CN118119402A - 工程化抗her2双特异性蛋白 - Google Patents
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Abstract
在一方面，提供了具有特异性结合人HER2的亚结构域II和人HER2的亚结构域IV两者的能力的双特异性蛋白。在另一方面，提供了使用特异性结合人HER2的亚结构域II和亚结构域IV的双特异性蛋白来治疗癌症或治疗癌症的脑转移的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月25日提交的美国临时专利申请号63/237,071的优先权，所述申请的公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景技术
癌症诸如乳腺癌的脑转移的治疗目前提出了令人畏惧的临床挑战。在乳腺癌患者中，脑转移的发生率高达50％。临床数据表明，HER2阳性乳腺癌有转移至脑的倾向。值得注意的是，抗HER2疗法已被证明可用于控制颅外肿瘤，但不能用于控制颅内病变。这些疗法未能控制转移性病变，诸如HER2阳性乳腺癌的脑转移，主要是由于治疗剂无法穿过血脑屏障(BBB)并进入脑实质。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种蛋白质，其包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与单链可变片段(scFv)融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)与(a)中所述的Fd部分配对形成Fab的轻链多肽，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且
其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。
在此蛋白质的一些实施方案中，独立地包含所述S239D和/或所述I332E取代的所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能。
在此蛋白质的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在其他实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。
在此蛋白质的一些实施方案中，
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(g)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(h)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(j)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(k)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(l)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(m)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代；
(n)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代；或者
(o)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
在此蛋白质的某些实施方案中，
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代。
在此蛋白质的特定实施方案中，
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(d)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。在其他实施方案中，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第二Fc多肽经由第一接头与所述scFv融合。所述第一接头的长度可为1至20个氨基酸，例如以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述scFv包含经由第二接头连接的VL区和VH区。所述第二接头的长度可为1至20个氨基酸，例如以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合转铁蛋白受体(TfR)，例如，含有产生TfR结合位点的本文所述的任何序列修饰。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代。在其他实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽包含T366W取代。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，所述降低效应子功能的修饰是L234A和L235A取代。作为一个实例，根据EU编号，所述第一Fc多肽可以特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代，所述第一Fc多肽还可以包含P329G或P329S取代，并且所述第二Fc多肽可以包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。作为另一实例，根据EU编号，所述第二Fc多肽可以特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代，所述第二Fc多肽还可以包含P329G或P329S取代，并且所述第一Fc多肽可以包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
在此蛋白质的一些实施方案中，铰链区或其部分连接至所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的N端。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含与选自SEQ ID NO:131-149和183-196组成的组的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在某些实施方案中，所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:133和183-185的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在某些其他实施方案中，所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:137和186-196的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在此蛋白质的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在此蛋白质的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在此蛋白质的其他实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在另一方面，本公开提供了一种蛋白质，其包含：
(a)(i)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:159的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(b)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(c)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:174的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(d)(i)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(e)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(f)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:174的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(g)(i)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(h)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(i)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:176的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(j)(i)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(k)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(l)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:176的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽；或者
(m)(i)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的轻链多肽。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一重链多肽包含存在于第一重链多肽序列中的TfR结合位点、促进异二聚化的修饰、增强HER2介导的效应子功能的修饰和/或减少TfR介导的效应子功能的修饰，以及与所述第一重链多肽序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在此蛋白质的其他实施方案中，所述第二重链多肽包含存在于第二重链多肽序列中的TfR结合位点、促进异二聚化的修饰、增强HER2介导的效应子功能的修饰和/或减少TfR介导的效应子功能的修饰，以及与所述第二重链多肽序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在再另一方面，本公开提供了一种蛋白质，其包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)和/或(b)中的所述Fd部分在N端处与scFv融合，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且
其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。
在此蛋白质的一些实施方案中，独立地包含所述S239D和/或所述I332E取代的所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能。
在此蛋白质的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在其他实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。
在此蛋白质的一些实施方案中，
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(g)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(h)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(j)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(k)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(l)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(m)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代；
(n)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代；或者
(o)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
在此蛋白质的某些实施方案中，
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代。
在此蛋白质的特定实施方案中，
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(d)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。在其他实施方案中，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在此蛋白质的一些实施方案中，(a)或(b)中的所述Fd部分在N端处与所述scFv融合。
在此蛋白质的一些实施方案中，(a)和/或(b)中的所述Fd部分经由第一接头与所述scFv融合。在某些实施方案中，所述第一接头的长度为1至20个氨基酸，例如以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述scFv包含经由第二接头连接的VL区和VH区。在一些实施方案中，所述第二接头的长度为1至20个氨基酸，例如以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGS GGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGS GGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SE Q ID NO:123)。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合转铁蛋白受体(TfR)，例如，含有产生TfR结合位点的本文所述的任何序列修饰。在一些实施方案中，所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代。在其他实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽包含T366W取代。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，所述降低效应子功能的修饰是L234A和L235A取代。作为一个实例，根据EU编号，所述第一Fc多肽可以特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代，所述第一Fc多肽还可以包含P329G或P329S取代，并且所述第二Fc多肽可以包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。作为另一实例，根据EU编号，所述第二Fc多肽可以特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代，所述第二Fc多肽还可以包含P329G或P329S取代，并且所述第一Fc多肽可以包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
在此蛋白质的一些实施方案中，铰链区或其部分连接至所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的N端。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含与选自SEQ ID NO:131-149和183-196组成的组的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在某些实施方案中，所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:133和183-185的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在某些其他实施方案中，所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:137和186-196的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在此蛋白质的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在此蛋白质的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在此蛋白质的其他实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在又一方面，本公开提供了一种蛋白质，其包含：
(a)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:160的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(b)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:161的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(c)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:162的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(d)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(e)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:178的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(f)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(g)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(h)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:178的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(i)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(j)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(k)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:180的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(l)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(m)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(n)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:180的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(o)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(p)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(q)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:182的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(r)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(s)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(t)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:182的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(u)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ IDNO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的两条轻链多肽。
在此蛋白质的一些实施方案中，所述第一重链多肽包含存在于第一重链多肽序列中的TfR结合位点、促进异二聚化的修饰、增强HER2介导的效应子功能的修饰和/或减少TfR介导的效应子功能的修饰，以及与所述第一重链多肽序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在此蛋白质的其他实施方案中，所述第二重链多肽包含存在于第二重链多肽序列中的TfR结合位点、促进异二聚化的修饰、增强HER2介导的效应子功能的修饰和/或减少TfR介导的效应子功能的修饰，以及与所述第二重链多肽序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在本公开的另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的任何蛋白质和药学上可接受的载剂。
在本公开的另一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本文所述的蛋白质的核苷酸序列。
在本公开的另一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包含前述方面的多核苷酸。
在本公开的另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含多核苷酸或载体。
在本公开的另一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的癌症或治疗受试者的癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的蛋白质或其药物组合物。
在所述方法的一些实施方案中，所述蛋白质与化学疗法或放射疗法组合施用。
在此方法的一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是HER2阳性癌症。
附图说明
图1A是示意图，示出了具有“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”结构的示例性双特异性蛋白，其中scFv经由铰链或部分铰链区与具有TfR结合位点(星号)和杵突变(knob mutation)的Fc多肽的N端融合，而另一Fc多肽具有臼突变。
图1B是示意图，示出了具有“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”结构的示例性双特异性蛋白，其中scFv经由铰链或部分铰链区与具有臼突变的Fc多肽的N端融合，而另一Fc多肽具有TfR结合位点(星号)和杵突变。
图2A是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在HC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中scFv与具有臼突变的Fc多肽的C端融合，而另一Fc多肽具有TfR结合位点(星号)和杵突变。
图2B是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在HC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中scFv经由接头与Fd部分的N端融合。scFv与含有具有臼突变的Fc多肽的重链Fd部分融合，而另一Fc多肽具有TfR结合位点(星号)和杵突变。
图2C是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在HC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中两个scFv各自经由接头与重链的Fd部分的N端融合。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图2D是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在HC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中两个scFv各自经由接头与重链的Fc多肽的C端融合。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图3A是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在LC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中scFv经由接头与轻链的C端融合。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图3B是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在LC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中scFv经由接头与轻链的N端融合。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图3C是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在LC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中两个scFv各自经由接头与轻链的N端融合。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图3D是示意图，示出了具有“mAb/N端或C端scFv在LC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中两个scFv各自经由接头与轻链的C端融合。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图4是示意图，示出了具有“mAb/N端VH VL在HC和LC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中两个VH区各自与重链的Fd部分的N端融合并且两个VL区各自与轻链的N端融合。VH区和VL区形成Fv片段。Fc多肽上的TfR结合位点用星号表示。
图5是示意图，示出了具有“mAb/C端VH VL在HC上”结构的示例性双特异性蛋白，其中VH区与具有臼突变的Fc多肽的C端融合并且VL区与具有TfR结合位点(星号)和杵突变的Fc多肽的C端融合。VH区和VL区形成Fv片段。
图6A和图6B示出了在BT474和OE19细胞的生长抑制测定中分别在第6天和第3天具有“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”结构的双特异性蛋白对癌细胞增殖的抑制。
图7是示出C57/BL6小鼠中抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照的血浆PK曲线的图表。
图8A是示出静脉内施用抗HER2双特异性蛋白或抗HER2对照的TfRmu/hu KI小鼠中网状红细胞定量的图表。
图8B是示出TfRmu/hu KI小鼠中抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照的血浆PK曲线的图表。
图8C是示出TfRmu/hu KI小鼠中抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照的脑PK曲线的图表。
图8D是示出TfRmu/hu KI小鼠中抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照的脑浓度比血浆浓度的百分比的图表。
图9A-图9F示出了抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照对具有(图9A-图9C)或不具有(图9D-图9F)NRG1的BT474细胞的生长抑制测定。
图9G-图9I示出了抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照对OE19细胞的生长抑制测定。
图9J-图9L示出了抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照对ZR75细胞的生长抑制测定。
具体实施方式
I.引言
在一方面，提供了可结合人HER2的亚结构域II和人HER2的亚结构域IV两者的双特异性蛋白。一般来说，双特异性蛋白可以在没有轻链错配或转向(steering)的情况下产生。在一些实施方案中，双特异性蛋白单价结合人HER2的每个靶亚结构域。在一些实施方案中，双特异性蛋白单价结合人HER2的一个靶亚结构域并且二价结合人HER2的另一靶亚结构域(例如，单价结合亚结构域II并且二价结合亚结构域IV，或者单价结合亚结构域IV并且二价结合亚结构域II)。在一些实施方案中，双特异性蛋白二价结合人HER2的每个靶亚结构域。双特异性蛋白的各种结构在本文中进一步详细描述。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含结合人HER2的亚结构域II(或亚结构域IV)的scFv和结合人HER2的亚结构域IV(或亚结构域II)的Fab(参见，例如，第III节中的“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”结构)。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含一个或多个与双特异性蛋白重链的N端或C端连接的scFv，其中scFv结合人HER2的亚结构域II(或亚结构域IV)并且双特异性蛋白中的Fab结合人HER2的亚结构域IV(或亚结构域II)(参见，例如，第III节中的“mAb/N端或C端scFv在HC上”结构)。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含一个或多个与双特异性蛋白轻链的N端或C端连接的scFv，其中scFv结合人HER2的亚结构域II(或亚结构域IV)并且双特异性蛋白中的Fab结合人HER2的亚结构域IV(或亚结构域II)(参见，例如，第III节中的“mAb/N端或C端scFv在HC上mAb/N端或C端scFv在LC上”结构)。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含与重链的N端连接的Fv片段的VH区(或VL区)和与轻链的N端连接的Fv片段的VL区(或VH区)，其中Fv片段结合人HER2的亚结构域II(或亚结构域IV)并且双特异性蛋白中的Fab结合人HER2的亚结构域IV(或亚结构域II)(参见，例如，第III节中的“mAb/N端VH VL在HC和LC上”结构)。在再其他实施方案中，双特异性蛋白包含与双特异性蛋白中的两条重链中的一条的C端连接的Fv片段的VH区(或VL区)和与两条重链中的另一条的C端连接的Fv片段的VL区(或VH区)，其中Fv片段结合人HER2的亚结构域II(或亚结构域IV)并且双特异性蛋白中的Fab结合人HER2的亚结构域IV(或亚结构域II)(参见，例如，第III节中的“mAb/C端VH VL在HC上”结构)。
先前的疗法未能控制HER2阳性乳腺癌的脑转移，主要是因为治疗剂不能穿过血脑屏障(BBB)并进入脑实质。因此，需要能够穿过BBB并靶向脑实质中的HER2的新治疗剂。我们先前描述了使用转铁蛋白受体(TfR)结合作为一种实现跨脑内皮BBB递送的方法，因为TfR的表达在脑内皮细胞中高度表达，并且可以经由受体介导的转胞吞作用实现BBB递送。有趣的是，TfR在多种癌症中高度表达，包括HER2阳性乳腺癌。癌细胞获得TfR表达增加的机制可能涉及肿瘤细胞增殖和代谢需求诸如铁摄取的增加。事实上，公共微阵列数据集证明了TfR表达与乳腺癌预后的相关性(Miller等人,Cancer Res.71:6728,2011)。也有一些关于使用TfR作为各种类型的癌症的药理学靶标的报道。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含特异性结合BBB受体例如TfR的一种或多种修饰的Fc多肽(即，TfR结合Fc多肽)。在一些实施方案中，双特异性蛋白能够转运穿过BBB。在一些实施方案中，与仅结合HER2的其他治疗剂相比，如本文所述的结合HER2和TfR两者的抗HER2双特异性蛋白在结合也表达高水平TfR的HER2阳性肿瘤细胞后可以提供额外的抗肿瘤益处。具体地，由于这些蛋白质可以同时结合TfR和HER2两者，这可以增强它们的效力和/或功效。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含修饰的Fc多肽二聚体，其特异性结合TfR，当与TfR结合时具有降低的效应子功能(例如，ADCC或CDC)，但当与HER2结合时保留或具有增强的效应子功能(例如，ADCC或CDC)。
II.定义
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括多个指示物，除非内容另外明确指出。因此，例如，提及“抗体”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。
如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰以数值或范围指定的量时，表示所述数值以及与本领域技术人员已知的值的合理偏差，例如±20％、±10％或±5％在所列举值的预期含义内。
如本文所用，术语“抗体”是指具有经由其可变区特异性结合抗原的免疫球蛋白折叠的蛋白质。所述术语涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、多特异性抗体诸如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。如本文所用的术语“抗体”还包括保留抗原结合特异性的抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv、scFv和二价scFv。抗体可以含有分类为κ或λ的轻链。抗体可以含有分类为γ、μ、α、δ或ε的重链，这些重链又分别定义了免疫球蛋白类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每一对具有一个“轻”(约25kD)链和一个“重”链(约50-70kD)。每条链的N端定义了主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指代这些轻链和重链。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中来源于种系(germline)可变(V)基因、多样性(D)基因或接合(J)基因(而不是来源于恒定(Cμ和Cδ)基因区段)并且赋予抗体与抗原结合的特异性的结构域。通常，抗体可变区包含四个保守的“框架”区，其间散布着三个高变的“互补决定区”。
术语“互补决定区”或“CDR”是指每条链中中断由轻链可变区和重链可变区建立的四个框架区的三个高变区。CDR主要负责抗体与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始按顺序编号，并且通常还通过特定CDR所在的链来识别。因此，VH CDR3或CDR-H3位于其所在抗体的重链可变区，而VL CDR1或CDR-L1是来自其所在抗体的轻链可变区的CDR1。
不同轻链或重链的“框架区”或“FR”在物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在人和小鼠序列的“VBASE2”种系可变基因序列数据库中找到。
CDR和框架区的氨基酸序列可以使用本领域各种众所周知的定义来确定，例如，Kabat、Chothia、国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)、AbM和观察到的抗原接触(“Contact”)。在一些实施方案中，CDR根据Contact定义来确定。参见，MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745,1996。在一些实施方案中，CDR通过Kabat、Chothia和/或ContactCDR定义的组合来确定。
术语“Fd部分”是指免疫球蛋白重链的N端部分。通常，Fd部分包括重链可变(VH)区和重链恒定(CH1)区。
术语“Fab”是指由轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区和重链CH1恒定区组成的抗原结合片段。
术语“单链可变片段”或“scFv”是指由经由肽接头连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成的抗原结合片段。scFv缺乏恒定区。
术语“Fv片段”是指由重链可变区和轻链可变区组成的抗原结合片段，所述重链可变区和轻链可变区一起形成抗原的结合位点。
术语“表位”是指分子(例如，抗体的CDR)特异性结合的抗原区域或区，并且可以包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如5个或6个或更多个，例如20个或更多个氨基酸，或那些氨基酸的部分。在一些情况下，表位包括非蛋白质组分，例如来自碳水化合物、核酸或脂质。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，当靶标是蛋白质时，表位可以由连续氨基酸(例如，线性表位)或来自通过蛋白质折叠而接近的蛋白质不同部分的氨基酸(例如，不连续或构象表位)构成。
如本文所用，如关于抗体使用的短语“识别表位”意指抗体CDR与抗原在所述表位或含有所述表位的抗原的部分处相互作用或与其特异性结合。
“人源化抗体”是衍生自非人来源(例如，鼠科动物)的嵌合免疫球蛋白，其含有衍生自CDR之外的非人免疫球蛋白的最少序列。通常，人源化抗体将包含至少一个(例如，两个)可变结构域，其中CDR区基本对应于非人免疫球蛋白的那些并且框架区基本对应于人免疫球蛋白序列的那些。在一些情况下，人免疫球蛋白的某些框架区残基可以用来自非人物种的相应残基替换以例如提高特异性、亲和力和/或血清半衰期。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白序列的至少一部分。抗体人源化的方法是本领域已知的。
“人抗体”或“完全人抗体”是具有人重链和轻链序列的抗体，通常衍生自人种系基因。在一些实施方案中，抗体由人细胞、由利用人抗体库的非人动物(例如，进行遗传工程化以表达人抗体序列的转基因小鼠)或由噬菌体展示平台产生。
术语“特异性结合”是指分子(例如，Fab、scFv或修饰的Fc多肽(或其靶标结合部分))结合表位或靶标，其中与其与另一表位或非靶标化合物(例如，结构上不同的抗原)的结合相比，其与样品中的所述表位或靶标的结合具有更大的亲和力、更大的亲合力和/或更长的持续时间。在一些实施方案中，特异性结合表位或靶标的Fab、scFv或修饰的Fc多肽(或其靶标结合部分)是这样的Fab、scFv或修饰的Fc多肽(或其靶标结合部分)，其以比其他表位或非靶标化合物大至少5倍的亲和力结合表位或靶标，例如至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或更大的亲和力。如本文所用的术语“特异性结合特定表位或靶标”、“特异性结合至特定表位或靶标”或“对特定表位或靶标特异”可以例如通过具有以下分子与表位或靶标结合的平衡解离常数KD的分子来展现：例如10-4M或更小，例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。本领域技术人员将认识到，特异性结合来自一个物种的靶标的Fab或scFv也可以特异性结合所述靶标的直系同源物(ortholog)。
术语“结合亲和力”在本文中用于指代两个分子之间的非共价相互作用的强度，例如Fab或scFv与抗原之间，或修饰的Fc多肽(或其靶标结合部分)与靶标之间的非共价相互作用的强度。因此，例如，所述术语可以指代Fab或scFv与抗原之间或者修饰的Fc多肽(或其靶标结合部分)与靶标之间的1:1相互作用，除非另有说明或从上下文中清楚看出。结合亲和力可通过测量平衡解离常数(KD)进行量化，所述平衡解离常数是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1M-1)。KD可通过测量复合物形成和解离的动力学来确定，例如使用表面等离子体共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排除测定诸如以及BioLayer干涉法(例如，使用/>Octet平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括正式(formal)结合亲和力，诸如反映Fab或scFv与抗原之间或者修饰的Fc多肽(或其靶标结合部分)与靶标之间的1:1相互作用的那些，还包括可反映亲合结合的、计算KD的表观亲和力。
如本文所用的“转铁蛋白受体”或“TfR”是指转铁蛋白受体蛋白1。人转铁蛋白受体1多肽序列如SEQ ID NO:150所阐示。来自其他物种的转铁蛋白受体蛋白1序列也是已知的(例如，黑猩猩，登录号XP_003310238.1；恒河猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；和鸡，NP_990587.1)。术语“转铁蛋白受体”还涵盖示例性参考序列(例如人序列)的等位基因变体，其由转铁蛋白受体蛋白1染色体基因座处的基因编码。全长转铁蛋白受体蛋白包括短的N端细胞内区域、跨膜区和大的细胞外结构域。细胞外结构域的特征在于三个结构域：蛋白酶样结构域、螺旋结构域和顶端结构域。
如本文所用，术语“Fc多肽”是指天然存在的免疫球蛋白重链多肽的C端区域，其特征在于呈结构结构域(structural domain)形式的Ig折叠。Fc多肽含有至少包括CH2结构域和/或CH3结构域的恒定区序列，并且可含有至少部分铰链区，但不含有可变区。
“修饰的Fc多肽”是指与野生型免疫球蛋白重链Fc多肽序列相比具有至少一个突变，例如取代、缺失或插入，但保留天然Fc多肽的总体Ig折叠或结构的Fc多肽。
如本文所用，“FcRn”是指新生儿Fc受体。Fc多肽与FcRn的结合降低了Fc多肽的清除率并且增加了血清半衰期。人FcRn蛋白是异二聚体，由大小约50kDa的蛋白质(与主要组织相容性(MHC)I类蛋白相似)和大小约15kDa的β2-微球蛋白构成。
如本文所用，“FcRn结合位点”是指Fc多肽的与FcRn结合的区域。在人IgG中，如使用EU索引所编号，FcRn结合位点包括L251、M252、I253、S254、R255、T256、M428、H433、N434、H435和Y436。这些位置对应于SEQ ID NO:130的位置21至26、198和203至206。
如本文所用，“天然FcRn结合位点”是指Fc多肽的与FcRn结合的区域，并且所述区域具有与天然存在的Fc多肽的与FcRn结合的区域相同的氨基酸序列。
如本文所用，术语“CH3结构域”和“CH2结构域”是指免疫球蛋白恒定区结构域多肽。出于本申请的目的，CH3结构域多肽是指根据EU编号方案所编号的从约位置341至约位置447的氨基酸区段，并且CH2结构域多肽是指根据EU编号方案所编号的从约位置231至约位置340的氨基酸区段，并且不包括铰链区序列。CH2和CH3结构域多肽还可根据IMGT科学图表编号(IMGT网站)通过IMGT(ImMuno GeneTics)编号方案来编号，其中CH2结构域编号为1-110并且CH3结构域编号为1-107。CH2和CH3结构域是免疫球蛋白Fc区的一部分。Fc区是指根据EU编号方案所编号的从约位置231至约位置447的氨基酸区段，但是如本文所用，可以包括抗体铰链区的至少一部分。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQID NO:127)。
如关于CH3或CH2结构域所用的术语“野生型”、“天然”和“天然存在的”是指具有天然存在的序列的结构域。
如本文所用，术语“突变体”，如关于突变体多肽或突变体多核苷酸所使用，可与“变体”互换使用。相对于给定野生型CH3或CH2结构域参考序列的变体可包括天然存在的等位基因变体。“非天然”存在的CH3或CH2结构域是指天然细胞中不存在的变体或突变体结构域，并且是通过对天然CH3结构域或CH2结构域多核苷酸或多肽进行遗传修饰(例如使用遗传工程技术或诱变技术)产生的。“变体”包括相对于野生型包含至少一个氨基酸突变的任何结构域。突变可包括取代、插入和缺失。
如关于核酸或蛋白质所用，术语“分离的”表示核酸或蛋白质基本上不含在自然状态下与其相关的其他细胞组分。它优选处于均匀状态。纯度和均匀性通常使用分析化学技术诸如电泳(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳)或色谱法(例如，高效液相色谱法)来测定。在一些实施方案中，分离的核酸或蛋白质是至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯或至少99％纯的。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后期修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即结合氢、羧基、氨基和R基团的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有这样的结构的化学化合物，所述结构不同于氨基酸的一般化学结构，但其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，以指代单链中氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可完全包含L-氨基酸、完全包含D-氨基酸、或L和D氨基酸的混合物。
如本文所用的术语“蛋白质”是指多肽或单链多肽的二聚体(即，两个)或多聚体(即，三个或更多个)。蛋白质的单链多肽可以通过共价键例如二硫键或非共价相互作用接合。
如本文所用，术语“接头”是指连接(例如，共价连接)两个肽或多肽(例如，Fc多肽与scFv之间)以连接或融合肽或多肽的部分。在一些实施方案中，接头包含化学键联。在一些实施方案中，接头包含具有一个或多个氨基酸残基长度的肽。用于连接或融合肽或多肽的合适的接头可以基于接头的性质来选择，所述性质诸如接头的长度、疏水性、柔性、刚性或可裂解性。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地指代任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。
术语“保守取代”和“保守突变”是指导致一个氨基酸被可归类为具有相似特征的另一氨基酸取代的改变。以这种方式定义的保守氨基酸基团类别的实例可包括：“带电荷/极性基团”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳族基团”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)和(组氨酸或H)；以及“脂族基团”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每个组内，还可以识别子组。例如，带电或极性氨基酸组可再分为子组，包括：包含Lys、Arg和His的“带正电荷子组”；包含Glu和Asp的“带负电荷子组”；以及包含Asn和Gln的“极性子组”。在另一实例中，芳族或环状基团可再分为子组，包括：包含Pro、His和Trp的“氮环子组”；以及包含Phe和Tyr的“苯基子组”。在又另一实例中，脂族基团可以再分为子组，例如包含Val、Leu、Gly和Ala的“脂族非极性子组”；以及包含Met、Ser、Thr和Cys的“脂族微极性子组”。保守突变类别的实例包括上述子组内的氨基酸的氨基酸取代，诸如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，使得可以维持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，使得可以维持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，使得可以维持游离-OH；以及Gln取代Asn或反之亦然，使得可以维持游离-NH2。在一些实施方案中，疏水性氨基酸取代天然存在的疏水性氨基酸，例如在活性位点中，以保持疏水性。
在两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“同一性”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列在比较窗口或指定区域上为了最大对应性进行比较和比对时在特定区域上是相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大)，如使用序列比较算法或通过手工比对和目测所测量的。
对于多肽的序列比较，通常一个氨基酸序列充当参考序列，与候选序列进行比较。可以使用本领域技术人员可用的各种方法来进行比对，例如目视比对或使用公开可用的软件使用已知算法来实现最大比对。此类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于比对以实现最大比对的参数可由本领域技术人员确定。为了本申请目的的多肽序列的序列比较，使用BLASTP算法标准蛋白质BLAST，用于使用默认参数比对两个蛋白质序列。
当在多肽序列中的给定氨基酸残基的鉴定的上下文中使用时，术语“对应于”、“参考……确定”或“参考……编号”是指在将给定氨基酸序列与参考序列进行最大程度的比对和比较时指定参考序列的残基的位置。因此，例如，当在与SEQ ID NO:130最佳比对时残基与SEQ ID NO:130中的氨基酸对齐时，修饰的Fc多肽中的氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO:130中的氨基酸。与参考序列比对的多肽不需要与参考序列具有相同的长度。
如本文可互换使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)、兔、牛、猪、马和其他哺乳动物物种。在一个实施方案中，患者是人。
在本文中使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等一般意指获得期望的药理作用和/或生理作用。“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可指代成功治疗或改善神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)或本文所述的另一神经退行性疾病)的任何指标，包括任何客观或主观参数，诸如消减、缓解、患者生存的改善、生存时间或生存率的增加、症状的减轻或使患者更耐受所述疾病、退化或衰退速率的减缓，或患者身心健康的改善。症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数。可以将治疗的效果与未接受治疗的一个个体或一组个体进行比较，或与治疗之前或治疗期间不同时间的同一患者进行比较。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指在生物学或药理学上相容以用于人或动物的非活性药物成分，诸如但不限于缓冲剂、载剂或防腐剂。
如本文所用，剂的“治疗量”或“治疗有效量”是治疗受试者疾病的剂(例如，本文所述的任何蛋白质)的量。
术语“施用”是指将剂、化合物或组合物递送至期望的生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、皮内递送、肌内递送、鞘内递送、结肠递送、直肠递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，静脉内施用如本文所述的蛋白质。
III.抗HER2双特异性蛋白
在一方面，提供了具有特异性结合人HER2的亚结构域II和人HER2的亚结构域IV两者的能力的双特异性蛋白。在一些实施方案中，双特异性蛋白的Fc多肽之一或两者是修饰的Fc多肽(例如，修饰以促进TfR结合和/或增强Fc多肽的异二聚化)。
Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含与Fab的一部分和scFv融合的Fc多肽。此种双特异性蛋白的示意图如图1A和图1B所示。在一些实施方案中，所述双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与单链可变片段(scFv)融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)与(a)中所述的Fd部分配对形成Fab的轻链多肽，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。在一些实施方案中，蛋白质中的Fab结合人HER2的亚结构域II并且scFv结合人HER2的亚结构域IV。在其他实施方案中，蛋白质中的Fab结合人HER2的亚结构域IV并且scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
Fab由与第一Fc多肽的N端融合的Fab的Fd部分与轻链配对形成。在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域II的Fab包含与SEQ ID NO:108的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域IV的Fab包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。
在一些实施方案中，双特异性蛋白的第二Fc多肽在N端处与scFv片段融合。在一些实施方案中，第二Fc多肽在N端处经由第一接头与scFv片段融合。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1至约50个氨基酸，例如，约1至约40、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约5至约40、约5至约30、约5至约25或约5至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45或50个氨基酸。本文进一步详细描述了各种接头。在一些实施方案中，第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，双特异性蛋白中的scFv包含经由第二接头连接的VH区和VL区。在一些实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VL区-VH区-(C端)，其中scFv的C端经由第一接头与Fc多肽的N端接合。在其他实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VH区-VL区-(C端)，其中scFv的C端经由第一接头与Fc多肽的N端接合。
在一些实施方案中，scFv的VL区和VH区经由第二接头连接。在一些实施方案中，第二接头的长度为约10至约25个氨基酸，例如，约10至约20、约12至约25、约12至约20、约14至约25或约14至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头包含柔性接头。本文进一步详细描述了各种接头。在一些实施方案中，第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGG SGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GG GGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，scFv的VL区和VH区均含有Cys取代。在一些实施方案中，VL区和VH区中的Cys取代可以形成二硫键并且有助于稳定scFv的结构。在一些实施方案中，根据Kabat可变结构域编号，scFv在位置VH44和VL100中的每一者处包含半胱氨酸。在一些实施方案中，scFv在位置VH44与VL100处的半胱氨酸之间包含二硫键。
例如，抗HER2DII VL区可在SEQ ID NO:110的位置100处具有Gln至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DII VL区可具有SEQ ID NO:114的序列。在一些实施方案中，抗HER2DIV VL区可在SEQ ID NO:111的位置100处具有Gln至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DIV VL区可具有SEQ ID NO:115的序列。
例如，抗HER2DII VH区可在SEQ ID NO:108的位置44处具有Gly至Cys取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DII VH区可具有SEQ ID NO:112的序列。在一些实施方案中，抗HER2DIV VH区可在SEQ ID NO:109的位置44处具有Gly至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DIV VH区可具有SEQ ID NO:113的序列。
在一些实施方案中，在具有结构“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”的双特异性蛋白的部分(a)中，第一Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。在一些实施方案中，在具有结构“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”的双特异性蛋白的部分(b)中，第二Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与scFv融合。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:127)。部分铰链区是指SEQ ID NO:127的序列的一部分，例如具有DKTHTCPPCP序列(SEQ ID NO:128)的部分铰链区。
在另外的实施方案中，在具有结构“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”的双特异性蛋白的部分(b)中，铰链区(例如，SEQ ID NO:127)或部分铰链区(例如，SEQ ID NO:128)第二Fc多肽的N端处融合。在某些实施方案中，当铰链区在第二Fc多肽的N端处融合时，相对于SEQ IDNO:127的序列，铰链区可在位置5处含有Cys至Ser的突变。例如，具有Cys至Ser突变的铰链区可具有EPKSSDKTHTCPPCP序列(SEQ ID NO:129)。
在具有结构“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”的双特异性蛋白中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可特异性结合转铁蛋白受体(例如，TfR结合Fc多肽)。本文进一步详细描述了不同的Fc多肽及其修饰。在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽可各自包含促进异二聚化的修饰。例如，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366W取代并且第二Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代。在另一实例中，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽可包含T366W取代。此外，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰，即，降低TfR结合后的效应子功能。例如，根据EU编号，降低TfR介导的效应子功能的修饰是(i)L234A和L235A取代或者(ii)L234A和L235A取代以及P329G或P329S取代。
在具有结构“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”的双特异性蛋白的特定实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)是包含T366W取代、L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)以及任选的S239D和/或I332E取代的TfR结合Fc多肽，并且根据EU编号，第二Fc多肽(或第一Fc多肽)包含T366S、L368A和Y407V取代以及任选的S239D和/或I332E取代。例如，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:137和186-196中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二Fc多肽(或第一Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:133和183-185中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)，并且第二Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第一Fc多肽中))。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第二Fc多肽中))并且第二Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)。
示例性双特异性“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”蛋白
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与单链可变片段(scFv)融合的第二Fc多肽，所述单链可变片段结合人HER2的亚结构域IV，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)与(a)中所述的Fd部分配对形成Fab的轻链多肽。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:159的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:174的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:174的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQID NO:167的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:176的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQID NO:165的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:176的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:21或22的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:23的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQID NO:5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:24的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。注意，在这两个实例中，scFv部分含有具有Gln至Cys取代的抗HER2DIV VL区(SEQ ID NO:115)和具有Gly至Cys取代的抗HER2DIV VH区(SEQ ID NO:113)。同样在两种构建体中，(b)中的铰链区在位置5处具有Cys至Ser的突变(EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:129))。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与单链可变片段(scFv)融合的第二Fc多肽，所述单链可变片段结合人HER2的亚结构域II，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)与(a)中所述的Fd部分配对形成Fab的轻链多肽。
在一个实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:15、16或17的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:14的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:11或12的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含在位置234和235处的Leu。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在位置234和235处包含Leu。在某些实施方案中，蛋白质包括下述顺式LALA构型。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽之一或两者可去除其C端赖氨酸(例如，根据EU编号，在Fc多肽的位置447处的Lys残基)。在一些实施方案中，去除Fc多肽中的C端赖氨酸可以改善双特异性蛋白的稳定性。
mAb/N端或C端scFv在HC上
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含在每个N端处与Fab融合的Fc多肽，所述Fab特异性结合人HER2的亚结构域II或IV，并且一个或两个Fc多肽在C端处与scFv融合，所述scFv特异性结合人HER2的亚结构域II或IV。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含在每个N端处与Fab融合的Fc多肽，所述Fab特异性结合人HER2的亚结构域II或IV，并且一个或两个Fab在N端处与scFv融合，所述scFv特异性结合人HER2的亚结构域II或IV。此种双特异性蛋白的示意图如图2A-图2D所示。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽和/或第二Fc多肽在C端处与scFv融合，或者
其中(a)和/或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合，或者
其中第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合并且(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合，并且
其中Fab结合人HER2的亚结构域II并且scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中Fab结合人HER2的亚结构域IV并且scFv结合人HER2的亚结构域II。在一些实施方案中，Fab结合人HER2的亚结构域II并且scFv结合人HER2的亚结构域IV。在其他实施方案中，Fab结合人HER2的亚结构域IV并且scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域II的Fab包含与SEQ ID NO:108的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域IV的Fab包含与SEQ IDNO:109的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。
在某些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽在C端处与scFv融合。在特定实施方案中，第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合。在特定实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽中的每一者在C端处与scFv融合。在某些实施方案中，(a)和/或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合。在特定实施方案中，(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合。在特定实施方案中，(a)或(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与scFv融合。在另外的实施方案中，第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合，并且(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合。
在一些实施方案中，当第一Fc多肽和第二Fc多肽各自在C端处与scFv融合时，两个scFv可包含相同的序列。在一些实施方案中，当(a)中的Fd部分和(b)中的Fd部分各自在N端处与scFv融合时，两个scFv可包含相同的序列。在一些实施方案中，当第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合并且(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合时，两个scFv可包含相同的序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽在C端处经由第一接头与scFv融合。在其他实施方案中，(a)中的Fd部分和/或(b)中的Fd部分在N端处经由第一接头与scFv融合。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1至约50个氨基酸，例如，约1至约40、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约5至约40、约5至约30、约5至约25或约5至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45或50个氨基酸。本文进一步详细描述了各种接头。在某些实施方案中，第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGG SGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGS GGGGSGGGGS(SEQID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ IDNO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGG GS(SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，双特异性蛋白中的scFv包含经由第二接头连接的VH区和VL区。在一些实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VL区-VH区-(C端)，其中scFv的C端经由第一接头与(a)或(b)中的Fd部分的N端接合。在其他实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VH区-VL区-(C端)，其中scFv的C端经由第一接头与(a)或(b)中的Fd部分的N端接合。在一些实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VL区-VH区-(C端)，其中scFv的N端经由第一接头与第一Fc多肽或第二Fc多肽的C端接合。在其他实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VH区-VL区-(C端)，其中scFv的N端经由第一接头与第一Fc多肽或第二Fc多肽的C端接合。
在一些实施方案中，连接scFv中的VL区和VH区的第二接头的长度为约10至约25个氨基酸，例如，约10至约20、约12至约25、约12至约20、约14至约25或约14至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头包含柔性接头。本文进一步详细描述了各种接头。在一些实施方案中，第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQID NO:123)。
在一些实施方案中，scFv的VL区和VH区均含有Cys取代。在一些实施方案中，VL区和VH区中的Cys取代可以形成二硫键并且有助于稳定scFv的结构。在一些实施方案中，根据Kabat可变结构域编号，scFv在位置VH44和VL100中的每一者处包含半胱氨酸。在一些实施方案中，scFv在位置VH44与VL100处的半胱氨酸之间包含二硫键。
例如，抗HER2DII VL区可在SEQ ID NO:110的位置100处具有Gln至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DII VL区可具有SEQ ID NO:114的序列。在一些实施方案中，抗HER2DIV VL区可在SEQ ID NO:111的位置100处具有Gln至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DIV VL区可具有SEQ ID NO:115的序列。
例如，抗HER2DII VH区可在SEQ ID NO:108的位置44处具有Gly至Cys取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DII VH区可具有SEQ ID NO:112的序列。在一些实施方案中，抗HER2DIV VH区可在SEQ ID NO:109的位置44处具有Gly至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DIV VH区可具有SEQ ID NO:113的序列。
在一些实施方案中，在具有结构“mAb/N端或C端scFv在HC上”的双特异性蛋白的部分(a)中，第一Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。在一些实施方案中，在具有结构“mAb/N端或C端scFv在HC上”的双特异性蛋白的部分(b)中，第二Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:127)。部分铰链区是指SEQ ID NO:127的序列的一部分，例如具有DKTHTCPPCP序列(SEQ ID NO:128)的部分铰链区。
在具有结构“mAb/N端或C端scFv在HC上”的双特异性蛋白中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可特异性结合转铁蛋白受体(例如，TfR结合Fc多肽)。本文进一步详细描述了不同的Fc多肽及其修饰。在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽可各自包含促进异二聚化的修饰。例如，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366W取代并且第二Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代。在另一实例中，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽可包含T366W取代。此外，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰，即，降低TfR结合后的效应子功能。例如，根据EU编号，降低TfR介导的效应子功能的修饰是(i)L234A和L235A取代或者(ii)L234A和L235A取代以及P329G或P329S取代。
在具有结构“mAb/N端或C端scFv在HC上”的双特异性蛋白的特定实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)是包含T366W取代、L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)以及任选的S239D和/或I332E取代的TfR结合Fc多肽，并且根据EU编号，第二Fc多肽(或第一Fc多肽)包含T366S、L368A和Y407V取代以及任选的S239D和/或I332E取代。例如，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:137和186-196中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二Fc多肽(或第一Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:133和183-185中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)，并且第二Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第一Fc多肽中))。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第二Fc多肽中))并且第二Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)。
示例性双特异性“mAb/N端或C端scFv在HC上”蛋白
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:27或28的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ IDNO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:31或32的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ IDNO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:33或34的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:35的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:36的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:37、38或39的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ IDNO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽和第二Fc多肽中的每一者在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:27或28的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:31或32的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:30的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽和第二Fc多肽中的每一者在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:33或34的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:37、38或39的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:35的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:36的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:43或44的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:160的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ IDNO:161的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:162的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:178的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:178的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:180的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:180的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:182的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:182的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在双特异性蛋白的另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:45或46的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:47的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:48的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:49或50的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ IDNO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:43或44的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:42的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:49或50的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:47的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:48的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，并且(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:31或32的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:30的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:43或44的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:27或28的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中第一Fc多肽或第二Fc多肽在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且(a)或(b)中的Fd部分在N端处与scFv融合。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:37、38或39的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:47的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:36的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:48的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:35的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:49或50的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:33或34的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链多肽中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含在位置234和235处的Leu。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在位置234和235处包含Leu。在某些实施方案中，蛋白质包括下述顺式LALA构型。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽之一或两者可去除其C端赖氨酸(例如，根据EU编号，在Fc多肽的位置447处的Lys残基)。在一些实施方案中，去除Fc多肽中的C端赖氨酸可以改善双特异性蛋白的稳定性。
mAb/N端或C端scFv在LC上
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含在N端和/或C端与scFv融合的轻链，所述scFv特异性结合人HER2的亚结构域II或IV。此种双特异性蛋白的示意图如图3A-图3D所示。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中轻链多肽之一或两者在N端处与scFv融合，或者
其中轻链多肽之一或两者在C端处与scFv融合，或者
其中第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合，并且
其中Fab结合人HER2的亚结构域II并且scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中Fab结合人HER2的亚结构域IV并且scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域II的Fab包含与SEQ ID NO:108的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域IV的Fab包含与SEQ IDNO:109的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。
在某些实施方案中，轻链多肽之一或两者在N端处与scFv融合。在特定实施方案中，轻链多肽之一在N端处与scFv融合。在特定实施方案中，两条轻链多肽中的每一者在N端处与scFv融合。在某些实施方案中，轻链多肽之一或两者在C端处与scFv融合。在特定实施方案中，轻链多肽之一在C端处与scFv融合。在特定实施方案中，两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合。在另外的实施方案中，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合。
在一些实施方案中，当两条轻链多肽各自在C端处与scFv融合时，两个scFv可包含相同的序列。在一些实施方案中，当两条轻链多肽各自在N端处与scFv融合时，两个scFv可包含相同的序列。
在一些实施方案中，轻链多肽之一或两者经由第一接头与scFv融合。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1至约50个氨基酸，例如，约1至约40、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约5至约40、约5至约30、约5至约25或约5至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45或50个氨基酸。本文进一步详细描述了各种接头。在某些实施方案中，第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，双特异性蛋白中的scFv包含经由第二接头连接的VH区和VL区。在一些实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VL区-VH区-(C端)，其中scFv的C端经由第一接头与轻链多肽的N端接合。在其他实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VH区-VL区-(C端)，其中scFv的C端经由第一接头与轻链多肽的N端接合。在一些实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VL区-VH区-(C端)，其中scFv的N端经由第一接头与轻链多肽的C端接合。在其他实施方案中，scFv中的VL区和VH区的方向为(N端)-VH区-VL区-(C端)，其中scFv的N端经由第一接头与轻链多肽的C端接合。
在一些实施方案中，连接scFv中的VL区和VH区的第二接头的长度为约10至约25个氨基酸，例如，约10至约20、约12至约25、约12至约20、约14至约25或约14至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，第二接头包含柔性接头。本文进一步详细描述了各种接头。在一些实施方案中，第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQID NO:123)。
在一些实施方案中，scFv的VL区和VH区均含有Cys取代。在一些实施方案中，VL区和VH区中的Cys取代可以形成二硫键并且有助于稳定scFv的结构。在一些实施方案中，根据Kabat可变结构域编号，scFv在位置VH44和VL100中的每一者处包含半胱氨酸。在一些实施方案中，scFv在位置VH44与VL100处的半胱氨酸之间包含二硫键。
例如，抗HER2DII VL区可在SEQ ID NO:110的位置100处具有Gln至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DII VL区可具有SEQ ID NO:114的序列。在一些实施方案中，抗HER2DIV VL区可在SEQ ID NO:111的位置100处具有Gln至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DIV VL区可具有SEQ ID NO:115的序列。
例如，抗HER2DII VH区可在SEQ ID NO:108的位置44处具有Gly至Cys取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DII VH区可具有SEQ ID NO:112的序列。在一些实施方案中，抗HER2DIV VH区可在SEQ ID NO:109的位置44处具有Gly至Cys的取代。在特定实施方案中，含有Cys取代的抗HER2DIV VH区可具有SEQ ID NO:113的序列。
在一些实施方案中，在具有结构“mAb/N端或C端scFv在LC上”的双特异性蛋白的部分(a)中，第一Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。在一些实施方案中，在具有结构“mAb/N端或C端scFv在LC上”的双特异性蛋白的部分(b)中，第二Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:127)。部分铰链区是指SEQ ID NO:127的序列的一部分，例如具有DKTHTCPPCP序列(SEQ ID NO:128)的部分铰链区。
在具有结构“mAb/N端或C端scFv在LC上”的双特异性蛋白中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可特异性结合转铁蛋白受体(例如，TfR结合Fc多肽)。本文进一步详细描述了不同的Fc多肽及其修饰。在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽可各自包含促进异二聚化的修饰。例如，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366W取代并且第二Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代。在另一实例中，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽可包含T366W取代。此外，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰，即，降低TfR结合后的效应子功能。例如，根据EU编号，降低TfR介导的效应子功能的修饰是(i)L234A和L235A取代或者(ii)L234A和L235A取代以及P329G或P329S取代。
在具有结构“mAb/N端或C端scFv在HC上”的双特异性蛋白的特定实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)是包含T366W取代、L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)以及任选的S239D和/或I332E取代的TfR结合Fc多肽，并且根据EU编号，第二Fc多肽(或第一Fc多肽)包含T366S、L368A和Y407V取代以及任选的S239D和/或I332E取代。例如，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:137和186-196中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二Fc多肽(或第一Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:133和183-185中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)，并且第二Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第一Fc多肽中))。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第二Fc多肽中))并且第二Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)。
示例性双特异性“mAb/N端或C端scFv在LC上”蛋白
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中轻链多肽之一在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在C端处与scFv融合并且包含与SEQ IDNO:52的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中轻链多肽之一在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在C端处与scFv融合并且包含与SEQ IDNO:53或54的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:53或54的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQID NO:52的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
一些实施方案，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQID NO:53或54的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:53或54的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中轻链多肽之一在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ IDNO:55的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中轻链多肽之一在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:56或57的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:56或57的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:56或57的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且两条轻链多肽中的每一者在C端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:56或57的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中第一轻链多肽在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:4或5的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ IDNO:55的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合且包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合且包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中第一轻链多肽在N端处与scFv融合，所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:9或10的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ IDNO:56或57的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合且包含与SEQ ID NO:53或54的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQID NO:7的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，第一轻链多肽在N端处与scFv融合并且包含与SEQ ID NO:56或57的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二轻链多肽在C端处与scFv融合且包含与SEQ ID NO:53或54的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含在位置234和235处的Leu。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在位置234和235处包含Leu。在某些实施方案中，蛋白质包括下述顺式LALA构型。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽之一或两者可去除其C端赖氨酸(例如，根据EU编号，在Fc多肽的位置447处的Lys残基)。在一些实施方案中，去除Fc多肽中的C端赖氨酸可以改善双特异性蛋白的稳定性。
mAb/N端VH VL在HC和LC上
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含在两条重链中的每一者的N端处融合的VH区(或VL区)和在两条轻链中的每一者的N端处融合的VL区(或VH区)。此种双特异性蛋白的示意图如图4所示。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VH区或VL区融合，并且
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VH区或VL区中的另一者融合，并且
其中VH区和VL区一起形成Fv片段，并且
其中Fab结合人HER2的亚结构域II并且Fv片段结合人HER2的亚结构域IV，或者其中Fab结合人HER2的亚结构域IV并且Fv片段结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
在双特异性蛋白的一些实施方案中，(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VH区融合，并且两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VL区融合。在其他实施方案中，(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VL区融合，并且两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VH区融合。
在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域II的Fab包含与SEQ ID NO:108的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域IV的Fab包含与SEQ IDNO:109的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。
在一些实施方案中，第一接头将VH区或VL区连接至(a)和(b)中的Fd部分中的每一者的N端。在一些实施方案中，第二接头将VH区或VL区连接至两条轻链多肽中的每一者的N端。在一些实施方案中，第一接头或第二接头的长度为约1至约50个氨基酸，例如，约1至约40、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约5至约40、约5至约30、约5至约25或约5至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45或50个氨基酸。本文进一步详细描述了各种接头。在某些实施方案中，第一接头包含ASTKGPSVF序列(SEQ ID NO:125)。在某些实施方案中，第二接头包含RTVAAPSVFI序列(SEQ ID NO:126)。
在一些实施方案中，在具有结构“mAb/N端VH VL在HC和LC上”的双特异性蛋白的部分(a)中，第一Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。在一些实施方案中，在具有结构“mAb/N端VH VL在HC和LC上”的双特异性蛋白的部分(b)中，第二Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:127)。部分铰链区是指SEQ ID NO:127的序列的一部分，例如具有DKTHTCPPCP序列(SEQ ID NO:128)的部分铰链区。
在具有结构“mAb/N端VH VL在HC和LC上”的双特异性蛋白中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可特异性结合转铁蛋白受体(例如，TfR结合Fc多肽)。本文进一步详细描述了不同的Fc多肽及其修饰。在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽可各自包含促进异二聚化的修饰。例如，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366W取代并且第二Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代。在另一实例中，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽可包含T366W取代。此外，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰，即，降低TfR结合后的效应子功能。例如，根据EU编号，降低TfR介导的效应子功能的修饰是(i)L234A和L235A取代或者(ii)L234A和L235A取代以及P329G或P329S取代。
在具有结构“mAb/N端VH VL在HC和LC上”的双特异性蛋白的特定实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)是包含T366W取代、L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)以及任选的S239D和/或I332E取代的TfR结合Fc多肽，并且根据EU编号，第二Fc多肽(或第一Fc多肽)包含T366S、L368A和Y407V取代以及任选的S239D和/或I332E取代。例如，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:137和186-196中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二Fc多肽(或第一Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:133和183-185中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)，并且第二Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第一Fc多肽中))。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第二Fc多肽中))并且第二Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)。
示例性双特异性“mAb/N端VH VL在HC和LC上”蛋白
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VH区融合，所述Fv片段结合人HER2的亚结构域IV，并且
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VL区中的另一者融合，并且
其中VH区和VL区一起形成Fv片段。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:58的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:61或62的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VL区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:78的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:59的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:60的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VL区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:78的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VH区融合，所述Fv片段结合人HER2的亚结构域II，并且
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VL区中的另一者融合，并且
其中VH区和VL区一起形成Fv片段。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:63的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:66或67的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VL区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:79的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:64的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VH区融合和与SEQ ID NO:65的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VL区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:79的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域II；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VL区融合，所述Fv片段结合人HER2的亚结构域IV，并且
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VH区中的另一者融合，并且
其中VH区和VL区一起形成Fv片段。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:68的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:71或72的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VH区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:80的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:69的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:70的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VH区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:80的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中(a)和(b)中的Fd部分中的每一者在N端处与Fv片段的VL区融合，所述Fv片段结合人HER2的亚结构域II，并且
其中两条轻链多肽中的每一者在N端处与Fv片段的VH区中的另一者融合，并且
其中VH区和VL区一起形成Fv片段。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在一个实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:73的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:76或77的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VH区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:81的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，双特异性蛋白包含第一多肽，其包含(a)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:74的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；第二多肽，其包含(b)在N端处与Fv片段的VL区融合和与SEQ ID NO:75的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；以及第三多肽和第四多肽，其各自包含在N端处与Fv片段的VH区融合的轻链多肽，并且各自包含与SEQ ID NO:81的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含在位置234和235处的Leu。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在位置234和235处包含Leu。在某些实施方案中，蛋白质包括下述顺式LALA构型。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽之一或两者可去除其C端赖氨酸(例如，根据EU编号，在Fc多肽的位置447处的Lys残基)。在一些实施方案中，去除Fc多肽中的C端赖氨酸可以改善双特异性蛋白的稳定性。
mAb/C端VH VL在HC上
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含在两个Fc多肽之一的C端处融合的VH区(或VL区)和在两个Fc多肽中的另一者的C端处融合的VL区(或VH区)。此种双特异性蛋白的示意图如图5所示。在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)第一Fc多肽，其在N端处与Fab的Fd部分融合，并且在C端处与Fv片段的VH区或VL区融合；
(b)第二Fc多肽，其在N端处与Fab的Fd部分融合，并且在C端处与(a)中所述的VH区或VL区中的另一者融合,
其中VH区和VL区一起形成Fv片段，并且其中第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab；
其中Fab结合人HER2的亚结构域II并且Fv片段结合人HER2的亚结构域IV，或者其中Fab结合人HER2的亚结构域IV并且Fv片段结合人HER2的亚结构域II。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
在双特异性蛋白的一些实施方案中，第一Fc多肽与Fv片段的VH区融合并且第二Fc多肽与Fv片段的VL区融合。在一些实施方案中，第一Fc多肽与Fv片段的VL区融合并且第二Fc多肽与Fv片段的VH区融合。
在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域II的Fab包含与SEQ ID NO:108的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。在一些实施方案中，特异性结合人HER2的亚结构域IV的Fab包含与SEQ IDNO:109的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的VH区。
在一些实施方案中，第一接头将VH区或VL区连接至Fc多肽的C端。在一些实施方案中，第一接头或第二接头的长度为约1至约50个氨基酸，例如，约1至约40、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约2至约40、约2至约30、约2至约20、约2至约10、约5至约40、约5至约30、约5至约25或约5至约20个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45或50个氨基酸。本文进一步详细描述了各种接头。在一些实施方案中，第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ IDNO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，在具有结构“mAb/C端VH VL在HC上”的双特异性蛋白的部分(a)中，第一Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。在一些实施方案中，在具有结构“mAb/C端VH VL在HC上”的双特异性蛋白的部分(b)中，第二Fc多肽在N端处经由铰链区或部分铰链区与Fab的Fd部分融合。例示性铰链区序列是人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:127)。部分铰链区是指SEQ ID NO:127的序列的一部分，例如具有DKTHTCPPCP序列(SEQ ID NO:128)的部分铰链区。
在具有结构“mAb/C端VH VL在HC上”的双特异性蛋白中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可特异性结合转铁蛋白受体(例如，TfR结合Fc多肽)。本文进一步详细描述了不同的Fc多肽及其修饰。在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽可各自包含促进异二聚化的修饰。例如，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366W取代并且第二Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代。在另一实例中，根据EU编号，第一Fc多肽可包含T366S、L368A和Y407V取代并且第二Fc多肽可包含T366W取代。此外，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰，即，降低TfR结合后的效应子功能。例如，根据EU编号，降低TfR介导的效应子功能的修饰是(i)L234A和L235A取代或者(ii)L234A和L235A取代以及P329G或P329S取代。
在具有结构“mAb/N端VH VL在HC上”的双特异性蛋白的特定实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)是包含T366W取代、L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)以及任选的S239D和/或I332E取代的TfR结合Fc多肽，并且根据EU编号，第二Fc多肽(或第一Fc多肽)包含T366S、L368A和Y407V取代以及任选的S239D和/或I332E取代。例如，第一Fc多肽(或第二Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:137和186-196中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且第二Fc多肽(或第一Fc多肽)可包含与SEQ ID NOS:133和183-185中的任一者的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)，并且第二Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第一Fc多肽中))。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽不包括L234A或L325A取代(或者P329G或P329S取代(如果存在于第二Fc多肽中))并且第二Fc多肽是TfR结合Fc多肽且含有L234A和L235A取代(任选地包括P329G或P329S取代)。
示例性双特异性“mAb/C端VH VL在HC上”蛋白
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)第一Fc多肽，其在N端处与Fab的Fd部分融合，所述Fab结合人HER2的亚结构域II，并且在C端处与Fv片段的VH区融合，所述Fv片段结合人HER2的亚结构域IV；
(b)第二Fc多肽，其在N端处与Fab的Fd部分融合，并且在C端处与Fv片段的VL区融合。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:82或83的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:99、100或101的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:84的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:98的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ IDNO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:97的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:86、87或88的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ IDNO:95或96的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，双特异性蛋白包含：
(a)第一Fc多肽，其在N端处与Fab的Fd部分融合，所述Fab结合人HER2的亚结构域IV，并且在C端处与Fv片段的VH区融合，所述Fv片段结合人HER2的亚结构域II；
(b)第二Fc多肽，其在N端处与Fab的Fd部分融合，并且在C端处与Fv片段的VL区融合。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。在某些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在某些其他实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和/或I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D和/或I332E取代。在特定实施方案中，独立地包含S239D和/或I332E取代的第一Fc多肽和/或第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能，即增强HER2结合后的效应子功能。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且第二Fc多肽包含S239D取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽包含I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含S239D取代并且第二Fc多肽包含S239D和I332E取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含I332E取代。
在双特异性蛋白的一个实例中，(a)包含与SEQ ID NO:89或90的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:105、106或107的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:91的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:104的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ IDNO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:92的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQID NO:103的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在再另一实例中，(a)包含与SEQ ID NO:93或94的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，(b)包含与SEQ ID NO:102的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，并且(c)中两条轻链中的每一者包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽包含在位置234和235处的Leu。在一些实施方案中，根据EU编号，第二Fc多肽在位置234和235处包含Leu。在某些实施方案中，蛋白质包括下述顺式LALA构型。
在上述双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽之一或两者可去除其C端赖氨酸(例如，根据EU编号，在Fc多肽的位置447处的Lys残基)。在一些实施方案中，去除Fc多肽中的C端赖氨酸可以改善双特异性蛋白的稳定性。
IV.Fc多肽及其修饰
在一些方面，本文所述的任何抗HER2双特异性蛋白包含Fc多肽二聚体，其中二聚体中的一个或两个Fc多肽相对于野生型Fc多肽含有氨基酸修饰。在一些实施方案中，Fc多肽(例如，修饰的Fc多肽)中的氨基酸修饰可导致Fc多肽二聚体与BBB受体(例如，TfR)的结合、促进二聚体中两个Fc多肽的异二聚化、调节效应子功能、延长血清半衰期、影响糖基化和/或降低人体免疫原性。在一些实施方案中，存在于双特异性蛋白中的Fc多肽独立地具有与相应的野生型Fc多肽(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。修饰的Fc多肽(例如，TfR结合Fc多肽)的实例和描述可见于例如在国际专利公开号WO 2018/152326中，其通过引用整体并入本文。
用于BBB受体结合的Fc多肽修饰
本文提供了能够跨BBB转运的抗HER2双特异性蛋白。此种蛋白质包含结合BBB受体的修饰的Fc多肽。BBB受体在BBB内皮以及其他细胞和组织类型上表达。在一些实施方案中，BBB受体是TfR。结合TfR的修饰的Fc多肽也称为具有TfR结合位点。
在各种Fc修饰中指定的氨基酸残基，包括在结合BBB受体例如TfR的修饰的Fc多肽中引入的那些氨基酸残基，在本文中使用EU索引编号进行编号。任何Fc多肽，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽，可具有在如本文所述的一个或多个位置中的修饰，例如氨基酸取代。在一些实施方案中，针对BBB(例如，TfR)受体结合活性进行修饰的结构域是人Ig CH3结构域，诸如IgG1 CH3结构域。CH3结构域可以是任何IgG亚型，即来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗体的上下文中，CH3结构域是指如根据EU编号方案进行编号的从约位置341至约位置447的氨基酸区段。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的修饰的Fc多肽结合TfR的顶端结构域并且可结合TfR而不阻断或以其他方式抑制转铁蛋白与TfR的结合。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合基本上未被抑制。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合被抑制小于约50％(例如，小于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。
在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含一个或多个、至少一个、两个或三个取代；以及在一些实施方案中，根据EU编号方案，在包含266、267、268、269、270、271、295、297、298和299的氨基酸位置处的至少四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含至少一个、两个或三个取代；以及在一些实施方案中，根据EU编号方案，在包含274、276、283、285、286、287、288、289和290的氨基酸位置处的至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含至少一个、两个或三个取代；以及在一些实施方案中，根据EU编号方案，在包含268、269、270、271、272、292、293、294、296以及300的氨基酸位置处的至少四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含至少一个、两个或三个取代；以及在一些实施方案中，根据EU编号方案，在包含272、274、276、322、324、326、329、330和331的氨基酸位置处的至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含至少一个、两个或三个取代；以及在一些实施方案中，根据EU编号方案，在包含345、346、347、349、437、438、439和440的氨基酸位置处的至少四个、五个、六个或七个取代。
在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含至少一个、两个或三个取代；以及在一些实施方案中，根据EU编号方案，在氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416和421处的至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含至少一个相对于SEQ IDNO:130具有如下取代的位置：在位置384处的Leu、Tyr、Met或Val；在位置386处的Leu、Thr、His或Pro；在位置387处的Val、Pro或酸性氨基酸；在位置388处的芳族氨基酸，例如Trp或Gly(例如，Trp)；在位置389处的Val、Ser或Ala；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置416处的Thr或酸性氨基酸；或者在位置421处的Trp、Tyr、His或Phe。在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽可包含集合中一个或多个位置处的指定氨基酸的保守取代，例如相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如，芳族氨基酸)、或大小分组，和/或极性或非极性分组中的氨基酸。因此，例如，Ile可以存在于位置384、386和/或位置413处。在一些实施方案中，在位置387、413和416中的一个位置、两个位置或每一个位置处的酸性氨基酸是Glu。在其他实施方案中，在位置387、413和416中的一个、两个或每一个处的酸性氨基酸是Asp。在一些实施方案中，位置384、386、387、388、389、413、416和421中的两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个具有如本段中指定的氨基酸取代。
在一些实施方案中，在氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416和/或421中具有修饰的Fc多肽在位置390处包含天然Asn。在一些实施方案中，Fc多肽在位置390处包含Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala或Asp。在一些实施方案中，Fc多肽在包含380、391、392和415的位置处还包含一个、二个、三个或四个取代。在一些实施方案中，Trp、Tyr、Leu或Gln可存在于位置380处。在一些实施方案中，Ser、Thr、Gln或Phe可存在于位置391处。在一些实施方案中，Gln、Phe或His可存在于位置392处。在一些实施方案中，Glu可存在于位置415处。
在某些实施方案中，Fc多肽包含选自以下的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个位置：位置380处的Trp、Leu或Glu；位置384处的Tyr或Phe；位置386处的Thr；位置387处的Glu；位置388处的Trp；位置389处的Ser、Ala、Val或Asn；位置390处的Ser或Asn；位置413处的Thr或Ser；位置415处的Glu或Ser；位置416处的Glu；和/或位置421处的Phe。在一些实施方案中，Fc多肽包含如下所有十一个位置：位置380处的Trp、Leu或Glu；位置384处的Tyr或Phe；位置386处的Thr；位置387处的Glu；位置388处的Trp；位置389处的Ser、Ala、Val或Asn；位置390处的Ser或Asn；位置413处的Thr或Ser；位置415处的Glu或Ser；位置416处的Glu；和/或位置421处的Phe。
在某些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含位置384处的Leu或Met；位置386处的Leu、His或Pro；位置387处的Val；位置388处的Trp；位置389处的Val或Ala；位置413处的Pro；位置416处的Thr；和/或位置421处的Trp。在一些实施方案中，Fc多肽还包含在位置391处的Ser、Thr、Gln或Phe。在一些实施方案中，Fc多肽还包含在位置380处的Trp、Tyr、Leu或Gln和/或在位置392处的Gln、Phe或His。在一些实施方案中，Trp存在于位置380处且/或Gln存在于位置392处。在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽在位置380处不具有Trp。
在其他实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含位置384处的Tyr；位置386处的Thr；位置387处的Glu或Val；位置388处的Trp；位置389处的Ser；位置413处的Ser或Thr；位置416处的Glu；和/或位置421处的Phe。在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含在位置390处的天然Asn。在某些实施方案中，Fc多肽还包含在位置380处的Trp、Tyr、Leu或Gln；和/或在位置415处的Glu。在一些实施方案中，Fc多肽还包含在位置380处的Trp和/或在位置415处的Glu。
在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽包含以下取代中的一者或多者：位置380处的Trp；位置386处的Thr；位置388处的Trp；位置389处的Val；位置413处的Thr或Ser；位置415处的Glu；和/或位置421处的Phe。
在另外的实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽还包含选自以下的一个、二个或三个位置：位置414是Lys、Arg、Gly或Pro；位置424是Ser、Thr、Glu或Lys；以及位置426是Ser、Trp或Gly。
在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽具有SEQ ID NO:135的序列。在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽之一可为具有SEQ ID NO:135的序列的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽，而Fc多肽二聚体中的另一个Fc多肽可具有野生型Fc多肽的序列(例如，SEQ ID NO:130)。在本文所述的双特异性蛋白的其他实施方案中，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽可为具有SEQ ID NO:135的序列的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽。
在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽之一可为BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽，其包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:135的序列具有至少90％同一性的序列，而Fc多肽二聚体中的另一个Fc多肽可具有野生型Fc多肽的序列(例如，SEQ IDNO:130)。
在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ala、位置413处的Thr、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:140-144的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽之一可为BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽，其包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ala、位置413处的Thr、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:140的序列具有至少90％同一性的序列，而Fc多肽二聚体中的另一个Fc多肽可具有野生型Fc多肽的序列(例如，SEQ IDNO:130)。
在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽具有SEQ ID NO:140的序列。在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽之一可为具有SEQ ID NO:140的序列的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽，而Fc多肽二聚体中的另一个Fc多肽可具有野生型Fc多肽的序列(例如，SEQ ID NO:130)。在本文所述的双特异性蛋白的其他实施方案中，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽可为具有SEQ ID NO:140的序列的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽。
在一些实施方案中，BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽具有SEQ ID NO:145的序列。在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽之一可为具有SEQ ID NO:145的序列的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽，而Fc多肽二聚体中的另一个Fc多肽可具有野生型Fc多肽的序列(例如，SEQ ID NO:130)。在本文所述的双特异性蛋白的其他实施方案中，Fc多肽二聚体中的两个Fc多肽可为具有SEQ ID NO:145的序列的BBB(例如，TfR)受体结合Fc多肽。
用于异二聚化的Fc多肽修饰
在一些实施方案中，存在于本文所述的任何双特异性蛋白中的Fc多肽包括杵和臼突变以促进异二聚体形成并且阻碍同二聚体形成。通常，修饰在第一多肽的界面处引入突出部(“杵”)，并且在第二多肽的界面中引入对应的腔穴(“臼”)，使得突出部可定位在腔穴中，以便促进异二聚体形成，并因此阻碍同二聚体形成。通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建突出部。通过用较小氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突出部大小相同或相似的补偿腔穴。在一些实施方案中，此类另外的突变处于Fc多肽中对多肽与BBB受体(例如，TfR)的结合没有负面影响的位置上。
在用于二聚化的杵和臼方法的一个例示性实施方案中，双特异性蛋白中存在的Fc多肽中的一者的位置366(根据EU编号方案进行编号)包含代替了天然苏氨酸的色氨酸。二聚体中的另一个Fc多肽具有在位置407(根据EU编号方案进行编号)处代替了天然酪氨酸的缬氨酸。另一个Fc多肽还可包含这样的取代：其中位置366(根据EU编号方案进行编号)处的天然苏氨酸被丝氨酸取代，并且位置368(根据EU编号方案进行编号)处的天然亮氨酸被丙氨酸取代。因此，本文所述的双特异性蛋白的Fc多肽中的一者具有T366W杵突变，并且另一个Fc多肽具有Y407V突变，其通常伴有T366S和L368A臼突变。
在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的一个或两个Fc多肽还可工程化以含有用于异二聚化的其他修饰，例如，CH3-CH3界面内的天然带电的接触残基的静电工程化或疏水性补丁修饰(patch modification)。
例如，在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有Fc多肽二聚体，所述Fc多肽二聚体具有一个Fc多肽，其具有T366W杵突变并且与SEQ ID NO:131的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性；以及另一个Fc多肽，其具有T366S、L368A和Y407V臼突变并且与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性。在某些实施方案中，Fc多肽二聚体中的一个或两个Fc多肽可为TfR结合Fc多肽。在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有Fc多肽二聚体，其具有(i)具有SEQ ID NO:133的序列的第一Fc多肽，和(ii)具有SEQ ID NO:136的序列的第二Fc多肽。在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有Fc多肽二聚体，其具有(i)具有SEQ ID NO:133的序列的第一Fc多肽，和(ii)具有SEQ ID NO:141的序列的第二Fc多肽。在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有Fc多肽二聚体，其具有(i)与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的第一Fc多肽，和(ii)具有SEQ ID NO:146的序列的第二Fc多肽。
用于调节效应子功能的Fc多肽修饰
在一些实施方案中，本文所述的任何双特异性蛋白中存在的一个或两个Fc多肽可包含在TfR结合后降低TfR介导的效应子功能的修饰，即，在与介导效应子功能的在效应细胞上表达的Fc受体结合后降低诱导某些生物学功能的能力。抗体效应子功能的实例包括但不限于C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调以及B细胞活化。效应子功能可能因抗体类别而异。例如，天然人IgG1和IgG3抗体在与存在于免疫系统细胞上的适当Fc受体结合后可引发ADCC和CDC活性；并且天然人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4在与存在于免疫细胞上的适当Fc受体结合后可引发ADCP功能。
在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的一个或两个Fc多肽可包含减少或消除TfR介导的效应子功能的修饰。根据EU编号方案，降低TfR介导的效应子功能的例示性Fc多肽突变包括但不限于CH2结构域中的取代，例如在位置234和235处。例如，在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽可在位置234和235处包含丙氨酸残基。因此，一个或两个Fc多肽可具有L234A和L235A(本文中也称为“LALA”)取代。
调节效应子功能的另外的Fc多肽突变包括但不限于以下：位置329可具有其中脯氨酸被甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或精氨酸或氨基酸残基取代的突变，所述氨基酸残基足够大以破坏Fc/Fcγ受体界面，受体界面在Fc的脯氨酸329与FcγRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成。另外的例示性取代包括，根据EU编号方案，S228P、E233P、L235E、N297A、N297D和P331S。还可以存在多个取代，例如，根据EU编号方案，人IgG1 Fc区的L234A和L235A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和P329G；人IgG4 Fc区的S228P和L235E；人IgG1Fc区的L234A和G237A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和G237A；人IgG2 Fc区的V234A和G237A；人IgG4Fc区的L235A、G237A和E318A；以及人IgG4 Fc区的S228P和L236E。在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽可具有调节ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如，根据EU编号方案，在位置298、333和/或334处的取代。在一些实施方案中，根据EU编号方案，一个或两个Fc多肽可具有L234A、L235A和P329G或P329S取代。
在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白中存在的一个或两个Fc多肽可包含能够在HER2结合后增强HER2介导的效应子功能的修饰，即，在与介导效应子功能的在效应细胞上表达的Fc受体结合后增强诱导某些生物学功能的能力。抗体效应子功能的实例如上所述。能够增强HER2介导的效应子功能的例示性Fc多肽突变，根据EU编号方案，包括但不限于CH2结构域中的取代，例如在位置239和/或332处。例如，在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽可包含在位置239处的天冬氨酸和/或在位置332处的谷氨酸。因此，根据EU编号，一个或两个Fc多肽可具有S239D和/或I332E取代。
“顺式LALA”构型
在本文所述的任何双特异性蛋白的一些实施方案中，双特异性蛋白中两个Fc多肽中的两个Fc多肽中的仅一者(但不是两个Fc多肽)被修饰以在TfR结合后降低TfR介导的效应子功能。其他Fc多肽不含有TfR结合位点或任何降低效应子功能的修饰。两个Fc多肽中仅有一个含有TfR结合位点和当与TfR结合时降低FcγR结合的修饰(例如，LALA取代)两者，而另一个Fc多肽不含有TfR结合位点或降低FcγR结合的任何修饰的双特异性蛋白中的Fc多肽二聚体被称为具有顺式LALA构型。
例如，在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)具有SEQ ID NO:137的序列的第一Fc多肽，其具有TfR结合位点和LALA取代，以及杵修饰，和(ii)与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的第二Fc多肽，其仅具有臼修饰。在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)具有SEQ ID NO:142的序列的第一Fc多肽，其具有TfR结合位点和LALA取代，以及杵修饰，和(ii)与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的第二Fc多肽，其仅具有臼修饰。在一些实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)具有SEQ ID NO:147的序列的第一Fc多肽，其具有TfR结合位点和LALA取代，以及杵修饰，和(ii)与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的第二Fc多肽，其仅具有臼修饰。
在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)第一Fc多肽，根据EU编号，其包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％同一性的序列，以及(ii)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列。
在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)第一Fc多肽，根据EU编号，其包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列，以及(ii)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％同一性的序列。
在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)第一Fc多肽，根据EU编号，其包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ala、位置413处的Thr、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:142的序列具有至少90％同一性的序列，以及(ii)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列。
在特定实施方案中，本文所述的双特异性蛋白可含有具有顺式LALA构型的Fc多肽二聚体，其具有(i)第一Fc多肽，根据EU编号，其包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列，以及(ii)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ala、位置413处的Thr、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:142的序列具有至少90％同一性的序列。
用于延长血清半衰期的Fc多肽修饰
在一些实施方案中，可将增强血清半衰期的修饰引入本文所述的任何双特异性蛋白中。例如，在一些实施方案中，如根据EU编号方案进行编号，本文所述的双特异性蛋白中存在的一个或两个Fc多肽可包含位置252处的酪氨酸、位置254处的苏氨酸和位置256处的谷氨酸。因此，一个或两个Fc多肽可具有M252Y、S254T和T256E取代。或者，一个或两个Fc多肽可具有M428L和N434S取代，如根据EU编号方案进行编号。或者，一个或两个Fc多肽可具有N434S或N434A取代。
C端赖氨酸残基去除的Fc多肽
在本文所述的双特异性蛋白的一些实施方案中，Fc多肽之一或两者可去除其C端赖氨酸(例如，根据EU编号，在Fc多肽的位置447处的Lys残基)。C端赖氨酸残基在许多物种的免疫球蛋白中高度保守，并且可在蛋白质产生过程中由细胞机制完全或部分去除。在一些实施方案中，去除Fc多肽中的C端赖氨酸可以改善双特异性蛋白的稳定性。
V.接头
如本文所述，双特异性蛋白可含有一个或多个接头。接头是指双特异性蛋白中的两个元件之间(即，VH区与VL区之间、scFv与Fc多肽之间、scFv与Fd部分之间、scFv与轻链之间、VH区或VL区与Fd部分之间、VH区或VL区与轻链之间、或者VH区或VL区与Fc多肽之间)的键联。在一些实施方案中，接头可以是肽接头，其可连接双特异性蛋白中的两个元件以提供空间和/或柔性。
在一些实施方案中，接头可包含1-100个氨基酸(例如，1-90、1-80、1-70、1-90、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-8、1-6、1-4、5-100、10-100、15-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20或10-15个氨基酸)。在一些实施方案中，两个Fc结构域单体之间的接头是含有1-30个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸)的氨基酸间隔区。接头可含有天然氨基酸、非天然氨基酸或其组合。在一些实施方案中，接头可为柔性接头，例如含有氨基酸诸如Gly、Asn、Ser、Thr、Ala等。此类接头是使用已知参数设计的，并且可以具有任何长度且含有任何数量的任何长度的重复单元(例如，Gly和Ser残基的重复单元)。例如，接头可具有重复，诸如两个、三个、四个、五个或更多个GGGGS(SEQ ID NO:117)、GGSG(SEQ ID NO:151)、GS GG(SEQ ID NO:152)或SGGG(SEQ ID NO:153)重复或者单个GG GGS(SEQ ID NO:117)、GGSG(SEQ ID NO:151)、GSGG(SEQ ID NO:152)或SGGG(SEQ ID NO:153)。含有Gly和Ser残基的柔性接头的实例包括但不限于GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQID NO:117；G4S)、GGGGSGG GGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SE Q ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，接头还可含有除甘氨酸和丝氨酸之外的氨基酸，例如GGGGSEPKSS(SEQ ID NO:124)、ASTKGPSVF(SEQ ID NO:125)或RTVAAPSVFI(SEQ ID NO:126)。本领域中也描述了其他接头的实例，参见，例如，Chen等人Adv.Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369,2013。
VI.双特异性蛋白的制备
为了制备本文所述的双特异性蛋白，可以使用本领域已知的许多技术。在一些实施方案中，编码感兴趣抗体的重链和轻链的基因可以从细胞，例如从杂交瘤克隆。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制备。或者，噬菌体或酵母展示技术可用于鉴定与选定抗原特异性结合的抗体和Fab片段。
双特异性蛋白可使用任何数量的表达系统产生，包括原核和真核表达系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达系统，诸如杂交瘤或CHO细胞表达系统。许多此类系统可从商业供应商广泛获得。在一些实施方案中，编码包含双特异性蛋白的多肽的多核苷酸可使用单一载体表达，例如在双顺反子表达单元中或在不同启动子的控制下。在其他实施方案中，编码包含双特异性蛋白的多肽的多核苷酸可使用单独的载体表达。
在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含编码任何包含如本文所述的双特异性蛋白的多肽的核酸序列；包含此类核酸的载体；以及引入核酸的宿主细胞，其用于复制核酸以及/或者表达双特异性蛋白。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含如本文所公开的双特异性蛋白(例如，如上文第III节中所述)。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码下文非正式序列表中公开的一个或多个氨基酸序列(例如，重链、轻链和/或Fc多肽序列)的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码与下文非正式序列表中公开的序列具有至少85％序列同一性(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸可操作地连接至异源核酸，例如异源启动子。
含有编码本公开的抗体或其片段的多核苷酸的合适载体包括克隆载体和表达载体。虽然所选克隆载体可根据打算使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有针对特定限制性内切核酸酶的单一靶标，且/或可携带可用于选择含有载体的克隆的标志物的基因。实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可从商业供应商诸如BioRad、Strategene和Invitrogen获得。
表达载体一般是含有本公开的核酸的可复制多核苷酸构建体。表达载体可在宿主细胞中作为游离体或作为染色体DNA的整体部分复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)和任何其他载体。
适用于克隆或表达如本文所述的多核苷酸或载体的宿主细胞包括原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞，例如人胚肾(HEK)细胞。
在另一方面，提供了制备如本文所述的双特异性蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在适合表达双特异性蛋白的条件下培养如本文所述的宿主细胞(例如，表达如本文所述的多核苷酸或载体的宿主细胞)。在一些实施方案中，随后从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收双特异性蛋白。在一些实施方案中，对双特异性蛋白进行纯化，例如通过色谱法。
VII.治疗方法
在一些方面，本文提供了用于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的任何双特异性蛋白或含有其的药物组合物来治疗受试者的癌症(例如，HER2阳性癌症)或治疗受试者的癌症(例如，HER2阳性癌症)的脑转移的方法。本文还提供了跨内皮对能够结合HER2(例如，人HER2)或其抗原结合片段的抗体可变区进行转胞吞作用的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使内皮与包含本文所述的双特异性蛋白的组合物接触。在一些实施方案中，内皮是血脑屏障(BBB)。
可根据本文提供的方法治疗的HER2阳性癌症的非限制性实例包括HER2阳性乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，以及HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管接合部腺癌。在一些实施方案中，HER2阳性癌症是HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，HER2阳性癌症是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管接合部腺癌。在一些实施方案中，HER2阳性癌症是转移性癌症。
在又其他方面，本文提供了用于治疗癌症(例如，HER2阳性癌症)转移的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗HER2双特异性蛋白。在一些实施方案中，转移是上述HER2阳性癌症的脑转移。在一些实施方案中，转移是HER2阳性乳腺癌的脑转移。在一些实施方案中，转移是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管接合部腺癌的脑转移。
在一些实施方案中，治疗益处可包括肿瘤生长的减少或减缓、肿瘤大小(例如，体积)的减少、肿瘤细胞活力的降低、转移性病灶数量的减少、癌症(例如，HER2阳性癌症)的一种或多种体征或症状的改善，和/或患者存活率的增加。在一些实施方案中，肿瘤细胞存活、肿瘤生长、肿瘤大小和/或转移性病灶数量减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，抗HER2双特异性蛋白拮抗HER2活性。在一些实施方案中，HER2活性被抑制(例如，抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)。
本文所述的抗HER2双特异性蛋白的施用途径可以是经口、腹膜内、透皮、皮下、静脉内、肌内、鞘内、吸入、局部、病灶内、直肠、支气管内、鼻腔、透粘膜、肠、眼或耳部递送，或本领域已知的任何其他方法。在一些实施方案中，抗HER2双特异性蛋白经口、静脉内或腹膜内施用。
VIII.药物组合物和试剂盒
在其他方面，提供了包含根据本公开的抗HER2双特异性蛋白的药物组合物和试剂盒。
药物组合物
制备用于本公开的制剂的指南可在本领域技术人员已知的任何数量的药物制备和制剂手册中找到。
在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的抗HER2双特异性蛋白，并且还包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。药学上可接受的载剂包括生理上相容且不干扰或以其他方式抑制活性剂的活性的任何溶剂、分散介质或包衣。
在一些实施方案中，可配制双特异性蛋白用于通过注射进行肠胃外施用。通常，用于体内施用的药物组合物是无菌的，例如加热灭菌、蒸汽灭菌、无菌过滤或照射。
本文所述的药物组合物的剂量和所需药物浓度可根据设想的特定用途而变化。
试剂盒
在一些实施方案中，提供了用于治疗癌症(例如，HER2阳性癌症)的试剂盒，其包含本文所述的双特异性蛋白。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种另外的治疗剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒包含如本文所述的双特异性蛋白并且还包含一种或多种用于治疗癌症的另外的治疗剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含说明材料，所述说明材料含有用于实践本文所述方法的指导(即，方案)(例如，使用试剂盒施用双特异性蛋白的说明书)。虽然所述说明材料通常包含书面或打印材料，但它们并不限于此。本公开考虑了能够存储此类说明书并且将它们传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD-ROM)等。此类介质可包括提供此类说明材料的互联网网站的网址。
IX.实施例
将通过具体实施例来更详细地描述本发明。以下实施例仅出于说明目的而提供，且不旨在以任何方式限制本发明。
实施例1.双特异性蛋白的产生
产生具有如本文所述并且在图1-图5中示出的双特异性蛋白结构的工程化蛋白，以靶向人HER2的亚结构域II和人HER2的亚结构域IV。在一些构建体中，Fc多肽的C端赖氨酸被去除。在一些构建体中，将Fd部分(VH+CH1)克隆至包含编码Fc多肽的序列的表达载体中。在一些实施方案中，Fc多肽被工程化以具有TfR结合位点。在构建体的一些实施方案中，Fc多肽中的一个含有TfR结合位点和“杵”(T366W)突变(例如，SEQ ID NO:137)，而另一个Fc多肽含有“臼”(T366S/L368A/Y407V)突变(例如，SEQ ID NO:133)。另外，一个或两个Fc多肽还含有突变L234A/L235A，其减弱了FcγR结合。
将载体与对应的轻链载体一起以1:1:2的杵:臼:轻链的比率共转染至ExpiCHO或Expi293细胞中。通过将上清液加载在蛋白A柱上，从条件培养基中纯化表达的蛋白。将柱用10个柱体积的PBS(pH 7.4)洗涤。用50mM柠檬酸钠(pH 3.0，含有150mM NaCl)洗脱蛋白质，并且立即用200mM精氨酸/137mM琥珀酸(pH 5.0)中和。使用200mM精氨酸/137mM琥珀酸(pH5.0)作为运行缓冲液，通过尺寸排阻色谱(SEC)(GE Superdex200)进一步纯化蛋白质。通过完整质量LC/MS确认纯化的蛋白质，并且通过SDS-PAGE和分析型HPLC-SEC确认纯度>95％。产生了含有未修饰的人IgG1恒定区的抗HER2双特异性蛋白。下表1提供了抗HER2双特异性蛋白和两种对照抗HER2抗体的序列。
表1
实施例2.双特异性蛋白的Biacore评估
使用Biacore T200或Biacore 8K，通过SPR测量双特异性蛋白的亲和力。BiacoreTMSeries S CM5传感器芯片固定有用于HER2亲和力测量的单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体或用于TfR亲和力测量的小鼠抗人Fab(来自GE Healthcare的人抗体或Fab捕获试剂盒)。以30μL/min的流速注射分析物(重组HER2细胞外结构域或重组TfR顶端结构域)的连续3倍稀释液。使用针对HER2细胞外结构域结合的3分钟缔合和10分钟解离以及针对人TfR顶端结构域结合的40秒缔合和3分钟解离来分析每个样品。每次注射后，使用3M MgCl2或50mM甘氨酸(pH 2.0)对芯片进行再生。通过从以相似密度捕获无关IgG的流动池中减去RU来校正结合反应。同时对kon和koff进行拟合的1:1朗格缪尔模型用于动力学分析。构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_1”的KD为2.3nM，而构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_2”的KD为1.9nM。两种构建体描述如下。
两种构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_1”和“抗HER2_DIV/DII_scFv_2”都具有“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”结构。在构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_1”中，(a)包含SEQ ID NO:1的序列(抗HER2DII Fab经由铰链区与具有杵LALA的CH3C.35.23.4的N端融合)，(b)包含SEQID NO:23的序列(抗HER2DIV scFv经由铰链区与具有臼突变的Fc多肽的N端融合)，并且(c)包含SEQ ID NO:25的序列。在构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_2”中，(a)包含SEQ ID NO:5的序列(抗HER2DII Fab经由铰链区与具有臼突变的Fc多肽的N端融合)，(b)包含SEQ ID NO:24的序列(抗HER2DIV scFv经由铰链区与具有杵LALA的CH3C.35.23.4的N端融合)，并且(c)包含SEQ ID NO:25的序列。在两种构建体中，scFv部分都含有在位置100处具有Gln至Cys取代的抗HER2DIV VL区(SEQ ID NO:115)和在位置44处具有Gly至Cys取代的抗HER2DIV VH区(SEQ ID NO:113)。而且在两种构建体中，(b)中的铰链区在位置5处具有Cys至Ser突变(EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:129))。
下表2进一步示出抗HER2双特异性蛋白的HER2结合KD和TfR结合KD。
表2
| HER2结合KD(nM) | TfR结合KD(nM) | |
| 抗HER2DIV对照 | 3.0 | 不适用 |
| 抗HER2DII对照 | 2.9 | 不适用 |
| 双特异性蛋白#1 | 3.0 | 460 |
| 双特异性蛋白#2 | 0.024 | 480 |
| 双特异性蛋白#3 | 0.027 | 450 |
| 双特异性蛋白#4 | 0.019 | 470 |
| 双特异性蛋白#5 | 0.031 | 540 |
| 双特异性蛋白#6 | 0.0074 | 490 |
| 双特异性蛋白#7 | 0.0038 | 350 |
| 双特异性蛋白#8 | 0.0031 | 290 |
| 双特异性蛋白#9 | 0.0033 | 500 |
| 双特异性蛋白#10 | 0.0017 | 520 |
| 双特异性蛋白#11 | 0.0028 | 470 |
| 双特异性蛋白#12 | 0.0006 | 560 |
| 双特异性蛋白#13 | 0.0008 | 600 |
实施例3.共同靶向TfR和HER2亚结构域II和IV
许多肿瘤细胞和肿瘤细胞系，诸如BT474和OE19，表达HER2和TfR两者。虽然已经充分确定靶向HER2亚结构域IV的抗体能够在一些HER2+细胞系中抑制肿瘤细胞生长并且降低肿瘤细胞活力，但我们试图了解共同靶向HER2亚结构域IV和TfR是否会导致增强的细胞杀伤。
使用了具有“Fab-Fc多肽/scFv-Fc多肽”结构的两种构建体。构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_1”和构建体“抗HER2_DIV/DII_scFv_2”描述于先前的实施例中。
我们首先在对抗HER2疗法敏感的HER2+肿瘤细胞系BT474的生长抑制测定中比较了两种构建体和对照单克隆抗HER2抗体。将BT474细胞以10,000个细胞/孔铺种在96孔板中过夜，用60μL从166nM(25,000ng/mL)开始的感兴趣的分子的1:3连续稀释液处理。在第3天补充培养基(RPMI)和药物。在第6天，在50μL生长培养基中使用5μL WST-1试剂(SigmaAldrich)测定细胞生长。将板在WST-1试剂存在下孵育4小时，并且在440nm处测定吸光度。基于A440nM计算生长抑制/增殖百分比，并且将其归一化至未处理对照。如图6A中所示，抗HER2-DIV和抗HER2-DII的组合相对于对照降低了BT474细胞活力，其中最大抑制为约87％。相似地，与抗HER2-DIV和抗HER2-DII相比，抗HER2_DIV/DII_scFv_1和抗HER2_DIV/DII_scFv_2显示出相似的最大生长抑制(图6A)。
接下来，我们用对抗HER2治疗具有抗性的另一HER2+癌细胞系OE19对两种构建体和对照单克隆抗HER2抗体进行了比较。如图6B中所示，与BT474不同(其中两种抗HER2_DIV/DII_scFv构建体与抗HER2-DIV和抗HER2-DII的组合的最大生长抑制作用之间没有差异)，OE19细胞系在抗HER2_DIV/DII_scFv_1和抗HER2_DIV/DII_scFv_2处理时最大抑制为约80％，而细胞对抗HER2-DIV和抗HER2-DII的组合的反应最小。这些结果表明，与仅靶向HER2亚结构域相比，靶向HER2亚结构域IV、HER2亚结构域II和TfR可导致抗HER2抗性细胞系中细胞生长抑制增强。值得注意的是，如果细胞系已经对抗HER2疗法敏感，则任何增强都可能被掩盖。
实施例4.抗HER2双特异性蛋白的体内药代动力学性质
为了评价在不存在TfR结合的情况下抗HER2双特异性蛋白的体内血浆药代动力学，向C57BL/6小鼠静脉内施用10mg/kg的抗HER2双特异性蛋白。在单一剂量后30分钟、1天、4天和7天收集血液，处理成血浆，并且在-80℃下储存直至分析。使用抗人IgG夹心ELISA(图7)并且使用适当的给药溶液作为标准品来对血浆中双特异性蛋白的总治疗浓度进行量化。将板用抗人IgG包被过夜，然后用洗涤缓冲剂洗涤3次。将标准品和相关稀释样品在室温下搅拌孵育2小时。孵育后，将板用洗涤缓冲剂洗涤3次。将检测抗体稀释在封闭缓冲剂中，并且将板在室温下搅拌孵育1小时。在最后3次洗涤后，通过添加TMB底物使板显影并且孵育5-10分钟。淬灭反应并且使用450nM吸光度(Biotek酶标仪)读数。所有抗HER2双特异性蛋白都显示在正常IgG范围内的清除率值。
实施例5.抗HER2双特异性蛋白的体内脑摄取
为了评价抗HER2双特异性蛋白至脑中的体内摄取，向TfRmu/hu KI小鼠静脉内施用50mg/kg的抗HER2双特异性蛋白。给药后大约24小时，经由心脏穿刺将全血收集至涂有EDTA的管中，然后用冰冷的PBS灌注动物。使用新鲜全血评价临床血液化学和网状红细胞定量(图8A)，并且将单独的等分试样处理成血浆。与对照处理的小鼠相比，大多数抗HER2双特异性蛋白显示在正常范围内的网状红细胞值。
将血浆和新鲜脑在干冰上速冻并且储存在-80℃下。使用Qiagen Tissue LyserII用带有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的10倍体积的PBS中的按组织重量计1％NP40缓冲剂对脑进行匀浆；上清液储存在-80℃下。使用夹心ELISA量化抗HER2双特异性蛋白的血浆(图8B)和脑裂解物(图8C)浓度。血浆浓度表现出预期的TfR介导的药物处置；脑中抗HER2双特异性蛋白的脑浓度在大约15nM至52nM范围内，表明这些分子能够结合血脑屏障上的TfR并且被转运至脑中。所得脑-血浆浓度百分比介于大约1-2％之间(图8D)，大约比缺少TfR或其他受体介导的转胞吞作用靶向的抗体的预期高十倍。此数据表明并且支持如本文所述的具有不同结构的多种抗HER2双特异性蛋白是脑渗透性的。
实施例6.抗HER2双特异性蛋白的体外生长抑制
用对抗HER2疗法敏感的各种HER2+肿瘤细胞系(BT474(图9A-图9F)、OE19(图9G-图9I)和ZR75(图9J-图9L))评价抗HER2双特异性蛋白和现有抗HER2疗法的体外生长抑制功效。将肿瘤细胞以10,000个细胞/孔铺种在96孔板中过夜，用60μL从166nM(25,000ng/mL)开始的感兴趣的分子的1:3连续稀释液处理。在第3天补充培养基(RPMI)和药物。对于神经调节蛋白1(NRG1)处理的BT474组(图9D-图9F)，将细胞在50ng/ml NRG1存在下孵育。在第6天，在50μL生长培养基中使用5μL WST-1试剂(Sigma Aldrich)测定细胞生长。将板在WST-1试剂存在下孵育4小时，并且在440nm处测定吸光度。基于A440 nM计算生长抑制/增殖百分比，并且将其归一化至未处理对照。下表3进一步示出抗HER2双特异性蛋白和抗HER2对照在三种不同的HER2+细胞系中的生长抑制功效。图9A-图9L和表3示出，总体抗HER2双特异性蛋白显示出与具有野生型Fc的抗HER2DIV对照和抗HER2DII对照等效或优于其的生长抑制。在具有某些抗HER2双特异性蛋白的一些细胞系中，与具有野生型Fc的抗HER2DIV对照或抗HER2DII对照相比，生长抑制降低，这可能是由于在某些构型中对结合位点的竞争。
表3
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*ND–未测定
实施例7.另外双特异性蛋白的产生
重组双特异性蛋白变体的表达和纯化
将由(i)包含TfR结合位点和杵(T366W)突变的重链多肽，(ii)包含臼(T366S/L368A/Y407V)突变的重链多肽，和(iii)根据表4和表5中的组合的轻链组成的表达质粒共同转染到Expi293或ExpiCHO细胞中。随后通过将上清液加载到蛋白A柱(GE Mab SelectSuRe)上，从条件培养基中纯化重组双特异性蛋白变体。将柱用10个柱体积的PBS(pH 7.4)洗涤。用50mM柠檬酸钠(pH 3.0，含有150mM NaCl)洗脱蛋白质，并且立即用200mM精氨酸/137mM琥珀酸(pH 5.0)中和。使用200mM精氨酸/137mM琥珀酸(pH 5.0)作为运行缓冲剂，通过尺寸排阻色谱(GE Superdex200)进一步纯化蛋白质。通过完整质量LC/MS确认纯化的蛋白质，并且通过SDS-PAGE和分析型HPLC-SEC确认纯度>95％。
表4
| 重链1-K | 重链2-H | 轻链 | |
| 双特异性蛋白#20 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:22 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#21 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:159 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#22 | SEQ ID NO:164 | SEQ ID NO:173 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#23 | SEQ ID NO:164 | SEQ ID NO:174 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#24 | SEQ ID NO:166 | SEQ ID NO:173 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#25 | SEQ ID NO:165 | SEQ ID NO:173 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#26 | SEQ ID NO:165 | SEQ ID NO:174 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#27 | SEQ ID NO:167 | SEQ ID NO:173 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#28 | SEQ ID NO:164 | SEQ ID NO:175 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#29 | SEQ ID NO:164 | SEQ ID NO:176 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#30 | SEQ ID NO:166 | SEQ ID NO:175 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#31 | SEQ ID NO:165 | SEQ ID NO:175 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#32 | SEQ ID NO:165 | SEQ ID NO:176 | SEQ ID NO:25 |
| 双特异性蛋白#33 | SEQ ID NO:167 | SEQ ID NO:175 | SEQ ID NO:25 |
表5
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重链可以在细胞培养物产生期间被进一步加工，使得C端赖氨酸残基被去除。因此，上表4和表5中列出的双特异性蛋白可指包含未加工的重链(即，包含C端赖氨酸残基)的蛋白质分子；包含一条或多条加工的重链(即，不存在C端赖氨酸残基)的蛋白质分子；或具有加工的和/或未加工的重链的蛋白质分子的混合物。
实施例8.抗HER2双特异性蛋白的体外ADCC/ADCP
根据表6中的组合，使用人ADCC报告基因生物测定，V变体试剂盒(Promega G7018)来评估人FcγRIIIa的活化，而使用人FcgRIIa ADCP报告基因生物测定试剂盒(PromegaG9995)来测量双特异性抗体的人FcγRIIa报告基因的活化。所述试剂盒含有下述所有组分。测试了几种具有不同HER2和TfR表达水平的细胞系。将细胞SKBR 3(ATCC HTB-30)、ZR-75-30(ATCC CRL-1504)、BT-474(ATCC HTB-20)、OE-19(Sigma 96071721)、CHO-KI+HumanTfR(ChemPar tner CRO协议)在补充有10％FBS(Hyclone牛血清SH30080.03)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies 15140-122)的RPMI(Liffe Technol ogies 61870-036)中培养至指数期，用PBS洗涤两次并且以1.0x106个细胞/mL重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI中。将白色96孔高结合Nunc板(ThermoFisher)涂有25μL含有50,000个细胞的培养基/孔。
在具有4％低IgG血清的RPMI中制备抗体滴定液并且将每孔25μl添加到板中以调理细胞，然后覆盖并且在37℃、5％CO2下孵育30分钟。在抗体调理期间，将3.5mL培养基预热至37℃，并且将FcγR报告基因细胞在37℃水浴中快速解冻，无需翻转，然后在轻轻混合下添加到15mL锥形管中的预热培养基中。在30分钟调理后，将FcγR报告基因细胞系以每孔25μl添加到每个板中，并且在37℃、5％CO2下孵育6小时(hFcγRIIIa和hFcγRIIa活化，对于SKBR3、ZR-75-30、BT-474)或16小时(hFcγRIIIa和hFcγRIIa，对于CHO-KI+huTfR)。在孵育后，使板适应至室温，并且添加每孔75μL Bio-Glo荧光素酶底物悬浮液(Promega)，且在Perkin Elmer Envision读数器上测量发光。结果示于表7。
表6
表7
目的是开发与对照和/或Fc1相比不增加TfR介导的ADCC并且还具有与对照相当的HER2介导的ADCC水平和/或与Fc1相比改善的HER2介导的ADCC水平的Fc变体。如上表7所示，Fc1、Fc41、Fc5、Fc45、Fc42、Fc52、Fc44、Fc50、Fc68、Fc7、Fc8、Fc2、Fc34和Fc4在TfR过表达CHO细胞中全部具有与对照相当的TfR介导的ADCC水平。在所有测试的HER2过表达细胞系中，Fc50和Fc52显示出最高水平的HER2介导的ADCC，而不增加TfR介导的ADCC活化。
Fc1、Fc41、Fc5、Fc45、Fc42、Fc52、Fc44和Fc50变体的ADCP水平也在表7中示出，与HER2过表达细胞系(即，OE19、ZR-75-30和SKBR3)的对照相比。
实施例9抗HER2双特异性蛋白的体外生长抑制
生长抑制测定用于测定用不同抗体处理不同持续时间后细胞的活力。测试了几种具有不同HER2和TfR表达水平的细胞系。将细胞SKBR3(ATCC HTB-30)、ZR-75-30(ATCC CRL-1504)、BT-474(ATCC HTB-20)、OE-19(Sigma 96071721)、CHO-KI+HumanTfR(ChemPartnerCRO协议)在补充有10％FBS(Hyclone牛血清SH30080.03)和1％青霉素-链霉素(LifeTechnologies 15140-122)的RPMI(Liffe Technologies 61870-036)中培养至指数期。在用PBS洗涤后，将细胞以1.0x105个细胞/mL重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI中。将黑色聚-D-赖氨酸板(Corning 354640)涂有100ul含有10,000个细胞的细胞培养基/孔。将板在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。
在具有10％FBS血清和1％青霉素/链霉素的RPMI中制备抗体滴定液。将抗体以每孔65μl添加到每个板中，然后覆盖并且在37℃、5％CO2下孵育72小时(仅对于OE-19细胞系)。对于BT-474和ZR-75-30细胞系，在72小时后再添加65μl抗体，然后在37℃、5％CO2下再孵育72小时。
在第7天，在50μL生长培养基中使用5μL WST-1试剂(Sigma Aldrich)测定细胞生长。将板在WST-1试剂存在下孵育4小时，并且在440nm处测定吸光度。基于A440 nM计算生长抑制/增殖百分比，并且将其归一化至未处理对照。
X.示例性实施方案
根据当前公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求书和以下实施方案：
1.一种蛋白质，其包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与单链可变片段(scFv)融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)与(a)中所述的Fd部分配对形成Fab的轻链多肽，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且
其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。
2.如实施方案1所述的蛋白质，其中独立地包含所述S239D和/或所述I332E取代的所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能。
3.如实施方案1或2所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(g)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(h)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(j)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(k)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(l)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(m)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代；
(n)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代；或者
(o)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
4.如实施方案3所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代。
5.如实施方案4所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(d)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸。
6.如实施方案1至5中任一项所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
7.如实施方案1至5中任一项所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
8.如实施方案1至7中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽经由第一接头与所述scFv融合。
9.如实施方案8所述的蛋白质，其中所述第一接头的长度为1至20个氨基酸。
10.如实施方案8或9所述的蛋白质，其中所述第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
11.如实施方案1至10中任一项所述的蛋白质，其中所述scFv包含经由第二接头连接的VL区和VH区。
12.如实施方案11所述的蛋白质，其中所述第二接头的长度为1至20个氨基酸。
13.如实施方案11或12所述的蛋白质，其中所述第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
14.如实施方案1至13中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合转铁蛋白受体(TfR)。
15.如实施方案1至14中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。
16.如实施方案15所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代。
17.如实施方案15所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽包含T366W取代。
18.如实施方案14至17中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰。
19.如实施方案18所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述降低效应子功能的修饰是L234A和L235A取代。
20.如实施方案19所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
21.如实施方案20所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
22.如实施方案21所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
23.如实施方案19所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
24.如实施方案23所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
25.如实施方案24所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
26.如实施方案1至25中任一项所述的蛋白质，其中铰链区或其部分连接至所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的N端。
27.如实施方案1至26中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含与选自由SEQ ID NO:131-149和183-196组成的组的序列具有至少90％同一性的序列。
28.如实施方案27所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:133和183-185的序列具有至少90％同一性的序列。
29.如实施方案27所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:137和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
30.如实施方案1至29中任一项所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
31.如实施方案1至30中任一项所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列。
32.如实施方案1至30中任一项所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ IDNO:137的序列具有至少90％同一性的序列。
33.一种蛋白质，其包含：
(a)(i)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:159的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(b)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(c)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:174的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(d)(i)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(e)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(f)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:174的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(g)(i)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(h)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(i)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:176的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(j)(i)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(k)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(l)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:176的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(m)(i)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽。
34.如实施方案33所述的蛋白质，其中：
(a)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:1的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:159的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(b)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(c)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:174的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(d)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:166的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(e)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(f)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:174的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(g)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:167的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(h)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(i)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:176的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(j)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:166的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(k)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(l)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:176的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(m)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:167的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列。
35.一种蛋白质，其包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)和/或(b)中的所述Fd部分在N端处与scFv融合，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且
其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。
36.如实施方案35所述的蛋白质，其中独立地包含所述S239D和/或所述I332E取代的所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能。
37.如实施方案35或36所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(g)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(h)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(j)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(k)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(l)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(m)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代；
(n)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代；或者
(o)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
38.如实施方案37所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代。
39.如实施方案38所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(d)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和位置332处的异亮氨酸。
40.如实施方案35至39中任一项所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
41.如实施方案35至39中任一项所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
42.如实施方案35至41中任一项所述的蛋白质，其中(a)或(b)中的所述Fd部分在N端处与所述scFv融合。
43.如实施方案35至42中任一项所述的蛋白质，其中(a)和/或(b)中的所述Fd部分经由第一接头与所述scFv融合。
44.如实施方案43所述的蛋白质，其中所述第一接头的长度为1至20个氨基酸。
45.如实施方案43或44所述的蛋白质，其中所述第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
46.如实施方案35至45中任一项所述的蛋白质，其中所述scFv包含经由第二接头连接的VL区和VH区。
47.如实施方案46所述的蛋白质，其中所述第二接头的长度为1至20个氨基酸。
48.如实施方案46或47所述的蛋白质，其中所述第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
49.如实施方案35至48中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合转铁蛋白受体(TfR)。
50.如实施方案35至49中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。
51.如实施方案50所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代。
52.如实施方案50所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽包含T366W取代。
53.如实施方案49至52中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰。
54.如实施方案53所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述降低效应子功能的修饰是L234A和L235A取代。
55.如实施方案54所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
56.如实施方案55所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
57.如实施方案56所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
58.如实施方案54所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
59.如实施方案58所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
60.如实施方案59所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
61.如实施方案35至60中任一项所述的蛋白质，其中铰链区或其部分连接至所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的N端。
62.如实施方案35至61中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含与选自由SEQ ID NO:131-149和183-196组成的组的序列具有至少90％同一性的序列。
63.如实施方案62所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:133和183-185的序列具有至少90％同一性的序列。
64.如实施方案62所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:137和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
65.如实施方案35至64中任一项所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
66.如实施方案35至65中任一项所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列。
67.如实施方案35至65中任一项所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ IDNO:137的序列具有至少90％同一性的序列。
68.一种蛋白质，其包含：
(a)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:160的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(b)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:161的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(c)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:162的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(d)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(e)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:178的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(f)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(g)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(h)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:178的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(i)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(j)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(k)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:180的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(l)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(m)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(n)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:180的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(o)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(p)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(q)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:182的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(r)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(s)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(t)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:182的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(u)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽。
69.如实施方案68所述的蛋白质，其中：
(a)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:6的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:160的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(b)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:6的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:161的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(c)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:6的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:162的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(d)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(e)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:178的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(f)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:171的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(g)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(h)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:178的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(i)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:172的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(j)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(k)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:180的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(l)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:171的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(m)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(n)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:180的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(o)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:172的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(p)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(q)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:182的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(r)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:171的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(s)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(t)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:182的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(u)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:172的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQ ID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列。
70.一种药物组合物，其包含如实施方案1至69中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的载剂。
71.一种分离的多核苷酸，其包含编码如实施方案1至69中任一项所述的蛋白质的核苷酸序列。
72.一种载体，其包含如实施方案71所述的多核苷酸。
73.一种宿主细胞，其包含如实施方案71所述的多核苷酸或如实施方案72所述的载体。
74.一种用于治疗受试者的癌症或治疗受试者的癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如实施方案1至69中任一项所述的蛋白质或如实施方案70所述的药物组合物。
75.如实施方案74所述的方法，其中所述蛋白质与化学疗法或放射疗法组合施用。
76.如实施方案74或75所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
77.如实施方案74至76中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
78.如实施方案74至77中任一项所述的方法，其中所述癌症是HER2阳性癌症。
应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的并且根据其的各种修改或变化将为本领域技术人员所想到并且欲包括在本申请的精神和权限以及随附权利要求书的范围内。本文引用的序列登录号的序列特此通过引用并入。
非正式序列表
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Claims (78)
1.一种蛋白质，其包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与单链可变片段(scFv)融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)与(a)中所述的Fd部分配对形成Fab的轻链多肽，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且
其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中独立地包含所述S239D和/或所述I332E取代的所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能。
3.如权利要求1所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(g)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(h)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(j)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(k)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(l)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(m)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代；
(n)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代；或者
(o)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代。
5.如权利要求4所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(d)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和332处的异亮氨酸。
6.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
7.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
8.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽经由第一接头与所述scFv融合。
9.如权利要求8所述的蛋白质，其中所述第一接头的长度为1至20个氨基酸。
10.如权利要求8所述的蛋白质，其中所述第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GGGG SGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
11.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述scFv包含经由第二接头连接的VL区和VH区。
12.如权利要求11所述的蛋白质，其中所述第二接头的长度为1至20个氨基酸。
13.如权利要求11所述的蛋白质，其中所述第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SE Q ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GG GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
14.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合转铁蛋白受体(TfR)。
15.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。
16.如权利要求15所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代。
17.如权利要求15所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽包含T366W取代。
18.如权利要求14所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰。
19.如权利要求18所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述降低效应子功能的修饰是L234A和L235A取代。
20.如权利要求19所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
21.如权利要求20所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
22.如权利要求21所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
23.如权利要求19所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
24.如权利要求23所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
25.如权利要求24所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
26.如权利要求1所述的蛋白质，其中铰链区或其部分连接至所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的N端。
27.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含与选自由SEQ ID NO:131-149和183-196组成的组的序列具有至少90％同一性的序列。
28.如权利要求27所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:133和183-185的序列具有至少90％同一性的序列。
29.如权利要求27所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:137和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
30.如权利要求1所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
31.如权利要求1所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列。
32.如权利要求1所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ IDNO:137的序列具有至少90％同一性的序列。
33.一种蛋白质，其包含：
(a)(i)包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:159的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(b)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(c)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:174的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(d)(i)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(e)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(f)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:174的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(g)(i)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:173的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(h)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(i)(i)包含与SEQ ID NO:164的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:176的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(j)(i)包含与SEQ ID NO:166的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(k)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(l)(i)包含与SEQ ID NO:165的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:176的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽；或者
(m)(i)包含与SEQ ID NO:167的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:175的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少90％同一性的序列的轻链多肽。
34.如权利要求33所述的蛋白质，其中：
(a)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:1的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:159的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(b)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(c)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:174的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(d)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:166的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(e)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(f)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:174的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(g)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:167的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:173的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(h)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(i)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:164的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:176的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(j)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:166的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(k)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(l)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:165的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:176的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列；或者
(m)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:167的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:175的序列，并且(iii)所述轻链多肽包含SEQ ID NO:25的序列。
35.一种蛋白质，其包含：
(a)在N端处与Fab的Fd部分融合的第一Fc多肽；
(b)在N端处与Fab的Fd部分融合的第二Fc多肽，其中所述第一和第二Fc多肽形成Fc二聚体；和
(c)两条轻链多肽，其各自与(a)和(b)中所述的每个Fd部分配对以形成Fab，
其中(a)和/或(b)中的所述Fd部分在N端处与scFv融合，
其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV，或者其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II，并且
其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含S239D和/或I332E取代。
36.如权利要求35所述的蛋白质，其中独立地包含所述S239D和/或所述I332E取代的所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽能够增强HER2介导的效应子功能。
37.如权利要求35所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(g)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(h)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(i)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(j)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；
(k)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(l)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；
(m)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代；
(n)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代；或者
(o)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代。
38.如权利要求37所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(d)根据EU编号，所述第二Fc多肽包含I332E取代；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代。
39.如权利要求38所述的蛋白质，其中：
(a)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(b)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D和I332E取代，并且所述第二Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸；
(c)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(d)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸；
(e)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含S239D取代和位置332处的异亮氨酸，并且所述第二Fc多肽包含S239D和I332E取代；或者
(f)根据EU编号，所述第一Fc多肽包含I332E取代和位置239处的丝氨酸，并且所述第二Fc多肽包含位置239处的丝氨酸和位置332处的异亮氨酸。
40.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域II并且所述scFv结合人HER2的亚结构域IV。
41.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述Fab结合人HER2的亚结构域IV并且所述scFv结合人HER2的亚结构域II。
42.如权利要求35所述的蛋白质，其中(a)或(b)中的所述Fd部分在N端处与所述scFv融合。
43.如权利要求35所述的蛋白质，其中(a)和/或(b)中的所述Fd部分经由第一接头与所述scFv融合。
44.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述第一接头的长度为1至20个氨基酸。
45.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述第一接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SE Q ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GG GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
46.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述scFv包含经由第二接头连接的VL区和VH区。
47.如权利要求46所述的蛋白质，其中所述第二接头的长度为1至20个氨基酸。
48.如权利要求46所述的蛋白质，其中所述第二接头包含以下中任一者的序列：GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:116；(GGSG)5)、GGGGS(SEQ ID NO:117；G4S)、GGGGSGGGGS(SE Q ID NO:118；(G4S)2)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119；(G4S)3)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:120；(G4S)2-G4)、GG GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:121)、GGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:122)和GGGGGSGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:123)。
49.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合转铁蛋白受体(TfR)。
50.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自包含促进异二聚化的修饰。
51.如权利要求50所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366W取代并且所述第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代。
52.如权利要求50所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V取代并且所述第二Fc多肽包含T366W取代。
53.如权利要求49所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含降低TfR介导的效应子功能的修饰。
54.如权利要求53所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述降低效应子功能的修饰是L234A和L235A取代。
55.如权利要求54所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
56.如权利要求55所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
57.如权利要求56所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
58.如权利要求54所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽特异性结合TfR并且包含L234A和L235A取代。
59.如权利要求58所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第二Fc多肽还包含P329G或P329S取代。
60.如权利要求59所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234和235处的Leu以及位置329处的脯氨酸。
61.如权利要求35所述的蛋白质，其中铰链区或其部分连接至所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的N端。
62.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含与选自由SEQ ID NO:131-149和183-196组成的组的序列具有至少90％同一性的序列。
63.如权利要求62所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:133和183-185的序列具有至少90％同一性的序列。
64.如权利要求62所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽或所述第二Fc多肽包含与选自SEQ ID NO:137和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
65.如权利要求35所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽独立地包含位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与选自SEQ ID NO:135-139和186-196的序列具有至少90％同一性的序列。
66.如权利要求35所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ ID NO:137的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列。
67.如权利要求35所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽包含位置366处的Ser、位置368处的Ala和位置407处的Val，以及与SEQ ID NO:133的序列具有至少90％同一性的序列，并且
根据EU编号，所述第二Fc多肽包含位置234处的Ala、位置235处的Ala、位置366处的Trp、位置384处的Tyr、位置386处的Thr、位置387处的Glu、位置388处的Trp、位置389处的Ser、位置413处的Ser、位置415处的Glu、位置416处的Glu和位置421处的Phe，以及与SEQ IDNO:137的序列具有至少90％同一性的序列。
68.一种蛋白质，其包含：
(a)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:160的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(b)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:161的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(c)(i)包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:162的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(d)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(e)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:178的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(f)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(g)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(h)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:178的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(i)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:177的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(j)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(k)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:180的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(l)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(m)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(n)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:180的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(o)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:179的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(p)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(q)(i)包含与SEQ ID NO:169的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:182的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(r)(i)包含与SEQ ID NO:171的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(s)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(t)(i)包含与SEQ ID NO:170的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:182的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽；或者
(u)(i)包含与SEQ ID NO:172的序列具有至少90％同一性的序列的第一重链多肽，(ii)包含与SEQ ID NO:181的序列具有至少90％同一性的序列的第二重链多肽，和(iii)各自包含与SEQ ID NO:26的序列具有至少90％同一性的序列的两条轻链多肽。
69.如权利要求68所述的蛋白质，其中：
(a)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:6的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:160的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(b)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:6的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:161的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(c)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:6的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:162的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(d)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(e)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:178的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(f)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:171的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(g)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(h)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:178的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(i)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:172的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:177的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(j)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(k)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:180的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(l)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:171的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(m)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(n)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:180的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(o)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:172的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:179的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(p)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(q)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:169的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:182的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(r)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:171的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(s)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(t)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:170的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:182的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列；或者
(u)(i)所述第一重链多肽包含SEQ ID NO:172的序列，(ii)所述第二重链多肽包含SEQID NO:181的序列，并且(iii)所述两条轻链多肽各自包含SEQ ID NO:26的序列。
70.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的蛋白质和药学上可接受的载剂。
71.一种分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求1所述的蛋白质的核苷酸序列。
72.一种载体，其包含如权利要求71所述的多核苷酸。
73.一种宿主细胞，其包含如权利要求71所述的多核苷酸或如权利要求72所述的载体。
74.一种用于治疗受试者的癌症或治疗受试者的癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求70所述的药物组合物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述蛋白质与化学疗法或放射疗法组合施用。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
77.如权利要求74所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
78.如权利要求74所述的方法，其中所述癌症是HER2阳性癌症。
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