TW202307003A - 抗ｃｅａ和抗ｃｄ１３７多特異性抗體及其使用方法 - Google Patents

抗ｃｅａ和抗ｃｄ１３７多特異性抗體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露提供了結合人CEA和CD137的多特異性抗體及其抗原結合片段、包含所述抗體的藥物組成物、以及該多特異性抗體或該組成物用於治療疾病諸如癌症之用途。

Description

抗CEA和抗CD137多特異性抗體及其使用方法
本文揭露了結合人CEA和人CD137的多特異性抗體或其抗原結合片段、包含所述抗體的組成物，以及用於治療癌症之方法。
癌胚抗原（CEA，也稱為CEACAM5或CD66e）係一種糖蛋白，其分子量為約70-100 kDa，取決於所存在的糖基化的量。Gold等人, J. Exp. Med.[實驗醫學雜誌], 121, 439 (1965)首先報導了與人腺癌中的癌症特異性抗原相關的CEA之存在。CEA通常在多種腺上皮組織（諸如胃腸道、呼吸道和泌尿生殖道）中表現，在該等腺上皮組織中它似乎位於細胞的頂端表面（Hammarstrom, S. Semin. Cancer Biol.[癌症生物學研討會] 9, 67-81 (1999)）。例如，發現它存在於結腸的柱狀上皮細胞和杯狀細胞中（Fraengsmyr等人, Tumor Biol.[腫瘤生物學] 20:277-292 (1999)）。在由該等組織類型產生的腫瘤中，CEA表現從頂端膜到細胞表面增加，並且一旦從細胞表面除去，就會進入血流（Hammarstrom, S. Semin. Cancer Biol.[癌症生物學研討會] 9, 67-81；(1999)，還參見Fraengsmyr等人, Tumor Biol.[腫瘤生物學] 20:277-292 (1999)）。在許多類型的癌症中觀察到CEA過表現，該等癌症包括結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳癌和甲狀腺癌。因此，在癌症的預後和治療中，CEA已經用作診斷性腫瘤標誌物以確定癌症患者血液中的CEA水平升高（Chevinsky, A. H. (1991) Semin. Surg. Oncol.[外科腫瘤學研討會] 7, 162-166；Shively, J. E.等人, (1985) Crit. Rev. Oncol. Hematol.[腫瘤學/血液學評論] 2, 355-399）。
CEA已被認為是用於靶向療法的有用的腫瘤相關抗原（Kuroki M等人, (2002) Anticancer Res [抗癌研究] 22:4255-64）。一種方法係產生展示抗CEA scFv的反轉錄病毒構建體，並將一氧化氮合酶（iNOS）基因遞送至表現CEA的癌細胞。（Kuroki M.等人, (2000) Anticancer Res.[抗癌研究] 20(6A):4067-71）。另一種方法係將放射性同位素與抗CEA抗體連接，並證明放射特異性針對表現CEA的腫瘤（Wilkinson等人, PNAS USA [美國國家科學院院刊] 98, 10256-60 (2001)；Goldenberg等人, Am. J. Gastroenterol.[美國胃腸病學雜誌], 86: 1392-1403 (1991)；Olafsen T.等人, Protein Engineering, Design & Selection [蛋白質工程設計與選擇], 17, 21-27, (2004)；Meyer等人, Clin. Cancer Res.[臨床癌症研究] 15:4484-4492 (2009)；Sharkey等人, J. Nucl. Med.[核醫學雜誌] 46:620-633 (2005)）。放射性同位素方法已擴展到抗CEA抗體藥物軛合物（ADC）。例如，Shinmi等人報導了一種與單甲基澳瑞他汀E（MMAE）軛合的抗CEA抗體（Shinmi等人, Cancer Med.[癌症醫學] 6(4): 798-808 (2017)）。
然而，抗CEA抗體的問題之一係交叉反應性。CEA與其他CEACAM家族成員高度同源，例如，人CEA與CEACAM6顯示出84%同源性，與CEACAM8顯示出77%同源性，與CEACAM1顯示出73%同一性。本揭露提供了對CEA特異的抗CEA抗體。
CD137（也稱為TNFRSF9/41BB）係屬於TNFRSF家族的共刺激分子。它係藉由對由伴刀豆球蛋白A刺激的小鼠輔助細胞和細胞毒性細胞的T細胞因子篩選發現的，並在1989年被鑒定為在抗原引發的T細胞上表現但在靜息T細胞上不表現的誘導型基因（Kwon等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.[美國國家科學院學報] 1989;86:1963-1967）。CD137係屬於TNFRSF的共刺激分子。它係在80年代後期對由伴刀豆球蛋白A刺激的小鼠輔助細胞和細胞毒性細胞進行T細胞因子篩選期間發現的。此外，已知它在樹突狀細胞（DC）、自然殺手細胞（NK）（Vinay等人, Mol. Cancer Ther.[分子癌症治療學] 2012;11:1062-1070）、活化的CD4+和CD8+T淋巴球、嗜酸性球、自然殺手T細胞（NKT）和肥大細胞（Kwon等人, 1989同上；Vinay D., Int. J. Hematol.[國際血液學雜誌] 2006;83:23-28）中表現。
結合CD137的CRD I的抗CD137抗體烏瑞魯單抗（Urelumab）（BMS-663513）和結合CD137的CRD III和IV的烏托魯單抗（Utomilumab）（PF-05082566）因它們激活細胞毒性T細胞並增加干擾素γ（IFN-γ）之產生的能力而顯示出作為癌症治療劑的潛力。該等抗體使腫瘤消退的潛在機制係對免疫細胞對癌細胞的反應的影響。抗CD137抗體刺激並激活效應T淋巴球（例如，刺激CD8 T淋巴球產生INFγ）、NKT和APC（例如，巨噬細胞）。
烏瑞魯單抗在臨床前實驗和早期臨床研究中顯示出有希望的結果（Sznol等人, Clin. Oncol.[臨床腫瘤學] 2008;26（增刊15））。然而，在後來的研究中，烏瑞魯單抗表現出肝毒性，導致抗體的開發暫停，直到2012年2月（Segal等人, Clin. Cancer Res.[臨床癌症研究] 2017;23:1929-1936）。肝毒性主要是由於腫瘤和基質細胞分泌的S100A4蛋白，並且將烏瑞魯單抗的劑量限制為每名患者每3週8 mg或0.1 mg/kg的研究已經恢復了對該抗體的興趣（Segal等人, Clin. Cancer Res.[臨床癌症研究] 2017;23:1929-1936）。
與烏瑞魯單抗相反，烏托魯單抗顯示出更好的安全性，並且初步研究顯示沒有肝毒性或其他劑量限制因素（Segal等人, J. Clin. Oncol.[臨床腫瘤學雜誌] 2014;32（增刊15））。烏托魯單抗作為單一療法的I期試驗的報告結果表明具有良好的安全性（Segal等人, Clin. Cancer Res.[臨床癌症研究] 2018;24:1816-1823）。推測這兩種抗體之間的差異係由於它們在CD137受體上的結合位點不同。
鑒於這兩個靶標的獨特生物學特性，將免疫細胞募集至表現CEA的癌症的抗CEAxCD137多特異性抗體將可用於治療癌症。
本揭露關於多特異性抗CEAxCD137抗體及其抗原結合片段。本揭露涵蓋以下實施方式。
一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含在SEQ ID NO: 88的胺基酸596至674處特異性結合人CEA的第一抗原結合結構域和特異性結合人CD137的第二抗原結合結構域。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合結構域不結合其他CEACAM家族成員。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3；或 (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 43的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 31至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 32至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或 (iii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 49至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）； (ii) 包含SEQ ID NO: 31的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 32的輕鏈可變區（VL）；或 (iii) 包含SEQ ID NO: 48的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈可變區（VL）。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3；或
(iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 84至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 86至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 75至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iv) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 70至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 60至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 84、86、75、70或60中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 84的重鏈可變區（VH）； (ii) 包含SEQ ID NO: 86的重鏈可變區（VH）； (iii) 包含SEQ ID NO: 75的重鏈可變區（VH）； (iv) 包含SEQ ID NO: 70的重鏈可變區（VH）；或 (v) 包含SEQ ID NO: 60的重鏈可變區（VH）。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中： (i) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3；以及 (ii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3； (iii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3；或 (iv) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中： (i) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 84的重鏈可變區（VH）； (ii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 86的重鏈可變區（VH）； (iii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 75的重鏈可變區（VH）； (iv) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 70的重鏈可變區（VH）；或 (v) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 60的重鏈可變區（VH）。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人工程化抗體、單鏈抗體（scFv）、Fab片段、Fab'片段或F(ab') 2片段。
該多特異性抗體，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
該雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體含有SEQ ID NO: 317至SEQ ID NO 358的連接子。
該雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 324。
該雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 329。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-146（SEQ ID NO: 313和SEQ ID NO: 179）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-189（SEQ ID NO: 255和SEQ ID NO: 179）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-718（SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 179）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-740（SEQ ID NO: 297和SEQ ID NO: 179）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-942（SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 301和SEQ ID NO: 303）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-755（SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 301和SEQ ID NO: 305）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-562（SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 179）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-375（SEQ ID NO: 309和SEQ ID NO: 179）。
該雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-244（SEQ ID NO: 311和SEQ ID NO: 179）。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含增加的二等分GlcNac結構。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該Fc結構域係具有降低的效應子功能的IgG1。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該Fc結構域係IgG4。
該多特異性抗體或抗原結合片段，其中該IgG4具有S228P取代（根據EU編號系統）。
一種包含多特異性抗體或其抗原結合片段的藥物組成物，其進一步包含藥學上可接受的載劑。
該藥物組成物，其進一步包含組胺酸/組胺酸HCl、海藻糖二水合物和聚山梨醇酯20。
一種治療癌症之方法，其包括向有需要的患者投與有效量的該多特異性抗體或抗原結合片段。
該方法，其中該癌症係胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
該方法，其中該結腸癌係結腸直腸癌。
該方法，其中該胃癌與血清中的高CEA水平相關。
該方法，其中該肺癌與血清中的高CEA水平相關。
該方法，其中該非小細胞肺癌與血清中的高CEA水平相關。
該治療方法，其中該多特異性抗體以5 mg-1200 mg的範圍投與。
該方法，其中該多特異性抗體以5 mg-1200 mg的範圍投與，每週一次。
該方法，其中該多特異性抗體或抗原結合片段與另一種治療劑組合投與。
該方法，其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
該方法，其中該治療劑係紫杉醇藥劑、來那度胺或5-氮雜胞苷。
該方法，其中該治療劑係抗PD1或抗PDL1抗體。
該方法，其中該抗PD1抗體係替雷利珠單抗（Tislelizumab）。
一種分離的核酸，其編碼該多特異性抗體或抗原結合片段。
一種載體，其包含該核酸。
一種宿主細胞，其包含該核酸或載體。
一種用於產生多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，其包括培養宿主細胞以及從培養物中回收該抗體或抗原結合片段。
在一個實施方式中，該多特異性抗體或其抗原結合片段包含一或多個互補決定區（CDR），該一或多個互補決定區包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 80或SEQ ID NO: 81。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含一或多個互補決定區（HCDR）的重鏈可變區，該一或多個互補決定區包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 80和SEQ ID NO: 81，和/或 (b) 包含一或多個互補決定區（LCDR）的輕鏈可變區，該一或多個互補決定區具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 40。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含三個互補決定區（HCDR）的重鏈可變區，這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 77的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 73或SEQ ID NO: 80的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 81的胺基酸序列的HCDR3，和/或 (b) 包含三個互補決定區（LCDR）的輕鏈可變區，這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 45的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的LCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含三個互補決定區（HCDR）的重鏈可變區，這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 42的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 80的胺基酸序列的HCDR2，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 81的HCDR3，和/或 (b) 包含三個互補決定區（LCDR）的輕鏈可變區，這三個互補決定區係包含SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的LCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3。
在又一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 43的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3。
在又一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 67的HCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 67的HCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 43的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3； (ii)     重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3； (iii)    重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3；或 (iv)    重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3； (ii)     重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3； (iii)    重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3；或 (iv)    重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
在一個實施方式中，本揭露的抗體或其抗原結合片段包含：(a) 重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86中的任一個至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；和/或 (b) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49中的任一個至少95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在另一個實施方式中，本揭露的多特異性抗體或其抗原結合片段包含：(a) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86的胺基酸序列或在SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86的胺基酸序列中包含一個、兩個或三個胺基酸取代的胺基酸序列；和/或 (b) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49的胺基酸序列或在SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 49的胺基酸序列中包含一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸取代的胺基酸序列。在另一個實施方式中，該等胺基酸取代係保守胺基酸取代。
在一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 84的VH； (ii)     包含SEQ ID NO: 86的VH； (iii)    包含SEQ ID NO: 75的VH； (iv)    包含SEQ ID NO: 70的VH；或 (v)     包含SEQ ID NO: 60的VH。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 31的VH和包含SEQ ID NO: 32的VL；以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 84的VH； (ii)     包含SEQ ID NO: 86的VH； (iii)    包含SEQ ID NO: 75的VH； (iv)    包含SEQ ID NO: 70的VH；或 (v)     包含SEQ ID NO: 60的VH。
在另一個實施方式中，該多特異性抗體或抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 48的VH和包含SEQ ID NO: 49的VL，以及第二抗原結合結構域，該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 84的VH； (ii)     包含SEQ ID NO: 86的VH； (iii)    包含SEQ ID NO: 75的VH； (iv)    包含SEQ ID NO: 70的VH；或 (v)     包含SEQ ID NO: 60的VH。
在一個實施方式中，本揭露的多特異性抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型。在更特定的實施方式中，本揭露的抗體包含野生型人IgG1（也稱為人IgG1wt或huIgG1）或IgG2的Fc結構域。在另一個實施方式中，本揭露的抗體包含具有S228P和/或R409K取代（根據EU編號系統）的人IgG4的Fc結構域。
在一個實施方式中，本揭露的多特異性抗體以1 × 10 -6M至1 × 10 -10M的結合親和力（K D）結合CEA。在另一個實施方式中，本揭露的抗體以約1 × 10 -6M、約1 × 10 -7M、約1 × 10 -8M、約1 × 10 -9M或約1 × 10 -10M的結合親和力（K D）結合CEA。
在另一個實施方式中，本揭露的抗人CEA多特異性抗體顯示對石蟹獼猴CEA的跨物種結合活性。
在一個實施方式中，本揭露的抗體具有強的Fc介導的效應子功能。抗體介導對表現CEA的靶細胞的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。
本揭露關於分離的核酸，該等分離的核酸包含編碼多特異性抗體或抗原結合片段的胺基酸序列的核苷酸序列。在一個實施方式中，分離的核酸包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 87的VH核苷酸序列或與SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 87具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，並且編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的VH區。替代性地或另外地，分離的核酸包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 34、或SEQ ID NO: 51的VL核苷酸序列或與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 34、或SEQ ID NO: 51具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，並且編碼本揭露的抗體或抗原結合片段的VL區。
在另一方面，本揭露關於包含CEAxCD137多特異性抗體或其抗原結合片段和視需要藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。
在又一方面，本揭露關於治療受試者的疾病之方法，該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的CEAxCD137多特異性抗體或其抗原結合片段或CEAxCD137多特異性抗體藥物組成物。在另一個實施方式中，待由該抗體或抗原結合片段治療的疾病係癌症。
本揭露關於CEAxCD137多特異性抗體或其抗原結合片段或CEAxCD137多特異性抗體藥物組成物用於治療疾病諸如癌症之用途。
定義
除非在本文件的其他地方具體定義，否則本文所用的所有其他技術和科學術語具有本領域的普通技術者通常理解的含義。
如本文所用，包括所附申請專利範圍，除非上下文另外明確說明，否則如「一個」、「一種」和「該」的單數形式包括它們相應的複數指代。
除非上下文另外明確說明，否則術語「或」意指術語「和/或」並且可與術語「和/或」互換使用。
如本文所用的術語「抗癌劑」係指可用於治療細胞增殖性障礙（如癌症）的任何藥劑，包括但不限於細胞毒性劑、化療劑、放射療法和放射治療劑、靶向性抗癌劑、和免疫治療劑。
術語「癌胚抗原」或「CEA」係指大約70-100 kDa的糖蛋白。CEA也稱為CEACAM5或CD66e。人CEA的胺基酸序列（SEQ ID NO: 88）也可在登錄號P06731或NM_004363.2中找到。
術語「CD137」或「TNFRSF9」、「ILA」或「41BB」係指人CD137的胺基酸序列（SEQ ID NO: 135），其也可在登錄號Q07011（TNR9_HUMAN）或U03397找到。CD137的核酸序列如SEQ ID NO: 136所示。
如本文所用的術語「投與（administration/administering）」和「治療（treating/treatment）」，當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，意指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與該動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞的處理涵蓋試劑與細胞的接觸以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。術語「投與」和「治療」還意指藉由試劑、診斷劑、結合化合物或另一種細胞進行的例如細胞的體外和離體處理。本文中的術語「受試者」包括任何生物，較佳的是動物，更較佳的是哺乳動物（例如，大鼠、小鼠、狗、貓、兔），最較佳的是人。在一方面，治療任何疾病或障礙係指改善該疾病或障礙（即，減緩或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展）。在另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指緩解或改善至少一個身體參數，包括患者可能無法辨別的那些。在又另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指在身體上（例如，可辨別症狀的穩定化）、在生理上（例如，身體參數的穩定化）或兩者上調節疾病或障礙。在又另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指預防或延遲疾病或障礙的發作或發展或進展。
在本揭露的上下文中，術語「受試者」係哺乳動物，例如，靈長類動物，較佳的是高等靈長類動物，例如人（例如，患有本文所述之障礙或處於患上本文所述之障礙的風險中的患者）。
如本文所用的術語「親和力」係指抗體與抗原之間相互作用的強度。在抗原內，抗體的可變區通過非共價力與抗原在許多位點相互作用。通常，相互作用越多，親和力越強。
如本文所用的術語「抗體」係指免疫球蛋白家族的多肽，其可以非共價地、可逆地和以特異性方式結合相應的抗原。例如，天然存在的IgG抗體係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區（本文縮寫為VH）和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文縮寫為VL或Vκ）和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR），其間插有更保守的區域，稱為框架區（FR）。每個VH和VL由從胺基末端到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個框架區（FR）構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）以及經典補體系統的第一組分（Clq））的結合。
術語「抗體」包括但不限於單株抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和抗獨特型（抗Id）抗體。抗體可為任何同種型/類別（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）或亞類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）。
在一些實施方式中，抗CEA抗體包含至少一個抗原結合位點，至少一個可變區。在一些實施方式中，抗CEA抗體包含來自本文所述CEA抗體的抗原結合片段。在一些實施方式中，抗CEA抗體係分離的或重組的。
在一些實施方式中，抗CD137抗體包含至少一個抗原結合位點，至少一個可變區。在一些實施方式中，抗CD137抗體包含來自本文所述之CD137抗體的抗原結合片段。在一些實施方式中，抗CD137抗體係分離的或重組的。
本文中的術語「單株抗體」或「mAb」或「Mab」係指基本上同質的抗體的群體，即，除了可能少量存在的可能天然發生的突變外，該群體中包含的抗體分子在胺基酸序列上係相同的。相比之下，常規（多株）抗體製劑典型地包括在其可變結構域中具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，特別地其互補決定區（CDR），它們通常對不同的表位具有特異性。修飾語「單株」指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特徵並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。可以藉由熟悉該項技術者已知的方法獲得單株抗體（mAb）。參見，例如Kohler等人, Nature [自然] 1975 256:495-497；美國專利案號4,376,110；Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY [分子生物學現代方法] 1992；Harlow等人, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL [抗體：實驗室手冊], Cold spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室] 1988；以及Colligan等人, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY [當代免疫學方案] 1993。本文揭露的抗體可為任何免疫球蛋白類別（包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA），及其任何亞類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）。產生單株抗體的融合瘤可以在體外或在體內培養。高效價的單株抗體可以在體內產生中獲得，其中將來自單個融合瘤的細胞腹膜內注射到小鼠中，例如原始引發的Balb/c小鼠，以產生含有高濃度所需抗體的腹水。可以使用熟悉該項技術者熟知的柱層析方法從這樣的腹水，或從培養上清液中純化同種型IgM或IgG的單株抗體。
通常，基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體包括兩對相同的多肽鏈，每對具有一條「輕鏈」（約25 kDa）和一條「重鏈」（約50-70 kDa）。每條鏈的胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可以定義為主要負責效應子功能的恒定區。典型地，人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。此外，人重鏈典型地分類為α、δ、ε、γ或μ，並且分別將抗體的同種型定義為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區藉由約12個或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈還包括約10個以上胺基酸的「D」區。
每個輕鏈/重鏈（VL/VH）對的可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結合位點通常在一級序列中係相同的。
典型地，重鏈和輕鏈的可變結構域包含三個高變區，也稱為「互補決定區（CDR）」，其位於相對保守的框架區（FR）之間。CDR通常由框架區對齊，使得能夠結合特異性表位。一般而言，從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈可變結構域兩者都包含FR-1（或FR1）、CDR-1（或CDR1）、FR-2（FR2）、CDR-2（CDR2）、FR-3（或FR3）、CDR-3（CDR3）和FR-4（或FR4）。CDR和框架區的位置可以使用本領域熟知的多種定義確定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT（參見，例如Johnson等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:205-206 (2001)；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 196:901-917 (1987)；Chothia等人, Nature [自然], 342:877-883 (1989)；Chothia等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 273:927-748 (1997)）、ImMunoGenTics（IMGT）編號（Lefranc, M.-P., The Immunologist [免疫學者], 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P.等人, Dev. Comp.Immunol.[發育與比較免疫學], 27, 55-77 (2003)（「IMGT」編號方案））。抗原結合位點的定義還在以下文獻中描述：Ruiz等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 28:219-221 (2000)；和Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:207-209 (2001)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 262:732-745 (1996)；和Martin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 86:9268-9272 (1989)；Martin等人, Methods Enzymol. [酶學方法], 203:121-153 (1991)；和Rees等人, 在Sternberg M. J. E.（編）, Protein Structure Prediction [蛋白質結構預測], Oxford University Press [牛津大學出版社], 牛津, 141-172 (1996)中。例如，根據Kabat，重鏈可變結構域（VH）中的CDR胺基酸殘基編號為31-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）；並且輕鏈可變結構域（VL）中的CDR胺基酸殘基編號為24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）。根據Chothia，VH中的CDR胺基酸編號為26-32（HCDR1）、52-56（HCDR2）和95-102（HCDR3）；VL中的胺基酸殘基編號為26-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和91-96（LCDR3）。藉由結合Kabat和Chothia的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）以及人VL中的胺基酸殘基24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）組成。根據IMGT，VH中的CDR胺基酸殘基編號為約26-35（HCDR1）、51-57（HCDR2）和93-102（HCDR3），VL中的CDR胺基酸殘基編號為約27-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和89-97（LCDR3）（編號根據Kabat）。根據IMGT，可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定抗體的CDR區。
術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「CDR」（例如輕鏈可變結構域中的LCDR1，LCDR2和LCDR3以及重鏈可變結構域中的HCDR1，HCDR2和HCDR3）的胺基酸殘基。參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], 第5版 Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [國立衛生研究院], 貝塞斯達, 馬里蘭州（藉由序列定義抗體的CDR區）；還參見Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917（藉由結構定義抗體的CDR區）。術語「框架」或「FR」殘基意指除了本文定義為CDR殘基的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
除非另外說明，否則「抗原結合片段」係指抗體的抗原結合片段，即保留與全長抗體結合的抗原特異性結合的能力的抗體片段，例如保留一或多個CDR區的片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如，單鏈Fv（ScFv））；奈米抗體以及從抗體片段形成的多特異性抗體。
如本文所用，抗體「特異性結合」靶蛋白，係指與其他蛋白相比，抗體表現出優先結合靶蛋白，但這種特異性不需要絕對的結合特異性。在描述抗原（例如蛋白質）與抗體或抗原結合抗體片段之間的相互作用的上下文中使用的抗體「特異性結合」或「選擇性結合」係指決定抗原在蛋白質和其他生物製劑的異質群體中（例如在生物樣本、血液、血清、血漿或組織樣本中）的存在的結合反應。因此，在某些指定的免疫測定條件下，抗體或其抗原結合片段與特定抗原特異性結合係背景水平的至少兩倍，並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。在一方面，在指定的免疫測定條件下，抗體或其抗原結合片段與特定抗原的特異性結合係背景結合水平的至少十（10）倍，並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。
如本文所用的「抗原結合結構域」包含至少三個CDR並特異性結合表位。多特異性抗體（例如雙特異性抗體）的「抗原結合結構域」包含特異性結合第一表位的第一抗原結合結構域和也包含特異性結合第二表位的至少三個CDR的第二抗原結合結構域。多特異性抗體可為雙特異性抗體、三特異性抗體、四特異性抗體等，具有針對每個特定表位的抗原結合結構域。多特異性抗體可為多價抗體（例如，雙特異性四價抗體），其包含多個抗原結合結構域，例如特異性結合第一表位的2、3、4或更多個抗原結合結構域和特異性結合第二表位的2、3、4或更多個抗原結合結構域。
本文中的術語「人抗體」意指僅包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細胞或源自小鼠細胞的融合瘤中產生，人抗體可以含有鼠碳水化合物鏈。類似地，「小鼠抗體」或「大鼠抗體」意指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。
術語「人源化」或「人源化抗體」意指含有來自非人（例如鼠）抗體以及人抗體的序列的抗體形式。此類抗體含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體將包含基本上至少一個、並且典型地兩個可變結構域的全部，其高變環的全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的那些，並且FR的全部或基本上全部係人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還將視需要包含免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。當有必要區分人源化抗體與親本齧齒動物抗體時，將前綴「hum」、「hu」、「Hu」或「h」添加到抗體殖株名稱中。人源化形式的齧齒動物抗體會通常包含親本齧齒動物抗體的相同CDR序列，但是可包括某些胺基酸取代以增加親和力，增加人源化抗體的穩定性，除去翻譯後修飾或出於其他原因。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或亞序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知可變區胺基酸序列相比，其與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高確定的胺基酸序列同一性。相應的人種系序列也可以指與所有其他評估的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或亞序列。相應的人種系序列可以僅是框架區，僅互補決定區，框架和互補決定區，可變區段（如上定義），或包含可變區的序列或亞序列的其他組合。可以使用本文所述之方法確定序列同一性，例如使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。此外，如果抗體含有恒定區，則恒定區也衍生自此類人序列，例如人種系序列，或突變形式的人種系序列或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗體，例如Knappik等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 296:57-86, 2000中所述。
術語「平衡解離常數（K D，M）」係指解離速率常數（kd，時間 -1）除以締合速率常數（ka，時間 -1，M -l）。平衡解離常數可以使用本領域任何已知的方法測量。本揭露的抗體通常將具有小於約10 -7或10 -8M，例如小於約10 -9M或10 -10M，在一些方面，小於約10 -11M、10 -12M或10 -13M的平衡解離常數。
本文中的術語「癌症」或「腫瘤」具有如本領域理解的最廣泛的含義，並且係指哺乳動物中典型地以不受調控的細胞生長為特徵的生理病症。在本揭露的上下文中，癌症不限於某個類型或位置。
在本揭露的上下文中，當提及胺基酸序列時，術語「保守取代」意指用新胺基酸取代原始胺基酸，該新胺基酸基本上不改變抗體或片段的化學、物理和/或功能性質，例如其與CEA或CD137的結合親和力。具體地，胺基酸的常見保守取代係本領域熟知的。
如本文所用的術語「杵臼（knob-into-hole）」技術係指胺基酸在體外或體內藉由在它們相互作用的介面上將空間突起（杵）引入一個多肽並將穴袋或空腔（臼）引入另一個多肽從而引導將兩條多肽配對在一起。例如，杵臼已經被引入了抗體的Fc:Fc結合介面、C L:C HI介面、或V H/V L介面（參見例如US 2011/0287009、US 2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人, 1997, Protein Science [蛋白質科學] 6:781-788）。在一些實施方式中，杵臼確保了多特異性抗體製備期間兩個不同重鏈正確配對在一起。例如，在其Fc區中具有杵臼胺基酸的多特異性抗體還可包含與每個Fc區連接的單個可變結構域，或者進一步包含與相似或不同輕鏈可變結構域配對的不同重鏈可變結構域。杵臼技術還可在VH或VL區中使用，以確保正確配對。
如本文在「杵臼」技術的上下文中所用的術語「杵」係指向多肽在該多肽與另一多肽相互作用的介面處引入突起（杵）的胺基酸改變。在一些實施方式中，另一多肽具有臼突變。
如本文在「杵臼」的上下文中所用的術語「臼」係指向多肽在該多肽與另一多肽相互作用的介面處引入穴袋或空腔（臼）的胺基酸改變。在一些實施方式中，另一多肽具有杵突變。
適用於確定百分比序列同一性和序列相似性的演算法之實例係BLAST演算法，其分別描述於Altschul等人, Nuc. Acids Res.[核酸研究] 25:3389-3402, 1977; 和Altschul等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 215:403-410, 1990中。用於進行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）揭露獲得。此演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中短字長W鑒定高得分序列對（HSP），當與資料庫序列中相同字長比對時，其匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值。該等初始鄰域字命中作為開始搜索以找到包含它們的較長HSP的值。字命中沿著每個序列在兩個方向上延伸，直到累積比對得分可以增加為止。對於核苷酸序列，使用參數M（一對匹配殘基的獎勵得分；始終 ＞ 0）和N（錯配殘基的罰分；始終 ＜ 0）來計算累積得分。對於胺基酸序列，使用得分矩陣來計算累積得分。在以下情況下，將停止字命中在每個方向上的延伸：累積比對得分從其最大實現值下降了數量X；由於一或多個負得分殘基比對的累積，累積得分趨於零或更低；或者到達任一序列的末端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式（對於核苷酸序列）默認使用字長（W）11，期望值（E）10，M = 5，N = -4並比較兩條股。對於胺基酸序列，BLAST程式預設使用字長3，期望值（E）10和BLOSUM62得分矩陣（參見Henikoff和Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報] 89: 10915）比對（B）50，期望值（E）10，M = 5，N = -4並比較兩條股。
BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析（參見例如Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報] 90:5873-5787, 1993）。BLAST演算法提供的一種相似性度量係最小總和概率（P(N)），其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中最小總和概率小於約0.2，更較佳的是小於約0.01，最較佳的是小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比還可使用以下的演算法來確定：E. Meyers和W. Miller, Comput. Appl. Biosci. [生物科學中的電腦應用] 4: 11-17, (1988)，其已併入ALIGN程式（2.0版本），使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。此外，可以使用以下確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分比：Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:444-453 (1970) 的演算法，其已併入GCG套裝軟體中的GAP程式中，使用BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，並且長度權重為1、2、3、4、5或6。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且係指單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或經修飾的主鏈殘基或連接的核酸，它們係合成的，天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以與參考核苷酸相似的方式代謝。此類類似物之實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA）。
在核酸的上下文中，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個多核苷酸（例如DNA）區段之間的功能關係。典型地，它係指轉錄調節序列與轉錄序列的功能關係。例如，啟動子或強化子序列如果在合適的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則可操作地連接至編碼序列。通常，可操作地連接至轉錄序列的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調節序列（如強化子）不需要在物理上鄰接或緊鄰它們增強其轉錄的編碼序列。
在一些方面，本揭露提供了組成物，例如藥學上可接受的組成物，其包含與至少一種藥學上可接受的賦形劑一起配製的如本文所述之抗CEAxCD137多特異性抗體。如本文所用，術語「藥學上可接受的賦形劑」包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。賦形劑可適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊柱或表皮投與（例如藉由注射或輸注）。
本文揭露的組成物可為多種形式。該等包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液（例如可注射和輸注溶液）、分散液或懸浮液、脂質體和栓劑。合適的形式取決於預期的投與方式和治療應用。典型的合適組成物係可注射或輸注溶液的形式。一種合適的投與方式係腸胃外（例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌內）。在一些實施方式中，該抗體藉由靜脈內輸注或注射來投與。在某些實施方式中，該抗體藉由肌內或皮下注射來投與。
如本文所用的術語「治療有效量」係指當投與於受試者以治療疾病、或疾病或障礙的至少一種臨床症狀時，足以影響該疾病、障礙或症狀的治療的抗體之量。「治療有效量」可以隨抗體，疾病，障礙，和/或疾病或障礙的症狀，疾病、障礙、和/或疾病或障礙的症狀的嚴重程度，待治療的受試者的年齡，和/或待治療的受試者的體重而變化。在任何給定情況下的合適量對於熟悉該項技術者而言係顯而易見的，或者可以藉由常規實驗確定。在組合療法的情況下，「治療有效量」係指用於有效治療疾病、障礙或病症的組成對象的總量。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本揭露中所述之治療病症或障礙。這種投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑。這種投與也涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器（例如，膠囊、粉末和液體）中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前重構或稀釋到所需劑量。此外，這種投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間以順序方式使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下，治療方案將在治療本文所述之病症或障礙方面提供藥物組合的有益作用。
如本文所用，短語「與…組合」意指將抗CEAxCD137多特異性抗體在投與另外的治療劑的同時、就在該投與前或就在該投與後投與於受試者。在某些實施方式中，將抗CEAxCD137多特異性抗體作為與另外的治療劑的共同配製物來投與。
本揭露提供了抗體、抗原結合片段和抗CEAxCD137多特異性抗體。此外，本揭露提供了具有所需的藥物動力學特徵和其他期望的屬性的抗體，並且因此可用於降低癌症的可能性或治療癌症。本揭露進一步提供了包含抗體的藥物組成物以及製備和使用此類藥物組成物用於預防和治療癌症和相關障礙之方法。 抗CEA抗體
本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或其抗原結合片段。本揭露的抗體或抗原結合片段包括但不限於如下所述產生的抗體或其抗原結合片段。
本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 14、31或48的胺基酸序列（表1）的VH結構域。本揭露還提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有表1中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的HCDR。在一方面，本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含（或替代性地，由其組成）具有表1中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個HCDR。
本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 15、32或49的胺基酸序列（表1）的VL結構域。本揭露還提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有表1中列出的LCDR中的任一個的胺基酸序列的LCDR。具體地，本揭露提供了特異性結合CEA的抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包含（或替代性地，由其組成）具有表1中列出的LCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個LCDR。
本揭露的其他抗體或其抗原結合片段包括已被改變，但在CDR區中與表1中揭露的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的胺基酸。在一些方面，其包括胺基酸改變，其中當與表1中描述的序列中描繪的CDR區相比時，在CDR區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
本揭露的其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已被改變，但與表1中描述的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的那些。在一些方面，其包括胺基酸序列的改變，其中當與表1中描述的序列中描繪的可變區相比時，在可變區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸，同時保持基本上相同的治療活性。
本揭露還提供了編碼特異性結合CEA的抗體的VH、VL、全長重鏈和全長輕鏈的核酸序列。可以優化此類核酸序列以在哺乳動物細胞中表現。 [表1]：胺基酸和核酸序列
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA113K (IMGT) SEQ ID NO: 1 HCDR1 (IMGT) GYIFTSYY
SEQ ID NO: 2 HCDR2 (IMGT) INPQTGKT
SEQ ID NO: 3 HCDR3 (IMGT) AREYGNYNYPLDY
SEQ ID NO: 4 LCDR1 (IMGT) ENQYGY
SEQ ID NO: 5 LCDR2 (IMGT) NY
SEQ ID NO: 6 LCDR3 (IMGT) QHHLGTPYT
BGA113K (Kabat) SEQ ID NO: 7 HCDR1 (Kabat) SYYLH
SEQ ID NO: 8 HCDR2 (Kabat) YINPQTGKTSYAQKFQG
SEQ ID NO: 9 HCDR3 (Kabat) EYGNYNYPLDY
SEQ ID NO: 10 LCDR1 (Kabat) RASENQYGYLA
SEQ ID NO: 11 LCDR2 (Kabat) NYKNLVE
SEQ ID NO: 6 LCDR3 (Kabat) QHHLGTPYT
BGA113K (Chothia) SEQ ID NO: 12 HCDR1 (Chothia) GYIFTSY
SEQ ID NO: 13 HCDR2 (Chothia) NPQTGK
SEQ ID NO: 9 HCDR3 (Chothia) EYGNYNYPLDY
SEQ ID NO: 10 LCDR1 (Chothia) RASENQYGYLA
SEQ ID NO: 11 LCDR2 (Chothia) NYKNLVE
SEQ ID NO: 6 LCDR3 (Chothia) QHHLGTPYT
BGA113K SEQ ID NO: 14 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 15 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 16 VH DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO: 17 VL DNA GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
BGA190 (IMGT) SEQ ID NO: 18 HCDR1 (IMGT) GFTFSSFG
SEQ ID NO: 19 HCDR2 (IMGT) ISIGSDII
SEQ ID NO: 20 HCDR3 (IMGT) TRRSYRSYWYFDV
SEQ ID NO: 21 LCDR1 (IMGT) ENIYSY
SEQ ID NO: 22 LCDR2 (IMGT) NA
SEQ ID NO: 23 LCDR3 (IMGT) QHHFLSPWM
BGA190 (Kabat) SEQ ID NO: 24 HCDR1 (Kabat) SFGMH
SEQ ID NO: 25 HCDR2 (Kabat) YISIGSDIIYYADTVKG
SEQ ID NO: 26 HCDR3 (Kabat) RSYRSYWYFDV
SEQ ID NO: 27 LCDR1 (Kabat) RTSENIYSYLA
SEQ ID NO: 28 LCDR2 (Kabat) NAKTLAE
SEQ ID NO: 23 LCDR3 (Kabat) QHHFLSPWM
BGA190 (Chothia) SEQ ID NO: 29 HCDR1 (Chothia) GFTFSSF
SEQ ID NO: 30 HCDR2 (Chothia) SIGSDI
SEQ ID NO: 26 HCDR3 (Chothia) RSYRSYWYFDV
SEQ ID NO: 27 LCDR1 (Chothia) RTSENIYSYLA
SEQ ID NO: 28 LCDR2 (Chothia) NAKTLAE
SEQ ID NO: 23 LCDR3 (Chothia) QHHFLSPWM
BGA190 SEQ ID NO: 31 VH DVQLVESGGGLVQPGGSRELSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPERGLEWVAYISIGSDIIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAVYYCTRRSYRSYWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 32 VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYSYLAWYQQKQGKSPHLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKIISLQPEDFGTYYCQHHFLSPWMFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 33 VH DNA GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGGAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAGGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTATTGGCAGTGATATCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACAAGAAGGTCTTATAGGTCCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 34 VL DNA GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAACAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCATCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAGGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCATCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTCAGCATCATTTTCTTAGTCCGTGGATGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
BGA288 (IMGT) SEQ ID NO: 35 HCDR1 (IMGT) GYTFTDYN
SEQ ID NO: 36 HCDR2 (IMGT) IGPNYGGT
SEQ ID NO: 37 HCDR3 (IMGT) ARRGSIPRAVDY
SEQ ID NO: 38 LCDR1 (IMGT) QDIHNY
SEQ ID NO: 39 LCDR2 (IMGT) RA
SEQ ID NO: 40 LCDR3 (IMGT) LQYDEFPYT
BGA288 (Kabat) SEQ ID NO: 41 HCDR1 (Kabat) DYNID
SEQ ID NO: 42 HCDR2 (Kabat) DIGPNYGGTIYNQKFKG
SEQ ID NO: 43 HCDR3 (Kabat) RGSIPRAVDY
SEQ ID NO: 44 LCDR1 (Kabat) KASQDIHNYLS
SEQ ID NO: 45 LCDR2 (Kabat) RANRLVD
SEQ ID NO: 40 LCDR3 (Kabat) LQYDEFPYT
BGA288 (Chothia) SEQ ID NO: 46 HCDR1 (Chothia) GYTFTDY
SEQ ID NO: 47 HCDR2 (Chothia) GPNYGG
SEQ ID NO: 43 HCDR3 (Chothia) RGSIPRAVDY
SEQ ID NO: 44 LCDR1 (Chothia) KASQDIHNYLS
SEQ ID NO: 45 LCDR2 (Chothia) RANRLVD
SEQ ID NO: 40 LCDR3 (Chothia) LQYDEFPYT
BGA288 SEQ ID NO: 48 VH EVLLQQSGPELVKPGASVKIFCKASGYTFTDYNIDWVQQSHGKSLEWIGDIGPNYGGTIYNQKFKGKATLTVAKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARRGSIPRAVDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 49 VL DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIHNYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 50 VH DNA GAGGTCCTGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATTTTCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATAGACTGGGTGCAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTGGTCCTAATTATGGTGGTACTATCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGCCAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCGGTAGCATCCCGAGGGCTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 51 VL DNA GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCATAACTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
本揭露提供了結合人CEA的表位的抗體及其抗原結合片段。在某些方面，抗體和抗原結合片段可以結合CEA的相同表位。
本揭露還提供了結合與表1中描述的抗CEA抗體相同的表位的抗體及其抗原結合片段。因此，其他抗體及其抗原結合片段可以基於它們在結合測定中與其他抗體交叉競爭（例如，以統計學顯著的方式競爭性抑制其結合）的能力來鑒定。測試抗體抑制本揭露的抗體及其抗原結合片段結合CEA的能力證明測試抗體可與該抗體或其抗原結合片段競爭結合CEA。不受任何一種理論的束縛，這種抗體可以結合CEA上的與其競爭的抗體或其抗原結合片段相同或相關（例如，在結構上相似或在空間上鄰近）的表位。在某些方面，結合CEA上的與本揭露的抗體或其抗原結合片段相同的表位的抗體係人或人源化單株抗體。這種人或人源化單株抗體可以如本文所述製備和分離。 抗CD137抗體 [表2]：序列
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-7207 (IMGT) SEQ ID NO: 52 HCDR1 (IMGT) GFRLDTTE
SEQ ID NO: 53 HCDR2 (IMGT) IMGISGST
SEQ ID NO: 54 HCDR3 (IMGT) ARVVDSLFDDSAVFDY
BGA-7207 (Kabat) SEQ ID NO: 55 HCDR1 (Kabat) TTEVG
SEQ ID NO: 56 HCDR2 (Kabat) TIMGISGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 57 HCDR3 (Kabat) VVDSLFDDSAVFDY
BGA-7207 (Chothia) SEQ ID NO: 58 HCDR1 (Chothia) GFRLDTT
SEQ ID NO: 59 HCDR2 (Chothia) MGISGS
SEQ ID NO: 57 HCDR3 (Chothia) VVDSLFDDSAVFDY
BGA-7207 SEQ ID NO: 60 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRLDTTEVGWVRQAPGKGLEWVSTIMGISGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVDSLFDDSAVFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 61 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCAGATTGGACACCACCGAAGTAGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCACCATCATGGGTATTAGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCGATTCCCTCTTTGATGACAGCGCCGTTTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-4712 (IMGT) SEQ ID NO: 62 HCDR1 (IMGT) GFMLSAED
SEQ ID NO: 63 HCDR2 (IMGT) ILDFGGST
SEQ ID NO: 64 HCDR3 (IMGT) ARVVYHAGGGVTFDY
BGA-4712 (Kabat) SEQ ID NO: 65 HCDR1 (Kabat) AEDVG
SEQ ID NO: 66 HCDR2 (Kabat) AILDFGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 67 HCDR3 (Kabat) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712 (Chothia) SEQ ID NO: 68 HCDR1 (Chothia) GFMLSAE
SEQ ID NO: 69 HCDR2 (Chothia) LDFGGS
SEQ ID NO: 67 HCDR3 (Chothia) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712 SEQ ID NO: 70 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 71 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-4712-M3 (IMGT) SEQ ID NO: 72 HCDR1 (IMGT) GFTLSAED
SEQ ID NO: 63 HCDR2 (IMGT) ILDFGGST
SEQ ID NO: 64 HCDR3 (IMGT) ARVVYHAGGGVTFDY
BGA-4712-M3 (Kabat) SEQ ID NO: 65 HCDR1 (Kabat) AEDVG
SEQ ID NO: 73 HCDR2 (Kabat) AILDFGGSTYYAESVKG
SEQ ID NO: 67 HCDR3 (Kabat) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712-M3 (Chothia) SEQ ID NO: 74 HCDR1 (Chothia) GFTLSAE
SEQ ID NO: 69 HCDR2 (Chothia) LDFGGS
SEQ ID NO: 67 HCDR3 (Chothia) VVYHAGGGVTFDY
BGA-4712-M3 SEQ ID NO: 75 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 76 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-5623 (IMGT) SEQ ID NO: 77 HCDR1 (IMGT) GFTVSAED
SEQ ID NO: 78 HCDR2 (IMGT) ILDKGGST
SEQ ID NO: 79 HCDR3 (IMGT) ARIVYHAGGGVTFDT
BGA-5623 (Kabat) SEQ ID NO: 65 HCDR1 (Kabat) AEDVG
SEQ ID NO: 80 HCDR2 (Kabat) AILDKGGSTYYAESVKG
SEQ ID NO: 81 HCDR3 (Kabat) IVYHAGGGVTFDT
BGA-5623 (Chothia) SEQ ID NO: 82 HCDR1 (Chothia) GFTVSAE
SEQ ID NO: 83 HCDR2 (Chothia) LDKGGS
SEQ ID NO: 81 HCDR3 (Chothia) IVYHAGGGVTFDT
BGA-5623 SEQ ID NO: 84 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 85 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BGA-7556 SEQ ID NO: 86 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 87 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
本揭露提供了特異性結合CD137的抗體或其抗原結合片段。本揭露的抗體或抗原結合片段包括但不限於如下所述產生的抗體或其抗原結合片段。
本揭露提供了特異性結合CD137的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86的胺基酸序列（表2）的VH結構域。本揭露還提供了特異性結合CD137的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有表2中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的HCDR。在一方面，本揭露提供了特異性結合CD137的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含（或替代性地，由其組成）具有表2中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個HCDR。
本揭露的其他抗體或其抗原結合片段包括已被改變，但在CDR區中與表2中揭露的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的胺基酸。在一些方面，其包括胺基酸改變，其中當與表2中描述的序列中描繪的CDR區相比時，在CDR區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
本揭露的其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已被改變，但與表2中描述的序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%或99%百分比同一性的那些。在一些方面，其包括胺基酸序列的改變，其中當與表2中描述的序列中描繪的可變區相比時，在可變區中改變不超過1、2、3、4或5個胺基酸，同時保持基本上相同的治療活性。
本揭露還提供了編碼特異性結合CD137的抗體的VH、VL、全長重鏈和全長輕鏈的核酸序列。可以優化此類核酸序列以在哺乳動物細胞中表現。
本揭露提供了結合人CD137的表位的抗體及其抗原結合片段。在某些方面，抗體和抗原結合片段可以結合CD137的相同表位。
本揭露還提供了結合與表2中描述的抗CD137抗體相同的表位的抗體及其抗原結合片段。因此，其他抗體及其抗原結合片段可以基於它們在結合測定中與其他抗體交叉競爭（例如，以統計學顯著的方式競爭性抑制其結合）的能力來鑒定。測試抗體抑制本揭露的抗體及其抗原結合片段結合CD137的能力證明測試抗體可與該抗體或其抗原結合片段競爭結合CD137。不受任何一種理論的束縛，這種抗體可以結合CD137上的與其競爭的抗體或其抗原結合片段相同或相關（例如，在結構上相似或在空間上鄰近）的表位。在某些方面，結合CD137上的與本揭露的抗體或其抗原結合片段相同的表位的抗體係人或人源化單株抗體。這種人或人源化單株抗體可以如本文所述製備和分離。 抗CEAxCD137多特異性抗體
在一個實施方式中，如本文所揭露的抗CEA和抗CD137抗體可以摻入抗CEAxCD137多特異性抗體中。抗體分子係多特異性抗體分子，例如，其包含多個抗原結合結構域，其中至少一個抗原結合結構域序列特異性結合作為第一表位的CEA，而第二抗原結合結構域序列特異性結合作為第二表位的CD137。在一個實施方式中，多特異性抗體包含第三、第四或第五抗原結合結構域。在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體。在每個實例中，多特異性抗體包含至少一個抗CEA抗原結合結構域和至少一個抗CD137抗原結合結構域。
在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體。如本文所用，雙特異性抗體僅特異性結合兩種抗原。雙特異性抗體包含特異性結合CEA的第一抗原結合結構域和特異性結合CD137的第二抗原結合結構域。這包括雙特異性抗體，其包含特異性結合作為第一表位的CEA的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域以及特異性結合作為第二表位的CD137的重鏈可變結構域。在另一個實施方式中，雙特異性抗體包含特異性結合CEA的抗體的抗原結合片段和特異性結合CD137的抗原結合片段。包含抗原結合片段的雙特異性抗體、抗原結合片段可為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(ScFv)或scFv。
先前的實驗（Coloma和Morrison Nature Biotech.[自然生物技術] 15: 159-163 (1997)）描述了四價雙特異性抗體，其藉由在lgG3抗丹磺醯基抗體的C末端（CH3-scFv）之後或鉸鏈（鉸鏈-scFv）之後融合編碼單鏈抗丹磺醯基抗體Fv（scFv）的DNA進行工程化。本揭露提供了具有至少兩個抗原結合結構域的多價抗體（例如四價抗體），其可藉由編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表現容易地產生。本文的多價抗體包含三至八個，但較佳的是四個抗原結合結構域，其特異性結合至少兩種抗原。 連接子
還應理解，雙特異性四價抗體的多肽鏈的結構域和/或區可被各種長度的連接子區分開。在一些實施方式中，抗原結合結構域藉由連接子區與彼此CL、CH1、鉸鏈、CH2、CH3或整個Fc區分開。例如，VL1-CL-（連接子）VH2-CH1這種連接子區可以包含隨機分類的胺基酸，或一組受限的胺基酸。此類連接子區可為柔性的或剛性的（參見US 2009/0155275）。
已經藉由以下方式構建了多特異性抗體：使用或不使用柔性連接子基因融合兩種單鏈Fv（scFv）或Fab片段（Mallender等人, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 1994 269:199-206；Mack等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.[美國國家科學院學報] 1995 92:7021-5；Zapata等人, Protein Eng.[蛋白質工程] 1995 8.1057-62），經由二聚化裝置諸如白胺酸拉鍊（Kostelny等人, J. Immunol.[免疫學雜誌] 1992148:1547-53；de Kruif等人J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 1996 271:7630-4）和Ig C/CH1結構域（Muller等人, FEBS Lett.[歐洲生化學會聯合會快報] 422:259-64）；藉由雙抗體（Holliger等人, (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA.[美國國家科學院學報] 1998 90:6444-8；Zhu等人, Bio/Technology (NY) [生物/技術（紐約）] 1996 14:192-6）；Fab-scFv融合（Schoonjans等人, J. Immunol.[免疫學雜誌] 2000 165:7050-7）；以及微型抗體形式（Pack等人, Biochemistry [生物化學] 1992.31:1579-84；Pack等人, Bio/Technology [生物/技術] 1993 11:1271-7）。
本文揭露的雙特異性四價抗體在其一或多個抗原結合結構域、CL結構域、CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域或Fc區之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多個胺基酸殘基的連接子區。在一些實施方式中，胺基酸甘胺酸和絲胺酸包含連接子區內的胺基酸。在另一個實施方式中，連接子可為GS (SEQ ID NO: 317)、GGS (SEQ ID NO: 318)、GSG (SEQ ID NO: 319)、SGG (SEQ ID NO: 320)、GGG (SEQ ID NO: 321)、GGGS (SEQ ID NO: 322)、SGGG (SEQ ID NO: 323)、GGGGS (SEQ ID NO: 324)、GGGGSGS (SEQ ID NO: 325)、GGGGSGS (SEQ ID NO: 326)、GGGGSGGS (SEQ ID NO: 327)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 328)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 329)、AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 330)、AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 331)、AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 332)、SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 333)、AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 334)、SAKTTP (SEQ ID NO: 335)、SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 336)、RADAAP (SEQ ID NO: 337)、RADAAPTVS (SEQ ID NO: 338)、RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 339)、RADAAAA(G 4S) 4(SEQ ID NO: 340)、SAKTTP (SEQ ID NO: 341)、SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 342)、SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 343)、ADAAP (SEQ ID NO: 344)、ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 345)、TVAAP (SEQ ID NO: 346)、TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 347)、QPKAAP (SEQ ID NO: 348)、QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 349)、AKTTPP (SEQ ID NO: 350)、AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 351)、AKTTAP (SEQ ID NO: 352)、AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 353)、ASTKGP (SEQ ID NO: 354)、ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 355)、GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 356)、GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 357)和GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 358)或它們的任何組合（參見WO 2007/024715）。 二聚化特異性胺基酸
在一個實施方式中，多價抗體包含至少一個二聚化特異性胺基酸改變。二聚化特異性胺基酸改變導致「突起到孔中」相互作用，並增加正確多價抗體的組裝。二聚化特異性胺基酸可以在CH1結構域或CL結構域或其組合內。用於將CH1結構域與其他CH1結構域（CH1-CH1）和CL結構域與其他CL結構域（CL-CL）配對的二聚化特異性胺基酸至少可以在WO 2014082179、WO 2015181805家族和WO 2017059551的揭露內容中找到。二聚化特異性胺基酸也可以在Fc結構域內，並且可以與CH1或CL結構域內的二聚化特異性胺基酸組合。在一個實施方式中，本揭露提供了包含至少一個二聚化特異性胺基酸對的雙特異性抗體。 對Fc區框架的進一步改變
在其他方面，藉由用不同的胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應子功能。例如，可以用不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸，使得抗體對效應配體具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結合能力。親和力改變的效應子配體可為例如Fc受體或補體的C1組分。此方法描述於例如Winter等人的美國專利案號5,624,821和5,648,260中。
在另一方面，可以用一或多個不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸殘基，使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性（CDC）。此方法描述於例如Idusogie等人的美國專利案號6,194,551中。
另一方面，改變一或多個胺基酸殘基從而改變抗體固定補體的能力。此方法描述於例如Bodmer等人的公開WO 94/29351中。在特定的方面，本揭露的抗體或其抗原結合片段的一或多個胺基酸被IgG1亞類和κ同種型的一或多個同種異型胺基酸殘基替代。同種異型胺基酸殘基還包括但不限於IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈恒定區以及κ同種型的輕鏈恒定區，如Jefferis等人, MAbs. [單株抗體] 1:332-338 (2009)所述。
在另一方面，藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的能力和/或增加抗體對Fcγ受體的親和力。此方法描述於例如Presta的公開WO 00/42072中。此外，已經繪製了在人IgG1上與FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點，並且已經描述了具有改善的結合的變體（參見Shields等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 276:6591-6604, 2001）。
在另一方面，多特異性抗體的糖基化被修飾。例如，可以製備無糖基化抗體（即，抗體缺乏或具有降低的糖基化）。例如，可以改變糖基化以增加抗體對「抗原」的親和力。這種碳水化合物修飾可以藉由例如改變抗體序列內的一或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一或多個胺基酸取代，其導致消除一或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。此方法描述於例如Co等人的美國專利案號5,714,350和6,350,861中。
另外地或替代性地，可以製備具有改變的糖基化類型的抗體，如具有減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。已經證明此類改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變的糖基化途徑的宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變的糖基化途徑的細胞已經在本領域中描述並且可以用作宿主細胞，在其中表現重組抗體從而產生具有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破壞的FUT8基因的細胞系，其編碼岩藻糖基轉移酶，使得在這種細胞系中表現的抗體表現出低岩藻糖基化。Presta的公開WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其具有降低的將岩藻糖連接至Asn（297）-連接的碳水化合物的能力，也導致在該宿主細胞中表現的抗體的低岩藻糖基化（也參見Shields等人, (2002) J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 277:26733-26740）。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表現糖蛋白修飾的糖基轉移酶（例如，β(1,4)-N乙醯胺基葡萄糖轉移酶III（GnTIII））的細胞系，使得在工程化的細胞系中表現的抗體表現出增加的二等分GlcNac結構，這導致抗體的ADCC活性增加（還參見Umana等人, Nat. Biotech.[自然生物技術] 17:176-180, 1999）。
在另一方面，如果所需的ADCC降低，許多先前的報導顯示人抗體亞類IgG4僅具有適度的ADCC並且幾乎沒有CDC效應子功能（Moore G L等人, 2010 MAbs [單株抗體], 2:181-189）。然而，發現天然IgG4在應激條件下（如在酸性緩衝劑中或在升高的溫度下）較不穩定（Angal, S. 1993 Mol Immunol [分子免疫學], 30:105-108；Dall'Acqua, W.等人, 1998 Biochemistry [生物化學], 37:9266-9273；Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19）。降低的ADCC可以藉由將抗體可操作地連接至用降低FcγR結合或C1q結合活性的改變的組合工程化的IgG4 Fc，從而降低或消除ADCC和CDC效應子功能來實現。考慮到抗體作為生物藥物的物理化學性質，IgG4的較不期望的固有特性之一係其兩條重鏈在溶液中動態分離以形成半抗體，這導致通過稱為「Fab臂交換」的過程在體內產生雙特異性抗體（Van der Neut Kolfschoten M等人, 2007 Science [科學], 317:1554-157）。228位（EU編號系統）絲胺酸突變為脯胺酸表現出對IgG4重鏈分離的抑制作用（Angal, S. 1993 Mol Immunol [分子免疫學], 30:105-108；Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19）。據報導，鉸鏈區和γFc區中的一些胺基酸殘基對抗體與Fcγ受體的相互作用具有影響（Chappel S M等人, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報], 88:9036-9040；Mukherjee, J.等人, 1995 FASEB J [美國實驗生物學學會聯合會雜誌], 9:115-119；Armour, K. L.等人, 1999 Eur J Immunol [歐洲免疫學雜誌], 29:2613-2624；Clynes, R. A.等人, 2000 Nature Medicine [自然醫學], 6:443-446；Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol [免疫學年鑒], 25:21-50）。此外，在人群中一些罕見的IgG4同種型也可引起不同的物理化學特性（Brusco, A.等人, 1998 Eur J Immunogenet [歐洲免疫遺傳學雜誌], 25:349-55；Aalberse等人, 2002 Immunol [免疫學], 105:9-19）。為了產生具有低ADCC和CDC但具有良好穩定性的多特異性抗體，可以修飾人IgG4的鉸鏈區和Fc區並引入許多改變。該等經修飾的IgG4 Fc分子可在SEQ ID NO: 83-88，Li等人的美國專利案號8,735,553中找到。 抗體產生
抗體及其抗原結合片段可藉由本領域已知的任何方法產生，包括但不限於抗體四聚體的重組表現、化學合成和酶消化，而全長單株抗體可藉由例如融合瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何合適的宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本揭露還提供了編碼本文所述抗體的多核苷酸，例如編碼包含本文所述之互補決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段的多核苷酸。在一些方面，編碼重鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 85和SEQ ID NO: 87組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些方面，編碼輕鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 17、34或51組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
本揭露的多核苷酸可以編碼抗CEAxCD137抗體的可變區序列。它們還可以編碼抗體的可變區和恒定區。一些多核苷酸序列編碼包含示例性抗CEAxCD137抗體的重鏈和輕鏈的可變區的多肽。
本揭露還提供了用於產生抗CEAxCD137抗體的表現載體和宿主細胞。表現載體的選擇取決於表現載體的預期宿主細胞。通常，表現載體含有可操作地連接至編碼抗CEAxCD137抗體鏈或抗原結合片段的多核苷酸的啟動子和其他調節序列（例如，強化子）。在一些方面，除了在誘導條件的控制下，使用誘導型啟動子來防止插入序列的表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除啟動子外，其他調節元件也可為有效表現抗CEAxCD137抗體或抗原結合片段所需要或期望的。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，藉由包含適合於使用中的細胞系統的強化子，可以提高表現效率（參見，例如，Scharf等人, Results Probl. Cell Differ. [細胞分化中的結果和問題] 20:125, 1994；以及Bittner等人, Meth. Enzymol. [酶學方法], 153:516, 1987）。例如，SV40強化子或CMV強化子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
用於攜帶並表現抗CEAxCD137抗體鏈的宿主細胞可為原核或真核的。大腸桿菌係一種可用於選殖和表現本揭露多核苷酸的原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），和其他腸桿菌科（enterobacteriaceae），如沙門氏菌屬（Salmonella）、沙雷氏菌屬（Serratia）和各種假單胞菌屬（Pseudomonas）物種。在該等原核宿主中，還可以製備表現載體，其典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列（例如複製起點）。此外，將存在任何數量的多種熟知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色胺酸（trp）啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視需要用操縱子序列控制表現，並具有核糖體結合位點序列等，用於啟動和完成轉錄和翻譯。其他微生物如酵母也可用於表現抗CEAxCD137抗體。也可以使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體的組合。在其他方面，哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本揭露的抗CEAxCD137抗體。例如，它們可為表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞系或攜帶外源性表現載體的哺乳動物細胞系。該等包括任何正常死亡或正常或異常永生化動物或人細胞。例如，已經開發了幾種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HEK 293細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽一般在例如Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y.[從基因到殖株，紐約VCH出版社，紐約市], 1987中討論。用於哺乳動物宿主細胞的表現載體可以包括表現控制序列，如複製起點、啟動子和強化子（參見例如Queen等人, Immunol. Rev. [免疫學綜述] 89:49-68, 1986）和必要的加工資訊位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可為組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的、和/或可調控的或可調節的。有用的啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子（如人立即早期CMV啟動子）、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-強化子組合。 雙特異性抗體的產生
工程化異二聚體抗體Fc結構域的現行標準係杵臼（KiH）設計，其在核心CH3結構域介面引入突變。所得異二聚體具有降低的CH3熔融溫度（69°C或更低）。然而，ZW異二聚體Fc設計具有81.5°C的熱穩定性，這與野生型CH3結構域相當。 檢測和診斷方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用，包括但不限於檢測CEA之方法。在一方面，抗體或抗原結合片段可用於檢測生物樣本中CEA的存在。如本文所用的術語「檢測」包括定量或定性檢測。在某些方面，生物樣本包括細胞或組織。在其他方面，此類組織包括相對於其他組織以更高水平表現CEA的正常和/或癌性組織。
在一方面，本揭露提供了檢測生物樣本中CEA的存在之方法。在某些方面，該方法包括在允許抗體與抗原結合的條件下，將生物樣本與抗CEAxCD137抗體接觸，並檢測抗體與抗原之間是否形成複合物。生物樣本可以包括但不限於尿液、組織、痰或血液樣本。
還包括診斷與CEA表現相關的障礙之方法。在某些方面，該方法包括使測試細胞與抗CEAxCD137抗體接觸；藉由檢測抗CEAxCD137抗體與CEA多肽的結合來測定測試細胞表現的CEA的表現水平（定量或定性）；以及將測試細胞的表現水平與對照細胞（例如，與測試細胞相同組織來源的正常細胞或非CEA表現細胞）中的CEA表現水平進行比較，其中與對照細胞相比，測試細胞中較高水平的CEA表現表明存在與CEA表現相關的障礙。 治療方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用，包括但不限於治療CEA相關障礙或疾病之方法。在一方面，CEA相關障礙或疾病係癌症。
在一方面，本揭露提供了治療癌症之方法。在某些方面，該方法包括向有需要的患者投與有效量的抗CEAxCD137抗體或抗原結合片段。癌症可包括但不限於胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
本文揭露的抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式投與，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要用於局部治療、病灶內投與。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可以藉由任何合適的途徑，例如藉由注射，如靜脈內或皮下注射，這部分取決於投與是短暫的還是長期的。本文考慮了多種給藥方案，包括但不限於單次投與或在不同時間點的多次投與、推注投與、和脈衝輸注。
本揭露的抗體或抗原結合片段可以以符合良好醫學實踐的方式配製、給藥和投與。關於這點要考慮的因素包括治療的特定障礙、治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的起因、藥劑的遞送位點、投與方法、投與方案、和醫療從業者已知的其他因素。抗體不需要但視需要與目前用於預防或治療所研究的障礙的一或多種藥劑一起配製。此類其他藥劑的有效量取決於配製物中存在的抗體的量、障礙或治療的類型、以及上文討論的其他因素。該等通常以與如本文所述相同的劑量和投與途徑使用，或以本文所述劑量的約1%-99%使用，或以經驗/臨床確定為合適的任何劑量和任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本揭露的抗體或抗原結合片段的合適的劑量將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和病程、投與抗體是用於預防還是治療目的、先前療法、患者的臨床病史和對抗體的響應、以及主治醫生的判斷。抗體適當地以一次或經一系列治療投與於患者。取決於疾病的類型和嚴重性，約1 μg/kg至100 mg/kg的抗體可為用於向患者投與的初始候選劑量，無論是例如藉由一次或多次分開投與，還是藉由連續輸注。取決於上述因素，一個典型的日劑量可以為約1 μg/kg至100 mg/kg或更多。對於幾天或更長時間內的重複投與，取決於病症，治療通常會持續直到出現疾病症狀的期望抑制。此類劑量可以間歇地投與，例如每週或每三週（例如使得患者接受約兩個至約二十個，或例如約六個劑量的抗體）。投與初始較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。但是，其他給藥方案可為有用的。藉由常規技術和測定可以容易地監測此療法的進展。 組合療法
在一方面，本揭露的抗CEAxCD137抗體可與其他治療劑組合使用。可以與本揭露的抗CEAxCD137抗體一起使用的其他治療劑包括：但不限於化療劑（例如，紫杉醇或紫杉醇藥劑；（例如Abraxane®）、多西他賽；卡鉑；拓撲替康；順鉑；伊立替康、多柔比星、來那度胺、5-氮雜胞苷、異環磷醯胺、奧沙利鉑、培美曲塞二鈉、環磷醯胺、依託泊苷、地西他濱、氟達拉濱、長春新鹼、苯達莫司汀、氮芥苯丁酸、白消安、吉西他濱、黴法蘭、噴司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二鈉）、酪胺酸激酶抑制劑（例如EGFR抑制劑（例如厄洛替尼）、多激酶抑制劑（例如MGCD265、RGB-286638）、CD-20靶向劑（例如利妥昔單抗、奧法木單抗、RO5072759、LFB-R603）、CD52靶向劑（例如阿侖單抗）、普賴蘇穠、達貝泊汀α、來那度胺、Bcl-2抑制劑（例如奧利默森鈉）、極光激酶抑制劑（例如MLN8237、TAK-901）、蛋白酶體抑制劑（例如硼替佐米）、CD-19靶向劑（例如MEDI-551、MOR208）、MEK抑制劑（例如ABT-348）、JAK-2抑制劑（例如INCB018424）、mTOR抑制劑（例如坦羅莫司、依維莫司）、BCR/ABL抑制劑（例如伊馬替尼）、ET-A受體拮抗劑（例如ZD4054）、TRAIL受體2（TR-2）促效劑（例如CS-1008）、EGEN-001、Polo樣激酶1抑制劑（例如BI 672）。
本揭露的抗CEAxCD137抗體可與其他治療劑（例如免疫檢查點抗體）組合使用。此類免疫檢查點抗體可包括抗PD1抗體。抗PD1抗體可包括但不限於替雷利珠單抗、帕博利珠單抗（Pembrolizumab）或納武利尤單抗（Nivolumab）。替雷利珠單抗揭露於US 8,735,553中。帕博利珠單抗（以前稱為MK-3475）揭露於US 8,354,509和US 8,900,587中，並且係人源化lgG4-K免疫球蛋白，其靶向PD1受體並抑制PD1受體配體PD-L1和PD-L2的結合。帕博利珠單抗已被批准用於轉移性黑色素瘤和轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）的適應症，並且正在進行用於治療頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）和難治性何杰金氏淋巴瘤（cHL）的臨床研究。納武利尤單抗（如由百時美施貴寶公司（Bristol-Meyers Squibb）所揭露的）係全人lgG4-K單株抗體。納武利尤單抗（殖株5C4）揭露於美國專利案號US 8,008,449和WO 2006/121168中。納武利尤單抗被批准用於治療黑色素瘤、肺癌、腎癌、和何杰金氏淋巴瘤。
用於與抗CEAxCD137抗體組合的其他免疫檢查點抗體可包括抗TIGIT抗體。此類抗TIGIT抗體可包括但不限於如WO 2019/129261中所揭露的抗TIGIT抗體。 藥物組成物和配製物
還提供了包含抗CEAxCD137抗體或其抗原結合片段或包含編碼抗CEAxCD137抗體或抗原結合片段的序列的多核苷酸的組成物，包括藥物配製物。在某些實施方式中，組成物包含一或多種抗CEAxCD137抗體或抗原結合片段，或包含編碼一或多種抗CEAxCD137抗體或抗原結合片段的序列的一或多種多核苷酸。該等組成物還可包含合適的載劑，如本領域熟知的藥學上可接受的賦形劑，包括緩衝劑。
藉由將具有所需純度的這種抗體或抗原結合片段與一或多種視需要的藥學上可接受的載劑混合來製備本文所述之抗CEAxCD137抗體或抗原結合片段的藥物配製物（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition [雷明頓藥物科學第16版], Osol, A.編(1980)），呈凍乾配製物或水溶液的形式。藥學上可接受的載劑在所採用的劑量和濃度下對於接受者通常是無毒性的，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑（如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨；氯化本索寧；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡合物（例如Zn-蛋白絡合物）；和/或非離子型界面活性劑，如聚乙二醇（PEG）。本文的示例性藥學上可接受的載劑進一步包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白（sHASEGP），例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，如rHuPH20（HYLENEX ®，百特國際有限公司（Baxter International, Inc.））。在美國專利案號US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，將sHASEGP與一或多種另外的糖胺聚糖酶如軟骨素酶組合。
在一個實施方式中，配製物由L-組胺酸/L-組胺酸鹽酸鹽一水合物、海藻糖和聚山梨醇酯20組成。在另一個實施方式中，抗CEAxCD137抗體藥物產品在用無菌注射用水配製後的濃度係由10 mg/mL抗CEAxCD137抗體、20 mM組胺酸/組胺酸HCl、240 mM海藻糖二水合物和0.02%聚山梨醇酯20組成的等滲溶液，pH約5.5。
示例性凍乾抗體配製物描述於美國專利案號6,267,958中。水性抗體配製物包括美國專利案號6,171,586和WO 2006/044908中所述的那些，後者的配製物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有該抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，該基質為成形製品的形式，例如膜或微膠囊。
用於體內投與的配製物通常是無菌的。無菌性可以例如通過無菌過濾膜過濾而容易地實現。 實例 實例1：    抗CEA單株抗體的產生 用於免疫和結合測定的CEA重組蛋白
為了發現在含有結構域B3（SEQ ID NO: 88的胺基酸596-674，參見Beauchemin等人, Mol. Cell Bio.[分子細胞生物學], 1987, 7(9):3321-3330）的膜周圍區域與人和獼猴CEA發生交叉反應但不與其他人CEACAM成員脫靶結合的針對CEA的新抗體，設計並表現了幾種重組蛋白用於抗體篩選（參見表3）。
將全長人CEA（SEQ ID NO: 88）、獼猴CEA（SEQ ID NO: 89）和全長人CEACAM6（SEQ ID NO: 90）的cDNA編碼區根據GenBank序列排序。對於人CEA（登錄號：NM_004363.2），該基因可獲自Sinobio，目錄號HG11077-UT。對於獼猴CEA（登錄號：NM_001047125），該基因可獲自Genscript，目錄號OMb23865D。對於人CEACAM6（登錄號：NM_002483.4），該基因可獲自Sinobio，目錄號HG10823-UT。CEA融合蛋白之示意圖如圖1所示。據報導，人CEA的剪接變體與全長CEA在腫瘤上同時表現（Peng等人, PloS one [公共科學圖書館：綜合], 7, e36412-e36412 (2012)），並且因此製備了變體（CEA-v）。為了產生此構建體，將由huCEA（SEQ ID NO: 91）的胺基酸（AA）1-687組成的細胞外結構域（ECD）的編碼區、猴CEA（SEQ ID NO: 92）的胺基酸（AA）1-690的區域和CEACAM6（SEQ ID NO: 93）的胺基酸（AA）1-320的區域進行PCR擴增。將CEA胺基酸（AA）1-78（SEQ ID NO: 94）和CEA的胺基酸398-687（SEQ ID NO: 95）的區域進行PCR擴增，然後藉由重疊PCR軛合以製備CEA變體（CEA-v）（SEQ ID NO: 96）。替代性地，將CEACAM6胺基酸（AA）1-273（SEQ ID NO: 97）的區域和含有CEA胺基酸（AA）596-687的結構域B3（SEQ ID NO: 98）的膜周圍區域進行PCR擴增，然後藉由重疊PCR軛合以製備嵌合構建體（CHIM）（SEQ ID NO: 99）。然後將所有構建體選殖到基於pcDNA3.1的表現載體（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA））中，其C末端分別與6xHis標籤融合，從而產生五個重組融合蛋白表現質體CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM。為了產生重組融合蛋白，將CEA、猴CEA、CEACAM6、CEA-v和CHIM質體瞬時轉染到基於HEK293的哺乳動物細胞表現系統（內部產生）中，並在裝備有旋轉振盪器的CO 2培養箱中培養5-7天。收集含有重組蛋白的上清液並離心澄清。使用Ni-NTA瓊脂糖（目錄號R90115，英傑公司）純化重組蛋白。將所有重組蛋白用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）透析，並以小等分試樣保存在-80°C冰箱中。 在細胞系中穩定表現
為了建立表現全長人CEA的穩定細胞系（登錄號：NM_004363.2），將表現CEA的cDNA選殖到反轉錄病毒載體pFB-Neo（目錄號217561，美國的安捷倫公司（Agilent, USA））中。根據先前的方案（Zhang等人, Blood.[血液] 2005 106(5):1544-51）產生雙嗜性反轉錄病毒載體。將含有人CEA的病毒載體轉導到L929（美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心（ATCC, Manassas, VA, USA））和CT26細胞（美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心）中，以產生人CEA表現細胞系。藉由在含有10% FBS和G418的完全RPMI1640培養基中培養來選擇高表現細胞系，然後藉由FACS結合測定來驗證。 免疫、融合瘤融合和選殖
用500 µl含有或不含水溶性佐劑（目錄號KX0210041，中國北京的康碧泉公司（KangBiQuan, Beijing, China））的1 × 10 7個L929/huCEA細胞腹膜內（i.p.）免疫八至十二週齡Balb/c小鼠（中國北京的華阜康生物科技有限公司（HFK BIOSCIENCE CO., LTD, Beijing, China））。兩週後重複該過程以促進抗體產生。第三次免疫後兩週，藉由ELISA和FACS評估小鼠血清的可溶性CEA（sCEA）結合。使用標準技術（Colligan JE等人, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY [免疫學實驗手冊], 1993）分離脾細胞並與鼠骨髓瘤細胞系SP2/0細胞（美國維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心）融合。 藉由ELISA和FACS評估抗體的CEA結合活性
為了篩選結合人CEA但不結合CEACAM6或sCEA的抗體，篩選並反篩選結合CHIM但不結合sCEA、CEACAM6和CEA-v的抗體，以及結合CHIM、sCEA和CEA-v但不結合CEACAM6的抗體。融合瘤殖株的上清液最初藉由（Methods in Molecular Biology [分子生物學方法] (2007) 378:33-52）中所述的ELISA（略作修改）進行篩選。簡而言之，將sCEA、CHIM、CEACAM6或CEA-v分別以3 µg/ml的低濃度包被在96孔板中。使用HRP-連接的抗小鼠IgG抗體（目錄號7076S，美國的細胞傳導技術公司（Cell Signaling Technology, USA））和底物（目錄號00-4201-56，美國的伊生物技術公司（eBioscience, USA））進行顯色，並使用酶標儀（SpectraMax Paradigm™，美國的分子設備公司（Molecular Devices, USA））測量450 nm波長處的吸光度信號。使用L929/huCEA和/或MKN45細胞（ATCC）藉由FACS進一步驗證ELISA陽性殖株。MKN45細胞來源於人胃癌。將表現CEA的細胞（10 5個細胞/孔）與ELISA陽性融合瘤上清液一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的山羊抗小鼠IgG抗體（目錄號A0473，中國的碧雲天生物技術公司（Beyotime Biotechnology, China））結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。
對來自融合瘤的在FACS篩選中表現出陽性信號並且與CHIM而不是CEACAM6和sCEA結合的條件培養基進行功能測定，以評估sCEA的存在對CEA抗體與CEA表現細胞的結合的影響（參見下面的實例）。對具有所需結合特異性和功能活性的抗體進一步亞選殖和表徵。 融合瘤亞選殖和對無血清或低血清培養基的適應
主要藉由ELISA、FACS和功能測定進行初步篩選後，藉由有限稀釋亞選殖陽性融合瘤殖株。通過功能測定而驗證的靠前抗體亞殖株在含3% FBS的CDM4MAb培養基（目錄號SH30801.02，美國的海殖株公司（Hyclone, USA））中適應生長。 單株抗體的表現和純化
將融合瘤細胞在CDM4MAb培養基（目錄號SH30801.02，海殖株公司）中培養，並在37°C下、在CO 2培養箱中孵育5至7天。通過離心收集條件培養基並在純化前通過0.22 µm膜過濾。依照製造商的指導中的方案應用含有鼠抗體的上清液並結合到蛋白A柱（目錄號17127901，通用生命科學公司（GE Life Sciences））。該程序通常產生純度高於90%的抗體。將蛋白A親和純化的抗體用PBS透析或使用HiLoad™ 16/60 Superdex™200柱（目錄號17531801，通用生命科學公司）進一步純化以去除聚集物。藉由測量280 nm處的吸光度來確定蛋白質濃度。將最終的抗體製劑以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 [表3]：胺基酸和核酸序列
SEQ ID NO： 構建體 序列
SEQ ID NO: 88 全長人CEA MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI
SEQ ID NO: 89 獼猴CEA MGSPSAPLHRWCIPWQTLLLTASLLTFWNPPTTAQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNVSQNLFGYIWYKGERVDASRRIGSCVIRTQQITPGPAHSGRETIDFNASLLIHNVTQSDTGSYTIQVIKEDLVNEEATGQFRVYPELPKPYISSNNSNPVEDKDAVALTCEPETQDTTYLWWVNNQSLPVSPRLELSSDNRTLTVFNIPRNDTTSYKCETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLTCHAASNPTAQYFWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYAELPKPYITSNNSNPIEDKDAVTLTCEPETQDTTYLWWVNNQSLSVSSRLELSNDNRTLTVFNIPRNDTTFYECETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLSCHAASNPAAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYVELPKPYISSNNSNPIEDKDAVTLTCEPVAENTTYLWWVNNQSLSVSPRLQLSNGNRILTLLSVTRNDTGPYECGIQNSESAKRSDPVTLNVTYGPDTPIISPPDLSYRSGANLNLSCHSDSNPSPQYSWLINGTLRQHTQVLFISKITSNNSGAYACFVSNLATGRNNSIVKNISVSSGDSAPGSSGLSARATVGIIIGMLVGVALM
SEQ ID NO: 90 全長人CEACAM6 MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI
SEQ ID NO: 91 huCEA的1-687 MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGAHHHHHH
SEQ ID NO: 92 猴CEA的1-690 MGSPSAPLHRWCIPWQTLLLTASLLTFWNPPTTAQLTIESRPFNVAEGKEVLLLAHNVSQNLFGYIWYKGERVDASRRIGSCVIRTQQITPGPAHSGRETIDFNASLLIHNVTQSDTGSYTIQVIKEDLVNEEATGQFRVYPELPKPYISSNNSNPVEDKDAVALTCEPETQDTTYLWWVNNQSLPVSPRLELSSDNRTLTVFNIPRNDTTSYKCETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLTCHAASNPTAQYFWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYAELPKPYITSNNSNPIEDKDAVTLTCEPETQDTTYLWWVNNQSLSVSSRLELSNDNRTLTVFNIPRNDTTFYECETQNPVSVRRSDPVTLNVLYGPDAPTISPLNTPYRAGENLNLSCHAASNPAAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTAITVYVELPKPYISSNNSNPIEDKDAVTLTCEPVAENTTYLWWVNNQSLSVSPRLQLSNGNRILTLLSVTRNDTGPYECGIQNSESAKRSDPVTLNVTYGPDTPIISPPDLSYRSGANLNLSCHSDSNPSPQYSWLINGTLRQHTQVLFISKITSNNSGAYACFVSNLATGRNNSIVKNISVSSGDSAPGSSGLSARAHHHHHH
SEQ ID NO: 93 CEACAM6的1-320 MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGHHHHHH
SEQ ID NO: 94 huCEA的1-78 MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQN
SEQ ID NO: 95 huCEA的398-687 ELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGA
SEQ ID NO: 96 CEA-v MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNELSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGAHHHHHH
SEQ ID NO: 97 CEACAM6的1-273 MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDVPTIS
SEQ ID NO: 98 huCEA的596-687 PIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGA
SEQ ID NO: 99 CHIM MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDVPTISPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGAHHHHHH
SEQ ID NO: 100 CEACAM1 MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTAQLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENGLSPGAIAGIVIGVVALVALIAVALACFLHFGKTGSSGPLQ
SEQ ID NO: 101 CEACAM3 MGPPSASPHRECIPWQGLLLTASLLNFWNPPTTAKLTIESMPLSVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGAAYSGRETIYTNASLLIQNVTQNDIGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYQENAPGLPVGAVAGIVTGVLVGVALVAALVCFLLLAKTGRTSIQRDLKEQQPQALAPGRGPSHSSAFSMSPLSTAQAPLPNPRTAASIYEELLKHDTNIYCRMDHKAEVAS
SEQ ID NO: 102 CEACAM7 MGSPSACPYRVCIPWQGLLLTASLLTFWNLPNSAQTNIDVVPFNVAEGKEVLLVVHNESQNLYGYNWYKGERVHANYRIIGYVKNISQENAPGPAHNGRETIYPNGTLLIQNVTHNDAGIYTLHVIKENLVNEEVTRQFYVFSEPPKPSITSNNFNPVENKDIVVLTCQPETQNTTYLWWVNNQSLLVSPRLLLSTDNRTLVLLSATKNDIGPYECEIQNPVGASRSDPVTLNVRYESVQASSPDLSAGTAVSIMIGVLAGMALI
SEQ ID NO: 103 CEACAM8 MGPISAPSCRWRIPWQGLLLTASLFTFWNPPTTAQLTIEAVPSNAAEGKEVLLLVHNLPQDPRGYNWYKGETVDANRRIIGYVISNQQITPGPAYSNRETIYPNASLLMRNVTRNDTGSYTLQVIKLNLMSEEVTGQFSVHPETPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPETQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDVGPYECEIQNPASANFSDPVTLNVLYGPDAPTISPSDTYYHAGVNLNLSCHAASNPPSQYSWSVNGTFQQYTQKLFIPNITTKNSGSYACHTTNSATGRNRTTVRMITVSDALVQGSSPGLSARATVSIMIGVLARVALI
SEQ ID NO: 104 全長人CEA DNA ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACACCCTACACGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACGCAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACACAGCAAGCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGCCAGGCGCAGTGATTCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCCCCCACCATTTCCCCTCTAAACACATCTTACAGATCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACTTTCCAGCAATCCACCCAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGTGGATCCTATACGTGCCAAGCCCATAACTCAGACACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGACGATCACAGTCTATGCAGAGCCACCCAAACCCTTCATCACCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGATGAGGATGCTGTAGCCTTAACCTGTGAACCTGAGATTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTCTACTCAGTGTCACAAGGAATGATGTAGGACCCTATGAGTGTGGAATCCAGAACGAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCCACTGTCGGCATCATGATTGGAGTGCTGGTTGGGGTTGCTCTGATATAG
SEQ ID NO: 105 猴CEA DNA ATGGGGTCTCCCTCAGCCCCTCTTCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGACGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCCAGCTCACTATTGAATCCAGGCCGTTCAATGTTGCAGAGGGGAAGGAGGTTCTTCTACTTGCCCACAATGTGTCCCAGAATCTTTTTGGCTACATTTGGTACAAGGGAGAAAGAGTGGATGCCAGCCGTCGAATTGGATCATGTGTAATAAGAACTCAACAAATTACCCCAGGGCCCGCACACAGCGGTCGAGAGACAATAGACTTCAATGCATCCCTGCTGATCCACAATGTCACCCAGAGTGACACAGGATCCTACACCATACAAGTCATAAAGGAAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTACATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTAACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGGAGCTGTCCAGTGACAACAGGACCCTCACTGTATTCAATATTCCAAGAAATGACACAACATCCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGTCAGACGCAGCGACCCAGTCACCCTGAACGTCCTCTATGGCCCGGATGCGCCCACCATTTCCCCTCTAAACACACCTTACAGAGCAGGGGAAAATCTGAACCTCACCTGCCACGCAGCCTCTAACCCAACTGCACAGTACTTTTGGTTTGTCAATGGGACGTTCCAGCAATCCACACAAGAGCTCTTTATACCCAACATCACCGTGAATAATAGCGGATCCTATATGTGCCAAGCCCATAACTCAGCCACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGGCGATCACAGTCTACGCGGAGCTGCCCAAGCCCTACATCACCAGCAACAACTCCAACCCCATAGAGGACAAGGATGCTGTGACCTTAACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCTCGGTCAGTTCCAGGCTGGAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTGTATTCAATATTCCAAGAAACGACACAACGTTCTACGAATGTGAGACCCAGAACCCAGTGAGTGTCAGACGCAGCGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCGCCCACCATTTCCCCTCTAAACACACCTTACAGAGCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCAGCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACGTTCCAGCAATCCACACAAGAGCTCTTTATACCCAACATCACCGTGAATAATAGCGGATCCTATATGTGCCAAGCCCATAACTCAGCCACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGGCGATCACAGTCTATGTGGAGCTGCCCAAGCCCTACATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCATAGAGGACAAGGATGCTGTGACCTTAACCTGTGAACCTGTGGCTGAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCTCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTCTCCAATGGCAACAGGATCCTCACTCTACTCAGTGTCACACGGAATGACACAGGACCCTATGAATGTGGAATCCAGAACTCAGAGAGTGCAAAACGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCACCTATGGCCCAGACACCCCCATCATATCCCCCCCAGACTTGTCTTACCGTTCGGGAGCAAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGACTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCTTATCAATGGGACACTGCGGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCTCCAAAATCACATCAAACAATAGCGGGGCCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACCGGTCGCAATAACTCCATAGTCAAGAACATCTCAGTCTCCTCTGGCGATTCAGCACCTGGAAGTTCTGGTCTCTCAGCTAGGGCTACTGTCGGCATCATAATTGGAATGCTGGTTGGGGTTGCTCTGATGTAG
SEQ ID NO: 106 全長人CEACAM6 DNA ATGGGACCCCCCTCAGCCCCTCCCTGCAGATTGCATGTCCCCTGGAAGGAGGTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCACCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTTCTTCTACTCGCCCACAACCTGCCCCAGAATCGTATTGGTTACAGCTGGTACAAAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTAATTGTAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGACAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACGTCACCCAGAATGACACAGGATTCTATACCCTACAAGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGTTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACATGACCCTCACTCTACTCAGCGTCAAAAGGAACGATGCAGGATCCTATGAATGTGAAATACAGAACCCAGCGAGTGCCAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGATGTCCCCACCATTTCCCCCTCAAAGGCCAATTACCGTCCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTATCAATGGGACGTTCCAGCAATCCACACAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGCGGATCCTATATGTGCCAAGCCCATAACTCAGCCACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGATGATCACAGTCTCTGGAAGTGCTCCTGTCCTCTCAGCTGTGGCCACCGTCGGCATCACGATTGGAGTGCTGGCCAGGGTGGCTCTGATATAG
SEQ ID NO: 107 huCEA DNA的1-687 ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACACCCTACACGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACGCAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACACAGCAAGCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGCCAGGCGCAGTGATTCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCCCCCACCATTTCCCCTCTAAACACATCTTACAGATCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACTTTCCAGCAATCCACCCAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGTGGATCCTATACGTGCCAAGCCCATAACTCAGACACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGACGATCACAGTCTATGCAGAGCCACCCAAACCCTTCATCACCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGATGAGGATGCTGTAGCCTTAACCTGTGAACCTGAGATTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTCTACTCAGTGTCACAAGGAATGATGTAGGACCCTATGAGTGTGGAATCCAGAACGAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCCCATCACCATCACCATCAC
SEQ ID NO: 108 猴CEA DNA的1-690 ATGGGGTCTCCCTCAGCCCCTCTTCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGACGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCCAGCTCACTATTGAATCCAGGCCGTTCAATGTTGCAGAGGGGAAGGAGGTTCTTCTACTTGCCCACAATGTGTCCCAGAATCTTTTTGGCTACATTTGGTACAAGGGAGAAAGAGTGGATGCCAGCCGTCGAATTGGATCATGTGTAATAAGAACTCAACAAATTACCCCAGGGCCCGCACACAGCGGTCGAGAGACAATAGACTTCAATGCATCCCTGCTGATCCACAATGTCACCCAGAGTGACACAGGATCCTACACCATACAAGTCATAAAGGAAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTACATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTAACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGGAGCTGTCCAGTGACAACAGGACCCTCACTGTATTCAATATTCCAAGAAATGACACAACATCCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGTCAGACGCAGCGACCCAGTCACCCTGAACGTCCTCTATGGCCCGGATGCGCCCACCATTTCCCCTCTAAACACACCTTACAGAGCAGGGGAAAATCTGAACCTCACCTGCCACGCAGCCTCTAACCCAACTGCACAGTACTTTTGGTTTGTCAATGGGACGTTCCAGCAATCCACACAAGAGCTCTTTATACCCAACATCACCGTGAATAATAGCGGATCCTATATGTGCCAAGCCCATAACTCAGCCACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGGCGATCACAGTCTACGCGGAGCTGCCCAAGCCCTACATCACCAGCAACAACTCCAACCCCATAGAGGACAAGGATGCTGTGACCTTAACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCTCGGTCAGTTCCAGGCTGGAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTGTATTCAATATTCCAAGAAACGACACAACGTTCTACGAATGTGAGACCCAGAACCCAGTGAGTGTCAGACGCAGCGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCGCCCACCATTTCCCCTCTAAACACACCTTACAGAGCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCAGCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACGTTCCAGCAATCCACACAAGAGCTCTTTATACCCAACATCACCGTGAATAATAGCGGATCCTATATGTGCCAAGCCCATAACTCAGCCACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGGCGATCACAGTCTATGTGGAGCTGCCCAAGCCCTACATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCATAGAGGACAAGGATGCTGTGACCTTAACCTGTGAACCTGTGGCTGAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCTCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTCTCCAATGGCAACAGGATCCTCACTCTACTCAGTGTCACACGGAATGACACAGGACCCTATGAATGTGGAATCCAGAACTCAGAGAGTGCAAAACGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCACCTATGGCCCAGACACCCCCATCATATCCCCCCCAGACTTGTCTTACCGTTCGGGAGCAAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGACTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCTTATCAATGGGACACTGCGGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCTCCAAAATCACATCAAACAATAGCGGGGCCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACCGGTCGCAATAACTCCATAGTCAAGAACATCTCAGTCTCCTCTGGCGATTCAGCACCTGGAAGTTCTGGTCTCTCAGCTAGGGCTCATCACCATCACCATCAC
SEQ ID NO: 109 CEACAM6 DNA的1-320 ATGGGACCCCCCTCAGCCCCTCCCTGCAGATTGCATGTCCCCTGGAAGGAGGTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCACCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTTCTTCTACTCGCCCACAACCTGCCCCAGAATCGTATTGGTTACAGCTGGTACAAAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTAATTGTAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGACAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACGTCACCCAGAATGACACAGGATTCTATACCCTACAAGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGTTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACATGACCCTCACTCTACTCAGCGTCAAAAGGAACGATGCAGGATCCTATGAATGTGAAATACAGAACCCAGCGAGTGCCAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGATGTCCCCACCATTTCCCCCTCAAAGGCCAATTACCGTCCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTATCAATGGGACGTTCCAGCAATCCACACAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGCGGATCCTATATGTGCCAAGCCCATAACTCAGCCACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGATGATCACAGTCTCTGGACATCACCATCACCATCAC
SEQ ID NO: 110 huCEA DNA的1-78 ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAAT
SEQ ID NO: 111 huCEA DNA的398-687 GAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCC
SEQ ID NO: 112 CEA-v DNA ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCCCATCACCATCACCATCAC
SEQ ID NO: 113 NCA DNA的1-273 ATGGGACCCCCCTCAGCCCCTCCCTGCAGATTGCATGTCCCCTGGAAGGAGGTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCACCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTTCTTCTACTCGCCCACAACCTGCCCCAGAATCGTATTGGTTACAGCTGGTACAAAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTAATTGTAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGACAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACGTCACCCAGAATGACACAGGATTCTATACCCTACAAGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGTTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACATGACCCTCACTCTACTCAGCGTCAAAAGGAACGATGCAGGATCCTATGAATGTGAAATACAGAACCCAGCGAGTGCCAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGATGTCCCCACCATTTCC
SEQ ID NO: 114 huCEA DNA的596-687 CCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCC
SEQ ID NO: 115 CHIM DNA ATGGGACCCCCCTCAGCCCCTCCCTGCAGATTGCATGTCCCCTGGAAGGAGGTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCACCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTTCTTCTACTCGCCCACAACCTGCCCCAGAATCGTATTGGTTACAGCTGGTACAAAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTAATTGTAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGACAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACGTCACCCAGAATGACACAGGATTCTATACCCTACAAGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGTTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACATGACCCTCACTCTACTCAGCGTCAAAAGGAACGATGCAGGATCCTATGAATGTGAAATACAGAACCCAGCGAGTGCCAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGATGTCCCCACCATTTCCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCCCATCACCATCACCATCAC
實例2. CEA抗體的選殖和序列分析
根據製造商的方案，使用Ultrapure RNA套組（kit）（目錄號74104，德國的凱傑公司（QIAGEN, Germany））收穫鼠融合瘤細胞以製備總RNA。使用來自英傑公司的cDNA合成套組（目錄號18080-051）合成第一條股cDNA，並使用PCR套組（目錄號CW0686，中國北京的康為世紀公司（CWBio, Beijing, China））進行鼠單株抗體的VH和VL基因的PCR擴增。基於先前報導的序列（Brocks等人, Mol Med.[分子醫學] 2001 7(7):461-9）合成用於重鏈可變區（VH）和κ輕鏈可變區（VL）的抗體cDNA選殖的寡核苷酸引物。然後將PCR產物亞選殖到pEASY-Blunt選殖載體（目錄號CB101-02，中國的全式金公司（TransGen, China））中，並定序。從DNA定序結果確定VH和VL區的胺基酸序列。
單株抗體藉由比較序列同源性來分析，並基於序列相似性分組（圖2）。根據IMGT（Lefranc等人, 1999 Nucleic Acids Research [核酸研究] 27:209-212）系統藉由序列注釋來定義互補決定區（CDR）。代表性殖株BGA13的胺基酸序列在表4中列出。 [表4]：胺基酸序列
BGA13 (IMGT) SEQ ID NO: 116 HCDR1 (IMGT) GYIFTSYW
SEQ ID NO: 117 HCDR2 (IMGT) INPNTGYT
SEQ ID NO: 3 HCDR3 (IMGT) AREYGNYNYPLDY
SEQ ID NO: 118 LCDR1 (IMGT) ENIYGY
SEQ ID NO: 119 LCDR2 (IMGT) NA
SEQ ID NO: 120 LCDR3 (IMGT) QHHYGTPYT
BGA13 SEQ ID NO: 121 VH QVQLQQSGAELAKSGASVKMSCKASGYIFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGYINPNTGYTNYSQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 122 VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYGYLAWYQQKQGKSPQLLVFNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIK
實例3. 純化的鼠抗CEA抗體之結合概況測定
藉由使用BIAcore TMT-200（通用生命科學公司）的SPR測定，表徵了具有CEA特異性結合（如藉由ELISA和FACS顯示的）以及沒有可溶性CEA（sCEA）干擾的CEA抗體的結合動力學（圖3A）。簡言之，將抗鼠IgG抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號BR100530，通用生命科學公司）上。使純化的鼠抗體流過晶片表面並被抗鼠IgG抗體捕獲。然後使純化的CHIM、CEA-v、CEA或猴CEA重組蛋白的連續稀釋液（6.0 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。BGA13的結合親和力概況在下表5中示出。
通過抗原ELISA檢查BGA13的結合概況，觀察到純化的BGA13與huCEA和猴CEA的結合，這表明BGA13對可溶性huCEA和猴CEA係弱結合劑，或者可溶性CEA在固定時具有不同的構象（圖3B）。對於該實驗，將sCEA、CHIM、猴CEA、CEA-v和BSA以10 µg/ml的高濃度在4°C下包被在96孔板中過夜。BGA13或對照抗體ab4451（目錄號ab4451，美國的艾博抗公司（abcam, USA））以2 µg/ml的濃度孵育1小時。使用HRP-連接的抗小鼠IgG抗體（目錄號7076S，美國的細胞傳導技術公司（Cell Signaling Technology, USA））和底物（目錄號00-4201-56，美國的伊生物技術公司（eBioscience, USA））進行顯色，並使用酶標儀（SpectraMax Paradigm，美國的分子設備公司（Molecular Devices, USA））測量450 nm波長處的吸光度信號。 [表5]：藉由SPR比較BGA13結合親和力
抗原 KD (M)
sCEA ND
sCEA-v 1.50E-07
CHIM 1.20E-07
猴CEA ND（由於結合較弱，無法檢測到）
實例4. 重組可溶性CEA對BGA13與CEA表現細胞的結合之影響
通過流式細胞術評估可溶性CEA的存在對各種CEA抗體與CEA表現細胞的特異性結合之影響。簡言之，在20 µg/ml額外的重組可溶性CEA蛋白的存在下，將表現人CEA的細胞（10 5個細胞/孔）與2 µg/ml純化的CEA鼠單株抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的山羊抗小鼠IgG抗體（目錄號A0473，中國的碧雲天生物技術公司）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。如圖4A和圖4B所示，BGA13與CEA表現細胞的結合不受可溶性CEA存在的影響。 實例5. 鼠抗人CEA抗體的人源化 mAb人源化和工程化
對於BGA13的人源化，藉由在IMGT和NCBI的人免疫球蛋白基因數據庫中進行序列比較，搜索人種系IgG基因中與BGA13可變區的cDNA序列具有高度同源性的序列。選擇以高頻率存在於人抗體庫（Glanville等人，2009 PNAS [美國國家科學院院刊] 106:20216-20221）中並且與BGA13高度同源的人IGVH和IGVL基因作為人源化的模板。在人源化之前，將BGA13重鏈和輕鏈可變結構域分別與命名為人IgG1wt的野生型人IgG1恒定區（SEQ ID NO: 123）和人κ恒定（CL）區（SEQ ID NO: 124）融合。 [表6]：胺基酸序列
SEQ ID NO: 123 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG1wt
SEQ ID NO: 124 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC CL
藉由CDR移植進行人源化（Methods in Molecular Biology [分子生物學方法], 第248卷: Antibody Engineering, Methods and Protocols [抗體工程、方法和方案], Humana Press [胡馬納出版社]）並將BGA13抗體以人IgG1形式工程化。在第一輪人源化中，框架區中從鼠到人胺基酸殘基的突變由模擬的3D結構指導，並且在人源化抗體BGA13的第一版本BGA131中保留了對於維持CDR的規範結構具有結構重要性的鼠框架殘基（重鏈和輕鏈的胺基酸序列在SEQ ID NO: 125和126中示出）。 [表7]：胺基酸序列
SEQ ID NO: 125 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWLHWVRQAPGQGLEWIGYINPNTGYTNYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK BGA131重鏈
SEQ ID NO: 126 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHYGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC BGA131輕鏈
具體地，將BGA13 VL的CDR移植到保留了2個鼠框架殘基（N66和V68）的人種系可變基因IGVK1-27的框架中（輕鏈可變結構域的胺基酸序列在SEQ ID NO: 128中示出）。將BGA13 VH的CDR移植到保留了5個鼠框架（L39、I53、Y55、N66、S68）殘基的人種系可變基因IGVH1-46的框架中（重鏈可變結構域的胺基酸序列在SEQ ID NO: 127中示出）。 [表8]：胺基酸序列
SEQ ID NO: 127 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWLHWVRQAPGQGLEWIGYINPNTGYTNYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS BGA131 VH
SEQ ID NO: 128 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHYGTPYTFGQGTKVEIK BGA131 VL
使用內部開發的表現載體將BGA13-1構建為人全長抗體形式，該等表現載體含有野生型人IgG1的恒定區，具有容易適應的亞選殖位點。藉由將上述兩種構建體共轉染到293G細胞中並使用蛋白A柱（目錄號17543802，通用生命科學公司）純化來實現BGA13-1抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。
使用BGA131，進行額外數量的單個或多個胺基酸改變，將VH和VL框架區中的人殘基轉化為相應的鼠種系殘基，其分別包括VH中的V68A、R72A和V79A以及VL中的V43S。這產生BGA132（VH中的V68A、R72A）、BGA133（VH中的V79A）、BGA134（VH中的V68A、R72A、V79A）、BGA135（VL中的V43S）、BGA136（VH中的V68A、R72A和VL中的V43S）、BGA137（VH中的V79A、VL中的V43S）和BGA138（VH中的V68A、R72A、V79A和VL中的V43S）。所有含有修飾的抗體都具有與BGA131相似的結合活性，並且沒有一種改變消除結合。
為了去除翻譯後修飾（PTM）位點，藉由基於BGA131序列在CDR和框架區中引入突變來進行進一步工程化，該等突變包括VH區中的N52T、N54Q、N59S、N102G、N104Q和S61A胺基酸改變。這產生BGA131A（N52T（VH））、BGA131B（N54Q（VH））、BGA131C（N59S（VH））、BGA131D（N102G（VH））、BGA131E（N104Q（VH））和BGA131F（N54Q、N59S、S61A（VH）），並且所有抗體都具有與BGA131相似的結合特異性，沒有一種改變消除結合。在保持特異性的同時，還考慮了胺基酸組成和表現水平。使用在特定位置含有突變的引物和定點誘變套組（目錄號FM111-02，中國北京的全式金公司）進行所有人源化突變。藉由序列分析驗證所需的突變。與BGA13-1相比，BGA13-1F具有顯著降低的結合親和力，沒有糖基化位點，但具有高表現水平（表9）。 [表9]：胺基酸序列
SEQ ID NO: 129 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNAKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHYGTPYTFGQGTKVEIK BGA13-1 VL
SEQ ID NO: 130 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGYTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS BGA13-1F VH
實例6.親和力成熟文庫的產生
藉由標準分子生物學技術使用噬菌粒載體pCANTAB 5E（通用電氣醫療集團（GE Healthcare））構建噬菌粒，該噬菌粒被設計成在M13噬菌體的表面上展示BGA13-1F Fab片段作為與基因-3次要外殼蛋白片段的N末端的融合體。在g3序列之前有一個琥珀終止密碼子，以允許直接從噬菌粒殖株表現Fab片段。使用噬菌粒作為模板來構建含有10 8個獨特成員的噬菌體展示文庫。
構建兩個文庫（H-AM、L-AM），分別隨機化重鏈和輕鏈中的CDR位置。所有三個CDR在每個文庫中隨機化，但每個CDR在每個殖株中具有最多一個突變，HCDR3除外，其可具有兩個同時突變。每個位置用編碼任何胺基酸的NNK密碼子（IUPAC編碼）或琥珀終止密碼子隨機化。組合的重鏈和輕鏈文庫設計具有5.0 × 10 6個獨特全長殖株的潛在多樣性，沒有終止密碼子或半胱胺酸密碼子，並且預期分佈分別為約0.02%、1.1%、17%和82%的殖株分別具有0、1、2和3個突變。由於HCDR3區域中的引物設計，預期一小部分重鏈殖株具有4個突變。作為第一步，使用pCANTAB 5E（作為模板）和含有隨機化CDR3位置的引物擴增DNA片段（參見圖5A和圖5B）。然後將PCR產物凝膠純化並與含有隨機化CDR2位置的引物組裝。用針對隨機CDR1位置的引物重複該過程。然後藉由重疊PCR將所得的重鏈或輕鏈的PCR產物與其相應的CH片段或CL片段組裝。藉由重疊PCR將片段進一步與沒有突變的輕鏈或重鏈組裝。然後將所得片段凝膠純化，並在NcoI/NotI消化後與pCANTAB 5E連接。藉由電穿孔將純化的連接物轉化到TG1細菌中。來自每個文庫的48個殖株的定序證實了每個位置的隨機化（數據未示出），儘管由於取樣深度有限，並非在每個位置都觀察到所有的胺基酸突變。約52%和55%的輕鏈和重鏈文庫具有全長隨機殖株，足以覆蓋設計的所有潛在多樣性，即使在寡核苷酸合成和文庫構建中存在適度的摻入偏差，也會產生10 8個獨立殖株。 實例7.親和力成熟的人源化BGA13變體的產生 文庫選擇和篩選
使用標準方案藉由噬菌體展示進行親和力成熟的人源化BGA13 Fab的產生（Silacci等人, (2005) Proteomics [蛋白質組學], 5, 2340-50；Zhao等人, (2014) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 9, e111339）。對於第一輪和第二輪選擇，在免疫管（目錄號470319，賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher））中對固定化的CHIM進行競爭選擇。簡言之，免疫管用1 ml CHIM（5 µg/ml的PBS溶液）在4°C下包被過夜。在各種濃度的BGA13-1F IgG（第1輪，1 µg/ml；第2輪，5 µg/ml）存在下，將所有親和力成熟文庫與包被的免疫管一起孵育1小時。對於第三輪和第四輪選擇，使用L929/huCEA細胞（第3輪）或LOVO細胞（ATCC CCL-229）（第4輪）進行細胞淘選，其中HEK293細胞作為耗竭細胞。在四輪選擇之後，挑選單個殖株並使用標準方案製備含有噬菌體的上清液。對ELISA陽性殖株定序，並分析突變位點。 CDR中的突變頻率分析
在四輪選擇之後，每個CDR中的突變頻率相對較高，範圍從HCDR3中的17%到LCDR2中的95%。關於重鏈，在H-AM文庫中鑒定的大約一半殖株與親本殖株相同。其他殖株在HCDR2中的Q54N處含有一個回復突變。
在分析輕鏈時，突變更加多樣化。兩個位點分別在LCDR1的幾乎所有殖株中都發生了突變。輕鏈殘基29和31分別在47.09%和35.29%的殖株中從Ile突變為Gln和從Gly突變為Gln。位置29不僅具有高頻率的Gln突變，而且具有突變為酪胺酸的殖株子集。位置31不僅具有高頻率的Gln突變，而且有約12.5%的機會突變為Leu。由於文庫設計限制，沒有發現位置29和31的突變彼此結合。然而，這兩個位點中的每一個中的突變通常與其他CDR中的突變組合。關於LCDR2，只有A51在至少64.71%的殖株中發生突變，但沒有任何明顯的模式，其包括大的疏水和極性殘基，諸如Tyr、Phe、Thr和Asn。關於LCDR3，兩個位點在至少50%的殖株中發生了突變。輕鏈殘基90和92分別在11.76%和47.06%的殖株中從His突變為Leu和從Tyr突變為Leu。圖6示出了四輪選擇後輕鏈CDR區的序列差異。 所選擇的人源化BGA13變體的表現
進行了突變的組合。將來自所選噬菌體殖株的輕鏈可變區亞選殖到人κ輕鏈表現哺乳動物表現載體中。將輕鏈表現載體與表現BGA13-1F重鏈的哺乳動物表現載體以1 : 1的比例共轉染到293G細胞中。藉由蛋白A親和層析法（目錄號17543802，通用生命科學公司）從培養上清液中純化CEA抗體形式。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 親和力成熟的人源化BGA13變體的表徵
藉由使用BIAcore™ T-200（通用生命科學公司）的SPR測定（表10）和流式細胞術（圖7）進行BGA13-1F和其他親和力成熟殖株的親和力比較。對於該實驗，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號BR100839，通用生命科學公司）上。抗CEA抗體流過晶片表面並被抗人Fab抗體捕獲。然後使CHIM的連續稀釋液（1.37 nM至333 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。對於流式細胞術，將表現CEA的細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的親和力成熟抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號409320，美國的百進生化技術公司（BioLegend, USA））結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。BGA131F-ph-L（SEQ ID NO: 131）和BGA131F-ph-M（SEQ ID NO: 132）顯示出對huCEA表面蛋白的親和力提高（表11）。 [表10]：藉由SPR比較結合親和力
樣本ID Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
1F-ph-E 3.4E+3 3.5E-3 1.0E-6 284
1F-ph-F 1.0E+2 1.2E-2 1.2E-4 4162
1F-ph-G 6.4E+1 2.6E-3 4.1E-5 3487
1F-ph-H 1.1E+2 2.8E-3 2.5E-5 1983
1F-ph-I 2.0E+2 2.2E-3 1.1E-5 2248
1F-ph-L 6.7E+3 3.0E-4 4.6E-8 184
1F-ph-M 2.5E+3 2.5E-4 9.9E-8 224
1F-ph-N 1.1E+3 1.0E-2 9.2E-6 1267
BGA13-1F 1.9E+3 1.5E-3 7.9E-7 367
[表11]：胺基酸序列
SEQ ID NO: 131 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNFKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIK BGA13-1F-ph-L VL
SEQ ID NO: 132 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNTKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIK BGA13-1F-ph-M VL
實例8.親和力成熟的人源化BGA13變體的進一步工程化
藉由在基於BGA131F-ph-M模板的CDR中引入突變進行了進一步的工程化，該模板包括VH中的W33Y、Q54N和S59N以及VL中的T51Y。這產生BGA1132A（W33Y（VH））、BGA1132B（Q54N（VH））、BGA1132C（S59N（VH））、BGA1131A（T51Y（VL）），它們都具有改進的與BGA-1131F的結合活性，其中改進最大的抗體最終產生具有（W33Y（VH）、T51Y（VL））改變的BGA113抗體（表12），序列在表13中示出。 [表12]：藉由SPR比較與CHIM的結合親和力
樣本ID Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
BGA1311F-ph-M 1.97E+04 2.48E-04 1.26E-08 97.2
1132A 1.99E+04 2.82E-04 1.42E-08 129.1
1132B 1.98E+04 3.80E-04 1.92E-08 71.1
1132C 1.84E+04 3.94E-04 2.15E-08 59.4
1131A 3.21E+04 4.63E-04 1.44E-08 92.9
113 3.15E+04 4.75E-04 1.51E-08 112.4
[表13]：BGA-113的胺基酸和核酸序列
BGA113 SEQ ID NO: 133 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGYTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 15 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 134 VH DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCTATACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO: 17 VL DNA GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
實例9. BGA113的優化
為了進一步改善生物化學/生物物理學性質，藉由在CDR和框架區中引入取代來優化BGA113（表14）。選擇大的疏水殘基並將其改變為極性殘基，K13和Q53除外，它們係基於觀察到的人VH種系之間的差異而選擇的。考慮因素包括胺基酸組成、熱穩定性（Tm）、表面疏水性和等電點（pI），同時保持功能活性。如實例6所述，藉由選殖到載體pCANTAB-5E中以Fab形式表現變體。然後藉由ELISA和SPR分析篩選含有Fab的上清液的CEA結合。選擇沒有顯著親和力降低的變體並鑒定出可耐受取代的殘基。證明輕鏈中的L92E，重鏈中的K13E、Q54E、Y57D/E和Y57K對親和力的影響極小。因此，表現和純化具有單個鑒定出的突變或組合的IgG形式的BGA113變體，如實例8中所述。進行SPR研究和FACS分析並總結在表14中。證實了特異性和表位沒有由於引入的胺基酸取代而發生改變（數據未示出）。總之，結果表明該等單一或組合突變（重鏈中的K13E、Q54E、Y57D和Y57K，輕鏈中的L92E）對親和力的影響極小，L92E除外，它略微降低了與CEA的結合親和力。總之，Y57K改變優化了BGA113抗體的表現、CEA結合和親和力，從而產生BGA113K（表1）。 [表14]：用於取代的殘基之總結
殘基 AA取代
H：K13 E
H：Y32 H、N、Q、D、E、K
H：Y33 H、N、Q、D、E、K
H：Q53 A、D、G、N、S、T、Y、R、H
H：Y57 H、N、Q、D、E、K
H：Y100 H、N、Q、D、E、K
H：Y105 H、N、Q、D、E、K
L：V15 T、P、L
L：Y30 H、N、Q、D、E、K
L：Y32 H、N、Q、D、E、K
L：Y49 H、N、Q、D、E、K
L：P80 S、T、A
L：L92 H、N、Q、D、E、K
[表15]：藉由SPR對BGA113變體的親和力測量之總結
BGA113變體 動力學（huCEA） 親和力（MKN45細胞）
ka（1/Ms） kd（1/s） KD (M) 最高 EC50（μg/ml）
L92E、Y57K 3.34E+04 1.77E-04 5.29E-09 969.9 1.09
L92E 4.17E+04 1.88E-04 4.50E-09 945.4 1.19
Q54E、Y57K 1.10E+05 2.60E-04 2.36E-09 901.9 0.58
Y57K 1.02E+05 1.81E-04 1.77E-09 934.6 0.52
K13E、Y57K 1.28E+05 1.72E-04 1.34E-09 959.9 0.48
Q54E、Y57E 1.17E+05 2.50E-04 2.14E-09 926.9 0.65
Y57D 1.07E+05 1.95E-04 1.82E-09 949.3 0.56
BGA113 1.13E+05 1.69E-04 1.49E-09 919.3 0.49
實例10.抗CEA抗體BGA113K之結合概況
BGA113K和先前揭露的CEA抗體（在U.S. 2012/0251529中命名為抗體2F1）以人IgG1形式產生並使用BIAcore TMT-200（通用生命科學公司）藉由SPR測定表徵它們的結合動力學。
為了獲得該數據，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號BR100839，通用生命科學公司）上。BGA113K抗體流過晶片表面並被抗人Fab抗體捕獲。然後使可溶性huCEA或cynoCEA（目錄號：CE5-C52H5，北京百普賽斯生物科技股份有限公司（Acrobiosystem））的連續稀釋液（1.37 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。BGA113K和2F1對照抗體表現出不同的結合親和力。BGA113K對人CEA具有非常高的親和力，對cynoCEA也具有相當的親和力，如下表16所示。
對於流式細胞術，將表現CEA的MKN45細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的親和力成熟抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號409320，美國的百進生化技術公司（BioLegend, USA））結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。如圖8所示，BGA-113K以劑量反應方式與活細胞上的天然CEA特異性結合，EC50為2.92 µg/ml。 [表16]：藉由SPR比較抗CEA抗體的結合親和力
   BGA113K 2F1抗體
   Ka（1/Ms） Kd（1/s） KD (M) Ka（1/Ms） Kd（1/s） KD (M)
huCEA 1.02E+05 1.81E-04 1.77E-09 4.50E+4 3.00E-3 6.50E-8
cynoCEA 2.67E+04 5.34E-04 1.99E-08 ND ND ND
實例11.脫靶特異性的評估
通過ELISA和流式細胞術評估BGA113K的脫靶特異性。對於流式細胞術，將CEACAM3（SEQ ID NO: 101）、CEACAM7（SEQ ID NO: 102）或CEACAM8（SEQ ID NO: 103）瞬時轉染到HEK293細胞（10 5個細胞/孔）中，然後與2 µg/ml純化的BGA113K一起孵育，隨後與Alexa Fluor-647標記的抗huIgG Fc抗體（目錄號409320，美國的百進生化技術公司）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。對於抗原ELISA、CEACAM1（SEQ ID NO: 100）（目錄號10822-H08H，中國的義翹神州公司（Sino Biological, China））、CHIM（SEQ ID NO: 99）、CEA（SEQ ID NO: 91）或CEACAM6（SEQ ID NO: 93）以10 µg/ml的濃度在4°C下包被在96孔板中過夜。使用HRP-連接的抗人Fc（Fc特異性）IgG抗體（目錄號A0170，美國的西格瑪公司（Sigma, USA））和底物（目錄號00-4201-56，美國的伊生物技術公司（eBioscience, USA））進行顯色，並使用酶標儀（SpectraMax Paradigm，美國的分子設備公司（Molecular Devices, USA））測量450 nm波長處的吸光度信號。如圖9A和圖9B所示，沒有觀察到與其他CEACAM家族成員的交叉反應性，因此BGA113K僅表現出對CEA的特異性（圖9A-B中的CEACAM5）。 實例12.可溶性huCEA對BGA113K與CEA表現細胞的結合之影響
為了確定可溶性CEA（sCEA）是否對BGA113K的特異性結合有任何影響，將不同濃度（0、0.5、1、2 µg/ml）的重組可溶性CEA與（0.01-100 µg/ml）BGA113K預混合並孵育5分鐘。然後將混合物與2 × 10 5個CEA表現細胞諸如MKN45細胞在4°C下孵育30分鐘。將細胞用第二抗體抗huFc-APC（目錄號409320，美國的百進生化技術公司）染色並藉由流式細胞術分析。在2 µg/ml重組sCEA存在下，BGA113K與CEA表現細胞的結合不受影響。該結果針對MKN45細胞顯示（圖10），並表明BGA113K對CEA的膜結合形式的特異性。 實例13. BGA113誘導對CEA +腫瘤細胞的有效ADCC作用
為了確定野生型IgG1形式的BGA113是否可以誘導抗體依賴性細胞毒性（ADCC），將表現CD16（V158）的NK92MI細胞（NK92MI/CD16V）用作效應細胞，並與表現CEA的小鼠結腸癌細胞（CT26 - ATCC CRL-2638）共培養。在指定濃度（0.00005-5 μg/ml）的BGA113存在下，以1 : 1的E : T比率進行共培養5小時，並藉由乳酸脫氫酶（LDH）釋放確定細胞毒性。使用CytoTox™ 96非放射性細胞毒性測定套組（威斯康辛州麥迪森的普洛麥格公司（Promega, Madison, WI））測量上清液中LDH的量，並根據製造商的說明計算特異性裂解的量。如圖11所示，BGA113可在體外誘導ADCC，EC 50為約6.7 ng/ml。 實例14. BGA113的體內抗腫瘤功效
為了確定BGA113針對CEA +腫瘤細胞的體內功效，將NK92MI/CD16V細胞（5 × 10 6）與CT26/CEA細胞（10 6）混合並皮下注射到NCG小鼠中。在腫瘤注射當天開始，每週兩次給予BGA113（0.12、0.62或3.1 mg/kg）或媒介物對照（每組7隻小鼠）。與媒介物相比，3.1 mg/kg劑量的BGA113表現出少量的腫瘤抑制，儘管與媒介物對照的差異在統計學上不顯著（P ＞ 0.05）（圖12）。 實例15.重組蛋白和穩定細胞系的產生 用於噬菌體活動和結合測定的CD137重組蛋白
為了發現與人和獼猴CD137交叉結合但不與其他人TNF受體成員脫靶結合的針對CD137的VH結構域抗體，設計並表現了幾種重組蛋白用於噬菌體淘選和篩選（參見表17）。將全長人CD137（SEQ ID NO: 135）的cDNA編碼區根據CD137 GenBank序列（登錄號：NM_001561.4，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG10041-M）排序。將人CD137配體（TNFSF9）（SEQ ID NO: 145）根據（登錄號：NM_003811.3，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG15693-G）排序。將猴（獼猴）CD137（SEQ ID NO: 151）根據（登錄號：NM_001266128.1，該基因可獲自Genscript，目錄號：OMb00270）排序。將全長人CD40（SEQ ID NO: 157）根據（登錄號：NM_001250.4，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG10774-M）排序。將OX40（SEQ ID NO: 163）根據（登錄號：NM_003327.2，該基因可獲自Sinobio，目錄號：HG10481-UT）排序。簡言之，分別對由huCD137的胺基酸（AA）24-183（SEQ ID NO: 137）組成的細胞外結構域（ECD）的編碼區、由人CD137配體的AA 71-254（SEQ ID NO: 147）組成的ECD的編碼區、由cynoCD137的AA 24-186（SEQ ID NO: 153）組成的ECD的編碼區和由人CD40的AA 1-194（SEQ ID NO: 159）組成的ECD的編碼區進行了PCR擴增。對mIgG2a Fc（SEQ ID NO: 143）的編碼區進行了PCR擴增，然後藉由重疊PCR與人CD137、人CD137配體、猴CD137或人CD40的ECD軛合，以製備mIgG2a Fc融合蛋白。然後將PCR產物選殖到基於pcDNA3.1的表現載體（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司）中，產生五個重組mIgG2a Fc融合蛋白表現質體：人CD137 ECD-mIgG2a、人CD137配體mIgG2a、cyno CD137 ECD-mIgG2a和人CD40 ECD-mIgG2a。替代性地，將由huCD137（SEQ ID NO: 135）的AA 24-183（SEQ ID NO: 137）組成的ECD的編碼區和由人OX40（SEQ ID NO: 165）的AA 1-216組成的ECD的編碼區也選殖到基於pcDNA3.1的表現載體（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司）中，其C末端與6xHis標籤融合，從而分別產生人CD137-his和人OX40-his。為了產生重組融合蛋白，將質體瞬時轉染到基於HEK293的哺乳動物細胞表現系統（內部開發）中，並在裝備有旋轉振盪器的CO 2培養箱中培養5-7天。收集含有重組蛋白的上清液並離心澄清。使用蛋白A柱（目錄號：17127901，通用生命科學公司）或Ni-NTA瓊脂糖（目錄號：R90115，英傑公司）純化重組蛋白。將所有重組蛋白用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）透析，並以小等分試樣保存在-80°C冰箱中。 穩定表現細胞系
為了建立表現全長人CD137（huCD137）的穩定細胞系，將huCD137序列選殖到反轉錄病毒載體pFB-Neo（目錄號：217561，美國的安捷倫公司）中。根據先前的方案（Zhang等人, (2005) Blood [血液], 106, 1544-1551）產生雙嗜性反轉錄病毒載體。將含有huCD137的載體轉導到Hut78細胞（ATCC，TIB-161）或NK92-mi細胞（ATCC，CRL-2408）中，以產生huCD137表現細胞系Hut78/huCD137或NK92-mi/huCD137。藉由在含有10% FBS和G418的培養基中培養來選擇表現huCD137的細胞系，然後藉由FACS驗證。 [表17]：重組CD137蛋白的序列
構建體 SEQ ID NO： 序列
人CD137 FL AA SEQ ID NO: 135    MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
人CD137 FL DNA SEQ ID NO: 136 ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
人CD137 AA 24-183 SEQ ID NO: 137 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGH
人CD137 24-183 DNA SEQ ID NO: 138 CTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACAC
人CD137 -his SEQ ID NO: 139 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE
人CD137 -his DNA SEQ ID NO: 140 CTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACCATCACCATCACCATCACGGAGGCGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA
人CD137 ECD-mIgG2a AA SEQ ID NO: 141 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
人CD137 ECD-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 142 CTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
mIgG2a AA SEQ ID NO: 143 EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
mIgG2a DNA SEQ ID NO: 144 GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
人CD137配體AA SEQ ID NO: 145 MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
人CD137配體cDNA SEQ ID NO: 146 ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAA
人CD137配體71-254 AA SEQ ID NO: 147 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
人CD137配體71-254 DNA SEQ ID NO: 148 CGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
人CD137配體-mIgG2a AA SEQ ID NO: 149 EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
人CD137配體-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 150 GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCACGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
cyno CD137 FL AA SEQ ID NO: 151 MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQIIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
cyno CD137 FL DNA SEQ ID NO: 152 ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTGAACTTTGAGAGGACAAGATCCTTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGATATCACTGCCTGGGGGCAGAATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTTCTTTCTTGCGCTGACTTCGACTGTGGTACTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCGTGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGAGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCGGTACAAACCACTCAAGAGGAAGATGGATGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGA
cyno CD137 ECD 24-186 AA SEQ ID NO: 153 LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ
cyno CD137 ECD 24-186 DNA SEQ ID NO: 154 CTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGATATCACTGCCTGGGGGCAGAATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAG
cyno CD137 ECD-mIgG2a AA SEQ ID NO: 155 LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
cyno CD137 ECD-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 156 CTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTTCAGGATATCACTGCCTGGGGGCAGAATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAGCATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
人CD40 AA SEQ ID NO: 157 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
人CD40 DNA SEQ ID NO: 158 ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCCCTGGTGGTGATCCCCATCATCTTCGGGATCCTGTTTGCCATCCTCTTGGTGCTGGTCTTTATCAAAAAGGTGGCCAAGAAGCCAACCAATAAGGCCCCCCACCCCAAGCAGGAACCCCAGGAGATCAATTTTCCCGACGATCTTCCTGGCTCCAACACTGCTGCTCCAGTGCAGGAGACTTTACATGGATGCCAACCGGTCACCCAGGAGGATGGCAAAGAGAGTCGCATCTCAGTGCAGGAGAGACAGTGA
huCD40 ECD AA (1-194) SEQ ID NO: 159 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRA
huCD40 ECD DNA (1-194) SEQ ID NO: 160 ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCC
人CD40 ECD-mIgG2a AA SEQ ID NO: 161 MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRASEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
人CD40 ECD-mIgG2a DNA SEQ ID NO: 162 ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAGTTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCTAGCGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
人OX40 AA SEQ ID NO: 163 MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
人OX40 DNA SEQ ID NO: 164 ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCCGCCATCCTGGGCCTGGGCCTGGTGCTGGGGCTGCTGGGCCCCCTGGCCATCCTGCTGGCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCTGA
人OX40 ECD (1-216) AA SEQ ID NO: 165 MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVA
人OX40 ECD (1-216) DNA SEQ ID NO: 166 ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCC
人OX40 ECD-His AA SEQ ID NO: 167 MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAHHHHHH
人OX40 ECD-His DNA SEQ ID NO: 168 ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCCCATCACCATCACCATCAC
實例16.抗huCD137 VH結構域抗體的產生 合成人VH抗體庫的構建
合成文庫基本上使用種系3-23（SEQ ID NO: 169和170）構建。藉由使用簡並寡核苷酸的組合誘變進行重鏈CDR（HCDR）的隨機化。如Meetei（Meetei等人, (1998) Anal. Biochem [分析生物化學], 264, 288-91；Meetei等人, (2002) Methods Mol Biol [分子生物學方法], 182, 95-102）所述，藉由聚合酶鏈反應經由多個位點特異性突變進行HCDR1和HCDR2區的隨機化。對於CDR3區，合成了8至14（Kabat定義）的不同長度的簡並寡核苷酸（英傑公司），並藉由剪接重疊延伸PCR引入了多樣性。誘變步驟後的PCR產物由NcoI/NotI雙重消化並連接到噬菌粒載體pCANTAB-5E中。然後將該等庫轉化到大腸桿菌TG1細菌中，並藉由隨機殖株的DNA Sanger定序驗證（分析 ＞ 96個殖株）。在使用KM13輔助噬菌體的拯救步驟之後，藉由用PEG/NaCl直接從培養上清液中沈澱兩次來純化噬菌體。轉化到大腸桿菌中後獲得總大小為1.38 × 10 11的文庫。 [表18]：用於文庫構建的種系
3-23種系AA SEQ ID NO: 169 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAISWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
3-23種系DNA SEQ ID NO: 170 GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCGGCAGCGGCGGTAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCCGTGTATTATTGCGCGCGT
噬菌體展示淘選和篩選
使用標準方案藉由噬菌體展示進行噬菌體展示選擇（Silacci等人, (2005) Proteomics [蛋白質組學], 5, 2340-50；Zhao等人, (2014) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 9, e111339）。簡言之，在第1輪和第2輪中使用了在免疫管中的10 µg/ml固定化人CD137 ECD-mIgG2a（目錄號470319，賽默飛世爾科技公司）。在第3輪和第4輪中使用Hut78/huCD137細胞進行選擇。用補充有1% Tween 20（MPBST）的5%奶粉（w/v）的PBS溶液阻斷免疫管1小時。用PBST（補充有0.05% Tween 20的PBS緩衝液）洗滌後，每個子文庫的5 × 10 12個（第1輪）或5 × 10 11個（第2輪）噬菌體被MPBST中的人CD40 ECD-mIgG2a耗竭1小時，然後與抗原一起孵育1小時。對於第三輪和第四輪選擇，使用Hut78/huCD137細胞（第3輪）和HEK293（ATCC，CRL-1573）細胞作為耗竭細胞進行細胞淘選。用PBST洗滌後，用100 mM三乙胺（西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））洗脫結合的噬菌體。洗脫的噬菌體用於感染對數中期的大腸桿菌TG1細菌，並接種到補充有2%葡萄糖和100 µg/ml胺苄青黴素的TYE瓊脂板上。在四輪選擇之後，挑選單個殖株並使用標準方案製備含有噬菌體的上清液。噬菌體ELISA和FACS用於篩選抗huCD137 VH結構域抗體。
對於噬菌體ELISA，用抗原包被Maxisorp™免疫板，並用5%奶粉（w/v）的PBS緩衝液阻斷。將噬菌體上清液用MPBST阻斷30分鐘，然後添加到ELISA板的孔中1小時。用PBST洗滌後，使用HRP軛合的抗M13抗體（通用電氣醫療集團）和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物（目錄號：00-4201-56，美國的伊生物技術公司）檢測結合的噬菌體。使用Hut78/huCD137細胞藉由流式細胞術進一步驗證ELISA陽性殖株。將表現CD137的細胞（10 5個細胞/孔）與ELISA陽性噬菌體上清液一起孵育，然後與Alexa Fluro-647標記的抗M13抗體（通用電氣醫療集團）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。
挑選在FACS篩選中顯示陽性信號並結合huCD137和cynoCD137但不結合huOX40和huCD40的殖株並對其進行定序。鑒定了93個陽性殖株的大約76個獨特序列（圖13A至圖13B）。 Fc融合VH抗體的表現和純化
藉由比較序列同源性分析VH序列，並基於序列相似性分組。根據Kabat（Wu和Kabat (1970) J. Exp. Med.[實驗醫學雜誌] 132:211-250）和IMGT（Lefranc (1999) Nucleic Acids Research [核酸研究] 27:209-212）系統藉由序列注釋和藉由基於互聯網的序列分析來定義互補決定區（CDR）。兩個代表性靠前殖株BGA-7207和BGA-4712的胺基酸和DNA序列在下表19中列出。在藉由SPR對結合曲線進行序列檢查和分析之後，然後使用內部開發的表現載體將抗huCD137 VH結構域抗體構建為人Fc融合VH抗體形式（VH-Fc）。如圖14A所示，VH結構域抗體在人Fc的N末端與其間的G4S（SEQ ID NO: 324）連接子融合。使用了人IgG1（SEQ ID NO: 175）的Fc無效形式（沒有與FcγR結合的惰性Fc）。藉由轉染到293G細胞中並藉由使用蛋白A柱（目錄號17543802，通用生命科學公司）純化來實現Fc融合VH抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 [表19]：兩種所選擇的抗huCD137 VH結構域抗體的胺基酸和DNA序列
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-7207 SEQ ID NO: 60 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRLDTTEVGWVRQAPGKGLEWVSTIMGISGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVDSLFDDSAVFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 61 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCAGATTGGACACCACCGAAGTAGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCACCATCATGGGTATTAGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCGATTCCCTCTTTGATGACAGCGCCGTTTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 171 VH-Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRLDTTEVGWVRQAPGKGLEWVSTIMGISGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVDSLFDDSAVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 172 VH-Fc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCAGATTGGACACCACCGAAGTAGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCACCATCATGGGTATTAGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCGATTCCCTCTTTGATGACAGCGCCGTTTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
BGA-4712 SEQ ID NO: 70 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 71 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 173 VH-Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 174 VH-Fc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
惰性Fc SEQ ID NO: 175 Fc無效形式IgG1 DKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 176 Fc無效形式IgG1 DNA GACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
實例17.抗huCD137 VH結構域抗體的功能篩選
使用含有VH-Fc蛋白的上清液對所選擇的具有強激動作用的抗huCD137 VH結構域抗體進行功能篩選。簡言之，將96孔白色/透明底板（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher））與3 μg/ml抗hu CD3（英傑公司，目錄號16-0037-85）以50 µl/孔預孵育5分鐘，然後用PBS緩衝液洗去。接下來，將Hut78/huCD137細胞以5 × 10 5個細胞/ml重新懸浮，並以50 µl/孔（25,000孔/孔）直接鋪板到預包被的板中。將含有各種VH-Fc蛋白的上清液與細胞混合。替代性地，對於具有Fc融合的純化的VH結構域抗體，以25、5、1、0.2、0.04、0.008或0.0016 µg/ml以50 µl/孔一式兩份添加純化的VH-Fc蛋白製劑的劑量滴定。添加山羊抗hu IgG（H&L）聚苯乙烯顆粒（6.46 µm）（目錄號HUP-60-5，球體技術公司（Spherotech））作為交聯劑。將測定板在37°C下孵育過夜，並在24小時後測量IL-2的濃度。將數據繪製為與僅含培養基的孔中的濃度相比的IL-2倍數增加。圖14B示出了使用含有VH-Fc蛋白的上清液的代表性篩選結果，並且其中一個殖株BGA-4712已經顯示能夠以劑量依賴性方式刺激Hut78/huCD137細胞中的IL-2產生（圖14C）。 實例18.純化的抗huCD137 VH結構域抗體的表徵 通過ELISA表徵純化的抗體
對於抗原ELISA，用抗原包被Maxisorp™免疫板，並用3% BSA（w/v）的PBS緩衝液（阻斷緩衝液）阻斷。將單株VH結構域抗體用阻斷緩衝液阻斷30分鐘，然後添加到ELISA板的孔中1小時。用PBST洗滌後，使用HRP軛合的抗人IgG抗體（西格瑪公司，A0170）和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物（目錄號：00-4201-56，美國的伊生物技術公司）檢測結合的抗體。所有選擇的殖株都顯示與cynoCD137發生交叉反應，而不與人OX40 ECD和人CD40 ECD結合。 通過SPR分析表徵純化的抗體
藉由使用BIAcore™ T-200（通用生命科學公司）的SPR測定對抗huCD137 VH結構域抗體進行表徵。簡言之，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號：BR100839，通用生命科學公司）上。抗huCD137結構域抗體流過晶片表面並被抗人IgG（Fc）抗體捕獲。然後使人CD137 ECD-mIgG2a的連續稀釋液（6.0 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。 通過流式細胞術表徵純化的抗體
對於流式細胞術，將人CD137 +表現細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的VH結構域抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司（BioLegend, USA））結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。配體競爭也應用於基於流式細胞術的測定。簡言之，在連續稀釋的人CD137配體mIgG2a存在下，將Hut78/huCD137與Fc融合VH結構域抗體（VH-Fc）一起孵育，隨後用Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司）進行檢測。
然後表徵所選擇的VH結構域抗體的親和力、細胞結合和配體競爭。一個代表性靠前殖株BGA-4712的SPR研究、FACS分析和配體競爭結果在圖15A至圖15B中示出。 實例19.使用抗CD137 VH結構域抗體BGA-4712和抗CEA抗體構建CEAxCD137多特異性抗體
為了探索比單一抗體治療更有效的基於CD137的作用機制（MOA），已經構建並測試了多種利用抗huCD137 VH結構域抗體的多特異性形式。在此，已經採用多種形式來產生基於CD137的T細胞接合劑（TCE），其中第一抗原結合結構域針對腫瘤相關抗原（TAA），而第二抗原結合結構域靶向CD137活化受體。例如，抗CEA抗體BGA-113的第一抗原結合結構域（SEQ ID NO: 179和181）用於與抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712的第二抗原結合結構域（SEQ ID NO: 70）以如下所示的具體定義的形式配對（表20）。對於該構建體，使用惰性Fc（SEQ ID NO: 175）。藉由轉染到293G細胞中並藉由使用蛋白A柱（目錄號17543802，通用生命科學公司）純化來實現該等多特異性抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。 形式A（A-CD137/CEA）
形式A提供具有Fab×VH組態的對稱IgG樣多特異性分子。如圖16A所示，抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與抗CEA抗體的Fc（CH3結構域）的c末端融合，在它們（SEQ ID NO: 179和177）之間具有一個G4S連接子（SEQ ID NO: 324）。 形式B（B-CD137/CEA）
形式B也提供具有Fab×VH組態的對稱IgG樣多特異性分子。如圖16B所示，抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與抗CEA抗體的輕鏈（Cκ）的c末端融合，在它們（SEQ ID NO: 181和183）之間具有一個G4S連接子（SEQ ID NO: 324）。 形式C（C-CD137/CEA）
形式C提供具有Fab×VH組態的對稱VH抗體樣多特異性分子。如圖16C所示，抗CEA抗體的Fab區與抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712的VH的N末端融合，在它們（SEQ ID NO: 179和185）之間具有一個G4S連接子（SEQ ID NO: 324）。 形式D（D-CD137/CEA）
形式D也提供具有Fab×VH組態的對稱IgG樣多特異性分子。如圖16D所示，抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與抗CEA抗體的重鏈（Vh）的N末端融合，在它們（SEQ ID NO: 179和187）之間具有一個G4S連接子（SEQ ID NO: 324）。
各種CD137/CEA多特異性抗體的產率和生化特性總結在表21中。對於兩種分子A-CD137/CEA和D-CD137/CEA，基於SEC-HPLC譜，單體都高於95%（表21）。藉由基於流式細胞術的測定，證明了在形式A中抗CEA臂的親和力降低非常小，而在形式D中抗CEA臂的親和力顯著降低（圖17A）。還證明了在形式A中CD137臂的親和力降低，而在形式D中對親和力的影響很小或沒有影響（圖17D）。 [表20]：多種形式的CEAxCD137多特異性抗體的胺基酸和DNA序列
構建體 鏈 SEQ ID NO 序列
A-CD137/CEA A-BGA-4712/CEA重鏈AA SEQ ID NO: 177 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
A-BGA-4712/CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 178 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
抗CEA Ab輕鏈AA SEQ ID NO: 179 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CEA Ab輕鏈DNA SEQ ID NO: 180 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
B-CD137/CEA 抗CEA Ab重鏈AA SEQ ID NO: 181 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗CEA Ab重鏈DNA SEQ ID NO: 182 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
B-BGA-4712/CEA輕鏈AA SEQ ID NO: 183 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
B-BGA-4712/CEA輕鏈DNA SEQ ID NO: 184 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGCGGGGGAGGCGGGTCCGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
C-CD137/CEA C-BGA-4712/CEA重鏈AA SEQ ID NO: 185 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
C-BGA-4712/CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 186 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACGGGGGAGGCGGGTCcGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGTCTGGTGGAGGCGGTTCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCTGCTGCCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
抗CEA Ab輕鏈AA SEQ ID NO: 179 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CEA Ab輕鏈DNA SEQ ID NO: 180 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
D-CD137/CEA D-BGA-4712/CEA重鏈AA SEQ ID NO: 187 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
D-BGA-4712/CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 188 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCATGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGACAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACTCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGAATAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGTCCGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
抗CEA Ab輕鏈AA SEQ ID NO: 179 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗CEA Ab輕鏈DNA SEQ ID NO: 180 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
[表21]：產率和生化特性的總結
抗體形式 產率（mg/L） HMW（%） 單體（%） LMW（%） 人CD137 ECD-mIgG2a SPR KD（M） CT26/CEA EC50（μg/ml） Hut78/huCD137 EC50（μg/ml）
A-CEAxCD137 30.00 1.28 96.34 2.39 3.60E-07 0.75 0.57
D-CEAxCD137 11.00 1.80 98.19% 0.0 7.80E-08 3.78 2.28
實例20.基於CD137的多特異性抗體A-CEAxCD137以CEA依賴性方式活化CD137 基於CD137的多特異性抗體在CD137表現細胞中誘導CD137活化
為了測試基於CD137的多特異性抗體誘導CD137 +細胞對CEA +腫瘤細胞刺激的反應的能力，使用Hut78/huCD137測試CD137活化。根據先前描述的方案（Zhang等人, 2005同上），藉由反轉錄病毒轉導到CT26（ATCC CRL-2638）中產生CEA表現CT26（CT26/CEA）細胞。在OKT3預包被的96孔板中，在CEAxCD137多特異性構建體的存在下，將Hut78/huCD137細胞與CT26/CEA或CT26（CEA陰性）細胞共培養過夜，並測量介白素-2（IL-2）作為Hut78/huCD137細胞中CD137活化的指示劑。如圖18A所示，在CEA +CT26/CEA細胞存在下，A-CEAxCD137以劑量依賴性方式誘導Hut78/huCD137細胞分泌IL-2。在沒有CEA +CT26/CEA細胞的情況下沒有觀察到IL-2的誘導。 基於CD137的多特異性抗體在人周邊血單核細胞（PBMC）中誘導CD137活化
藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司（Sigma-St. Louis MO））分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。根據先前描述的方案（Zhang等人, 2005同上），藉由反轉錄病毒轉導到HEK293（ATCC CRL-1573）中產生OS8表現HEK293（HEK293/OS8）細胞。為了確定CD137/CEA多特異性抗體是否可以在CEA +腫瘤細胞存在下活化T細胞，將PBMC（2 × 10 5個/孔）與HEK293/OS8和CT26/CEA細胞在CD137/CEA多特異性抗體存在下共培養48小時。藉由測量PBMC中的IFN-γ來確定CD137/CEA多特異性抗體對CD137的活化。結果表明，在CEA表現細胞存在下，A-CD137/CEA可以在PBMC中誘導顯著的CD137活化（圖18B）。 實例21.工程化和親和力成熟 工程化
對所選擇的殖株BGA-4712進行了工程化，以改善生物化學和生物物理特性。考慮因素包括胺基酸組成、熱穩定性（Tm）、表面疏水性、翻譯後修飾（PTM）位點和等電點（pI）的去除，同時保持功能活性。取代主要在基於BGA-4712序列的HCDR和框架區中進行。取代包括胺基酸改變F28R、M29T、V35M、V37F或Y、G44E、L45R或G或Y，以及W47G或S或F或L或R或Y、D62E、S75A、N84S、W103R（Kabat定義）。如前所述，變體以Fc融合VH和A-CD137/CEA多特異性抗體形式表現。鑒定了沒有顯著親和力降低的取代（表22）。進行了突變的組合。BGA-4712-M3和BGA-7556的序列揭露於表23和表24中。 親和力成熟
為了進一步探索潛在有效的基於CD137的作用機制（MOA），我們旨在藉由噬菌體展示產生具有改善的藥物開發性的親和力成熟的BGA-4712-M3變體。文庫構建如前所述。簡言之，藉由標準分子生物學技術使用噬菌粒載體pCANTAB 5E（通用電氣醫療集團（GE Healthcare））構建噬菌粒，該噬菌粒被設計成在M13噬菌體的表面上展示CH3-G4S（連接子）-BGA-4712-M3（表25）作為與基因-3次要外殼蛋白片段的N末端的融合體。使用標準方案藉由噬菌體展示進行親和力成熟的BGA-4712變體的產生（Silacci等人, (2005) Proteomics [蛋白質組學], 5, 2340-50；Zhao等人, (2014) PLoS One [公共科學圖書館：綜合], 9, e111339）。使用噬菌粒作為模板來構建含有2.0 × 10 8個獨特成員的噬菌體展示文庫。所有三個CDR隨機化，但每個CDR在每個殖株中具有最多一個突變，HCDR3除外，其可具有兩個同時突變。每個位置用編碼任何胺基酸的NNK密碼子（IUPAC編碼）或琥珀終止密碼子隨機化。
在四輪選擇之後，每個HCDR中的突變頻率相對較高。圖19示出了四輪選擇後HCDR區的序列。所有突變都被引入BGA-7556（SEQ ID NO: 86）中以產生親和力成熟的變體，BGA-3386除外，其突變被引入BGA-4712-M3（SEQ ID NO: 75）中。所有變體均以單株抗體（VH-Fc）和它們相應的多特異性抗體形式A（A-CEAxCD137）表現。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-10 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。
藉由使用BIAcore™ T-200（通用生命科學公司）的SPR測定和所述流式細胞術進行CD137親和力成熟變體的親和力比較。序列資訊顯示在表28中，抗huCD137抗體的SPR測定的結合概況的結果總結在表26和表27中。 [表22]：CD137結合親和力的比較
抗體 形式 SEC-HPLC（%） KD (M) Hut78/huCD137細胞的EC50（µg/ml）
BGA-4712-M3 Fc融合VH 97.98 1.69E-07 2.37
BGA-4712-M3 形式A-CEAxCD137 97.06 2.55E-07 0.52
BGA-7556 Fc融合VH 98.36 2.00E-07 5.71
BGA-7556 形式A-CEAxCD137 92.30 6.69E-07 3.23
[表23]：BGA-4712-M3的序列資訊
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-4712-M3 SEQ ID NO: 75 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 76 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
BGA-4712-M3-mutFc SEQ ID NO: 189 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 190 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
A-CEAxCD137-M3    SEQ ID NO: 191 AA GSATMDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 192 DNA GGATCCGCCACCATGGATATGAGAGTTCCTGCTCAATTGCTGGGGTTGCTCTTGCTCTGGTTTCCTGGCTCGAGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCGTGAAAGCTTCGTCAG
[表24]：Fc融合VH和A-CEAxCD137多特異性抗體形式中BGA-7556的序列資訊
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-7556 SEQ ID NO: 86 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 87 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BGA-7556-mutFc SEQ ID NO: 193 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 194 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
形式A- BGA-7556    SEQ ID NO: 195 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 196 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
[表25]：序列資訊
構建體 SEQ ID NO    序列
CH3    SEQ ID NO: 197 AA GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 198 DNA GGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
CH3- BGA-4712-M3 SEQ ID NO: 199 AA GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 200 DNA GGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGTTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
[表26]：親和力成熟的BGA-4712變體作為Fc融合抗體的親和力比較
殖株編號 形式 SEC-HPLC（%） KD (M)
BGA-5623 Fc融合VH 97.62 5.03E-08
BGA-2690 97.82 6.75E-05
BGA-3849 98.75 7.63E-08
BGA-7916 97.57 8.77E-08
BGA-4988 97.71 1.03E-06
BGA-5164 99.07 1.38E-05
BGA-3953 97.29 4.83E-08
BGA-5385 97.86 1.00E-07
BGA-9468 97.56 1.90E-07
BGA-3285 97.83 1.86E-07
BGA-9442 98.6 1.51E-07
BGA-7746 97.68 1.93E-07
BGA-8425 98.2 9.34E-08
BGA-6468 92.00 1.12E-08
BGA-4712-M3 97.98 1.69E-07
BGA-7556 98.36 2.00E-07
[表27]：親和力成熟的BGA-4712變體的親和力比較
殖株編號 形式 SEC-HPLC（%） KD (M)
形式A -BGA-5623 A-CEAxCD137 94.55 9.48E-08
形式A - BGA-2690 - -
形式A - BGA-3849 - -
形式A- BGA-7916 98.38 2.03E-07
形式A- BGA-4988 98.43 -
形式A - BGA-5164 98.36 -
形式A - BGA-3953 96.19 1.15E-07
形式A - BGA-5385 97.18 1.54E-07
形式A - BGA-9468 98.55 8.73E-07
形式A - BGA-3285 97.32 7.98E-07
形式A - BGA-9442 98.67 1.64E-07
形式A - BGA-7746 97.66 2.45E-07
形式A - BGA-8425 95.69 1.89E-07
形式A - BGA-3386 87.00 2.14E-08
形式A - BGA-4712-M3 97.06 2.89E-07
形式A - BGA-7556 92.3 6.49E-07
[表28]：親和力成熟的BGA-4712變體的序列資訊
SEQ ID NO: 84 BGA-5623 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 85 BGA-5623 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 201 BGA-2690 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSREDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGSSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 202 BGA-2690 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCAGAGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTCGGTTCTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 203 BGA-3849 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSHEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 204 BGA-3849 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCCATGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCCGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 205 BGA-7916 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 206 BGA-7916 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 207 BGA-4988 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDRGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 208 BGA-4988 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCGGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 209 BGA-5164 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 210 BGA-5164 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 211 BGA-3953 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 212 BGA-3953 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATtcGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 213 BGA-5385 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVIYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 214 BGA-5385 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTATCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 215 BGA-9468 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHSGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 216 BGA-9468 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATtcGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATTCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 217 BGA-3285 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 218 BGA-3285 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 219 BGA-9442 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 220 BGA-9442 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 221 BGA-7746 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 222 BGA-7746 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCAGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACGCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 223 BGA-8425 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 224 BGA-8425 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 225 BGA-3386 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 226 BGA-3386 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 227 BGA-5623-mutFc-AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 228 BGA-5623-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 229 BGA-2690- mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSREDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGSSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 230 BGA-2690 mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCAGAGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTCGGTTCTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
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SEQ ID NO: 232 BGA-3849 mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCCATGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCCGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
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SEQ ID NO: 234 BGA-7916-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
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SEQ ID NO: 236 BGA-4988-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCGGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 237 BGA-5164-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 238 BGA-5164-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 239    BGA-3953-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 240 BGA-3953-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATtcGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 241 BGA-5385-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDHGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVIYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 242 BGA-5385-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGcTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTATCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 243 BGA-9468-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHSGGGVTFDLRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 244 BGA-9468-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATTCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 245 BGA-3285-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 246 BGA-3285-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 247 BGA-9442-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDLRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 248 BGA-9442-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 249 BGA-7746-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 250 BGA-7746-mutFc DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCAGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACGCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAA
SEQ ID NO: 251 BGA-8425-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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SEQ ID NO: 253 BGA-3386-mutFc AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTWGQGTLVTVSSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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SEQ ID NO: 256 形式A BGA-5623 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 257 形式A BGA-2690 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSREDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGSSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
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SEQ ID NO: 259 形式A BGA-3849 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSHEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 260 形式A BGA-3849 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCCATGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCCGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 262 形式A BGA-7916 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 264 形式A BGA-4988 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCGGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 266 形式A BGA-5164 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTATCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 268 形式A BGA-3953 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATtcGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
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SEQ ID NO: 270 形式A BGA-5385 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATCATGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTATCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 271 形式A BGA-9468 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHSGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 272 形式A BGA-9468 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATTCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 273 形式A BGA-3285 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 274 形式A BGA-3285 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 275 形式A BGA-9442 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARYVYHAGGGVTFDLRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 276 形式A BGA-9442 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGATTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCTGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCTATGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATCTTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 277 形式A BGA-7746 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDFGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 278 形式A BGA-7746 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTTTGGTGGTTCGACATACTATGCAGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACGCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 279 形式A BGA-8425 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVVYHAGGGVTYDYRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 280 形式A BGA-8425 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGCTGTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATTCGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCGTCGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTATGATTACCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 281 形式A BGA-3386 AA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 282 形式A BGA-3386 DNA CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTTGGGGACAGGGCACCTTAGTTACAGTCTCATCG
實例22.抗CD137抗體BGA-5623之結合概況
BGA-5623由人IgG1 Fc融合體產生，並藉由使用BIAcore™ T-200（通用生命科學公司）的SPR測定表徵其結合動力學。簡言之，將抗人IgG（Fc）抗體固定在活化的CM5生物感測器晶片（目錄號：BR100839，通用生命科學公司）上。抗huCD137結構域抗體流過晶片表面並被抗人IgG（Fc）抗體捕獲。然後使人CD137 ECD-mIgG2a或cyno CD137 ECD-mIgG2a的連續稀釋液（6.0 nM至2150 nM）流過晶片表面，並藉由使用一對一Langmuir結合模型（BIA評估軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（k on）和解離速率（k off）。將平衡解離常數（K D）計算為比率k off/k on。結果表明，BGA-5623對cynoCD137的親和力高於對huCD137的親和力，如下表29所示。為了評估抗huCD137 VH結構域抗體與活細胞上的天然huCD137的結合活性，轉染Hut78細胞以過表現人CD137。將表現Hut78/huCD137的活細胞接種在96孔板中，並與連續稀釋的抗huCD137 VH結構域抗體一起孵育。將山羊抗人IgG用作二抗來檢測抗體與細胞表面的結合。與人天然CD137的劑量依賴性結合的EC 50值藉由用GraphPad Prism™將劑量反應數據與四參數邏輯模型擬合來確定。如圖20所示，BGA-5623以劑量反應方式與活細胞上的天然CD137特異性結合，EC50為2.97 µg/ml。
通過ELISA評估BGA-5623的脫靶特異性。TNF受體家族成員諸如TNFRSF1A（CD120a）（目錄號10872-H08H，中國的義翹神州公司）、TNFRSF1B（CD120b）（目錄號10417-H08H1，中國的義翹神州公司）、TNFRSF4（OX40）（SEQ ID NO: 167）、TNFRSF5（CD40）（SEQ ID NO: 161）、TNFRSF7（CD27）（目錄號10039-H08B1，中國的義翹神州公司）、TNFRSF9（CD137）（SEQ ID NO: 135）和TNFRSF18（GITR）（目錄號13643-H08H，中國的義翹神州公司）以10 µg/ml的濃度在4°C下包被在96孔板中過夜。添加了與野生型IgG1 Fc（SEQ ID NO: 283）融合的BGA-5623。如圖21所示，沒有觀察到與其他TNF受體家族成員的結合。 [表29]：藉由SPR確定的親和力
樣本 種類 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
BGA-5623 huCD137 2.12E+05 5.03E-03 2.38E-08
cynoCD137 1.30E+05 2.54E-03 1.96E-08
[表30]：胺基酸和DNA序列
抗體 SEQ ID NO    序列
BGA-5623 SEQ ID NO: 84 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 85 VH DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
SEQ ID NO: 283 IgG1 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 284 IgG1 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 285 IgG4 AA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 286 IgG4 DNA GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAATCCAAGTATGGTCCGCCATGTCCACCGTGCCCGGCACCCGAGTTTTTGGGAGGGCCTAGTGTGTTTTTGTTTCCTCCTAAGCCAAAGGACACGCTTATGATTAGTCGCACACCCGAGGTTACCTGTGTAGTGGTGGACGTATCACAAGAGGATCCGGAAGTCCAATTTAATTGGTACGTCGACGGAGTGGAAGTCCACAATGCAAAGACCAAGCCTAGGGAAGAACAGTTCAATTCTACCTATCGCTGGTCTGTACTCACTGTACTCCACCAGGATTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAATGCAAGGTTTCCAACAAAGGGCTCCCCTCTTCCATTGAGAAAACTATTAGCAAGGCTAAAGGCCAACCCAGAGAACCACAGGTTTATACCCTTCCACCTTCCCAGGAGGAGATGACGAAGAATCAGGTTAGTCTTACGTGCCTCGTTAAAGGATTCTACCCTTCAGATATCGCAGTTGAATGGGAGTCTAACGGGCAACCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCGCCGGTGCTGGACTCAGATGGTAGTTTCTTTCTTTACAGTCGGCTTACCGTCGACAAGTCACGCTGGCAGGAGGGAAATGTATTCTCCTGCAGCGTAATGCACGAAGCTCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCACTGAGCCTTTCTCTGGGTAAG
實例23.丙胺酸掃描對BGA-5623之表位作圖
為了表徵BGA-5623的結合表位，基於來自先前報導的CD137的晶體結構的資訊（Bitra等人, (2018) J Biol Chem [生物化學雜誌], 293, 9958-9969；Chin等人, (2018) Nat. Commun.[自然通訊] 9, 4679），將人CD137的17個胺基酸殘基單獨突變為丙胺酸以產生17個單突變huCD137變體。
CD137突變體與野生型CD137一起在HEK293細胞（ATCC CRL-1573）中瞬時表現。藉由流式細胞術分析它們被BGA-5623識別和結合。藉由使用公開可獲得的烏瑞魯單抗序列在內部產生的烏瑞魯單抗類似物（SEQ ID NO: 287-290）用於同一測定以監測CD137突變體的表現。在該測定中，將人CD137或人CD137突變體表現細胞（10 5個細胞/孔）與2 µg/ml純化的BGA-5623-mutFc（Fc融合VH Ab）或烏托魯單抗類似物一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司）結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。所有結果用野生型CD137結合信號的螢光讀數平均值作為標準進行標準化。為了簡化數據分析，如果特異性突變型CD137的抗體的FACS結合信號下降到或低於25%，則該位點的胺基酸被認為對於表位係關鍵的。如圖22A所示，BGA-5623的表位在CD137的胺基酸F36、I44、P47、P49和S52處具有重要的結合殘基。
為了進一步研究BGA-5623表位，表現並純化具有單AA取代的人CD137 ECD突變體以準備用於ELISA。此外，藉由使用可公開獲得的烏托魯單抗序列在內部產生烏托魯單抗類似物抗體（SEQ ID NO: 291-294）。藉由直接ELISA，藉由BGA-5623分析CD137突變體和野生型CD137的結合。簡言之，將各50 ng野生型或突變型CD137包被在ELISA板中。阻斷後，向板中加入100 μl濃度為2 μg/ml的BGA-5623-mutFc、烏瑞魯單抗類似物或烏托魯單抗類似物抗體，並藉由HRP-連接的二抗檢測各抗體的結合信號。在使用野生型或突變型huCD137的ELISA結合測定中，胺基酸F36A、P47A和P49A顯著削弱CD137與BGA-5623的結合（圖22A至圖22B）。在胺基酸F36A處的改變僅輕微降低了烏瑞魯單抗或烏托魯單抗類似物的結合，這表明F36A在CD137的構象完整性中起關鍵作用。相比之下，在胺基酸P47A或P49A處的改變均不破壞烏瑞魯單抗或烏托魯單抗類似物與CD137的結合，這表明BGA-5623、烏瑞魯單抗類似物或烏托魯單抗具有不同的表位。該數據表明，胺基酸F36A、P47A和P49A係抗體BGA-5623的表位中的關鍵殘基。 [表31]：胺基酸和DNA序列
抗體 SEQ ID NO    序列
烏瑞魯單抗類似物 SEQ ID NO: 287 重鏈AA QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 288 重鏈DNA CAAGTTCAACTTCAGCAGTGGGGAGCGGGTCTCTTGAAGCCTAGTGAGACGCTGAGCCTGACCTGTGCAGTCTACGGGGGTTCATTTTCTGGGTACTACTGGTCCTGGATACGCCAAAGCCCAGAGAAAGGCCTGGAATGGATTGGGGAGATAAATCACGGGGGTTATGTGACATATAATCCTTCTCTTGAGAGCCGGGTCACGATATCTGTTGACACAAGTAAAAATCAGTTCTCCCTCAAACTGAGCTCCGTTACCGCAGCAGACACTGCCGTTTACTACTGTGCGCGGGACTATGGGCCAGGTAATTACGATTGGTACTTCGACCTGTGGGGTAGAGGAACGCTGGTCACTGTAAGCAGTGCATCTACAAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTTGCACCATGTTCACGGAGCACTAGTGAAAGCACTGCCGCGCTCGGGTGTCTCGTTAAGGATTATTTTCCGGAGCCTGTCACTGTCTCTTGGAACTCTGGTGCACTGACATCAGGCGTTCACACGTTCCCTGCAGTACTCCAGAGCTCAGGATTGTACAGCCTGTCCAGTGTAGTTACAGTGCCTTCCTCCTCCCTTGGAACAAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCATAAGCCCAGCAATACGAAAGTAGACAAACGAGTCGAATCCAAGTATGGTCCGCCATGTCCACCGTGCCCGGCACCCGAGTTTTTGGGAGGGCCTAGTGTGTTTTTGTTTCCTCCTAAGCCAAAGGACACGCTTATGATTAGTCGCACACCCGAGGTTACCTGTGTAGTGGTGGACGTATCACAAGAGGATCCGGAAGTCCAATTTAATTGGTACGTCGACGGAGTGGAAGTCCACAATGCAAAGACCAAGCCTAGGGAAGAACAGTTCAATTCTACCTATCGCTGGTCTGTACTCACTGTACTCCACCAGGATTGGCTCAATGGAAAGGAATACAAATGCAAGGTTTCCAACAAAGGGCTCCCCTCTTCCATTGAGAAAACTATTAGCAAGGCTAAAGGCCAACCCAGAGAACCACAGGTTTATACCCTTCCACCTTCCCAGGAGGAGATGACGAAGAATCAGGTTAGTCTTACGTGCCTCGTTAAAGGATTCTACCCTTCAGATATCGCAGTTGAATGGGAGTCTAACGGGCAACCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCGCCGGTGCTGGACTCAGATGGTAGTTTCTTTCTTTACAGTCGGCTTACCGTCGACAAGTCACGCTGGCAGGAGGGAAATGTATTCTCCTGCAGCGTAATGCACGAAGCTCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCACTGAGCCTTTCTCTGGGTAAG
SEQ ID NO: 289 輕鏈AA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 290 輕鏈DNA GAAATCGTGCTGACCCAATCACCTGCGACCCTCTCCCTTAGCCCTGGAGAACGAGCAACTCTCAGTTGCAGAGCAAGCCAGAGCGTCAGCTCATATCTCGCATGGTATCAACAAAAACCAGGCCAAGCTCCTAGACTGTTGATTTATGATGCCTCTAACCGGGCGACTGGCATACCAGCCCGCTTTAGCGGGTCTGGGAGTGGCACTGATTTTACGCTCACGATTTCATCTTTGGAGCCAGAAGATTTCGCTGTATACTACTGTCAACAAAGGTCAAACTGGCCGCCTGCACTTACGTTCGGCGGGGGTACCAAGGTGGAGATTAAGAGGACAGTTGCGGCGCCATCAGTTTTTATATTCCCACCCTCCGATGAGCAGTTGAAAAGTGGCACGGCATCAGTTGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTATCCACGGGAGGCGAAAGTCCAATGGAAAGTGGACAATGCGCTTCAGAGCGGGAACTCTCAGGAGAGTGTCACTGAACAGGATTCAAAGGACTCCACGTACTCACTCTCATCCACTCTCACCCTTTCAAAGGCGGATTACGAAAAGCATAAGGTCTACGCTTGTGAGGTAACACATCAGGGGCTTTCCAGTCCTGTAACCAAGAGCTTCAATCGCGGCGAATGC
烏托魯單抗類似物 SEQ ID NO: 291 重鏈AA EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 292 重鏈DNA GAAGTTCAACTGGTACAGTCCGGTGCTGAAGTTAAAAAACCCGGAGAGAGTCTGAGAATCTCTTGCAAGGGGTCTGGGTACTCTTTTAGTACATATTGGATATCTTGGGTGAGACAAATGCCGGGGAAAGGCCTCGAATGGATGGGCAAGATTTATCCCGGAGACAGCTATACAAATTACTCACCTAGTTTTCAAGGTCAGGTAACTATCAGCGCGGACAAATCCATAAGTACGGCCTATCTGCAATGGTCTTCCTTGAAGGCATCCGACACGGCGATGTATTACTGCGCAAGAGGGTATGGTATATTCGATTACTGGGGGCAGGGCACTCTCGTTACCGTGAGCAGCGCTTCAACAAAAGGCCCATCTGTCTTCCCTCTCGCGCCTTGCTCCCGCTCTACTTCAGAGTCAACAGCTGCTCTGGGGTGCTTGGTGAAGGATTACTTTCCTGAACCGGTTACTGTCAGCTGGAATTCTGGGGCTTTGACGAGCGGAGTTCACACTTTCCCAGCTGTACTGCAAAGTTCTGGACTTTACAGCTTGAGCTCCGTGGTGACAGTGCCGAGCTCAAACTTCGGTACGCAGACATATACATGCAATGTGGATCATAAACCCAGCAATACGAAAGTAGATAAGACAGTCGAAAGGAAGTGTTGTGTAGAGTGCCCACCGTGCCCCGCCCCTCCGGTTGCAGGCCCATCAGTGTTTCTCTTCCCGCCCAAACCTAAGGACACGCTGATGATTTCACGAACGCCCGAGGTCACCTGTGTCGTAGTCGATGTGTCCCATGAGGACCCAGAAGTTCAGTTCAATTGGTATGTAGACGGCGTGGAGGTACACAATGCAAAAACGAAACCACGCGAGGAACAGTTCAATAGTACGTTCCGGGTCGTGAGTGTGCTCACGGTGGTTCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAAGAATATAAGTGCAAAGTATCCAATAAAGGCCTGCCCGCACCCATCGAAAAAACTATAAGTAAAACTAAAGGGCAACCGCGAGAGCCTCAGGTCTATACTTTGCCACCGTCACGCGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTAAGTCTTACTTGCTTGGTCAAGGGGTTCTACCCCTCAGATATAGCGGTGGAGTGGGAATCCAATGGCCAACCCGAGAACAATTACAAGACAACACCACCAATGCTGGACTCTGACGGGAGTTTCTTTCTGTATAGTAAACTTACCGTCGATAAATCACGCTGGCAGCAAGGCAACGTATTCTCATGCTCAGTAATGCATGAAGCCTTGCATAATCACTACACTCAGAAAAGCCTGTCCCTCTCTCCAGGTAAG
SEQ ID NO: 293 輕鏈AA SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 294 輕鏈DNA AGCTACGAGTTGACTCAGCCACCATCCGTCAGTGTTAGCCCCGGACAGACGGCGTCAATTACTTGTAGTGGAGACAACATTGGCGATCAGTACGCCCATTGGTATCAGCAAAAACCGGGTCAATCACCAGTTCTGGTGATATATCAGGATAAGAATCGACCATCAGGGATTCCAGAGAGGTTCTCAGGTAGTAACTCAGGTAACACAGCTACTCTGACCATAAGTGGTACCCAGGCTATGGACGAAGCAGACTACTACTGCGCCACCTACACAGGCTTCGGATCACTTGCGGTTTTCGGGGGCGGAACCAAACTAACCGTTCTTGGGCAACCTAAGGCTGCCCCGTCCGTGACTCTTTTTCCTCCGTCTTCCGAAGAGCTTCAAGCCAATAAAGCAACCTTGGTATGTTTGATTTCCGATTTTTACCCTGGAGCGGTGACGGTGGCATGGAAAGCTGATTCAAGCCCTGTGAAAGCTGGGGTGGAAACTACTACGCCGTCCAAACAGAGCAATAATAAGTACGCGGCCTCCAGCTATTTGTCACTTACCCCGGAGCAATGGAAGTCACACCGAAGTTACAGTTGTCAAGTTACTCACGAAGGCAGCACTGTTGAAAAGACCGTAGCACCCACCGAATGCTCA
實例24.配體競爭
人CD137結合其主要配體人CD137配體（CD137L），親和力較弱，Kd為約三位數M（Chin等人, (2018) Nat Commun [自然通訊] 9, 4679）。上述實例23中的表位作圖結果顯示CD137的胺基酸殘基F36A、P47A和P49A係構成BGA-5623抗體的表位的一部分的關鍵胺基酸殘基。此外，配體沿受體CRD-2的全長和CRD-3的A2模體結合CD137，並且受體與配體之間的介面主要由氫鍵和凡得瓦相互作用介導（Bitra等人, (2018) J Biol Chem [生物化學雜誌], 293, 9958-9969）。基於該數據，假設BGA-5623抗體可以阻斷CD137/CD137配體相互作用。用人IgG4 Fc融合產生BGA-5623。對於CD137配體競爭ELISA，用人CD137 ECD-mIgG2a包被Maxisorp免疫板，並用3% BSA（w/v）的PBS緩衝液（阻斷緩衝液）阻斷。將VH結構域抗體BGA-5623用阻斷緩衝液阻斷30分鐘，並在連續稀釋的人CD137配體ECD-mIgG2a存在下添加到ELISA板的孔中1小時。用PBST洗滌後，使用HRP軛合的抗人IgG抗體（西格瑪公司，A0170）和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺底物（目錄號：00-4201-56，美國的伊生物技術公司）檢測結合的抗體（圖23A）。為了藉由流式細胞術測定CD137配體競爭，在連續稀釋的BGA-5623存在下，將CD137穩定轉導的細胞系Hut78/huCD137與人CD137配體ECD-mIgG2a一起孵育，然後用山羊抗鼠IgG-APC檢測（圖23B）。如圖23A-B所示，BGA-5623與CD137配體競爭並減少CD137/CD137配體相互作用。 實例25.結構性和功能性CD137表位作圖
為了更好地理解抗CD137單結構域抗體臂如何能夠高親和力結合CD137，以及CD137/CD137L相互作用的強效促效劑，確定了與CD137複合的VH（BGA-5623）的晶體結構。 A. CD137和VH（BGA-5623）的表現、純化和結晶
在HEK293G細胞中表現含有四個CRD（1-4；胺基酸24-162）的人CD137細胞外結構域，其攜帶有C121S、N138D和N149Q突變。將編碼CD137的cDNA選殖到具有N末端分泌序列和C末端TEV切割位點隨後是Fc標籤的內部表現載體中。將含有分泌的CD137-Fc融合蛋白的培養上清液與Mab Select Sure™樹脂（GE醫療生命科學公司（GE Healthcare Life Sciences））在4°C下混合3小時。用含有20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl的緩衝液洗滌蛋白質，然後用50 mM乙酸（用5 M NaOH將pH值調節至3.5）洗脫，最後用1/10 CV 1.0 M Tris-HCl pH 8.0中和。將洗脫的蛋白質與TEV蛋白酶（10:1莫耳比）混合，並在4°C下用緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl）透析過夜。將混合物上樣到Ni-NTA柱（凱傑公司（Qiagen））和Mab Select Sure™樹脂上以除去TEV蛋白酶和Fc標籤，然後使用HiLoad 16/600 Superdex™ 75pg柱（GE醫療生命科學公司）在緩衝液（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中藉由粒徑排阻層析法進一步純化流出物。
將編碼VH（BGA-5623）的DNA序列選殖到具有N末端HIS-MBP標籤隨後是TEV蛋白酶位點的PET21a載體中。在OD600為0.6-1.0時，用1 mM IPTG在18°C下誘導Shuffle T7中的蛋白質表現16小時。藉由以7,000g離心10分鐘收穫細胞。將細胞沈澱重新懸浮在裂解緩衝液（50 mM Na 3PO 4pH 7.0、300 mM NaCl）中，並在冰上超音波裂解。然後將裂解物在4°C下以48,000 g離心30分鐘。將上清液與Talon樹脂混合並在4°C下分批次處理3小時。用含有5 mM咪唑的裂解緩衝液洗滌樹脂，用含有另外100 mM咪唑的裂解緩衝液洗脫蛋白質。將洗脫液與TEV蛋白酶（10 : 1莫耳比）混合，並在4°C下用緩衝液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl）透析過夜。將混合物上樣到Talon柱上以除去TEV蛋白酶和HIS-MBP標籤，然後使用HiLoad 16/600 Superdex™ 75pg柱（GE醫療生命科學公司）在緩衝液（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中藉由粒徑排阻層析法進一步純化流出物。
將純化的CD137與過量的純化的VH（BGA-5623）混合（1 : 1.5莫耳比）以產生CD137/VH（BGA-5623）複合物。然後使用HiLoad 16/600 Superdex™ 75pg柱（GE醫療生命科學公司）在緩衝液（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中藉由凝膠過濾進一步純化複合物。CD137/VH（BGA-5623）複合物（10 mg/ml）在0.6 M Li 2SO4、0.01 M NiCl 2、0.1 M Tris pH 9.0中結晶。將用逐步5% D-(+)-蔗糖冷凍保護至最終20%濃度的晶體在液氮中快速冷凍。此外，將apoVH（BGA-5623）在1.2 M (NH 4) 2SO 4、0.1 M檸檬酸pH 5.0中結晶。將晶體用7%甘油冷凍保護並在液氮中快速冷凍。在Spring-8同步加速器輻射設備（日本的兵庫公司（Hyogo, Japan））的束線BL45XU處收集X射線繞射數據。 B.數據收集和結構解析
在Spring-8同步加速器輻射設備（日本的兵庫公司）中配備ZOO（Hirata, K.等人, Acta Crystallogr D Struct Biol [晶體結構生物學學報], 2019. 75(Pt 2): 138-150）自動數據收集系統的束線BL45XU處在100克耳文的低溫冷卻條件下收集X射線繞射數據。藉由採用XDS（Kabsch W., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體生物學晶體學報], 2010. 66 (Pt 2): 125-32）的集成數據處理軟體KAMO（Yamashita等人, Acta Crystallogr D Struct Biol [晶體結構生物學學報], 2018. 74 (Pt 5): 441-449）處理繞射圖像。人CD137（PDB: 6MGP）和VHH模型（PDB:4U3X）的結構用作檢索模型。藉由分子替換程式PHASER（McCoy等人, Phaser crystallographic software [Phaser結晶學軟體]. J Appl Crystallogr [應用結晶學雜誌], 2007. 40(Pt 4): 658-674）找到初始解。然後使用程式COOT（Emsley等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體生物學晶體學報], 2004. 60(Pt 12 Pt 1): 2126-32）手動反覆運算構建該模型並使用PHENIX（Adams等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體生物學晶體學報], 2010. 66(Pt 2): 213-21）進行細化。將最終模型細化為可接受的R和R自由值以及拉氏構象圖（Ramachandran）統計（藉由Molprobity計算）。數據處理和細化統計可以在表32中找到。 C. 結合人CD137的VH（BGA-5623）的結構
與CD137複合的VH（BGA-5623）在I41空間群中結晶，一個複合物在不對稱單元中，並繞射到2.58 Å。結合人CD137的VH（BGA-5623）的結構顯示VH（BGA-5623）與CD137L結合部分地空間連接（圖24）。VH（BGA-5623）與CD137之間的埋入表面積為約571 Å2。VH（BGA-5623）相互作用聚集在CD137 CRD2結構域周圍。該等相互作用主要由VH（BGA-5623）CDR2和CDR3介導，並與CD137更廣泛地接觸。VH（BGA-5623）CDR1不直接接觸CD137，而CDR3在CD137結合時經歷從非結構化環到ß折疊的顯著構象變化（圖25）。VH（BGA-5623）CDR2 Leu52、Tyr58接觸CD137殘基Pro50、Asn51。VH（BGA-5623）CDR3殘基Gly100A、Gly100B、Val100C、Thr100D、Phe100E接觸CD137殘基Phe36、Pro47、Pro49、Arg60、Cys62、Ile64。此外，FR2 Leu45和Trp47接觸CD137殘基Pro47、Cys48、Pro49、Pro50，該等殘基對CD137結合有顯著貢獻。VH（BGA-5623）使用氫鍵和疏水相互作用的組合與CD137相互作用。例如，FR2 Trp47與CD137殘基Pro47、Cys48、Pro49和Pro50形成強疏水接觸。CDR3殘基Phe100E與CD137殘基Phe36和Pro47形成疏水相互作用。FR2殘基Trp47和CDR3殘基Gly100A分別與CD137殘基Pro47和Ile64形成一個氫鍵。CDR3殘基Val100C與CD137殘基Cys62形成兩個氫鍵（圖26）。
基於VH（BGA-5623）/CD137複合物的晶體結構，確定了與VH（BGA-5623）接觸的CD137的殘基（即，與VH結合的CD137的表位殘基）和與CD137接觸的VH（BGA-5623）的殘基（即，與CD137接觸的VH的互補位殘基）。下表33示出了它們接觸的CD137和VH（BGA-5623）的殘基，如使用3.7 Å的接觸距離嚴格性所評估的，其係凡得瓦（非極性）相互作用力最高的點。這種晶體結構分析與先前的丙胺酸掃描分析一致，據發現，最影響BGA-5623結合的許多CD137殘基與結構中的BGA-5623相互作用。 [表32]：數據收集和細化統計
晶體 apoVH（BGA-5623） VH（BGA-5623）/CD137複合物
數據收集   
X射線源 BL45XU BL45XU
波長（Å） 1.0 1.0
空間群 P41212 I41
晶胞尺寸   
a（Å） 68.342 123.943
b（Å） 68.342 123.943
c（Å） 102.952 57.877
α（°） 90 90
ß（°） 90 90
ϒ（°） 90 90
解析度（Å） 56.94-1.70 (1.80-1.70)a 87.64-2.58 (2.73-2.58)
Rsym（%） 18.0 (145.8) 21.4 (209.3)
＜I/σ＞ 14.3 (1.6) 12.3 (1.2)
CC1/2 99.8 (56.1) 99.7 (44.4)
冗餘度 11.6 (5.9) 6.8 (6.6)
完整度（%） 97.3 (84.3) 99.9 (99.4)
細化   
解析度（Å） 48.33-1.70 43.82-2.58
反射次數 26791 14038
R功/R自由b（%） 19.84/23.46 22.8/28.9
r.m.s.d. c鍵/角 0.006/0.892 0.010/1.314
原子數   
蛋白質 1787 1959
水 204 5
B因子   
蛋白質 27.37 83.97
水 36.42 66.79
拉氏構象圖   
推薦值（%） 98.71 94.21
允許值（%） 1.29 3.47
離群值（%） 0 2.32
a括號中的值係最高解析度殼層的值。 b根據細化期間留出的約5%的反射而計算 cr.m.s.d.，均方根偏差 [表33]：CD137的表位殘基及其相應的VH（BGA-5623）的互補位殘基
CD137    VH（BGA-5623）   
Phe 36 Thr 100D
      Phe 100E
Pro 47 Leu 45
      Trp 47
      Phe 100E
Cys 48 Trp 47
Pro 49 Trp 47
      Val 100C
      Thr 100D
Pro 50 Trp 47
      Tyr 58
Asn 51 Leu 52
Arg 60 Thr 100D
Cys 62 Gly 100B
      Val 100C
Ile 64 Gly 100A
VH（BGA-5623）殘基按照Kabat命名法編號。 實例27.可能影響體外CD137活化的參數
已經證明，除了親和力、受體密度和CD137中的表位位置以及分子形式之外，還有其他關鍵參數，諸如模組比率、模組取向、連接子長度和Fc功能，其可以顯著影響細胞介素釋放（IL-2和IFN-γ）。因此，為了合理設計基於CD137的多特異性抗體，我們採用系統方法來探究該等參數如何影響CD137激動作用。該等多特異性抗體的表現和製備如所述進行。
首先，我們構建了具有不同模組比率諸如2 : 4、1 : 1和1 : 2的CEA/CD137多特異性抗體變體，即BE-718（A-BGA-5623-BGA-5623）（SEQ ID NO: 295和179）、BE-942（ZW 1+1）（SEQ ID NO: 299、301和303）（其為1+1組態的BGA-5623）和BE-755（ZW1+2）（SEQ ID NO: 299、301和305）（其為1+2組態的BGA-5623）（圖27）。對於具有「ZW」名稱的抗體構建體，惰性Fc用於該等多特異性抗體，並使用Zymeworks的Azymetric™平臺組裝Fab×VH組態，其中ZW1突變（鏈A：T350V/L351Y/F405A/Y407V；鏈B：T350V/T366L/K392L/T394W）被引入重鏈的CH3結構域中以允許有效的異二聚體形成（Von Kreudenstein等人, (2013) Mabs [單株抗體] 5(5):646-54）。對於代表模組比率為2 : 2的多特異性抗體的BE-189（A-BGA-5623）（SEQ ID NO: 255和179），我們能夠研究模組比率如何影響細胞介素釋放。如上文實例20中所述，將高CEA表現細胞系CT26/CEA與PBMC（2 × 10 5個/孔）和HEK293/OS8細胞（其可觸發T細胞活化的第一信號）一起用於體外CD137活化測定。如表34和圖28所示，模組比率為2 : 2的多特異性抗體被證明是有效的CD137促效劑，沒有CD137內在活化，這表明BE-189（形式A-BGA-5623）以CEA依賴性方式活化CD137。相比之下，模組比率為2 : 4的多特異性抗體BE-718（A-BGA-5623-BGA-5623）顯示即使在不存在CEA表現細胞的情況下也活化CD137。
接著，我們研究了模組取向和Fc功能如何影響CD137活化。在本實驗中，我們構建了BE-740（A-IgG1-BGA-5623）（SEQ ID NO: 297和179），其與A-BGA-5623（BE-189）完全相同，只是用野生型IgG1 Fc替代惰性Fc。我們還分別構建了BE-562（E-muFc-BGA-5623）（SEQ ID NO: 307和179）和BE-375（E-IgG1-BGA-5623）（SEQ ID NO: 309和179）。如圖29所示，這兩種多特異性抗體與A-BGA-5623和A-IgG1-BGA-5623共用同一對抗CEA抗體和抗huCD137 VH結構域（CEA和BGA-5623），但是方向相反。如實例20所述，使用基於PBMC的細胞介素釋放測定來定量CD137活化的效力。基於體外結果，證明A-BGA-5623和A-IgG1-BGA-5623在CD137活化方面比E-muFc-BGA-5623和E-IgG1-BGA-5623更有效。此外，根據該實驗，Fc功能似乎對CD137活化的影響極小（圖30）。
然後，評估了連接Fc和VH結構域抗體的連接子對CD137活化的影響。A-(G4S)3-BGA-5623（BE-244）（SEQ ID NO: 311和179）藉由用(G4S) 3（SEQ ID NO: 329）的15 AA連接子取代G4S而產生。同樣，使用基於PBMC的細胞介素釋放測定來比較效力。如圖31和表34所示，連接子長度對CD137活化的影響極小。
最後，選擇了具有不同親和力的兩種BGA-4712變體（BGA-6468和BGA-9442）用於效力比較。SPR研究和FACS分析示出在表35中。對於流式細胞術，將人CD137 +或人CEA +表現細胞（10 5個細胞/孔）與各種濃度的純化的VH結構域抗體一起孵育，隨後與Alexa Fluro-647標記的抗hu IgG Fc抗體（目錄號：409320，美國的百進生化技術公司（BioLegend, USA））結合。使用流式細胞儀（Guava easyCyte™ 8HT，美國的默克密理博公司（Merck-Millipore, USA））定量細胞螢光。兩種測試的多特異性抗體之間的CEA結合沒有顯著差異，而如預期的，藉由流式細胞術觀察到針對人CD137的不同結合親和力。接下來，應用如上文實例20中所述之基於PBMC的細胞介素釋放測定來評估該等具有不同親和力的BGA-4712變體在多特異性抗體形式A-CD137/CEA中的效力。如表35所示，由該等變體誘導的CD137活化與CD137臂親和力增加成正比。 [表34].體外CD137活化的關鍵參數
代碼 替代名稱 mAb對 模組比率 Fc 蛋白A純化後的SEC-HPLC（%） 功能測定EC50（μg/ml）
BE-189 A-BGA-5623 BGA-5623/CEA 2+2 惰性Fc 94.55 0.31  
BE-718 A-BGA-5623-BGA-5623 2+4 惰性Fc 89.47 0.01  
BE-740 A-IgG1- BGA-5623 2+2 wt-IgG1 98.71 0.17  
BE-942 ZW1+1 1+1 LALADS 92.65 25.06  
BE-755 ZW1+2 1+2 LALADS 83.19 1.16  
BE-562 E-muFc- BGA-5623 2+2 惰性Fc 98.17 4.69  
BE-375 E-IgG1- BGA-5623 2+2 wt-IgG1 97.76 1.76  
BE-244 A-(G4S)3- BGA-5623 2+2 惰性Fc 98.84 0.18  
[表35].具有不同親和力的多特異性抗體形式A-CD137xCEA中BGA-4712變體的比較
形式/殖株 形式 細胞結合EC50（μg/ml） 功能
Hut78/huCD137 EC50（μg/ml） 最高
形式A-BGA-5623 A-CD137xCEA 0.38 0.3412 2512
形式A BGA-3386 0.21 0.07681 1953
[表36]：CD137xCEA多特異性抗體的胺基酸和DNA序列
構建體 SEQ ID NO： 序列
BE-718 A-BGA-5623- BGA-5623重鏈AA SEQ ID NO: 295 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-718 A-BGA-5623- BGA-5623重鏈DNA SEQ ID NO: 296 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGATCGGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-740 AA SEQ ID NO: 297 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-740 DNA SEQ ID NO: 298 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-942 （ZW1+1）抗CEA重鏈AA SEQ ID NO: 299 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAWLGCEVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BE-942 （ZW1+1）抗CEA重鏈DNA SEQ ID NO: 300 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGACCAAGCGTGTTCCCACTGGCACCCAGCTCCAAGAGCACCTCCGGAGGAACAGCATGGCTGGGATGCGAGGTGACCGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACAGTGTCTTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACATTTCCTGCCGTGCTGGAGTCTAGCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCTCCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGTAACGTGAATCACAAGCCATCTAATACAAAGGTGGATAAGAAGGTGGAGCCAAAGTCCTGCGACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGAGCGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCAAGCCGCGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGCTGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAATTACCTGACCTGGCCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATTCTAAGCTGACAGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
BE-942 （ZW1+1）抗CEA輕鏈AA SEQ ID NO: 301 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVAIFPPSDERLKSGTASVVCVLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSRLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-942 （ZW1+1）抗CEA輕鏈DNA SEQ ID NO: 302 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAAAGGACAGTGGCAGCACCAAGCGTGGCAATCTTCCCACCTTCCGACGAGAGACTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGCGTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCTACATATAGCCTGAGCTCCAGGCTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGT
BE-942 （ZW1+1）抗CD137重鏈AA SEQ ID NO: 303 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BE-942 （ZW1+1）抗CD137重鏈DNA SEQ ID NO: 304 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCAAAGTCCTCCGACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGAGCGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACGTGTATCCTCCAAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCGCCCTGGTGTCTAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
BE-755 （ZW1+2）抗CD137重鏈AA SEQ ID NO: 305 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BE-755 （ZW1+2）抗CD137重鏈DNA SEQ ID NO: 306 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGGCGGCGGAGGGAGCGAGGTGCAGCTGCTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCCAGCGAGCCAAAGTCCTCCGACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCACCAGAGGCAGCAGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGAGCGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCTGCCCCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCAAAGGGACAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACGTGTATCCTCCAAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCTCTTTCGCCCTGGTGTCTAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
BE-562（E-mutFc）重鏈AA SEQ ID NO: 307 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
BE-562（E-mutFc）重鏈DNA SEQ ID NO: 308 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCAAAGTCCTCTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC
BE-375（E-wtIgG1 Fc）重鏈AA SEQ ID NO: 309 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
BE-375（E-wtIgG1 Fc）重鏈DNA SEQ ID NO: 310 GAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC
BE-244（A-（G4S）3）重鏈AA SEQ ID NO: 311 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-244（A-（G4S）3）重鏈DNA SEQ ID NO: 312 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCGGAGGATCTGGTGGCGGTGGGTCCGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
實例28.單劑CEAxCD137多特異性抗體的體內功效
為了確定CEAxCD137多特異性抗體BE-189和BE-740針對CEA+腫瘤細胞的體內功效，將CT26/CEA細胞（1 × 10 6）皮下注射到BALB/c背景的人源化CD137小鼠中。從腫瘤注射當天開始，每週兩次給予BE-189（3 mg/kg）、BE-740（3 mg/kg）、抗CEA Ab（SEQ ID NO: 181和179）（3mg/kg）、烏瑞魯單抗類似物（3 mg/kg）或媒介物對照（每組6隻小鼠）。與媒介物對照相比，BE-189（A- BGA-5623）和烏瑞魯單抗類似物誘導腫瘤生長的顯著抑制（P ＜ 0.001），如圖32所示。 實例29. CEAxCD137促效劑
激動性抗huCD137抗體已經在臨床環境中顯示出毒性，這可能表明全身性Fc
Figure 02_image001
R交聯對於CD137活化並不理想。目的係在腫瘤部位特異性地實現有效的CD137刺激，而無需對廣泛的癌症進行全身性CD137活化。為了克服Fc
Figure 02_image001
R交聯的依賴性，我們產生了具有以下特徵的CEAxCD137多特異性抗體，如圖33所示。該特異性構建體包括模組比率為2 : 2的IgG融合樣多特異性抗體形式、結合CEA的二價F(ab')2片段、在CH3的C末端融合的VH結構域片段（其結合huCD137），以及huIgG1的Fc無效形式（其不具有FcγR結合但保留FcRn結合）。序列資訊在表37中示出。 [表37]：CEAxCD137的胺基酸和DNA序列
構建體 SEQ ID NO 序列
BE-146重鏈AA SEQ ID NO: 313 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYYLHWVRQAPGQGLEWIGYINPQTGKTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREYGNYNYPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSAEDVGWVRQAPGKGLEWVSAILDKGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARIVYHAGGGVTFDTRGQGTQVTVSS
BE-146 重鏈 DNA SEQ ID NO: 314 CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATATTTTTACCAGCTATTACCTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATATTAACCCGCAGACCGGCAAGACCAGCTATGCCCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCACCAGCACCGTGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAATATGGCAACTATAACTATCCGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGGCCCTCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGTACTTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCAAAGTCCTGTGACAAGACCCACACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCACCAGCTGCAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCTCTCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGCCCTGGCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTCAAGGGCTTCTATCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAATCACTATACTCAGAAATCCCTGTCACTGTCACCTGGTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGAGGTCCAGTTACTTGAGAGTGGTGGAGGTCTGGTCCAACCAGGAGGTTCGCTGCGTTTATCCTGCGCCGCGTCTGGATTCACGGTTTCCGCCGAAGACGTGGGTTGGGTGCGTCAAGCGCCGGGGAAAGGACTGGAATGGGTCTCCGCCATCTTGGATAAGGGTGGTTCGACATACTATGCGGAAAGTGTCAAAGGGCGCTTTACGATCTCGCGCGATAACGCAAAAAATACTCTTTACCTTCAAATGTCTAGCCTTCGTGCTGAGGACACTGCGGTGTACTACTGCGCCCGCATTGTCTACCATGCTGGTGGTGGCGTCACCTTTGATACTCGGGGACAGGGCACCCAAGTTACAGTCTCATCG
BE-146 輕鏈AA SEQ ID NO: 179 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENQYGYLAWYQQKPGKVPKLLIYNYKNLVEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHHLGTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
BE-146輕鏈DNA SEQ ID NO: 180 GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCGAAAACCAGTATGGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGTGCCGAAACTGCTGATTTATAACTATAAAAACCTGGTGGAAGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATGTGGCGACCTATTATTGCCAGCATCATCTGGGCACCCCGTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGAACAGTGGCAGCCCCTTCCGTCTTCATTTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAATCAGGAACTGCTAGCGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGTGTGACCGAACAGGACTCAAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGTACTCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAAGTCACACACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACCAAGAGTTTCAACAGAGGGGAATGC
實例30. CEAxCD137的靶結合活性 結合重組CD137和CEA
ELISA結果顯示BE-146以一致的結合活性與抗原CEA（CEA/His）和CD137（huCD137-mIgG2a）結合，而2個陰性對照人IgG和DS（藥物物質）緩衝液沒有可檢測到的與CEA和CD137的結合（圖34）。
使用表面電漿共振（SPR）測量BE146的結合動力學。我們使用SPR測量CD137和CEA的重組蛋白的抗體的解離速率常數（ka）和締合速率常數（kd），然後確定親和力常數（KD）。結果顯示BE-146對人CD137和人CEA具有相當的結合親和力。
人CD137蛋白與鼠CD137的序列同源性較低，只有61.0%的序列同一性。相比之下，CD137與石蟹獼猴CD137高度同源，具有95%的序列同一性。為了測試BE-146結合功能的物種特異性，使用人、石蟹獼猴和小鼠CD137作為結合蛋白進行SPR結合研究。BE-146顯示對人CD137的高結合親和力，K D為約36.2 nM。相比之下，BE-146與石蟹獼猴CD137的結合親和力具有約15.9 nM的相似K D。如表38所示，在SPR測定中，BE-146沒有可檢測到的與小鼠CD137的結合傳訊。
在人與石蟹獼猴物種之間的結合親和力測試表明BE-146對人CEA（K D：約3.00 nM）和猴CEA（目錄號：CE5-C52H5，北京百普賽斯生物科技股份有限公司）（K D：約11.4 nM）表現出相似的結合親和力。該數據在下表39中示出。人和猴CEA的序列比對表明這兩個物種之間有79.2%的同源性。 結合天然CD137和CEA
FACS結果進一步證實了BE-146與HuT78/CD137細胞表面上表現的CD137的結合活性。BE-146以劑量反應方式顯示出與CD137的強結合活性，EC50為2.257 µg/mL（12.90 nM）；而陰性對照人抗體（hIgG）沒有預期地結合HuT78/CD137和CT26 OS8-CEA（圖35和圖37）。類似地，BE-146以劑量反應方式顯示出與CEA的強結合活性，EC50為1.532 µg/mL（8.75 nM）；而陰性對照人抗體（hIgG）沒有預期地結合HuT78/CD137和CT26-OS8-CEA（圖35和圖36）。 [表38]：SPR確定的動力學參數與不同種類CD137的比較分析
抗原 抗體 K on（1/Ms） K off（1/s） K D(M) a, b
人CD137 BE-146 1.30E+05 4.69E-03 3.62E-08
猴CD137 1.67E+05 2.66E-03 1.59E-08
小鼠CD137 ND c ND ND
縮寫：K D，親和力常數；K off，解離速率常數；K on，締合速率常數；ND，無法確定；SPR，表面電漿共振。 K D值由動力學常數的比率計算為K D= K off/ K on。 K D值由平衡時一半配體被佔據時的分析物濃度確定。 ND：親和力對於測定而言太弱。 [表39]：SPR確定的動力學參數與不同種類CEA的比較分析
抗原 抗體 K on（1/Ms） K off（1/s） K D(M) a,b
人CEA BE-146 9.85E+04 2.95E-04 3.00E-09
猴CEA 6.30E+04 7.17E-04 1.14E-08
縮寫：CEA，癌胚抗原；K D，親和力常數；K off，解離速率常數；K on，締合速率常數；ND，無法確定；SPR，表面電漿共振。 K D值由動力學常數的比率計算為K D= K off/K on。 K D值由平衡時一半配體被佔據時的分析物濃度確定。 實例31. CEAxCD137以CEA依賴性方式誘導T細胞活化
在不同的體外實驗中評估了CEAxCD137多特異性抗體BE-146的功能性。我們首先使用來自健康供體的人周邊血單核細胞（PBMC）用提供信號的CEAxCD137和HEK293/OS8活化人T細胞。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司（Sigma-St. Louis MO））分離法從健康供體的全血中分離PBMC。為了確定在CEA +腫瘤細胞存在下CEAxCD137是否可以誘導從人PBMC釋放細胞介素，將PBMC（1 × 10 5個/孔）與CEA +MKN45細胞（2 × 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 × 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天（圖38A）。藉由ELISA確定來自PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示CEAxCD137可以誘導顯著的細胞介素釋放（圖38B至圖38C）。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值± SD表示。
我們接下來研究了CEAxCD137是否可以增強抗原特異性CD8+T細胞功能。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司（Sigma-St. Louis MO））分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。使用人全T細胞分離套組（美天旎公司（Miltenyi），目錄號130-096-535）分離T細胞。為了確定在CEA+腫瘤細胞存在下BE-146是否可以誘導從人T細胞釋放細胞介素，將T細胞（1 × 10 5個/孔）與CEA+ MKN45細胞（2 × 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 × 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天。藉由ELISA確定T細胞的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示多特異性抗體BE-146可誘導顯著的IL-2（圖39A）和IFN-γ（圖39B）釋放。
然後我們研究了CEAxCD137是否可以誘導CEA依賴性反應。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司（Sigma-St. Louis MO））分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。為了確定CEAxCD137誘導的從人PBMC的細胞介素釋放是否是CEA依賴性的，將PBMC（1 × 10 5個/孔）與HEK293或過表現CEA的HEK293細胞（HEK293/CEA）（1 × 10 5個/孔）（作為靶細胞）和HEK293/OS8（1×10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天。藉由ELISA確定來自PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示多特異性抗體BE-146可誘導來自PBMC的顯著的IL-2和IFN-γ釋放，針對過表現CEA的HEK293細胞，但不針對沒有CEA轉導的HEK293細胞（圖40A-B）。
此外，進行了一系列實驗以確定來自CEAxCD137構建體的誘導反應是否可以被可溶性CEA阻斷。藉由Ficoll（Histopaque-1077，密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司（Sigma-St. Louis MO））分離法從健康供體的全血中分離人周邊血單核細胞（PBMC）。為了確定BE-146誘導的從人PBMC釋放的細胞介素是否可以被可溶性CEA阻斷，在不同濃度的重組可溶性CEA存在下，將PBMC（1 × 10 5個/孔）與MKN45（1 × 10 5個/孔）和HEK293/OS8（1 × 10 5個/孔）細胞在96孔v型底板中共培養2天。藉由ELISA確定來自PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。結果顯示多特異性抗體BE-146誘導來自PBMC的IL-2（圖41A）和IFN-γ（圖41B）釋放，並且該釋放未被50 ng/ml或500 ng/ml可溶性CEA顯著阻斷。僅極高濃度的CEA（5000 ng/ml）導致減少。
該等數據表明，在（CD3ε或T細胞受體刺激）存在下，CEA x CD137誘導強烈的CEA依賴性T細胞活化。 實例32.BE-146增強T細胞活化
開發了一種基於細胞的生物發光測定法並用於測量靶向並刺激誘導型共刺激受體CD137並增強T細胞活化的BE-146的活性。
兩種遺傳修飾的細胞系JK-NFKB-CD137和CT26-OS8-CEA在該測定中分別用作效應細胞和靶細胞。JK-NFKB-CD137由Jurkat細胞系殖株E6-1（ATCC，TIB-152）藉由穩定轉染人CD137基因載體和具有NF-kB響應元件的螢光素酶構建體而開發，該NF-kB響應元件可響應T細胞受體（TCR）活化和CD137共刺激。藉由異位表現人CEA和T細胞接合物OS8（抗-CD3抗體的膜結合形式）從CT26WT細胞產生CT26-OS8-CEA細胞系。當共培養兩種細胞系時，雙特異性抗體BE-146的添加將與在效應細胞上表現的CD137和在靶細胞上表現的CEA相互作用，並以劑量依賴性方式啟動CEA依賴性CD137共刺激和螢光素酶基因啟動子的活化。將JK-NFKB-CD137（5×10 4個細胞/孔）和CT26-OS8-CEA（1 × 10 4個細胞/孔）在連續稀釋的BE-146存在下共培養5-6小時。作為陰性對照，使用人IgG（hIgG）和不含抗體的緩衝液。
BE-146以劑量反應方式顯示出激動功能活性。該實驗一式兩份進行，BE-146的EC50為0.51 µg/mL（2.91 nM）和0.56 µg/mL（3.20 nM），如圖42所示。緩衝液和人IgG對照沒有活性。 實例33. BE-146以CEA依賴性方式增強來自人PBMC的IFN-γ和IL-2產生
Hek293/OS8 低細胞系藉由用T細胞接合物OS8（抗CD3抗體的膜結合形式）進行反轉錄病毒轉導來產生，以提供抗CD3刺激以用於初始T細胞活化。在BE-146或烏瑞魯單抗（作為參考抗體）或人IgG1（作為陰性對照）的存在下，將來自健康供體和Hek293/OS8 低的PBMC與具有CEA高表現的靶細胞MKN45或僅表現少量CEA的NCI-N87共培養。在連續稀釋的BE-146、烏瑞魯單抗或huIgG1存在下，將PBMC（3 × 10 4個細胞/孔）與Hek293/OS8 低（1 × 10 4個細胞/孔）和MKN45（2 × 10 4個細胞/孔）共培養48小時。在連續稀釋的BE-146、烏瑞魯單抗或huIgG1存在下，將PBMC（3 × 10 4個細胞/孔）與Hek293/OS8 低（1 × 10 4個細胞/孔）和NCI-N87（2 × 10 4個細胞/孔）共培養48小時。藉由ELISA測量IFN-γ和IL-2釋放。
當靶細胞為MKN45（CEA高）時，BE-146促進來自兩個供體的PBMC以劑量依賴性方式分泌IFN-γ和IL-2（圖43A）。然而，當NCI-N87（CEA低）細胞用作靶細胞時，BE-146不誘導細胞介素釋放（圖43B）。 實例34. BE-146增強人PBMC對MKN45細胞的細胞毒性
在BE-146存在下，將來自健康供體的PBMC與作為靶細胞的MKN45共培養。使用烏瑞魯單抗作為參考抗體，而人IgG1用作陰性對照。將蘇力圖單抗（Solitomab）（一種EpCam/CD3雙特異性T細胞接合物（BiTE）構建體（Ferrari等人, J Exp Clin Cancer Res [實驗與臨床癌症研究雜誌] 2015;34:123））以10 pg/mL的濃度添加到共培養系統中以便為初始T細胞活化提供抗CD3刺激。將MKN45（1 × 10 4個細胞/孔）細胞預培養24小時以使細胞黏附到板上，然後在BE-146或烏瑞魯單抗存在下與PBMC（1 × 10 5個細胞/孔）共培養。將蘇力圖單抗（10 pg/mL）添加到共培養系統中以提供初始刺激。
使用即時細胞分析（RTCA）系統（Hamidi、Lilja和Ivaska Bio Protoc [生物方案] 2017; 7(24):e2646），通過監測MKN45與底層細胞外基質的黏附變化來測量對MKN45細胞的殺傷。BE-146誘導對MKN45腫瘤細胞的劑量依賴性殺傷。來自2個供體的BE-146的平均EC50在與烏瑞魯單抗相當的水平下為0.5452 nM（EC50 = 0.258 nM）（圖44）。 實例35.與抗PD-1抗體替雷利珠單抗組合的CEAxCD137抗體進一步促進免疫細胞活化
共刺激受體CD137可誘導T細胞活化細胞內信號，但該等信號可藉由免疫檢查點連接諸如PD-1/PD-L1來抑制。因此，PD-1抗體替雷利珠單抗（BGB-A317）與BE-146的組合可提高功效。為了確定與單一療法相比，BE-146與抗PD-1抗體替雷利珠單抗組合是否可增強免疫細胞活化，將人PBMC與CEA和PD-L1表現靶細胞共培養，並將IFN-γ釋放確定為功能讀數。將PBMC用作效應細胞。將被工程化以表現PD-L1和T細胞接合物OS8的Hek293/OS8-PDL1細胞與作為靶細胞的MKN45（CEA高）混合。IFN-γ分泌被確定為T細胞活化的標誌物。
將PBMC用40 ng/mL OKT3預刺激2天。在連續稀釋的BE-146和替雷利珠單抗（1000 ng/mL）存在下，將刺激的PBMC（3 × 10 4個細胞/孔）與Hek293/OS8-PDL1（1 × 10 4細胞/孔）和MKN45（2 × 10 4個細胞/孔）共培養48小時。藉由ELISA測量IFN-γ釋放作為讀數。
當PBMC與Hek293/OS8-PD-L1細胞和MKN45（CEA高）細胞共培養時，BE-146和替雷利珠單抗的組合投與顯示出對人T細胞活化的累積作用。BE-146和替雷利珠單抗的組合相對於單獨的BE-146或替雷利珠單抗顯著增強了IFN-γ產生，如圖45所示。
替雷利珠單抗（BGB-A317）揭露於美國專利案號8,735,553，並且VH/VL序列在下表40中示出。 [表40]：替雷利珠單抗序列表
替雷利珠單抗VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIYADGSTNYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGNYWYIDVWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 315）
替雷利珠單抗VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVSNDVAWYQQKPGQPPKLLINYAFHRFTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQAYSSPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 316)
實例36.效應子受體結合和效應子功能
BE-146使用工程化的人IgG1 Fc部分，它降低了與效應子功能受體的結合活性。ELISA測定表明，當BE-146與人IgG（huIgG）比較時，BE-146與FcγRI、FcγRIIAH131、FcγRIIAR131、FcγRIIB、FcγRIIIAV158、FcγRIIIAF158、FcγRIIIB和C1q的結合活性降低。由於FcγRs和C1q係介導免疫複合物誘導的效應子功能的關鍵受體，BE-146具有不可檢測到的效應子功能，諸如抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）和補體依賴性細胞毒性（CDC）。
藉由ELISA評估FcγR結合活性。BE-146對FcγRI、FcγRIIAH131、FcγRIIAR131、FcγRIIB、FcγRIIIAV158、FcγRIIIAF158、FcγRIIIB沒有表現出任何顯著的結合活性，其與陰性對照相當。相比之下，陽性對照人IgG在測定中對任何FcγRs產生強結合信號（圖46A-B）。 實例37. CEAxCD137抗體減少體內腫瘤
BE-146的體內功效在人源化CD137敲入小鼠的MC38/hCEA小鼠結腸腺癌模型中檢查。將MC38/hCEA細胞植入雌性人源化CD137敲入小鼠體內。在細胞接種後第5天，根據腫瘤體積將小鼠隨機分成4組。腹膜內投與BE-146（0.1、0.5和3.0 mg/kg，每週一次）有效抑制腫瘤生長，第17天的TGI率分別為70%、61%和92%（圖47）。此外，在研究終點（第21天），0.1、0.5和3.0 mg/kg組的無腫瘤比率分別為20%、30%和90%。無腫瘤動物的百分比隨劑量從0.1 mg/kg增加至3.0 mg/kg。在第一次給藥後表徵BE-146在3個劑量水平（0.1、0.5和3.0 mg/kg）下的藥物動力學（PK）曲線。BE-146的藥物暴露（AUC 0-168h和C max）成比例地增加（表41）。在整個研究中，任何治療組對動物體重都沒有顯著影響。 [表41]：BE-146在人源化CD137敲入小鼠MC38/hCEA同源腫瘤模型中的功效和PK參數
抗體 n 劑量（mg/kg） TGI（%） （第17天） 平均腫瘤 體積 （mm 3± SEM） （第17天） p值與 媒介物 （第17天） PK參數（單個劑量）
C max（µg/mL） （平均值 ± SEM） AUC 0-168h（h·µg/mL） （平均值 ± SEM）
媒介物 10 NA NA 2187.0 (± 161.4) NA NA NA
BE-146 10 0.1，QW 70 741.7 (± 316.7) 0.0143 0.60 (± 0.04) 42.34 (± 1.92)
BE-146 10 0.5，QW 61 930.9 (± 309.3) 0.0077 3.04 (± 0.35) 304.66 (± 29.75)
BE-146 10 3.0，QW 92 286.3 (± 284.7) 0.0014 26.11 (± 1.39) 2278.75 (± 334.34)
縮寫：AUC 0-168h，0至168小時的血清濃度-時間曲線下面積；C max，最高濃度；hCEA，癌胚抗原；n，動物數量；NA，不適用；PK，藥物動力學；QW，每週一次；SEM，平均值的標準差；TGI，腫瘤生長抑制。 注：根據下式計算TGI率：%TGI = [1-（治療的Tt-治療的T0）/（媒介物Tt-媒介物T0）] × 100%。該表示出了第17天的TGI。治療的Tt = 第t天給藥組的平均腫瘤體積；治療的T0 = 第0天給藥組的平均腫瘤體積；媒介物Tt = 第t天媒介物組的平均腫瘤體積；並且媒介物T0 = 第0天媒介物組的平均腫瘤體積。 實例38.抗PD-1抗體與CEA x CD137的組合療法增加腫瘤消退
在人源化CD137敲入小鼠的CT26/hCEA同源模型中研究了BE-146和抗小鼠PD-1抗體的組合的抗腫瘤活性。將CT26/hCEA細胞植入雌性人源化CD137敲入小鼠體內。在細胞接種後第7天，根據腫瘤體積將小鼠隨機分成4組。接受BE-146（1.0 mg/kg，每週一次）和抗小鼠PD-1抗體Ch15mt（0.3 mg/kg，每週一次）的組合治療的小鼠表現出協同的腫瘤生長抑制。第14天的腫瘤生長抑制率為70%，其顯著高於單獨用BE-146（-24%）或Ch15mt（41%）治療的組。與媒介物對照或單劑治療相比，BE-146和抗PD-1的組合誘導顯著增加的抗腫瘤作用，總結於表42中並示出於圖48中。 [表42]：BE-146和Ch15mt在人源化CD137敲入小鼠CT26/hCEA同源模型中的抗腫瘤作用
治療 n 劑量（mg/kg） TGI（%） （第14天） 平均腫瘤 體積（mm 3± SEM） （第14天） P值 與BE-146 + Ch15mt組 （第14天）
媒介物 10 NA NA 1856.8 ± 273.6 NA
BE-146 10 1.0 QW -24 2264.5 ± 213.4 0.0000
Ch15mt 10 0.3 QW 41 1173.0 ± 238.3 0.0648
BE-146 + Ch15mt 10 1.0 + 0.3 QW 70 692.1 ± 180.5 NA
縮寫：hCEA，人癌胚抗原；n，動物數量；NA，不適用；QW，每週一次；SEM，平均值的標準差；TGI，腫瘤生長抑制。 實例39. BE-146和抗PD-1抗體的組合在人源化CD137敲入小鼠B16-F10/hCEA模型中的功效
在人源化CD137敲入小鼠的B16-F10/hCEA同源模型中研究了BE-146和抗小鼠PD-1抗體的組合的抗腫瘤活性。B16-F10係鼠黑色素瘤細胞系。接受BE-146（3.0 mg/kg，每週一次）和抗小鼠PD-1抗體Ch15mt（3.0 mg/kg，每週一次）的組合治療的小鼠具有顯著的腫瘤生長抑制（TGI）。在組合抗體治療的第12天，TGI為78%，如圖49和表43所示。此外，BE-146和Ch15mt的組合治療顯著提高動物的存活率。研究終點的存活率為75%，高於單獨使用BE-146（25%）或單獨使用Ch15mt（25%）的單一療法組（圖50和表43）。整個研究期間，對任何治療組動物的體重都無顯著影響。 [表43]：BE-146和Ch15mt在人源化CD137敲入小鼠B16-F10/hCEA同源模型中的抗腫瘤作用
治療 n 劑量（mg/kg） TGI（%） （第12天） 平均腫瘤 體積 （mm 3± SEM）（第12天） P值與組合組 （第12天） 存活率（%）（第22天） P值與 組合組
存活率（第22天）
媒介物 12 NA NA 1126.9 ± 161.3 NA 0 NA
BE-146 12 3.0 QW 62 495.4 ± 92.7 0.1302 25 0.02
Ch15mt 12 3.0 QW 32 795.2 ± 205.6 0.0181 25 0.02
BE-146 + Ch15mt 12 3.0 + 3.0 QW 78 328.6 ± 71.3 NA 75 NA
縮寫：n，動物數量；NA，不適用；QW，每週一次；SEM，平均值的標準差；TGI，腫瘤生長抑制。 注：根據下式計算TGI率：%TGI = [1-（治療的Tt-治療的T0）/（媒介物Tt-媒介物T0）] × 100%。該表示出了第12天的TGI。治療的Tt = 第t天給藥組的平均腫瘤體積；治療的T0 = 第0天給藥組的平均腫瘤體積；媒介物Tt = 第t天媒介物組的平均腫瘤體積；並且媒介物T0 = 第0天媒介物組的平均腫瘤體積。 實例40. BE-146給藥
在每個21天週期的第1天、第8天和第15天，將通過靜脈內輸注投與單獨的BE-146或與替雷利珠單抗（BGB-A317）的組合的固定劑量。作為單一療法測試的BE-146的計畫劑量水平為5 mg、15 mg、50 mg、150 mg、300 mg、600 mg和1200 mg。如表44所示，待測試的BE-146與200 mg替雷利珠單抗組合的劑量水平為50 mg、150 mg、300 mg、600 mg和1200 mg。替雷利珠單抗的劑量水平和時間表（即，在每個21天週期的第1天通過靜脈輸注投與200mg）將保持固定。當聯合給予時，首先投與替雷利珠單抗，然後投與BE-146。然而，在單一療法組中和/或在接受BE-146和替雷利珠單抗的組合的組中BE-146的較低、中間和/或較高劑量水平和/或替代給藥間隔可由醫生確定。 [表44]：BE-146給藥
BE-146單一療法 BE-146+替雷利珠單抗
5 mg（QW） NA
15 mg（QW） NA
50 mg（QW） 50 mg（QW）+ 200 mg替雷利珠單抗（Q3W）
150 mg（QW） 150 mg（QW）+ 200 mg替雷利珠單抗（Q3W）
300 mg（QW） 300 mg（QW）+ 200 mg替雷利珠單抗（Q3W）
600 mg（QW） 600 mg（QW）+ 200 mg替雷利珠單抗（Q3W）
1200 mg（QW） 1200 mg（QW）+ 200 mg替雷利珠單抗（Q3W）
縮寫：NA，不適用；QW，每週一次；Q3W，每3週一次。
實例44. BE-146適應症
在許多類型的癌症中觀察到CEA過表現，包括結腸直腸癌（CRC）、胃癌（GC）、肺癌、胰臟癌、肝細胞癌、乳癌和甲狀腺癌（Chevinsky AH., Semin Surg Oncol.[外科腫瘤學研討會] 1991;7(3):162-6；Shively等人, Crit Rev Oncol Hematol.[腫瘤學/血液學評論] 1985;2(4):355-99）。高血清CEA與GC和肺癌患者的不良預後相關。（Hall等人, Ann Coloproctol.[結直腸病學年鑒] 2019;35(6):294-305；Moriyama等人, Surg Today.[今日外科] 2021年10月;51(10):1638-48；Grunnet等人, Lung Cancer.[肺癌] 2012年5月;76(2):138-43）。轉移性晚期疾病患者的腫瘤五年存活率仍然很低：CRC為14.7%，GC為5.5%，而肺癌為6.3%。
CEA的過表現導致免疫功能障礙。據報導，CEA可調節各種類型的免疫細胞的反應。例如，CEA可以與CEACAM1相互作用，後者充當共抑制性分子以降低自然殺手（NK）細胞介導的細胞毒性（Stern等人, J. Immuno.[免疫學雜誌] 2005;174(11):6692-701）。當CEA活化時，庫弗細胞（Kupffer cell）可誘導細胞介素諸如IL-10、IL-6和TNF-α（Gangopadhyay等人, Cancer Letters [癌症通訊] 1997;118(1):1-6）。還報導了人PBMC衍生的T細胞的活化可被CEA抑制（Lee等人, Int. J. Cancer [國際癌症期刊] 2015;136(11):2579-87）。
基於CEA過表現，將對患有組織學或細胞學證實的晚期、轉移性、不可切除的CRC、GC或NSCLC的患者投與BE-146治療。將依次評估BE-146單一療法的約7個遞增劑量水平的隊列以及BE-146的5個遞增劑量水平與200 mg替雷利珠單抗組合的隊列，以評估BE-146作為單一療法和與替雷利珠單抗組合的安全性、耐受性、PK和藥效學，並確定BE-146在晚期結腸直腸癌（CRC）、胃癌（GC）或非小細胞肺癌（NSCLC）患者中的功效。 實例35. CEAxCD137體內毒性
將BE-146或烏瑞魯單抗類似物抗體（30 mg/kg）注射到C57BL/6背景的人源化CD137小鼠中，每週一次，共三次給藥。在第22天收集血液並藉由血液生化測試進行分析。與媒介物對照相比，高劑量的烏瑞魯單抗類似物而非BE-146誘導指示肝毒性的丙胺酸轉胺酶（ALT）和天冬胺酸轉胺酶（AST）濃度的顯著增加。此外，在烏瑞魯單抗類似物治療組的肝組織中觀察到炎性細胞增加的微觀變化，而在BE-146治療組中沒有觀察到顯著的微觀變化（圖51）。因此，BE-146係一種有希望的無肝毒性癌症免疫療法的組合夥伴，包括檢查點抑制劑和T細胞接合物。
BE-146的安全性特徵在於在石蟹獼猴中進行的為期4週的重複給藥毒性研究，該研究使用正常人體組織的組織交叉反應測定和使用新鮮人PBMC的細胞介素釋放測定。該等研究係根據良好實驗室規範條例/原則進行的。
在通過靜脈內輸注以5、20或100 mg/kg劑量每週一次持續4週（總共5劑）的BE-146治療的石蟹獼猴的重複劑量研究中，未發現死亡或不良反應。首次給藥後，全身暴露與劑量成比例地增加。沒有發現明顯的性別差異或藥物積累。未觀察到的副作用水平（NOAEL）為100 mg/kg。NOAEL被認為是100 mg/kg，其中穩態Cmax和AUC0-168h在雄性中分別為2220 µg/mL和58,600 h•µg/mL，在雌性中分別為2110 µg/mL和66,800 h•µg/mL。此外，在基於PBMC的細胞介素釋放測定中，與人IgG相比，固定化BE-146在任何測試的供體樣本中均未誘導細胞介素/趨化因子的顯著釋放，表明誘導細胞介素釋放綜合症的風險極小。 參考文獻 Abdul-Wahid, A., M. Cydzik, N. W. Fischer, A. Prodeus, J. E. Shively, A. Martel, S. Alminawi, Z. Ghorab, N. L. Berinstein & J. Gariépy (2018) Serum-derived carcinoembryonic antigen (CEA) activates fibroblasts to induce a local re-modeling of the extracellular matrix that favors the engraftment of CEA-expressing tumor cells. International Journal of Cancer, 143, 1963-1977. Abdul-Wahid, A., E. H. B. Huang, M. Cydzik, E. Bolewska-Pedyczak & J. Gariépy (2014) The carcinoembryonic antigen IgV-like N domain plays a critical role in the implantation of metastatic tumor cells. Molecular Oncology, 8, 337-350. Arnon, T. I., H. Achdout, O. Levi, G. Markel, N. 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無
[圖1]示出了脫落CEA（sCEA）、嵌合CEA（CHIM）、CEACAM6和CEA變體（CEA-v）之示意圖。在CEA中，標記了N結構域、A1、B1、A2、B2、A3、B3和GPI連接子（GPI）；在CEACAM6中，標記了結構域N'、A'和B'。 [圖2A-B]描繪了抗CEA結構域B3抗體VH（圖2A）和VL（圖2B）區之系統發生樹。使用DNASTAR的Megalign™軟體對候選抗CEA抗體的VH和VL序列進行比對。序列同源性在系統發生樹中顯示。 [圖3A]示出了藉由表面電漿共振（SPR）對嵌合構建體（CHIM）上的純化的鼠抗CEA抗體BGA13之親和力測定。圖3B描繪了藉由抗原ELISA分析的BGA13之結合概況。 [圖4A-B]示出了可溶性CEA（sCEA）對CEA抗體與MKN45細胞的結合之影響。圖4A示出了在可溶性CEA（sCEA）存在或不存在下結構域B3抗體之結合概況；圖4B係圖4A的抗體結合概況，示出為直方圖。 [圖5A-B]示出了產生用於人源化BGA13抗體輕鏈CDR（LCDR）區（圖5A）和重鏈CDR（HCDR）區（圖5B）的親和力成熟的抗體文庫之隨機化位點。 [圖6]示出了四輪選擇後BGA13輕鏈CDR區的胺基酸改變。 [圖7]示出了藉由流式細胞術測定的親和力成熟的人源化BGA13變體與LOVO細胞的結合。 [圖8]係藉由流式細胞術測定的優化的人源化BGA113變體與MKN45細胞的結合。 [圖9A和圖9B]表明藉由流式細胞術（圖9A）和抗原ELISA（圖9B）所發現，抗體BGA113K與各種CEACAM家族成員沒有脫靶結合。 [圖10]示出了在各種濃度的可溶性CEA存在下，可溶性CEA對BGA113K與CEA表現細胞MKN45細胞結合之影響。 [圖11]表明抗體BGA113在體外藉由ADCC殺傷細胞。 [圖12]描繪了當用BGA113抗體治療時鼠癌症模型的腫瘤體積減小。 [圖13A]係從每個子文庫鑒定的人抗huCD137 VH結構域抗體之總結。圖13B係來自每個子文庫的人抗huCD137 VH結構域抗體之圖解系統發生樹。使用DNASTAR的Megalign™軟體對候選抗huCD137 VH結構域抗體的VH序列進行比對。序列同源性在系統發生樹中顯示。 [圖14A]示出了人Fc融合VH抗體形式（VH-Fc）之示意圖。VH結構域抗體在惰性Fc（無FcγR結合）的N末端與其間的GS4連接子融合。圖14B示出了使用含有VH-Fc蛋白的上清液之代表性篩選結果，並且圖14C示出了其中一個殖株BGA-4712已被證明能夠以劑量依賴性方式刺激Hut78/huCD137細胞中的IL-2產生。 [圖15A至圖15B]係代表性抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712之結合概況。圖15A描繪了藉由流式細胞術測定人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712結合。圖15B示出了藉由huCD137配體（人CD137配體-ECD-mIgG2a融合蛋白）相互作用對人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712之阻斷。藉由流式細胞術測定純化的人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-4712與表現CD137的Hut78/huCD137細胞（Hut78/huCD137）之結合。 [圖16A-D]係CEAxCD137多特異性抗體形式之示意圖。 [圖17A至圖17B]係藉由流式細胞術對CEAxCD137多特異性抗體的細胞結合之比較。圖17A示出了與表現CEA的細胞CT26/CEA之結合。圖17B示出了與表現CD137的細胞Hut78/huCD137之結合。 [圖18A至圖18B]證明A-CD137/CEA在CEA +腫瘤細胞存在下刺激PBMC產生IFN-γ。圖18A示出了CEAxCD137多特異性抗體A-CEA/CD137之一誘導CD137表現細胞系Hut78/huCD137產生Il-2。圖18B示出了CEAxCD137多特異性抗體A-CEA/CD137之一以劑量依賴性方式誘導人周邊血單核細胞（PBMC）產生IFN-γ。 [圖19]示出了四輪選擇後BGA-4712-M3的CDR區序列。 [圖20]係藉由流式細胞術對抗huCD137 VH結構域Ab BGA-5623之結合測定，證明在親和力成熟後與CD137的結合得到改善。 [圖21]藉由ELISA證明BGA-5623不與其他TNF受體家族成員脫靶結合。 [圖22A至圖22B]示出了人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-5623之表位作圖。圖22A係基於細胞的結合測定中的代表性篩選結果。藉由烏瑞魯單抗類似物監測huCD137突變體的表現。圖22B示出了純化的huCD137突變體的BGA-5623結合。 [圖23A]證明通過ELISA測定的CD137配體與人抗huCD137 VH結構域抗體BGA-5623競爭。圖23B證明CD137 x CEA多特異性抗體BGA-5623可以在基於細胞的配體競爭測定中減少CD137/CD137配體相互作用。 [圖24]示出了VH（BGA-5623）對於CD137與CD137L的部分競爭性結合。VH（BGA-5623）/CD137的晶體結構通過CD137與CD137L/CD137複合物（PDB：6MGP）重疊。CD137、CD137L和VH分別以黑色、白色和灰色著色。 [圖25]示出了VH（BGA-5623）的CDR3在CD137結合後經歷顯著的構象變化。黑色的CD137結合VH（BGA-5623）與白色的apoVH（BGA-5623）重疊。 [圖26]示出了VH（BGA-5623）/CD137複合物的結合表面上的原子相互作用。VH（BGA-5623）與CD137之間的結合介面識別BGA-5623（互補位殘基）和CD137（表位殘基）的某些關鍵殘基。CD137的CRD1和2結構域示出為覆蓋有白色透明表面的灰色底圖。互補位殘基以黑色著色。 [圖27]係用於研究可能影響體外CD137活化的其他參數諸如模組比率的CEAxCD137多特異性抗體形式之示意圖。 [圖28]證明模組比率為2 : 4的雙特異性抗體A-41A11-41A11可激活CD137，無論CEA +腫瘤細胞存在（28A）還是不存在（28B）。 [圖29]係用於研究可能影響體外CD137活化的其他參數諸如Fc功能和模組取向的CEA x CD137多特異性抗體形式之示意圖。 [圖30A]證明所研究的CEAxCD137多特異性抗體在CEA +腫瘤細胞存在下僅刺激PBMC產生IFN-γ。圖30B示出在不存在CEA +腫瘤細胞的情況下，CEAxCD137多特異性抗體不誘導IFN-γ。 [圖31]證明在CEA +腫瘤細胞存在下，連接子長度對體外CD137活化的影響極小。 [圖32A-D]示出了形式A-BGA-5623（BE-189）（圖32B）誘導對體內腫瘤生長的顯著抑制，但A-IgG1-BGA-5623（BE-740）（圖32C）則不，其中烏瑞魯單抗用作對照（圖32D）。 [圖33]係設計的腫瘤靶向CEA x CD137多特異性抗體形式之示意圖。 [圖34A至圖34B]示出了BE-146與huCEA（圖34A）和huCD137-mIgG2a（圖34B）的抗原結合ELISA。在該測定中測試了兩批BE-146。 [圖35]示出了藉由FACS分析的BE-146與人CD137的結合。 [圖36]示出了藉由FACS分析的BE-146與人CEA的結合。 [圖37]示出了藉由FACS，BE-146沒有脫靶結合。 [圖38A至圖38C]證明CEA x CD137多特異性抗體BE-146誘導來自人PBMC的IL-2和IFN-γ釋放。圖38A係在MKN45細胞存在下通過用BE-146和HEK293/OS8細胞共刺激huPBMC而活化CD137之示意圖。圖38B至圖38C示出了BE-146可誘導來自人PBMC的IL-2（圖38B）和IFN-γ（圖38C）。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖39A-B]證明CEA x CD137多特異性抗體BE-146誘導來自人T細胞的IL-2和IFN-γ釋放。圖39A示出了BE-146可誘導來自人PBMC的IL-2和IFN-γ（圖39B）。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值± SD表示。 [圖40A至圖40B]證明CEA x CD137誘導的反應係CEA依賴性的。圖40A示出BE-146可誘導來自PBMC的顯著的IL-2和IFN-γ釋放（圖40B），針對過表現CEA的HEK293細胞，但不針對沒有CEA轉導的HEK293細胞。測試了來自3個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖41A至圖41B]示出了CEAxCD137誘導的反應沒有被重組可溶性CEA顯著阻斷。結果示出BE-146誘導的來自PBMC的IL-2（圖41A）和IFN-γ（圖41B）釋放未被50 ng/ml或500 ng/ml可溶性CEA顯著阻斷。測試了來自2個供體的PBMC。結果以兩次重複的平均值 ± SD表示。 [圖42]證明BE-146使用基於細胞的生物發光測定增強T細胞活化。 [圖43A至圖43B]示出BE-146增強針對MKN45（CEA 高）（圖43A）而非NCI-N87（CEA 低）（圖43B）的來自PBMC的IFN-γ和IL-2釋放。 [圖44]證明BE-146劑量依賴性地增強PBMC對MKN45細胞的細胞毒性。 [圖45]示出BE-146和BGB-A317的組合促進來自PBMC的IFN-γ分泌。 [圖46A]係BE-146的基於ELISA的FcγRs結合分析。圖46B係基於ELISA的BE-146的C1q結合活性。 [圖47]示出了BE-146對人源化CD137敲入小鼠MC38/hCEA同源模型中的腫瘤生長之影響。 [圖48]示出了BE-146和Ch15mt對人源化CD137敲入小鼠CT26/hCEA同源模型中的腫瘤生長之影響。 [圖49]示出了BE-146和Ch15mt對人源化CD137敲入小鼠B16 F10/hCEA同源模型中的腫瘤生長之影響。 [圖50]示出了BE-146和Ch15mt對人源化CD137敲入小鼠B16 F10/hCEA同源模型中的動物存活率之影響。 [圖51]示出BE-146在體內不具有肝毒性。高劑量的烏瑞魯單抗類似物而不是BE-146誘導丙胺酸轉胺酶（ALT）和天冬胺酸轉胺酶（AST）濃度顯著增加，並增加肝中的炎性細胞浸潤。

Claims (50)

  1. 一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含在SEQ ID NO: 88的胺基酸596至674處特異性結合人CEA的第一抗原結合結構域和特異性結合人CD137的第二抗原結合結構域。
  2. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合結構域不與其他CEACAM家族成員結合。
  3. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 24的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 25的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 26的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 27的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 28的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 23的LCDR3；或 (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 41的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 42的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 43的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 44的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 45的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 40的LCDR3。
  4. 如請求項3所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 31至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 32至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或 (iii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 49至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  5. 如請求項4所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 14、15、31、32、48或49中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
  6. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該第一抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）； (ii) 包含SEQ ID NO: 31的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 32的輕鏈可變區（VL）；或 (iii) 包含SEQ ID NO: 48的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 49的輕鏈可變區（VL）。
  7. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3；或 (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
  8. 如請求項7所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 84至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 86至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iii) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 75至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (iv) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 70至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 60至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  9. 如請求項8所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 84、86、75、70或60中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
  10. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該第二抗原結合結構域包含： (i) 包含SEQ ID NO: 84的重鏈可變區（VH）； (ii) 包含SEQ ID NO: 86的重鏈可變區（VH）； (iii) 包含SEQ ID NO: 75的重鏈可變區（VH）； (iv) 包含SEQ ID NO: 70的重鏈可變區（VH）；或 (v) 包含SEQ ID NO: 60的重鏈可變區（VH）。
  11. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中： (i) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 80的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 81的HCDR3；以及 (ii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 73的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3； (iii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 65的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 66的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 67的HCDR3；或 (iv) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 7的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 8的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 9的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 10的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 11的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 55的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 56的HCDR2、(c) SEQ ID NO: 57的HCDR3。
  12. 如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中： (i) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 84的重鏈可變區（VH）； (ii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 86的重鏈可變區（VH）； (iii) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 75的重鏈可變區（VH）； (iv) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 70的重鏈可變區（VH）；或 (v) 特異性結合人CEA的該第一抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 14的重鏈可變區（VH）和包含SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區（VL）；並且特異性結合人CD137的該第二抗原結合結構域包含：包含SEQ ID NO: 60的重鏈可變區（VH）。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人工程化抗體、單鏈抗體（scFv）、Fab片段、Fab'片段或F(ab') 2片段。
  14. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  15. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體含有SEQ ID NO: 317至SEQ ID NO 358的連接子。
  16. 如請求項15所述之雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 324。
  17. 如請求項15所述之雙特異性抗體，其中該連接子係SEQ ID NO: 329。
  18. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-146（SEQ ID NO: 313和SEQ ID NO: 179）。
  19. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-189（SEQ ID NO: 255和SEQ ID NO: 179）。
  20. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-718（SEQ ID NO: 295和SEQ ID NO: 179）。
  21. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-740（SEQ ID NO: 297和SEQ ID NO: 179）。
  22. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-942（SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 301和SEQ ID NO: 303）。
  23. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-755（SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 301和SEQ ID NO: 305）。
  24. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-562（SEQ ID NO: 307和SEQ ID NO: 179）。
  25. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-375（SEQ ID NO: 309和SEQ ID NO: 179）。
  26. 如請求項14所述之雙特異性抗體，其中該多特異性抗體係BE-244（SEQ ID NO: 311和SEQ ID NO: 179）。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。
  28. 如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
  29. 如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含增加的二等分GlcNac結構。
  30. 如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該Fc結構域係具有降低的效應子功能的IgG1。
  31. 如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段，其中該Fc結構域係IgG4。
  32. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其進一步包含藥學上可接受的載劑。
  33. 如請求項32所述之藥物組成物，其進一步包含組胺酸/組胺酸HCl、海藻糖二水合物和聚山梨醇酯20。
  34. 一種治療癌症之方法，其包括向有需要的患者投與有效量的如請求項1所述之多特異性抗體或抗原結合片段。
  35. 如請求項34所述之方法，其中該癌症係胃癌、結腸癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該結腸癌係結腸直腸癌。
  37. 如請求項35所述之方法，其中該胃癌與血清中的高CEA水平相關。
  38. 如請求項35所述之方法，其中該肺癌與血清中的高CEA水平相關。
  39. 如請求項35所述之方法，其中該非小細胞肺癌與血清中的高CEA水平相關。
  40. 如請求項34所述之治療方法，其中該多特異性抗體以5 mg-1200 mg的範圍投與。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該多特異性抗體以5 mg-1200 mg的範圍投與，每週一次。
  42. 如請求項34所述之方法，其中該多特異性抗體或抗原結合片段與另一種治療劑組合投與。
  43. 如請求項42所述之方法，其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該治療劑係紫杉醇藥劑、來那度胺或5-氮雜胞苷。
  45. 如請求項42所述之方法，其中該治療劑係抗PD1或抗PDL1抗體。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該抗PD1抗體係替雷利珠單抗。
  47. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至26中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段。
  48. 一種載體，其包含如請求項47所述之核酸。
  49. 一種宿主細胞，其包含如請求項47所述之核酸或如請求項48所述之載體。
  50. 一種用於產生多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，其包括培養如請求項49所述之宿主細胞以及從培養物中回收該抗體或抗原結合片段。
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