CN115151570A - 抗人cd19抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及结合人CD19的抗体（抗人CD19抗体或抗人CD19抗体）、包含这种抗人CD19抗体的组合物以及使用这种抗人CD19抗体的方法。

Description

抗人CD19抗体
技术领域
本公开内容涉及结合人CD19的抗体（“抗人CD19抗体”或“抗-CD19抗体”）、包含这种抗人CD19抗体的组合物以及使用这种抗人CD19抗体的方法。
背景技术
B细胞可以产生针对各种抗原的抗体，且因此在体液免疫应答中起重要作用。此外，B细胞还起抗原呈递细胞（APC）的作用并分泌细胞因子。B细胞在其细胞膜上表达B细胞受体（BCR）；且BCR允许B细胞结合特定抗原，其针对所述抗原将引发抗体应答。B细胞的调节异常与多种病症有关。
人B-淋巴细胞抗原CD19（也称为分化簇（Cluster of Differentiation）19、B-淋巴细胞表面抗原B4、T-细胞表面抗原Leu-12或CVID3）是一种跨膜蛋白，其在B细胞发育的所有阶段都广泛表达，直到其最终分化为浆细胞为止。因此，人CD19是一种泛-B细胞标记。发现CD19与补体受体CD21和四跨膜蛋白（tetraspan）家族成员CD81有关（Carter等人，Immunol. Res. 26: 45-54, 2002）。CD19是BCR的共同受体，并充当衔接蛋白以将细胞质信号传导蛋白募集到BCR复合体。CD19是正常B细胞功能所需要的，并且与各种各样的B细胞应答有关，包括B细胞存活、增殖、活化和分化。
以前已经描述了抗人CD19抗体，并且正在临床试验中进行测试。许多已知的抗人CD19抗体是B细胞耗尽性抗体；例如，在III期临床试验中的英比利珠单抗（inebilizumab）（也称为MEDI-551）和tafasitamab（也称为MOR208或XmAb5574），在II期临床试验中的朗妥昔单抗（loncastuximab），在I期临床试验中的4G7SDIE和DI-B4，均被报告为B细胞耗尽性抗体（Cree等人, Lancet. 394(10206):1352-1363, 2019；Kellner等人, Leukemia. 27(7):1595–1598, 2013；Kaplon等人, MAbs. 12(1): 1703531, 2020；Seidel等人, Mol. Ther.24(9):1634-43, 2016；WO2007076950）。
奥贝利单抗（Obexelimab）（也称为XmAb5871）是一种Fc-人工改造的抗体，其结合CD19和FcγRIIb两者，并通过参加抑制性FcγRIIb受体信号传导来抑制B细胞功能（Szili等人, MAbs. 6(4): 991–999, 2014）。然而，奥贝利单抗与FcγRIIb的高亲和力结合可导致与其他细胞类型的非特异性结合。在人类患者中，据报道奥贝利单抗具有短的半衰期，T1/2为3.5±1.0天；并减少外周人B细胞计数，平均减少基线水平的约30-40%（Jaraczewska-Baumann等人, European League Against Rheumatism (EULAR) 2015 Annual MeetingPoster: A Phase 1b/2a Study of the Safety, Tolerability, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of XmAb®5871 in Patients with Rheumatoid Arthritis, 2015年6月12日, 可在https://investors.xencor.com/static-files/0017dcf1-deb2-46eb-93ff-90ba164ec50c获得）。
因此，仍然需要特异性结合和抑制人B细胞而不耗尽它们的备择抗人CD19抗体，用于治疗B细胞相关病症。
发明内容
本文提供了在不耗尽B细胞的情况下结合人CD19并抑制B细胞应答（例如，增殖、活化和分化）的抗体（即，“非耗尽性抗人CD19抗体”）。这种非耗尽性抗人CD19抗体可用于在不破坏那些重要的免疫细胞的情况下治疗B细胞相关病症，例如，自身免疫性疾病，且从而避免有问题的并发免疫妥协、长期免疫抑制和由B细胞耗尽引起的其他并发症。本文提供的抗人CD19抗体具有用于开发和用于治疗自身免疫性疾病的以下性质中的一种或多种：1）以期望的结合亲和力和/或缔合和解离速率结合人CD19（和有时食蟹猴CD19），2）特异性结合人B细胞并抑制原代人B细胞增殖、活化和/或分化，3）不耗尽人B细胞，4）被内化到人B细胞中，5）低免疫原性危险，6）低疏水性，和/或7）良好的稳定性、溶解度、粘度和药物代谢动力学特征。如下所述，在并列比较中，一种这样的抗人CD19抗体CB3f在全血测定中显示出以高特异性结合人B细胞，而奥贝利单抗除了B细胞结合之外还显示与人嗜中性粒细胞的非特异性结合。由于嗜中性粒细胞是人中最丰富的白细胞类型，所以与嗜中性粒细胞的非特异性结合可能解释了在人患者中观察到的奥贝利单抗的短半衰期。此外，在体外B细胞凋亡测定中，奥贝利单抗（obexilimab）显示以剂量依赖性方式诱导原代人B细胞凋亡，而抗人CD19抗体CB3f在相同测定中不诱导原代人B细胞的凋亡。
在一个方面，本文提供了新的非耗尽性抗人CD19抗体。在一些实施方案中，抗人CD19抗体是完全人抗体。
在一些实施方案中，本文提供了结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中所述VH包含重链互补性决定区（HCDR）HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含轻链互补性决定区（LCDR）LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 29，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 30，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 31，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 32，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 33，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 34。在一些实施方案中，抗人CD19抗体包含包含SEQ ID NO: 37的VH和包含SEQ ID NO: 41的VL。
在一些实施方案中，抗人CD19抗体具有人IgG1或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗人CD19抗体具有人IgG4同种型。在一些实施方案中，抗人CD19抗体具有修饰的人IgG4铰链区，所述铰链区包含S228P突变（根据EU索引编号），其减少体内IgG4 Fab-臂交换（参见Labrijn等人, Nat. Biotechnol. 2009, 27(8):767）。在一些实施方案中，抗人CD19抗体具有人IgG1同种型。在一些实施方案中，抗人CD19抗体具有修饰的人IgG1 Fc区，其具有降低或消除的Fc效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）和依赖补体的细胞毒性（CDC）。这种抗体被称为“IgG1-效应子无效”抗体。
在一些实施方案中，抗人CD19抗体具有人IgG4同种型。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 35的重链（HC）和包含SEQ ID NO: 39的轻链（LC）。在一些实施方案中，抗体具有人IgG1同种型。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 50的HC和包含SEQ ID NO: 39的LC。在一些实施方案中，抗体是IgG1-效应子无效抗体。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 52的HC和包含SEQ ID NO: 39的LC。
在一些实施方案中，本文提供了结合人CD19的抗体片段（例如，Fab或scFv），其中所述抗体片段包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 29，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 30，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 31，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 32，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 33，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 34。在一些实施方案中，抗体片段包含包含SEQ ID NO: 37的VH和包含SEQ ID NO: 41的VL。
本文还提供了结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:29，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 30，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 31，所述LCDR1包含SEQ IDNO: 43，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 44，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 45。在一些实施方案中，抗人CD19抗体包含包含SEQ ID NO: 37的VH和包含SEQ ID NO: 48的VL。在一些实施方案中，抗体具有人IgG4同种型。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 35的HC和包含SEQ ID NO: 46的LC。在一些实施方案中，抗体具有人IgG1同种型。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 50的HC和包含SEQ ID NO: 46的LC。在一些实施方案中，抗体是IgG1-效应子无效抗体。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 52的HC和包含SEQ ID NO: 46的LC。
在一些实施方案中，本文提供了结合人CD19的抗体片段（例如，Fab或scFv），其中所述抗体片段包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 29，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 30，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 31，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 43，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 44，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 45。在一些实施方案中，抗体片段包含包含SEQ ID NO: 37的VH和包含SEQ ID NO: 48的VL。
本文还提供了结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:15，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 16，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 17，所述LCDR1包含SEQ IDNO: 18，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 19，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 20。在一些实施方案中，抗人CD19抗体包含包含SEQ ID NO: 23的VH和包含SEQ ID NO: 27的VL。在一些实施方案中，抗体具有人IgG4同种型。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 21的HC和包含SEQ ID NO: 25的LC。在一些实施方案中，抗体具有人IgG1同种型。在一些实施方案中，抗体是IgG1-效应子无效抗体。例如，在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 54的HC和包含SEQ ID NO: 25的LC。
在一些实施方案中，本文提供了结合人CD19的抗体片段（例如，Fab或scFv），其中所述抗体片段包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 15，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 16，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 17，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 18，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 19，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 20。在一些实施方案中，抗体片段包含包含SEQ ID NO: 23的VH和包含SEQ ID NO: 27的VL。
本文还提供了结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 2，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:4，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些实施方案中，抗人CD19抗体包含包含SEQ ID NO: 9的VH和包含SEQ ID NO: 13的VL。在一些实施方案中，抗体包含包含SEQ ID NO: 7的HC和包含SEQ ID NO: 11的LC。
在一些实施方案中，本文提供了结合人CD19的抗体片段（例如，Fab或scFv），其中所述抗体片段包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 1，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 2，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 3，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 4，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些实施方案中，抗体片段包含包含SEQ ID NO: 9的VH和包含SEQ ID NO: 13的VL。
在另一个方面，本文提供了编码本文所述的新的抗人CD19抗体的重链或轻链或VH或VL的核酸，以及包含这种核酸的载体。
在一些实施方案中，本文提供了编码本文所述的抗人CD19抗体的重链或轻链的核酸。在一些实施方案中，本文提供了包含编码SEQ ID NO: 35、52、50、39、46、21、54、25、7或11的序列的核酸。在一些实施方案中，本文提供了包含编码抗体重链的序列的核酸，所述抗体重链包含SEQ ID NO: 35、52、50、21、54或7。例如，核酸可以包含选自SEQ ID NO: 36、53、51、22、55或8的序列。在一些实施方案中，本文提供了包含编码抗体轻链的序列的核酸，所述抗体轻链包含SEQ ID NO: 39、46、25或11。例如，核酸可以包含选自SEQ ID NO: 40、47、26或12的序列。
本文还提供了编码本文所述的抗人CD19抗体的VH或VL的核酸。在一些实施方案中，本文提供了包含编码SEQ ID NO: 37、23、27、9、41、48、13的序列的核酸。在一些实施方案中，本文提供了包含编码抗体VH的序列的核酸，所述抗体VH包含SEQ ID NO: 37、23、27、9。例如，核酸可以包含选自SEQ ID NO: 38、24、28、10的序列。在一些实施方案中，本文提供了包含编码抗体VL的序列的核酸，所述抗体VL包含SEQ ID NO: 41、48、13。例如，核酸可以包含选自SEQ ID NO: 42、49、14的序列。
本文还提供了包含编码抗体重链或轻链的核酸序列的载体。例如，这种载体可包含编码SEQ ID NO: 35、52、50、39、46、21、54、25、7或11的核酸序列。在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO: 36、53、51、40、47、22、55、26、8或12。
本文还提供了包含编码抗体VH或VL的核酸序列的载体。例如，这种载体可包含编码SEQ ID NO: 37、23、27、9、41、48或13的核酸序列。在一些实施方案中，载体包含SEQ IDNO: 38、24、28、10、42、49或14。
本文还提供了包含编码抗体重链的第一核酸序列和编码抗体轻链的第二核酸序列的载体。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 35、50或52的第一核酸序列，和编码SEQ ID NO: 39或46的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 21或54的第一核酸序列，和编码SEQ ID NO: 25的第二核酸序列。
在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 35的第一核酸序列和编码SEQ IDNO: 39的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 52的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 39的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 50的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 39的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 35的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 46的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 52的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 46的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 50的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 46的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 21的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 25的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ ID NO: 54的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 25的第二核酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQ IDNO: 7的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 11的第二核酸序列。
还提供了包含包含编码抗体重链的核酸序列的第一载体和包含编码抗体轻链的核酸序列的第二载体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 35、52或50的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 39或46的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 21或54的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 25的核酸序列的第二载体。
在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 35的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 39的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 52的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 39的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 50的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 39的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQID NO: 35的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 46的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 52的核酸序列的第一载体和包含编码SEQID NO: 46的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO:50的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 46的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 21的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ IDNO: 25的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 54的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 25的核酸序列的第二载体。在一些实施方案中，组合物包含包含编码SEQ ID NO: 7的核酸序列的第一载体和包含编码SEQ ID NO: 11的核酸序列的第二载体。
本公开内容的核酸可以在宿主细胞中表达，例如，在核酸已与表达控制序列可操作地连接之后。能够表达与其可操作地连接的核酸的表达控制序列是本领域众所周知的。表达载体可以包含编码一种或多种信号肽的序列，所述信号肽促进一种或多种多肽从宿主细胞分泌。可以通过众所周知的方法，例如，稳定或瞬时转染、转化、转导或感染，将含有感兴趣的核酸（例如，编码抗体重链或轻链的核酸）的表达载体转移到宿主细胞中。此外，表达载体可以含有一种或多种选择标记，例如，四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以帮助检测用所期望的核酸序列转化的宿主细胞。
在另一个方面，本文提供了细胞，例如，宿主细胞，其包含本文所述的核酸、载体或核酸组合物。宿主细胞可以是用一种或多种表达本文所述抗体的全部或部分的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以用表达本公开内容的抗体的HC和LC多肽的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染。在一些实施方案中，宿主细胞可以用表达本文所述抗体的HC多肽的第一载体和表达本文所述抗体的LC多肽的第二载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染。这样的宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞，可以表达本文所述的抗人CD19抗体。已知能够表达抗体的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞、HEK293细胞、COS细胞和NS0细胞。
在一些实施方案中，细胞，例如，宿主细胞，包含载体，所述载体包含编码SEQ IDNO: 35、50或52的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 39或46的第二核酸序列。在一些实施方案中，细胞，例如，宿主细胞，包含载体，所述载体包含编码SEQ ID NO: 21或54的第一核酸序列和编码SEQ ID NO: 25的第二核酸序列。
在一些实施方案中，细胞，例如，宿主细胞，包含包含编码SEQ ID NO: 35、52或50的核酸序列的第一载体，和包含编码SEQ ID NO: 39或46的核酸序列的第二载体. 在一些实施方案中，细胞，例如，宿主细胞，包含包含编码SEQ ID NO: 21或54的核酸序列的第一载体，和包含编码SEQ ID NO: 25的核酸序列的第二载体。
本公开内容进一步提供了通过在这样的条件下培养上述宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞以使抗体表达并从培养基回收表达的抗体来产生本文所述的抗人CD19抗体的方法。抗体已分泌至其中的培养基可通过常规技术来纯化。可以使用各种蛋白纯化方法，且这些方法是本领域已知的，并描述于，例如，Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)和Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 第3版,Springer, NY (1994)中。
还提供了通过本文所述的任何一种方法产生的抗体。
在另一个方面，本文提供了包含本文所述的抗体、核酸或载体的药物组合物。这种药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。药物组合物可以通过本领域众所周知的方法制备（例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版(2012), A. Loyd等人, Pharmaceutical Press）。
本文所述的抗人CD19抗体、核酸、载体或药物组合物可用于治疗B细胞相关病症。由于它们在调节免疫系统中的关键作用，所以B细胞的调节异常与多种病症有关。B细胞相关病症包括由自身反应性B细胞和T细胞活化引起的自身免疫性疾病，以及由过度和/或不受控制的B细胞增殖引起的淋巴瘤和白血病。B细胞相关的自身免疫性疾病的例子包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎（抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关脉管炎）、重症肌无力。
已知本文所述的抗人CD19抗体不耗尽B细胞，它们对于治疗自身免疫性疾病提供了比起B细胞耗尽性抗体来的优点，并且可以避免有问题的并发免疫妥协、长期免疫抑制和由B细胞耗尽引起的其他并发症。如下文所示的，本文所述的抗人CD19抗体被内化在原代人B细胞中。因此，本文所述的抗人CD19抗体也可用于将其他治疗剂递送到人B细胞中。
在一些实施方案中，本文提供了通过向有需要的主体（例如，人患者）施用治疗有效量的如本文所述的抗人CD19抗体，编码这种抗人CD19抗体的核酸，包含这种核酸的载体或包含这种抗人CD19抗体、核酸或载体的药物组合物，在所述主体中治疗B细胞相关病症例如自身免疫性疾病的方法。本文所述的抗体、核酸、载体或药物组合物可以通过肠胃外途径（例如，皮下和静脉内）施用。在一些实施方案中，B细胞相关病症选自系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎、重症肌无力。
还提供了供治疗之用的本文所述的抗人CD19抗体、核酸、载体或药物组合物。此外，本公开内容还提供了本文所述的抗人CD19抗体、核酸、载体或药物组合物，其供治疗B细胞相关病症之用，如，例如自身免疫性疾病，例如，系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎、重症肌无力。
本文还提供了本文所述的抗人CD19抗体、核酸、载体或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗B细胞相关病症，例如，自身免疫性疾病，例如，系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、或1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎、重症肌无力。
如本文所用的，在本公开内容的上下文中（尤其是在权利要求的上下文中）使用的术语“一（a）”和“一（an）”和“所述（the）”和类似术语要被解释为包括单数和复数两者，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。
如本文所用的，术语“抗体”指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或缀合的抗体。抗体可以是任何类别（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA）和任何亚类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）。
示例性抗体是包含四条多肽链的免疫球蛋白G（IgG）型抗体：通过链间二硫键交联的两条重链（HC）和两条轻链（LC）。四条多肽链中的每一条的氨基末端部分都包含主要负责抗原识别的约100-125或更多个氨基酸的可变区。四条多肽链中的每一条的羧基末端部分都含有主要负责效应子功能的恒定区。每条重链包含重链可变区（VH）和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区（VL）和轻链恒定区。IgG同种型可以进一步分成亚类（例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）。
VH和VL区可进一步细分成点缀有更保守的称为构架区（FR）的区域的具有高变性的称为互补性决定区（CDRs）的区域。CDRs暴露在蛋白表面，且是对于抗原结合特异性的抗体中的重要区域。每个VH和VL由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDRs称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”且轻链的三个CDRs称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDRs含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。可以根据众所周知的方案进行氨基酸残基到CDRs的分配，包括Kabat（Kabat等人, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md.（1991））、Chothia（Chothia等人, “Canonicalstructures for the hypervariable regions of immunoglobulins”, Journal ofMolecular Biology, 196, 901-917 (1987)；Al-Lazikani等人, “Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal ofMolecular Biology, 273, 927-948（1997））、North（North等人, “A New Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations”, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256（2011））或IMGT（可在www.imgt.org获得的国际ImMunoGeneTics数据库；参见Lefranc等人,Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212）中描述的那些。North CDR定义用于本文所述的抗人CD19抗体。
本公开内容的抗体的示例性实施方案还包括抗体片段或抗原结合片段，其包含保留与抗原特异性相互作用的能力的抗体的至少一部分，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、scFab、二硫键连接的Fvs（sdFv）、Fd 片段和线性抗体。
除非另外指出，否则如本文所使用的术语“结合（bind）”和“结合（binds）”意图意指蛋白或分子与另一种蛋白或分子形成化学键或有吸引力的相互作用的能力，这导致两种蛋白或分子接近，如通过本领域已知的常用方法确定的。
除非另外说明，否则如本文所使用的术语“CD19”指人B-淋巴细胞抗原CD19（也称为分化簇19、B-淋巴细胞表面抗原B4、T-细胞表面抗原Leu-12或CVID3）。人CD19的氨基酸序列是本领域已知的，例如，NCBI参考序列NP_001171569.1（同种型1，SEQ ID NO: 56）或NP_001761.3（同种型2，SEQ ID NO: 57）。同种型2是同种型1的剪接变体，且在细胞内结构域中比同种型1短一个氨基酸。本文使用的术语“CD19”总起来说指所有已知的人CD19同种型和多态形式。
如本文所用的术语“Fc区”指抗体的区域，其包含抗体重链的CH2和CH3结构域。任选地，Fc区可以包含抗体重链的部分铰链区或整个铰链区。
如本文所用的术语“非耗尽性抗体”指如与治疗前的B细胞数目所比较的，治疗后不显著减少主体中的B细胞数目的抗体。B细胞数目可以使用众所周知的测定来测量，例如在实施例中描述的那些。非耗尽性抗体一般不诱导抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）、依赖抗体的细胞吞噬作用（ADCP）、依赖补体的细胞毒性（CDC）或B细胞的凋亡。
如本文可互换使用的术语“核酸”或“多核苷酸”指核苷酸的聚合物，包括单链和/或双链含核苷酸的分子，例如DNA、cDNA和RNA分子，并入天然的、修饰的核苷酸和/或核苷酸的类似物。本公开内容的多核苷酸还可以包括例如通过DNA或RNA聚合酶或合成反应并入其中的底物。
如本文所用的，术语“主体”指哺乳动物，包括，但不限于，人、黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等。优选地，主体是人。
如本文所用的，术语“治疗有效量”指将引出主体的生物学或医学反应的蛋白或核酸或载体或组合物的量，例如，酶或蛋白活性的降低或抑制，或改善症状，使状况缓和，减慢或延迟疾病进展，或预防疾病，等。在非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”指蛋白或核酸或载体或组合物的量，其当施用于主体时，有效地至少部分缓和、抑制、预防和/或改善状况、或病症或疾病。
如本文所用的，“治疗（treatment）”或“治疗（treating）”指其中可能存在本文所公开的病症或疾病的进展的减慢、控制、延迟或停止，或改善病症或疾病症状的所有过程，但不必定表示完全消除所有病症或疾病症状。治疗包括施用蛋白或核酸或载体或组合物用于治疗患者特别是人中的疾病或状况。
附图说明
图1A-1B显示抗人CD19亲本抗体C323（图1A）和最优化的抗人CD19抗体CB3f（图1B）的表面疏水性分布图。
图2显示在ELISA测定中抗人CD19抗体与人CD19的结合。
图3显示抗人CD19 mAb CB3f对原代B细胞增殖的抑制。
图4显示抗人CD19 mAb CB3f对全血中B细胞活化的抑制。
图5显示抗人CD19 mAb CB3f对B细胞分化成浆母细胞的抑制。
图6A-6B显示抗人CD19 mAb CB3f缺乏CDC（图6A）和ADCC（图 6B）活性。
图7显示抗人CD19 mAb CB3f和奥贝利单抗对人全血中细胞的结合特异性。
图8显示奥贝利单抗和抗人CD19 mAb CB3f对B细胞凋亡的诱导中的差异。
图9A-9B显示在治疗后第6天（图9A）和第10天（图9B）用抗人CD19 mAb CB3f治疗的NSG小鼠中人IgM的降低。
图10显示用抗人CD19 mAb CB3f治疗的NSG小鼠中人B细胞上CD86表达的降低。
图11显示用抗人CD19 mAb CB3f治疗的NSG小鼠中B细胞的频率。
图12显示抗人CD19 mAb1（CB3f）和抗人CD19 mAb2（C323.C1）在原代人B细胞中的内化。
图13A-13B显示非耗尽性CD19替代Ab和耗尽性CD20替代Ab在小鼠胶原诱导的关节炎（CIA）模型中的功效的比较。图13A显示在小鼠CIA模型中，以半确立的模式（semi-established mode）用非耗尽性CD19替代Ab治疗比耗尽性CD20替代Ab更大地降低临床分数。在研究的第21天和第42天之间小鼠的临床分数（除了对于同种型对照治疗的无疾病对照组n = 5之外n = 12/组）。符号代表组的平均值，且误差条代表平均值的标准误（SEM）。从第19天开始对动物给药。图13B显示在小鼠CIA模型中用非耗尽性CD19替代Ab治疗比耗尽性CD20替代Ab更大地降低临床分数AUC（第24至42天）。在研究的第24天和第42天之间小鼠的临床分数AUCs（除了对于同种型对照治疗的无疾病对照组n = 5之外n = 12/组）。条代表组的平均值，且误差条代表平均值的标准误（SEM）。从第19天开始对小鼠给药。不共享共同字母的条彼此显著不同（p<.05单因素方差分析（ANOVA）Tukey 事后分析（Tukey's post-hoc））。
图14显示在1型糖尿病的NOD模型中，以半治疗模式用非耗尽性CD19替代Ab治疗比耗尽性CD20替代Ab更大地延迟和降低糖尿病发病率。糖尿病发病率（血糖水平高于240 mg/dl的小鼠被认为是糖尿病的>. 除了对于未治疗组n = 9之外n = 10/组）。在12周龄时开始对动物给药。
图15显示在小鼠EAE模型中，以半治疗模式用非耗尽性CD19替代Ab治疗比耗尽性CD20替代Ab更大地降低临床分数。在研究的第6天和第42天之间小鼠的临床分数（n = 12/组）。符号代表组的平均值，且误差条代表平均值的标准误（SEM）。从第6天开始对动物给药。* p<0.05对同一日同种型对照。
具体实施方式
实施例
提供以下实施例来举例说明但不限制请求保护的发明。
实施例1. 产生结合人CD19的抗体（抗人CD19抗体）。
抗人CD19抗体C323是使用针对用人CD19（SEQ ID NO: 56）及其共同受体CD21共转染的人胚胎肾（HEK）细胞的基于细胞的淘选从噬菌体展示文库发现的。针对亲本HEK-293细胞的负淘选用于去除非特异性细胞结合物（binders）。通过ELISA使用CD19细胞外结构域（ECD）蛋白证实CD19-特异性结合。在转变为IgG形式和纯化后，通过FACS使用Daudi人伯基特淋巴瘤细胞系和分离的原代人B细胞证实细胞结合。
疏水作用层析（HIC）是通常用于表征抗体变体的用于分离蛋白的技术；且感兴趣的蛋白到HIC柱的保留时间反映了它的总疏水性（J Pharm Biomed Anal. 2016 130:3-18）。由于延长的HIC柱保留时间，C323被认为是疏水的。抗体疏水性可导致制造问题，例如不良表达和蛋白聚集。定向和随机诱变用于增强C323的生物物理性质并增加其亲和力和效价。产生了C323抗人CD19亲本mAb可变区的同源模型。然后将空间聚集倾向算法应用于模型以鉴定表面暴露的疏水斑块。所述方法鉴定了LCDR1、HCDR2和HCDR3内的八个表面暴露的疏水残基：LCDR1：Y31、Y32；HCDR2：I52、I53和F54；HCDR3：F97、Y99和Y100a（Kabat 编号）（图1A）。这些残基被靶向用于诱变。使用基于VVK密码子的诱变寡核苷酸产生文库以包含更多亲水性（极性或带电的）氨基酸，并使用Kunkel诱变将其并入到编码选择的CDR序列被缺失的原始C323亲本抗体的含有尿嘧啶的单链DNA模板中。使用生物素化的人CD19 ECD抗原筛选噬菌体表达的Fab。以这种方式鉴定的亲和力中性突变被DNA测序且独特的克隆在大肠杆菌（E. coli）中作为周质Fab表达，并通过滴定ELISA进行分析。所述方法鉴定了三个亲和力中性但更亲水的氨基酸取代：LCDR1：Y31H、HCDR2：F54Y和HCDR3：Y99K（Kabat 编号）。
同时，使用靶向所有六个CDRs的基于NNK密码子的诱变寡核苷酸进行最优化以增加亲和力，并使用Kunkel诱变将其并入选择的CDRs被缺失的含有尿嘧啶的单链DNA模板中。噬菌体表达的Fab变体的筛选通过捕获转移（capture-lift）（Anal Biochem. 1998 256(2):169-77）和使用生物素化的人CD19 ECD抗原的ELISA来进行。以这种方式，鉴定了导致增加的亲和力的CDR取代：HCDR1：F29I、I34Y；HCDR2：G55D，HCDR3：G100bA；LCDR1：G27aK、A34H，LCDR2：S52R、A55P，LCDR3：N93Q（Kabat编号）并将其组合，从而导致产生C323.C1。
将上述三个亲水性取代（Y31H、F54Y和Y99K）添加到C323.C1中，从而产生Fab模板，所述模板用于使用基于NNK密码子的诱变的最后一轮CDR随机化。将有益的CDR突变组合在文库中，从而允许所有有益的突变被随机组合或回复突变为野生型序列。所述方法鉴定了称为CB3的高亲和力变体。CB3含有额外的CDR残基取代：HCDR1：G27H，HCDR2：G50D、I53A、D55G、T56S、A57P；LCDR1：K27aH、H34A，LCDR3：L95Q（Kabat 编号）。
使用CB3作为模板，进行额外的CDR改变以将具体残基回复为人IGKV3-20种系个性。LCDR1中的一个残基：N29S和LCDR2中的五个残基：A50G、T51A、R52S、T53S、P55A在对抗体功能的影响最小的情况下同时回复。这结果产生了称为CB3f的最终分子。
产生了几种形式的CB3f，包括（1）IgG4 同种型，其包含SEQ ID NO: 35的HC和SEQID NO: 39的LC；（2）IgG1同种型，其包含SEQ ID NO: 50的HC和SEQ ID NO: 39的LC，和（3）IgG1效应子无效抗体，其包含SEQ ID NO: 52的HC和SEQ ID NO: 39的LC。除非另外详细说明，否则“CB3f”指包含SEQ ID NO: 35的HC和SEQ ID NO: 39的LC的IgG4同种型。
图1A-1B显示了与亲本抗体C323相比，CB3f的改进的表面疏水性分布图。当与亲本抗体C323相比时，CB3f在HIC柱上的保留时间降低到低于1/2。同时，当与亲本C323抗体滴度相比时，来自瞬时CHO表达的CB3f抗体滴度增加到不止两倍。
图2显示在ELISA测定中，当与C323和C323.C1相比时，亲和力人工改造的抗体CB3和CB3f与人CD19的改善的结合。ELISA测定如下执行。使用50 µL/孔的在磷酸缓冲盐水（PBS）中稀释至5 µg/mL的山羊抗人κ多克隆抗体，于4℃过夜包被96孔微量滴定板。过夜温育后，将平板抽吸并于室温使用200 µL酪蛋白缓冲液封闭1小时。使用PBST（具有0.1%吐温的PBS）将平板洗涤3次。抗人CD19抗体在PBS酪蛋白中稀释至5 µg/mL，并于37℃将50 µL添加到抗人κ包被的酪蛋白封闭的平板的每列中达1小时。使用PBST将平板洗涤3次。将生物素化的人CD19细胞外结构域蛋白从20 µg/mL连续稀释至9 ng/mL，且将50 µL添加到平板中，并于37℃温育1小时。将平板使用PBST洗涤3次，且然后转移到含有1升PBST的烧杯中，并在搅拌的情况下于37℃温育过夜（约16小时）。吸出洗涤缓冲液，并添加50 µL在酪蛋白缓冲液中1:1000稀释的中性抗生物素蛋白（neutravidin）碱性磷酸酶缀合物，且于37℃温育1小时。使用PBS 0.1%吐温将平板洗涤3 次。添加50 µL在去离子水中1:35稀释的AMP-PMP底物，并在Spectramax平板读出器上读取560 nm处的吸光度。
如下所示，CB3f显示出与表达人CD19的CHO细胞的高亲和力结合，并且已出乎意料地获得了与表达食蟹猴CD19的CHO细胞的结合。CB3f分别与人IGHV1-69和IGKV3-20种系具有92%和96%的同一性。因此，抗人CD19抗体CB3f具有高亲和力、低疏水性和高百分比的人种系同一性，即，低免疫原性危险。
本文所述的抗人CD19抗体，包括但不限于CB3f，可以在用表达系统瞬时或稳定转染的哺乳动物细胞系如HEK293或CHO中表达，所述表达系统用于使用最佳预定HC:LC载体比或编码HCs和LC两者的单个载体系统分泌抗体。已向其中分泌抗体的澄清培养基可使用常用技术进行纯化。在这些层析步骤之后，抗体的纯度可以达到大于99.0%（单体）的值。
实施例2. 抗人CD19抗体的表征。
与CD19的结合亲和力
抗人CD19 mAb CB3f与在CHO细胞上稳定表达的膜结合的人CD19和食蟹猴CD19的溶液相平衡结合亲和力通过MSD溶液平衡滴定（MSD-SET）测定于37℃进行测量。此外，CB3fFab片段与CD19结合的单价亲和力和动力学于37℃通过表面等离振子共振（SPR）进行测量。
MSD SI6000仪器（Meso Scale Discovery, Rockville, MD）用于读取MSD平板。MSD测定平板如下制备。多阵列96-孔平板（Meso Scale Discovery, P/N L15XA-3）于4℃用1 μg/mL山羊抗人Fc捕获抗体（Jackson ImmunoResearch, P/N 109-005-098）在PBS中的溶液包被过夜。包被后将平板在TBS + 0.1%吐温-20（TBST）中洗涤3X。
于室温将稳定表达人和食蟹猴CD19细胞的CHO细胞于在PBS中的1%低聚甲醛中固定5分钟。通过用PBS洗涤去除低聚甲醛，并将细胞于4℃储存在具有0.05%（w/v）叠氮化钠的1% Blocker A（从3% Blocker A稀释的，Meso Scale Discovery, P/N R93AA-1）中。
对于人CD19亲和力测量，以400 pM、80 pM、16 pM和3.2 pM的固定的抗体浓度一式两份地制备样品。对于食蟹猴CD19亲和力测量，以10 nM、2 nM、400 pM和80 pM的固定的抗体浓度一式两份地制备样品。固定的人CD19 CHO细胞通过离心沉淀并以22 x 106个细胞/mL重悬浮于3% Blocker A溶液中。固定的食蟹猴CD19 CHO细胞通过离心沉淀并以200 x106个细胞/mL重悬浮于3% Blocker A溶液中。将细胞在锥形底96-孔平板中在3% BlockerA中连续稀释2.5-倍降到大约对于人CD19为900个细胞/mL和对于食蟹猴CD19为8,400个细胞/mL，达各自总数为12次细胞稀释。这些与以前制备的抗体稀释物1:1混合。对于人CD19，最终抗体浓度为200 pM、40 pM、8 pM和1.6 pM，且最终细胞稀度为11 x 106个细胞/mL降到大约450个细胞/mL。对于食蟹猴CD19，最终抗体浓度为5 nM、1 nM、200 pM和40 pM，且最终细胞稀度为100 x 106个细胞/mL降到大约4,200个细胞/mL。将平板在平板摇床上于37℃对于人CD19温育3-4天且对于食蟹猴CD19温育2天，以使结合达到平衡。
温育后，细胞通过离心沉淀。将来自平板的100微升澄清的上清液转移到准备好的MSD平板，并于室温在平板摇床上温育60分钟。温育后，将平板用TBST洗涤3X，然后将100 μL在1% Blocker A中的1 μg/mL生物素化的山羊抗人IgG第一抗体（Southern Biotech, 产品目录2010-08）添加到所有孔中。这于室温在平板摇床上温育60分钟。将平板用TBST洗涤3X，然后将100 µL在1% Blocker A中的1 µg/mL SULFO-TAG链霉抗生物素蛋白（Meso ScaleDiscovery, P/N R32AD-1）添加到所有孔中。这于室温在平板摇床上温育60分钟。将平板用TBST洗涤3x，然后在读取平板之前马上添加1X读出缓冲液（Read Buffer）T（Meso ScaleDiscovery, P/NR92TC-1）。在GraphPad Prism中使用非线性回归将解离常数（KD）和计及细胞上未知抗原浓度的最小公倍数（LCM）从MSD-SET数据全局拟合到平衡结合方程（参见Darling和Brault, 2005, Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterizationof Molecular Interactions. Assay and Drug Development Technologies 2: 647–657）。
Biacore T200仪器（GE Healthcare Life Sciences）、试剂和Biacore T200评价软件Ver 3.1 用于人、小鼠和食蟹猴CD19与CB3f的Fab片段结合的表面等离振子共振分析。重组CD19-Fc蛋白购自R&D Systems。使用A蛋白传感器芯片（GE A蛋白芯片P/N 2912755）。运行缓冲液为1X HBS-EP+（Teknova P/N H8022），且运行温度为37℃。
CD19 Fc融合蛋白在运行缓冲液中稀释至3 μg/mL，且人、食蟹猴和小鼠蛋白各约60 RU 分别在流动池（Fc）2、3和4中捕获。CB3f Fab片段在运行缓冲液中稀释至1000 nM，且然后在运行缓冲液中5-倍连续稀释至1.6 nM达总数为5次稀释。Fab或缓冲液空白以50 µL/分钟注射300秒，继之以900秒的解离阶段。通过在所有Fc上以50 µL/分钟注射10 mM甘氨酸pH 1.5达30秒来进行再生。参考减去的数据收集为Fc2-Fc1、Fc3-Fc1和Fc4-Fc1，且然后参考减去的数据是空白减去的。结合速率（kon）和解离速率（koff）使用“1:1结合”模型进行拟合。根据以下关系从结合动力学计算亲和力（KD）：KD = koff /kon。
CB3f分别以3.35 pM和45.2 pM的亲和力（KD）与在CHO细胞上表达的人和食蟹猴CD19结合（表1）。
CB3f的Fab片段以3.20 x 106 M-1 s-1的结合速率（kon）、2.35 x 10-4 s-1的解离速率（koff）和76.8 pM的亲和力（KD）结合人CD19（表2）。CB3f的Fab片段以1.04 x 106 M-1 s-1的结合速率（kon）、9.78 x 10-2 s-1的解离速率（koff）和94.5 nM的亲和力（KD）结合食蟹猴CD19（表2）。在1µM Fab浓度未观察到与小鼠CD19的结合。
表1：CB3f与表达人或食蟹猴CD19的固定的CHO细胞的体外结合。
[由MSD-SET于37℃测量的。结果报告为来自3次独立重复实验的KD的几何平均值。误差估计计算为几何平均值 x 标准差log10 KD x ln 10]
物种 mAb亲和力（pM）
人CD19 3.35 ± 0.56
食蟹猴CD19 45.2 ± 2.8
表2：CB3f的Fab片段与人、食蟹猴和小鼠CD19 Fc融合蛋白的体外结合参数。
[于37℃通过表面等离振子共振（SPR）测量的。结果报告为3次独立重复实验的平均值±标准差。]
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稳定性
在具有赋形剂的5 mM组氨酸缓冲液（pH 6.0）中以高浓度（约100 mg/mL）评估CB3f的稳定性。将浓缩的样品于5℃和35℃温育4周的时间段。温育后，使用大小排阻层析（SEC）分析样品的高分子量百分比（%HMW），通过毛细管电泳（CE-SDS）分析片段化，以及通过LC-MS肽作图分析化学修饰（例如脱酰胺作用、异构化或氧化）。于35℃ 4周后，CB3f显示出0.5%的∆%HMW，0.6%的∆%片段，以及没有大于0.2%的CDR化学修饰。
使用模拟放置在-70℃的大体积大批药品（bulk drug substance）的冻/融条件的3次重复的缓慢、受控的温度循环评价相同条件下的冻/融稳定性。在3个冻-融循环后，CB3f显示出如由SEC 所测量的1.9%的∆%HMW。其他赋形剂可以进一步降低%HMW增长（数据未显示）。
这些结果表明CB3f具有良好的物理和化学稳定性。
溶解度
通过使用30 kDa分子量截断离心过滤器（例如，Amicon U.C.过滤器, Millipore,产品目录# UFC903024）将100mg CB3f浓缩至约0.5 mL的体积来评估溶解度。使用Solo VPE分光光度计（C Technologies, Inc）通过280 nm处的紫外线吸光度测量样品的最终浓度。
CB3f展示在5 mM组氨酸pH 6缓冲液中大于或等于183 mg/mL的溶解度，和在PBS（磷酸缓冲盐水）pH 7.4中大于或等于170 mg/mL的溶解度。这些结果表明CB3f显示出高溶解度。
粘度
CB3f的粘度于15℃以在具有不同赋形剂的pH 6.0的5 mM组氨酸中大约125 mg/mL的浓度进行分析。使用VROC Initium（RheoSense）进行粘度测量。CB3f显示出在pH 6的5mM组氨酸 + 280mM甘露糖醇中在131 mg/mL时14.2 cP，在pH 6.0的5mM组氨酸 + 150 mM氯化钠中9.5 cP，和在5mM组氨酸pH 6.0 + 280 mM精氨酸中6.1 cP粘度的粘度。这些结果表明CB3f显示出低粘度，这可以使得能够实现高浓度给药。
药物代谢动力学（PK）
在单次皮下施用0.03、0.3、1和10 mg/kg CB3f或静脉内快速灌注方式（singleintravenous bolus）施用1 mg/kg CB3f后，在食蟹猴中研究CB3f的PK性质。CB3f在检查的皮下剂量范围内显示线性PK，而最终半衰期（T1/2）的范围从182一直到301小时。静脉内快速灌注方式施用1 mg/kg CB3f后的T1/2为324小时。
据报道，奥贝利单抗具有3.5±1.0天的平均T1/2，其等于60-108小时（Jaraczewska-Baumann等人, European League Against Rheumatism (EULAR) 2015Annual Meeting Poster: A Phase 1b/2a Study of the Safety, Tolerability, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of XmAb®5871 in Patients with Rheumatoid Arthritis, 2015年6月12日, 可在https://investors.xencor.com/static-files/0017dcf1-deb2-46eb-93ff-90ba164ec50c获得）。因此，CB3f具有比奥贝利单抗更好的T1/2 。
实施例3. 抗人CD19抗体的体外功能表征。
抗人CD19 mAb CB3f对B细胞增殖的体外抑制。
在体外B细胞增殖测定中测试了抗人CD19 mAb CB3f抑制原代人B细胞增殖的能力。
使用B细胞分离试剂盒（Stemcell Technologies）通过负选择从健康供体PBMCs分离原代人B细胞。人原代B细胞以1 x 106个细胞/mL重悬浮，并于37℃在聚苯乙烯96-孔、u型底平板中在完全培养基（含有10%胎牛血清、1x MEM-非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、1x青霉素-链霉素溶液（均来自Corning）和1x Glutamax（Gibco）、0.1% β-巯基乙醇（LifeTechnologies）的RPMI-1640中培养。细胞用抗人CD19抗体预处理1小时，并于370和5% CO2用小鼠抗人IgM（2μg/mL-Southern Biotech）加兔抗小鼠IgG（12μg/mL-Thermo Fisher）刺激2天。然后用[3H]-胸苷（1µCi胸苷/孔，PerkinElmer, Boston, MA）脉冲细胞用于18小时的细胞培养。[3H]-胸苷的并入水平通过2450微量培养板计数器（Microplate Counter）（MicroBeta²序列号：5129186, PerkinElmer, Boston, MA）测量并表示为每分钟细胞计数（c.c.p.m）。
抗人CD19 mAb CB3f以剂量依赖性方式抑制原代人B细胞的增殖，而同种型对照在任何测试的浓度均未显示出抑制（图3）。使用从12个不同供体获得的B细胞测试CB3f的抑制功能，且CB3f的平均IC50为0.007 nM（表3）。数据显示抗人CD19 mAb CB3f可以以剂量依赖性方式抑制人原代B细胞的增殖，而B细胞增殖不受同种型对照抗体的影响。
表3. 抗人CD19 mAb CB3f对原代B细胞增殖的抑制
IC<sub>50</sub>值（nM）
供体1 0.006
供体2 0.009
供体3 0.003
供体4 0.006
供体5 0.004
供体6 0.003
供体7 0.003
供体8 0.005
供体9 0.005
供体10 0.028
供体11 0.004
供体12 0.005
平均值 0.007
人全血中的B细胞活化的体外抑制
在体外全血活化测定中测试了抗人CD19 mAb CB3f抑制全血中原代人B细胞活化的能力。
EDTA处理的人全血（健康供体，TSRI Normal Blood Donor Services, SanDiego, CA）在聚苯乙烯96-孔、u型底平板中培养，并于37℃和5% CO2与CB3f或同种型对照抗体预温育30分钟至1小时。7 nM每种抗体用作最高浓度，同时在完全培养基（含有10%胎牛血清、1x MEM-非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、1x青霉素-链霉素溶液（均来自Corning）和1xGlutamax（Gibco）、0.1% β-巯基乙醇（Life Technologies）的RPMI-1640中进行4倍稀释和12点滴定。全血于37℃和5% CO2用2.5 µg/mL TLR9配体刺激24小时（CpG ODN 7909(InvivoGen, San Diego, CA)）。通过流式细胞术测量B细胞活化分布图，并使用FlowJo软件分析数据。
流式细胞术如下进行。用RBC裂解缓冲液（Fisherscientific, USA）裂解经处理和活化的人全血。细胞于4℃用荧光染料缀合的抗体的适当组合染色30分钟，以鉴定B细胞活化标记：来自BioLegend的CD69 BV605（cat #310938）。细胞还用均来自BioLegend的CD3FITC（cat # 300306）、CD19 APC（cat # 363006），来自BD Pharminogen的CD20 PerCP-Cy5.5（cat # 560736）和可固定的生存力染料（fixable viability dye）eFluor™ 780（eBioscience）染色。对于每个样品至少分析了25,000-50,000个活细胞门控事件。在BDFortessa X-20上获得样品，并使用FlowJo软件分析结果。
抗人CD19 mAb CB3f以剂量依赖性方式抑制原代人B细胞的活化，这通过CD69+ B细胞的减少来测量。使用从三个不同供体获得的血液进行测定，且代表性结果显示在图4中。所述测定中CB3f的平均IC50为0.008 nM（表 4）。同种型对照抗体在任何测试的浓度均未显示对CD69表达的抑制。数据显示，抗人CD19 mAb CB3f可以以剂量依赖性方式抑制全血中原代人B细胞的活化，而B细胞活化不受同种型对照抗体的影响。
表4. 抗人CD19 mAb CB3f抑制全血中B细胞活化
IC<sub>50</sub>值（nM）
供体1 0.015
供体2 0.0006
供体3 0.008
平均值 0.008
体外抑制B细胞分化为浆母细胞
使用记忆B细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）从健康供体PBMCs分离记忆人B细胞。人原代记忆B细胞以1 x 106个细胞/mL重悬浮，并于37℃在聚苯乙烯96-孔、u型底平板中在完全培养基（含有10%胎牛血清、1x MEM-非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、1x青霉素-链霉素溶液（均来自Corning）和1x Glutamax（Gibco）、0.1% β-巯基乙醇（Life Technologies）的RPMI-1640中培养。细胞用抗人CD19 mAb CB3f预处理1 小时，并用50 ng/mL抗-CD40、200ng/mL BAFF、1 ng/mL IL-2、100 ng/mL IL-21（均来自R&D）刺激5天。洗涤细胞并于4℃用适当的荧光染料缀合的抗体组合染色30分钟，以鉴定记忆B细胞分化为浆母细胞：均来自BioLegend的CD38 PE、CD3 FITC（cat # 300306）, CD19 APC（cat # 363006），来自BDPharminogen的CD20 PerCP-Cy5.5（cat. # 560736），和可固定的生存力染料eFluor™780, eBioscience。对于每个样品至少分析了25,000-50,000个活细胞门控事件。在BDFortessa X-20上获得样品，并使用FLowJo软件分析结果。浆母细胞百分比定义为CD38亮/CD20低B细胞的%。
抗人CD19 mAb CB3f以剂量依赖性方式抑制原代人记忆B细胞分化为浆母细胞（图5）。实验重复3次并显示代表性数据。同种型对照抗体在任何测试的浓度均未显示对浆母细胞分化的抑制。数据显示，CB3f可以以剂量依赖性方式抑制原代人记忆B细胞分化为浆母细胞，而分化不受同种型对照抗体的影响。
CD19 mAb CB3f是非耗尽性mAb，且在体外CDC和ADCC测定中缺乏活性。
抗人CD19 mAb CB3f是B细胞抑制性抗体，其被设计成在不导致B细胞耗尽的情况下抑制B细胞功能。进行体外测定以证实CB3f缺乏依赖补体的细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）活性，这意味着其它不具有耗尽功能。
表达CD19和CD20的Wil2-s细胞系用作靶细胞，且表达功能性FcγRIIIa (V158)-NFAT-Luc的Jurkat细胞系（Eli Lilly and Company）用作效应细胞系。测试了CB3f，且作为已知的ADCC和CDC的有效诱导物的IgG1抗体用作阳性对照。
CB3f一式三份连续稀释，对于CDC和ADCC测定分别从10 μg/mL和1 μg/mL测试浓度开始。将50 μL/孔测试化合物或测定缓冲液添加到96-孔平板（Costar 3916）。将Wil2-s细胞稀释至1x106个细胞/mL的浓度，并添加50 μL/孔至平板。CDC和ADCC平板于37℃温育1小时。紧接着，将Jurkat V158细胞稀释至3x106个细胞/mL的浓度，并添加50 μL/孔用于ADCC平板，或添加50 μL/孔来自人血清的预稀释补体（Quidel A113）用于CDC平板。CDC平板于37℃温育2小时，继之以添加100 μL/孔Cell-Titre Glo（Promega G7571）。ADCC平板于37℃温育4小时，继之以添加100 μL/孔ONE-Glo（Promega E8130）。使用平板摇床以低速混合平板的内容物，并使用0.2 cps积分（integration）在Envision 11多模式平板读出器上读取发光信号。使用GraphPad Prism v8.2分析数据。
CDC和ADCC测定的结果显示在图6A-6B中（来自三个独立的平板运行的代表性结果）。所有反应水平都相对于阳性对照IgG1抗体进行分类。抗人CD19 mAb CB3f在所示的浓度既没有CDC活性（图6A）也没有ADCC活性（图6B）。
抗人CD19 mAb与人全血中B细胞结合的特异性。
抗人CD19 mAb CB3f是B细胞抑制性抗体，其通过抑制B细胞功能发挥作用。奥贝利单抗是结合CD19和FcγRIIb两者的抗体。然而，奥贝利单抗与FcγRIIb的高亲和力结合可导致以不依赖CD19的方式与其他细胞类型结合。因此，使用人全血结合测定比较了奥贝利单抗和抗人CD19 mAb CB3f的结合特异性。
EDTA处理的人全血（健康供体，TSRI Normal Blood Donor Services, SanDiego, CA）平板接种在聚苯乙烯96-孔中，并用不同浓度的Alexa Flour® 647缀合的CB3f、Alexa Flour® 647缀合的和Alexa Flour® 647缀合的同种型对照加荧光染料缀合的细胞外抗体的适当组合进行染色，以检测淋巴细胞/粒细胞群体。7 nM每种抗体用作最高浓度，同时在均来自Corning®的补加了2%胎牛血清（FBS-热灭活的）的DPBS 1x无Ca2+、无Mg2+（Dulbecco磷酸缓冲盐水（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline））中进行3倍稀释和8点滴定。混合物包括均来自BD Biosciences的CD20 PerCP-Cy5.5（cat # 560736）、CD45BV421（cat # 563879）、CD66 FITC（cat # 555724)，均来自BioLegend的CD3 BV605（cat #317322）、CD11b PE-Cy7（cat # 101216）和来自eBioscience的可固定的生存力染料eFluor™ 780（cat # 65-0865-14）。全血加抗体于4℃在黑暗中染色30分钟。死细胞被生存力染料排除，并且至少分析了25,000-50,000个活细胞门控事件。在BD Fortessa X-20上获得样品，并使用FlowJo软件分析结果。
流式细胞术分析证实，在所有测试的浓度，CB3f仅与人全血中的B细胞结合（图7）。奥贝利单抗显示与人B细胞以及表达CD66和CD11b并因此被鉴定为嗜中性粒细胞的CD20-阴性细胞（即，非-B细胞）群体结合（图7）。因此，数据表明抗人CD19 mAb CB3f与人全血中的人B细胞具有高度特异性结合，而奥贝利单抗除了B细胞结合外，还显示与人嗜中性粒细胞的非特异性结合。由于嗜中性粒细胞是人中最丰富的白细胞类型，所以与嗜中性粒细胞的非特异性结合可能解释了在人患者中观察到的奥贝利单抗的短半衰期。使用来自四个不同供体的血液重复所述实验，代表性结果显示在图7中。
体外凋亡测定。
如上所述，在临床研究期间，显示奥贝利单抗减少人患者中的B细胞计数（Jaraczewska-Baumann等人, EULAR 2015 Annual Meeting Poster: A Phase 1b/2a Study of the Safety, Tolerability, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of XmAb®5871 in Patients with Rheumatoid Arthritis，2015年6月12日）。
使用体外B细胞凋亡测定测试抗人CD19 mAb CB3f和奥贝利单抗诱导原代人B细胞凋亡的能力。使用B细胞分离试剂盒（Stemcell Technologies）通过负选择从健康供体PBMCs分离人原代B细胞。人原代B细胞以1 x 106个细胞/mL重悬浮，并于37℃在聚苯乙烯96-孔、u型底平板中在完全培养基（含有10%胎牛血清、1x MEM-非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、1x青霉素-链霉素溶液（均来自Corning）和1x Glutamax（Gibco）、0.1% β-巯基乙醇（Life Technologies）的RPMI-1640中培养。于37℃和5% CO2，用所示浓度的CB3f、奥贝利单抗或同种型对照抗体处理细胞24小时。B细胞凋亡通过流式细胞术使用膜联蛋白V染色结合生存力染料进行测量。细胞于4℃用适当的荧光染料缀合的抗体组合染色30分钟以鉴定B细胞活化标记：CD19 APC（Biolegend）、CD20 PerCP-Cy5.5（BD Pharminogen）、膜联蛋白V（Invitrogen）和可固定的生存力染料eFluor™ 780（eBioscience）。凋亡细胞被定义为活的膜联蛋白V+细胞。在BD Fortessa X-20上获得样品，并使用FlowJo软件分析结果。
使用从三个不同供体获得的B细胞重复实验，并且代表性数据显示在图8中。奥贝利单抗以剂量依赖性方式诱导B细胞凋亡（图 8），这可以解释临床研究中观察到的人患者中B细胞计数的减少。相对照而言，当与同种型对照相比时，CB3f诱导非常小至不诱导人B细胞凋亡（图8）。数据表明，与奥贝利单抗相对比，抗人CD19 mAb CB3f不先体外后体内诱导原代人B细胞凋亡，从而提示CB3f的不同作用机制。所示数据进一步表明抗人CD19 mAb CB3f通过在不耗尽B细胞或显著减少B细胞数目的情况下抑制B细胞功能发挥作用。
实施例4. 抗人CD19抗体的体内功能表征。
雌性NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, JAX Labs, 原种（Stock）#05557）于72℃在12小时光:暗周期下每笼3只安置，并允许随意进食和饮水（n=33）。根据制造商的说明（StemCell Technologies, Vancouver, BC），使用SepMate 50 Ficol制备管从获得自San Diego Blood Bank（San Diego CA）的LRS管分离人外周血单核细胞（PBMCs）。将新鲜分离的PBMCs以1.2 e8个细胞/mL悬浮在PBS中，并在第0天用100 µL PBMCs悬浮液静脉内移入小鼠（1.2e7/小鼠，n=29）；4只小鼠未施用PBMCs作为非移入的对照。在第1天，将小鼠分成3个重量匹配组，并皮下用0.01或1.0 mg/kg的人IgG4同种型对照或CB3f给药（200 µL/小鼠，分别n = 10、10和9）。在剩余的实验中每周一次继续给药。定期进行健康检查和体重测量。在第6天和第10天，通过剪尾将血液收集到肝素包被的毛细管中。在第15天，在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺将血液收集到EDTA管中用于FACS分析，并通过离心澄清用于血浆分析。收获脾并加工成单细胞悬浮液用于FACS分析。
小鼠在BSL2罩中称重，且每周2-3次评估不良应激的临床病征。所述模型常见的临床病征是杂乱的毛发、耸肩弓身的身体、消瘦和困难的呼吸或运动。将体重变化计算为其基线重量的百分比：（第（x）天重量/第0天重量）*100。
来自心脏穿刺的血液被收集到EDTA包被的管中，通过离心澄清，且所得血浆储存于-80℃用于将来处理。根据制造商的说明，使用Mesoscale Discovery人同种型分型实验对象组（Human Isotyping panel）（Rockville Maryland）测量血浆IgM水平。
小鼠脾的单细胞悬浮液用于FACS分析。将细胞在96-孔平板中平板接种，并于4℃用荧光染料缀合的抗体的适当组合染色30分钟，以鉴定B细胞活化标记：均来自BioLegend的hCD45-BV421、CD86 BV650、CD3 APC、CD19 FTIC，CD20 PerCP-Cy5.5和可固定的生存力染料eFluor™ 780。对于每个样品至少分析了250,000个活细胞门控事件。在BD Fortessa X-20上获得样品，并使用FlowJo软件分析结果。使用Prism软件（GraphPad, San Diego, CA）将数据作图并计算统计量。组之间重量中的差异由具有Tukey事后分析检验的2-因素RM-ANOVA确定。血浆IgM水平中的差异由具有Tukey事后分析检验的1-因素ANOVA确定，且如果p< 0.05，则被认为是显著的。
将人PBMCs注射到NSG小鼠中导致功能性B细胞显著的移入，如通过人IgM分泌到周边所测量的。分别在移入后第6天和第10天，IgG4同种型对照处理的动物中的人IgM从不可检测迅速增加到1.3±0.1和48.8±6.2 µg/mL。以0.01和1.0 mg/kg/wk给药的CB3f在第6天显著将IgM的分泌减弱60%和78%，如图9A-9B中所示的（对于两种剂量p<0.01）。使用1.0 mg/kg/wk剂量的CB3f在第10天也观察到循环IgM中的57%减少（p<0.05）。组之间的小鼠重量没有差异，也没有任何小鼠展示GvHD的病征。
NSG小鼠中人B细胞的活化通过活化标记CD86的表达来测量。如图10中所证实的，用抗人CD19 mAb CB3f处理以剂量依赖性方式降低人B细胞上CD86的表达。
用CB3f治疗导致脾B细胞百分比轻度降低，这可能归因于减低的B细胞活化和增殖。尽管如此，但B细胞在脾中以基本上未改变的数目存在（>50%的脾细胞），从而指示抗人CD19 mAb CB3f的非耗尽特性（图11）。
实施例5. 人原代B细胞中抗人CD19抗体的内化
使用标准密度梯度离心法从健康志愿者的LRS-WBC收集外周血单核细胞（PBMCs）。使用B细胞分离试剂盒通过负选择从健康供体PBMCs分离人原代B细胞。对于内化研究，B细胞以4x106个细胞/mL重悬浮，并在96孔平板的每个孔中添加50 µL。靶向人Ig Fcγ片段的标记的F(ab')2（F(ab')2-TAMRA-QSY7）用作探针以追踪内化。测试抗体与探针于4℃温育30分钟以形成复合体，并将50 µL添加到每个孔中的B细胞中。测试抗体的最终浓度为2 µg/mL。细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。然后将细胞用2% FBS PBS洗涤两次，并重悬浮在具有生存力染料（SYTOX Green, Invitrogen）的2% FBS PBS中。数据在BD Fortessa X-20上收集并在FlowJo中进行分析。
抗人CD19 mAb1（CB3f）和抗人CD19 mAb2（C323.C1）两者均在24小时时显示在原代人B细胞中的内化（图12）。IgG1效应子无效同种型对照抗体用作阴性对照并且不显示任何显著的内化，如由低百分比的TAMRA+细胞所证明的（图12）。阳性对照IgG4 mAb显示出与测试的抗人CD19 mAbs类似的内化（图12）。
实施例6. 在动物模型中比较非耗尽性抗小鼠CD19替代抗体与B细胞耗尽性抗小鼠CD20替代抗体的功效
非耗尽性CD19替代抗体和B细胞耗尽性CD20替代抗体在小鼠CIA模型中的体内功 效
在所述研究中，在小鼠胶原诱导的关节炎（CIA）模型中以半确立的疾病模式与同种型对照抗体一起测试了非耗尽性抗小鼠CD19替代抗体（CD19替代Ab）和B细胞耗尽性抗小鼠CD20替代抗体（CD20替代Ab）（即，在诱导疾病之后但在动物发展任何可检测的临床分数之前引入抗体）。
从第25天开始，用胶原和完全弗氏佐剂（CFA）免疫的同种型对照治疗的小鼠发展了可观察到的关节炎症病征，而同种型治疗的未患病小鼠在整个研究过程中没有可观察到的关节炎症（图13A）。从第19天开始用CD20替代Ab（10 mg/kg SC，每周一次）治疗改善了平均临床分数，而CD19替代Ab（5 mg/kg SC，每周两次）甚至更降低了平均临床分数（图13A）。与同种型对照相比，CD20替代Ab没有显著降低临床分数AUC（图13B）。另一方面，与同种型对照和CD20替代Ab两者相比，CD19替代Ab显著降低了临床分数AUC（图13B）。这些结果提示，CD19替代Ab比CD20替代Ab更大地降低疾病严重程度，如通过以半确立的模式进行的小鼠关节炎的CIA模型中的临床分数AUC所评估的。
非耗尽性CD19替代Ab和B细胞耗尽性CD20替代Ab在1型糖尿病的小鼠NOD模型中的 体内功效。
NOD/ShiLtJ小鼠品系（通常称为非肥胖糖尿病患者）是自身免疫性1型糖尿病（T1D）的多基因模型。NOD小鼠中的糖尿病的特点在于高血糖和胰岛炎，胰岛的白细胞浸润。雌性小鼠中的疾病流行最高。
在所述研究中，在1型糖尿病的小鼠NOD模型中以半治疗疾病模式与耗尽性CD20替代Ab一起测试了非耗尽性CD19替代Ab（即，恰好在对照动物开始发展临床分数之前引入抗体）。
雌性NOD-LTJ小鼠未经治疗，从12周龄开始给药5 mg/kg/BIW的CD19替代Ab或CD20替代Ab。每周使用Accu Check Aviva血糖仪（Roche cat# 06870287001）和测试条（Rochecat# 06908373001 lot# 497064）测试所有小鼠的血糖。血糖水平高于240 mg/dl的小鼠被认为患有糖尿病。未经治疗的小鼠从14周龄开始发展糖尿病。用CD20替代Ab（5 mg/kg SC，每周两次）治疗显示出非常轻度的保护免于疾病进展，而CD19替代Ab（5 mg/kg SC，每周两次）延迟并降低了糖尿病的发病率（图14）。这些结果提示，非耗尽性CD19替代Ab可以比耗尽性抗-CD20替代Ab更大地延迟和降低NOD小鼠中1型糖尿病的发病率。
非耗尽性CD19替代Ab和B细胞耗尽性CD20替代Ab在小鼠EAE模型中的体内功效
小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）已被广泛用作炎性神经变性和脱髓鞘疾病的模型，例如多发性硬化（MS）。
在所述研究中，在蛋白脂质蛋白（PLP）诱导的缓解-复发（RR）脱髓鞘EAE模型中以半治疗疾病模式与耗尽性CD20替代Ab一起测试了非耗尽性抗-CD19替代Ab（即，在疾病诱导后但在动物开始发展任何可检测的临床分数之前引入抗体）。
对于所述研究使用平均体重为18-21g的雌性9-10周龄SJL小鼠（Jackson Labs）。用Hooke Kit™ PLP139-151/CFA乳液（Emulsion）（产品目录号EK-0120, HookeLaboratories, Lawrence MA）和75 ng百日咳毒素（PTX）对小鼠进行免疫。基于体重将动物随机化为研究组，每组15只小鼠。从第8天开始，每周两次皮下给予5 mg/kg的非耗尽性CD19替代Ab、耗尽性CD20替代Ab或同种型小鼠IgG1对照。每天以0-6级以0.5个单位为增量收集EAE分数。第42天处死小鼠。与同种型对照相比，用非耗尽性CD19替代Ab进行的治疗在第35-41天显著降低EAE分数；最后一天的EAE分数中有51%降低（图15）。在任何测试的时间点，比起同种型对照来，用耗尽性CD20替代Ab进行的治疗都没有显示出疾病分数的显著降低（图15）。这些结果提示，非耗尽性CD19替代Ab可以比耗尽性CD20替代Ab更大地降低疾病严重程度，如通过以治疗的半治疗模式在多发性硬化的EAE模型中的临床分数所评估的。
序列表
Figure 185192DEST_PATH_IMAGE002
Figure 476234DEST_PATH_IMAGE003
Figure 583867DEST_PATH_IMAGE004
Figure 854443DEST_PATH_IMAGE005
Figure 449241DEST_PATH_IMAGE006
Figure 802862DEST_PATH_IMAGE007
Figure 601054DEST_PATH_IMAGE008
Figure 331112DEST_PATH_IMAGE009
Figure 281882DEST_PATH_IMAGE010
Figure 9667DEST_PATH_IMAGE011
Figure 295154DEST_PATH_IMAGE012
CB3f/CB3-IgG1效应子无效
SEQ ID NO: 52 CB3f/CB3 IgG1-效应子无效HC（LC与CB3f/CB3相同）（从IgG1 WT的改变加下划线）
Figure 828904DEST_PATH_IMAGE013
Figure 86710DEST_PATH_IMAGE014
SEQ ID NO: 53 CB3f/CB3 IgG1-效应子无效HC DNA（LC与CB3f/CB3相同）
Figure 313292DEST_PATH_IMAGE015
C323.C1-IgG1效应子无效
SEQ ID NO: 54 C323.C1 IgG1-效应子无效HC（LC与CB3.C1相同）（从IgG1 WT的改变加下划线）
Figure 289338DEST_PATH_IMAGE016
SEQ ID NO: 55 C323.C1 IgG1-效应子无效HC DNA
Figure 339028DEST_PATH_IMAGE017
Figure 779237DEST_PATH_IMAGE018
SEQ ID NO: 56人CD19同种型1（NCBI 参考序列: NP_001171569.1）
Figure 848824DEST_PATH_IMAGE019
SEQ ID NO: 57人CD19同种型2（NCBI参考序列: NP_001761.3）
Figure 374483DEST_PATH_IMAGE020
序列表
<110> 伊莱利利公司
<120> 抗人CD19抗体
<130> X22706
<150> 62/983,093
<151> 2020-02-28
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Ser Tyr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Tyr Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln His Tyr Gly Asn Ser Leu Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 8
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300
ttcggctaca attacggcat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
gcttctacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt ttctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggaaagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctgggt 1338
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300
ttcggctaca attacggcat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 11
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Asn Ser Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 12
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gggtgttaac agctactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatgtat gctacatcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggta actcactatt cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaacggacc gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Asn Ser Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gggtgttaac agctactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatgtat gctacatcca ccagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggta actcactatt cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaa 324
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ile Ser Ser Tyr Ala Tyr Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Arg Ala Ser Gln Lys Val Asn Ser Tyr Tyr Leu His
1 5 10
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Tyr Ala Thr Arg Thr Arg Pro Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Gln His Tyr Gly Gln Ser Leu Phe Thr
1 5
<210> 21
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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ctctccctgt ctctgggt 1338
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccattagc agctatgctt acagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttgacac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300
ttcggctaca attacgcgat ggacgtctgg ggccaaggga cccttgtcac cgtctcctca 360
<210> 25
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Lys Val Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Arg Thr Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gln Ser Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gaaagttaac agctactact tacattggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gctacaagaa ccaggccaac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggtc agtcactatt cactttcggc 300
caggggacca aggtggagat caaacggacc gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Lys Val Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Arg Thr Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gln Ser Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gaaagttaac agctactact tacattggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gctacaagaa ccaggccaac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggtc agtcactatt cactttcggc 300
caggggacca aggtggagat caaa 324
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Lys Ala Ser Gly His Thr Ile Ser Ser Tyr Ala Tyr Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Asp Ile Ile Pro Ala Tyr Gly Ser Pro Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Lys Asn Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Arg Ala Ser Gln His Val Ser Ser His Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gln His Tyr Gly Gln Ser Gln Phe Thr
1 5
<210> 35
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ala Tyr Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Lys Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 36
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggaca taccattagc agctatgctt acagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagac atcatccctg cctatggctc accaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300
ttcggcaaga attacgcgat ggacgtctgg ggccaaggga cccttgtcac cgtctcctca 360
gcttctacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt ttctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggaaagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctgggt 1338
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ala Tyr Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Lys Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggaca taccattagc agctatgctt acagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagac atcatccctg cctatggctc accaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300
ttcggcaaga attacgcgat ggacgtctgg ggccaaggga cccttgtcac cgtctcctca 360
<210> 39
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Ser His
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gln Ser Gln
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 40
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gcatgttagc agccactact tagcttggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggtc agtcacagtt cactttcggc 300
caggggacca aggtggagat caaacggacc gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Ser His
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gln Ser Gln
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gcatgttagc agccactact tagcttggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggtc agtcacagtt cactttcggc 300
caggggacca aggtggagat caaa 324
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Arg Ala Ser Gln His Val Asn Ser His Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Tyr Ala Thr Arg Thr Arg Pro Thr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Gln His Tyr Gly Gln Ser Gln Phe Thr
1 5
<210> 46
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Asn Ser His
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Arg Thr Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gln Ser Gln
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gcatgttaac agccactact tagcttggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gctacaagaa ccaggccaac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggtc agtcacagtt cactttcggc 300
caggggacca aggtggagat caaacggacc gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
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<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Asn Ser His
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Arg Thr Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gln Ser Gln
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gcatgttaac agccactact tagcttggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gctacaagaa ccaggccaac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cactatggtc agtcacagtt cactttcggc 300
caggggacca aggtggagat caaa 324
<210> 50
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ala Tyr Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Lys Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 51
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggaca taccattagc agctatgctt acagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagac atcatccctg cctatggctc accaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300
ttcggcaaga attacgcgat ggacgtctgg ggccaaggga cccttgtcac cgtctcctca 360
gcttctacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggacgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gccccccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1347
<210> 52
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ala Tyr Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Lys Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ser Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 53
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
caggtgcaac ttgtccaaag cggagctgag gttaagaaac caggttcatc tgtgaaggtg 60
tcatgtaagg caagcggcca caccatttca tcttacgcat actcctgggt tcgacaagct 120
ccaggccagg gattggaatg gatgggagac ataatcccag catacggatc acctaactac 180
gcacagaagt ttcaggggag agtgacaatt acagccgacg agtctactag cactgcttac 240
atggagttgt cttcacttcg gtcagaggat acagcagttt actattgtgc cagggaggat 300
ttcgggaaaa attatgctat ggatgtatgg ggtcagggca ccctggttac tgtatcatct 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgccggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt gtccgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tatgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaagtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat tccaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 1350
<210> 54
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Tyr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Phe Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ser Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 55
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
caggttcagc tcgtgcaaag tggagctgag gtgaaaaaac ctggttctag cgtcaaggtc 60
tcttgtaagg cctctggggg cactataagc tcttatgctt atagttgggt gcgccaggcc 120
ccaggacagg gcttggaatg gatgggcggc ataataccca tattcgacac agccaactac 180
gctcaaaaat ttcaggggag agtgactata actgcagacg agagcactag caccgcttac 240
atggagttga gtagtctccg cagtgaagac acagccgtct attattgcgc tagggaggac 300
tttggttaca actacgccat ggatgtctgg ggccagggta ctttggtcac cgtatctagt 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgccggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt gtccgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tatgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaagtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat tccaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 1350
<210> 56
<211> 557
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325 330 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355 360 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Ala
485 490 495
Gly Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro
500 505 510
Gln Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp
515 520 525
Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala
530 535 540
Trp Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545 550 555
<210> 57
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325 330 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355 360 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
485 490 495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
500 505 510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
515 520 525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
530 535 540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545 550 555

Claims (36)

1.结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中所述VH包含重链互补性决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含轻链互补性决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
所述HCDR1包含SEQ ID NO: 29，
所述HCDR2包含SEQ ID NO: 30，
所述HCDR3包含SEQ ID NO: 31，
所述LCDR1包含SEQ ID NO: 32，
所述LCDR2包含SEQ ID NO: 33，且
所述LCDR3包含SEQ ID NO: 34。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO: 37且所述VL包含SEQ IDNO: 41。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO: 35的重链（HC）和包含SEQ ID NO: 39的轻链（LC）。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO: 52的HC和包含SEQ ID NO: 39的LC。
5.结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
所述HCDR1包含SEQ ID NO: 29，
所述HCDR2包含SEQ ID NO: 30，
所述HCDR3包含SEQ ID NO: 31，
所述LCDR1包含SEQ ID NO: 43，
所述LCDR2包含SEQ ID NO: 44，且
所述LCDR3包含SEQ ID NO: 45。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO: 37且所述VL包含SEQ IDNO: 48。
7.根据权利要求5或6所述的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO: 35的HC和包含SEQ ID NO: 46的LC。
8.根据权利要求5或6所述的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO: 52的HC和包含SEQ ID NO: 46的LC。
9.结合人CD19的抗体，其中所述抗体包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
所述HCDR1包含SEQ ID NO: 15，
所述HCDR2包含SEQ ID NO: 16，
所述HCDR3包含SEQ ID NO: 17，
所述LCDR1包含SEQ ID NO: 18，
所述LCDR2包含SEQ ID NO: 19，且
所述LCDR3包含SEQ ID NO: 20。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO: 23且所述VL包含SEQ IDNO: 27。
11.根据权利要求9或10所述的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO: 21的HC和包含SEQ ID NO: 25的LC。
12.根据权利要求9或10所述的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO: 54的HC和包含SEQ ID NO: 25的LC。
13.根据权利要求1-12任一项所述的抗体，其中所述抗体是非耗尽性抗体。
14.包含编码SEQ ID NO: 35、52、39、46、21、54或25的序列的核酸。
15.包含根据权利要求14所述的核酸的载体。
16.根据权利要求15所述的载体，其中所述载体包含编码SEQ ID NO: 35或52的第一核酸序列，和编码SEQ ID NO: 39或46的第二核酸序列。
17.根据权利要求15所述的载体，其中所述载体包含编码SEQ ID NO: 21或54的第一核酸序列，和编码SEQ ID NO: 25的第二核酸序列。
18.包含第一载体和第二载体的组合物，所述第一载体包含编码SEQ ID NO: 35或52的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO: 39或46的核酸序列。
19.包含第一载体和第二载体的组合物，所述第一载体包含编码SEQ ID NO: 21或54的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO: 25的核酸序列。
20.包含根据权利要求16或17所述的载体的细胞。
21.包含第一载体和第二载体的细胞，所述第一载体包含编码SEQ ID NO: 35或52的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO: 39或46的核酸序列。
22.包含第一载体和第二载体的细胞，所述第一载体包含编码SEQ ID NO: 21或54的核酸序列，所述第二载体包含编码SEQ ID NO: 25的核酸序列。
23.根据权利要求20-22任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
24.产生抗体的方法，其包括在这样的条件下培养根据权利要求20-23任一项所述的细胞以使所述抗体表达并从培养基回收表达的抗体。
25.通过根据权利要求24所述的方法产生的抗体。
26.包含根据权利要求1-13或25任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。
27.在有需要的主体中治疗B细胞相关病症的方法，包括向所述主体施用治疗有效量的根据权利要求1-13或25任一项所述的抗体或根据权利要求26的药物组合物。
28.根据权利要求27的方法，其中所述B细胞相关病症是自身免疫性疾病。
29.根据权利要求27的方法，其中所述B细胞相关病症选自系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎或重症肌无力。
30.根据权利要求1-13或25任一项所述的抗体，其供治疗之用。
31.根据权利要求1-13或25任一项所述的抗体或根据权利要求26的药物组合物，其供治疗B细胞相关病症之用。
32.根据权利要求31的抗体或药物组合物，其中所述B细胞相关病症是自身免疫性疾病。
33.根据权利要求31的抗体或药物组合物，其中所述B细胞相关病症选自系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎或重症肌无力。
34.根据权利要求1-13或25任一项所述的抗体在制备用于治疗B细胞相关病症的药物中的用途。
35.根据权利要求34的用途，其中所述B细胞相关病症是自身免疫性疾病。
36.根据权利要求34的用途，其中所述B细胞相关病症选自系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、特发性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、ANCA脉管炎或重症肌无力。
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PL2066349T3 (pl) * 2006-09-08 2012-09-28 Medimmune Llc Humanizowane przeciwciała anty-CD19 i ich zastosowanie w leczeniu nowotworów, transplantacjach i leczeniu chorób autoimmunologicznych
CA2948165A1 (en) 2014-05-08 2015-11-12 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Using b-cell-targeting antigen igg fusion as tolerogenic protein therapy for treating adverse immune responses
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