-5623)和乌瑞鲁单抗类似物诱导肿瘤生长的显著抑制(P<0.001)，如图32所示。
实例29.CEAxCD137激动剂
激动性抗huCD137抗体已经在临床环境中显示出毒性，这可能表明全身性FcγR交联对于CD137活化并不理想。目的是在肿瘤部位特异性地实现有效的CD137刺激，而无需对广泛的癌症进行全身性CD137活化。为了克服FcγR交联的依赖性，我们产生了具有以下特征的CEAxCD137多特异性抗体，如图33所示。该特异性构建体包括模块比率为2:2的IgG融合样多特异性抗体形式、结合CEA的二价F(ab')2片段、在CH3的C末端融合的VH结构域片段(其结合huCD137)，以及huIgG1的Fc无效形式(其不具有FcγR结合但保留FcRn结合)。序列信息在表37中示出。
表37：CEAxCD137的氨基酸和DNA序列
/>
/>
实例30.CEAxCD137的靶结合活性
结合重组CD137和CEA
ELISA结果显示BE-146以一致的结合活性与抗原CEA(CEA/His)和CD137(huCD137-mIgG2a)结合，而2个阴性对照人IgG和DS(药物物质)缓冲液没有可检测到的与CEA和CD137的结合(图34)。
使用表面等离子体共振(SPR)测量BE146的结合动力学。我们使用SPR测量CD137和CEA的重组蛋白的抗体的解离速率常数(ka)和缔合速率常数(kd)，然后确定亲和力常数(KD)。结果显示BE-146对人CD137和人CEA具有相当的结合亲和力。
人CD137蛋白与鼠CD137的序列同源性较低，只有61.0％的序列同一性。相比之下，CD137与食蟹猴CD137高度同源，具有95％的序列同一性。为了测试BE-146结合功能的物种特异性，使用人、食蟹猴和小鼠CD137作为结合蛋白进行SPR结合研究。BE-146显示对人CD137的高结合亲和力，KD为约36.2nM。相比之下，BE-146与食蟹猴CD137的结合亲和力具有约15.9nM的相似KD。如表38所示，在SPR测定中，BE-146没有可检测到的与小鼠CD137的结合信号传导。
在人与食蟹猴物种之间的结合亲和力测试表明BE-146对人CEA(KD：约3.00nM)和猴CEA(目录号：CE5-C52H5，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)(KD：约11.4nM)表现出相似的结合亲和力。该数据在下表39中示出。人和猴CEA的序列比对表明这两个物种之间有79.2％的同源性。
结合天然CD137和CEA
FACS结果进一步证实了BE-146与HuT78/CD137细胞表面上表达的CD137的结合活性。BE-146以剂量反应方式显示出与CD137的强结合活性，EC50为2.257μg/mL(12.90nM)；而阴性对照人抗体(hIgG)没有预期地结合HuT78/CD137和CT26 OS8-CEA(图35和图37)。类似地，BE-146以剂量反应方式显示出与CEA的强结合活性，EC50为1.532μg/mL(8.75nM)；而阴性对照人抗体(hIgG)没有预期地结合HuT78/CD137和CT26-OS8-CEA(图35和图36)。
表38：SPR确定的动力学参数与不同种类CD137的比较分析
缩写：KD，亲和力常数；Koff，解离速率常数；Kon，缔合速率常数；ND，无法确定；SPR，表面等离子体共振。
KD值由动力学常数的比率计算为KD＝Koff/Kon。
KD值由平衡时一半配体被占据时的分析物浓度确定。
ND：亲和力对于测定而言太弱。
表39：SPR确定的动力学参数与不同种类CEA的比较分析
缩写：CEA，癌胚抗原；KD，亲和力常数；Koff，解离速率常数；Kon，缔合速率常数；ND，无法确定；SPR，表面等离子体共振。
KD值由动力学常数的比率计算为KD＝Koff/Kon。
KD值由平衡时一半配体被占据时的分析物浓度确定。
实例31.CEAxCD137以CEA依赖性方式诱导T细胞活化
在不同的体外实验中评估了CEAxCD137多特异性抗体BE-146的功能性。我们首先使用来自健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)用提供信号的CEAxCD137和HEK293/OS8活化人T细胞。通过Ficoll(Histopaque-1077，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma-St.Louis MO))分离法从健康供体的全血中分离PBMC。为了确定在CEA+肿瘤细胞存在下CEAxCD137是否可以诱导从人PBMC释放细胞因子，将PBMC(1×105个/孔)与CEA+MKN45细胞(2×105个/孔)和HEK293/OS8(1×105个/孔)细胞在96孔v型底板中共培养2天(图38A)。通过ELISA确定来自PBMC的IL-2和IFN-γ释放。结果显示CEAxCD137可以诱导显著的细胞因子释放(图38B至图38C)。测试了来自2个供体的PBMC。结果以两次重复的平均值±SD表示。
我们接下来研究了CEAxCD137是否可以增强抗原特异性CD8+T细胞功能。通过Ficoll(Histopaque-1077，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma-St.Louis MO))分离法从健康供体的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)。使用人全T细胞分离试剂盒(美天旎公司(Miltenyi)，目录号130-096-535)分离T细胞。为了确定在CEA+肿瘤细胞存在下BE-146是否可以诱导从人T细胞释放细胞因子，将T细胞(1×105个/孔)与CEA+MKN45细胞(2×105个/孔)和HEK293/OS8(1×105个/孔)细胞在96孔v型底板中共培养2天。通过ELISA确定T细胞的IL-2和IFN-γ释放。结果显示多特异性抗体BE-146可诱导显著的IL-2(图39A)和IFN-γ(图39B)释放。
然后我们研究了CEAxCD137是否可以诱导CEA依赖性反应。通过Ficoll(Histopaque-1077，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma-St.Louis MO))分离法从健康供体的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)。为了确定CEAxCD137诱导的从人PBMC的细胞因子释放是否是CEA依赖性的，将PBMC(1×105个/孔)与HEK293或过表达CEA的HEK293细胞(HEK293/CEA)(1×105个/孔)(作为靶细胞)和HEK293/OS8(1×105个/孔)细胞在96孔v型底板中共培养2天。通过ELISA确定来自PBMC的IL-2和IFN-γ释放。结果显示多特异性抗体BE-146可诱导来自PBMC的显著的IL-2和IFN-γ释放，针对过表达CEA的HEK293细胞，但不针对没有CEA转导的HEK293细胞(图40A-B)。
此外，进行了一系列实验以确定来自CEAxCD137构建体的诱导反应是否可以被可溶性CEA阻断。通过Ficoll(Histopaque-1077，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma-St.Louis MO))分离法从健康供体的全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)。为了确定BE-146诱导的从人PBMC释放的细胞因子是否可以被可溶性CEA阻断，在不同浓度的重组可溶性CEA存在下，将PBMC(1×105个/孔)与MKN45(1×105个/孔)和HEK293/OS8(1×105个/孔)细胞在96孔v型底板中共培养2天。通过ELISA确定来自PBMC的IL-2和IFN-γ释放。结果显示多特异性抗体BE-146诱导来自PBMC的IL-2(图41A)和IFN-γ(图41B)释放，并且该释放未被50ng/ml或500ng/ml可溶性CEA显著阻断。仅极高浓度的CEA(5000ng/ml)导致减少。
这些数据表明，在(CD3ε或T细胞受体刺激)存在下，CEA x CD137诱导强烈的CEA依赖性T细胞活化。
实例32.BE-146增强T细胞活化
开发了一种基于细胞的生物发光测定法并用于测量靶向并刺激诱导型共刺激受体CD137并增强T细胞活化的BE-146的活性。
两种遗传修饰的细胞系JK-NFKB-CD137和CT26-OS8-CEA在该测定中分别用作效应细胞和靶细胞。JK-NFKB-CD137由Jurkat细胞系克隆E6-1(ATCC，TIB-152)通过稳定转染人CD137基因载体和具有NF-kB应答元件的萤光素酶构建体而开发，该NF-kB应答元件可应答T细胞受体(TCR)活化和CD137共刺激。通过异位表达人CEA和T细胞接合物OS8(抗-CD3抗体的膜结合形式)从CT26WT细胞产生CT26-OS8-CEA细胞系。当共培养两种细胞系时，双特异性抗体BE-146的添加将与在效应细胞上表达的CD137和在靶细胞上表达的CEA相互作用，并以剂量依赖性方式启动CEA依赖性CD137共刺激和荧光素酶基因启动子的活化。将JK-NFKB-CD137(5×104个细胞/孔)和CT26-OS8-CEA(1×104个细胞/孔)在连续稀释的BE-146存在下共培养5-6小时。作为阴性对照，使用人IgG(hIgG)和不含抗体的缓冲液。
BE-146以剂量反应方式显示出激动功能活性。该实验一式两份进行，BE-146的EC50为0.51μg/mL(2.91nM)和0.56μg/mL(3.20nM)，如图42所示。缓冲液和人IgG对照没有活性。
实例33.BE-146以CEA依赖性方式增强来自人PBMC的IFN-γ和IL-2产生
Hek293/OS8低细胞系通过用T细胞接合物OS8(抗CD3抗体的膜结合形式)进行逆转录病毒转导来产生，以提供抗CD3刺激以用于初始T细胞活化。在BE-146或乌瑞鲁单抗(作为参考抗体)或人IgG1(作为阴性对照)的存在下，将来自健康供体和Hek293/OS8低的PBMC与具有CEA高表达的靶细胞MKN45或仅表达少量CEA的NCI-N87共培养。在连续稀释的BE-146、乌瑞鲁单抗或huIgG1存在下，将PBMC(3×104个细胞/孔)与Hek293/OS8低(1×104个细胞/孔)和MKN45(2×104个细胞/孔)共培养48小时。在连续稀释的BE-146、乌瑞鲁单抗或huIgG1存在下，将PBMC(3×104个细胞/孔)与Hek293/OS8低(1×104个细胞/孔)和NCI-N87(2×104个细胞/孔)共培养48小时。通过ELISA测量IFN-γ和IL-2释放。
当靶细胞为MKN45(CEA高)时，BE-146促进来自两个供体的PBMC以剂量依赖性方式分泌IFN-γ和IL-2(图43A)。然而，当NCI-N87(CEA低)细胞用作靶细胞时，BE-146不诱导细胞因子释放(图43B)。
实例34.BE-146增强人PBMC对MKN45细胞的细胞毒性
在BE-146存在下，将来自健康供体的PBMC与作为靶细胞的MKN45共培养。使用乌瑞鲁单抗作为参考抗体，而人IgG1用作阴性对照。将苏力图单抗(Solitomab)(一种EpCam/CD3双特异性T细胞接合物(BiTE)构建体(Ferrari等人,J Exp Clin Cancer Res[实验与临床癌症研究杂志]2015；34:123))以10pg/mL的浓度添加到共培养系统中以便为初始T细胞活化提供抗CD3刺激。将MKN45(1×104个细胞/孔)细胞预培养24小时以使细胞粘附到板上，然后在BE-146或乌瑞鲁单抗存在下与PBMC(1×105个细胞/孔)共培养。将苏力图单抗(10pg/mL)添加到共培养系统中以提供初始刺激。
使用实时细胞分析(RTCA)系统(Hamidi、Lilja和Ivaska Bio Protoc[生物方案]2017；7(24):e2646)，通过监测MKN45与底层细胞外基质的粘附变化来测量对MKN45细胞的杀伤。BE-146诱导对MKN45肿瘤细胞的剂量依赖性杀伤。来自2个供体的BE-146的平均EC50在与乌瑞鲁单抗相当的水平下为0.5452nM(EC50＝0.258nM)(图44)。
实例35.与抗PD-1抗体替雷利珠单抗组合的CEAxCD137抗体进一步促进免疫细胞活化
共刺激受体CD137可诱导T细胞活化细胞内信号，但这些信号可通过免疫检查点连接诸如PD-1/PD-L1来抑制。因此，PD-1抗体替雷利珠单抗(BGB-A317)与BE-146的组合可提高功效。为了确定与单一疗法相比，BE-146与抗PD-1抗体替雷利珠单抗组合是否可增强免疫细胞活化，将人PBMC与CEA和PD-L1表达靶细胞共培养，并将IFN-γ释放确定为功能读数。将PBMC用作效应细胞。将被工程化以表达PD-L1和T细胞接合物OS8的Hek293/OS8-PDL1细胞与作为靶细胞的MKN45(CEA高)混合。IFN-γ分泌被确定为T细胞活化的标志物。
将PBMC用40ng/mL OKT3预刺激2天。在连续稀释的BE-146和替雷利珠单抗(1000ng/mL)存在下，将刺激的PBMC(3×104个细胞/孔)与Hek293/OS8-PDL1(1×104细胞/孔)和MKN45(2×104个细胞/孔)共培养48小时。通过ELISA测量IFN-γ释放作为读数。
当PBMC与Hek293/OS8-PD-L1细胞和MKN45(CEA高)细胞共培养时，BE-146和替雷利珠单抗的组合施用显示出对人T细胞活化的累积作用。BE-146和替雷利珠单抗的组合相对于单独的BE-146或替雷利珠单抗显著增强了IFN-γ产生，如图45所示。
替雷利珠单抗(BGB-A317)披露于美国专利号8,735,553，并且VH/VL序列在下表40中示出。
表40：替雷利珠单抗序列表
/>
实例36.效应子受体结合和效应子功能
BE-146使用工程化的人IgG1 Fc部分，它降低了与效应子功能受体的结合活性。ELISA测定表明，当BE-146与人IgG(huIgG)比较时，BE-146与FcγRI、FcγRIIAH131、FcγRIIAR131、FcγRIIB、FcγRIIIAV158、FcγRIIIAF158、FcγRIIIB和C1q的结合活性降低。由于FcγRs和C1q是介导免疫复合物诱导的效应子功能的关键受体，BE-146具有不可检测到的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
通过ELISA评估FcγR结合活性。BE-146对FcγRI、FcγRIIAH131、FcγRIIAR131、FcγRIIB、FcγRIIIAV158、FcγRIIIAF158、FcγRIIIB没有表现出任何显著的结合活性，其与阴性对照相当。相比之下，阳性对照人IgG在测定中对任何FcγRs产生强结合信号(图46A-B)。
实例37.CEAxCD137抗体减少体内肿瘤
BE-146的体内功效在人源化CD137敲入小鼠的MC38/hCEA小鼠结肠腺癌模型中检查。将MC38/hCEA细胞植入雌性人源化CD137敲入小鼠体内。在细胞接种后第5天，根据肿瘤体积将小鼠随机分成4组。腹膜内施用BE-146(0.1、0.5和3.0mg/kg，每周一次)有效抑制肿瘤生长，第17天的TGI率分别为70％、61％和92％(图47)。此外，在研究终点(第21天)，0.1、0.5和3.0mg/kg组的无肿瘤比率分别为20％、30％和90％。无肿瘤动物的百分比随剂量从0.1mg/kg增加至3.0mg/kg。在第一次给药后表征BE-146在3个剂量水平(0.1、0.5和3.0mg/kg)下的药代动力学(PK)曲线。BE-146的药物暴露(AUC0-168h和Cmax)成比例地增加(表41)。在整个研究中，任何治疗组对动物体重都没有显著影响。
表41：BE-146在人源化CD137敲入小鼠MC38/hCEA同源肿瘤模型中的功效和PK参数
缩写：AUC0-168h，0至168小时的血清浓度-时间曲线下面积；Cmax，最高浓度；hCEA，癌胚抗原；n，动物数量；NA，不适用；PK，药代动力学；QW，每周一次；SEM，平均值的标准差；TGI，肿瘤生长抑制。
注：根据下式计算TGI率：％TGI＝[1-(治疗的Tt-治疗的T0)/(媒介物Tt-媒介物T0)]×100％。该表示出了第17天的TGI。治疗的Tt＝第t天给药组的平均肿瘤体积；治疗的T0＝第0天给药组的平均肿瘤体积；媒介物Tt＝第t天媒介物组的平均肿瘤体积；并且媒介物T0＝第0天媒介物组的平均肿瘤体积。
实例38.抗PD-1抗体与CEA x CD137的组合疗法增加肿瘤消退
在人源化CD137敲入小鼠的CT26/hCEA同源模型中研究了BE-146和抗小鼠PD-1抗体的组合的抗肿瘤活性。将CT26/hCEA细胞植入雌性人源化CD137敲入小鼠体内。在细胞接种后第7天，根据肿瘤体积将小鼠随机分成4组。接受BE-146(1.0mg/kg，每周一次)和抗小鼠PD-1抗体Ch15mt(0.3mg/kg，每周一次)的组合治疗的小鼠表现出协同的肿瘤生长抑制。第14天的肿瘤生长抑制率为70％，其显著高于单独用BE-146(-24％)或Ch15mt(41％)治疗的组。与媒介物对照或单剂治疗相比，BE-146和抗PD-1的组合诱导显著增加的抗肿瘤作用，总结于表42中并示出于图48中。
表42：BE-146和Ch15mt在人源化CD137敲入小鼠CT26/hCEA同源模型中的抗肿瘤作用
缩写：hCEA，人癌胚抗原；n，动物数量；NA，不适用；QW，每周一次；SEM，平均值的标准差；TGI，肿瘤生长抑制。
实例39.BE-146和抗PD-1抗体的组合在人源化CD137敲入小鼠B16-F10/hCEA模型中的功效
在人源化CD137敲入小鼠的B16-F10/hCEA同源模型中研究了BE-146和抗小鼠PD-1抗体的组合的抗肿瘤活性。B16-F10是鼠黑素瘤细胞系。接受BE-146(3.0mg/kg，每周一次)和抗小鼠PD-1抗体Ch15mt(3.0mg/kg，每周一次)的组合治疗的小鼠具有显著的肿瘤生长抑制(TGI)。在组合抗体治疗的第12天，TGI为78％，如图49和表43所示。此外，BE-146和Ch15mt的组合治疗显著提高动物的存活率。研究终点的存活率为75％，高于单独使用BE-146(25％)或单独使用Ch15mt(25％)的单一疗法组(图50和表43)。整个研究期间，对任何治疗组动物的体重都无显著影响。
表43：BE-146和Ch15mt在人源化CD137敲入小鼠B16-F10/hCEA同源模型中的抗肿瘤作用
缩写：n，动物数量；NA，不适用；QW，每周一次；SEM，平均值的标准差；TGI，肿瘤生长抑制。
注：根据下式计算TGI率：％TGI＝[1-(治疗的Tt-治疗的T0)/(媒介物Tt-媒介物T0)]×100％。该表示出了第12天的TGI。治疗的Tt＝第t天给药组的平均肿瘤体积；治疗的T0＝第0天给药组的平均肿瘤体积；媒介物Tt＝第t天媒介物组的平均肿瘤体积；并且媒介物T0＝第0天媒介物组的平均肿瘤体积。
实例40.BE-146给药
在每个21天周期的第1天、第8天和第15天，将通过静脉内输注施用单独的BE-146或与替雷利珠单抗(BGB-A317)的组合的固定剂量。作为单一疗法测试的BE-146的计划剂量水平为5mg、15mg、50mg、150mg、300mg、600mg和1200mg。如表44所示，待测试的BE-146与200mg替雷利珠单抗组合的剂量水平为50mg、150mg、300mg、600mg和1200mg。替雷利珠单抗的剂量水平和时间表(即，在每个21天周期的第1天通过静脉输注施用200mg)将保持固定。当联合给予时，首先施用替雷利珠单抗，然后施用BE-146。然而，在单一疗法组中和/或在接受BE-146和替雷利珠单抗的组合的组中BE-146的较低、中间和/或较高剂量水平和/或替代给药间隔可由医生确定。
表44：BE-146给药
实例44.BE-146适应症
在许多类型的癌症中观察到CEA过表达，包括结肠直肠癌(CRC)、胃癌(GC)、肺癌、胰腺癌、肝细胞癌、乳腺癌和甲状腺癌(Chevinsky AH.,Semin Surg Oncol.[外科肿瘤学研讨会]1991；7(3):162-6；Shively等人,Crit Rev Oncol Hematol.[肿瘤学/血液学评论]1985；2(4):355-99)。高血清CEA与GC和肺癌患者的不良预后相关。(Hall等人,AnnColoproctol.[结直肠病学年鉴]2019；35(6):294-305；Moriyama等人,Surg Today.[今日外科]2021Oct；51(10):1638-48；Grunnet等人,Lung Cancer.[肺癌]2012May；76(2):138-43)。转移性晚期疾病患者的肿瘤五年存活率仍然很低：CRC为14.7％，GC为5.5％，而肺癌为6.3％。
CEA的过表达导致免疫功能障碍。据报道，CEA可调节各种类型的免疫细胞的反应。例如，CEA可以与CEACAM1相互作用，后者充当共抑制性分子以降低自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性(Stern等人,J.Immuno.[免疫学杂志]2005；174(11):6692-701)。当CEA活化时，枯否细胞(Kupffer cell)可诱导细胞因子诸如IL-10、IL-6和TNF-α(Gangopadhyay等人,Cancer Letters[癌症通讯]1997；118(1):1-6)。还报道了人PBMC衍生的T细胞的活化可被CEA抑制(Lee等人,Int.J.Cancer[国际癌症期刊]2015；136(11):2579-87)。
基于CEA过表达，将对患有组织学或细胞学证实的晚期、转移性、不可切除的CRC、GC或NSCLC的患者施用BE-146治疗。将依次评估BE-146单一疗法的大约7个递增剂量水平的队列以及BE-146的5个递增剂量水平与200mg替雷利珠单抗组合的队列，以评估BE-146作为单一疗法和与替雷利珠单抗组合的安全性、耐受性、PK和药效学，并确定BE-146在晚期结肠直肠癌(CRC)、胃癌(GC)或非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的功效。
实例35.CEAxCD137体内毒性
将BE-146或乌瑞鲁单抗类似物抗体(30mg/kg)注射到C57BL/6背景的人源化CD137小鼠中，每周一次，共三次给药。在第22天收集血液并通过血液生化测试进行分析。与媒介物对照相比，高剂量的乌瑞鲁单抗类似物而非BE-146诱导指示肝毒性的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度的显著增加。此外，在乌瑞鲁单抗类似物治疗组的肝组织中观察到炎性细胞增加的微观变化，而在BE-146治疗组中没有观察到显著的微观变化(图51)。因此，BE-146是一种有希望的无肝毒性癌症免疫疗法的组合伙伴，包括检查点抑制剂和T细胞接合物。
BE-146的安全性特征在于在食蟹猴中进行的为期4周的重复给药毒性研究，该研究使用正常人体组织的组织交叉反应测定和使用新鲜人PBMC的细胞因子释放测定。这些研究是根据良好实验室规范条例/原则进行的。
在通过静脉内输注以5、20或100mg/kg剂量每周一次持续4周(总共5剂)的BE-146治疗的食蟹猴的重复剂量研究中，未发现死亡或不良反应。首次给药后，全身暴露与剂量成比例地增加。没有发现明显的性别差异或药物积累。未观察到的副作用水平(NOAEL)为100mg/kg。NOAEL被认为是100mg/kg，其中稳态Cmax和AUC0-168h在雄性中分别为2220μg/mL和58,600h·μg/mL，在雌性中分别为2110μg/mL和66,800h·μg/mL。此外，在基于PBMC的细胞因子释放测定中，与人IgG相比，固定化BE-146在任何测试的供体样品中均未诱导细胞因子/趋化因子的显著释放，表明诱导细胞因子释放综合征的风险极小。
参考文献
Abdul-Wahid,A.,M.Cydzik,N.W.Fischer,A.Prodeus,J.E.Shively,A.Martel,S.Alminawi,Z.Ghorab,N.L.Berinstein&J.Gariépy(2018)Serum-derivedcarcinoembryonic antigen(CEA)activates fibroblasts to induce a local re-modeling of the extracellular matrix that favors the engraftment of CEA-expressing tumor cells.International Journal of Cancer,143,1963-1977.
Abdul-Wahid,A.,E.H.B.Huang,M.Cydzik,E.Bolewska-Pedyczak&J.Gariépy(2014)The carcinoembryonic antigen IgV-like N domain plays a critical role inthe implantation of metastatic tumor cells.Molecular Oncology,8,337-350.
Arnon,T.I.,H.Achdout,O.Levi,G.Markel,N.Saleh,G.Katz,R.Gazit,T.Gonen-Gross,J.Hanna,E.Nahari,A.Porgador,A.Honigman,B.Plachter,D.Mevorach,D.G.Wolf&O.Mandelboim(2005)Inhibition of the CD137 activating receptor by pp65 ofhuman cytomegalovirus.Nat Immunol,6,515-23.
Augugliaro,R.,S.Parolini,R.Castriconi,E.Marcenaro,C.Cantoni,M.Nanni,L.Moretta,A.Moretta&C.Bottino(2003)Selective cross-talk among naturalcytotoxicity receptors in human natural killer cells.Eur J Immunol,33,1235-41.
Bacac,M.,C.Klein&P.Umana(2016)CEATCB:A novel head-to-tail 2:1 Tcellbispecific antibody for treatment of CEA-positive solidtumors.Oncoimmunology,5,e1203498.
Barrow,A.D.,C.J.Martin&M.Colonna(2019)The Natural CytotoxicityReceptorsin Health and Disease.Front Immunol,10,909.
Beauchemin,N.2017.CEAGene Family.In Encyclopedia of Cancer,ed.M.Schwab,870-874.Berlin,Heidelberg:Springer Berlin Heidelberg.
Beck,A.,T.Wurch,C.Bailly&N.Corvaia(2010)Strategies and challenges forthenext generation of therapeutic antibodies.Nat Rev Immunol,10,345-52.
Biron,C.A.,K.B.Nguyen,G.C.Pien,L.P.Cousens&T.P.Salazar-Mather(1999)Natural killer cells in antiviral defense:function and regulation by innatecytokines.AnnuRev Immunol,17,189-220.
Bozzano,F.,A.Picciotto,P.Costa,F.Marras,V.Fazio,I.Hirsch,D.Olive,L.Moretta&A.De Maria(2011)Activating NK cell receptor expression/function(CD137,NKp46,DNAM-1)during chronic viraemic HCV infection is associated withthe outcome ofcombined treatment.Eur J Immunol,41,2905-14.
Brinkmann,U.&R.E.Kontermann(2017)The making of bispecificantibodies.MAbs,9,182-212.
Brocks,B.,P.Garin-Chesa,E.Behrle,J.E.Park,W.J.Rettig,K.Pfizenmaier&D.Moosmayer(2001)Species-crossreactive scFv against the tumor stroma marker"fibroblastactivation protein"selected by phage display from an immunizedFAP-/-knock-out mouse.Molecular medicine(Cambridge,Mass.),7,461-469.
Castriconi,R.,C.Cantoni,M.Della Chiesa,M.Vitale,E.Marcenaro,R.Conte,R.Biassoni,C.Bottino,L.Moretta&A.Moretta(2003)Transforming growth factor beta1inhibits expression of CD137 and NKG2D receptors:consequences for the NK-mediatedkilling of dendritic cells.Proc Natl Acad Sci U S A,100,4120-5.
Chau,I.,M.J.Allen,D.Cunningham,A.R.Norman,G.Brown,H.E.Ford,N.Tebbutt,D.Tait,M.Hill,P.J.Ross&J.Oates(2004)The value of routine serum carcino-embryonicantigen measurement and computed tomography in the surveillance ofpatients after adjuvantchemotherapy for colorectal cancer.J Clin Oncol,22,1420-9.
Correia,M.P.,A.Stojanovic,K.Bauer,D.Juraeva,L.O.Tykocinski,H.M.Lorenz,B.Brors&A.Cerwenka(2018)Distinct human circulating CD137(+)FcepsilonRIgamma(+)CD8(+)T cell population exhibiting high natural killer-like antitumor potential.Proc NatlAcad Sci U S A,115,E5980-E5989.
Dahlen,E.,N.Veitonmaki&P.Norlen(2018)Bispecific antibodies incancerimmunotherapy.Ther Adv Vaccines Immunother,6,3-17.
Delahaye,N.F.,S.Rusakiewicz,I.Martins,C.Menard,S.Roux,L.Lyonnet,P.Paul,M.Sarabi,N.Chaput,M.Semeraro,V.Minard-Colin,V.Poirier-Colame,K.Chaba,C.Flament,V.Baud,H.Authier,S.Kerdine-Romer,M.Pallardy,I.Cremer,L.Peaudecerf,B.Rocha,D.Valteau-Couanet,J.C.Gutierrez,J.A.Nunes,F.Commo,S.Bonvalot,N.Ibrahim,P.Terrier,P.Opolon,C.Bottino,A.Moretta,J.Tavernier,P.Rihet,J.M.Coindre,J.Y.Blay,N.Isambert,J.F.Emile,E.Vivier,A.Lecesne,G.Kroemer&L.Zitvogel(2011)Alternatively spliced CD137 isoforms affect the prognosis ofgastrointestinal stromal tumors.Nat Med,17,700-7.
Dotan,E.,A.Starodub,J.Berlin,C.H.Lieu,M.J.Guarino,J.Marshall,J.R.Hecht,S.J.Cohen,W.A.Messersmith,P.P.Maliakal,W.A.Wegener,R.M.Sharkey&D.M.Goldenberg(2015)Anew anti-CEA-SN-38 antibody-drug conjugate(ADC),IMMU-130,isactive in controlling metastatic colorectal cancer(mCRC)in patients(pts)refractory orrelapsing after irinotecan-containing chemotherapies:Initial results of a phase I/II study.Journal of Clinical Oncology,33,2505-2505.
Durbin,H.,S.Young,L.M.Stewart,F.Wrba,A.J.Rowan,D.Snary&W.F.Bodmer(1994)An epitope on carcinoembryonic antigen defined by the clinicallyrelevant antibodyPR1A3.Proc Natl Acad Sci U S A,91,4313-7.
Engler,F.A.,J.R.Polli,T.Li,B.An,M.Otteneder,J.Qu&J.P.Balthasar(2018)"Catch-and-Release"Anti-Carcinoembryonic Antigen Monoclonal Antibody LeadstoGreater Plasma and Tumor Exposure in a Mouse Model of Colorectal Cancer.JPharmacolExp Ther,366,205-219.
Fischer,E.,K.Chaitanya,T.Wuest,A.Wadle,A.M.Scott,M.van den Broek,R.Schibli,S.Bauer&C.Renner(2012)Radioimmunotherapy of fibroblast activationproteinpositive tumors by rapidly internalizing antibodies.Clin Cancer Res,18,6208-18.
Flamini,E.,L.Mercatali,O.Nanni,D.Calistri,R.Nunziatini,W.Zoli,P.Rosetti,N.Gardini,A.Lattuneddu,G.M.Verdecchia&D.Amadori(2006)FreeDNAandcarcinoembryonic antigen serum levels:an important combination fordiagnosis of colorectalcancer.Clin Cancer Res,12,6985-8.
Gangopadhyay,A.,D.A.Lazure&P.Thomas(1997)Carcinoembryonicantigeninduces signal transduction in Kupffer cells.Cancer Letters,118,1-6.
Gauthier,L.,A.Morel,N.Anceriz,B.Rossi,A.Blanchard-Alvarez,G.Grondin,S.Trichard,C.Cesari,M.Sapet,F.Bosco,H.Rispaud-Blanc,F.Guillot,S.Cornen,A.Roussel,B.Amigues,G.Habif,F.Caraguel,S.Arrufat,R.Remark,F.Romagne,Y.Morel,E.Narni-Mancinelli&E.Vivier(2019)Multifunctional Natural Killer Cell EngagersTargetingNKp46 Trigger Protective Tumor Immunity.Cell,177,1701-1713 e16.
Gold,P.&S.O.Freedman(1965)Demonstration of tumor-specific antigens inhumancolonic carcinomata by immunological tolerance and absorptiontechniques.J Exp Med,121,439-62.
Goldenberg,D.M.(1992)Cancer imaging with CEAantibodies:historical andcurrentperspectives.Int J Biol Markers,7,183-8.
S.(1999)The carcinoembryonic antigen(CEA)family:structures,suggested functions and expression in normal and malignanttissues.Seminars in CancerBiology,9,67-81.
Hezareh,M.,A.J.Hessell,R.C.Jensen,J.G.van de Winkel&P.W.Parren(2001)Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizingantibody againsthuman immunodeficiency virus type 1.J Virol,75,12161-8.
Hohenberger,P.,P.M.Schlag,T.Gerneth&C.Herfarth(1994)Pre-andpostoperativecarcinoembryonic antigen determinations in hepatic resection forcolorectal metastases.Predictive value and implications for adjuvanttreatment based on multivariate analysis.AnnSurg,219,135-43.
Hollyoake,M.,R.D.Campbell&B.Aguado(2005)CD137(NCR3)is a pseudogenein12 inbred and wild mouse strains,but an expressed gene in Mus caroli.Mol BiolEvol,22,1661-72.
Hsieh,C.L.,K.Nagasaki,O.M.Martinez&S.M.Krams(2006)CD137 is afunctionalactivation receptor on a subset of rat natural killer cells.Eur JImmunol,36,2170-80.
Hudspeth,K.,M.Fogli,D.V.Correia,J.Mikulak,A.Roberto,S.Della Bella,B.Silva-Santos&D.Mavilio(2012)Engagement of CD137 on Vdelta1 T cells inducestheproduction of CCL3,CCL4,and CCL5 and suppresses HIV-1 replication.Blood,119,4013-6.
Hudspeth,K.,B.Silva-Santos&D.Mavilio(2013)Natural cytotoxicityreceptors:broader expression patterns and functions in innate and adaptiveimmune cells.FrontImmunol,4,69.
Hurwitz,E.,I.Stancovski,M.Sela&Y.Yarden(1995)Suppression andpromotion oftumor growth by monoclonal antibodies to ErbB-2 differentiallycorrelate with cellularuptake.Proc Natl Acad Sci U S A,92,3353-7.
Igawa,T.,H.Tsunoda,Y.Kikuchi,M.Yoshida,M.Tanaka,A.Koga,Y.Sekimori,T.Orita,Y.Aso,K.Hattori&M.Tsuchiya(2010)VH/VL interface engineering topromoteselective expression and inhibit conformational isomerization ofthrombopoietin receptoragonist single-chain diabody.Protein Eng Des Sel,23,667-77.
Joyce,M.G.,P.Tran,M.A.Zhuravleva,J.Jaw,M.Colonna&P.D.Sun(2011)Crystalstructure of human natural cytotoxicity receptor CD137 andidentification of its ligandbinding site.Proc Natl Acad Sci U S A,108,6223-8.
Koch,J.,A.Steinle,C.Watzl&O.Mandelboim(2013)Activating naturalcytotoxicityreceptors of natural killer cells in cancer and infection.TrendsImmunol,34,182-91.
Kuespert,K.,S.Pils&C.R.Hauck(2006)CEACAMs:their role in physiologyandpathophysiology.Current Opinion in Cell Biology,18,565-571.
Kruse,P.H.,J.Matta,S.Ugolini&E.Vivier(2014)Natural cytotoxicityreceptors andtheir ligands.Immunol Cell Biol,92,221-9.
Lanier,L.L.(2015)NKG2D Receptor and Its Ligands in HostDefense.CancerImmunol Res,3,575-82.
Lee,J.H.&S.-W.Lee(2017)The Roles of Carcinoembryonic Antigen inLiverMetastasis and Therapeutic Approaches.Gastroenterology Research andPractice,2017,11.
Lee,K.-A.,E.-A.Bae,Y.C.Song,E.-K.Kim,Y.-S.Lee,T.-G.Kim&C.-Y.Kang(2015)Amultimeric carcinoembryonic antigen signal inhibits the activation ofhuman T cells by aSHP-independent mechanism:Apotential mechanism for tumor-mediated suppression of T-cell immunity.International Journal of Cancer,136,2579-2587.
Lefranc,M.P.,V.Giudicelli,C.Ginestoux,J.Bodmer,W.Muller,R.Bontrop,M.Lemaitre,A.Malik,V.Barbie&D.Chaume(1999)IMGT,theinternationalImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res,27,209-12.
Liersch,T.,J.Meller,M.Bittrich,B.Kulle,H.Becker&D.M.Goldenberg(2007)Update of carcinoembryonic antigen radioimmunotherapy with(131)I-labetuzumabaftersalvage resection of colorectal liver metastases:comparison of outcometo acontemporaneous control group.Ann Surg Oncol,14,2577-90.
Li,Y.,Q.Wang&R.A.Mariuzza(2011)Structure of the human activatingnaturalcytotoxicity receptor CD137 bound to its tumor cell ligand B7-H6.J ExpMed,208,703-14.
Liu,L.,W.Zeng,M.A.Wortinger,S.B.Yan,P.Cornwell,V.L.Peek,J.R.Stephens,J.W.Tetreault,J.Xia,J.R.Manro,K.M.Credille,D.W.Ballard,P.Brown-Augsburger,V.Wacheck,C.K.Chow,L.Huang,Y.Wang,I.Denning,J.Davies,Y.Tang,P.Vaillancourt&J.Lu(2014)LY2875358,a neutralizing and internalizing anti-MET bivalentantibody,inhibits HGF-dependent and HGF-independent MET activation and tumorgrowth.ClinCancer Res,20,6059-70.
Matsuoka,Y.,Y.Matsuo,K.Sugano,H.Ohkura,M.Kuroki&M.Kuroki(1990)Characterization of Carcinoembryonic Antigen-related Antigens in Normal AdultFeces.Japanese Journal of Cancer Research,81,514-519.
Mechetner,E.(2007)Development and characterization of mousehybridomas.Methods Mol Biol,378,1-13.
Moertel,C.G.,T.R.Fleming,J.S.Macdonald,D.G.Haller,J.A.Laurie&C.Tangen(1993)An evaluation of the carcinoembryonic antigen(CEA)test for monitoringpatientswith resected colon cancer.Jama,270,943-7.
Muller,D.&R.E.Kontermann(2010)Bispecific antibodies for cancerimmunotherapy:Current perspectives.BioDrugs,24,89-98.
Nap,M.,M.L.Hammarstrom,O.Bormer,S.Hammarstrom,C.Wagener,S.Handt,M.Schreyer,J.P.Mach,F.Buchegger,S.von Kleist&et al.,(1992)Specificity andaffinity ofmonoclonal antibodies against carcinoembryonic antigen.Cancer Res,52,2329-39.
Nap,M.,K.Mollgard,P.Burtin&G.J.Fleuren(1988)Immunohistochemistryofcarcino-embryonic antigen in the embryo,fetus and adult.Tumour Biol,9,145-53.
Oberst,M.D.,S.Fuhrmann,K.Mulgrew,M.Amann,L.Cheng,P.Lutterbuese,L.Richman,S.Coats,P.A.Baeuerle&S.A.Hammond(2014)CEA/CD3 bispecificantibodyMEDI-565/AMG 211 activation of T cells and subsequent killing ofhuman tumors isindependent of mutations commonly found in colorectaladenocarcinomas.MAbs,6,1571-84.
Pegram,H.J.,D.M.Andrews,M.J.Smyth,P.K.Darcy&M.H.Kershaw(2011)Activating and inhibitory receptors of natural killer cells.Immunol CellBiol,89,216-24.
Pende,D.,S.Parolini,A.Pessino,S.Sivori,R.Augugliaro,L.Morelli,E.Marcenaro,L.Accame,A.Malaspina,R.Biassoni,C.Bottino,L.Moretta&A.Moretta(1999)Identification and molecular characterization of CD137,a noveltriggering receptor involvedin natural cytotoxicity mediated by human naturalkiller cells.J Exp Med,190,1505-16.
Peng,L.,M.D.Oberst,J.Huang,P.Brohawn,C.Morehouse,K.Lekstrom,P.A.Baeuerle,H.Wu,Y.Yao,S.R.Coats,W.Dall'Acqua,M.Damschroder&S.A.Hammond(2012)The CEA/CD3-bispecific antibody MEDI-565(MT111)binds a nonlinearepitope inthe full-length but not a short splice variant of CEA.PloS one,7,e36412-e36412.
Pesce,S.,G.Tabellini,C.Cantoni,O.Patrizi,D.Coltrini,F.Rampinelli,J.Matta,E.Vivier,A.Moretta,S.Parolini&E.Marcenaro(2015)B7-H6-mediateddownregulation ofCD137 in NK cells contributes to ovarian carcinoma immuneescape.Oncoimmunology,4,e1001224.
Pogge von Strandmann,E.,V.R.Simhadri,B.von Tresckow,S.Sasse,K.S.Reiners,H.P.Hansen,A.Rothe,B.Boll,V.L.Simhadri,P.Borchmann,P.J.McKinnon,M.Hallek&A.Engert(2007)Human leukocyte antigen-B-associated transcript 3 isreleased fromtumor cells and engages the CD137 receptor on natural killercells.Immunity,27,965-74.
Poul,M.A.,B.Becerril,U.B.Nielsen,P.Morisson&J.D.Marks(2000)Selectionoftumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries.J MolBiol,301,1149-61.
Primrose,J.N.,R.Perera,A.Gray,P.Rose,A.Fuller,A.Corkhill,S.George&D.Mant(2014)Effect of 3 to 5 years of scheduled CEA and CT follow-up todetect recurrence ofcolorectal cancer:the FACS randomized clinicaltrial.Jama,311,263-70.
Richman,P.I.&W.F.Bodmer(1987)Monoclonal antibodies to humancolorectalepithelium:markers for differentiation and tumourcharacterization.Int J Cancer,39,317-28.
Ridgway,J.B.,L.G.Presta&P.Carter(1996)'Knobs-into-holes'engineeringofantibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng,9,617-21.
Saito,G.,S.Sadahiro,K.Okada,A.Tanaka,T.Suzuki&A.Kamijo(2016)Relationbetween Carcinoembryonic Antigen Levels in Colon Cancer Tissue andSerumCarcinoembryonic Antigen Levels at Initial Surgery andRecurrence.Oncology,91,85-9.
Sakurai,Y.,S.Hirohashi,T.Ohishi,Y.Shimosato,S.Kodaira&O.Abe(1989)Conformational epitopes specific to carcinoembryonic antigen defined bymonoclonalantibodies raised against colon cancer xenografts.J Surg Oncol,42,39-46.
Sheahan,K.,M.J.O'Brien,B.Burke,P.A.Dervan,J.C.O'Keane,L.S.Gottlieb&N.Zamcheck(1990)Differential reactivities of carcinoembryonic antigen(CEA)andCEA-related monoclonal and polyclonal antibodies in common epithelialmalignancies.Am J ClinPathol,94,157-64.
Shinmi,D.,R.Nakano,K.Mitamura,M.Suzuki-Imaizumi,J.Iwano,Y.Isoda,J.Enokizono,Y.Shiraishi,E.Arakawa,K.Tomizuka&K.Masuda(2017)Novelanticarcinoembryonic antigen antibody-drug conjugate has antitumoractivity in theexistence of soluble antigen.Cancer Med,6,798-808.
Silacci,M.,S.Brack,G.Schirru,J.Marlind,A.Ettorre,A.Merlo,F.Viti&D.Neri(2005)Design,construction,and characterization of a large synthetichuman antibody phagedisplay library.Proteomics,5,2340-50.
Stern,N.,G.Markel,T.I.Arnon,R.Gruda,H.Wong,S.D.Gray-Owen&O.Mandelboim(2005)Carcinoembryonic Antigen(CEA)Inhibits NK Killing via InteractionwithCEA-Related Cell Adhesion Molecule 1.The Journal of Immunology,174,6692-6701.
Stewart,L.M.,S.Young,G.Watson,S.J.Mather,P.A.Bates,H.A.Band,R.W.Wilkinson,E.L.Ross&D.Snary(1999)Humanisation and characterisation ofPR1A3,amonoclonal antibody specific for cell-bound carcinoembryonicantigen.Cancer ImmunolImmunother,47,299-306.
Takahashi,T.,S.Minami,Y.Tsuchiya,K.Tajima,N.Sakai,K.Suga,S.I.Hisanaga,N.Ohbayashi,M.Fukuda&H.Kawahara(2019)Cytoplasmic control of Rabfamily smallGTPases through BAG6.EMBO Rep,20.
Thompson,J.A.,F.Grunert&W.Zimmermann(1991)Carcinoembryonic antigengenefamily:Molecular biology and clinical perspectives.Journal of ClinicalLaboratory Analysis,5,344-366.
Von Kreudenstein,T.S.,E.Escobar-Carbrera,P.I.Lario,I.D'Angelo,K.Brault,J.Kelly,Y.Durocher,J.Baardsnes,R.J.Woods,M.H.Xie,P.A.Girod,M.D.Suits,M.J.Boulanger,D.K.Poon,G.Y.Ng&S.B.Dixit(2013)Improving biophysicalproperties of a bispecificantibody scaffold to aid developability:quality bymolecular design.MAbs,5,646-54.
Wong,J.Y.,D.Z.Chu,L.E.Williams,D.M.Yamauchi,D.N.Ikle,C.S.Kwok,A.Liu,S.Wilczynski,D.Colcher,P.J.Yazaki,J.E.Shively,A.M.Wu&A.A.Raubitschek(2004)Pilot trial evaluating an 123I-labeled 80-kilodalton engineeredanticarcinoembryonicantigen antibody fragment(cT84.66 minibody)in patientswith colorectal cancer.ClinCancer Res,10,5014-21.
Wu,J.,Y.Song,A.B.Bakker,S.Bauer,T.Spies,L.L.Lanier&J.H.Phillips(1999)An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP10.Science,285,730-2.
Wu,T.T.&E.A.Kabat(1970)An analysis of the sequences of the variableregions ofBence Jones proteins and myeloma light chains and theirimplications for antibodycomplementarity.J Exp Med,132,211-50.
Zhang,T.,B.A.Lemoi&C.L.Sentman(2005)Chimeric NK-receptor-bearing Tcellsmediate antitumor immunotherapy.Blood,106,1544-1551.
Zhang,T.,X.Song,L.Xu,J.Ma,Y.Zhang,W.Gong,Y.Zhang,X.Zhou,Z.Wang,Y.Wang,Y.Shi,H.Bai,N.Liu,X.Yang,X.Cui,Y.Cao,Q.Liu,J.Song,Y.Li,Z.Tang,M.Guo,L.Wang&K.Li(2018)The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota hasaprofound impact on its biological functions.Cancer Immunol Immunother,67,1079-1090.
Zhang,T.,M.R.Wu&C.L.Sentman(2012)An CD137-based chimericantigenreceptor promotes T cell effector functions and antitumor efficacy invivo.J Immunol,189,2290-9.
Zhao,L.,L.Qu,J.Zhou,Z.Sun,H.Zou,Y.Y.Chen,J.D.Marks&Y.Zhou(2014)Highthroughput identification of monoclonal antibodies to membrane bound andsecretedproteins using yeast and phage display.PLoS One,9,e111339.

Claims (50)

1.一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:88的氨基酸596至674处特异性结合人CEA的第一抗原结合结构域和特异性结合人CD137的第二抗原结合结构域。
2.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该第一抗原结合结构域不与其他CEACAM家族成员结合。
3.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1(轻链互补决定区1)、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQ ID NO:6的LCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2、(c)SEQ ID NO:26的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:23的LCDR3；或
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:41的HCDR1、(b)SEQ ID NO:42的HCDR2、(c)SEQ ID NO:43的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:44的LCDR1、(e)SEQ ID NO:45的LCDR2和(f)SEQ ID NO:40的LCDR3。
4.如权利要求3所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(iii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:48至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:49至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
6.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该第一抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:31的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区(VL)；或
(iii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(VL)。
7.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：
(i)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3；
(ii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；
(iii)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；或
(iv)重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2、(c)SEQ ID NO:57的HCDR3。
8.如权利要求7所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(ii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(iii)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(iv)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:70至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或
(v)重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:84、86、75、70或60中已插入、缺失或取代一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸。
10.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该第二抗原结合结构域包含：
(i)包含SEQ ID NO:84的重链可变区(VH)；
(ii)包含SEQ ID NO:86的重链可变区(VH)；
(iii)包含SEQ ID NO:75的重链可变区(VH)；
(iv)包含SEQ ID NO:70的重链可变区(VH)；或
(v)包含SEQ ID NO:60的重链可变区(VH)。
11.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中：
(i)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:80的HCDR2、(c)SEQ ID NO:81的HCDR3；以及
(ii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:73的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；
(iii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:65的HCDR1、(b)SEQ ID NO:66的HCDR2、(c)SEQ ID NO:67的HCDR3；或
(iv)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:7的HCDR1、(b)SEQ ID NO:8的HCDR2、(c)SEQ ID NO:9的HCDR3，以及轻链可变区，该轻链可变区包含：(d)SEQ ID NO:10的LCDR1、(e)SEQ ID NO:11的LCDR2和(f)SEQID NO:6的LCDR3；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：重链可变区，该重链可变区包含(a)SEQ ID NO:55的HCDR1、(b)SEQ ID NO:56的HCDR2、(c)SEQ ID NO:57的HCDR3。
12.如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中：
(i)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:84的重链可变区(VH)；
(ii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:86的重链可变区(VH)；
(iii)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:75的重链可变区(VH)；
(iv)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:70的重链可变区(VH)；或
(v)特异性结合人CEA的该第一抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)；并且特异性结合人CD137的该第二抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:60的重链可变区(VH)。
13.如权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
14.如权利要求1所述的多特异性抗体，其中该多特异性抗体是双特异性抗体。
15.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该双特异性抗体含有SEQ ID NO:317至SEQ ID NO 358的接头。
16.如权利要求15所述的双特异性抗体，其中该接头是SEQ ID NO:324。
17.如权利要求15所述的双特异性抗体，其中该接头是SEQ ID NO:329。
18.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-146(SEQ ID NO:313和SEQ ID NO:179)。
19.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-189(SEQ ID NO:255和SEQ ID NO:179)。
20.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-718(SEQ ID NO:295和SEQ ID NO:179)。
21.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-740(SEQ ID NO:297和SEQ ID NO:179)。
22.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-942(SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301和SEQ ID NO:303)。
23.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-755(SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301和SEQ ID NO:305)。
24.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-562(SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:179)。
25.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-375(SEQ ID NO:309和SEQ ID NO:179)。
26.如权利要求14所述的双特异性抗体，其中该多特异性抗体是BE-244(SEQ ID NO:311和SEQ ID NO:179)。
27.如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
28.如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或是低岩藻糖基化的。
29.如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
30.如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该Fc结构域是具有降低的效应子功能的IgG1。
31.如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中该Fc结构域是IgG4。
32.一种药物组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其进一步包含药学上可接受的载剂。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其进一步包含组氨酸/组氨酸HCl、海藻糖二水合物和聚山梨醇酯20。
34.一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的如权利要求1所述的多特异性抗体或抗原结合片段。
35.如权利要求34所述的方法，其中该癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
36.如权利要求35所述的方法，其中该结肠癌是结肠直肠癌。
37.如权利要求35所述的方法，其中该胃癌与血清中的高CEA水平相关。
38.如权利要求35所述的方法，其中该肺癌与血清中的高CEA水平相关。
39.如权利要求35所述的方法，其中该非小细胞肺癌与血清中的高CEA水平相关。
40.如权利要求34所述的治疗方法，其中该多特异性抗体以5mg-1200mg的范围施用。
41.如权利要求40所述的方法，其中该多特异性抗体以5mg-1200mg的范围施用，每周一次。
42.如权利要求34所述的方法，其中该多特异性抗体或抗原结合片段与另一种治疗剂组合施用。
43.如权利要求42所述的方法，其中该治疗剂是紫杉醇或紫杉醇药剂、多西他赛、卡铂、托泊替康、顺铂、伊立替康、多柔比星、来那度胺或5-氮杂胞苷。
44.如权利要求43所述的方法，其中该治疗剂是紫杉醇药剂、来那度胺或5-氮杂胞苷。
45.如权利要求42所述的方法，其中该治疗剂是抗PD1或抗PDL1抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其中该抗PD1抗体是替雷利珠单抗。
47.一种分离的核酸，其编码如权利要求1至26中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段。
48.一种载体，其包含如权利要求47所述的核酸。
49.一种宿主细胞，其包含如权利要求47所述的核酸或如权利要求48所述的载体。
50.一种用于产生多特异性抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养如权利要求49所述的宿主细胞以及从培养物中回收该抗体或抗原结合片段。
CN202280036536.1A 2021-05-21 2022-05-18 抗cea和抗cd137多特异性抗体及其使用方法 Pending CN117396182A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2021/095113 2021-05-21
CN2021095113 2021-05-21
CNPCT/CN2022/085625 2022-04-07
CN2022085625 2022-04-07
CNPCT/CN2022/088172 2022-04-21
CN2022088172 2022-04-21
PCT/CN2022/093565 WO2022242680A1 (en) 2021-05-21 2022-05-18 Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117396182A true CN117396182A (zh) 2024-01-12

Family

ID=84140249

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280036536.1A Pending CN117396182A (zh) 2021-05-21 2022-05-18 抗cea和抗cd137多特异性抗体及其使用方法

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP4340805A1 (zh)
KR (1) KR20240014058A (zh)
CN (1) CN117396182A (zh)
AU (1) AU2022277479A1 (zh)
CA (1) CA3219672A1 (zh)
CO (1) CO2023017609A2 (zh)
IL (1) IL308660A (zh)
TW (1) TW202307003A (zh)
WO (1) WO2022242680A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116814664B (zh) * 2023-08-25 2023-12-12 中国医学科学院肿瘤医院 一种扩展肿瘤识别表位的cea嵌合抗原受体t细胞的制备与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3267969A1 (en) * 2015-03-09 2018-01-17 King's College London Combination therapy with rar alpha agonists for enhancing th1 response
CN105753978B (zh) * 2016-03-14 2020-02-07 中国人民解放军第二军医大学 一种hla-a11限制性癌胚抗原来源的表位肽及用途
JP2022538075A (ja) * 2019-06-26 2022-08-31 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体結合ｃｅａ及び４－１ｂｂｌの融合

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022277479A1 (en) 2024-01-18
IL308660A (en) 2024-01-01
CO2023017609A2 (es) 2024-01-15
EP4340805A1 (en) 2024-03-27
CA3219672A1 (en) 2022-11-24
TW202307003A (zh) 2023-02-16
KR20240014058A (ko) 2024-01-31
WO2022242680A1 (en) 2022-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9884921B2 (en) Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
JP2017532290A (ja) Ｃｄ３イプシロンおよびｂｃｍａに対する二特異性抗体
KR20160006168A (ko) 인간화 항-cd134(ox40) 항체 및 이의 용도
AU2016258115A1 (en) Prostate specific membrane antigen (PSMA) bispecific binding agents and uses thereof
AU2021311701A1 (en) Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
CN114907479A (zh) 抗cd112r抗体及其用途
WO2022242680A1 (en) Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
KR20220121808A (ko) 항-pd-l1/항-b7-h3 다중특이적 항체 및 이의 용도
EP4155318A1 (en) Bispecific antibody and use thereof
WO2022242682A1 (en) Anti-gpc3 and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
WO2022242679A1 (en) Anti-cd137 antibodies and methods of use
WO2022242681A1 (en) Anti-cea antibodies and methods of use
WO2024109678A1 (en) Anti-cd137 antibodies and methods of use
CN114641500B (zh) 使用抗ox40抗体与抗tim3抗体的组合治疗癌症的方法
WO2021098749A1 (en) Methods of cancer treatment with anti-ox40 antibody in combination with radiation
JP2024521701A (ja) 抗ｃｄ１３７抗体及びその使用方法
KR20230012559A (ko) 암 치료를 위한 결합 분자
CN114539420A (zh) 抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3×cd3双特异性抗体、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication