KR20220071177A - 인간화 항-vegf 단클론 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 면역요법 분야에 속하며, VEGF에 결합하는 인간화 단클론 항체에 관한 것이다. 상기 항체를 인코딩하는 핵산 서열(중쇄/경쇄 가변 영역 포함), 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터, 약제학적 조성물 및 키트가 제공된다. 제공된 항체는 VEGF에 높은 친화도로 특이적으로 결합할 수 있고, 수용체 VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 차단할 수 있다. 상기 항체는 또한 HUVEC 세포에 대한 VEGF165 단독 및 다수의 VEGF 아형의 증식 효과를 중화할 수 있으며, 결장직장암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 종양의 임상 치료에 사용될 수 있다.

Description

인간화 항-VEGF 단클론 항체
본 발명은 종양 면역요법 분야에 관한 것이며, 구체적으로는 VEGF에 결합하는 인간화 단클론 항체에 관한 것이다.
혈관계의 발달은 많은 생리학적 및 병리학적 과정의 기초이다. 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 내피세포 유사분열 및 항아폽토시스를 촉진하고, 혈관 투과성을 증가시키며, 세포 이동을 촉진하는 중요한 전-혈관신생 활성(pro-angiogenic activity)을 보유하는 성장 인자 그룹이다. 인간 VEGF 유전자는 염색체 6p21.3에 위치하고, VEGF/PDGF 슈퍼유전자 계열에 속하며, 이 계열은 이량체를 형성하기 위해 이황화 결합으로 연결된 VEGF를 인코딩한다. 인간에서 VEGF 계열은 기능이 다른 여러 구성원, 즉 VEGFA(VEGF, 여러 다른 스플라이싱 변이체 포함), VEGFB, VEGFC, VEGFD, VEGFE, VEGFF 및 태반 성장 인자(placenta growth factor, PIGF)를 포함한다. 최근에는, 내분비선 유래 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF)도 이 계열에 포함되었다(Samson M et al., J Clin Endocrinol Metab. 2004; 89(8):4078-4088). VEGF는 인간의 조직 및 기관에 널리 분포되어 있으며, 그 중 눈의 망막 색소 상피세포, 혈관 내피세포, 신경세포 등이 언급된다(Goel H L et al., Nat Rev Cancer. 2013; 13(12): 871). VEGF 수용체에는 세 가지 유형이 있다: VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3. 수용체 세포외 도메인에 대한 VEGF의 결합은 수용체 이량체화를 유발하고 세포내 도메인에서 티로신 잔기의 자가 인산화를 촉진하여 세포 증식, 이동, 항-세포자멸사 및 증가된 혈관 투과성을 촉진하는 다운스트림 신호를 활성화한다. VEGFR1 및 VEGFR2는 주로 혈관 내피세포에서 발현되는 반면, VEGFR3은 주로 림프 내피세포에서 발현된다.
VEGF는 정상 및 병리학적 혈관신생의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다(Melincovici C S et al., Rom J Morphol Embryol. 2018; 59(2): 455-467). VEGF는 악성 복수를 유발할 수 있는 다양한 종양에서 과발현되며, 종양에서 VEGF의 발현은 종양 세포의 이동 능력과 연관성이 있다. 위장암, 난소암, 유방암 및 폐암과 같이 생존율이 낮은 고형 종양 환자에서 VEGF의 농도는 질병 병기(disease staging)와 양의 상관관계를 갖는다(Sebastian, K et al., Oncologist. 2009; 14(12): 1242 -1251). 종양 미세환경의 저산소 상태는 종양 세포 전사 인자 HIF-1a가 핵으로 진입하도록 유도하고, 순차적으로 HIF-1a가 VEGFA의 HRE 요소에 결합하여 VEGFA의 전사 수준이 상향 조절되고, 종양 세포가 종양 미세환경으로 다량의 VEGF를 분비하도록 촉진된다. 차례로, 고농도의 VEGF는 혈관 내피세포의 VEGFR에 작용하여 다수의 신생혈관증식(neovascularization)을 유도하고, 혈액 공급을 강화하고, 종양 세포의 성장에 충분한 영양분을 제공한다. 빠르게 성장한 종양 세포에서 더 많은 VEGF가 분비되어 혈관 내피세포의 증식과 이동을 더욱 촉진하고 종양 전이를 유도한다. 또한, VEGF는 종양 조직의 단핵구를 자극하여 M2 억제 대식세포로 전환하여 더 많은 음성 면역 인자를 생성하고, 동시에 Treg 세포를 상향 조절하며, 이는 T 세포의 사멸 능력을 상승적으로 감소시킨다.
VEGF와 내피세포 표면 수용체 VEGFR2 및 VEGFR1의 상호 작용을 억제함으로써, VEGF 단클론 항체 약물은 하류 신호전달 경로를 차단하고, 내피세포 증식 및 신생혈관증식을 억제하며, 종양 조직에 혈액 공급을 차단하고, 종양의 내부 영양소 공급을 제어하여 종양 성장을 제한하고, 궁극적으로 항암 효과를 달성한다. 아바스틴(Avastin)(베바시주맙(bevacizumab), 2009년 승인)은 종양 혈관신생을 억제하는 것으로 승인된 최초의 항체 약물로, 주로 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 교모세포종, 신경교종, 비소세포 폐암, 난소암, 및 신세포 암종의 치료에 사용된다. 아바스틴이 다양한 암을 치료하는 데 사용되었지만, VEGF 억제가 더 크고 효능이 더 높은 보다 강력한 항체에 대한 당해 분야의 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 결장직장암 치료를 위한 신규한 인간 VEGF 항체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 32에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호: 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 28에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 영역을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 39에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 39와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호: 40에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 40과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 항체는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 42에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 42와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역이고/이거나 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 41에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 41과 적어도 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역이다.
일 구현예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG 항체, 바람직하게는 IgG1 항체이다.
일 구현예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론 항체이다.
일 구현예에서, 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 친화도 KD는 1 내지 100 pM, 바람직하게는 5 내지 50 pM, 보다 바람직하게는 19.5 pM이다.
일 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd 단편, Fd' 단편, 단일 사슬 항체 분자 또는 단일 도메인 항체이고; 이때 상기 단일 사슬 항체 분자는 바람직하게는 scFv, 디-scFv, 트리-scFv, 디아바디(diabody) 또는 scFab이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 추가의 치료제를 포함하는 항체-약물 접합체를 제공하며, 바람직하게는 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 커넥터(connector)를 통해 추가 치료제와 연결된다.
일 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 영역 및 서열 번호: 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호: 13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 영역 및 서열 번호: 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 영역을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 25에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 25와 적어도 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역; 및 서열 번호: 26에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 26과 적어도 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 키메라 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 핵산은 서열 번호: 7에 기재된 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호: 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 서열 번호: 23에 기재된 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호: 24에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 또는 서열 번호: 47에 기재된 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호: 48에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 발현에 적합한 조건 하에 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 발현된 항체를 수거하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기재된 핵산, 또는 본원에 기재된 발현 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 결장직장암의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 치료적 유효량의 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 결장직장암의 치료가 필요한 피험자(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, 결장직장암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 결장직장암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-VEGFR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본원에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물, 및 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 약제학적 배합물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-VEGF 항체 또는 항원-결합 단편, 본원에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하고, 바람직하게는 투여용 장치를 추가로 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 설명되며, 여기서:
도 1은 토끼 항체 VEGF165가 VEGFR2 단백질에 대한 VEGF165의 결합을 차단함을 보여준다.
도 2는 토끼 항체 VEGF165가 VEGF165에 의해 유도된 HUVEC의 증식을 중화함을 보여준다.
도 3은 ELISA에 의해 검출된, VEGF165에 대한 인간화 항체 VEGF165-H988의 결합을 나타낸다.
도 4는 ELISA에 의해 검출된, mVEGF165에 대한 인간화 항체 VEGF165-H988의 결합을 나타낸다.
도 5는 VEGF-H988 항체가 ELISA에 의해 검출된, VEGFR2 단백질에 대한 VEGF165의 결합을 차단함을 보여준다.
도 6은 상이한 농도의 VEGF165를 중화하는데 있어서 항체 VEGF-H988의 효과를 나타낸다.
도 7은 VEGF-H988이 VEGF165, VEGFC 및 VEGFD-유도된 HUVEC 세포 증식의 중화에 미치는 영향을 나타낸다.
도 8은 VEGF-H988(50 mg/kg)이 복강내 주사된 G2 그룹 마우스의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타낸다.
도 9는 VEGF-H988(50 mg/kg)이 복강내 주사된 G4 그룹 마우스의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타낸다.
도 10은 VEGF-H988(50 mg/kg)이 복강내 주사된 G2&G4 그룹 마우스의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타낸다.
도 11은 인간 결장직장암 세포주 HCT-116 이종이식 종양 모델에서 VEGF-H988과 대조 약물의 효능을 비교한 것을 보여준다.
도 12는 인간 결장직장암 세포주 HCT-116 이종이식 종양 모델에서 VEGF-H988과 대조 약물의 효능을 비교한 것을 보여준다.
본 발명의 다양한 측면은 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 발현 벡터를 포함하는 항체-약물 접합체, 및 상기 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법, 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물, 및 결장직장암을 치료하기 위해 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 방법에 관한 것이다.
정의
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어는 당업계에서 일반적으로 이해되는 의미와 일치되도록 정의된다.
본 명세서에서 또는 첨부된 청구범위에서 사용되는 경우, 단수 형태 "하나(one)", "한(a/an)", "또 다른(another)", 및 "상기(said)"는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 대상의 복수형 표기를 포함한다.
용어 "항체(antibody)"는 면역글로불린 분자를 지칭하고, 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 상기 용어는 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 심지어 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 전장 항체 구조는 바람직하게는, 통상적으로 이황화 결합에 의해 상호연결된, 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 함유한다. 이러한 통상적인 전장 항체 구조에 더하여, 상기 구조는 다른 유도체 형태도 포함한다.
상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 더 보존적인 영역(프레임워크 영역(framework region, FR)이라고 함) 및 이에 산재된 초가변 영역(상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라고 함)으로 더 세분화될 수 있다.
용어 "상보성 결정 영역"(CDR, 예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)은 그 존재가 항원 결합에 필요한 항체의 가변 영역에 있는 이러한 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 영역은 통상적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각 상보성 결정 영역은 Kabat이 정의한 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991) 및/또는 "고-가변성 루프(high-variable loop)"로부터의 아미노산 잔기(Chothia and Lesk; J MolBiol 196: 901-917 (1987))를 함유할 수 있다.
용어 "프레임워크(framework) 또는 FR" 잔기는 본 명세서에서 정의된 CDR 잔기 외의 가변 영역 내 잔기이다.
각 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 통상적으로 3개의 CDR 및 최대 4개의 FR을 함유하고, 상기 CDR 및 FR은 아미노 말단부터 카복실 말단까지, 예를 들어, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 배열된다.
주어진 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)은 Kabat 시스템을 사용하여 식별될 수 있다(Kabat et al: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91- 3242, 1991).
용어 "불변 영역(constant region)"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 연루되어 있지 않지만 항체 의존적 세포독성과 같은 다양한 이펙터 기능(effector function)을 나타내는 항체의 경쇄 및 중쇄에 있는 이러한 아미노산 서열을 지칭한다.
불변 영역의 아미노산 서열의 항원 차이에 따라, 항체의 중쇄는 5가지 부류로 분류될 수 있다: α, δ, ε, γ 및 μ. 상기 중쇄가 경쇄와 완전한 항체를 형성하는 경우, 이는 5개의 부류로 분류될 수 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들은 추가로 하위부류(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는, 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, κ와 λ로 분류될 수 있다.
"항체의 항원 결합 단편"은 모 항체(parent antibody)의 결합 특이성의 적어도 일부를 보유하는 온전한 항체 분자의 일부를 포함하며, 통상적으로 모 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역의 적어도 일부(예를 들어, 하나 이상의 CDR)를 포함한다. 항원 결합 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd 단편, Fd' 단편, 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv, 디-scFv 또는 트리-scFv, 디아바디 또는 scFab), 단일 도메인 항체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체 단편"은 위에서 "항원 결합 단편"으로 기재된 것 이외에, Fc 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 모 항체의 생물학적 특성의 적어도 일부를 보유하는 온전하지 않은(non-intact) 항체 분자를 지칭한다.
용어 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 선택적으로 치료제 또는 세포독성제일 수 있는, 하나 이상의 화학적 약물(본원에서 작용제로도 지칭됨)에 화학적으로 연결된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 단백질을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, ADC는 항체, 세포독성 또는 치료 약물, 및 약물이 항체에 연결되거나 접합될 수 있게 하는 링커를 포함한다. ADC는 일반적으로 2, 4, 6 또는 8개의 약물 로딩 물질을 포함하여, 항체에 접합된 1 내지 8개 중 어느 값의 약물을 갖는다. ADC에 포함될 수 있는 약물의 비제한적인 예로는 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 면역조절제, 유전자 요법용 벡터, 알킬화제, 항혈관신생제, 항대사물질, 붕소 함유 제제, 화학요법 보호제, 호르몬, 항호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성 치료제, 올리고뉴클레오티드, 방사성핵종 제제, 토포이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 방사선 증감제가 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. "키메라 항체"는 또한 상기 정의된 바와 같은 기능적 단편일 수 있다. "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 하위 집합이다.
용어 "인간화 항체" 또는 "인간화 항원 결합 단편"은 하기와 같은 항체 또는 항체 단편으로 본 명세서에서 정의된다: (i) 비인간 공급원(예를 들어, 이종 면역계를 보유하는 형질전환 마우스)으로부터 유래되고, 인간 생식계열(germline) 서열을 기반으로 하는 항체 또는 항체 단편; 또는 (ii) 가변 영역이 비인간 기원이고, 불변 영역이 인간 기원인 키메라 항체; 또는 (iii) 가변 영역의 CDR이 비인간 기원이고, 가변 영역의 하나 이상의 프레임워크 영역이 인간 기원이며, 불변 영역이, 존재한다면, 인간 기원인 CDR 이식물(transplant). "인간화(humanization)"의 목표는 가능한 최대의 친화도를 유지하면서, 인체 내 비인간 기원 항체의 면역원성을 제거하는 것이다. 인간화를 위한 주형으로서 비인간 공급원 항체의 프레임워크 서열과 가장 유사한 인간 프레임워크 서열을 선택하는 것이 유리하다. 일부 경우에, 친화도의 손실을 피하기 위해 인간 프레임워크 서열 내 하나 이상의 아미노산을 비인간 작제물 내 상응하는 잔기로 대체하는 것이 필요할 수 있다.
용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 즉 매우 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이(예를 들어, 자연 돌연변이)를 제외하고 집단에 포함된 모든 단일 항체가 동일하다. 따라서, 용어 "단클론"은 해당 항체의 특성, 즉 관련 없는 항체들의 혼합물이 아님을 나타낸다. 일반적으로 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 단클론 항체 제제 내 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, 단클론 항체 제제는 일반적으로 다른 항체에 의해 오염되지 않는다는 이점이 있다. 용어 "단클론"은 임의의 특정 방법에 의해 상기 항체가 생산되는 것을 요구하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
항체는 종양-관련 펩티드 항원 표적(이 경우, PD-1)과 같은 표적 항원에 "특이적으로 결합하며", 즉 상기 항체가, 상기 항원을 발현시키는 세포 또는 조직을 표적화하는 치료제로 사용될 수 있도록 충분한 친화도로 상기 항원과 결합하고, 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않거나, 상기 언급된 표적 단백질의 동족체(homologue) 및 변이체(예를 들어, 돌연변이 형태, 스플라이스(splice) 변이체, 또는 단백질 가수분해 절단 형태) 외의 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는다.
용어 "결합 친화도"는 분자의 개별 결합 부위와 이의 결합 파트너 사이의 비-공유 상호작용의 합계 강도를 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "kon"은 항체가 항원에 결합하는 속도 상수(rate constant)를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "koff"는 항체가 항체/항원 복합체로부터 해리되는 속도 상수를 지칭한다. "KD", "결합 속도 상수 kon" 및 "해리 속도 상수 koff"는 분자(예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 친화도를 기술하기 위해 일반적으로 사용된다. 친화도, 즉 리간드가 특정 단백질에 결합하는 단단한 정도(tight degree). 결합 친화도는 수소 결합, 정전기 상호작용, 두 분자 사이의 소수성 및 반데르발스(van der Waals) 힘과 같은 비-공유 분자간 상호작용에 영향을 받는다. 또한, 리간드와 이의 표적 분자 사이의 결합 친화도는 다른 분자의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 ELISA를 포함하여, 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 분석될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질 결정인자 클러스터(protein determinant cluster)를 포함한다. 에피토프 결정인자 클러스터는 통상적으로 분자의 화학적 활성 표면 그룹(예를 들어, 아미노산, 당 측쇄, 또는 이들의 조합)으로 구성되고, 종종 특정 3차원 구조적 특징 및 특정 전하 특성을 가지고 있다.
용어 "단리된" 항체는 항체가 발현된 세포의 구성요소들로부터 식별 및 단리된 항체이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내부의 인시츄(in situ) 항체를 포함하며, 이때 상기 항체의 자연 환경에 있는 적어도 하나의 구성요소도 존재하지 않는다. 그러나 일반적으로, 단리된 항체는 적어도 한 번의 정제 단계를 거쳐 준비된다.
2개의 폴리펩티드들 또는 핵산 서열들 간의 "서열 동일성"은 상기 서열들 간에 동일한 잔기의 수를 전체 잔기 수의 백분율로 표시한 것이며, 비교되는 분자들 중 더 작은 분자의 크기를 기준으로 계산된다. 백분율 동일성(percentage identity)을 계산할 때, 정렬된 서열들은 서열들 간의 최대 매칭을 생성하는 방식으로 매칭되며, 매칭에서 갭(gap)(존재하는 경우)은 특정 알고리즘으로 해결된다. 두 서열들 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP, BLASTP, BLASTN 및 FASTA를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). 상기 절차는 국립 생물 정보 센터(International Center for Biotechnology Information, NCBI) 및 기타 출처로부터 공개적으로 이용할 수 있다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘도 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다. 천연 서열의 인간 FcR이 바람직하고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 이소형, 및 이들 수용체의 변이체를 포함하는, IgG 항체에 결합하는 수용체(감마 수용체)가 바람직하다. 다른 모든 FcR은 "FcR"이라는 용어에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG를 태아로 운반하는 역할을 하는 신생아 수용체(FcRn)를 포함한다(Guyer et al, Journal of Immunology 117: 587 (1976) and Kim et al, Journal of Immunology 24: 249 (1994)).
"FcRn"으로 약칭되는 용어 "신생아 Fc 수용체"는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합한다. 신생아 Fc 수용체(FcRn)는 생체 내에서 IgG 유사 항체의 대사 운명(metabolic fate)에 중요한 역할을 한다. FcRn은 리소좀 분해 경로에서 IgG를 구출하는 기능을 하여 혈청 내 제거율(clearance)을 줄이고, 이의 반감기를 연장시킨다. 따라서, IgG의 시험관내 FcRn 결합 성질/특성은 순환에서 이의 생체 내 약동학적 특성을 나타낸다.
용어 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체-의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체 하향-조절(예를 들어, B 세포 수용체) 및 B 세포 활성화가 포함된다.
용어 "이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현시키고, 이펙터 기능을 수행하는 세포를 지칭한다. 일 측면에서, 상기 이펙터 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 세포의 예로는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 자연 살해(natural killer, NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함된다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어, 혈액으로부터 단리될 수 있다. 이펙터 세포는 일반적으로 이펙터 단계(effector phase)와 관련된 림프구이고, 사이토카인을 생산하거나(헬퍼 T 세포), 병원체에 감염된 세포를 죽이거나(세포독성 T 세포) 항체를 분비하는(분화된 B 세포) 기능을 한다.
"면역 세포"는 조혈 기원을 갖고, 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 포함한다. 면역 세포에는 B 세포 및 T 세포와 같은 림프구; 자연 살해 세포; 및 골수 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구가 포함된다.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 분비된 Ig가 특정 세포독성 세포(예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 기재된 Fcγ 수용체에 결합하고, 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 후속적으로, 예를 들어, 세포독소를 사용하여 상기 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 형태를 지칭한다. 표적 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호(Presta)에 문서로 기록된 시험관내 ADCC 검정과 같은 시험관내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 사용하기 위한 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 지칭한다. 보체 활성화를 위한 고전적인 경로는 보체 시스템의 제1 구성요소(C1q)를, 상응하는 항원에 결합하는 항체(적절한 하위부류의 항체)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 문헌(참조: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202: 163 (1996))에 인용된 CDC 검정과 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 WO1999/51642에는 Fc 영역의 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드 변이체(변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 C1q 결합이 향상되거나 감소된 폴리펩티드 변이체가 기재되어 있다.
본 발명의 항체의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열
본 발명은 재조합 인간 VEGF165 단백질을 이용하여 토끼를 면역화시킨 후 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝을 통해 재조합 인간 VEGF165 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 클론 VEGF-R859, VEGF-R988, VEGF-R613 및 VEGF-R812를 얻었다. 이어서, VEGFR2-MK19 scFv 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 토끼 IgG1 불변 영역 또는 토끼 카파 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지닌 pSTEP2 벡터 내로 PCR을 통해 삽입하고, 발현을 위해 배양했다. 고순도 항체를 단백질 A 정제 컬럼을 사용하여 정제했다. ELISA에서는, 상기 토끼 항체가 VEGFR2 단백질에 대한 VEGF165 단백질의 결합을 차단할 수 있고, VEGF-R988 및 VEGF-R613이 HUVEC 증식을 촉진하는 VEGF165의 능력을 효과적으로 감소시킬 수 있고, VEGF-R988이 더 높은 최대 억제율을 나타냈음을 보여준다.
이어서, 인간화 CDR 이식을 위한 고전적인 방법을 사용하여, 서열이 토끼 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 서열에 더 가까운 인간 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 주형으로 선택하고, 인간화 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 서열은 토끼 항체 경쇄 또는 중쇄의 3개의 CDR(표 1) 각각을 상기 인간 항체의 가변 영역 내로 삽입함으로써 얻어졌다. 토끼 프레임워크 영역의 핵심 부위는 CDR 활성의 안정성을 유지하는 데 필수적이기 때문에, 핵심 부위는 토끼 항체의 상응하는 서열로 역돌연변이(reverse-mutated)되었다. VEGF-H988-10 경쇄/중쇄 발현 벡터를 전체 유전자 합성으로 수득하고, HEK-293 세포에 형질감염시키고, 발현을 위해 배양하고, 배양 상청액을 단백질 A 정제 컬럼을 이용하여 정제하여 고순도 항체를 얻었다. VEGF-H988-10의 친화도를 향상시키기 위해, 중쇄 및 경쇄 가변 영역(LCDR1, LCDR3, HCDR2, 및 HCDR3 포함)의 CDR 영역의 SDM 라이브러리를 구축하고, 4개의 돌연변이 라이브러리를 scFv 형태로 구축하고, svFv-gIII 융합 단백질로서 파지 벡터에 클로닝하고; 각 CDR에 대해, 가용성 항원 VEGF에 대한 최적의 결합 능력을 갖는 CDR 클론을 스크리닝하고, 최종적으로 최적화된 CDR 친화도 및 안정성을 갖는 항체 VEGF-H988을 얻었다.
본 발명의 핵산
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자의 서열은 서열 번호: 11, 19-20, 23-24, 43-51 및 53-54를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 핵산 분자는 본원에 개시된 서열에 제한되지 않으며, 이의 변이체도 포함한다. 본 발명의 변이체는 혼성화(hybridization)에서 이의 물리적 특성과 관련하여 설명될 수 있다. 핵산 혼성화 기술을 사용하여, 핵산이 이의 보체뿐만 아니라 이의 등가물 또는 동족체를 식별하는 데 사용될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 혼성화가 100% 미만의 상보성으로 발생할 수 있음이 또한 인식될 것이다. 하지만, 적절한 조건이 선택된다면, 혼성화 기술은 특정 프로브에 대한 DNA 서열의 구조적 관련성에 기초하여 상기 DNA 서열을 구별하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조건에 대한 지침은 문헌(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 and Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., &Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)을 참조한다.
재조합 벡터 및 발현
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 작제물을 제공한다. 본 발명의 재조합 작제물은 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자를 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터 내로 삽입함으로써 구축된다.
본원에 제공된 항체는 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄 또는 이의 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 재조합적으로 발현시켜 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포를 경쇄 및/또는 중쇄 또는 이의 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시켜 상기 경쇄 및 중쇄가 상기 숙주 세포에 발현될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법은 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이러한 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 통합시키고, 상기 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는데 사용된다(예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 Boss 등의 미국 특허 제4,816,397호에 기록된 것).
적합한 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는 박테리아이고, 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 또는 포유류 세포이다. 조절 서열(regulatory sequence)의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준, 및 발현이 구성적(constitutive)인지 유도성(inducible)인지와 같은 여러 요인에 의해 결정된다는 것을 이해해야 한다.
박테리아 발현
원하는 항체를 인코딩하는 구조적 DNA 서열을, 적절한 번역 개시 및 종결 신호 및 기능적 프로모터와 함께 작동가능한 판독 프레임 내로 삽입함으로써, 박테리아에서 사용하기 위한 발현 벡터가 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고 필요에 따라 숙주에서 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선별 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 여러 종의 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 뿐만 아니라 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)를 포함한다.
박테리아 벡터는, 예를 들어, 파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반일 수 있다. 이러한 벡터는, 일반적으로 잘 알려진 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 요소들을 포함하는 상업적으로 이용가능한 플라스미드에서 유래된 선별 마커 및 박테리아 복제 기점을 포함할 수 있다. 적절한 숙주 균주를 형질전환시키고, 숙주 균주를 적절한 세포 밀도로 성장시킨 후, 선택된 프로모터를 적절한 방법(예를 들어, 온도 변화 또는 화학적 유도)으로 활성화(de-repressed)/유도하고, 세포를 추가 시간 동안 배양한다. 세포는 일반적으로 원심분리에 의해 수거되고, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 파괴되며, 생성된 조 추출물은 추가 정제를 위해 보유된다.
박테리아 시스템에서, 발현된 단백질의 의도된 용도에 따라 다양한 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 생산을 위해 또는 펩티드 라이브러리 스크리닝을 위해 이러한 단백질을 대량으로 생산해야 하는 경우, 예를 들어, 쉽게 정제될 수 있도록 융합 단백질 생성물의 고수준 발현을 지시하는 벡터가 필요할 수 있다.
포유류 발현 및 정제
포유류 숙주 세포에서의 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40(SV40)의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스의 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter, AdMLP)) 및 폴리오마 바이러스의 프로모터 및/또는 인핸서와 같은, 포유류 세포에서 고수준 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소들을 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그 서열에 대한 추가 설명은, 예를 들어, Stinski의 US5,168,062, Bell 등의 U.S. 4,510,245, 및 Schaffner 등의 U.S. 4,968,615를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 또한 복제 기점 및 선별 마커를 포함할 수 있다(참조: 예를 들어, Axel 등의 U.S. 4,399,216, U.S. 4,634,665 및 U.S. 5,179,017). 적합한 선별 마커에는 벡터가 도입된 숙주 세포에, G418, 하이그로마이신(hygromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다. 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 반면, neo 유전자는 G418에 대한 내성을 부여한다.
숙주 세포 내로 발현 벡터의 형질감염은 전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염과 같은 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 제공된 항체의 발현에 적합한 포유류 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함, 예를 들어, R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621에 기재된 바와 같이 DHFR 선별 마커가 사용됨], NSO 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2 세포가 포함된다.
본 발명의 항체는 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있으며, 상기 공지된 방법에는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 친화성 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 및 렉틴(lectin) 크로마토그래피가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")도 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각 전문이 본원에 참조로 포함된, 문헌(참조: Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 및 10)을 참조한다.
본 발명의 항체의 특징 및 기능
본 발명의 인간화 항체 VEGF-H988의 특성 분석 및 기능 분석을 수행하였다. 분석 결과, 본 발명의 항체는 다음과 같은 이점을 갖는다는 것을 보여주었다: (1) VEGF-H988이 VEGF165 단백질에 결합하는 능력은 아바스틴보다 약간 우수하고; (2) 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 VEGF165-H988의 결합 친화도는 아바스틴의 결합 친화도보다 약간 높고, 이는 아바스틴의 약 1.5배이고; (3) VEGF165-H988은 재조합 인간 VEGF165 단백질에 특이적으로 결합하고, 재조합 마우스 mVEGF164 단백질에 교차 결합하고; (4) 항체 VEGF-H988은 VEGF165 단백질에 대한 VEGFR2 단백질의 결합을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이의 억제 능력은 EYLEA보다 약하지만, 아바스틴보다 우수하고; (5) 항체 VEGF-H988은 HUVEC 증식을 촉진하는 VEGF165의 능력을 효과적으로 감소시킬 수 있으며; (6) 항체 VEGF-H988은 HUVEC 세포에 동시에 작용하는 VEGF의 상이한 이소형(VEGF165, VEGFC, VEGFD)의 경우에 아바스틴보다 더 강한 중화 효과가 있고; (7) 마우스에서 반복된 약물 투여 독성 시험 결과, 항체 VEGF-H988에 의해 유의한 약물 관련 독성 반응이 관찰되지 않았음을 보여주었고; (8) HCT-116 이종이식 종양 모델의 종양 억제 시험 결과, VEGF-H988이 아바스틴보다 종양 억제에 더 우수한 효과가 있음을 보여주었다.
용도
본 발명의 항체는 결장직장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 상기 질환의 치료를 위한 의약을 제조하는데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 항체는 본 발명의 항체 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 형성하기 위해 적어도 하나의 기타 작용제(예를 들어, 안정한 화합물)와 함께 준비될 수 있다. 선택적으로, 약제학적 조성물은 추가 치료제를 포함할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 패키지 및 키트에 관한 것으로, 상기 용기는 전술한 본 발명의 약제학적 조성물을 함유한다. 이러한 용기에는, 의약품(drug product) 또는 생물학적 제제(biological product)의 제조, 사용 또는 유통을 관장하는 정부 기관에서 규정한 형태의 설명서(specification)가 수반될 수 있으며, 상기 설명서는 상기 제품이 제조, 사용 또는 유통되는 기관에 의한 인체 투여에 대한 승인을 반영한다.
제조 및 보관
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 향정(pastille) 제조, 분쇄, 유화, 캡슐화, 포매 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다.
허용되는 담체로 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 미리 제조한 후, 이를 적절한 용기에 넣고, 지시된 상태의 치료를 위해 라벨링할 수 있다. 이러한 라벨링에는 약물의 투여량, 투여 빈도, 및 투여 경로가 포함될 것이다.
배합물
상기 기재된 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 항신생물제(antineoplastic agent)와 같은 하나 이상의 다른 치료제와 배합되며, 수득된 배합물은 허용되지 않는 역효과를 일으키지 않는다.
하기 실시예는 본 발명의 더 나은 이해를 용이하게 하지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 실시예의 실험 방법은, 달리 명시되지 않는 한, 모두 통상적인 방법이다. 하기 실시예에 사용된 실험 재료는, 달리 명시되지 않는 한, 통상적인 생화학 시약 판매점에서 구입하였다.
실시예
실시예 1: 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 VEGFR1/VEGFR2에 대한 VEGF165의 결합을 차단하는 토끼 항체의 스크리닝
1.1 토끼의 면역화
재조합 인간 VEGF165 단백질(Sino Biological, Inc, Cat. 11066-HNAH)을 사용하여 토끼를 면역화시켰다. 인간 VEGF165 단백질(UniProt P15692-4)의 세포외 영역 Met1-Arg191의 아미노산 서열은 서열 번호: 1이다.
자세한 방법은 다음과 같았다: 재조합 인간 VEGF165 단백질을 프로인트 애쥬번트(Freund's adjuvant)와 혼합하고, 토끼를 매번 500 μg의 용량으로 각각 3주, 2주 및 2주 간격으로 4회 상기 혼합물로 피하 면역화시켰다. 4차 면역화부터, 면역화 후 4일째에 눈의 내안각 신경총(medial canthal plexus)을 통해 혈액을 채취했다. 토끼 항-VEGF165의 혈청 역가는 코팅된 재조합 인간 VEGF165 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 5차 면역화 후 혈청의 역가는 1:250000에 이르렀고, 5차 면역화 후 9주째에 25 μg의 재조합 인간 VEGF165 단백질을 토끼에게 정맥내 추가접종(boost)했다. 7일 후, 마우스를 죽이고, 비장 조직을 제거하고, 액체 질소에서 동결시켰다.
1.2 항체 파지-디스플레이 라이브러리의 스크리닝
TriPure 단리 시약(Roche, Cat. No.11 667 165 001)을 사용하여 토끼 비장 조직에서 RNA를 추출하고, 역전사 키트(Invitrogen Cat.No.18080-051)를 사용하여 RNA를 역전사하여 cDNA를 얻었다. 10쌍의 프라이머는 토끼 항체의 경쇄 가변 영역의 서열을 증폭하도록 설계되었고, 4쌍의 프라이머는 중쇄 가변 영역의 서열을 증폭하도록 설계되었다(Barbas C F et al., CSHL Press. 2004). 토끼 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 중첩 확장 PCR(overlapping extension PCR)에 의해 scFv를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 조립하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 하기 링커로 연결했다(Jones S T et al., Bio/technology. 1991; 9(1): 88):
TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC (SSGGGGSGGGGGGSSRSS)(서열 번호: 2);
제한 엔도뉴클레아제 Sfi I(Fermentas 유래)에 의해 파지 벡터 pComb3x(Sino Biological, Inc.)에 효소적으로 결찰시킨 다음, 적격 X-Blue로 전기형질전환(electrotransform)시켜 토끼 파지-디스플레이 scFv 항체 라이브러리를 구축했다. 재조합 인간 VEGF165 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 항-VEGF165 양성 항체가 풍부한 파지 라이브러리를 파지 항체 패닝 절차(O'Brien, PM, & Aitken, R. (Eds.), Springer Science & Business Media. 2002; ISBN: 9780896037113)의 절차에 따라 스크리닝했다. 발현을 위해 농축된 라이브러리로부터 단일 콜로니 파지를 선별하고, 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 이의 결합을 ELISA로 검출하였다. 재조합 인간 VEGF165에 특이적으로 결합하는 scFv 항체 클론을 선별하여 항체의 뉴클레오티드 서열을 얻기 위한 시퀀싱을 위해 시퀀싱 서비스 회사에 보냈으며, 이때 여러 scFv 항체 클론은 실시예 1.3에 기재된 방법에 의해 VEGF-R859, VEGF-R988, VEGF-R613, VEGF-R812로 유도되었다. scFV 항체 클론의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6이다.
1.3 VEGF165를 표적으로 하는 토끼 항체의 생산
VEGF-R988을 예로 들면, VEGF-R988의 scFv 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 PCR 증폭하고, 주입(in-fusion) 방법에 의해 중쇄 신호 펩티드(서열 번호: 45) 및 토끼 IgG1 불변 영역(서열 번호: 9)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 Sca I + Kpn I (Fermentas) 절단 pSTEP2 벡터 내로 삽입하여 중쇄(서열 번호: 53) 발현 벡터를 얻었다. VEGF-R988의 scFv 항체의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 PCR 증폭하고, 주입 방법에 의해 경쇄 신호 펩티드(서열 번호: 46) 및 토끼 카파 불변 영역(서열 번호: 10)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 Sca I + BamH I (Fermentas) 절단 pSTEP2 벡터 내로 삽입하여 경쇄(서열 번호: 54) 발현 벡터를 얻었다. 재조합 플라스미드를 추출하고, HEK-293 세포에 형질감염시키고, 7일 동안 발현을 위해 배양하고, 배양 상청액을 단백질 A 정제 컬럼으로 정제하여 고순도 항체를 얻었다.
중쇄 가변 영역의 증폭을 위한 프라이머:
Figure pct00001
경쇄 가변 영역의 증폭을 위한 프라이머:
Figure pct00002
1.4 VEGF165를 표적으로 하는 토끼 항체의 기능 분석
1.4.1 토끼 항체는 VEGF165가 VEGFR2-his에 결합하는 것을 차단한다
1 μg/mL 농도의 VEGF165 단백질(SinoBiological, Inc.)을 96웰 플레이트 상에 100 μL/웰로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음날 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단했다. 5 μg/mL VEGFR2-비오틴 단백질(SinoBiological, Inc.) 100 μL 및 상이한 농도의 VEGF165를 표적으로 하는 상기 토끼 항체를 첨가하고, 동시에 인큐베이션했다. 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 스트렙트아비딘(Streptavidin)/HRP(Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.)와 함께 인큐베이션한 다음 반복하여 세척하고, 발색을 위해 발색 기질 용액을 첨가했다. OD450은 발색이 끝난 후에 측정되었다. VEGF165를 표적으로 하는 토끼 항체의 농도를 가로 좌표로, 억제율 PI%를 세로 좌표로 하여, 데이터 분석에 graphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 곡선 차트를 생성했다. 억제율(%) = (OD블랭크 - OD샘플)/ OD블랭크 Х 100%, 이때 OD블랭크는 VEGFR2-비오틴만 첨가되고, 토끼 항체가 없는 웰의 OD 값을 나타내고, OD샘플은 VEGFR2-비오틴 및 토끼 항체가 모두 첨가된 웰의 OD 값을 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, VEGFR2 단백질은 코팅된 VEGF165 단백질에 효과적으로 결합할 수 있고, VEGF-R859, VEGF-R988, VEGF-R613, 및 VEGF-R812의 토끼 항체는 VEGFR2 단백질에 대한 VEGFR165 단백질의 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
항체는 제대 정맥 내피세포에 대한 VEGF 165의 증식 효과를 억제한다
1.4.2 토끼 항체는 HUVEC의 증식을 억제한다
VEGF 165로 유도된 제대 정맥 내피세포 증식을 중화하는 상기 토끼 항체의 효과를 WST-8 방법을 사용하여 검출했다. 인간 제대 정맥 내피세포 HUVEC를 96웰 플레이트에 4Х103 세포/웰로 접종하고, 10% FBS 및 5% L-Gln을 함유하는 M199 배지에서 4시간 동안 배양한 다음, 상이한 농도의 토끼 항체를 50 μL/웰로 첨가한 다음, 10 ng/mL의 최종 농도로 VEGF-165를 10 μL/웰로 첨가하고, 96웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 세포 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하고, 블랭크 웰 B(세포 없음), 음성 대조군 M(세포 접종, 항체 샘플 없음, VEGF-165 첨가) 및 M'(세포 접종, 항체 샘플 없음, VEGF-165 없음)를 사용했다. 인큐베이션 후, 10 μL/웰의 WST-8 발색 용액을 첨가하고, 발색을 위해 96웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 발색이 안정화된 후 마이크로플레이트 판독기로 OD450과 OD630을 측정했다. 각 웰에 대해, 판독값은 (OD450 - OD630)이었고, 각 그룹에 대한 OD 값을 그룹의 판독값에서 블랭크 웰 B의 판독값을 뺀 값으로 정의하여 항체의 중화율을 계산하였다, 중화율% = (음성 대조군 M의 OD 값 - 샘플의 OD 값) / (음성 대조군 M의 OD 값 - M'의 OD 값) Х 100%. 항체 샘플 농도를 가로 좌표로, 중화율을 세로 좌표로 하여, 통계 소프트웨어 GraphPad Prism의 자동 분석 기능을 사용하여 표준 곡선을 계산하고, 4-파라미터 로지스틱 회귀 방정식을 사용하여 표준 "S" 곡선을 피팅하여 항체 샘플의 반최대 유효 농도(half maximal effective concentration, EC50)를 계산했다.
도 2에 나타낸 결과는, VEGF-R988 및 VEGF-R613이 VEGF165의 HUVEC 증식 촉진 능력을 효과적으로 감소시키고, VEGF-R988이 더 높은 최대 억제율을 나타내고, VEGF-R812는 기본적으로 억제 능력이 없는 한편, VEGF-R859는 억제 능력이 전혀 없음을 보여준다.
실시예 2: 토끼 항체 VEGF-R988의 인간화, 변형 및 생산
실시예 1의 토끼 항체의 기능 분석 결과를 바탕으로 VEGF-R988을 인간화 및 생산을 위해 선택했다.
2.1 토끼 항체 VEGF-R988의 경쇄 및 중쇄의 CDR 결정
실시예 1.2에서 결정된 VEGF-R988 scFv 항체의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여, VEGF-R988 scFv의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 추론하였다(서열 번호: 11/12 참조).
Kabat 지수 및 IMGT 넘버링 시스템을 참조하여, 토끼 항체 VEGF-R988-scFv의 경쇄 및 중쇄의 3개 CDR 각각의 아미노산 서열을 결정했다(표 1 참조). 전술한 경쇄 및 중쇄의 각각의 3개의 CDR을 후속 단계에서 인간화 항체 VEGF-R988-scFv에 이식했다(실시예 2.2 참조).
Figure pct00003
2.2 토끼 항체 VEGF-R988의 CDR 이식
CDR 이식의 고전적인 인간화 방법을 사용하여 토끼 항체의 인간화를 수행했다. 서열이 토끼 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 서열에 가까운 인간 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 주형으로 선택하고, 토끼 경쇄 또는 중쇄의 CDR(표 1) 3개를 각각 인간 항체의 가변 영역 내로 삽입하여 인간화 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 각각 수득했다. VEGF-R988의 경쇄 가변 영역에 대한 인간 주형은 IGKV1-27*01이며, 이는 VEGF-R988의 경쇄와 65.30% 상동성이며, 중쇄 가변 영역에 대한 인간 주형은 IGHV4-4*08이며, 이는 VEGF-R988의 중쇄와 53.20% 상동성이다.
2.3 인간화 가변 영역의 프레임워크 영역에서의 역돌연변이
토끼 유래 프레임워크 영역의 일부 핵심 아미노산은 CDR 활성을 유지하는 데 필수적이므로, 핵심 아미노산을 상응하는 토끼 항체 아미노산 서열로 역돌연변이시켰으며, 다음 부위가 역돌연변이되었다: 경쇄에서, 위치 1은 E로 역돌연변이되고, 위치 2는 L로 역돌연변이되고, 위치 4는 L로 역돌연변이되고, 위치 63은 K로 역돌연변이되었고; 반면 중쇄에서, 위치 3은 V로 역돌연변이되고, 위치 37은 V로 역돌연변이되고, 위치 47은 Y로 역돌연변이되고, 위치 78은 V로 역돌연변이되고, 위치 79는 D로 역돌연변이되고, 위치 91은 F로 역돌연변이되었으며; 상기 모든 부위는 Kabat 넘버링 체계를 참조하여 넘버링되었다. 인간화 항체 VEGF-H988-10은 CDR 인간화 이식 및 프레임워크 영역 역돌연변이에 의해 얻어졌다.
2.4 인간화 단클론 항체 VEGF-H988-10의 생산 및 CDR 친화성 변형
VEGF-H988-10 중쇄 가변 영역(서열 번호: 23)을 전체 유전자 합성 방법으로 획득한 후, 주입 방법에 의해, 중쇄 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 45) 및 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 49)을 보유하는 Sca I + Nhe I (Fermentas) 절단 pSTEP2 벡터 내로 삽입하여 VEGF-H988-10 중쇄(서열 번호: 19) 발현 벡터를 얻었다. VEGF-H988-10 경쇄 가변 영역(서열 번호: 24)을 전체 유전자 합성 방법으로 획득한 후, 주입 방법에 의해, 경쇄 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 46) 및 인간 카파 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 50)을 보유하는 Sca I + BsiW I (Fermentas) 절단 pSTEP2 벡터 내로 삽입하여 VEGF-H988-10 경쇄(서열 번호: 20) 발현 벡터를 얻었다. 플라스미드를 추출하고, HEK-293 세포에 공동 형질감염시키고, 세포를 7일 동안 배양했다. 배양 상청액을 단백질 A 정제 컬럼으로 정제하여 고순도 항체를 얻었다.
중쇄 가변 영역의 전체 유전자 합성을 위한 프라이머
Figure pct00004
경쇄 가변 영역의 전체 유전자 합성을 위한 프라이머
Figure pct00005
VEGF-H988-10의 친화성을 향상시키기 위해, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR 영역의 SDM 라이브러리(LCDR1, LCDR3, 및 HCDR2의 3개의 포화 돌연변이 라이브러리 포함)를 구축하고; 한편, 항체의 화학적 안정성을 향상시키기 위해, 탈아미드화(deamidation) 또는 이성질화(isomerization)될 수 있는 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 변형시켜야 한다. 아스파라긴의 탈아미드화는 예를 들어 NG, NS, NA, NT 등에서 발생할 수 있으며, 이는 항체의 안정성 또는 생물학적 기능에 영향을 미치는 이소아스파르트산 잔기의 생성을 유도한다. VEGF-H988 가변 영역 HCDR3은 (a) 탈아미드화에 민감한 부위(들)를 가지므로, 항체의 화학적 안정성 및 생물학적 기능을 향상시키기 위해 SDM 라이브러리를 구축했다. 상기 4개의 돌연변이 라이브러리는 scFv 형태로 구축되었고, scFv-gIII 융합 단백질로서 파지 벡터 내로 클로닝되었으며; 각 CDR에 대해, 가용성 항원 VEGF에 대한 최적의 결합 능력을 갖는 CDR 클론을 스크리닝하고, 최종적으로 최적화된 CDR 친화도 및 안정성을 갖는 항체 VEGF-H988을 얻었다. VEGF-H988 경쇄 및 중쇄 CDR의 서열을 표 2에 나타냈다.
Figure pct00006
2.5 인간화 단클론 항체 VEGF-H988의 생산
순차적으로 연결된 경쇄 신호 펩티드(서열 번호: 46), 인간화 항체 경쇄 가변 영역(서열 번호: 48) 및 인간 항체 카파 경쇄 불변 영역(서열 번호: 50)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 전술한 항체 VEGF-H988 경쇄 및 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 44)을 PCR 증폭하고, 자체 개발한 pGS 벡터(Kpn I+Xba I)에 주입 방법으로 삽입하고, 시퀀싱을 통해 올바른 플라스미드를 확인했다. 순차적으로 연결된 중쇄 신호 펩티드(서열 번호: 45), 인간화 항체 중쇄 가변 영역(서열 번호: 47) 및 인간 항체 카파 중쇄 불변 영역(서열 번호: 49)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 전술한 항체 VEGF-H988 중쇄 및 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 43)을 PCR 증폭하고, 주입 방법으로 경쇄를 정확하게 함유하는 것으로 확인된 pGS 벡터(Nhe I+Not I)에 삽입하고, 시퀀싱을 통해 VEGF-R988의 경쇄와 중쇄를 모두 발현시키는 올바른 벡터를 확인했다. 이러한 발현 벡터는 선별 마커로서 GS 유전자 및 항체 경쇄 및 중쇄의 발현 요소를 함유하는 진핵 발현 벡터이다. 이러한 발현 벡터를 CHO-K1-GS-결핍 세포에 형질감염시키고, MSX 스크리닝에 의해 VEGF-H988 고발현 세포주를 얻었다. ELISA 검정에 의해 항체 발현이 높은 클론을 선별했고, 세포 성장 상태와 항체 약물의 주요 품질 특징을 모두 고려하여 고발현 세포주를 선별했다. 무혈청 현탁 배양을 사용하여 VEGF-H988 생산 CHO 세포주를 배양하여 고순도 및 품질의 VEGF-H988 항체를 얻었다.
실시예 3: 인간화 항체 VEGF-H988의 특성 분석
3.1 VEGF165에 결합하는 인간화 항체 VEGF-H988의 특성 분석
3.1.1 인간화 항체 VEGF-H988은 VEGF165에 특이적으로 결합한다
다양한 농도(0.15ng/mL, 0.46 ng/mL, 1.37 ng/mL, 4.12ng/mL, 12.35 ng/mL, 37.04 ng/mL, 111.11 ng/mL, 333.33 ng/mL, 1000 ng/mL 및 3000 ng/mL)의 재조합 인간 VEGF165 단백질(SinoBiological, Inc.)을 96웰 플레이트에 100 μL/웰로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음날 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단했다. 각각 100 μL의 1 g/mL VEGF165-H988, 아바스틴(Roche) 또는 음성 대조군 항체 H7N9-R1과 함께 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한 다음, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG F(ab')2/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)와 함께 인큐베이션하고, 반복하여 세척하고, 발색을 위해 발색 기질 용액을 첨가했다. OD450은 발색이 끝난 후에 측정되었다. 재조합 인간 VEGF165 단백질의 농도를 가로 좌표로, OD450 값을 세로 좌표로 하여, "S" 곡선 차트를 피팅하기 위해 graphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하고, 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 항체의 결합을 분석했다.
도 3에 나타낸 결과는, 재조합 인간 VEGF165에 특이적으로 결합하는 인간화 분자 VEGF165-H988의 EC50 값이 2.42 ng/mL, R2 = 0.999이고; 재조합 인간 VEGF165에 결합하는 아바스틴의 EC50 값은 2.77 ng/mL, R2 = 1.000임을 입증한다. 이는 VEGF165-H988이 재조합 인간 VEGF165 단백질에 결합하는 능력이 아바스틴보다 약간 더 우수함을 나타낸다. 음성 대조군 항체 H7N9-R1은 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 결합 능력이 없다.
3.1.2 재조합 VEGF165 단백질에 대한 인간화 항체 VEGF-H988의 결합 친화도 검정
VEGF165-H988과 아바스틴(Roche)의 친화도는 스트렙트아비딘-코팅된 센서와 고정된 비오틴-표지된 VEGF165 단백질을 사용하여 여러 농도에서 측정되었다.
재조합 인간 VEGF165 단백질은 다음 과정에 따라 1:2의 몰비로 비오틴으로 먼저 표지되었다: 재조합 VEGF 단백질 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0)을 5000 MW 한외여과 원심관에서 한외여과를 통해 PBS로 교체하고, UV 정량화에 의해 측정된 바와 같이 567.57 μg의 단백질을 얻었고, 수득된 단백질을 암실 실온에서 30분 동안 인큐베이션하는 동안 20 mM 비오틴 용액과 1:2 몰비로 혼합한 후, 5000 MW 한외여과 원심관에서 다시 여과하여 표지되지 않은 비오틴을 제거했다. UV 정량화 후, 동일한 부피의 글리세롤과 최종 농도 0.1% BSA를 첨가하여 비오틴-표지된 단백질을 얻었다. VEGF165 단백질의 농도는 UV에 의해 검출된 2.08 mg/mL이었다.
이어서 비오틴화된 재조합 인간 VEGF 단백질에 대한 다양한 농도의 VEGF165-H988 및 아바스틴의 친화도를 측정하고, 얻어진 KD 값이 최종 친화도였다.
표 3에 나타난 결과는, 표 3에 나와 있는 바와 같이, 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 VEGF165-H988의 결합 친화도 KD 값이 19.5 pM이고, 결합 상수 kon 값이 3.44E+05 M-1s-1이고, 해리 상수 kdis 값이 6.70E-06 s-1이고; VEGF 단백질에 대한 아바스틴의 결합 친화도 KD 값은 29.2E-11 pM이고, 결합 상수 kon 값은 1.87E+05 M-1s-1이고, 해리 상수 kdis 값은 5.46E-06 s-1이었음을 입증한다. 그 결과, VEGF165-H988의 친화도가 아바스틴보다 약간 높으며, 즉 아바스틴의 친화도보다 약 1.5배 높은 것으로 결론지을 수 있다.
Figure pct00007
3.1.3 인간화 항체 VEGF165-H988의 종 교차 반응성 측정
재조합 인간 VEGF165 단백질 또는 재조합 마우스 mVEGF164 단백질을 각각 0.1 μg/mL, 1 μg/mL 및 10 μg/mL로 희석하고, 96웰 플레이트 상에 100 μL/웰로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음날 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단했다. 100 μL의 VEGF165-H988, 아바스틴(Roche) 또는 음성 대조군 항체 H7N9-R1을 각각 1 μg/mL의 농도로 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션했다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척했다. 플레이트를 염소 F(ab')2 항인간 IgG F(ab')2/HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)와 함께 인큐베이션한 후 반복하여 세척하고, 발색을 위해 발색 기질 용액을 첨가했다. OD450은 발색이 끝난 후에 측정되었다. 단백질 농도를 가로 좌표로, OD450 값을 세로 좌표로 하여, graphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 막대 차트를 생성했다.
도 4에 나타낸 결과는 VEGF165-H988이 재조합 인간 VEGF165 단백질에 특이적으로 결합하고, 재조합 마우스 mVEGF164 단백질과 교차 결합을 나타낸다는 것을 입증한다.
3.2 인간화 항체 VEGF-H988의 수용체 차단 특성
1 μg/mL 농도의 VEGF165 단백질(SinoBiological, Inc.)을 96웰 플레이트 상에 100 μL/웰로 4℃에서 밤새 코팅했다. 다음날 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단했다. 2 μg/mL VEGFR2-his 단백질(SinoBiological, Inc.) 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 상이한 농도의 항체 VEGF-H988, EYLEA, 아바스틴(Roche) 또는 음성 대조군 항체 H7N9-R1을 각각 첨가하고, 동시에 인큐베이션했다. 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거했다. 플레이트를 C-his-R023/HRP와 함께 인큐베이션한 후 반복하여 세척하고, 발색을 위해 발색 기질 용액을 첨가했다. OD450은 발색이 안정화된 후 측정하였고, 각 그룹은 2회씩 시험하였다. 항체의 농도를 가로 좌표로, 억제율 PI%를 세로 좌표로 하여, 데이터 분석에 graphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하고, IC50 값을 계산하기 위한 곡선 차트를 생성했다. 억제율(%) = (OD블랭크 - OD샘플)/ OD블랭크Х 100%, 이때 OD블랭크는 VEGFR2-his만 첨가되고 인간화 항체가 첨가되지 않은 웰의 OD 값을 나타내고, OD샘플은 VEGFR2-his 및 인간화 항체가 둘 다 첨가된 웰의 OD 값을 나타낸다.
도 5에 나타낸 바와 같이, VEGFR2 단백질은 코팅된 VEGF165 단백질에 효과적으로 결합할 수 있고, 항체 VEGF-H988은 EYLEA보다는 상대적으로 약하지만 아바스틴보다는 큰 억제 능력으로 VEGFR2 단백질이 VEGFR165 단백질에 결합하는 것을 효과적으로 억제할 수 있으며, 음성 대조군 항체는 억제 효과가 없다.
3.3 인간화 항체에 의한 HUVEC 세포의 증식 억제
3.3.1 인간화 항체 VEGF-H988에 의한 상이한 농도의 VEGF165의 중화 효과
VEGF-H988이 VEGF 165로 유도된 HUVEC 세포 증식을 중화하는 효과를 WST-8 방법을 사용하여 검출했다. HUVEC 세포를 96웰 플레이트에 4Х103 세포/웰로 접종하고, 10% FBS 및 5% L-Gln을 함유하는 M199 배지에서 4시간 동안 배양한 다음, 상이한 농도의 VEGF-H988, EYLEA 또는 아바스틴(Roche)을 50 μL/웰로 첨가한 다음, 최종 농도 1000 ng/mL, 100 ng/mL 또는 10 ng/mL의 VEGF-165를 10 μL/웰로 첨가하고, 96웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 세포 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하고, 블랭크 웰 B(세포 없음), 음성 대조군 M(세포 접종, 항체 샘플 미첨가, VEGF-165 첨가) 및 M'(세포 접종, 항체 샘플 미첨가 및 VEGF-165 미첨가)를 사용했다. 인큐베이션 후, 10 μL/웰의 WST-8 발색 용액을 첨가하고, 발색을 위해 96웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 발색이 안정화된 후 마이크로플레이트 판독기로 OD450과 OD630을 측정했다. 각 웰에 대해, 판독값은 (OD450 - OD630)이었고, 각 그룹에 대한 OD 값을 그룹의 판독값에서 블랭크 웰 B의 판독값을 뺀 값으로 정의하여 항체의 중화율을 계산하였다, 중화율% = (음성 대조군 M의 OD 값 - 샘플의 OD 값) / (음성 대조군 M의 OD 값 - M'의 OD 값) Х 100%. 항체 샘플 농도를 가로 좌표로, 중화율을 세로 좌표로 하여, 통계 소프트웨어 GraphPad Prism의 자동 분석 기능을 사용하여 표준 곡선을 계산하고, 4-파라미터 로지스틱 회귀 방정식을 사용하여 표준 "S" 곡선을 피팅하여 항체 샘플의 반최대 유효 농도(EC50)를 계산했다.
도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 항체 VEGF-H988은 HUVEC 증식을 촉진하는 VEGF165의 능력을 효과적으로 감소시킬 수 있다. VEGF-H988의 중화 능력은 다양한 농도의 재조합 인간 VEGF165에서 EYLEA 및 아바스틴보다 강력했고; 중화 능력의 차이는 VEGF165의 농도가 높아질수록 더 강하게 나타났다. VEGF-H988은, VEGF165 농도가 높은 조건 하에, 중화 EC50이 여전히 낮고, 최대 중화율을 계속 유지할 수 있는 반면, EYLEA와 아바스틴의 중화 EC50은 점차 증가하고, 최대 중화율의 감소를 동반했다. 다양한 농도의 VEGF165를 중화하는 각 항체의 반최대 유효 농도(EC50) 및 최대 중화율은 표 4에 요약되어 있다.
Figure pct00008
3.3.2 인간화 항체 VEGF-H988에 의한 VEGF의 다른 아형의 중화 효과
WST-8 방법을 사용하여 VEGF-H988이 다른 아형의 VEGF(VEGF165, VEGFC 및 VEGFD)로 유도된 HUVEC 세포 증식을 중화하는 효과를 검출했다. HUVEC 세포를 96웰 플레이트에 4Х103 세포/웰로 접종하고, 10% FBS 및 5% L-Gln을 함유하는 M199 배지에서 4시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 VEGF-H988 또는 아바스틴(Roche)을 50 μL/웰로 첨가한 다음, VEGF-165, VEGFC 및 VEGFD 혼합물(최종 농도는 각각 25 ng/mL, 1000 ng/mL, 6000 ng/mL임)을 10 μL/웰로 첨가하고, 96웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 세포 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하고, 블랭크 웰 B(세포 없음), 음성 대조군 M(세포 접종, 항체 샘플 미첨가, VEGF 첨가) 및 M'(세포 접종, 항체 샘플 없음, VEGF 없음)를 사용했다. 인큐베이션 후, 10 μL/웰의 WST-8 발색 용액을 첨가하고, 발색을 위해 96웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 발색이 안정화된 후 마이크로플레이트 판독기로 OD450과 OD630을 측정했다. 각 웰에 대해, 판독값은 (OD450 - OD630)이었고, 각 그룹에 대한 OD 값을 그룹의 판독값에서 블랭크 웰 B의 판독값을 뺀 값으로 정의하여 항체의 중화율을 계산하였다, 중화율% = (음성 대조군 M의 OD 값 - 샘플의 OD 값) / (음성 대조군 M의 OD 값 - M'의 OD 값) Х 100%. 항체 샘플 농도를 가로 좌표로, 중화율을 세로 좌표로 하여, 통계 소프트웨어 GraphPad Prism의 자동 분석 기능을 사용하여 표준 곡선을 계산하고, 4-파라미터 로지스틱 회귀 방정식을 사용하여 표준 "S" 곡선을 피팅하여 항체 샘플의 반최대 유효 농도(EC50)를 계산했다.
도 8에 나타낸 바와 같이, HUVEC 세포에 동시에 작용하는 VEGF의 다른 아형(VEGF165, VEGFC, VEGFD)의 경우, 항체 VEGF-H988이 아바스틴보다 더 강한 중화 효과를 나타낸다. 0.016 내지 4.000 nM의 농도 범위에서, VEGF-H988은 아바스틴보다 EC50이 각각 0.26 nM 및 0.77 nM로 더 작고; VEGF-H988은 아바스틴보다 중화율이 각각 86.1% 및 58.5%로 더 높다. VEGF의 다른 아형을 중화하는 VEGF 및 아바스틴의 반최대 유효 농도(EC50) 및 최대 중화율이 표 5에 요약되어 있다.
Figure pct00009
실시예 4: 마우스에서 항체 VEGF-H988의 반복 투여 독성 연구
CD-1 마우스는 노령 그룹(35주령)과 정상 그룹(normal group)(9주령) 각각 8마리로, 절반은 수컷, 절반은 암컷을 사용하였다. 마우스는 완전 무작위화 방법에 따라 4개의 그룹(G1-G4)으로 나뉘었고, 각 그룹에 4마리의 마우스가 포함되었는데, 절반은 수컷이고, 절반은 암컷이었다. 구체적인 그룹화는 다음과 같았다: G1: 노령 마우스 용매 대조 그룹; G2: 노령 마우스 연구 그룹; G3: 정상 마우스 용매 대조 그룹; G4: 정상 마우스 연구 그룹. VEGF-H988 항체는 연구 그룹에 반복하여 투여되었고, 대조 그룹에는 동일한 부피의 용매가 주어졌다. 용량은 50 mg/kg이었고, 각 투여의 부피는 각각 5 mL/kg(1차 내지 8차 용량) 및 10 mL/kg(9차 내지 16차 용량)이었고; 투여 방식은 주 2회 빈도로 복강내 주사였다. 모든 마우스는 약동학 및 면역원성 검정을 위해, 첫 번째 투여 전과 투여 후 0.5시간, 2시간, 4시간, 6시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 후, 그리고 매 다른 투여 전 및 1시간 후에 궤도 혈액 샘플링(orbital blood sampling)을 거쳤다. 각각의 투여 전에 마우스의 체중을 측정하고 기록했다. 자세한 투여 요법은 표 6에 나와 있다.
Figure pct00010
항체 VEGF-H988 그룹의 마우스 체중은 상응하는 용매 대조 그룹의 체중과 유사했고, 이는 항체 VEGF-H988이 마우스 체중에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 연구 기간 동안, 항체 VEGF-H988 그룹에서 임상적 이상(clinical abnormality)이 관찰되었다. 모든 마우스는 총체적 부검을 받았고, 조직과 기관에 눈에 띄는 이상은 없었다. 조직병리학적 검사에서 모든 마우스가 간, 폐, 및 신장에 정맥 울혈이 있는 것으로 나타났으나, 대조 그룹과 연구 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다. 소수의 개별 마우스는 비장에서 분홍색 장액 또는 적혈구 정체를 보였고, 신장에서 염증 세포 침윤을 보였으며, 이는 개인차로 간주되었고, 약물 투여와 관련이 없었다. 첫 번째 투여 후 마우스의 독성 역학(toxicokinetic) 파라미터는 표 7에 요약되어 있다.
Figure pct00011
도 9 내지 11의 혈중 약물 농도-시간 곡선에 나타난 바와 같이, 각 그룹에서 수컷과 암컷 동물 사이의 혈중 농도 변화 경향에는 유의한 차이가 없었다. 두 그룹 모두에서 다중 투여 후 유의한 축적이 없었으며, 이는 더 많은 용량을 투여한 그룹이 포화 수준에 도달한 것과 관련이 있을 수 있다. G2 그룹(노령)과 G4 그룹(정상)의 최고 혈중 농도는 기본적으로 동일했고, 최저 농도(trough concentration)는 노령 그룹에서 약간 더 낮았으며, 이는 그룹 내 개인차가 큰 것과 관련이 있을 수 있다.
각 그룹의 마우스는 투여 후 1시간에 혈액 약물 농도에서 유의한 증가가 없거나 심지어 약간의 감소를 보였으며, 이는 면역원성과 상관관계가 없었다(면역원성 시험 데이터는 표 8 참조). 또한, 투여 1시간 후의 비정상적인 혈중 약물 농도는 생체 내 약물 분포 속도 및 개인차와도 관련이 있을 수 있다.
면역원성 검사 결과 대상체의 일부에서 양성이 나왔지만, SNR과 역치 SCP의 차이는 작았고, 실제로는 매우 근접하여 강한 양성을 보이지 않았고, 이는 앞서 말한 양성 결과가 아마도 위양성일 것으로 생각된다. 표 8은 마우스에서 항체 VEGF-H988의 반복 투여 독성 연구의 면역원성 결과를 요약한 것이다.
Figure pct00012
마우스에서 반복 투여 독성 시험 결과, VEGF-H988 항체를 16회 용량 동안 노령 CD-1 마우스와 정상 CD-1 마우스에게 50 mg/kg의 용량으로 주 2회 복강내 주사를 통해 반복 투여했을 때 유의한 약물 관련 독성 효과가 관찰되지 않은 것으로 나타났다.
실시예 5: 인간 결장직장암 세포주 HCT-116 이종이식 종양 모델에서의 효능 연구
암컷 Balb/c-nu 누드 마우스는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 입수했다(동물 생산 허가 번호 SCXK(베이징) 2016-0006, 품질 인증서 번호 11400700373019). 자체 개발한 HCT116 세포주를 접종한 마우스에서 HCT116 종양 블록(tumor block)을 얻었다. Balb/c-nu 6주령 암컷 마우스에 약 2Х2Х2(mm3) 크기의 HCT116 종양 블록을 피하 접종하고, 종양 부피가 약 300 mm3에 도달하면, 마우스에게 각각 1 mg/kg의 VEGF-H988 또는 아바스틴(SinoCelltech Co., Ltd.) 또는 상응하는 용매를 주 2회 복강내 주사로 그룹으로 투여했다. 종양 부피를 주 2회 측정하여 VEGF-H988 대 아바스틴의 항종양 효능을 평가했다.
도 12에 나타난 바와 같이, 약 300 mm3보다 더 큰 초기 종양 부피 및 더 낮은 용량(1 mg/kg)의 경우, 종양 성장 속도는 투여 후 7일 이후부터 비-투여 대조 그룹에 비해 VEGF-H988 처리 그룹에서 점진적으로 감소했다. 종양 성장에 대한 아바스틴의 억제 효과는 등가 용량의 VEGF-H988 처리 그룹에서보다 늦은 투여 후 11일째에 시작되었다. HCT-116 이종이식 종양 모델의 종양 억제 검정에서는, 종양 성장에 대한 VEGF-H988의 억제 효과가 아바스틴보다 더 우수함을 보여주었다.
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Sequence Listing <110> SinoCellTech Ltd. <120> HUMANIZED ANTI-VEGF MONOCLONAL ANTIBODY <130> CIE200065PCT <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 165 170 175 Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg 180 185 190 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the linker used in the construction of the phage antibody library for the linkage of the rabbit antibody scFv <400> 2 tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt ggaggtggta gttctagatc ttcc 54 <210> 3 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of rabbit antibody scFv used in the construction of antibody VEGF165-R859 <400> 3 gatgtcgtga tgacccagac tgcagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaagtgcc aggccagtca gagcattagg agttggttat cctggtatca gcagaaacca 120 gggcagcctc ccaagctcct gatctatcag gcatccaaat tggcatctgg ggtcccatcg 180 cggttcaaag gcagtggata tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240 gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaaac aattattctt ttagtaaaga tggtggtgct 300 ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt 360 ggaggtggta gttctagatc ttcccagtcg gtggaggagt ccgggggtcg cctggtcacg 420 cctgggacac ccctgacact cacctgccaa gtctctggat tctccctcaa catctacgac 480 atgacctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggaat ggatcggaat cattgcgcct 540 gatgatagcg catactacgc gaactgggcg aaaggccgat tcaccatctc caaaacctcg 600 accacggtgg atctgaaaat gaccagtccg acaaccgagg acacggccac ctatttctgt 660 gccagaaatg cctatagtag tggctggggt ggggacttgt ggggcccagg caccctggtc 720 actgtctctt ca 732 <210> 4 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the rabbit antibody scFv used in the construction of antibody VEGF165-R988 <400> 4 gagctcgatc tgacccagac tccatccccc gtgtctgcgg ctgttggagg cacagtcacc 60 atcaattgcc agtccagtca gactatttat gctaacaggc gcttagcctg gtatcaacag 120 aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatggtgcat ccactctggc atctggggtc 180 ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggctata aaagttatga tggtgatgat 300 gttggtttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaatcta gtggtggcgg tggttcgggc 360 ggtggtggag 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gtggtggcgg tggttcgggc 360 ggtggtggag gtggtagttc tagatcttcc cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg 420 gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc tgcacagtct ctggaatcga cctcagtagc 480 tatgcaataa gctgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggaatacat cggatacatt 540 tggagtactg ataacaccta ctatgcgagc tgggcaaaag gccgattcac catctccgag 600 gcctcgacca cggtggatct gaaaatcacc agcccgacaa ccgaggacac ggccacctat 660 ttctgtgcca gaggaacgtt aggggactac aatggcatgg acccctgggg cccagggacc 720 ctcgtcaccg tctcttca 738 <210> 6 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the rabbit antibody scFv used in the construction of antibody VEGF165-R812 <400> 6 gagctcgtgc tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaagtgcc aggccagtca gagcattaat agttggttat cctggtatca gcagaaacca 120 gggcagcgtc ccaagctcct gatctaccag gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatcg 180 cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt 240 gccgatgctg ccacttatta ctgccagaac aatcttggtg gtggtgatgg tagttatggt 300 cttcctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaatcta gtggtggcgg tggttcgggc 360 ggtggtggag gtggtagttc tagatcttcc cagtcgttgg aggagtccgg gggtcgcctg 420 gtaacgcctg gaggctccct gacactcacc tgcacagcct ctggattcga cctcggtatc 480 tatgaaataa cctgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt 540 tatggtgatg gtgacacagt ctacgcgaac tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa 600 acctcgacca cggtggatct gaaaatctcc agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat 660 ttctgtgcca gaaatggcta tactactggc tggggtgggg acttgtgggg cccaggcacc 720 ctggtcactg tctcttca 738 <210> 7 <211> 348 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 7 cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtaacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggaatcga cctcagtagc tatgcaataa gctgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatacat cggatacatt tggaatgctg gtaacaccta ctacgcgagc 180 tgggcaaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 240 agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggaacatt aggggactac 300 aatggcatgg acccctgggg cccagggacc ctcgtcaccg tctcttca 348 <210> 8 <211> 336 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 8 gagctcgatc tgacccagac tccatccccc gtgtctgcgg ctgttggagg cacagtcacc 60 atcaattgcc agtccagtca gactatttat gctaacaggc gcttagcctg gtatcaacag 120 aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatggtgcat ccactctggc atctggggtc 180 ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggctata aaagttatga tggtgatgat 300 gttggtttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaa 336 <210> 9 <211> 972 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 9 ggtcaaccta aggctccgtc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60 tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa ggctacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120 tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180 ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240 aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300 agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360 ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420 gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480 cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540 accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600 aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660 gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720 ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780 gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840 ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900 tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960 ccgggtaaat aa 972 <210> 10 <211> 315 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 10 ggggatccag ttgcacctac tgtcctcatc ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact 60 ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120 gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180 gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240 cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat 300 aggggtgact gttaa 315 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 11 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Trp Asn Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr 85 90 95 Leu Gly Asp Tyr Asn Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 12 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Thr Ile Tyr Ala Asn 20 25 30 Arg Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Tyr 85 90 95 Asp Gly Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 13 Gln Ser Ser Gln Thr Ile Tyr Ala Asn Arg Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 14 Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 15 Ala Gly Tyr Lys Ser Tyr Asp Gly Asp Asp Val Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 16 Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 17 Tyr Ile Trp Asn Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 18 Ala Arg Gly Thr Leu Gly Asp Tyr Asn Gly Met Asp Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the humanized antibody VEGF165-H988-10 heavy chain containing signal peptide <400> 19 atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtcag 60 tctgtccagg agtctggacc tggactggtg aagccatctg agaccctgtc cctgacttgt 120 actgtgtctg gcattgacct gtcctcctat gccatctcct gggtgagaca acctcctggc 180 aagggattgg aatacattgg ctacatctgg aatgctggca acacctacta tgcctcctgg 240 gctaagggca gggtgaccat ctctgtggac accagcaaga accaggtgga cctgaaactg 300 tcctctgtga cagcagcaga cacagcagtc tacttctgtg ccaggggcac cctgggagac 360 tacaatggga tggacccatg gggacctggc accctggtga cagtgtccag cgctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 20 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of humanized antibody VEGF165-H988-10 light chain containing signal peptide <400> 20 atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgaa 60 ctccaactta cccagagccc atcctccctg tctgcctctg tgggagacag ggtgaccatc 120 acttgtcagt ccagccagac catctatgcc aacaggagac tggcttggta tcaacagaag 180 cctggcaagg tgccaaaact gctgatttat ggagccagca ccctggcatc tggagtgcca 240 agcaggttca agggctctgg ctctggcaca gacttcaccc tgaccatctc ctccctccaa 300 cctgaggatg tggctaccta ctactgtgct ggctacaagt cctatgatgg agatgatgtg 360 ggctttggag gaggcaccaa ggtggagatt aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717 <210> 21 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized antibody VEGF165-H988-10 containing signal peptide <400> 21 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Ser Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser 35 40 45 Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Tyr Ile Gly Tyr Ile Trp Asn Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 85 90 95 Asp Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 100 105 110 Cys Ala Arg Gly Thr Leu Gly Asp Tyr Asn Gly Met Asp Pro Trp Gly 115 120 125 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu 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120 ggcaagggat tggaatacat tggctacatc tggaatgctg gcaacaccta ctatgcctcc 180 tgggctaagg gcagggtgac catctctgtg gacaccagca agaaccaggt ggacctgaaa 240 ctgtcctctg tgacagcagc agacacagca gtctacttct gtgccagggg caccctggga 300 gactacaatg ggatggaccc atggggacct ggcaccctgg tgacagtgtc cagc 354 <210> 24 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the light chain variable region of humanized antibody VEGF165-H988-10 <400> 24 gaactccaac ttacccagag cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagggtgacc 60 atcacttgtc agtccagcca gaccatctat gccaacagga gactggcttg gtatcaacag 120 aagcctggca aggtgccaaa actgctgatt tatggagcca gcaccctggc atctggagtg 180 ccaagcaggt tcaagggctc tggctctggc acagacttca ccctgaccat ctcctccctc 240 caacctgagg atgtggctac ctactactgt gctggctaca agtcctatga tggagatgat 300 gtgggctttg gaggaggcac caaggtggag attaag 336 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody VEGF165-H988-10 <400> 25 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Gly Met Asp Pro 1 5 10 <210> 33 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized antibody VEGF-H988 <400> 33 Gln Ser Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Trp Asn Asp Leu Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Gly Thr Leu Gly Asp Tyr Gly Gly Met Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser 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VEGF-H988 containing signal peptide <400> 36 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Leu Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Lys Phe Leu 35 40 45 Trp Gln Gly Arg Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr 100 105 110 Lys Ser Tyr Asp Gly Asp Val Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 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tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa ataa 1404 <210> 44 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of humanized antibody VEGF-H988 light chain containing signal peptide <400> 44 atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgaa 60 ctccaactta cccagagccc atcctccctg tctgcctctg tgggagacag ggtgaccatc 120 acttgtcagt ccagcaagtt cctctggcag ggcaggagac tggcttggta tcaacagaag 180 cctggcaagg tgccaaaact gctgatttat ggagccagca ccctggcatc tggagtgcca 240 agcaggttca agggctctgg ctctggcaca gacttcaccc tgaccatctc ctccctccaa 300 cctgaggatg tggctaccta ctactgtgct ggctacaagt cctatgatgg agatgttgtg 360 ggctttggag gaggcaccaa ggtggagatt aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 717 <210> 45 <211> 57 <212> 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Nucleotide sequence of the light chain variable region of humanized antibody VEGF-H988 <400> 48 gaactccaac ttacccagag cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagggtgacc 60 atcacttgtc agtccagcaa gttcctctgg cagggcagga gactggcttg gtatcaacag 120 aagcctggca aggtgccaaa actgctgatt tatggagcca gcaccctggc atctggagtg 180 ccaagcaggt tcaagggctc tggctctggc acagacttca ccctgaccat ctcctccctc 240 caacctgagg atgtggctac ctactactgt gctggctaca agtcctatga tggagatgtt 300 gtgggctttg gaggaggcac caaggtggag attaag 336 <210> 49 <211> 993 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa taa 993 <210> 50 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324 <210> 51 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the rabbit antibody scFv used in the construction of antibody VEGF165-R988 <400> 51 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Thr Ile Tyr Ala Asn 20 25 30 Arg Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Tyr 85 90 95 Asp Gly Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg 115 120 125 Ser Ser Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly 130 135 140 Thr Pro 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gctgagtcag 60 tcggtggagg agtccggggg tcgcctggta acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120 acagtctctg gaatcgacct cagtagctat gcaataagct gggtccgcca ggctccaggg 180 aaggggctgg aatacatcgg atacatttgg aatgctggta acacctacta cgcgagctgg 240 gcaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 300 ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag gaacattagg ggactacaat 360 ggcatggacc cctggggccc agggaccctc gtcaccgtct cttcaggtca acctaaggct 420 ccgtcagtct tcccactggc cccctgctgc ggggacacac ccagctccac ggtgaccctg 480 ggctgcctgg tcaaaggcta cctcccggag ccagtgaccg tgacctggaa ctcgggcacc 540 ctcaccaatg gggtacgcac cttcccgtcc gtccggcagt cctcaggcct ctactcgctg 600 agcagcgtgg tgagcgtgac ctcaagcagc cagcccgtca cctgcaacgt ggcccaccca 660 gccaccaaca ccaaagtgga caagaccgtt gcgccctcga catgcagcaa gcccacgtgc 720 ccaccccctg aactcctggg gggaccgtct gtcttcatct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcacgcac ccccgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggat 840 gaccccgagg tgcagttcac atggtacata aacaacgagc aggtgcgcac cgcccggccg 900 ccgctacggg agcagcagtt caacagcacg atccgcgtgg tcagcaccct ccccatcgcg 960 caccaggact ggctgagggg caaggagttc aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac 1080 accatgggcc ctccccggga ggagctgagc agcaggtcgg tcagcctgac ctgcatgatc 1140 aacggcttct acccttccga catctcggtg gagtgggaga agaacgggaa ggcagaggac 1200 aactacaaga ccacgccggc cgtgctggac agcgacggct cctacttcct ctacagcaag 1260 ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac 1320 gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag tccatctccc gctctccggg taaataa 1377 <210> 54 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the rabbit antibody VEGF165-R988 light chain containing signal peptide <400> 54 atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgag 60 ctcgatctga cccagactcc atcccccgtg tctgcggctg ttggaggcac agtcaccatc 120 aattgccagt ccagtcagac tatttatgct aacaggcgct tagcctggta tcaacagaaa 180 ccagggcagc ctcccaagct cctgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tggggtccca 240 tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag 300 tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggctataaaa gttatgatgg tgatgatgtt 360 ggtttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaaggggatc cagttgcacc tactgtcctc 420 atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 480 aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 540 ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 600 actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 660 cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttaa 708 <210> 55 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the rabbit antibody VEGF165-R988 heavy chain containing signal peptide <400> 55 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser 35 40 45 Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Tyr Ile Gly Tyr Ile Trp Asn Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu 85 90 95 Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Gly Asp Tyr Asn Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser 195 200 205 Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp 275 280 285 Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu 290 295 300 Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 340 345 350 Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu 355 360 365 Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp 420 425 430 Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 56 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the rabbit antibody VEGF165-R988 light chain containing signal peptide <400> 56 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala 20 25 30 Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Thr Ile 35 40 45 Tyr Ala Asn Arg Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr 100 105 110 Lys Ser Tyr Asp Gly Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val 115 120 125 Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala 145 150 155 160 Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr 165 170 175 Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala 180 185 190 Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln 195 200 205 Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr 210 215 220 Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 235 <210> 57 <211> 323 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 57 Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn 35 40 45 Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys 65 70 75 80 Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala 85 90 95 Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly 100 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 115 120 125 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 130 135 140 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val 145 150 155 160 Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile 165 170 175 Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly 180 185 190 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 195 200 205 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val 210 215 220 Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser 225 230 235 240 Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu 245 250 255 Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala 260 265 270 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val 275 280 285 Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met 290 295 300 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Gly Lys <210> 58 <211> 104 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus f. domesticus <400> 58 Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp 1 5 10 15 Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr 20 25 30 Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr 35 40 45 Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr 50 55 60 Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 80 His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val 85 90 95 Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 100 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F1 for amplifying the heavy chain variable region <400> 59 accagggtgc tgagtcagtc ggtggaggag tcc 33 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R1 for amplifying the heavy chain variable region <400> 60 tgtgaccagg gtacctgggc ccca 24 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F2 for amplifying the light chain variable region <400> 61 acaggagtgc atagtgagct cgatctgacc cagac 35 <210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R2 for amplifying the light chain variable region <400> 62 ggtgcaactg gatccccttt gacgaccacc tcggt 35 <210> 63 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F3 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 63 ccacaggagt gcatagtgaa ctccaactta cccagagccc atcctccctg 50 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R3 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 64 cctgtctccc acagaggcag acagggagga tgg 33 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F4 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 65 tctgtgggag acagggtgac catcacttgt cag 33 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R4 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 66 ggcatagatg gtctggctgg actgacaagt gat 33 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F5 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 67 cagaccatct atgccaacag gagactgg 28 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R5 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 68 ttctgttgat accaagccag tctcctgt 28 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F6 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 69 ttggtatcaa cagaagcctg gcaaggtg 28 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R6 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 70 aaatcagcag ttttggcacc ttgccagg 28 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F7 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 71 caaaactgct gatttatgga gccagcac 28 <210> 72 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R7 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 72 cactccagat gccagggtgc tggctcca 28 <210> 73 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F8 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 73 ctggcatctg gagtgccaag caggttcaag ggc 33 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R8 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 74 gaagtctgtg ccagagccag agcccttgaa cct 33 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F9 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 75 tctggcacag acttcaccct gaccatctcc tcc 33 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R9 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 76 agccacatcc tcaggttgga gggaggagat ggt 33 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F10 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 77 cctgaggatg tggctaccta ctactgtgct ggc 33 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R10 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 78 atctccatca taggacttgt agccagcaca gta 33 <210> 79 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F11 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 79 tcctatgatg gagatgatgt gggctttgga gga 33 <210> 80 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R11 for whole gene synthesis of the heavy chain variable region <400> 80 ggtgcagcca ccgtacgctt aatctccacc ttggtgcctc ctccaaagcc 50 <210> 81 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F12 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 81 gctaccaggg tgctgagtca gtctgtccag gagtctggac ctggactggt g 51 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R12 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 82 ggacagggtc tcagatggct tcaccagtcc agg 33 <210> 83 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F13 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 83 tctgagaccc tgtccctgac ttgtactgtg tct 33 <210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R13 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 84 ataggaggac aggtcaatgc cagacacagt aca 33 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F14 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 85 gacctgtcct cctatgccat ctcctgggtg a 31 <210> 86 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R14 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 86 cccttgccag gaggttgtct cacccaggag a 31 <210> 87 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F15 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 87 acctcctggc aagggattgg aatacattgg c 31 <210> 88 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R15 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 88 tgccagcatt ccagatgtag ccaatgtatt c 31 <210> 89 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F16 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 89 tctggaatgc tggcaacacc tactatgcct c 31 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R16 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 90 caccctgccc ttagcccagg aggcatagta g 31 <210> 91 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F17 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 91 gctaagggca gggtgaccat ctctgtggac acc 33 <210> 92 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R17 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 92 caggtccacc tggttcttgc tggtgtccac aga 33 <210> 93 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F18 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 93 aaccaggtgg acctgaaact gtcctctgtg aca 33 <210> 94 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R18 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 94 gtagactgct gtgtctgctg ctgtcacaga gga 33 <210> 95 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F19 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 95 gacacagcag tctacttctg tgccaggggc acc 33 <210> 96 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R19 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 96 catcccattg tagtctccca gggtgcccct ggc 33 <210> 97 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer F20 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 97 gactacaatg ggatggaccc atggggacct ggc 33 <210> 98 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer R20 for whole gene synthesis of the light chain variable region <400> 98 gggcccttgg tgctagcgct ggacactgtc accagggtgc caggtcccca 50

Claims (25)

  1. 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    서열 번호: 30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 31에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 32에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열 번호: 27에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 28에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 29에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 영역을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열 번호: 39의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 39와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열 번호: 40의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 40과 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는
    상기 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 42의 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 42와 적어도 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/갖거나
    상기 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 41의 IgG1의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 41과 적어도 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 또는 키메라 항체인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체, 바람직하게는 IgG1 항체인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 인간 VEGF165 단백질에 대한 결합 친화도 KD가 1 내지 100 pM, 바람직하게는 5 내지 50 pM, 보다 바람직하게는 19.5 pM인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd 단편, Fd' 단편, 단일 사슬 항체 분자 또는 단일 도메인 항체이고; 이때 상기 단일 사슬 항체 분자는 바람직하게는 scFv, 디-scFv, 트리-scFv, 이중 바디 항체(double body antibody) 또는 scFab인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 추가의 치료제를 포함하는 항체-약물 접합체로서, 바람직하게는 상기 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 추가의 치료제는 링커를 통해 연결되는 것인, 항체-약물 접합체.
  10. 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    서열 번호: 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    서열 번호: 13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 영역, 서열 번호: 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 영역, 및 서열 번호: 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 영역을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 단리된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    서열 번호: 25의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 25와 적어도 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역; 및
    서열 번호: 26의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 26과 적어도 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 인간화 항체 또는 키메라 항체인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd 단편, Fd' 단편, 단일 사슬 항체 분자 또는 단일 도메인 항체이고; 이때 상기 단일 사슬 항체 분자는 바람직하게는 scFv, 디-scFv, 트리-scFv, 이분 항체(bipartite antibody) 또는 scFab인, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산.
  16. 제15항에 있어서,
    서열 번호: 7로 나타낸 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호: 8로 나타낸 뉴클레오티드 서열; 또는
    서열 번호: 23으로 나타낸 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호: 24로 나타낸 뉴클레오티드 서열; 또는
    서열 번호: 47로 나타낸 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호: 48로 나타낸 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는, 핵산.
  17. 제15항 또는 제16항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제15항 또는 제16항에 기재된 핵산 또는 제17항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법으로서, 항체 발현에 적합한 조건 하에 제18항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 제15항 또는 제16항에 기재된 핵산, 또는 제17항에 기재된 발현 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 결장직장암의 치료 및 진단에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 제20항에 기재된 약제학적 조성물.
  22. 치료적 유효량의, 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 제20항에 기재된 약제학적 조성물을, 결장직장암의 치료가 필요한 피험자(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 결장직장암을 치료하는 방법.
  23. 결장직장암의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서, 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 제20항에 기재된 약제학적 조성물의 용도.
  24. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 제20항에 기재된 약제학적 조성물과 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 기재된 항체-약물 접합체, 또는 제20항에 기재된 약제학적 조성물, 또는 제24항에 기재된 약제학적 배합물을 포함하고, 바람직하게는 약물 투여용 장치를 추가로 포함하는, 키트.
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