JP7227138B2 - 骨標的抗体 - Google Patents
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Description
この出願は、2017年1月20日に出願された米国仮特許出願第62/448,763号の優先権を主張し、その開示はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。2018年1月11日に作成された前記ASCIIコピーは、022548_WO012_SL.txtと名付けられており、75,113バイトである。
本発明は、骨標的ペプチドで修飾された抗体、および病態生理学的骨変性を治療するためのそれらの使用方法に関する。
本発明は、それに結合した1つまたはそれ以上のポリD(ポリアスパラギン酸またはポリ-Asp)ペプチド(例えば、D10配列)を有する抗体および抗原結合断片を開示する。これらの修飾抗体および断片は、骨への局在化が改善されている。1つの特定の実施態様では、これらの抗体は、本明細書に記載のような抗TGFβ抗体である。理論に束縛されることを望まないが、1つまたはそれ以上のポリDペプチドを用いて抗TGFβ抗体を骨に対して効果的に標的化することは、TGFβに関連する病態生理学的な骨変性を特徴とする疾患を有する個体に対して、新たな治療を提供し得ると考えられる。
1つの特定の実施態様では、TGFβに関連する骨量減少についてヒト患者などの個体を治療する方法は、骨を標的とする有効量の抗TGFβ抗体を個体に投与することを含む。この方法はさらに、TGFβレベルまたは活性の低下、骨量減少または骨量減少率の低下、骨密度の増加、および/または骨強度の増加を測定または検出する工程を含み得る。
の治療薬、例えば骨量減少状態の治療薬(例えばビスホスホネート)との組合せで治療される。抗体または抗体断片および他の治療薬は、患者に同時にまたは逐次的に投与される。
本発明の抗体または断片は、当技術分野において十分に確立されている方法によって作製し得る。抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNA配列は、遺伝子が転写および翻訳制御配列などの必要な発現制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソームなどを含む。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列は、別々のベクターに挿入してもよく、また、同一または異なる発現制御配列(例えば、プロモーター)に機能的に連結してもよい。1つの実施態様では、両方のコード配列が同一の発現ベクターに挿入され、同じ発現制御配列(例えば、共通のプロモーター)、別々の同一の発現制御配列(例えば、プロモーター)に、または異なる発現制御配列(例えば、プロモーター)に機能的に連結される。抗体コード配列は、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位とベクターとのライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端のライゲーション)によって発現ベクターに挿入し得る。
本発明の抗体は、適切な貯蔵安定性のために調剤できる。例えば、抗体は、凍結乾燥されるか、または薬学的に許容される賦形剤を用いて使用のために保存または再構成される。併用療法のために、抗体などの2つ以上の治療剤を共配合してもよく、例えば混合されて単一の組成物中において提供される。
本発明のさらなる特定の実施態様が、以下に記述される。
抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第1および第2のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供すること、
抗体または抗原結合断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させること、ならびに
抗体または抗原結合断片を回収すること
を含む、前記製造方法。
抗体またはその抗原結合断片および1つまたはそれ以上のポリDペプチドを提供すること、ならびに
化学的コンジュゲーションによる共有結合を介してポリDペプチドを抗体に結合させること
を含む、前記製造方法。
実施態様1~25のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片を提供すること、および
抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される担体と混合すること
を含む、前記製造方法。
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様、およびその様々な用途を例示するものである。それらは説明の目的のためだけに記載されており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書においてmAb1と呼ばれる第1の抗TGFβ抗体は、ヒトTGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3に特異的(「汎特異的」)なマウスIgG1モノクローナル抗体であり、R&D Systemsから入手可能である(クローン#1D11、ミネアポリス、ミネソタ州)。mAb1抗体は、実施例において鋳型として役立った。
α-TGFβ抗体mAb1のD10ペプチド化学的コンジュゲートを図2に示されるようにして製造した。mAb1(2.0mg)をAmicon(登録商標)Ultra 50kDa MWCO遠心フィルター(EMD Millipore)を用いた3回の限外濾過によって、脱気ホウ酸緩衝液(25mM塩化ナトリウム、1mM DTPA、20mMホウ酸ナトリウム、pH8.0)中に交換した。次に、ヒンジ領域のジスルフィドをmAbあたり12モル:モルのジチオトレイトール(DTT)により37℃で2時間、還元した。この生成物を、脱気ホウ酸緩衝液4mLによりAmicon(登録商標)Ultraフィルターを用いて脱塩した。一定分量(1nmol、150μg)を25℃で漸増量(1~15モル:モル)のD10-マレイミドペプチド(Ac-D10-C2-PEG12-C6-マレイミド、ここでPEG12は12個のエチレンオキシド基を含む規定の長さのPEGから成る)と反応させた。1.5時間後、残りの未反応のチオール基をN-エチルマレイミド12当量の添加と、それに続く1.5時間のインキュベーションによってブロックした。この生成物を限外濾過により脱塩した。図3Aは、SimplyBlue(商標)(Thermo Scientific)で染色し、Odyssey(登録商標)近赤外スキャナー(LiCor)で画像化した4~12%のNuPAGEゲル上における各生成物0.5μgのSDS-PAGEを示している。レーン蛍光プロファイルをAlphaViewソフトウェア(ProteinSimple Corp.)を用いて統合し、ペプチド対抗体比(PAR)を決定した。重鎖または軽鎖のそれぞれにおける移動度のわずかなシフトは、単一のD10ペプチドの付加を表すと仮定されるが、これは、重鎖については最大5つの識別可能なバンド、軽鎖については1つの識別可能なバンドと一致し、それぞれのヒンジ領域システインの数とも一致する。重鎖および軽鎖上のペプチドの平均数は、各マイナーバンドの相対存在量とその割り当てられたペプチド数との積の合計から別々に計算された。各鎖はIgG全体中に2つあるため、PARは、重鎖および軽鎖からのそれらの数の2倍の合計から計算された。化学的コンジュゲーション反応におけるPAR値対ペプチド-マレイミド:mAb比が図3Bに示されており、これは、最大8モル:モルまでのコンジュゲートされたペプチドの数の増加に伴うPARの直線的な増加を示している。
この例では、DTTの比を8~10モル:モルに変え、マレイミド-ペプチド:mAbを3または15モル:モルのいずれかにしたことを除き、実施例1に記載したのと同じようにして、異なるPARの一群の化学的コンジュゲートを製造した。対照として、ヒトIgG1(ハーセプチン(登録商標))化学的コンジュゲートをアルゴン下、37℃、2時間の3モル:モルのトリス(2-カルボキシエチルホスフィン)(TCEP)による、そのヒンジジスルフィドの還元と、それに続く、25℃で一晩、15モル:モルのマレイミド-ペプチドによる反応によって製造し、限外濾過を用いて脱塩することにより精製した。
この例では、図2に示されているように、25mM NaCl、1mM DTPA、20mMホウ酸ナトリウム、pH8中、12当量のDTTを用いて、37℃で2時間、ヒンジ領域ジスルフィドを還元し、続いて、遊離チオールの一部をジスルフィドに変換するために2モル:モルの2,2’-ジピリジルジスルフィド(Sigma)と反応させることによって、D10とmAb1との化学的コンジュゲートを生成した。これに続き、実施例1に記載のD10-マレイミドペプチドとの反応を行った。最終生成物は、限外濾過により精製した。一部(25μg)は、スピンカラムで5mMリン酸ナトリウム(pH7.4)中に交換し、セラミックヒドロキシアパタイト(CHT)タイプII(BioRad)の100μLカラムでクロマトグラフィーにかけ、5~500mMリン酸ナトリウム(pH7.4)の勾配で0.5mL/分の流速で溶出させた。未修飾のmAb1を対照として使用した。A280カラムプロファイルが図5Aに示されている。mAb1はカラムへの微量の結合のみを示したが、コンジュゲートの約半分が結合し、0.2Mリン酸付近で溶出した。画分を濃縮し、SDS-PAGEによって分析した(図5B)。未結合(フロースルーまたは「FT」)画分は、ほぼ未修飾mAbを示したが、主ピーク4は、SDS-PAGEによる推定で6のPARを有するコンジュゲートを含んでいた。
この例では、実施例1に記載の様々な数のペプチドを有する一連のD10ペプチド化学的コンジュゲートを、実施例3に記載のようなCHTタイプIIカラムでのクロマトグラフィーにかけた。A280プロファイルおよび結合したコンジュゲートの割合およびピーク保持時間のプロットが図6Aに示されている。図6Bに見られるように、カラムに結合したコンジュゲートの量は、PAR3.8まで増加して横ばいになり、より多くのペプチドでは減少し始めた。対照的に、樹脂によるコンジュゲートの保持時間(相互作用の強さを示す)は、9までのペプチド数の増加に伴い増加した。
この例では、3つのmAb1-D10コンジュゲートのセットを、図2に示されるように、実施例1に記載されているようにして製造した。対照のコンジュゲートは、コンジュゲーション中にD10-マレイミドペプチドを省くことによって製造した。図3に示されるようなSDS-PAGE分析によって、これら3つのコンジュゲートについて、ペプチド負荷(PAR)は0、5または9であると決定した。次いで、これらのコンジュゲートがTGF-β1を不活性化する能力を1時間のTGF-β1との共インキュベーションによって決定した。次いで、増殖培地中の連続希釈物をヒトTGF-β1受容体を発現するヒトA549細胞に加え、続いて一晩インキュベートした。次いで、活性TGF-β1に対する細胞応答を増殖培地中へのIL-11の放出によって決定し、これをIL-11に特異的なELISAアッセイによって検出した。3つのコンジュゲートおよびmAb1対照についてのIL-11応答が図7に示されている。全ての場合において、約0.1nMの抗体でIL-11放出の最大半量阻害(EC50)が生じた。両方のコンジュゲート(PAR=5およびPAR=9)とペプチドを欠く擬似コンジュゲート(PAR=0)は、mAb1よりもわずかに良好な阻害を示した。コンジュゲートしたペプチドの数は、EC50に影響を及ぼさなかった。
D10-mAb1化学的コンジュゲートを、図2に示されるように、実施例1に記載されているのと同様にして製造した。mAb1(19.6mg)を脱気ホウ酸緩衝液中に交換し、37℃で1.5時間、10.6当量(1.06μmol)のDTTと反応させた後、緩衝液交換せずに、アルゴン下、25℃で1.5時間、6当量のD10ペプチド(Ac-D10-C2-PEG12-C6-マレイミド)と反応させた。コンジュゲーションされていない遊離のチオールは、N-エチルマレイミド12当量の添加と、それに続く25℃、30分間のインキュベーションによりブロックした。最終生成物を限外濾過により精製した。SDS-PAGEを用いて、ペプチド対抗体比を決定した(約4.8のPAR)。軽鎖は、軽鎖システイン残基への単一のペプチドの付加に対応する微量のバンドを示した。
図9Aおよび図9Bに示される一群の組換え抗TGFβ-D10ペプチド融合バリアントを以下のようにして製造した。
様々な位置にD10ペプチドを有するmAb1重鎖および軽鎖を発現するための一群のプラスミドを生成した。さらに、D10ペプチドを含まない野生型のmAb1重鎖および軽鎖についても、2つのプラスミドを生成した。クローニング目的のためにインフレームで設計された適切な制限酵素部位に隣接した、全てのコドン最適化配列を合成により生成した(GeneArt)。C末端にD10ペプチドを含む、または含まないマウスIgG1定常領域、およびmAb1野生型軽鎖全体をコードする3つの遺伝子断片をApaLI/HindIII制限酵素およびその後のライゲーションを用いて、Durocherら(2002,Nucl.Acids Res.30(2):E9)によって記載されたpTTベクターの類似体である空のエピソーム哺乳動物発現ベクターpFFにクローニングし、「mIgG1_CH123_pFF」、「mIgG1_CH123D10_pFF」および「mAb1_VLCL_pFF」を作製した。N末端D10ペプチドを含む、または含まない可変領域をコードする遺伝子断片は、重鎖についてはApaLI/EagIを、軽鎖についてはApaLI/MfeIを用いて、ベクターにクローニングした。野生型定常領域を置換するために、MfeI/HindIIIを使用して、C末端D10および異なる長さのG4S(配列番号9)スペーサーを有するマウスIgカッパ軽鎖の定常領域をコードする遺伝子断片を「mAb1_VLCL_pFF」にクローニングした。各構築物に予想される正しいDNA配列をDNA配列決定(ACGT,Inc.)によって確認した。
表1に記載の融合バリアントおよびペプチドなしの対照を生成するために、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターの各々の1つを同時トランスフェクションのために選択することによって、融合バリアントを作製した。「PAR」(ペプチド対抗体比)は、その重鎖および軽鎖の両方において、最終的に発現される抗体に付加されていると予想されるペプチドの総数を反映している。融合バリアントID「mAb1 F1」は、修飾なしのmAb1配列と実質的に同一である「野生型」(「wt」)構築物を表す。「HC」はmAb1の重鎖を表し、「LC」はmAb1の軽鎖を表し、「D10」はD10ペプチド(配列番号1)を表し、「G4S」は一部の構築物に組み込まれるgly-gly-gly-gly-ser(配列番号9)からなるスペーサー配列を表す。
20種類全ての組換えmAb1-D10融合バリアントを30mLスケールでExpi293-F細胞において発現させた。馴化培地(CM)を6日目に回収し、発現レベルを非還元SDS-PAGEによって評価した。最初の評価と比較して、やや高いレベルの発現(30~150μg/ml)が観察されたが、相対的な発現レベルは、より小規模のトランスフェクションと一致していた。
発現レベルおよびTGF-β1結合
発現レベルの定量化およびTGF-β1に結合する組換えmAb1-D10融合バリアントの能力をOctet(登録商標)QK384を用いて評価した。マウスIgGのためのOctet(登録商標)バイオセンサーを、サンプル希釈液(0.01%BSAおよび0.02%Tween20を含有するPBS、pH7.4)で1:10に希釈した馴化培地または1.25~100μg/mLの範囲の精製mAb1標準の2倍連続希釈液中に浸漬させた。サンプルを500rpmで振盪しながら、結合データを2分間収集した。力価は、初期結合速度の4パラメータフィットおよび標準から得られたものとの比較を用いて計算した。次いで、バイオセンサーを希釈液で1分間洗浄して培地を除去し、ベースラインを再確立して、次いで、結合を追跡するために40nMのTGF-β1を含有するウェルに1000rpmで3分間浸漬させた。この後、1000rpmで3分間、希釈液にセンサーを移すことによる解離工程が続いた。表2に見られるように、培地中の融合バリアントの濃度は、11~178μg/mLの範囲(「Octet濃度」)であり、SDS-PAGEによって観察された傾向(「発現レベル」)と概して一致していた。さらに、融合バリアントの全てがTGF-β1に結合することができ、これは、表示の位置のいずれかにD10ペプチドが存在することが、抗原結合に深刻な影響を及ぼさなかったことを示唆している。
組換えmAb1-D10融合バリアントによるマウスFcRn結合をOctet QK384を用いて評価した。全ての工程を1000rpmで実施した。10μg/mLの抗体濃度を達成するように希釈された馴化培地を5分間、抗マウスIgG Fvバイオセンサーに接触させた。次いで、バイオセンサーを、ベースラインを確立するために、PBSP pH6.0(50mMリン酸ナトリウム、pH6.0、150mM塩化ナトリウム、0.005%界面活性剤P2O)中に浸漬させた。次いで、センサーをPBSP pH6.0中1μMに希釈された可溶性マウスFcRnを含有するウェルに3分間移し、続いてPBSP pH6.0を含有するウェル中で3分間解離させた。表2に示されるように、全てのバリアントがマウスFcRnに結合した。
組換えmAb1-D10融合バリアントによるプロテインGへの結合をOctet QK384を用いて評価した。プロテインGバイオセンサーをサンプル希釈液中10μg/mL抗体に希釈した馴化培地を含むウェルに浸漬させ、1000rpmで3分間シグナルを追跡した。表2に示されるように、全てのバリアントがプロテインGに結合した。
精製WT構築物ならびに組換え融合バリアントmAb1 F2、mAb1 F6、mAb1 F7、mAb1 F11、mAb1 F12、mAb1 F16、およびmAb1 F17を還元および非還元条件下、4~20%トリス-グリシンSDS-PAGEゲル(Novex、Life Sciences)で分析し、クマシーブルーにより染色した。ProteinSimple(登録商標)イメージャーによって収集した可視光画像が図10に示されている。重鎖および/または軽鎖の移動度のわずかな低下が観察され、これは、それぞれについて予想されるD10ペプチドの存在および数と一致していた。不純物および共有結合性の凝集体は検出されなかった。
重鎖および軽鎖の末端におけるD10ペプチドの全ての可能な組合せを代表するいくつかの組換えmAb1-D10融合バリアントの熱安定性を、レポーター色素としてSYPRO(登録商標)Orange(Thermo Scientific)を使用した示差走査蛍光光度法によって決定した。より高い温度でのタンパク質の安定性は、典型的な貯蔵条件下でのそれらの安定性を予測するものであり、よって、治療薬としての製造および使用に対するそれらの適合性を評価するために使用し得ることが一般に受け入れられている。熱安定性は、タンパク質構造のアンフォールディングによって露出される疎水性領域への結合に伴って蛍光に増加を示す色素を用いて、リアルタイムPCR装置上で評価される(Loら,2004,Anal.Biochem.332(1):153-9)。1:1000希釈のSYPRO(登録商標)Orangeを含むサンプル(タンパク質1mlあたり0.5mgで10μL)の蛍光をCFX96リアルタイムPCR検出システムで温度を上げながら追跡した。データはCFX Manager 3.0(Bio-Rad Laboratories)を用いて分析した。図11は、いくつかのバリアントについての温度による蛍光の変化率を示している。構造遷移によって影響されないタンパク質構造の部分への色素の結合を分離するため、一般に絶対蛍光ではなく変化率が使用される。負の変位は蛍光変化率の増加を反映し、最小値はアンフォールド状態への遷移の中間点(「Tm」)を表す。試験したバリアントのいくつか(mAb1 F6、mAb1 F11、mAb1 F16)は、未修飾の抗体対照(「WT」=mAb1 F1)と区別がつかないTmプロファイルを示した。他の2つ(mAb1 F2およびmAb1 F7)は、主要な遷移についてTmの有意な減少を示した。2つのバリアント(mAb1 F12およびmAb1 F17)が最も低いTm値を示した。特に、軽鎖のN末端にD10ペプチドを含む4つ全ての組換えmAb1-D10融合バリアントがTmの有意な減少を示し、これは、mAb1抗体上のこの位置にペプチドが配置されると、その構造が不安定になることを示唆している。逆に、重鎖のいずれかの末端へのD10ペプチドの配置は、Tmのいかなる変化とも相関していなかった。図11に示されているように観察されたいくつかの融合バリアントについての優勢な遷移のTm値が表3にまとめられている。
TGF-β1活性の中和における組換えmAb1-D10融合バリアントの効力を、培地に添加したTGF-β1に応答したA549腫瘍細胞によるIL-11の分泌のin vitroにおける阻害によって決定した。手順は、実施例3に記載されているようにして行った。実施例7からのいくつかの代表的な融合バリアントを(それらの精製の容易さの指標として)それらのプロテインGに対する親和性に基づき選択した。8つのバリアント(mAb1 F1、mAb1 F2、mAb1 F6、mAb1 F7、mAb1 F11、mAb1 F12、mAb1 F16、およびmAb1 F17)についてのTGF-β1阻害プロファイルが図12Aおよび図12Bに示されている。全ての融合タンパク質がmAb1対照と同様なEC50を示した。
実施例7の組換えmAb1-D10融合バリアントをBiacore(登録商標)によって検出される表面プラズモン共鳴(SPR)を使い、TGF-β1結合について定量的にも評価した。平衡定数KDを決定するために、精製されたバリアントを含有するサンプルを、アミンカップリングしたTGF-β1を有するセンサーチップに通した。チップ上の隣接するTGF-β1分子から生じるアビディティー効果の可能性を最小化するために、100応答単位(RU)未満のTGF-β1の標的固定化レベルを選択した。固定化のレベルは、チップ表面のNHS/EDC活性化後、エタノールアミンでクエンチする前の応答単位の変化によって決定した。融合バリアント、WT融合バリアントF1、およびmAb1対照をHBS-EP緩衝液中で30、10、3、1および0.37nMに希釈し、TGF-β1チップ上に30μL/分で3分間通し、続いて5分間、同じ緩衝液中での解離を行った。試験の間に、流速75μL/分でチップ上に40mMのHClを30秒間で2回注入して通すことによって、チップ表面を再生し、結合した抗体を除去した。表4に示されるように、全ての融合バリアントおよびWT構築物(F1)についての平衡定数(KD)がmAb1対照の2.4倍以内であった。予想外なことに、融合バリアントにより誘発された最大のシグナル(RU)は、ペプチドの数の増加に伴って減少し、バリアントF17(D10-HC-D10/D10-LC、PAR=6)が最も低いシグナルを示した。これは、試験された全ての融合バリアントがTGF-β1の中和においてmAb1またはWT構築物のいずれかに匹敵するか、またはそれよりも強力であることを示した実施例9に記載されているA549細胞の効力アッセイとは対照的である。この低下の可能な説明は、チップマトリクス(カルボキシメチルデキストラン)と負に荷電したD10ペプチドとの間の静電反発力から反映され得る。
実施例7からの組換えmAb1-D10融合バリアントを、実施例3に記載されているセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)カラムへの結合についても試験し、それらが骨のミネラル構造に結合する可能性を評価した。組換えmAb1-D10融合バリアント(5mMリン酸ナトリウムpH7.4中、各25μg)をヒドロキシアパタイトの100μLカラム(CHTタイプII、BioRad)に付し、0.005~0.5Mリン酸Na+(pH7.4)の勾配を用いて溶出させた。カラムから溶出する移動相中のタンパク質をA280で追跡した。カラム性能の一貫性を確実にするために、各組の試験の始めと終わりに標準(通常、mAb1-D10化学的コンジュゲート)について試験した。図13は各試験のA280プロファイルを示している。以下の表5には、保持時間(RT)および結合画分が示されている。1つを除く全ての組換え融合バリアントがほぼ定量的に結合したが、それらの保持時間に反映されるように、親和性に差を示した。保持時間の順位はPARとあまり相関せず、これは、ペプチドの位置が結合に有意に影響することを示唆している。特に、最も強い結合(最高のRT)がバリアントF7(PAR4)で観察された一方、バリアントF17(PAR6)はわずかに弱い結合を示した。1つのバリアント(F6、PAR2)は、ほとんどのPAR4バリアントよりも弱い結合を示したが、他のPAR2バリアント(F2およびF11)よりも有意に良好であった。軽鎖のN末端のみにペプチドを有する1つのバリアント(F2)は、そのRTおよび結合画分に反映されるように、弱い結合しか示さなかった(23%)。mAb1-D10化学的コンジュゲート(「CC」;約4のPAR)は2つのピークを生成し、84%が全てのPAR4融合バリアントよりも早いRTで溶出した。
実施例6に記載されているようにして作製された組換えmAb1-D10融合バリアント(F6、F16、およびF17)およびmAb1-D10化学的コンジュゲートから選択されたサブセットの体内分布をCD-1マウスへの尾静脈注射後に決定した。組換えバリアントは、発現および精製収率、TGF-β1結合親和性、細胞での効力、およびヒドロキシアパタイトへの結合を含む、いくつかの要因に基づき選択した。これらのバリアントは、標的化がヒドロキシアパタイトへの結合を再現するかどうか、またはそれがペプチドの数の相関的要素であるかどうかを評価するために、2、4、または6個のD10ペプチドを含む例を含んでいた。タンパク質をHEK293細胞中で発現させ、プロテインA上で精製した。3つの組換えmAb1融合バリアントをin vitroとin vivoで詳細に分析した。これらにおいて、D10ペプチドは、重鎖のC末端(mAb1 F6)、重鎖のN末端およびC末端の両方(mAb1 F16)、または重鎖のN末端およびC末端と軽鎖のC末端(mAb1 F17)のいずれかのみに組換え的に付加されていた。mAb1 F6、F16およびF17組換えバリアントはそれぞれ、2、4および6のペプチド対抗体比(PAR)を有している。実施例6の試験において骨への標的化を示したmAb1-D10ペプチド化学的コンジュゲート(約4.8のPAR)をポジティブコントロールとして選択した。
重鎖C末端にD10配列を有するmAb2(ヒンジ変異S228Pを有するヒト抗TGFβIgG4抗体)を製造するための発現ベクター(すなわち、mAb2 HC-D10/mAb2 wt LC(配列番号14/配列番号15)、これはバリアントF6におけるものに対応する立体配置を有し(図9B参照)、以下mAb2 F6と呼ばれる;表7参照)を、実施例7に記載されているのと同様にして生成した。Expi293F細胞をミニプレップDNAでトランスフェクトし、6日後に馴化培地(60mL)を回収し、タンパク質生成物をHiTrapプロテインA(GE Healthcare)上で精製した。
組換えmAb2バリアントF6(mAb2 F6)およびmAb2対照抗体をAlexaFluor(登録商標)647(Thermo Scientific)で標識し、1mg/kgの用量でC57BL/6マウスに腹腔内投与した。24時間後および96時間後、数匹のマウスを屠殺し、脊椎および大腿骨を切除し、IVIS装置で画像化した。屠殺時に得られた血清サンプル(10μL)を並行して画像化した。大腿骨遠位(小柱)ROIおよび腰椎についての平均総放射効率が図17Aおよび図17Bに示されている。表8には相対強度がまとめられている。これらの結果は、mAb2へのD10の組換え付加の結果として、96時間後における腰椎および大腿骨における抗体量の大幅な増加を示し、血清中の有意な減少を示している。
この例では、マウス抗TGFβ-D10抗体融合タンパク質の薬物動態をマウスにおいて測定した。
この例では、骨形成不全症の動物モデルにおいて、複数回投与のピーク-トラフ薬物動態試験を実施した。
この例では、骨の密度および強度に対する非標的化mAb1に対する骨標的化(mAb1 F6)の効能を決定するために、骨形成不全症の動物モデルにおいて複数回投与の効能試験を実施した。
この例では、mAb1 F6についての適切な投与頻度を決定し、骨標的抗体のその最適有効性を達成するために、骨形成不全症の動物モデルにおいて、投与頻度試験を実施した。
この例では、mAb1 F16についての適切な投与頻度を決定し、骨密度に対するその最適な影響を達成するために、骨形成不全症の動物モデルにおいて投与頻度試験を実施した。
この例では、mAb1 F11についての適切な投与頻度を決定し、骨密度に対するその最適な影響を達成するために、野生型マウスにおいて投与頻度試験を実施した。
この例では、蛍光標識したmAb1、mAb1 F6、mAb2、およびmAb2 D10(mAb2の重鎖C末端にコンジュゲートしたD10;mAb2 F6)の、野生型マウスにおける体内分布を比較するための試験を実施した。各試験品およびビヒクルの単回腹腔内投与をマウスに行い、組織採取のために様々な時点でマウスを安楽死させた。採取した他の組織(データは示さず)のうち、mAb1およびmAb1 F6を投与した1、4、10、20、43、および98日後に腰椎、心臓、肝臓、および腸を回収した。また、mAb2およびmAb2 D10を投与した後、24および96時間においても組織をサンプリングした。
Claims (21)
- 重鎖、軽鎖、ならびに、重鎖、および/または軽鎖のC末端、に連結された1つまたはそれ以上のポリアスパラギン酸(ポリD)ペプチドを含み、ヒトTGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3に結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、前記1つまたはそれ以上のポリDペプチドは、重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と一体化しており、そして、前記抗体は、配列番号13の重鎖相補性決定領域(CDR)1~3および配列番号15の軽鎖CDR1~3を含むか、または、配列番号2および6の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
- (i)重鎖のN末端と一体化しているポリDペプチド、(ii)重鎖のC末端と一体化しているポリDペプチド、または(iii)(i)と(ii)の両方を含む、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片。
- 軽鎖のC末端と一体化しているポリDペプチドを含む、請求項1または2に記載の抗体または抗原結合断片。
- ポリDペプチドは、ペプチドリンカーを介して重鎖または軽鎖に融合している、請求項1~3のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 1つまたはそれ以上のポリDペプチドは、それぞれ独立して2~30個のアスパラギン酸残基を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 抗体がIgGである、請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。
- 抗体は、配列番号13の残基1~120に対応する重鎖可変ドメイン(VH)アミノ酸
配列、および配列番号15の残基1~108に対応する軽鎖可変ドメイン(VL)アミノ
酸配列を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片。 - 抗体は、228位(EU番号付け)にプロリンを有するヒトIgG4定常領域を含む、
請求項6または7に記載の抗体または抗原結合断片。 - 抗体の重鎖は、配列番号13のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は、配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片。
- 重鎖は、配列番号13、14、16または17のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号15、19、21または22のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- 抗体の重鎖は、配列番号14または17のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号15のアミノ酸配列を含む、ヒトTGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3に結合するIgG4抗体。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- TGFβの阻害から利益を得る骨状態を有するヒトを治療するための医薬を製造するための、請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
- 処置は、ヒトにおける(1)TGFβレベルの低下、(2)TGFβ活性の低下、(3)骨量減少の低下、(4)骨量減少率の低下、(5)骨密度の増加、(6)骨強度の増加、および(7)IL-11レベルの低下の少なくとも1つをもたらす、請求項13に記載の使用。
- ヒトは、骨形成不全症、骨量減少もしくは骨粗鬆症、慢性腎臓病、または骨転移を有する癌を有する、請求項13または14に記載の使用。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項16に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項17に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 宿主細胞は哺乳動物細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合断片の製造方法であって、
抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第1および第2のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供すること、
抗体または抗原結合断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させること、ならびに
抗体または抗原結合断片を回収すること
を含む、前記製造方法。 - 第1のヌクレオチド配列は、配列番号23、24、25または26を含み、第2のヌクレオチド配列は、配列番号27、29、31または32を含む、請求項20に記載の方法。
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